KR20070122563A - 질병에의 면역학적 개입을 위한 1가 및 다가 합성 다당류항원 - Google Patents

질병에의 면역학적 개입을 위한 1가 및 다가 합성 다당류항원 Download PDF

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KR20070122563A
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Abstract

본 발명은, 제1 에피토프 및 제2 에피토프가 각각 공유 부착된 TLR2-표적화 합성 펩티도글리칸(PGN) 잔기를 포함하는 친염증성 합성 다당류 항원(SPA) 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다. 제1 에피토프는 하나 이상의 제네릭 T 헬퍼 펩티드 서열을 포함하고, 제2 에피토프는 하나 이상의 표적 에피토프를 포함한다. 제1 및 제2 에피토프가 SPA 내에 각각 하나 이상의 카피로 존재한다. 각각의 표적 에피토프는 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고, CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원이다. 본 발명은, 하나 이상의 표적 에피토프가 공유 부착된 TLR2-표적화 합성 펩티도글리칸(PGN) 잔기를 포함하는, 억제성 합성 다당류 항원(SPA) 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다. 각각의 표적 에피토프는 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고, SPA 내에서 하나 이상의 카피로 존재한다.
합성 다당류 항원, TLR2-표적화, 면역조절제

Description

질병에의 면역학적 개입을 위한 1가 및 다가 합성 다당류 항원 {MONOVALENT AND POLYVALENT SYNTHETIC POLYSACCHARIDE ANTIGENS FOR IMMUNOLOGICAL INTERVENTION IN DISEASE}
본 발명은 질병에의 면역학적 개입을 위한 1가 및 다가 합성 다당류 항원에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 1가 및 다가 합성 다당류 항원에 의한 면역 반응의 항원-특이적 자극 및 억제에 관한 것이다.
수지상 세포(DC)는 미성숙 상태(iDC)로 거의 모든 말초 조직에 존재하여, 항원을 포식작용하고, 항원으로부터 펩티드 에피토프를 생성시키며, 이 에피토프를 주조직적합성 복합체(MHC)에 의해 암호화되는 분자의 인식 바구니에 부하한다. 항원의 획득 및 처리는 DC를 성숙시키고, 이러한 성숙은 항원을 획득하고 처리하며 처리된 항원을 세포 표면에 제시하는 능력의 소실을 초래하며, 표면 MHC II 분자 및 공동-자극 분자, 예컨대 CD80 및 CD86의 증가된 발현을 특징으로 한다 [Chakraborty 등 (2000) Clin.Immunol. 94: 88-98]. DC 성숙의 개시는 수지상 세포 위에 존재하는 톨-유사(toll-like) 수용체 (TLR)의 자극에 의해 유발될 수 있다. TLR는, 지질다당류(LPS), 펩티도글리칸 및 지질펩티드뿐만 아니라 플라겔린, 세균 DNA 및 바이러스성 이중-가닥 RNA를 포함하여, 고도로 보존된 구조적 모티프, 예를 들어 병원체-관련 분자 패턴 [PAMP; Medzhitov (2001) Nat.Rev.Immunol. 135-145]을 가진 항원을 인식한다.
성숙한 수지상 세포는 T 세포의 강력한 자극인자이고, 다촉수 (수지상) 형태이므로 에피토프-적재 MHC 분자를 통하여 다수의 T 세포와 세포-세포 접촉을 이루게 된다 [Banchereau 등 (2000) Annu.Rev.Immunol. 18:767-811]. 활성화된 CD4+ T 헬퍼 (Th) 세포는 케모카인 및 사이토카인 신호를 다른 DC에 전달할 수 있고, 이들이 항원에 노출된 적이 없는(naive) CD8+ T 세포를 활성화시켜 이들 세포를 항원-특이적 세포독성 T 림프구 (CTL)로 변형시키도록 한다. 활성화된 Th 세포는 B 세포와도 상호작용하여 분화, 클론 팽창, 및 적응 면역의 체액 반응을 개시하는데 있어서 이들이 분비할 항체 이소형의 정확성을 조절하는 분자 신호를 제공한다.
T 세포를 활성화하는 DC의 능력은 MHC 및 공동자극 마커 (예컨대 CD80 및 CD86) 양쪽 모두의 구성적 발현에 연관된다 [Banchereau 등, (2000) Annu.Rev.Immunol. 18: 767-811]. DC 세포 표면에서 이러한 분자가 감소되거나 부재한다면, DC는 T 세포와의 자극 동종 상호작용에 참여할 수 없다. 미성숙 DC는 인간 T 조절 (Treg) 세포의 분화를 유도함으로써 말초 면역관용에 기여하며 [Jonuliet 등 (2000) J.Exp.Med. 192: 1213-1222], 시험관내 및 생체내에서 조절 기능을 나타낸다. 활성화된 Treg 세포는 효과기 T 세포에서 자기조절 발현 또는 유도를 통하여 항-염증 사이토카인인 IL-10의 생성을 이끌어내는 것으로 밝혀졌다 [Dieckmann 등, (2002), J.Exp.Med. 196: 247-253].
유형 II 사이토카인인 IL-10은 강력한 항-염증성 활성을 갖고, T 효과기 세 포 [Morel 등 (2002) Immunol. 106: 229-236], 수지상 세포 [Martin 등 (2003) Immunity 18: 155-167] 및 기타 항원-제시 세포 [Williams 등 (2002) J.Leuko. Biol. 72:800-809]의 염증 반응을 하향 조절한다. IL-10은, 숙주에게 해로울 수도 있는 저지되지 않은 염증 반응을 하향 조절하는 작용을 한다 [Moore 등 (2001) Annu.Rev.Immunol. 19: 683-765].
예방접종 및 면역요법 전략은 이렇게 복잡하게 얽힌 일련의 세포 상호작용을 외부에서 조종하려고 하는 것이다.
현재의 백신 기술
주어진 CTL 에피토프에 대한 강력한 CD8+ T 세포 반응 및 주어진 항원 에피토프에 대한 항체 반응의 발생은, 양쪽 모두 강력한 Th 반응의 발생을 필요로 한다. 따라서, 적어도 하나의 T 헬퍼 세포 에피토프를 항원 에피토프와 함께 투여하는 것이 바람직하다 [Vitello 등, J.Clin.Invest (1995) 95:341; Livingston 등 (1997) J.Immunol. 159:1383]. 특정한 항원에 대한 개인의 면역 반응에서 큰 유전적 변동을 피하기 위하여, 항원을 종종 여러가지 Th 에피토프를 가진 큰 단백질, 예를 들어 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)과 함께 투여한다.
대안적으로, 무차별적(promiscuous) 또는 허용적(permissive) Th 에피토프-함유 펩티드를 항원과 함께 투여한다. 무차별적 또는 허용적 Th 에피토프-함유 펩티드는 대다수의 MHC 클래스 II 일배체형을 통해 제시되고, 따라서 대다수의 인간 집단에서 강한 CD4+ Th 반응을 유도한다. 무차별적 또는 허용적 T 헬퍼 에피토프의 예는 파상풍 톡소이드 펩티드, 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum) pfg27, 락테이트 탈수소효소 펩티드, 및 HIV의 gp120을 포함한다.
면역요법 및 예방접종은 특정한 감염성 질병 또는 암과 같은 질환의 예방 또는 치료를 위해 매력적인 접근법이다. 그러나, 면역치료 프로토콜에 고유한 몇몇 단점에 의하여 이러한 치료의 성공이 제한된다. 선택된 CTL 에피토프의 불량한 면역원성이 가장 일반적이다. T 세포 면역원을 나타내는 합성 펩티드는, 단리 상태로 전달될 때, 단지 약한 면역 반응을 이끌어낸다. 그 결과, 이들은 백신 또는 면역요법 제제로서 효과적이 아니다. CTL 에피토프를 함유하는 전장 단백질은 MHC 클래스 I 처리 경로에 효과적으로 들어가지 않는다. 추가로, CTL 에피토프는 또한 HLA-제한적이고, 따라서 인간 집단에서 나타나는 고도의 MHC 클래스 I 다형성은 CTL 에피토프-기초 백신이 집단 내에서 모든 유전자형에 대해 넓은 보호를 제공할 수 없음을 의미한다. 또한, 병원체/종양 이질성 때문에, 표적 미생물 또는 종양 세포의 효과적인 제거를 위해 다수의 항원이 요구될 수도 있다.
면역 반응을 증강시키기 위한 표준 방법은, 면역원과는 별개인, 완전 프로인트 아주반트(CFA)와 같은 아주반트를 사용하는 것이다. 그러나, CFA를 포함하는 다수의 효과적인 아주반트는 사람에게 사용하기에는 독성이 너무 크다. 일부 아주반트는 매우 불량한 용해도 때문에 투여 직전에 면역원과의 사전 배합을 필요로 한다. 사람에게 사용하기 위해 승인된 매우 적은 아주반트 중에서, 알룸이 이러한 아주반트의 예이다. 최근, 특정한 미생물 천연 생성물은 면역조절에서 특히 아주반트로서 유용한 것으로 밝혀졌으며, 새로운 백신 기술의 발전을 위한 발판을 놓았다 [Kensil, Methods Mol.Med. (2000) 42:259].
친염증성 반응
그람 음성 세균으로부터 지질다당류(LPS)와 같은 미생물 항원, 및 그람 음성 및 그람 양성 세균으로부터 뮤레인 또는 펩티도글리칸 (PGN)으로서 공지된 세균 세포벽 당펩티드는 강력한 면역조절제이다. 예를 들어, 천연 공급원으로부터 고 분자량 세균 PGN은 유력한 염증제로서 알려져 있고, 실험 동물에서 관절염을 유도하기 위해 오랫동안 사용되었다 [Wahl 등, (1986) J.Exp.Med. 165:884].
PGN을 포함한 다수의 미생물 항원은 하나 이상의 포유동물 TLR을 활성화함으로써 친염증성 효과를 발휘하는 것으로 생각된다. TLR에 결합하여 TLR을 활성화하는 것은, 전사 인자 NF-κB의 유도를 이끄는 세포내 신호화 캐스케이드를 유발하고, 이것은 다시 케모카인 및 특정한 사이토카인과 같은 친염증성 매개인자를 암호화하는 유전자의 발현을 자극한다.
TLR2의 두 번째 천연 생성물 리간드는 마이코플라스마로부터 마크로파지-활성화 지질펩티드 2 (MALP-2)의 지질 성분이다 [Mulradt 등 (2002) J.Exp.Med. 185: 1951]. MALP-2의 합성 변형체인 Pam3Cys는 인플루엔자 바이러스 감염된 세포에 대해 바이러스-특이성 CTL 반응을 촉진할 수 있고 [Deres 등, (1989) Nature 342:561], 적절한 에피토프에 접합될 때 구제역 질병에 대한 보호 항체의 생성을 자극할 수 있는 것으로 밝혀졌다. [Weismuller 등 (1989) Vaccine 7:29; 미국 특허 6,024,964호]. MALP-2의 다른 합성 변형, Pam2Cys는 다양한 항원 펩티드 에피토프에 공유 부착되고, 이러한 1가 에피토프-기초 백신/치료제가 동물 모델에서 세포 (세포독성 T 세포) 또는 체액성 (항체 매개) 면역 반응을 나타내었다 [Jackson 등 (2004) PNAS 101: 16440; WO 2003/014956 및 WO 2003/014957].
1가 에피토프-기초 백신/치료제 전략은 특히 암 화학요법 분야에서 상당한 관심을 끈다. 예를 들어, 특정한 항원에 대한 세포 및/또는 체액 면역 반응을 이끌어내기 위하여, 열 충격 단백질-펩티드 접합체 (WO 2004/071457; WO 2004/091493), 탄수화물-담체 단백질 접합체 [Slovin 등 (1999) PNAS 96: 5710] 및 Pam2Cys-펩티드 접합체 (WO 2004/014956; WO 2004/14957)이 모두 사용되었다. 그러나, 종양의 항원 불균일성 및 주어진 항원 에피토프에 대한 인간 면역 반응의 불균일성을 고려하면, 지속되는 임상적 성공을 얻기 위하여 다가 백신이 요구된다. 예를 들어, 뉴모백스(Pneumovax)(R) 23 (머어크 앤드 컴퍼니)는 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 23개 상이한 혈청형으로부터의 에피토프를 포함하고, 스트렙토코쿠스 감염에 대해 광범위한 전신 면역을 부여할 수 있다.
억제 반응
TLR2의 모든 리간드가 친염증성 세포내 신호화 캐스케이드를 개시하는 것은 아니다. 예를 들어, TLR2에 대해 특이적인 생쥐 항-인간 봉쇄 항체는 TLR2에 의해 내면화되고 MHC 클래스 II 처리 경로에 혼입되는 것으로 밝혀졌으나, DC의 비성숙화, 공동-자극 분자 CD80 및 CD86의 상향조절, MHC 클래스 II 분자의 상향조절, 또는 친염증성 매개인자의 유도가 관찰되었다 [Schejetne 등 (2003) J.Immunol. 171:32].
WO 2003/070761호는 TLR에 결합하고 그 결과 항-염증 반응을 일으키는 열 충 격 단백질 60의 특정한 분절 (p277로 명명)을 개시하고 있다. 세포 매개 자가면역 질병에 특이적인 항원 에피토프에 대한 p277의 접합에 의하여, 항원-특이적 항-염증성인 이작용성 분자(TLR2 리간드-에피토프)가 얻어진다. 그러나, 각각의 이작용성 분자는 주요 염증 또는 자가면역 질병 상황로부터 하나의 에피토프에 제한된다.
WO 2003/075593호는, NF-κB의 생성을 유도하지 않는 천연 세균 PGNs와 비교할 때, TLR2를 통해 NF-κB를 유도하지 않는 전체 합성 세균 PGN의 변형을 기재하고 있다. 합성 PGN의 구조는 천연 PGN의 구조를 닮았지만, 상기 언급된 p277 및 봉쇄 항체와 유사하게, 합성 PGN은 TLR2를 통한 자극 없이 TLR2에 결합한다. 복강 농양 형성, 수술후 유착 형성 및 캔딘(candin) DTH 반응이 합성 PGN에 의해 생체내에서 모두 억제된다. 또한, 저자는, 배열 분석에 의하여, 항-염증 매개인자 IL-10 및 IL-19가 합성 PGN과의 처리 시에 상향조절되지만 자극 사이토카인 및 케모카인은 그렇지 않다는 것을 나타내었다. 이러한 결과를 근거로 하여, WO 2003/075593의 합성 PGN은 친염증 효과기 T 세포의 전신 억제인자이다.
염증성 장 질환(IBD), 크론 병, 류마티스 관절염, 자가면역 당뇨병 및 알레르기 질병 등 IL-10이 효과적인 것으로 밝혀진 염증의 다수의 동물 모델이 존재한다 ([Madsen (2002) Gastroenterol. 123: 2140-2144; Barnes (2001) Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol. 1:555-560]; [Bremeanu 등 (2001) Int.Rev.Immunol. 20:301-331; St.Clair (2000) Curr.Dir.Autoimmun. 2:126-149]). 그러나, 염증성 장 질환의 치료를 위해 재조합 IL-10을 사용하는 임상 시험은, 여러가지 결과에 부딪치게 된다. 반복된 고 용량 섭생법의 요구뿐만 아니라 일부 얻 어지는 독성은 이러한 노력의 성공을 방해하고 있다.
안전하고 효과적인 방식으로 친염증 및 억제 상황 양쪽 모두에서 면역 반응을 조절하는 치료 분자가 여전히 요구되고 있다. 이러한 추가의 분자는 질병 예방 및 치료를 위해 더욱 효과적인 면역요법 전략을 개발하는 것을 촉진할 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 질병에서 면역학적 개입을 위한 1가 및 다가 합성 다당류 항원(SPA)에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 1가 및 다가 합성 다당류 항원에 의한 면역 반응의 항원-특이적 자극 및 억제에 관한 것이다.
본 발명은
제1 에피토프 및 제2 에피토프가 각각 공유 부착된 TLR2-표적화 합성 펩티도글리칸(PGN) 잔기를 포함하고,
제1 에피토프가 하나 이상의 제네릭(generic) T 헬퍼 에피토프를 포함하고, 제2 에피토프가 하나 이상의 표적 에피토프를 포함하며; 제1 및 제2 에피토프가 SPA 내에 각각 하나 이상의 카피로 존재하고,
각각의 표적 에피토프가 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고, 각각의 표적 에피토프가 CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원인,
친염증성 합성 다당류 항원(SPA) 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.
친염증성 SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염은 SPA 내에 하나 이상의 카피로 존재하는 단일 표적 에피토프를 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한, 다음 중에서 선택되는 앞서 기재된 친염증성 SPA 및 제약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.
Figure 112007082550753-PCT00001
, 또는
Figure 112007082550753-PCT00002
상기 식에서,
W는 SPA 내 단량체 단위의 총 수이고 약 10 내지 약 375 범위의 정수이며;
R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
x는 SPA 내 비치환 반복 단위(UR)의 몰 분율이고;
yn는 SPA 내 Th 에피토프 반복 단위(ThR)의 n번째 종의 몰 분율이고;
z는 SPA 내 표적 에피토프 반복 단위(TR)의 몰 분율이고;
ynz는 SPA 내 조합된 Th 에피토프/표적 에피토프 반복 단위(Th/TR)의 n번째 종의 몰 분율이고;
스템 펩티드(STEM PEPTIDE)는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하며;
링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
스페이서(SPACER) 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
스페이서 2는 0 내지 약 10개 아미노산 길이이고;
표적 에피토프는 CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원인 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고;
(Th 에피토프)n는 n개의 상이한 Th 에피토프이고, 각각의 Th 에피토프는 독립적으로 선택되고 제네릭 T 헬퍼 에피토프를 포함한다.
본 발명의 친염증성 SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염은 대안적으로 SPA 내에 각각 하나 이상의 카피로 존재하는 2종 이상의 표적 에피토프를 포함할 수도 있다.
본 발명은 다음 중에서 선택되는 앞서 기재된 친염증성 SPA 및 제약학적으로 허용가능한 그의 염을 더욱 제공한다.
Figure 112007082550753-PCT00003
상기 식에서,
W는 SPA 내 단량체 단위의 총 수이고 약 10 내지 약 375 범위의 정수이며;
R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
x는 SPA 내 비치환 반복 단위(UR)의 몰 분율이고;
yn는 SPA 내 Th 에피토프 반복 단위(ThR)의 n번째 종의 몰 분율이고;
zn는 SPA 내 표적 에피토프 반복 단위(TR)의 n번째 종의 몰 분율이고;
ynzn는 SPA 내 조합된 Th 에피토프/표적 에피토프 반복 단위(Th/TR)의 n번째/n번째 종의 몰 분율이고;
스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하며;
링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
스페이서 2는 0 내지 약 10개 아미노산 길이이고;
(표적 에피토프)n는 n개의 상이한 표적 에피토프이고, 각각의 표적 에피토프는 독립적으로 선택되며, CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원인 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고;
(Th 에피토프)n는 n개의 상이한 Th 에피토프이고, 각각의 Th 에피토프는 독립적으로 선택되고 제네릭 T 헬퍼 에피토프를 포함한다.
상기 기재된 바와 같은 친염증성 SPA는 각각 하나 이상의 카피로 존재하는, 약 2 내지 약 180개의 표적 에피토프 및 약 1 내지 약 180개 Th 헬퍼 에피토프를 포함할 수도 있다.
본 발명은
SPA 내에 각각 하나 이상의 카피로 존재하는 하나 이상의 표적 에피토프가 공유 결합된 TLR2-표적화 합성 펩티도글리칸(PGN) 잔기를 포함하며, 표적 에피토프의 각각의 종이 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기인,
억제성 합성 다당류 항원(SPA) 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.
억제성 SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염은 SPA 내에 하나 이상의 카피로 존재하는 단일 표적 에피토프를 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 억제성 SPA를 제공하고, 이것은 하기 화학식의 SPA 또는 그의 제약학적으로 허용가능한 염이다.
Figure 112007082550753-PCT00004
상기 식에서,
W는 SPA 내 단량체 단위의 총 수이고 약 10 내지 약 375 범위의 정수이며;
R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
x는 SPA 내 비치환 반복 단위(UR)의 몰 분율이고;
z는 SPA 내 표적 에피토프 반복 단위(TR)의 몰 분율이고;
스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하지 않으며;
링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
표적 에피토프는 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이다.
본 발명의 억제성 SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염은 대안적으로 SPA 내에 각각 하나 이상의 카피로 존재하는 2종 이상의 표적 에피토프를 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 것과 같은 억제성 SPA를 제공하고, 이것은 하기 화학식의 SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염이다.
Figure 112007082550753-PCT00005
상기 식에서,
W는 SPA 내 단량체 단위의 총 수이고 약 10 내지 약 375 범위의 정수이며;
R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
x는 SPA 내 비치환 반복 단위(UR)의 몰 분율이고;
zn는 SPA 내 표적 에피토프 반복 단위(TR)의 n번째 종의 몰 분율이고;
스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하지 않으며;
링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들 이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
(표적 에피토프)n는 n개의 상이한 표적 에피토프이고, 각각의 표적 에피토프는 독립적으로 선택되며, 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이다.
상기 기재된 억제성 SPA는 하나 이상의 카피의 각각에 약 2 내지 약 180개의 표적 에피토프를 포함할 수도 있다.
본 발명은 합성 다당류 항원을 더욱 제공하고, 여기에서 SPA는 하기 서열을 포함한 중합체 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염이다.
X1-[-MO-]w-X2
상기 식에서,
X1 및 X2는 독립적으로 H 또는 터미네이터이고;
W는 중합체에서 단량체 단위 (MO)의 수를 나타내고, 약 2 내지 약 375 범위의 정수일 수도 있고,
각각의 MO는 비치환 반복 단위(UR), 1종 이상의 TH 에피토프 반복 단위(ThR), 1종 이상의 표적 에피토프 반복 단위(TR), 1종 이상의 조합된 Th/표적 에피토프 반복 단위(Th/TR), 및 이들의 조합을 포함한 군에서 선택되는 단량체 단위이다.
상기 기재된 SPA는 랜덤 공중합체, 블록 공중합체 또는 교대하는 공중합체일 수도 있다.
본 발명은 상기 기재된 합성 다당류 항원 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공하고, 여기에서 SPA는 제1 에피토프 및 제2 에피토프가 공유 부착된 TLR2- 표적화 합성 펩티도글리칸(PGN) 잔기를 포함하는 친염증성 합성 다당류 항원 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염이고; 제1 에피토프는 하나 이상의 제네릭 T 헬퍼 에피토프를 포함하고; 제2 에피토프는 하나 이상의 표적 에피토프를 포함하며; 제1 및 제2 에피토프가 SPA 내에 각각 하나 이상의 카피에 존재하고; 각각의 표적 에피토프는 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고, 여기에서 각각의 표적 에피토프는 CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 합성 다당류 항원 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공하고, 여기에서 SPA는 하나 이상의 표적 에피토프가 공유 부착된 TLR2-표적화 합성 펩티도글리칸(PGN) 잔기를 SPA 내에 각각 하나 이상의 카피로 포함하는 억제성 합성 다당류 항원이고, 여기에서 각각의 표적 에피토프는 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이다.
본 발명은 또한, 약 10 내지 약 375개의 단량체 단위를 포함하고, 단량체 단위가 하기 화학식으로부터 독립적으로 선택되는 것인 전구-약물 합성 다당류 항원(PSA) 및 제약학적으로 허용가능한 그의 염을 더욱 제공한다.
Figure 112007082550753-PCT00006
, 또는
Figure 112007082550753-PCT00007
상기 식에서,
R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하며;
링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하 며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
스페이서 2는 0 내지 약 10개 아미노산 길이이고;
(표적 에피토프)n는 n개의 상이한 표적 에피토프이고, 각각의 표적 에피토프는 독립적으로 선택되며, CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원인 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고;
(Th 에피토프)n는 n개의 상이한 Th 에피토프이고, 각각의 Th 에피토프는 독립적으로 선택되고 제네릭 T 헬퍼 에피토프를 포함한다.
본 발명은 또한, 약 10 내지 약 375개의 단량체 단위를 포함하고, 단량체 단위가 독립적으로 하기 화학식으로부터 선택되는 것인, 친염증성 합성 다당류 항원(SPA) 및 제약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.
Figure 112007082550753-PCT00008
상기 식에서,
R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하며;
링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
스페이서 2는 0 내지 약 10개 아미노산 길이이고;
(표적 에피토프)n는 n개의 상이한 표적 에피토프이고, 각각의 표적 에피토프 는 독립적으로 선택되며, CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원인 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고;
(Th 에피토프)n는 n개의 상이한 Th 에피토프이고, 각각의 Th 에피토프는 독립적으로 선택되고 제네릭 T 헬퍼 에피토프를 포함한다.
본 발명은 또한, 약 10 내지 약 375개의 단량체 단위를 포함하고, 단량체 단위가 하기 화학식으로부터 독립적으로 선택되는 것인, 억제성 합성 다당류 항원(SPA)및 제약학적으로 허용가능한 그의 염을 더욱 제공한다.
Figure 112007082550753-PCT00009
상기 식에서,
R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하지 않으며;
링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하 며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
(표적 에피토프)n는 n개의 상이한 표적 에피토프이고, 각각의 표적 에피토프는 독립적으로 선택되며, 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 기재된 합성 다당류의 어느 하나 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염 및 제약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 합성 다당류 항원의 어느 하나 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염의 약제로서의 용도를 제공한다.
본 발명은, 면역조절제로의 치료에 감수성인 질병 또는 질환의 예방 또는 치료를 위해 약제를 제조하기 위한, 본 발명에 기재된 합성 다당류의 어느 하나의 화합물 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염의 용도를 더욱 제공한다.
본 발명은, 본 발명의 합성 다당류의 어느 하나 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염의 유효량을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 면역조절제로의 치료에 감수성인 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 더욱 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 기재된 합성 다당류의 어느 하나 또는 제약학적 으로 허용가능한 그의 염의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 1가 및 다가 합성 다당류 항원은, 단일 분자 물질 내에서, 단일 에피토프의 다수 카피, 또는 각각이 다수 카피로 존재하는 다수의 에피토프를 전달할 수 있다. 이들 신규 분자는 합리적으로 지정된 항원-특이적 방식으로 친염증 또는 항-염증 요법을 제공하도록 설계될 수 있다.
예를 들어 항균, 항바이러스 또는 항암 요법에서와 같이 염증 반응이 치료적으로 유익한 것인 질병 상황 또는 상태를 치료하기 위해 항원-특이적 염증 반응을 유도하기 위하여, 본 발명의 염증성 모노SPA 및 폴리SPA가 인간 및 기타 포유동물에서 사용될 수 있다. 친염증 면역 반응의 억제가 치료적으로 유익한 것인 질병 상황을 치료하기 위하여, 예를 들어 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 홍반 루푸스, 다발 경화증 및 이식편 거부의 치료에서, 본 발명의 억제성 모노SPA 및 폴리SPA가 인간 및 다른 포유동물에서 사용될 수 있다.
내인성 사이토카인 및 케모카인을 선택적으로 생성하도록 개인의 면역 체계를 이용하는 것은 면역요법에 대해 더욱 양호한 경로를 제공할 수도 있다. 면역 체계를 온전히 유지하면서 숙주에 의해 조절되어지는 내인성 사이토카인 및 케모카인의 발현은, 반복된 투여의 필요성 또는 사이토카인/케모카인 독성의 문제점 없이도 효능을 달성하기 위해 적절한 환경을 제공할 수도 있다. 또한, 세포 집단의 선택적 증강은 강력한 사이토카인/케모카인을 위해 이상적인 전달 체계인 것으로 입증될 수도 있다. 신체 내에서 염증 부위로 이동하는 능력은 면역 세포 레퍼토리에 고유한 속성이다. 이러한 치료적 접근은 강력한 사이토카인/케모카인의 전신 투여와 관련된 문제를 피하고 이러한 면역 매개인자의 자연적인 국소 작용을 더욱 양호하게 모방한다.
본 발명의 요약이 반드시 본 발명의 모든 특징을 설명하는 것은 아니다.
본 발명의 상기 및 기타 특징은 첨부된 도면을 참고로 하여 하기 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1은 T 조절 세포 가설을 나타내는 개략도이다.
도 2는 염증 화합물, 수지상 세포 및 T 세포 간의 상호작용이 염증 또는 적응 면역을 유도할 때 일어날 수도 있는 사건을 나타내는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 친염증성 모노SPA를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 친염증성 모노SPA를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 친염증성 폴리SPA를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 친염증성 폴리SPA를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 억제성 모노SPA를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 억제성 폴리SPA를 나타낸다.
도 3 내지 8에서, 박스는 SPA의 TLR2 결합 도메인을 나타낸다. 또한, 각 유형의 단량체 단위의 몰 분획은 아래첨자로 나타낸다 (x, yn, zn 또는 ynzn). 0.6의 몰 분율은, 주어진 단량체 단위가 SPA 내 반복 단위의 60 %로서 존재한다는 것을 나타낸다. 비치환 반복 단위(UR)의 몰 분율의 표시는 x (도 7 및 8)이고; 예를 들어, x=0.4이라면, UR은 SPA 내 단량체 단위의 40%로서 존재한다. Th 에피토프 반복 단위(ThR) 종의 몰 분율의 표시는 yn이고; 예를 들어, yn=0.15라면, ThR의 n번째 상이한 종은 SPA 내 단량체 단위의 15%로서 존재한다. 표적 에피토프 반복 단위(TR) 종의 몰 분율의 표시는 zn이고; 예를 들어, zn=0.20이라면, TR의 n번째 상이한 종은 SPA 내 단량체 단위의 20%로서 존재한다. 조합된 Th/표적 에피토프 반복 단위(Th/TR) 종의 몰 분율의 표시는 ynzn이고; 예를 들어, ynzn=0.17이라면, Th/TR의 n번째 상이한 종은 SPA 내 단량체 단위의 17%로서 존재한다. 모노SPA의 경우에, TR의 몰 분율의 표시는 z1 또는 z (도 3 및 7 참조)일 수도 있고; 유사하게, 모노SPA 내 Th/TR 종의 몰 분율은 ynz1, 또는 ynz일 수도 있다 (도 4 참조).
당업자라면, 몰 분율의 합계가 1.00과 같아야 하고, 다시 말해서 x + y + y1 + y2 + … + yn + z + z1 + z2 + … + zn (경우에 따라서) = 1.00이어야 한다는 것을 인지할 것이다. 다양한 반복 단위의 효소 중합 비율이 치환에 따라 거의 적게 변하게 때문에, UR, ThR, TR 및/또는 Th/TR은 조성물에서 각각의 몰 분율에 따라 중합체의 탄수화물 축을 따라서 고르게 분포된다. UR, ThR, TR 및/또는 Th/TR은 공중합체의 무작위한 형성 성질의 결과로서 다당류 내에서 임의의 순서로 존재할 수도 있다는 것을 주목한다.
W는 SPA 중합체 내 단량체 단위의 총 수이다. W는 10 내지 375일 수 있으 며, 더욱 일반적으로 분포의 중심이 약 130 내지 약 180에 있다는 것으로 설명될 수도 있다.
정의
본 명세서에서는, 달리 나타내지 않은 한 하기 용어들은 하기 의미를 갖는다.
"Ac"는 CH3C(O)-를 의미하고,
"알킬"은 사슬에 약 1 내지 약 20개 탄소 원자 또는 그 사이의 어느 양을 가진 직쇄 또는 분지쇄일 수도 있는 지방족 탄화수소 기를 의미하고; 예를 들어, 탄화수소 기는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 탄소 원자, 또는 여기에 한정된 2개의 양에 의해 한정된 범위의 탄소 원자 양을 가질 수도 있다. 비제한적 실시예에서, 알킬 기는 사슬에 약 1 내지 약 12개 탄소 원자를 가질 수도 있거나, 또는 저급 알킬일 수도 있다. 분지쇄는, 메틸, 에틸 또는 프로필과 같은 하나 이상의 저급 알킬 기가 직쇄 알킬 사슬에 부착됨을 의미한다. "저급 알킬"은 직쇄 또는 분지쇄에 약 1 내지 약 5개 탄소 원자, 또는 그 사이의 어느 양을 가진 탄화수소 기를 나타낸다; 예를 들어, 저급 알킬은 약 1, 2, 3, 4 또는 5개 탄소 원자를 가질 수도 있다.
"아미노산"이란 천연 및 비천연 아미노산으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산을 가리킨다. 아미노산은 α-탄소에 L 또는 D 입체화학을 가진 -아미노산을 포함하는 것을 의미한다; 특정한 비제한적 예에서, 아미노산은 α-아미노기를 가진 것이다. 천연 아미노산은 하기 4개의 군으로 나뉠 수 있다: (1) 산성 (음 전하) 아미노산, 예컨대 아스파르트산 및 글루탐산; (2) 염기성 (양 전하) 아미노산, 예컨대 아르기닌, 히스티딘 및 리신; (3) 중성 극성 아미노산, 예컨대 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인/시스틴, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민; 및 (4) 천연 비극성 아미노산, 예컨대 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌. "비천연 아미노산"은 핵산 코돈이 존재하지 않는 아미노산을 의미하고; 이러한 아미노산은 중성일 수도 있거나 또는 양 또는 음 전하를 가질 수도 있다. 비천연 아미노산의 비제한적인 예는 상기 나타낸 것과 같은 천연 α-아미노산의 D-이성질체; Aib (아미노부티르산), βAib (3-아미노-이소부티르산), Nva (노르발린), β-Ala, Aad (2-아미노아디프산), βAad (3-아미노아디프산), Abu (2-아미노부티르산), Gaba (γ-아미노부티르산), Acp (6-아미노카프론산), Dbu (2,4-디아미노부티르산), α-아미노피멜산, TMSA (트리메틸실릴-Ala), aIle (알로-이소류신), Nle (노르류신), tert-Leu, Cit (시트룰린), Orn, Dpm (2,2'-디아미노피멜산), Dpr (2,3-디아미노프로피온산), α- 또는 β-Nal, Cha (시클로헥실-Ala), 히드록시프롤린, Sar (사르코신) 등; 고리형 아미노산; Na-알킬화 아미노산, 예컨대 MeGly (Na-메틸글리신), EtGly (Na-에틸글리신) 및 EtAsn (Na-에틸아스파라긴); 및 α-탄소가 2개의 측쇄 치환기를 보유하는 아미노산을 포함한다. 천연 및 비천연 아미노산 및 여기에 사용된 그의 잔기의 명칭은, 문헌 ["Nomenclature of a-Amino acids(Recommendations, 1974)", Biochemistry, 14(2), (1975)]에 기재된 바와 같이, 유기 화학 명명법에 관한 IUPAC 위원회 및 생화학 명명법에 관한 IUPAC-IUB 위원회에 의해 제안된 지명 협정에 따른다.
"아미노산 잔기"는 아미드 결합을 통하여 펩티드 또는 분자의 펩티드 부분에 통합된 개개의 아미노산 단위를 의미한다.
"펩티드"는 아미드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 중합체를 의미한다.
"순 전하"는 이온성 종에서 전하의 산술 합계를 의미한다. 당업자라면 순 전하의 결정에 친숙할 것이다. "양쪽성이온"은 예를 들어 순 음 전하, 순 양 전하 또는 중성 전하를 가진 분자를 포함하여 다당류 단량체 단위 내에서 일분자 이극성 이온 또는 다극성 이온을 가리킨다.
"보존적 아미노산 치환"은 펩티드 구조 및 생물학적 기능을 보유하는 펩티드를 생성하기 위하여 단백질 또는 펩티드 내의 아미노산 치환을 가리킨다. 이러한 변화를 이루는데 있어서 아미노산의 소수성(hydropathic) 지수 및 친수성을 포함하여 다양한 요인이 고려될 수 있다. 보존적 아미노산 돌연변이를 고려하는데 사용될 수 있는 다른 요인은 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성이고, 이것은 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 고려한다. 펩티드 내에서 잠재성 변화를 가져오는 보존적 아미노산 치환은, 상기 기재된 바와 같이 천연 발생 아미노산이 속하는 부류의 다른 요소로부터 선택될 수도 있다.
아미노산의 상대적 소수성 특징은 얻어지는 펩티드 및 폴리펩티드의 2차 구조에 기여하고, 이것은 다시 효소 및 세포 수용체 등과 같은 분자와 펩티드 또는 폴리펩티드의 상호작용에 영향을 미친다. 소수성 및 전하 특징을 기초로 하여, 각각의 아미노산에는 다음과 같은 소수성 지수가 지정되었다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트/글루타민/아스파테이트/아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5). 유사하게, 친수성을 기초로 하여 유사한 아미노산을 치환할 수 있다. 하기 친수성 값이 아미노산에 지정되었다: 아르기닌/리신 (+3.0); 아스파테이트/글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴/글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌/히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신/이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 및 트립토판 (-3.4). 당업자에 의해 인식될 수 있듯이, 펩티드, 폴리펩티드에서의 아미노산은 유사한 소수성 지수 또는 친수성 점수를 가진 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 여전히 유사한 생물학적 활성을 가진 펩티드를 생성한다. 이러한 변화를 형성함에 있어서, ±2 이내의 소수성 지수 또는 소수성 지수들을 가진 아미노산이 일반적으로 서로 간에 치환되고; 예를 들어 아미노산을 ±1 또는 ±0.5 이내의 소수성 지수 또는 친수성 점수를 가진 다른 아미노산으로 치환할 수도 있다.
"미생물"은 자유로이 살아있는 단세포 유기체를 의미한다. 비제한적 예는 원생동물, 기생동물, 마이코박테리움을 포함한 세균, 원시세포, 마이코플라즈마 및 클라미디애를 포함한다.
"비면역 세포"는 면역 반응에 보통 관련되지 않지만 면역 체계의 생성물에 의해 조절되는 능력을 가질 수도 있는 세포를 의미한다.
"면역 세포"는 숙주 면역 체계의 존재물 내에서 반응할 수 있거나 반응을 개시할 수 있는 세포를 의미한다. 일반적으로, 이러한 세포는 "백혈구"라고 일컬어지지만, 반드시 이러한 부류에 한정되는 것은 아니다. 면역 세포의 예는, 이에 한정되지 않지만 T 및 B 세포, 단핵세포, 포식세포, 자연 킬러 세포, 수지상 세포, 항원 제시 세포 및 다형핵 백혈구를 포함한다.
"T 조절 세포" 또는 "Treg"는 시험관내 및 생체내에서 면역 효과기 T 세포를 유력하게 억제하는 면역조절 T 세포의 특유의 계통을 가리킨다. Treg는 예를 들어 CD4 및 CD25 (CD4+/CD25+)를 포함한 특정한 세포 표면 마커의 발현을 특징으로 한다.
"면역 반응"은 면역 체계의 친염증 또는 항-염증 반응을 의미한다.
용어 "염증", "염증-반응", "친염증 반응" 등은 내인성 또는 외인성의 조직 손상에 의해 개시되는 복잡한 신체 과정을 가리킨다. 이러한 손상에 대한 염증 반응은 이에 한정되지 않지만 인터류킨- (IL-) 1, IL-6 및 종양 괴사 인자(TNF)-α 를 포함한 사이토카인뿐만 아니라 이에 한정되지 않지만 Il-8, 인터페론-γ 및 포식세포 유도 단백질(MIP)-1β를 포함한 케모카인과 같은 가용성 인자의 유도와 관련된다. 이에 한정되지 않지만 호중구, 포식세포 및 림프구를 포함하는 몇몇 면역 세포 집단은 또한 염증 반응에 참여한다. 염증은 보호 기능으로서 유도될 수도 있긴 하지만, 염증 병변의 다수의 예를 마주치게 될 수도 있다 (예를 들어, 이에 한정되지 않지만 염증성 장 질환, 과다한 수술후 유착 형성, 및 농양 형성).
용어 "항-염증", "항-염증 반응", "억제성 반응" 등은, 염증 반응이 감소되거나 역전되는 과정을 가리킨다. 이러한 과정은, 이에 한정되지 않지만 IL-10과 같은 가요성 매개인자의 유도, 또는 조절 T (Treg) 세포와 같은 세포 집단의 유도를 포함한다.
"IL-10"은 염증 반응의 하향조절에 관련된 내인성 매개인자가다. IL-10의 지정된 내인성 발생은 효능을 최대화하고 독성 효과를 최소화할 수도 있다.
용어 "조절한다" 또는 "조절" 등은 선택된 매개변수에서의 증가 또는 감소를 의미한다.
"합성 다당류 항원" 또는 "SPA"는 합성적으로 생성되고, 실질적으로 순수하고, N-아실글루코사미닐-β-[1,4]-N-아실무라밀-펩티드의 선형 비가교 중합체이다. 펩티드는 하나 이상의 아미노산, 천연 또는 비천연 구조, D 또는 L 배위를 포함할 수도 있다. 여기에 개시된 것과 같은 실질적으로 순수한 합성 다당류 항원은 천연 발생 세균 세포벽 오염물을 필수적으로 갖지 않는다. 이러한 항원은 천연 공급원으로부터 입수될 수 없다. SPA는, 이에 한정되지 않지만, 선천적인 비가교 세균 펩티드 서열을 포함하거나, 또는 전체 합성에 의해 생성될 수 있다. SPA의 예는, 이에 한정되지 않지만 화합물 1, 2 및 3, 또는 여기에 개시된 모노SPA 및 폴리SPA를 포함하고, 이것은 합성 펩티드글리칸(PGNs)이다.
본 발명에 의해 포함되는 SPA는, 이에 한정되지 않지만 여기에 개시된 SPA를 포함하고 추가의 치환기를 더욱 포함할 수도 있다. 그러나, 이러한 치환기는 여기에 개시된 면역 반응을 조절함에 있어서 SPA의 기본적 및 신규의 특징에 현저하게 영향을 미쳐서는 안된고, 여기에 개시된 상응하는 SPA의 효과에 비해 그들의 정량적 효과를 가져서도 안된다.
"탄수화물 코어"는 N-아세틸글루코사미닐-β-[1,4]-N-아세틸무라밀의 β-[1,4]-결합 반복 단위로 이루어진 SPA 탄수화물 중합체를 가리킨다.
"피타닐"은 SPA 직전 합성 전구체의 지질 성분을 가리킨다. 이것은 비분지쇄 말단에 연결 지점이 있고 통상적인 "머리에서 꼬리로(head-to-tail)" (비분지쇄에서 분지쇄로) 배향으로 배열된 4개의 프레닐 단위(C20)를 포함하는 완전 포화된 탄화수소이다.
"말단 기" 또는 "터미네이터": 본 발명의 합성 중합체는 자유 환원 아노머 알콜이 있는 무람산 잔기에서 종결된다. 글루코피라노실 구조인 N-아세틸무라밀 말단을 아릴 아민으로 처리하여 C-1 N-아릴 유도체를 형성하고 아릴 히드라진으로 처리하여 C-1 히드라존을 형성할 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식된다. 또한, 세포용해성 트랜스글리코실라제에 의한 합성 중합체의 제한된 효소적 소화 (예를 들어, 문헌[Dijkstra 등 (1994), Curr. Opin. Struct. Biol. 4:810])는, 얻어지는 아노머 탄소의 화학적 변형을 위해 사용될 수 있는 무라밀-[1,6]-안히드로 결합을 가진 말단을 생성할 것이다.
"스템 펩티드"는 탄수화물 코어의 락틸 카르보닐 (무라밀) 작용기로부터 N에서 C까지 뻗은 펩티드를 가리킨다. 스템 펩티드는 SPA 탄수화물 코어의 무라밀 치환기이다.
"에피토프"는 특이성을 규정하는 항원의 일부, 즉 항원성 결정인자를 의미한다. 에피토프는 예를 들어 펩티드 또는 탄수화물일 수도 있다.
"T-헬퍼(Th) 에피토프"는, MHC 클래스 II의 환경에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL)의 클론 확장 및/또는 B 세포로부터 항체 생성을 유도하는 CD4+ T 세포의 활성화를 유도하는 항원성 결정인자를 의미한다.
"제네릭 Th 에피토프"는, 무차별적이거나 허용적 (제네릭)이며, 대다수의 MHC 클래스 II 일배체형에 의해 제시되어 대다수의 이계교배된 인간 또는 기타 포유동물 집단에서 강력한 CD4+ Th 반응 및/또는 CD8+ CTL 반응 및/또는 항체 생성을 유도할 수 있는 특정한 T 헬퍼(Th) 에피토프-함유 펩티드를 가리킨다.
"표적 에피토프"는 특정한 CD8+ CTL 클론의 확장 및 활성화 ("CTL 에피토프") 또는 B 세포로부터 항체 생성 ("B 세포 에피토프")을 유도하는 항원성 결정인자를 의미한다. CTL 에피토프 및 B 세포 에피토프는 표적 에피토프의 특정한 유형이다.
"가"는 하나의 합성 다당류 항원(SPA)에 함유된, Th 에피토프의 수를 제외한 표적 에피토프의 수를 가리킨다.
"1가"는 SPA의 중합체 주쇄를 따라 하나의 항원성 결정인자 또는 에피토프의 하나 이상의 카피가 제시되는 것을 의미한다.
"다가"는 SPA의 중합체 주쇄를 따라 둘 이상의 상이한 항원성 결정인자 또는 에피토프 각각의 하나 이상의 카피가 제시되는 것을 의미한다.
"1가 합성 다당류 항원" 또는 "모노SPA"는 표적 에피토프의 하나의 종을 함유하도록 변형되어진 하나 이상의 이당류 반복 단위 종을 제시하는 SPA로서 정의된다. 항원성 결정인자 또는 에피토프는 단일 SPA 분자 내에 여러 개의 카피로 존재할 수도 있다.
"다가 합성 다당류 항원" 또는 "폴리SPA"는 각각 하나의 구별되는 표적 에피토프를 함유하도록 변형되어진 2 이상의 상이한 이당류 반복 단위 종을 제시하는 SPA로서 정의된다. 각각의 표적 에피토프는 단일 SPA 분자 내에 하나 이상의 카피로 존재할 수도 있다. 폴리SPA는 2 이상의 상이한 표적 에피토프를 포함한다.
"제약학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 비교적 비독성, 무기 및 유기 산 부가 염, 및 염기 부가 염을 가리킨다. 이러한 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 동안에 동일 반응계에서 제조될 수 있다. 특히, 산 부가염은, 자유 염기 형태의 정제된 화합물을 적절한 유기 또는 무기 산과 별도로 반응시키고 이렇게 형성된 염을 단리시킴으로써 제조될 수 있다. 산 부가염의 예는, 이에 한정되지 않지만 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 설페이트, 비설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 발레레이트, 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락티오비오네이트, 술페메이트, 말로네이트, 살리실레이트, 프로피오네이트, 메틸렌-비스-β 히드록시나프토에이트, 겐티세이트, 이세티오네이트, 디-p-톨루오일타르트레이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 시클로헥실술파메이트 및 퀴나테스라우릴술포네이트 염 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌[S.M.Berge 등, "Pharmaceutical Salts", J.Pharm.Sci., 66, 1-19 (1977)] (여기에서 참고문헌으로 포함됨) 참조. 염기 부가염은, 산 형태의 정제된 화합물을 적절한 유기 또는 무기 염기와 반응시키고 이렇게 형성된 염을 단리함으로써 제조될 수 있다. 염기 부가 염은, 이에 한정되지 않지만, 제약학적으로 허용가능한 금속 및 아민 염을 포함한다. 적절한 금속 염은 소듐, 포타슘, 칼슘, 바륨, 아연, 마그네슘 및 알루미늄 염을 포함한다. 특별한 예에서, 금속 염은 소듐 및 포타슘 염이다. 적절한 무기 염기 부가 염은 이에 한정되지 않지만 수소화나트륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화알루미늄, 수산화리튬, 수산화마그네슘, 수산화아연을 포함하는 금속 염기로부터 제조된다. 적절한 아민 염기 부가 염은 안정한 염을 형성하기 위해 충분한 염기성을 가진 아민으로부터 제조되고, 낮은 독성 및 의학적 용도를 위한 허용성 때문에 의약 화학에서 종종 사용되는 아민, 예를 들어 이에 한정되지 않지만 암모니아, 에틸렌디아민, N-메틸-글루카민, 리신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 프로카인, N-벤질펜에틸아민, 디에틸아민, 피페라진, 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 테트라메틸암모늄 히드록시드, 트리에틸아민, 디벤질아민, 에펜아민, 데히드로아비에틸아민, N-에틸피페리딘, 벤질아민, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 에틸아민, 염기성 아미노산, 예를 들어 리신 및 아르기닌, 및 디시클로헥실아민 등을 포함한다.
"실질적으로 순수한"이란 약 90% 내지 약 100%, 또는 이 사이의 퍼센트 범위의 순도를 가리키고; 예를 들어 "실질적으로 순수한"은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%의 순도, 또는 2개의 퍼센트에 의해 정의된 범위 내에 있는 어떠한 순도일 수도 있다. 예를 들어, "실질적으로 순수한"은 약 95% 내지 약 100% 또는 약 97% 내지 약 100% 순도일 수도 있다. 본 발명의 화합물은, 천연 세균 공급원으로부터 단리된 펩티도글리칸의 제조에서 통상적으로 존재하는 면역조절 활성을 가진 다른 분자를 포함하여 대부분의 생물학적 오염물을 갖지 않은, 실질적으로 순수하거나 단리된 형태로 수득될 수 있다.
"아주반트"는 면역원과 조합될 때 면역원에 대해 면역 반응을 증진시키는 물질이다.
용어 "생체마커"는 약물의 투여와 상관되는 특정한 활성의 마커를 의미한다. 생체마커의 비제한적 예는 세포 표면 수용체, 가용성 매개인자, mRNA 메시지, 또는 조절되고 측정될 수 있는 생체내 반응을 포함한다.
"유효량"은 바람직하거나 지시된 면역학적 또는 치료적 효과를 일으키기 위해 효과적인 본 발명의 화합물 또는 조성물의 양을 가리킨다.
용어 "환자" 또는 "피험자"는 인간 및 기타 영장류: 이에 한정되지 않지만 고양이, 개, 설치류, 말, 소, 양, 돼지, 염소; 가금류 등을 포함하는 반려 동물, 동물원 동물 및 농장 동물을 포함하는 포유동물 및 기타 동물을 가리킨다.
항원 비특이적 SPA
항원 비특이적 SPA는 WO 2005/035588호 및 WO 2003/075953호 (이들의 전체내용이 여기에서 참고문헌으로 포함된다)에 기재되어 있다. 이들은 선형, 비가교 중합체이고, 다양한 유형의 단독중합체 및 공중합체를 포함한다. 이러한 중합체는 화학-효소적 총 합성을 통하여 예를 들어 N-아세틸-글루코사민으로부터 평가될 수 있다. 또한, 그들의 구조에 의존하여, 화학식 1의 화합물은 염증성 또는 항-염증성일 수 있다.
화학식 1의 선형, 비가교 중합체는 n개의 독립적인 단량체 단위 Ym을 포함한다.
Figure 112007082550753-PCT00010
상기 식에서, X1 및 X2는 독립적으로 H 또는 터미네이터이다.
중합체에서 단량체 단위 Ym의 수를 나타내는 아래첨자 n은 약 2 내지 약 375 범위의 하나의 정수이거나, 또는 그들 사이의 어느 양이고; 예를 들어 단량체 Ym의 수는 약 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370 또는 365, 또는 이들 사이의 어느 양, 또는 여기에 정의된 2개의 값에 의해 정의된 범위의 어느 양일 수도 있다. 비환원 말단으로부터 환원 말단까지 순차적으로 중합체에서 특정한 단량체 단위 Ym의 위치를 나타내는 위첨자 m은 1 내지 n의 일련의 정수이다. 비제한적 예에서, n=2일때, 2개의 단량체 단위: Y1 및 Y2가 존재하고; n=3일 때, 3개의 단량체 단위: Y1, Y2 및 Y3가 존재하고; 또는 n=375일 때, 375개의 단량체 단위: Y1, Y2, Y3, … ,Y374 및 Y375가 존재한다. Y1은 X1에 직접 부착되는 반면, Yn는 X2에 직접 부착된다.
각각의 단량체 단위 Ym (즉, Y1, Y2, … , Yn -1 및 Yn의 각각)는 이들이 모두 동일하거나, 모두 상이하거나 또는 이들의 조합이 되도록 독립적으로 선택된다. 따라서, 본 발명은 단독중합체 (즉, 모든 단량체가 동일하다) 및 공중합체 (즉, 2개 이상의 상이한 단량체)를 포함한다. 공중합체는 WO 2005/035588호 (여기에서 참고문헌으로 포함됨)에 정의된 바와 같이 랜덤 공중합체, 블록 공중합체 또는 교대 공중합체일 수 있다.
화학식 1의 중합체에서, 화학식 Ym의 각각의 단량체 단위는 독립적으로 다음과 같다:
(a) Ym가 Yn이 아닐 때, 화학식 2a의 기,
Figure 112007082550753-PCT00011
상기 식에서, 단량체의 환원 말단은 β 배위로 존재한다; 또는
(b) Ym가 Yn일 때, 화학식 2b의 기,
Figure 112007082550753-PCT00012
상기 식에서, 단량체의 환원 말단은 α 또는 β 배위일 수 있다 (α 배위는 상기 나타낸 것과 같다).
화학식 Ym의 각각의 단량체 단위는 다음과 같이 2개의 독립적인 세트의 변수: Rm 1 및 Rm 2를 포함한다:
세트 1: R1 1, R2 1, R3 1, … , Rn -1 1 및 Rn 1
세트 2: R1 2, R2 2, R3 2, … , Rn -1 2 및 Rn 2
각각의 세트 내에서, 변수들은 모두 동일하거나, 모두 상이하거나 또는 이들 의 조합이 되도록 독립적으로 선택된다. 다시 말해서, R1 1, R2 1, R3 1, … , Rn -1 1 및 Rn 1의 각각이 독립적으로 선택된다. 유사하게, R1 2, R2 2, R3 2, … , Rn -1 2 및 Rn 2의 각각이 독립적으로 선택된다.
각각의 변수 Rm 1 (즉, R1 1, R2 1, R3 1, … , Rn -1 1 및 Rn 1)은 H 또는 저급 알킬일 수도 있고; 각각의 변수 Rm 2 (즉, R1 2, R2 2, R3 2, … , Rn -1 2 및 Rn 2)은 -OH 또는 -NH2, 아미노산 잔기, 또는 2 내지 10개 아미노산 잔기를 포함한 펩티드 또는 이들의 제약학적으로 허용가능한 염일 수도 있고, 여기에서,
(i) 각각의 아미노산 잔기는 독립적으로 D 또는 L 배위로 있고;
(ii) 각각의 아미노산 잔기는 비치환되거나 또는 할로, 알킬, 히드록시, 알콕시, 페녹시, CF3, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, -C(O)O알킬 및 -NO2로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환되고;
(iii) 아미노산 잔기는 α 또는 γ 카르복실 기에서, α 또는 ε 아미노기에서, 또는 이들의 조합에서 독립적으로 결합된다.
염증성 화합물
예를 들어 Ym의 단량체 단위의 하나 이상이 다음과 같은 경우에, 화학식 1의 일부 화합물은 염증 반응을 유도한다:
(a) Ym가 Yn이 아닐 때, 화학식 3a의 기,
Figure 112007082550753-PCT00013
상기 식에서, 단량체의 환원 말단은 β 배위로 존재한다; 또는
(b) Ym가 Yn일 때, 화학식 3b의 기,
Figure 112007082550753-PCT00014
상기 식에서, 단량체의 환원 말단은 α 또는 β 배위일 수 있다 (α 배위는 상기 나타낸 것과 같다).
여기에서,
R1 3, R2 3, … , Rn -1 3 및 Rn 3의 각각은 독립적으로 -OH 또는 -NH2 이고;
R1 4, R2 4, … , Rn -1 4 및 Rn 4의 각각은 독립적으로 -OH 또는 -NH2, 아미노산 잔 기 또는 2 내지 8개 아미노산 잔기를 포함한 펩티드이고, 여기에서,
(i) 각각의 아미노산 잔기는 독립적으로 D 또는 L 배위로 있고;
(ii) 각각의 아미노산 잔기는 비치환되거나 또는 할로, 알킬, 히드록시, 알콕시, 페녹시, CF3, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, -C(O)O알킬 및 -NO2로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환되고;
(iii) 아미노산 잔기는 α 또는 γ 카르복실 기에서, α 또는 ε 아미노기에서, 또는 이들의 조합에서 독립적으로 결합된다.
이러한 염증 화합물은 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기를 갖고 화학식 5의 화합물이라고 일컬어진다. 그의 예는 화합물 2 및 3, 및 GMDP 및 GMDP-A의 중합체를 포함한다.
본 발명의 화학식 5의 화합물의 대표인 화합물 2는 친염증 면역조절제의 예이다. 이 분자는 TLR2를 활성화하고, 인간 PBMC에 의하여 친염증 사이토카인 TNF-α의 생성을 유도한다. 화합물 2의 친염증성 활성은, 세균 유래로부터 단리된 천연 펩티도글리칸의 강력한 염증성 활성에 비해 현저히 적다. 이러한 차이는 세균으로부터 단리된 이종 물질에 존재하는 다수의 생물학적 오염물의 존재 및 활성에 기인할 가능성이 높다.
Figure 112007082550753-PCT00015
하기 구조의 이당류 단량체 GMDP (N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민) 및 GMDP-A (N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-글루탐산)은 염증 반응을 유도하는 것으로 보고되었다 (예를 들어, 미국 특허 4,395,399호 참조).
Figure 112007082550753-PCT00016
유사하게, 중합체 세균 펩티도글리칸의 통상적으로 입수가능한 샘플 (스타필로코쿠스 아우레우스, 시그마; 스트렙토코쿠스 피오게네스, 리 래보러토리즈(Lee Laboratories))은 강력한 염증성이다 (스타필로코쿠스 > 스트렙토코쿠스). 이러한 물질은 조성에서 불균일성인 반면, 더욱 작은 이당류 분절 (그의 일부는 펩티드 가교를 갖는다)은 HPLC에 의해 정제되고 특징화되며, 또한 염증성이다. 이러한 물질의 염증 효력은 구조에 의존되는 것으로 보고되어 있다 [Tuomanen 등, (1993) J.Clin.Invest. 92: 297]. 기록에 따라 생물학적 활성을 갖는 펩티도글리칸의 가장 작은 분절은 무라밀 디펩티드 또는 MDP이고, 그의 생물학적 활성은 염증 성질이다 [Chedid (1983) Microbio. Immunol. 27:723]. 사실상, 하기 나타낸 MDP 및 MDP-A 모티프는 공지된 염증 화합물의 공통된 특징이다.
Figure 112007082550753-PCT00017
최소로, 화학식 1의 화합물은 염증 반응을 유도하기 위해 하기 모티프 중의 하나를 포함해야 한다 (WO 2005/035588, 참고문헌으로 포함됨):
Figure 112007082550753-PCT00018
이러한 모티프가 부재하거나 변형된다면, 중합체는 항-염증 반응을 유도할 수도 있다. 두 번째 아미노산 (D-이소-Glu 또는 D-이소-Gln)이 매달린 카르복실을 잃는다면, 또는 매달린 카르복실이 L 배위로 있다면, 염증성 활성이 없어진다 [Girardin 등, (2003) J. Biol. Chem. 278:8869]. 남아있는 3개의 아미노산 (Lys-D-Ala-D-Ala)의 하나 이상을 첨가하면 활성이 유지된다. 화합물 2는 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 친염증 반응을 일으키는 것으로 밝혀졌다 (WO 2005/035588). 그것의 중합체 구조는 -[NAG-NAM-트리펩티드]n이고, 여기에서 n은 분포가 대략 135를 중심으로 하는 정수이고 트리펩티드는 선천적 세균 서열(Ala-D-iso-Glu-Lys)이다.
화합물 3은 WO 2003/075953의 방법을 사용하여 화학-효소적 전체 합성에 의해 N-아세틸글루코사민으로부터 제조된 다른 친염증 (자극) 합성 세균 펩티도글리칸이다. 그것의 글리칸 주쇄는 β-[1,4]-결합된 N-아세틸글루코사미닐-β-[1,4]-N-아세틸-무라밀 반복 단위로 이루어지고, 여기에서 락틸 치환기 R은 H 또는 저급 (C1-C5) 알킬, 바람직하게는 메틸일 수도 있다. 메틸 또는 저급 알킬 치환기는 바람직하게는 D 배위이다.
Figure 112007082550753-PCT00019
이러한 유형의 분자는 약 130-180개 반복 단위 (n=130-180)를 중심으로 하는 분자량 분포로서 존재한다. 중합체는 물 또는 염수에 가용성인 흡습성 백색 분말이다. 각각의 이당류 반복 단위에 부착된 스템 펩티드는 약 1 내지 약 5개 아미노산을 함유할 수 있다. 위치 1은 알라닌, 알라닌의 저급 알킬 (C1-C5) 동족체, 또는 글리신에 의해 차지될 수 있고; 예를 들어 이에 한정되지 않지만 알라닌 또는 그의 동종체는 α-탄소에서 L-배위로 있다. 위치 2는 글루탐산 또는 글루타민에 의해 차지될 수도 있고; 이러한 아미노산은 α-탄소에서 D-배위일 수도 있고, 1차 아미드일 수도 있는 아미드는 이소 (비단백질) 위치에 있을 수도 있다. 보존적 아미노산 치환은 위치 1 및 2 (락틸 카르보닐로부터 N 내지 C)에서 계획된다. 위치 3은 천연 또는 비천연 α-아미노산에 의해 차지될 수도 있고; 비제한적 예에서 리신 또는 디아미노피멜산은 위치 3에 있다. 위치 4는 천연 또는 비천연 α-아미노산에 의해 차지될 수도 있고; 비제한적 예에서 위치 4는 D-알라닌에 의해 차지된다. 위 치 5는 천연 또는 비천연 α-아미노산에 의해 차지될 수도 있고, 비제한적 예에서 위치 5는 D-알라닌이다. 화합물 3은 자극 (친염증) 합성 펩티도글리칸의 펩티드-최소 예를 나타낸다.
항-염증 화합물
반대로, 예를 들어 단량체 단위 Ym이 상기 정의된 바와 같이 화학식 2a 및 화학식 2b의 기로부터 선택된다면, 화학식 1의 화합물의 일부는 항-염증 반응을 유도하고, 단 단량체 단위는 (a) Ym가 Yn이 아닐 때 화학식 3a (상기 정의됨)의 기, 또는 (b) Ym이 Yn일 때 화학식 3b (상기 정의됨)의 기가 아니다.
이러한 항-염증 화합물은 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기를 포함하지 않고, 화학식 4의 화합물로서 언급된다. 화합물 1은 화학식 4의 항-염증 화합물의 예이다. 화합물 1이 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기를 갖지 않는다는 것을 제외하고는, 화합물 1은 화합물 2와 동일한 구조를 갖는다는 것을 주목해야 한다.
화합물 1은 항-염증 면역조절제이다. 이것은 표시된 반복 단위의 단독중합체이고 약 150 킬로달톤을 중심으로 한 분자량의 분포로서 존재한다. 중합체는 물 또는 염수에서 가용성인 흡습성 백색 분말이다.
또한, 화합물 1은 다수의 생물학적 체계에서 항-염증 반응을 일으키는 것으로 밝혀졌다 (WO 2005/035588, 여기에서 참고문헌으로 포함된다). 이 분자는, 두 번째 아미노산이 매달린 카르복실을 잃는 것 이외에는, 화합물 2와 동일하다.
Figure 112007082550753-PCT00020
세균 세포벽에서 천연 펩티도글리칸은, 세포 주기에 걸쳐 세균 세포의 형태를 정확하게 한정하는 하나의 공유 결합된 거대분자이다. 이것은, 반복 단위가 β-[1,4]-결합된 N-아세틸글루코사미닐-β-[1,4]-N-아세틸-무라밀펜타펩티드인 평행한 중합체 펩티도글리칸 글리칸 스트랜드의 견고한 축으로 이루어진다. 글리칸 스트랜드는 나선의 완전한 회전 당 약 4개 반복 단위를 가진 형태의 나선형이다. 더욱 유연한 펜타펩티드 축은 뮤라믹산 잔기의 락틸 카르복실로부터 N에서 C까지 연장된다. 펩티드는 일반적으로 H2N-Ala-D-이소-Glu (또는 이소-Gln)-Lys (또는 디아미노피멜레이트, DAP)-D-Ala-D-Ala-COOH이다. 펩티드는 공여체 스트랜드로부터 수용체 스트랜드의 끝에서 두 번째의 D-Ala의 카르보닐까지 Lys (또는 DAP) 사이에서 가교될 수도 있다. 살아있는 세포에서 실제 가교 정도는 속에 따라 다르고 항상 100% 미만이다. 비교에서, 상기 화합물에서는 펩티드에 가교가 존재하지 않는다.
화학식 1의 화합물의 효과
WO 2005/035588호 (여기에서 전체 내용이 참고문헌으로 포함된다)에 개시된 바와 같이 화학식 1의 화합물을 제조하고 분석하였다. 더욱 특별하게는, 화합물 1은 화학식 6의 화합물의 예로서 제조되는 반면, 화합물 2는 화학식 5의 화합물의 예로서 제조되었다. 크기 배제 크로마토그래피, 1H NMR 분광분석법, 효소 감수성, 질량 분광측정법 또는 이들의 조합에 의하여, 합성된 화합물의 구조적 정체를 결정하였다.
인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 화합물 1로 시험관내 처리하면, 염증 사이토카인 IL2, IFN-γ, TNF-α, IL6 또는 IL12의 무시할만 발현이 얻어지고, 따라서 TLR2를 자극하는데 실패를 나타낸다. 그러나, 우세한 반응은 항-염증 사이토카인 IL-10의 발현이었다. IL-10의 발현은 시간 경과에서 늦은 것으로 관찰되고 5일에 검출가능하고, 8일에 대략 80 pg/ml의 농도까지 계속 상승하였다. 이러한 결과는, 화학식 6의 화합물이 PBMC 세포 배양물에서 IL-10의 발현을 선택적으로 유도할 수 있고, 동물 염증 모델에서 효능적일 수도 있고, 다양한 유형의 염증 병변을 치료한다는 것을 나타내었다.
시험관내 모델 체계에 의하여, 화학식 6의 화합물이 시험관내에서 친염증 사이토카인을 위한 전사 인자인 NK-κB를 활성화할 수 있는지의 여부를 결정하였다. 통상적으로 입수가능한 천연 펩티도글리칸의 다양한 농도가 HEK293 세포에서 루시퍼라제 NF-κB 리포터의 상당한 유도를 자극하는 반면, 화합물 1은 500 ㎍/ml 이하의 농도에서 루시퍼라제 NF-κB 리포터 활성화의 부족을 나타내었다. 이러한 결과는, 천연 펩티도글리칸과는 달리, 화합물 1이 TLR2를 통해 루시퍼라제 NF-κB 리포 터의 활성화를 유도하지 않는다는 것을 나타내었다. 추가의 실험은, 화합물 1이 다른 TLR 수용체에 의해 신호를 받는 루시퍼라제 NF-κB 리포터를 이끌어내지 않는다는 것을 나타내었다.
특정한 클러스터 분화 마커의 발현 수준을 사용하여, 화합물 1과 함께 배양된 수지상 세포의 성숙 상태를 추적하였다. 데이타는, 화합물 1과의 배양이 미성숙 수지상 세포 상태로부터 착색 프로파일을 변화시키지 못한다는 것을 밝혀내었으며, 이것은 이러한 화합물이 수지상 세포의 성숙에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
화합물 1에 의해 유도된 DC의 성숙 억제가, 화학식 6의 화합물과 같은 고 분자량 면역조절 다당류 항원을 세포내이입하는 무능력에 기인한 것인지의 여부를 평가하기 위하여, 화합물 1의 형광 유도체 및 공촛점 현미경을 사용하여 흡수 연구를 수행하였다. 화합물 1의 세포내 국소화는, 내면화된 중합체가 세포질 전체에 걸쳐 분산되지 않고, 그 대신 세포내이입 공포에서의 존재와 일치하여 별개의 패킷 또는 소포에 국소화된다는 것을 나타내었다. 또한, 미성숙 DC는 형광 표지된 화합물 1을 빠르게 세포내이입할 수 있고, DC의 성숙을 유발하는 분자의 무능력은 세포내이입 흡수에 대한 저항에 기인하지 않는다는 것이 밝혀졌다.
미성숙 DC의 성숙을 방해하는 화학식 6의 화합물의 능력을 또한 검사하였다. 결과는, 화합물 1이 iDC의 LPS-유도 성숙을 방해할 수 있다는 것을 보여주었다. 구체적으로, 화합물 1의 존재하에서 공동-자극 마커 CD86의 표면 발현이 저하되는 반면, 시험된 다른 마커들은 필수적으로 변화되지 않았다. 추가의 실험은, 공동- 자극의 다른 마커인 CD80이 또한 저하됨을 증명하였다. 따라서, DC 표면에 대한 공동자극 마커의 발현에 영향을 미칠 수 있는 화학식 6의 화합물의 능력은, 면역허용 DC의 유도에 있어서 이러한 유형의 분자를 위한 작용 메카니즘을 제안한다. 이어서, 무력한 DC가 직접적으로 또는 Treg 세포 집단의 활성을 통하여 T-세포 무력증을 유도할 수 있다.
또한, 피토헤마글루티닌(PHA)과 같은 다클론 미토겐 또는 스타필로코쿠스 아루레우스 엔테로톡신 A (SEA)과 같은 초항원으로 처리된 조절 배양물에 비교할 때, 화학식 1로 처리된 인간 PBMC 배양물은 증식에 의해 반응하지 않는다는 것이 밝혀졌다 (실시예 3 참조). 그러나, 화합물 2와 인간 PBMC의 배양은 친염증 사이토카인 TNF-α 의 인지 및 생성을 가져온다 (실시예 3 참조). 더욱이, 화합물 1-처리된 PBMC 배양물을 항-CD3 항체로 자극할 때, 비처리 대조군의 비하여, 배양물의 증식 능력이 현저하게 억제되었다. 또한, 마이크로어레이 분석은, 화합물 1 및 항-CD3 항체로 처리된 PBMC 배양물이 CD3+ T 세포 집단에서 IL-10 및 IL19 (IL-10 파라로그) 메시지의 발현을 선택적으로 상향조절하는 반면, IL17 및 TNFb와 같은 몇몇 염증성 사이토카인 메시지를 하항조절한다는 것을 드러내었다.
이러한 데이타들은, 함께 고려될 때, 화합물 1과 같은 화학식 4의 화합물이 수지상 세포의 성숙을 억제한다는 것을 나타낸다. 화학식 6의 화합물로 처리한 후에 PBMC 배양물에 존재하는 CD4+CD25+ 세포의 수 증가는, 이러한 화합물이 배양물 내에서 T 조절 세포의 자극을 유도하는 미성숙 APC의 집단을 생성한다는 것을 나타내었다. 이것은 화합물 1로의 처리 후에 항-CD3 항체로 자극된 PBMC 배양물 중에 서 T 세포의 증식 억제를 관찰함으로써 뒷받침되었다. 미성숙 수지상 세포는 Treg 세포의 발생을 유도하는 특유의 능력을 갖는다. 이어서, 세포-세포 신호화를 통해서뿐만 아니라 염증 부위에서 무력화된 T 세포로부터 IL-10 발현의 자극을 통해서, Treg 세포가 염증 반응의 억제에 참여할 수도 있다.
시험관내에서 억제 기능뿐만 아니라 인간 PBMC로부터 IL-10의 후기 생성을 가진 Treg 세포를 유도하여, 생체내 농양의 염증 형성에 대해 동물을 보호하는 화합물 1의 능력을 평가하였다. 결과는, 화합물 1이 다양한 용량에서 농양의 형성에 대한 상당한 보호를 일으킨다는 것을 나타내었다. 보호된 동물은 항원 투여의 유해한 효과를 나타내지 않으며, 염증 또는 패혈증의 공통적인 증상인 열 및 기면 징후를 있다 하더라도 거의 갖지 않는다. 또한, 화합물 1로 처리된 쥐에서 수술후 유착 형성이 상당히 제한되었으며, 이것은 이러한 다당류 항원이 위중한 수술에 의해 유도된 유착의 형성으로부터 쥐를 효과적으로 보호한다는 것을 나타내고, 화학식 6의 화합물은 생체내에서 항-염증 효과를 유도한다는 것을 제안한다.
화학식 6의 화합물과 같은 면역 조절제의 안전성 및 효능의 임상 평가는 편리한 생체마커를 필요로 한다. 따라서, 피부에서 국소화 염증 반응을 제한하기 위한 화학식 6의 화합물의 능력을 평가하기 위하여, 지연된 유형 과민성(DTH)의 기니 피그 모델이 개발되었다. 염증 T 세포 활성을 이끌어내기 위해 사용되는 항원은 칸디다 알비칸스(Candida albicans) (캔딘(Candin))로부터 유래된다. 대조 동물에 비하여, 화학식 1로 처리된 동물에서 발적 부위의 감소가 관찰되었다.
수득된 결과는 면역 체계에 의한 세균 펩티도글리칸의 인식을 특징화하는 문 헌의 본문과 직접적으로 대조된다. 또한, 화학식 6의 화합물에 의한 항-염증 반응의 자극은, 천연 펩티도글리칸에 관한 현재의 증거에 비추어 볼 때, 완전히 새롭고 예측되지 못한 것이며, 이것은 세균 펩티도글리칸이 강력한 염증 작인임을 나타낸다. 따라서, 천연 펩티도글리칸이 강력한 염증성인 반면, 화학식 6의 화합물은 항-염증성이다. 화학식 6의 화합물이 시험관내에서 항-염증성 활성을 나타낸다는 연구결과는, 정제된 세균 펩티도글리칸의 활성에 관해 이전의 공개된 관찰 내용과 현저히 대조된다.
TLR2를 자극하지 못하는 화합물 1과는 대조적으로, 화합물 2 및 화합물 3은 TLR2를 결합하고 자극하며, 이것은 인간 PBMC에 의한 친염증 사이토카인 TNF-α의 생성을 유도한다. 따라서, 화합물 1과 화합물 2 및 3 간의 구조적 차이가 세균 펩티도글리칸에서 기본적인 구조/생물학적 활성 관계를 나타내는 것으로 보인다. 따라서, 화합물 2 및 화합물 3은 인간 또는 기타 포유동물 면역요법에서 아주반트로서 작용하기 위해 필요한 특징을 갖지만, 화합물 1은 이러한 효과가 억제되고 아주반트 응용을 위해 금기된다.
화학식 6의 합성 다당류 항원의 작용 메카니즘 : T 조절 세포 가설
화학식 1의 화합물의 효과 연구로부터, 화학식 6의 합성 다당류 항원의 작용 메카니즘이 분명해지고 이것을 도 1에 요약한다. 화학식 6의 합성 면역조절 다당류 항원은 수지상 세포의 성숙을 억제한다. 미성숙 수지상 세포(iDC)는 낮은 CD80 및CD86 공동-자극 분자를 발현한다. 이러한 상태에서, iDC는 선천적 T 세포와 상호작용하는 특유의 능력을 갖고 있으며, CD4+CD25+Treg 세포의 발생을 유도한다 (경로 B). 면역 반응에도 불구하고, Treg 세포는 세포-세포 의존성 접촉을 통해 T 효과기 세포와 상호작용하고 이러한 T 염증 효과기 세포의 증식 능력을 억제한다. 또한, Treg 세포와 T 효과기 세포 간의 접촉은 효과기를 더욱 무력하게 만들고 다량의 IL-10을 발현하기 위하여 이러한 세포를 자극한다. 전자의 염증 T 세포 효과기에서 IL-10 발현의 유도는, 직접적인 Treg 세포 접촉의 억제 효과를 증폭시키고 진행 중인 염증 과정에 대한 보호를 확대시키는 역할을 한다. 본 연구자에 의해 관찰된 수지상 세포의 성숙 억제는, 2개의 세포 유형 사이에서 동족 상호작용의 부족을 통해 T 효과기 세포의 클론 확장을 억제할 수 있다 (경로 A). 그러나, 더욱 강제적으로, 이러한 데이타는 T 조절 세포가 본 발명의 화학식 6의 합성 다당류 항원에 의해 궁극적으로 생성되고 염증 병변에 대한 보호를 부여한다는 가설을 뒷받침한다.
화학식 5의 합성 다당류 항원의 작용 메카니즘 : 염증 가설
화합물 2 및 3으로 예시되는 화학식 5의 화합물은 TNF-α의 생성에 의해 증명되는 바와 같이 염증 반응을 자극하는 것으로 보인다. 화합물 2 및 3은 전체 세균 또는 세균 세포벽 항원과 유사한 방식으로, 가장 적당하게는 TLR2의 활성화를 통하여 면역 세포와 상호작용할 수도 있다. 이러한 경우에, 화학식 5와 TLR2-보유 세포 간의 상호작용은 염증의 특징적인 마커를 자극한다. 이것은, 침습 병원체의 검출 후의 경우에서와 같이, 염증 세포가 활동하기 시작한다는 것을 제안한다. 이러한 개념을 도 2에 요약한다.
항원-특이적 SPA
상기 기재된 항원 비특이적 SPA는 비특이적 방식으로 염증 반응을 활성화하거나 억제하는 역할을 한다. 이러한 유형의 활성화 또는 억제가 대 다수의 T 세포에 영향을 미치는 반면, 특이적 T 세포 집단을 표적화함으로써 특이적 염증 반응을 억제하거나 활성화하기 위해서는 더욱 표적화된 접근법이 바람직할 수도 있다. 염증의 표적화 활성화 또는 억제를 제공하기 위하여, 상기 기재된 화학식 5 및 6의 화합물의 구조를 기초로 하여 특이적 SPA가 개발되었다. 억제성 SPA는 화학식 6의 화합물을 기초로 하여 TLR2 결합 도메인 및 표적 에피토프를 포함한다. 친염증성 SPA는 화학식 6의 화합물을 기초로 한 TLR2 결합 도메인, 표적 에피토프, 및 염증 반응을 증폭시키는 Th 헬퍼 에피토프를 포함한다.
친염증성 모노SPA 및 폴리SPA
본 발명에 따른 합성 친염증성 SPA는
아주반트 기능을 공급하고, 제1 에피토프와 제2 에피토프가 각각 공유 부착되는 당펩티드 주쇄를 제공하는, TLR2-표적화 합성 PGN 잔기 (도 3 내지 6, 박스);
하나 이상의 제네릭 T 헬퍼 에피토프를 포함하는 제1 에피토프;
하나 이상의 표적 에피토프를 포함하는 제2 에피토프
를 포함하고, 첫 번째와 제2 에피토프는 SPA 내에서 하나 이상의 카피 각각에 존재하고,
여기에서 각각의 표적 에피토프는 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기일 수도 있고, 각각의 표적 에피토프는 CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원, 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염이다.
친염증성 SPA의 특정한 예를 도 3 내지 6에 개략적으로 나타내었으나 어떠한 방식으로도 제한적임을 의미하지 않는다.
비특이적 SPA와 유사하게, SPA는 화학식 7의 선형, 비가교 중합체 화합물 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염이다.
X1-[-MO-]w-X2
상기 식에서,
X1 및 X2는 독립적으로 H 또는 터미네이터이고;
W는 중합체에서 단량체 단위(MO)의 수를 나타내고, 약 10 내지 약 375 범위의 정수 또는 이들 사이의 양일 수도 있고; 예를 들어, W는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370 또는 375, 또는 이들 사이의 어느 양, 또는 여기에 한정된 2개의 값에 의해 한정된 범위의 어느 양일 수도 있다. 추가의 비제한적 예에서, W는 약 130 내지 약 180 범위 또는 이들 사이의 어느 양에 놓인 분포 중심으로서 설명될 수도 있다;
단량체 단위 MO는
비치환 반복 단위 (UR; 예를 들어 도 3 내지 6 참조);
Th 에피토프 반복 단위의 하나 이상의 종 (ThR; 예를 들어 도 3 및 5 참조); 및
표적 에피토프 반복 단위의 하나 이상의 종 (TR; 예를 들어 도 3 및 5 참조)을 포함한다.
대안적으로, ThR의 하나 이상의 종 및 TR의 하나 이상의 종을 조합된 Th/표적 에피토프 반복 단위의 하나 이상의 종으로 대체할 수도 있다 (Th/TR; 예를 들어 도 4 및 6 참조).
친염증성 SPA는 SPA 분자의 ThR 또는 Th/TR 종에 약 1 내지 약 180개, 또는 이들 사이의 어느 양의 상이한 Th 에피토프를 포함할 수도 있다. 각각의 에피토프는 "(Th 에피토프)n"로 명명된다 (도 3 내지 6 참조). 예를 들어, SPA 분자의 ThR 또는 Th/TR 종에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 상이한 Th 에피토프, 또는 이들 사이의 어느 양, 또는 여기에 개시된 2개의 양에 의해 한정된 범위의 어느 양이 존재할 수도 있다. 다양한 유형의 Th 에피토프가 본 발명에 의해 의도되고, 적절한 에피토프의 비제한적인 예는 본 발명에서 이후에 설명된다. 당업자라면, Th 에피토프의 수가 경우에 따라서 ThR 또는 Th/TR의 수를 결정할 것임을 인식할 것이다. 예를 들어, 어느 방식으로도 본 발명을 제한할 것을 원하지 않지만, 4개의 상이한 Th 에피토프가 사용된다면, 에피토프는 (Th 에피토프)1, (Th 에피토프)2, (Th 에피 토프)3 및 (표적 에피토프)4로 명명되고, 다시 말해서 4개의 상이한 ThR 종은 ThR1 ((Th 에피토프)1 보유), ThR2 ((Th 에피토프)2 보유), ThR3 ((Th 에피토프)3 보유) 및 ThR4 ((Th 에피토프)4 보유)로 명명된다.
친염증성 SPA 내 표적 에피토프의 수는 Th 에피토프의 수와 무관하다. 따라서, SPA는 SPA 분자의 TR 또는 Th/TR 종에 약 1 내지 약 180개, 또는 이들 사이의 어느 양의 상이한 표적 에피토프를 포함할 수도 있다. 각각의 에피토프는 "(표적 에피토프)n"로 명명된다 (도 3 내지 6 참조). 예를 들어, SPA 분자의 TR 또는 ThR 종에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 상이한 표적 에피토프, 또는 이들 사이의 어느 양, 또는 여기에 개시된 2개의 양에 의해 한정된 범위의 어느 양이 존재할 수도 있다. 펩티드 또는 탄수화물, CD8+ T 세포 또는 B 세포 에피토프 또는 이들의 조합을 포함하여 다양한 유형의 표적 에피토프가 본 발명에 의해 의도되고, 적절한 에피토프의 비제한적인 예는 본 발명에서 이후에 설명된다. 당업자라면, 표적 에피토프의 수가 경우에 따라서 TR 또는 Th/TR의 수를 결정할 것임을 인식할 것이다. 예를 들어, 어느 방식으로도 본 발명을 제한할 것을 원하지 않지만, 3개의 상이한 표적 에피토프가 사용된다면, 에피토프는 (표적 에피토프)1, (표적 에피토프)2, 및 (표적 에피토프)3로 명명되고, 다시 말해서 3개의 상이한 TR 종은 TR1 ((표적 에피토프)1 보유), TR2 ((표적 에피토프)2 보유) 및 TR3 ((표적 에피토프)3 보유)로 명명된다.
단일 종의 표적 에피토프가 존재할 때, 도 3 및 도 4에 나타낸 것과 같이, SPA는 1가 SPA 또는 모노SPA이다. 표적 에피토프의 하나 이상의 종이 존재할 때, 도 5 및 6에 나타낸 것과 같이, SPA가 다가 SPA 또는 폴리SPA이다.
Th 에피토프 대 표적 에피토프의 최적 비율은 부당한 실험 없이 경험적으로 결정된다.
단량체 단위의 각각의 종은 아래첨자 (x, yn, zn 또는 ynzn)로 표시되는 주어진 몰 분율로 SPA 내에서 존재한다. 예를 들어, 0.6의 몰 분율은 주어진 단량체 단위가 SPA 내에서 반복 단위의 60%로서 존재한다는 것을 나타낸다. 비치환 반복 단위(UR)의 몰 분율의 표시는 x이고; 예를 들어, x=0.4이라면, UR은 SPA 내 단량체 단위의 40%로서 존재한다. Th 에피토프 반복 단위(ThR) 종의 몰 분율의 표시는 yn이고; 예를 들어, yn=0.15라면, ThR의 n번째 상이한 종은 SPA 내 단량체 단위의 15%로서 존재한다. 표적 에피토프 반복 단위(TR) 종의 몰 분율의 표시는 zn이고; 예를 들어, zn=0.20이라면, TR의 n번째 상이한 종은 SPA 내 단량체 단위의 20%로서 존재한다. 조합된 Th/표적 에피토프 반복 단위(Th/TR) 종의 몰 분율의 표시는 ynzn이 고; 예를 들어, ynzn=0.17이라면, Th/TR의 n번째 상이한 종은 SPA 내 단량체 단위의 17%로서 존재한다.
당업자라면, 몰 분율의 합계가 1.00과 같아야 하고, 다시 말해서 x + y + y1 + y2 + … + yn + z + z1 + z2 + … + zn (경우에 따라서) = 1.00이어야 한다는 것을 인지할 것이다. 다양한 반복 단위의 효소 중합 비율이 치환에 따라 거의 적게 변하게 때문에, UR, ThR, TR 및/또는 Th/TR은 조성물에서 각각의 몰 분율에 따라 중합체의 탄수화물 축을 따라서 고르게 분포된다. UR, ThR, TR 및/또는 Th/TR은 공중합체의 무작위한 형성 성질의 결과로서 다당류 내에서 임의의 순서로 존재할 수도 있다는 것을 주목한다.
상기 기재된 값들의 관계를 예증하기 위하여, 하기 비제한적 예가 제시된다: 총 50개의 단량체 단위를 포함하는 SPA 중합체 (즉, W=50). SPA 중합체는 2개의 Th 에피토프 ((Th 에피토프)1 및 (Th 에피토프)2) 및 4개의 표적 에피토프 ((표적 에피토프)1, (표적 에피토프)2, (표적 에피토프)3 및 (표적 에피토프)4)를 갖고; 따라서 중합체는 1개 종의 UR, 2개 종의 ThR 및 4개 종의 TR을 포함한다. UR의 몰 분율 (즉, x)이 0.4라면; (Th 에피토프)1를 보유하는 ThR의 몰 분율 (즉, y1)은 0.08이고; (Th 에피토프)2를 보유하는 ThR의 몰 분율 (즉, y2)은 0.12이고; (표적 에피토프)1를 보유하는 TR의 몰 분율 (즉, z1)은 0.10이고; (표적 에피토프)2를 보 유하는 TR의 몰 분율 (즉, z2)은 0.06이고; (표적 에피토프)3를 보유하는 TR의 몰 분율 (즉, z3)은 0.06이고; (표적 에피토프)4를 보유하는 TR의 몰 분율 (즉, z1)은 0.18이고; 중합체는 40% UR, 8% ThR1, 12% ThR2, 10% TR1, 6% TR2, 6% TR3 및 18% TR4을 포함할 것이다 (즉, 20개 UR 단량체, 4개 ThR1 단량체, 6개 ThR2 단량체, 5개 TR1 단량체, 3개 TR2 단량체, 3개 ThR3 단량체 및 9개 TR4 단량체).
다른 일례의 비제한적 예는 총 100개의 단량체 단위를 포함하는 SPA 중합체이다 (즉, W=100). SPA 중합체는 3개의 Th 에피토프 ((Th 에피토프)1, (Th 에피토프)2 및 (Th 에피토프)3) 및 2개의 표적 에피토프 ((표적 에피토프)1 및 (표적 에피토프)2)를 갖고; 중합체는 1개 종의 UR 및 6개 종의 Th/TR을 포함한다. UR의 몰 분율 (즉, x)이 0.35라면 (Th 에피토프)1 및 (표적 에피토프)1을 보유하는 Th/TR의 몰 분율 (즉, y1z1)은 0.13이고; (Th 에피토프)1 및 (표적 에피토프)2을 보유하는 Th/TR의 몰 분율 (즉, y1z2)은 0.04이고; (Th 에피토프)2 및 (표적 에피토프)1을 보유하는 Th/TR의 몰 분율 (즉, y2z1)은 0.15이고; (Th 에피토프)2 및 (표적 에피토프)2을 보유하는 Th/TR의 몰 분율 (즉, y2z2)은 0.20이고; (Th 에피토프)3 및 (표적 에피토프)1을 보유하는 Th/TR의 몰 분율 (즉, y3z1)은 0.08이고; (Th 에피토프)3 및 (표적 에피토프)2을 보유하는 Th/TR의 몰 분율 (즉, y3z2)은 0.05이고; 중합체는 35% UR, 13% Th1/TR1, 4% Th1/TR2, 15% Th2/TR1, 20% Th2/TR2, 8% Th3/TR1, 및 5% Th3/TR2 (즉, 35개 UR 단량체, 13개 Th1/TR1 단량체, 4개 Th1/TR2 단량체, 15개 Th2/TR1 단량체, 20개 Th2/TR2 단량체, 8개 Th3/TR1 단량체, 및 5개 Th3/TR2)를 포함할 것이다.
본 발명의 항원-특이적 친염증성 SPA는 공중합체이다 (즉, 2개 이상의 상이한 단량체). 다양한 단량체 단위 (UR, ThR, TR 및/또는 Th/TR)의 효소 중합 속도는 거의 변하지 않고, 따라서 SPA 공중합체의 길이를 따라서 조성물 내의 개개의 몰 분율에 따라서 단량체가 고르게 분포될 수도 있다. 당업자라면, 도 3 내지 6이 SPA 내에서 특정한 순서로 단량체를 도시하고 있지만, 단량체들이 무작위 중합 성질의 결과로서 공중합체 내에 임의의 순서로 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 공중합체는 랜덤 공중합체, 블록 공중합체 또는 교대 공중합체일 수도 있다. 예를 들어, 제한적인 것은 아니라, UR, 1개 종의 TR (TR1) 및 1개 종의 ThR (ThR1)을 포함하는 SPA에 대해서 중합체 유형은 다음을 포함할 수도 있다.
중합체 유형 예
랜덤 공중합체* X1-UR-ThR1-TR1-ThR1-UR-TR1-TR1-ThR1-UR-TR1-X2
블록 공중합체** X1-UR-UR-UR-ThR1-ThR1-ThR1-TR1-TR1-TR1-X2
교대 공중합체* X1-UR-ThR1-TR1-UR-ThR1-TR1-UR-ThR1-TR1-X2
* 공중합체의 길이는 나타낸 것과 같이 변할 수도 있다;
** "블록"의 각각은 다양한 길이일 수도 있고; 공중합체 전체에 걸쳐 반복될 수도 있고; 이 공중합체의 길이는 나타낸 것과 같이 변할 수도 있다.
본 발명의 친염증성 모노SPA 및 폴리SPA는 뚜렷한 유형의 β-[1,4]-결합 N-아세틸글루코사미닐-β-[1,4]-N-아세틸무라밀 펩티드 반복 단위로 이루어진 랜덤 선형 공중합체이다. 보존적 치환이 탄수화물 코어에서 의도된다. 예를 들어, 제한적은 아니지만, 락틸 메틸 기는 또한 저급 알킬 (C1-C5) 또는 수소일 수도 있다. 추가의 비제한적 예에서, 알킬 기가 존재할 때 산소-보유 탄소가 D-배위로 존재한다.
일반적으로, 다양한 단량체 단위(MO)는 하기 구조에 의해 설명될 수 있다:
UR
Figure 112007082550753-PCT00021
ThR
Figure 112007082550753-PCT00022
TR
Figure 112007082550753-PCT00023
Th/TR
Figure 112007082550753-PCT00024
단량체 단위의 R 기는 독립적으로 선택될 수도 있고, H 또는 저급 알킬 (C1-C5)일 수도 있다.
비치환 반복 단위 (UR; 예를 들어 도 3 내지 6 참조), Th 에피토프 반복 단위 (ThR; 예를 들어 도 3 및 5 참조), 표적 에피토프 반복 단위 (TR; 예를 들어 도 3 및 5 참조) 및 조합된 Th/표적 에피토프 반복 단위 (Th/TR; 예를 들어 도 4 및 6 참조)의 스템 펩티드는 독립적으로 선택되고, 각각은 약 2개 내지 약 5개 아미노산을 함유할 수도 있다. 스템 펩티드는 천연 또는 비천연 아미노산을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 어떠한 방식으로도 제한하지 않지만, 하기 아미노산이 사용될 수도 있다. 위치 1은 알라닌, 알라닌의 저급 알킬 (C1-C5) 동족체, 또는 글리신에 의해 차지될 수도 있고; 알라닌 또는 그의 동족체를 위하여 α-탄소에서 L-배위가 바람직하다. 글루탐산, 글루타민 또는 저급 알킬 (C1-C5) 글루타민 2차 또는 3차 아미드가 위치 2에 있을 수 있고, 추가의 비제한적 예에서 아미노산을 위하여 D-배 위가 바람직하고, 매달린 아미드는 이소 (비단백질) 위치에 있을 수도 있다. 위치 3은 천연 또는 비천연 α-아미노산에 의해 차지될 수도 있고; 추가의 비제한적인 예에서 리신 또는 디아미노피멜산이 위치 3에 있다. 위치 4는 천연 또는 비천연 α-아미노산에 의해 차지될 수도 있고; 추가의 비제한적인 예에서 위치 4의 아미노산은 D-알라닌이다. 위치 5는 천연 또는 비천연 α-아미노산에 의해 차지될 수도 있고; 추가의 비제한적 예에서 D-알라닌은 위치 5에 있다. 아미노산 잔기는 독립적으로 α 또는 γ 카르복실 기에서, 또는 α 또는 ε 아미노 기에서, 또는 이들의 조합에서 결합될 수 있고, 단 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재한다. 특정한 비제한적 예에서, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기는 위치 2의 아미노산 위에 있다. 또한, 스템 펩티드의 각각의 아미노산 잔기는 비치환되거나 또는 할로, 알킬, 히드록시, 알콕시, 페녹시, CF3, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, -C(O)O알킬 및 -NO2로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수도 있다.
링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택될 수도 있고, 당 기술분야에 공지된 적절한 링커를 포함할 수도 있다. 특정한 예에서, 각각의 링커는 약 1 내지 약 6개 분절 또는 이들 사이의 양을 포함할 수도 있고; 예를 들어 링커는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 분절을 포함할 수도 있다. 제한적인 것은 아니지만, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH- 및 ≡CH-로부터 선택될 수도 있고, 여기에서 R은 저급 알킬이다. 3 내지 6개 분절이 존재하는 경우에, 분절 1 내지 4는 존재할 때 -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택될 수도 있고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않는다. 특정한 비제한적 예에서, 링커 1은 스템 펩티드의 동등한 리신의 측쇄일 수도 있다.
스템 펩티드와 링커 1 간의 연결 (도 3 내지 6 참조)은 각각 스템 펩티드의 아미노산의 어느 하나에서 독립적으로 이루어질 수도 있다. 비제한적인 예에서, 스템 펩티드와 링커 1 간의 연결은 스템 펩티드의 위치 3에서 이루어진다. 링커 1과 링커 2 간의 연결자는 1,4-[1,2,3-트리아졸]일 수도 있거나 [Rostovtsev 등 (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 114: 2708], 또는 이에 한정되지 않지만 티올레이트/말레이미드 [Verez-Bencomo 등, (2004) Science 305:522] 및 아민/알데히드 환원 알킬화 [Slovin 등 (1999) PNAS 96:5710]와 같은 당업자에게 공지된 기타 연결 화학일 수도 있다. 특정한 비제한적인 예에서, 표적 에피토프는 탄수화물이고, 링커 1과 링커 2 간의 연결자는 아민/알데히드 환원 알킬화이다.
표적 에피토프를 위한 스페이서 1은 약 1 내지 약 10 아미노산 길이, 또는 이들 사이의 어느 양일 수도 있고; 예를 들어 스페이서는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 길이일 수도 있다. 아미노산은 당 기술분야에 공지된 어떠한 천연 또는 비천연 아미노산일 수도 있다. 특정한 비제한적인 예에서, 스페이서는 Gly-Ser-Gly-Ser (도 1 내지 6 참조)일 수도 있지만, 그러나 원한다면 스페이서 내의 다른 아미노산을 사용할 수도 있고, 스페이서는 상기 기재된 상이한 길이, 예를 들어 약 2 내지 약 10개 아미노산, 또는 이들 사이의 어느 양, 예를 들어 약 4 내지 약 8개 아미노산, 또는 이들 사이의 어느 양일 수도 있다. 특정한 비제한적인 예에서, 스페이서는 4개 아미노산 길이이다. 스페이서는 N-말단에서 단량체 단위에 연결될 수 있거나 (즉, 그의 α-아미노 기에 의하여), 또는 존재한다면 아미노산의 어느 하나의 측쇄에 있는 ε 아미노기에 의하여 연결될 수 있고; 예를 들어 제한적이 아니지만, 스페이서가 스페이서의 위치 1의 α-아미노 기에서 아미노산에 있는 단량체 단위에 연결된다. 스페이서는 펩티드 결합을 통해 (에피토프가 펩티드라면) 또는 O-결합 글리코실화를 통해 (에피토프가 탄수화물이라면) 표적 에피토프에 연결된다.
Th 에피토프를 위한 스페이서 2는 약 0 내지 약 10개 아미노산 길이 또는 이들 사이의 양일 수도 있고; 예를 들어 스페이서는 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 길이일 수도 있다. 아미노산은 당 기술분야에 공지된 천연 또는 비천연 아미노산일 수도 있다. 특정한 비제한적 예에서, 스페이서는 0개 아미노산 (도 1 내지 6)을 포함하지만, 원한다면 스페이서 내의 다른 아미노산이 사용될 수도 있고, 스페이서는 상기 기재된 것과 상이한 길이, 예를 들어 약 2 내지 약 10개 아미노산, 또는 이들 사이의 어느 양, 예를 들어 약 4 내지 약 8개 아미노산 또는 이들 사이의 어느 양일 수도 있다. 스페이서는 N-말단에서 단량체 단위에 연결될 수 있거나 (즉, 그의 α-아미노 기에 의하여), 또는 존재한다면 아미노산의 어느 하나의 측쇄에 있는 아미노기에 의하여 연결될 수 있고; 예를 들어 제한적이 아니지만, 스페이서가 스페이서의 위치 1의 α-아미노 기에서 아미노산에 있는 단량체 단위에 연결된다. 스페이서는 펩티드 결합을 통해 (에피토프가 펩티드라면) 또는 O-결합 글리코실화를 통해 (에피토프가 탄수화물이라면) Th 에피토프에 연결된다.
본 발명은 또한 Th 에피토프만을 함유하는 친염증성 모노SPA 및 폴리SPA를 의도한다. 이들 특정한 SPA는 강력한 일반적인 아주반트일 수 있다.
억제성 모노SPA 및 폴리SPA
본 발명의 합성 억제성 SPA는 다음을 포함한다:
처리 및 제시를 위해 APC 세포 기구에 대한 접근을 공급하고, 하나 이상의 표적 에피토프가 공유 부착되는 당펩티드 주쇄를 제공하는, TLR2-표적화 합성 PGN 잔기 (도 7 및 8, 박스); 및
SPA 분자 내에서 하나 이상의 카피의 각각에 있는 하나 이상의 표적 에피토프. 표적 에피토프(들)는 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염일 수도 있다.
억제성 SPA의 특정한 예는 도 7 및 8에서 개략적으로 나타내지만, 어떠한 방식으로도 제한적임을 의미하지 않는다.
비특이적 SPA와 유사하게, SPA는 화학식 7의 선형, 비가교 중합체 화합물 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염이다.
<화학식 7>
X1-[-MO-]w-X2
상기 식에서,
X1 및 X2는 독립적으로 H 또는 터미네이터이고;
W는 중합체에서 단량체 단위(MO)의 수를 나타내고, 약 10 내지 약 375 범위의 정수 또는 이들 사이의 양일 수도 있고; 예를 들어, W는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370 또는 375, 또는 이들 사이의 어느 양, 또는 여기에 한정된 2개의 값에 의해 한정된 범위의 어느 양일 수도 있다. 추가의 비제한적 예에서, W는 약 130 내지 약 180 범위, 또는 이들 사이의 어느 양에 놓인 분포 중심으로서 설명될 수도 있다;
단량체 단위 MO는
비치환 반복 단위 (UR; 예를 들어 도 7 및 8 참조); 및
표적 에피토프 반복 단위의 하나 이상의 종 (TR; 예를 들어 도 7 및 8 참조)을 포함한다.
억제 SPA는 SPA 분자의 TR 종에 약 1 내지 약 180개, 또는 이들 사이의 어느 양의 상이한 표적 에피토프를 포함할 수도 있다. 각각의 에피토프는 "(표적 에피토프)n"로 명명된다 (도 3 내지 6 참조). 예를 들어, SPA 분자의 TR 종에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175 또는 180개의 상이한 표적 에피토프, 또는 이들 사이의 어느 양, 또는 여기에 개시된 2개의 양에 의해 한정된 범위의 어느 양이 존재할 수도 있다. 다양한 유형의 표적 에피토프가 본 발명에 의해 의도된다. 적절한 에피토프의 비제한적인 예는 본 발명에서 이후에 설명된다. 당업자라면, 표적 에피토프의 수가 TR 종의 수를 결정한다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 어느 방식으로도 본 발명을 제한할 것을 원하지 않지만, 3개의 상이한 표적 에피토프가 사용된다면, 에피토프는 (표적 에피토프)1, (표적 에피토프)2, 및 (표적 에피토프)3로 명명되고, TR의 각각의 종 위에 각각의 에피토프가 존재하며, 다시 말해서 3개의 상이한 TR 종은 TR1 ((표적 에피토프)1 보유), TR2 ((표적 에피토프)2 보유) 및 TR3 ((표적 에피토프)3 보유)로 명명된다.
단일 종의 표적 에피토프가 존재할 때, 도 7에 나타낸 것과 같이, SPA는 모노SPA이다. 표적 에피토프의 하나 이상의 종이 존재할 때, 도 8에 나타낸 것과 같이, SPA가 폴리SPA이다.
단량체 단위의 각각의 종은 아래첨자 (x 또는 zn)로 표시되는 주어진 몰 분율로 SPA 내에서 존재한다. 예를 들어, 0.6의 몰 분율은 주어진 단량체 단위가 SPA 내에서 반복 단위의 60%로서 존재한다는 것을 나타낸다. 비치환 반복 단위(UR)의 몰 분율의 표시는 x이고; 예를 들어, x=0.4이라면, UR은 SPA 내 단량체 단위의 40%로서 존재한다. 표적 에피토프 반복 단위(TR) 종의 몰 분율의 표시는 zn 이고; 예를 들어, zn=0.20이라면, TR의 n번째 상이한 종은 SPA 내 단량체 단위의 20%로서 존재한다.
당업자라면, 몰 분율의 합계가 1.00과 같아야 하고, 다시 말해서 x + y + y1 + y2 + … + yn + z + z1 + z2 + … + zn (경우에 따라서) = 1.00이어야 한다는 것을 인지할 것이다. 다양한 반복 단위의 효소 중합 비율이 치환에 따라 거의 변하지 않기 때문에, UR, ThR, TR 및/또는 Th/TR은 조성물에서 각각의 몰 분율에 따라 중합체의 탄수화물 축을 따라서 고르게 분포된다. UR, ThR, TR 및/또는 Th/TR은 공중합체의 무작위 형성 성질의 결과로서 다당류 내에서 임의의 순서로 존재할 수도 있다는 것을 주목한다.
상기 기재된 값들의 관계를 예증하기 위하여, 하기 비제한적 예가 제시된다: 총 50개의 단량체 단위를 포함하는 SPA 중합체 (즉, W=50). SPA 중합체는 4개의 표적 에피토프 ((표적 에피토프)1, (표적 에피토프)2, (표적 에피토프)3 및 (표적 에피토프)4)를 갖고; 따라서 중합체는 1개 종의 UR 및 4개 종의 TR을 포함한다. UR의 몰 분율 (즉, x)이 0.40이라면; (표적 에피토프)1를 보유하는 TR의 몰 분율 (즉, z1)은 0.06이고; (표적 에피토프)2를 보유하는 TR의 몰 분율 (즉, z2)은 0.20이고; (표적 에피토프)3를 보유하는 TR의 몰 분율 (즉, z3)은 0.24이고; (표적 에피토프)4를 보유하는 TR의 몰 분율 (즉, z1)은 0.10이고; 중합체는 40% UR, 6% ThR1, 20% ThR2, 24% TR3 및 10% TR4을 포함할 것이다 (즉, 20개 UR 단량체, 3개 TR1 단량체, 10개 TR2 단량체, 12개 ThR3 단량체 및 5개 TR4 단량체).
본 발명의 항원-특이적 친염증성 SPA는 공중합체이다 (즉, 2개 이상의 상이한 단량체). 다양한 단량체 단위 (UR 및 TR)의 효소 중합 속도는 거의 변하지 않고, 따라서 SPA 공중합체의 길이를 따라서 조성물 내의 개개의 몰 분율에 따라서 단량체가 고르게 분포될 수도 있다. 당업자라면, 도 7 내지 8이 SPA 내에서 특정한 순서로 단량체를 도시하고 있지만, 단량체들이 무작위 중합 성질의 결과로서 공중합체 내에 임의의 순서로 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 공중합체는 랜덤 공중합체, 블록 공중합체 또는 교대 공중합체일 수도 있다. 예를 들어, 제한적인 것은 아니라, UR 및 1개 종의 TR (TR1)을 포함하는 SPA에 대해서 중합체 유형은 다음을 포함할 수도 있다.
중합체 유형 예
랜덤 공중합체* X1-UR-TR1-TR1-UR-UR-TR1-TR1-UR-TR1-X2
블록 공중합체** X1-UR-UR-TR1-TR1-UR-UR-TR1-TR1-X2
교대 공중합체* X1-UR-TR1-UR-TR1-UR-TR1-UR-TR1-X2
* 공중합체의 길이는 나타낸 것과 같이 변할 수도 있다;
** "블록"의 각각은 다양한 길이일 수도 있고; 공중합체 전체에 걸쳐 반복될 수도 있고; 이 공중합체의 길이는 나타낸 것과 같이 변할 수도 있다.
본 발명의 억제성 모노SPA는 뚜렷한 유형의 β-[1,4]-결합 N-아세틸글루코사미닐-β-[1,4]-N-아세틸무라밀 펩티드 반복 단위로 이루어진 랜덤 선형 공중합체이다. 보존적 치환이 탄수화물 코어에서 의도된다. 예를 들어, 락틸 메틸 기는 또한 저급 알킬 (C1-C5) 또는 수소일 수도 있고, 알킬 기가 존재할 때 산소-보유 탄소에서 D-배위가 바람직하다.
일반적으로, 다양한 단량체 단위(MO)는 하기 구조에 의해 설명될 수 있다:
UR (화학식 7)
Figure 112007082550753-PCT00025
TR (화학식 10)
Figure 112007082550753-PCT00026
단량체 단위의 R기는 독립적으로 선택될 수도 있고 H 또는 저급 알킬 (C1-C5)일 수도 있다.
비치환 스템 펩티드 반복 단위의 스템 펩티드 (UR; 예를 들어 도 7 및 8 참조) 및 표적 에피토프 반복 단위의 스템 펩티드 (TR; 예를 들어 도 7 및 8 참조)는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 5개 아미노산을 포함할 수도 있다. 스템 펩티드는 천연 또는 비천연 아미노산을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 어떠한 방식으로도 제한하지 않지만, 하기 아미노산이 사용될 수도 있다. 위치 1은 알라닌, 알라닌의 저급 알킬 (C1-C5) 동족체, 또는 글리신에 의해 차지될 수도 있고; 추가의 비제한적 예에서 알라닌 또는 그의 동족체를 위한 α-탄소에서 L-배위가 바람직하다. 위치 2는 γ-아미노부티르산 (Gaba), 글리신, β-아미노프로피온산, δ-아미노펜타논산 및 ε-아미노 헥사논산에 의해 차지될 수도 있고; 추가의 비제한적 예에서 Gaba는 위치 2에 있다. 위치 3은 천연 또는 비천연 α-아미노산에 의해 차지될 수도 있고; 추가의 비제한적인 예에서 리신 또는 디아미노피멜산이 위치 3에 있다. 위치 4는 천연 또는 비천연 α-아미노산에 의해 차지될 수도 있고; 추가의 비제한적인 예에서 위치 4는 D-알라닌에 의해 차지된다. 위치 5는 천연 또는 비천연 α-아미노산에 의해 차지될 수도 있고; 추가의 비제한적인 예에서 D-알라닌이 위치 5에 있다. 아미노산 잔기는 독립적으로 α 또는 γ 카르복실 기에서, 또는 α 또는 ε 아미노 기에서, 또는 이들의 조합에서 결합될 수 있고, 단 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 스템 펩티드가 존재한다. 또한, 스템 펩티드의 각각의 아미노산 잔기는 비치환되거나 또는 할로, 알킬, 히드록시, 알콕시, 페녹시, CF3, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, -C(O)O알킬 및 -NO2로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수도 있다.
링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택될 수도 있고, 당 기술분야에 공지된 적절한 링커를 포함할 수도 있다. 특정한 예에서, 각각의 링커는 약 1 내지 약 6개 분절 또는 이들 사이의 양을 포함할 수도 있고; 예를 들어 링커는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 분절을 포함할 수도 있다. 제한적인 것은 아니지만, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH- 및 ≡CH-로부터 선택될 수도 있고, 여기에서 R은 저급 알킬이다. 3 내지 6개 분절이 존재하는 경우에, 분절 1 내지 4는 존재할 때 -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택될 수도 있고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않는다.
스템 펩티드와 링커 1 간의 연결 (도 3 내지 6 참조)은 각각 스템 펩티드의 아미노산의 어느 하나에서 독립적으로 이루어질 수도 있다. 비제한적인 예에서, 스템 펩티드와 링커 1간의 연결은 스템 펩티드의 위치 3에서 이루어진다. 링커 1과 링커 2 간의 연결자는 1,4-[1,2,3-트리아졸]일 수도 있거나 [Rostovtsev 등 (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 114: 2708], 또는 이에 한정되지 않지만 티올레이트/말레이미드 [Verez-Bencomo 등, (2004) Science 305:522] 및 아민/알데히드 환원 알킬화 [Slovin 등 (1999) PNAS 96:5710]와 같은 당업자에게 공지된 기타 연결 화학일 수도 있다. 특정한 비제한적인 예에서, 표적 에피토프는 탄수화물이고, 링커 1과 링커 2 간의 연결자는 아민/알데히드 환원 알킬화이다.
표적 에피토프를 위한 스페이서는 약 1 내지 약 10 아미노산 길이, 또는 이들 사이의 어느 양일 수도 있고; 예를 들어 스페이서는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 길이일 수도 있다. 아미노산은 당 기술분야에 공지된 어떠한 천연 또는 비천연 아미노산일 수도 있다. 특정한 비제한적인 예에서, 스페이서는 Gly-Ser-Gly-Ser (도 7 및 8 참조)일 수도 있지만, 그러나 원한다면 스페이서 내의 다른 아미노산을 사용할 수도 있고, 스페이서는 상기 기재된 상이한 길이, 예를 들어 약 2 내지 약 10개 아미노산, 또는 이들 사이의 어느 양, 예를 들어 약 4 내지 약 8개 아미노산, 또는 이들 사이의 어느 양일 수도 있다. 특정한 비제한적인 예에서, 스페이서는 4개 아미노산 길이이다. 스페이서는 N-말단에서 단량체 단위에 연결될 수 있거나 (즉, 그의 α-아미노 기에 의하여), 또는 존재한다면 아미노산의 어느 하나의 측쇄에 있는 ε 아미노기에 의하여 연결될 수 있고; 예를 들어 제한적이 아니지만, 스페이서가 스페이서의 위치 1의 α-아미노 기에서 아미노산에 있는 단량체 단위에 연결된다. 스페이서는 펩티드 결합을 통해 (에피토프가 펩티드라면) 또는 O-결합 글리코실화를 통해 (에피토프가 탄수화물이라면) 표적 에피토프에 연결된다.
제네릭 Th 에피토프
T-헬퍼 (Th) 에피토프는 특정한 표적 피험자 (즉, 인간 피험자, 또는 특정한 비인간 동물 피험자, 예를 들어 쥐, 생쥐, 기니 피그, 개, 말, 돼지 또는 염소)에서 면역 반응을 증진시키기 위해 당업자에게 공지된 적절한 T-헬퍼 에피토프일 수 도 있다. Th 에피토프는 본 발명의 친염증성 모노- 및 폴리SPA에 존재한다. 바람직한 T-헬퍼 에피토프는 적어도 약 10 내지 24개 아미노산 길이 또는 이들 사이의 양을 포함하고; 예를 들어 Th 에피토프는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 아미노산을 포함할 수도 있다. 비제한적인 예에서, Th 에피토프는 약 15개 내지 약 20개 아미노산 길이일 수도 있다. 화학적으로 용이하게 합성되고, 다수의 T-헬퍼 에피토프를 포함하는 단백질 또는 긴 폴리펩티드를 사용할 필요가 없기 때문에, 제네릭 (무차별적 또는 허용적) T-헬퍼 에피토프가 사용될 수도 있다.
본 발명의 SPA에서 사용하기 위해 적절한 무차별적 또는 허용적 T-헬퍼 에피토프의 비제한적 예는 다음으로 구성된 군에서 선택될 수도 있다:
i. 파상풍 톡소이드 펩티드 (TTP), 예를 들어 TTP의 아미노산 830-843의 설치류 또는 인간 T-헬퍼 에피토프 [Panina-Bordignon 등 (1989) EurJ.Immun. 19:2237].
ii. 플라스모듐 팔시파룸 pfg27의 설치류 또는 인간 T-헬퍼 에피토프;
iii. 락테이트 탈수소효소의 설치류 또는 인간 T-헬퍼 에피토프;
iv. HIV 또는 HIVgp120의 엔벨로프 단백질의 설치류 또는 인간 T-헬퍼 에피토프 [Berzofsky 등, (1991) J.Clin.Invest. 88:876];
v. 공지된 앵커 단백질의 아미노산 서열로부터 예측된 합성 인간 T-헬퍼 에피토프 (PADRE) [Alexander 등 (1994) Immunity 1:751];
vi. 홍역 바이러스 융합 단백질 MV 5F의 설치류 또는 인간 T-헬퍼 에피토프 [Muller 등 (1995) Mol.Immunol. 32:37; Partidos 등 (1990) J.Gen.Virol. 71: 2099];
vii. 개 홍역 바이러스 융합 단백질 (CDV-F)의 적어도 약 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 CDV-F의 아미노산 위치 148-283를 포함하는 T-헬퍼 에피토프 [Ghosh 등, (2001) Immunol. 104:58 및 WO 2000/46390];
viii. MUC1 뮤신의 세포외 직렬 반복 도메인의 펩티드 서열로부터 유래된 인간 T-헬퍼 에피토프 (WO 20018806);
ix. 인플루엔자 바이러스 해마글루티닌 Is (IV-H)의 설치류 또는 인간 T-헬퍼 에피토프 [Jackson 등 (1994) Virol. 198: 613]; 및
x. VP3의 잔기 173 내지 176 또는 FMDV의 다른 균주의 상응하는 아미노산을 포함하는 구제역 바이러스 (FMDV-O 카우프베우렌 균주)의 VP3 단백질의 소 또는 낙타 T-헬퍼 에피토프.
당업자에게 공지된 바와 같이, T-헬퍼 에피토프는 상이한 종의 하나 이상의 포유동물에 의해 인지될 수도 있다. 따라서, T-헬퍼 에피토프의 명명은 에피토프가 인지되는 종의 면역 체계에 대해 제한적인 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 설치류 T-헬퍼 에피토프는 생쥐, 쥐, 토끼, 기니 피그 또는 기타 설치류 또는 인간 또는 개의 면역 체계에 의해 인지될 수 있다.
T-헬퍼 에피토프는 예를 들어 이에 한정되지 않지만 하기로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 (WO 2004/014956, WO 2004/014957)을 포함할 수도 있다.
Figure 112007082550753-PCT00027
Figure 112007082550753-PCT00028
단지 예시의 목적을 위하여 여기에 개시된 T-헬퍼 에피토프가 포함된다. 당업자에게 알려진 표준 펩티드 합성 기술을 사용하여, 상이한 종에서 사용하기 위해 본 발명의 SPA를 적응시키기 위하여 여기에서 언급된 T-헬퍼 에피토프를 상이한 T-헬퍼 에피토프로 쉽게 대체할 수도 있다. 따라서, 주요 종에서 면역 반응을 이끌 어내거나 증진시키는데 유용한 것으로 당업자에게 공지된 추가의 T-헬퍼 에피토프가 배제되지 않는다.
적절한 서열을 확인하기 위해 성분 단백질, 단백질 분절 및 펩티드의 시험관내 T-세포 자극 기술을 사용하여, 상세한 분석에 의해 추가의 T-헬퍼 에피토프를 확인할 수도 있다 ([Goodman and Sercarz (1983) Ann.Rev. Immunol. 1: 465]; [Berzofsky (1986): "The Year in Immunology, Vol. 2, 151면, Karger, Basel] 및 [Livingstone and Fathman (1987) Ann.Rev.Immunol. 5:477]).
세포독성 T 림프구 ( CTL ) 표적 에피토프
이에 한정되지 않지만, 포유동물 피험자 또는 상기 피험자를 감염시키는 세균, 진균, 원생동물 또는 기생동물로부터 유래된 CTL 에피토프를 포함하여, 바이러스, 원핵 또는 진핵 유기체의 면역원성 단백질, 지질단백질 또는 당단백질의 아미노산 서열로부터 CTL 에피토프가 편리하게 유래될 수도 있다. CTL 에피토프의 미모토프가 본 발명의 범위 내에 구체적으로 포함된다.
CTL 에피토프는 포유동물에 투여될 때, 바람직하게는, 에피토프에 특이적인 CD8+ T 세포 또는 에피토프가 유래되는 항원을 활성화함으로써, 더욱 바람직하게는, 에피토프가 유래되는 병원체 또는 종양 세포에 대해 세포 매개 면역을 유도함으로써, T 세포 반응을 이끌어낼 수 있다. 펩티드 합성을 촉진하기 위하여 더욱 짧은 CTL 에피토프가 바람직하다. CTL 에피토프의 길이는 약 30개 아미노산 길이를 넘지 않아야 하고; 예를 들어 CTL 에피토프는 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개 아미노산 길이일 수도 있다. 비제한적인 예에서, CTL 에피토프는 약 25개 미만, 또는 약 20개 미만의 아미노산 잔기일 수도 있다. 다른 예에서, CTL 에피토프는 8 내지 12개 아미노산 잔기 길이이다.
CTL 에피토프는 예를 들어 이에 한정되지 않지만 리슈만편모충, 말라리아, 파동편모충증, 바베스열원충증 또는 주혈흡충증과 관련된 것을 포함하여 기생동물로부터 수득될 수도 있다. 예를 들어, CTL 에피토프는 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum); 서컴스포로조아(Circumsporozoa); 레이쉬마니아 도노바니(Leishmania donovani); 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii); 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni); 쉬스토소마 자포니컴(Schistosoma japonicum); 쉬스포소마 헤마토블룸(Schisfosoma hematoblum); 및 트립파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)로 구성된 군에서 선택된 기생동물의 항원으로부터 유래될 수도 있다.
P.팔시파룸의 CTL 에피토프의 특정한 예는 포자소체막 단백질(CSP), 포자소체 표면 단백질 2 (PfSSP2), 리버 스테이지(liver stage) 항원 1 (LSA 1), 분열소체 표면 단백질 1 (MSP 1), 세린 반복 항원 (SERA) 및 AMA-1 항원으로 구성된 군에서 선택되는 항원으로부터 유래된 것일 수도 있다 ([Amante 등 (1997) J.Immunol. 159:5535]; [Chaba 등 (1998) J.Immunopharm. 20:259]; [Shi 등, (1999) PNAS 96:1615]; [Wang 등 (1998) Science 282: 476]; 및 [Zevering 등 (1998) Immunol. 94:445]). L.도노바니의 CTL 에피토프의 특정한 예는 반복 펩티드로부터 유래된 것일 수도 있다 [Liew 등 (1990) J.Exp.Med. 172:1359]. T.곤디이의 CTL 에피토프 의 특정한 예는 P30 표면 단백질로부터 유래된 것일 수도 있다 [Darcy 등 (1992) J.Immunol. 149:3636]. S.만소니의 CTL 에피토프의 특정한 예는 Sm-28GST 항원으로부터 유래된 것일 수도 있다 [Wolowxzuk 등, (1991) J.Immunol. 146: 1987].
CTL 에피토프는 예를 들어 이에 한정되지 않지만 로타바이러스, 헤르페스 바이러스, 코로나 바이러스, 피코르나바이러스 (예, 아프토바이러스), 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 폭스 바이러스, 소 헤르페스 바이러스 유형 I, 소 바이러스성 설사 바이러스, 소 로타바이러스, 개 홍역 바이러스 (CDV), 구제역 바이러스(FMDV), 홍역 바이러스(MV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 엡스테인-바르 바이러스(EBV), 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV), 간염 바이러스, 간염 B 바이러스, 간염 C 바이러스, 헤르페스 심플렉스 - 1 바이러스, 헤르페스 심플렉스 - 2 바이러스, 간염 B 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 감염성 점액낭병 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 유두종 바이러스 유형 16, 인간 유두종 바이러스 유형 18, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스, 광견병 바이러스, 리노바이러스, 천연두 (마마) 바이러스, 우두 바이러스, 포진 바이러스 (수두) 등일 수도 있다.
HIV-1의 CTL 에피토프의 특정한 예는 env, gag 또는 pol 단백질로부터 유래된 것일 수도 있다.
인플루엔자 바이러스의 CTL 에피토프의 특정한 예는 핵산단백질 ([Taylor 등 (1989), Immunogenetics 26: 267 (1989)]; [Townsend 등 (1983) Nature 348: 674]), 기질 단백질 [Bednarek 등 (1991) J.Immunol. 147:4047] 또는 폴리머라제 단백질 ([Jameson 등 (1998) J.Virol. 72: 8682]; 및 [Gianfrani 등 (2000) Human Immunol. 61: 438])로부터 유래된 것일 수도 있다.
림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV)의 CTL 에피토프의 특정한 예는 당단백질-1 항원으로부터 유래된 것일 수도 있다 [Zinkernagel 등, (1974) Nature 248: 701].
사이토메갈로바이러스의 CTL 에피토프의 특정한 예는 pp28, pp50, pp65, pp71, pp150, gB, gH, IE-1, IE2, US2, US3, US6, US11 및 UL18로 구성된 군에서 선택되는 항원으로부터 유래된 것일 수도 있다 ([Longmate 등, (2000) Immunogenet. 52: 165]; [Wills 등, (1996) J.Virol. 70: 7569]; [Solache 등, (1999) J.Immunol. 163, 5512]; [Diamond 등, (1997) Blood. 90: 1751]; [Kern 등 (1998) Nature Med. 4:975]; [Weekes 등 (1999) J.Virol. 73, 2099]; [Retiere 등 (2000) J. Virol. 74: 3948]; 및 [Salquin 등 (2000) Eur J. Immunol. 30: 2531]).
홍역 바이러스의 CTL 에피토프의 특정한 예는 융합 당단백질 (MV-F)로부터 유래된 것, 특히 그의 잔기 438-446으로부터 유래된 것일 수도 있다 [Herberts 등, (2001) J.Gen Virol. 82: 2131].
엡스테인-바르 바이러스(EBV)의 CTL 에피토프의 특정한 예는 잠복 핵 항원(EBNA) 또는 EBV의 잠복 막 단백질(LMP)으로부터 유래된 것, 예를 들어 EBV 유형 A로부터 EBNA 2A, EBNA 3A, EBNA 4A 또는 EBNA 14a; EBV 유형 B로부터 EBNA 2B, EBNA 3B, EBNA 4B 또는 EBNA 14B; LMP1; 또는 LMP2일 수도 있다 (PCT/AU95/00140; PCT/AU97/00328; 및 PCT/AU98/00531).
CTL 에피토프는 예를 들어 이에 한정되지는 않지만 파스퇴렐라(Pasteurella), 액티노바실러스(Actinobacillus), 해모필루스(Haemophilus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria Monocytogenes), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 시겔라(Shigella) 등일 수도 있다. 적절한 세균 CTL 에피토프는, 이에 한정되지 않지만, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 65Kd 단백질 [Lamb 등 (1987) EMBO J. 6:1245]; M.투베르쿨로시스 ESAT-6 단백질 (Morten 등 (1998), Infect. Immun. 66:717]; 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 뉴클레아제 단백질 [Finnegan 등 (1986) J.Exp.Med. 164:897]; 에스케리키아 콜리 열 안정성 엔테로톡신 [Cardenas 등 (1993) Infect.Immunity 61: 4629]; 및 에스케리키아 콜리 열 불안정성 엔테로톡신 [Clements 등, (1986) Infect. Immunity 53: 685]로부터 유래된 CTL 에피토프를 포함한다.
CTL 에피토프는, 예를 들어 이에 한정되지 않지만 종양 CTL 항원에 대한 T 세포 반응으로부터 유래되고/되거나 반응을 발생시킬 수 있는 포유동물 피험자로부터의 CTL 에피토프일 수도 있다. 종양-특이적 CTL 에피토프는 보통 선천적 또는 외래 CTL 에피토프이고, 그것의 발현은 종양의 발생, 성장, 존재 또는 재발과 상관 관계를 갖는다. 이러한 CTL 에피토프가 정상 조직으로부터 비정상 조직을 분화하는데 유용한 만큼, 이들은 치료적 개입을 위한 표적으로서 유용하다. 이러한 CTL 에피토프는 당 기술분야에 공지되어 있다. 종양 CTL 에피토프의 비제한적인 예는 암배아항원(CEA), 전립선 특이 항원(PSA), 흑색종 항원 (PAGE, SAGE, GAGE) 및 뮤신, 예컨대 MUC-1로부터 유래된 것일 수도 있다. 암 환자에게 투여하기 위한 CTL 에피토프의 특정한 예는 암을 유도하는 단백질, 예를 들어 종양단백질 (예, p53, ras 등)로부터 유래된 것일 수도 있다.
비제한적인 예에서, CTL 에피토프는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다:
Figure 112007082550753-PCT00029
Figure 112007082550753-PCT00030
Figure 112007082550753-PCT00031
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본 발명의 조성물 및 방법은, 주요 질병 상황에 관련된 CTL 에피토프로서 연루되어 있는 상기 및 기타 공지된 펩티드 및 탄수화물과 함께 사용하기 위해 적절한 것으로 이해된다. 명백하게, 본 발명은 본 발명의 원리에 따라 CTL 표적 에피토프로서 사용될 수도 있는 것으로 장차 개시될 수 있는 기타 펩티드 또는 탄수화물을 포함하는 것으로 해석된다.
B 세포 표적 에피토프
B 세포 에피토프는, 이에 한정되지 않지만 포유동물 피험자 또는 상기 피험자를 감염시키는 세균, 진균, 원생동물 또는 기생동물로부터 유래된 항원을 포함하여, 바이러스, 원핵 또는 진핵 유기체의 면역원성 단백질, 지질단백질 또는 당단백질의 아미노산 서열로부터 편리하게 유래될 수도 있다. 면역 반응이 요망되는 이디오타입 및 항-이디오타입 B 세포 에피토프가, 지질-변형된 B 세포 에피토프와 마 찬가지로, 구체적으로 포함된다. 대안적으로, B 세포 에피토프는 탄수화물 항원, 예를 들어 ABH 혈액 군 항원, 이식 항원 (예, Gal-α-[1,3]-Gal-β-[1,4]-GlcNAc [Sandrin 등, (1993) PNAS 90: 11391]; [Galili 등 (1987) PNAS 84: 1369]; [Schofield 등 (2002) Nature 418: 785]) 또는 이들의 접합체일 수도 있다.
B-세포 에피토프는 포유동물에게 투여될 때 항체의 생성을 이끌어낼 수 있어야 한다: 예를 들어 중화 항체가 생성될 수도 있고; 추가의 예에서 고 적정 중화 항체가 생성될 수도 있다.
펩티드 합성을 촉진하기 위하여 짧은 B 세포 에피토프가 사용될 수도 있다. 예를 들어, B 세포 에피토프의 길이는 약 30개 아미노산 길이를 초과해서는 안된다; 예를 들어 B 세포 에피토프는 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개 아미노산 길이일 수도 있다. 비제한적인 예에서, B 세포 에피토프는 약 25개 미만, 또는 약 20개 미만의 아미노산 잔기일 수도 있다. 다른 예에서, B 세포 에피토프는 5 내지 20개 아미노산 잔기 길이이다.
펩티드는 B 세포 에피토프가 유래되는 선천적 폴리펩티드의 배위를 모방하는 배위를 취할 수 있다.
예를 들어, B 세포 에피토프는 이에 한정되지 않지만 기생동물로부터 유래될 수도 있고 리슈만편모충, 말라리아, 파동편모충증, 바베스열원충증 또는 주혈흡충증과 관련된 것일 수도 있다. 어떠한 방식으로도 제한되길 원하지 않지만, B 세포 에피토프는 다음으로 구성된 군에서 선택될 수도 있다:
i. 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum) (NANP) 3의 B 세포 에피토프 [Good 등, (1986) J.Exp.Med. 164: 655];
ii. 서컴스포로조아(Circumsporozoa)의 B 세포 에피토프 [Good 등 (1987) Protein Sci. 235: 1059];
iii. 레이쉬마니아 도노바니(Leishmania donovani) 반복 펩티드의 아미노산 잔기 326-343을 포함하는 B 세포 에피토프 [Liew 등 (1990) J.Exp.Med. 172: 1359];
iv. 톡소플라스마 곤디이 P30 표면 단백질의 B 세포 에피토프 [Darcy 등, (1992) J.Immunol. 149:3636]; 및
v. 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni) Sm-28GST 항원의 B 세포 에피토프 [Wolowxzuk 등, (1991) J.Immunol. 146: 1987].
B 세포 에피토프는 예를 들어 로타바이러스, 헤르페스 바이러스, 코로나 바이러스, 피코르나바이러스 (예, 아프토바이러스), 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 폭스 바이러스, 소 헤르페스 바이러스 유형 I, 소 바이러스성 설사 바이러스, 소 로타바이러스, 개 홍역 바이러스 (CDV), 구제역 바이러스(FMDV), 홍역 바이러스(MV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 엡스테인-바르 바이러스(EBV), 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV), 간염 바이러스, 간염 B 바이러스, 간염 C 바이러스, 헤르페스 심플렉스 - 1 바이러스, 헤르페스 심플렉스 - 2 바이러스, 간염 B 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 감염성 점액낭병 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 유두종 바이러스 유형 16, 인간 유두종 바이러스 유형 18, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스, 광견병 바이러스, 리노바이러스, 천연두 (마마) 바이러스, 우두 바이러스, 포진 바이러스 (수두) 등으로부터 유래되거나 및/또는 이에 대항한 항체를 생성할 수도 있다.
적절한 바이러스성 B 세포 에피토프는, 이에 한정되지 않지만 다음으로 구성된 군에서 선택되는 에피토프를 포함한다:
i. HIV gp120 V3 루프, 아미노산 잔기 308-331 [Jatsushita 등 (1988) J.Virol. 62: 2107];
ii. HIV gp120 아미노산 잔기 428-443 [Ratner 등 (1985) Nature 313:277];
iii. HIV gp120 아미노산 잔기 112-124 [Berzofsky 등 (1988) Nature 334: 706];
iv. HIV 역 전사효소의 B 세포 에피토프 [Hosmalin 등 (1990) PNAS 87: 2344];
v. 인플루엔자 바이러스 핵단백질 아미노산 잔기 335-349 [Townsend 등, Cell 44, 959 (1986)];
vi. 인플루엔자 바이러스 핵단백질 아미노산 잔기 366-379 [Townsend 등, (1986) Cell 44: 959];
vii. 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 아미노산 잔기 48-66 [Mills 등 (1986) J.Exp.Med. 163: 1477];
viii. 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 아미노산 잔기 111-120 [Hackett 등, (1983) J.Exp.Med. 158:294];
ix. 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 아미노산 114-131 [Lamb and Green (1983) Immunology 50: 659];
x. 엡스테인-바르 LOP 아미노산 잔기 43-53 [Thorley-Lawson 등 (1987) PNAS 84: 5384];
xi. 간염 B 바이러스 표면 항원 아미노산 잔기 95-109 [Milich 등, (1985) J.Immunol. 134: 4203];
xii. 간염 B 바이러스 표면 항원 아미노산 잔기 140-154;
xiii. 간염 B 바이러스 프리-S 항원 아미노산 잔기 120-132 [Milich 등, (1986) J.Exp.Med. 164: 532];
xiv. 헤르페스 심플렉스 바이러스 gD 단백질 아미노산 잔기 5-23 [Jayaraman 등, (1993) J.Immunol. 151: 5777];
xv. 헤르페스 심플렉스 바이러스 gD 단백질 아미노산 잔기 241-260 [Wyckoff 등, (1988) Immunobiol. 177:134];
xvi. 광견병 당단백질 아미노산 잔기 32-44 [MacFarlan 등 (1984) J.Immunol. 133: 2748];
xvii. FMDV 혈청형 O의 VP1 캡시드 단백질의 적어도 아미노산 잔기 134-168 또는 137-160 또는 잔기 142-160 또는 잔기 137-162 또는 잔기 145-150를 포함하는 주요 FMDV 에피토프, 또는 다른 항혈청의 상응하는 아미노산 잔기, 예를 들어 항혈 청 A, C, SAT1, SAT2, SAT3 또는 ASIA1 (US 5,864,008 및 US 6,107,021);
xviii. 간염 C 바이러스 (HCV) 변형체 AD78의 E2 단백질의 초가변 영역-1 (HVR1) [Zibert 등 (1997) Virol. 71: 4123-4127];
xix. 표면 항원 [Kobayashi 및 Kolke (1984) Gene 30:227], 예를 들어 LVLLDYQGMLPVCPL 및 TKPSDGNCTCIPIPS, 및 전구체 표면 항원 MQWNSTTFHQALL로부터 선택된 간염 B 바이러스의 서열;
xx. 핵단백질 [Gregory 등 (2001) J.Gen.Virol. 82: 1397], 예를 들어 MFEDLRVSSFIRGT 및 SNENMETMDSSTLE; 헤마글루티닌, 예를 들어 HPLILDTCTIEGLIYGNPS; YQRIQIFPDT; 및 IQIFPDTIWNVSYSGTSK로부터 선택된 인플루엔자 바이러스로부터의 서열; 및
xxi. 간염 C 바이러스로부터의 서열, 예를 들어 GGPTRTIGGSQAQTASGLVSMFSVGPSQK.
세균-특이적 B 세포 에피토프의 특정한 예는 파스퇴렐라, 액티노바실러스, 해모필루스, 리스테리아 모노사이토게네스, 마이코박테리아, 스타필로코시, 이.콜리, 시겔라 등으로부터 유래되고/되거나 이에 대한 항체를 발생할 수 있는 것일 수도 있다. 적절한 세균 B 세포 에피토프는 이에 한정되지 않지만 다음으로 구성된 군에서 선택되는 에피토프를 포함한다:
i. 마이코박테리움 투베르쿨로시스 65Kd 단백질 아미노산 잔기 112-126 [Lamb 등 (1987) EMBO J. 6:1245];
ii. M.투베르쿨로시스 65Kd 단백질 아미노산 잔기 163-184 [Lamb 등 (1987) EMBO J. 6:1245];
iii. M.투베르쿨로시스 65Kd 단백질 아미노산 잔기 227-243 [Lamb 등 (1987) EMBO J. 6:1245];
iv. M.투베르쿨로시스 65Kd 단백질 아미노산 잔기 242-266 [Lamb 등 (1987) EMBO J. 6:1245];
v. M.투베르쿨로시스 65Kd 단백질 아미노산 잔기 437-459 [Lamb 등 (1987) EMBO J. 6:1245];
vi. M.투베르쿨로시스 ESAT-6 단백질 잔기 3-15 [Morten 등, Infect Immun. 66, 717-723, 1998];
vii. M.투베르쿨로시스 ESAT-6 단백질 잔기 40-62 [Morten 등 (1998), Infect Immun. 66: 717];
viii. 마이코박테리움 스크로풀라세움(Mycobacterium scrofulaceum) α-항원 잔기 279-290 [Mikiko 등, (1997) Microb. Path. 23:95];
ix. 스타필로코쿠스 아우레우스 뉴클레아제 단백질 아미노산 잔기 61-80 [Finnegan 등 (1986) J.Exp.Med. 164: 897];
x. 에스케리키아 콜리 열 안정성 엔테로톡신의 B 세포 에피토프 [Cardenas 등, (1993) Infect. Immunity 61: 4629];
xi. 에스케리키아 콜리 열 불안정성 엔테로톡신의 B 세포 에피토프 [Clements 등, (1986) Infect. Immunity 53: 685];
xii. 시겔라 소네이 형태 I 항원의 B 세포 에피토프 [Formal 등 (1981) Infect Immunity 34: 746];
xiii. 군 A 스트렙토코쿠스, 바람직하게는 M 단백질, 더욱 바람직하게는 M 단백질의 C-말단 절반으로부터 유래된 B 세포 에피토프, 더욱 바람직하게는 M 단백질의 보존된 C 말단 절반으로부터 유래되고 나선형 접힘 및 상기 최소의 나선형 비-숙주-교차-반응성 펩티드 내에 나타나는 항원성을 유지하기 위해 설계된 비-M-단백질 펩티드를 포함하는 최소의 나선형 비-숙주-교차-반응성 펩티드. 예를 들어 비-M-단백질 펩티드 (예, 펩티드 J14)는, 면역원이 (알칸) 주쇄로부터 매달린 개개의 펩티드를 모두 표시할 수 있도록 하는 화학을 사용하여, 하나 이상의 혈청형 M 단백질 펩티드에 연결될 수도 있고, 이에 의해 뛰어난 면역원성 및 보호를 부여한다 (US 6,174,528) 및 [Brandt 등 (2000) Nat.Med. 6:455];
xiv. 콜레라 독소 B 소단위(CTB)의 B 세포 에피토프, 예를 들어 문헌 [Kazemi and Finkelstein (1991) Mol.Immnunol. 28: 865]에 기재됨;
xv. 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) (탄저병)의 단백질의 B 세포 에피토프, 예를 들어 탄저병의 외부 포자외피의 단백질로부터 유래된 B 세포 에피토프, 예컨대 250 kDa 당단백질 [Sylvestre 등 (2001) In: Proc. 4th Int. Conf. Anthrax, St.John's College, Annapolis, MD, June 10-13, Abstract 31 B]; 및
xvi. 예를 들어 파상풍 톡소이드 단백질과 같은 파상풍의 단백질로부터의 B 세포 에피토프.
포유동물 피험자로부터 B 세포 에피토프의 특정한 비제한적인 예는, 종양 항원에 대한 항체로부터 유래되거나 및/또는 항체를 생성할 수 있는 것일 수도 있다. 종양 항원은 보통 선천적 또는 외래 항원이고, 그의 발현은 종양의 발생, 성장, 존재 또는 재발과 상관관계를 갖는다. 정상 조직으로부터 비정상 조직을 분화하는데 있어서 종양 항원이 유용한 만큼이나 이들은 치료적 개입을 위한 표적으로서 유용하다. 종양 항원이 당 기술분야에 알려져 있다. 종양 항원의 비제한적인 예는, 이에 한정되지 않지만 암배아성 항원(CEA), 전립선 특이 항원(PSA), CA-125, CA-19-9, CA-15-3, CA-549, CA-72-4, CA-50, 프리에덴레이크(Friedenreich) 항원(T), Leb 항원, 포르스만 항원, 흑색종 항원(MAGE, BAGE, GAGE) 및 뮤신, 예컨대 MUC-1을 포함한다. 종양 항원은 글로보-H, Tn 및 시알릴 Lea과 같은 탄수화물일 수도 있다.
특정한 비제한적 예에서, B 세포 표적 에피토프를 포함하는 펩티드는, 하기 서열로 구성된 군에서 선택되는 전립선 특이 항원 (PSA, US 6,326,471)로부터의 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수도 있다:
Figure 112007082550753-PCT00034
또는 암배아성 항원(CEA) PPAQYSWLIDGN으로부터의 서열.
본 발명의 조성물 및 방법은, 주요 질병 상황에 관련된 B 세포 에피토프로서 연루되어 있는 상기 및 기타 공지된 펩티드 및 탄수화물과 함께 사용하기 위해 적절한 것으로 이해된다. 명백하게, 본 발명은 본 발명의 원리에 따라 B 세포 표적 에피토프로서 사용될 수도 있는 것으로 장차 개시될 수 있는 기타 펩티드 또는 탄수화물을 포함하는 것으로 해석된다.
억제성 표적 에피토프
본 발명에서 사용된 억제성 표적 에피토프는, 이에 한정되지 않지만, 진성 당뇨병, 관절염 (류마티스 관절염, 연소성 류마티스 관절염, 골관절염, 건선 관절염), 다발 경화증, 중증 근육 무력증, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 자가면역 갑상샘염, 피부염 (아토피 피부염 및 습진 피부염 포함), 건선, 쇼그렌 증후군에 속발성인 건조각막결막염을 포함하는 쇼그렌 증후군, 원형 탈모증, 절지동물 물림증 반응에 기인한 알레르기 반응, 크론 병, 아프타궤양, 홍채염, 결막염, 각막결막염, 궤양대장염, 천식, 알레르기성 천식, 피부 홍반 루푸스, 공피증, 질염, 직장염, 약물 발진, 나병 역전 반응, 나병 결절 홍반, 자가면역 포도막염, 알레르기성 뇌척수염, 급성 괴사 출혈 뇌병증, 특발 양측성 진행성 감각 신경성 난청, 재생 불량 빈혈, 진정 적혈구계 빈혈, 특발 저혈소판증, 다발연골염, 베게너육아종, 만성 급성 간염, 스티븐스-존슨 증후군, 특발 스프루, 편평 태선, 그레이브스 눈병증, 사코이드증, 원발성 쓸개관 간경화증, 후방 포도막염, 및 사이질 폐 섬유증을 포함하여 하나 이상의 자가면역 질병 또는 질환에서 관련된 펩티드 서열 또는 탄수화물로부터 유래된 에피토프일 수도 있다.
자가면역 질병에 관련된 공지된 항원의 예는, 이에 한정되지 않지만 수초 염기성 단백질, 수초 희소돌기아교세포 당단백질 및 수초 단백지질 단백질 (다발 경화증에 관련됨), 아세틸콜린 수용체 성분 (중증 근육무력증에 관련됨), 콜라겐 및 마이코박테리아 hsp 펩티드 180-188 (관절염에 관련됨), 라미닌 및 p53 펩티드 (전신 홍반 루푸스에 관련됨)를 포함한다.
특정한 비제한적 예에서, 억제성 표적 에피토프는 다발 경화증의 치료를 위한 수초 염기성 단백질 분절일 수도 있다. 추가의 예에서, 예를 들어 US 6,489,299호에 개시된 서열을 가진 수초 염기성 단백질 펩티드는 다음과 같이 나타낸다: Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gin-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr (MBP 87-99).
억제성 표적 에피토프는 예를 들어 제한적인 것은 아니지만 아세틸콜린 수용체 항원 또는 중증 근육무력증의 치료를 위한 펩티드의 하나일 수도 있다. 특정한 비제한적 예에서, 사용된 아세틸콜린 수용체 펩티드는 p259 펩티드 [Zisman 등 (1995) Hum.Immunol. 44:121] 및 [Brocke 등 (1990) Immnunology 69:495]일 수도 있다. 추가의 예에서, 사용된 아세틸콜린 수용체 펩티드는 hAChR의 아미노산 잔기 61-76을 포함하는 분절, 또는 hAChR의 아미노산 잔기 184-210을 포함하는 분절일 수도 있다.
억제성 표적 에피토프는 비제한적인 예에서 관절염의 치료를 위한 콜라겐 분절일 수도 있다. 추가의 예에서, 콜라겐 분절은 예를 들어 US 6,423,315호에 개시된 서열을 가진 콜라겐 유형 C11 펩티드 245-270일 수도 있고, SPTGPLGPKGQTGELGIAGFKGEQGPK로서 표시된다.
특히 비제한적 실시예에서, 억제성 표적 에피토프는 전신 홍반 루푸스의 치료를 위한 라미닌 분절일 수도 있다. 생쥐 라미닌 사슬의 C-말단 또는 N-말단으로부터 유래된 펩티드가 사용될 수도 있다. 특정한 비제한적인 예에서, 억제성 표적 에피토프는 하기 서열을 포함하여 미국 특허 6,228,363호에 개시된 라미닌 분절의 아미노산 서열일 수도 있다:
Figure 112007082550753-PCT00035
본 발명의 조성물 및 방법은 자가면역에 관련된 에피토프로서 연루되어 있는 상기 및 기타 공지된 펩티드 및 탄수화물과 함께 사용하기 위해 적절한 것으로 이해된다. 명백하게, 본 발명은 본 발명의 원리에 따라 억제성 표적 에피토프로서 사용될 수도 있는 것으로 장차 개시될 수 있는 기타 펩티드 또는 탄수화물을 포함하는 것으로 의도된다.
합성 방법
일반화된 항원 특이적 SPA에 적용되는 레트로합성 분석 [Corey and Cheng (1995) The Logic of Chemical Synthesis, John Wiley and Sons, New York: Chapter 1]은, 본 발명의 SPA의 구성을 위한 2가지 일반적 방법을 드러낸다.
비제한적 예에서 단지 예증의 목적을 위하여, 첫 번째 방법을 예시하기 위해 일반화된 자극 모노SPA (예를 들어, 도 3에 나타냄)가 사용된다. 당업자라면, 여기에 기재된 SPA의 모든 카테고리를 합성하기 위해 이러한 방법이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
Figure 112007082550753-PCT00036
첫 번째 레트로합성 단절 (열린 화살표, 상기 왼쪽에서 오른쪽)은 SPA의 직전 전구체인 3개의 상이한 지질 II를 제공한다. 합성 방향 (선 화살표, 상기 오른쪽에서 왼쪽)에서, 실온에서 수용액 중에서 MtgA 및 보조인자의 작용 (WO 2003/075953, 전체 내용이 참고문헌으로 포함됨)은 지질 II 출발 물질의 몰 분율과 동일한 몰 분율로 반복 단위를 가진 랜덤 공중합체 SPA를 생성할 수도 있다.
디펩티드 지질 II은 WO 2003/075953호에 기재된 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
Figure 112007082550753-PCT00037
Th 에피토프 지질 II에 두 번째 레트로합성 단절 (열린 화살표, 상기 왼쪽에서 오른쪽)이 적용되면 트리펩티드 지질 II (Ala-D-이소-Gln-비스노르-아지돌리신) 및 비천연 아미노산 rac-4-펜티닐글리신에 의해 C-말단에서 변형된 제네릭 Th 에피토프를 제공한다. 이들 2개의 성분은 수용액 중에서 구리 이온 및 아스코르브산의 작용에 의해 합성 방향 (선 화살표, 상기 오른쪽에서 왼쪽)으로 결합될 수 있다 [Rostovtsev 등 (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 114: 2708].
Figure 112007082550753-PCT00038
유사한 방식으로, 표적 에피토프(들) 지질(들) II에 세 번째 레트로합성 단절 (열린 화살표, 상기 왼쪽에서 오른쪽)이 적용되면 동일한 트리펩티드 지질 II (Ala-D-이소-Gln-비스노르-아지돌리신) 및 비천연 아미노산 rac-4-펜티닐글리신에 의해 C-말단에서 변형된 표적 에피토프 또는 에피토프들을 제공한다. 이들 성분들은 수용액 중에서 구리 이온 및 아스코르브산의 작용에 의해 합성 방향 (선 화살표, 상기 오른쪽에서 왼쪽)으로 결합될 수 있다 [Rostovtsev 등 (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 114: 2708].
WO 2003/075953호에 기재된 방법을 사용하여 아지도 지질 II를 합성한다. 이극성 비양성자성 용매 중에서 아지드 이온에 의해 호모-세린 p-톨루엔술포네이트의 치환을 통하여 표준 방법에 의해 비스노르-아지돌리신 성분을 제조할 수도 있다.
Figure 112007082550753-PCT00039
표준 고체상 펩티드 합성 기술 [Atherton and Shepard (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Irl Pr Publishing]에 의해 C-말단에서 변형된 Th 에피토프 및 N-말단에서 변형된 펩티드 표적 에피토프를 합성할 수도 있다. 그들의 알켄옥시 (예, 알릴, 4-펜테닐) 글리코시드로서 탄수화물 표적 에피토프를 상응하는 알데히드로 오존화할 수도 있고 적절히 보호된 리신의 ε-아미노 기와 함께 환원적으로 축합할 수 있다 [Slovin 등 (1999) PNAS 96: 5710]. 이렇게 수득된 탄수화물-유도화 리신을 표준 펩티드 합성 방법에 혼입할 수도 있다.
Figure 112007082550753-PCT00040
통상적으로 입수가능한 물질로부터 글리신-이민 방법에 의하여 [O'Donnell 등, J.Am.Chem.Soc. (1989) 111:2353]에 의한 라세믹 변형으로 비천연 알킨 아미노산을 제조할 수도 있다.
비제한적 예로서 단지 예증의 목적을 위하여, 대안적인 합성 경로를 증명하기 위해 전신 억제성 모노SPA (예를 들어, 도 7에 나타냄)를 사용한다. 당업자라면, 여기에 기재된 SPA의 모든 범주를 합성하기 위하여, 이러한 방법을 사용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 첫 번째 대안적인 레트로합성 단절은, 필요한 N-말단 서열을 가진 에피토프: [구속된 알키닐 Gly-GLy-Ser-Gly-Ser-표적 에피토프]를 허용하기 위해 적절히 치환된 프리-SPA 탄수화물 중합체, 즉 화합물(들) 8를 밝혀낸다.
Figure 112007082550753-PCT00041
일반적인 방법에 의하여 성분 지질 II로부터 아지드-함유 중합체 전구체를 제조할 수도 있다 (WO 2003/075953, 그 전체내용이 참고문헌으로 포함됨).
Figure 112007082550753-PCT00042
마지막으로, (WO 2003/075953)에 개시되어 있는 확립된 방법에 의하여 성분 지질 II를 합성한다. 당업자라면, 합성되어지는 정확한 SPA에 의존하여, 첫 번째 대안적인 합성 경로 및 두 번째 대안적인 합성 경로가 각각 바람직할 수 있음을 더 욱 인지할 것이다.
상기 기재된 실시예는 단지 예증 목적을 위한 것이고 본 발명의 범위를 결코 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
제약학적 조성물 및 그들의 제제
염증성 병변을 예방하거나 치료하기 위하여, 또는 염증이 인간 및 다른 동물에서 유리한 치료 또는 예방 효과를 제공하는 다양한 질병 상황 또는 상태와 연관된 염증을 유도하기 위하여, 여기에 개시된 모노- 및 폴리SPA를 그들의 구조에 의존하여 사용할 수 있다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 모노- 및 폴리SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염을 제약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 하나 이상의 완충제, 담체, 부형제 또는 희석제, 및 임의로 다른 치료제와 함께 포함하는, 인체 의료 및 수의학 용도를 위한 제약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 화합물이 개별적으로 투여될 수도 있거나 또는 2 이상의 화합물을 포함하는 혼합물로 투여될 수 있음을 주목해야 한다. 본 발명은 또한, 염증 병변을 예방하거나 또는 치료하기 위해, 또는 염증 면역 반응이 유익한 질병 상황 또는 상태를 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조를 위하여, 모노- 및 폴리SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염의 용도를 포함한다. 이러한 사용을 위한 친염증성 SPA 또는 억제성 SPA의 선택은, 치료 목적을 위해 요망되어지는 면역 반응의 유형에 의존된다.
본 발명의 화합물은 제약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 농도의 염, 완충제, 보존제, 상용성 담체, 희석제, 부형제, 분산제 등, 및 임의로 다른 치료 성 분을 함유할 수 있는 제약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 용액으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 화합물 1 및 화합물 2는 중성 pH에서 물 중에서 약 20 mg/mL 이하로 용해될 수 있다. 또한, 이러한 화합물의 수용액은 낮은 (약 0.5 내지 약 5) 중량%의 글리세롤, 슈크로스, 및 기타 제약학적으로 허용가능한 부형제 물질을 수용할 수 있다. 본 발명의 SPA는 각종 표준 제약학적으로 허용가능한 비경구 제제 로 제형될 수 있다.
순 전하 및 응집
반복 단위 당 동일한 수의 양 및 음 전하를 가진 본 발명의 균형잡힌 전하 양쪽성 분자는, 시간에 걸쳐, 상호 간에 응집되거나 및/또는 전하-전하 끄는 힘에 의해 분자 간에 압축될 수 있다. 예를 들어, 여기에 개시된 화합물 1은 바람직한 항-염증성 활성을 나타내는 대표적인 균형잡힌 전하 양쪽성이온 분자이다. 시간 경과시에, 제약학적 조성물 중에서 이러한 유형의 분자 및 억제성 모노- 및 폴리SPA에 의한 항-염증 면역조절 활성의 유지는, 예컨대 계면활성제 또는 분산제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 슈크로스 등의 포함과 같이 응집을 최소화하는 제형 기술에 의해 최적화될 수 있다.
유리하게는, 펩티드 잔기에 기인하여 생리학적 pH에서 반복 단위 당 순 양 전하 또는 음 전하를 보유하는 본 발명의 선형 중합체는 전하-전하 반발을 유지한다. 따라서, 이러한 분자는 이상적인 용액 거동, 다시 말해서 최소의 분자내 또는 분자간 응집을 가진 연장된 용액 상태를 나타내고, 이러한 사건은 시간에 걸쳐, 특히 낮은 이온 강도에서 면역학적 활성을 최소화할 수도 있다. 따라서, 반복 단위 당 순 양 또는 음 전하를 가진 본 발명의 분자는 중합전해질로서 거동할 것이고 증가된 용해 및 저장 거동을 나타낸다는 장점을 갖는다. 중합전해질 전하-전하 반발 현상은 폴리(2-비닐피리딘)에 대하여 원자 힘 현미경 (AFM)에 의해 직접적으로 관찰되었다 [Minko 등 (2002) J.Am.Chem.Soc. 124: 3218]. 또한, 반복 단위 당 순 양 또는 음 전하를 나타내는 모노- 및 폴리SPA의 합성 다당류 항원의 면역조절 활성은, 이러한 분자들이 응집되는 것을 막는 분자내- 및 분자간- 전하-전하 반발력에 의해 크게 증진되고, 이것은 세포 수용체에 대해 구조적 특징의 적절한 표시를 수월하게 한다.
본 발명의 제약학적 조성물은, 제약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 완충액, 담체, 부형제 또는 희석제 중에 임의로 포함된, 현재 개시된 화합물의 유효량을 함유할 수도 있다. 용어 "제약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 완충액, 담체, 부형제 또는 희석제"는 인간 또는 다른 동물에게 투여하기 위해 적절한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충진제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 용어 "담체"는 적용을 수월하게 하기 위해 활성 성분이 조합되는 유기 또는 무기 성분, 천연 또는 합성 성분을 나타낸다. 제약학적 조성물의 성분은 본 발명의 중합체와 함께, 그리고 활성 화합물의 바람직한 제약학적 효능을 실질적으로 손상시키는 상호작용이 존재하지 않도록 상호 간에 혼합될 수 있다.
비경구 투여를 위해 적절한 조성물은 무균 수성 제제를 포함하고, 이것은 수용자의 혈액과 등장성일 수 있다. 허용가능한 부형제 및 용매 중에는 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 무균 응고유가 용매 또는 현탁 매질 로서 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하여 온화한 응고유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사액의 제조에서 유용하다. 피하, 근육내, 복강내, 정맥내 투여 등을 위해 적절한 담체 제제는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 제19판, A.R.Gennaro, ed., Mack Publishing Co., 미국 펜실바니아주 이스톤 (1995)]에서 찾아볼 수 있다.
조성물은 단위 투여 형태 또는 투여 단위 형태로 편리하게 존재할 수 있고 제약 기술에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 모든 방법은 하나 이상의 부속 성분을 구성하는 담체와 화합물을 조합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 화합물을 액체 담체, 미세 분할된 고체 담체 또는 양쪽 모두와 함께 균일하고 긴밀하게 조합시킨 다음, 필요하다면 생성물을 성형함으로써 제조된다. 본 발명의 화합물은 동결 건조된 상태로 보존될 수 있다.
다른 전달 체계는 시간-방출, 지연-방출 또는 지속-방출 전달 체계를 포함할 수 있다. 이러한 체계는 항-염증 또는 염증 제의 반복 투여를 피할 수 있고, 환자 및 의사에게 편의를 증가시킨다. 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테라미드, 폴리오르소에스테르, 폴리히드록시부티르산 및 폴리안히드라이드와 같은 중합체-기재 체계를 포함하여, 많은 유형의 방출 전달 체계를 이용할 수 있고, 당업자에게 알려져 있다.
약물을 함유하는 상기 중합체의 미세캡슐이 예를 들어 미국 특허 5,075,109호 (여기에서 참고문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다. 전달 체계는 스테롤을 포함 한 지질, 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 중성 지방, 예컨대 모노-, 디- 및 트리-글리세리드; 히드로겔 방출 체계; 실라스틱 체계; 펩티드-기초 체계; 왁스 코팅; 통상적인 결합제 및 부형제를 사용한 압축 정제; 부분 융합 이식물 등을 포함한다. 특정한 예는, 이에 한정되지 않지만 (a) 본 발명의 약제가 미국 특허 4,452,775, 4,675,189 및 5,736,152 (여기에서 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 것과 같은 기질 내에서 형태로 함유되는 침식 체계; 및 (b) 미국 특허 3,854,480, 5,133,974 및 5,407,686 (여기에서 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 것과 같은 중합체로부터 조절된 속도로 활성 성분이 침투되는 확산 체계를 포함한다. 또한, 펌프-기초 하드웨어 전달 체계가 사용될 수 있고, 그의 일부가 이식을 위해 채택된다.
용량, 치료 섭생법 및 투여
수술후 유착 및 세균 감염과 관련된 복강내 농양을 포함하여 다양한 종류의 상이한 염증-기초 병변에 대해 보호를 유도하거나, 또는 염증이 유익한 치료 또는 예방 효과를 제공하는 다양한 질병 상황 또는 질환과 관련된 염증을 유도하기 위하여, 본 발명의 적절히 선택된 화합물이 유효량으로 투여될 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 유효량이란, 본 발명의 항-염증 또는 염증 화합물의 양이 단독으로 또는 추가의 복용 또는 추가의 치료 화합물과 함께, 염증-기초 병변을 억제, 개선 또는 예방하거나, 또는 치료적으로 유익한 염증 반응을 자극하는 양이다. 용량 범위는 약 1 피코그램/킬로그램 체중 내지 약 1 밀리그램/킬로그램 체중, 또는 약 1 나노그램/킬로그램 체중 내지 약 1 마이크로그램/킬로그램 체중일 수 있다. 절대 량 은, 치료되어지는 질병 또는 질환의 성질, 투여가 예정 수술 또는 응급 수술과 병용되는지의 여부, 동시 치료, 복용 횟수, 개별 환자 매개변수, 예를 들어 연령, 신체 조건, 체격 및 체중, 및 치료되어지는 질병 또는 질환의 중증도를 포함하여 여러 요인에 의존될 것이고, 의사에 의해서 단지 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 최대 용량, 즉 건전한 의학적 판단에 따른 최고의 안전 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 본 발명의 제약학적 조성물의 다수 용량 투여가 의도된다.
염증-기초 병변, 또는 면역 체계 자극으로부터 이익을 얻는 질병 또는 질환을 예방하거나 치료하는 것이 필요한 인간 또는 동물 환자에게 투여되는 화합물의 최적의 양뿐만 아니라 이러한 화합물을 포함하는 치료적 또는 제약학적 조성물의 투여 방법은, 제약학적, 의학적 및 수의학적 분야의 숙련가에 의해 결정된다. 인간 또는 동물 환자의 복용량은, 염증-기초 병변 또는 치료되어지는 기타 질병 또는 질환의 성질, 환자의 상태, 체중, 일반적 건강, 성별, 음식, 시간, 지속기간, 및 투여 경로, 흡수율, 분포, 대사, 및 화합물의 분비, 다른 약물과의 조합, 염증-기초 병변의 중증도 또는 치료되어지는 다른 질병 또는 질환, 및 치료되어지는 병변 또는 질병 상황의 반응성에 의존되고, 원하는 수준의 효과를 얻기 위하여 쉽게 최적화될 수 있다. 치료 과정은 수 일 내지 수 주일 또는 수 개월간, 또는 치료가 실행되거나 질병 상황의 허용가능한 감소 또는 예방이 달성될 때까지 지속될 수 있다. 최적의 투여 스케쥴은 치료 효과와 함께 환자의 신체에서 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있다. 당업자라면, 최적의 용량, 투여 방법 및 반복 속도를 쉽 게 결정할 수 있다. 최적의 용량은 면역조절 중합체 화합물의 효능에 의존하여 변할 수 있고, 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적으로 밝혀진 ED50 값을 기초로 하여 일반적으로 산출될 수 있다. 염증-기초 병변 또는 치료되어지는 다른 질병 또는 질환의 치료 또는 예방을 위한 본 화합물의 유효량, 이러한 화합물을 함유하는 전달 운반체, 작용질, 및 치료 프로토콜은 통상적인 수단에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 의학 또는 수의학 개업의사는 피험자 또는 환자에서 낮은 용량의 화합물로 치료를 시작할 수 있고, 이어서 용량을 증가시키거나, 용량 섭생법을 체계적으로 변화시키고, 환자 또는 피험자에서 그의 효과를 검사하고, 원하는 치료 효과를 최대화하기 위하여 용량 또는 치료 섭생법을 조절할 수 있다. 용량 및 치료 섭생법의 최적화에 관한 추가의 언급은 문헌 [Benet 등, Goodman & Gilman's, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 제9판, Hardman 등, Eds., McGraw-Hill, New York (1996), 제1장, pp3-27] 및 [L.A.Bauer, Pharmacotherapy, A Pathophysiologic Approach, 제4판, DiPiro 등, Eds., Appleton & Lange, Stamford, Connecticut (1999), 제3장, pp.21-43] 및 그것에 인용된 참고문헌에서 찾아볼 수 있다.
다양한 투여 경로를 이용할 수 있다. 선택된 특정한 방식은 선택되어지는 화합물, 치료되는 특정한 조건, 및 치료 효능을 위해 필요한 용량에 의존할 것이다. 일반적으로 말하자면, 본 발명의 방법은 의학적으로 허용될 수 있는 투여 방식을 사용하여 실행될 수 있고, 이것은 임상적으로 허용될 수 없는 부작용을 일으키지 않으면서 효과적인 수준의 면역 반응을 일으키는 방식을 의미한다. 경구 투 여가 또한 사용될 수 있긴 하지만, 바람직한 투여 방식은 비경구 경로이다. 용어 "비경구"는 피하, 정맥, 근육내 또는 복강내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다.
본 발명의 내용에서, 여기에서 사용된 용어 "치료", "치료적 용도" 또는 "치료 섭생법"은 본 발명의 면역조절 중합체의 예방, 경감 및 치료적 투여 양식을 포함하는 것을 의미하고, 염증-기초 병변에 의해 유발된 질병 상황, 상태, 증상, 증후 또는 질환, 또는 치료되어야 하는 다른 질병 또는 질환을 치료하거나 또는 그와 관련된 증상, 증후, 상태 또는 질환을 예방하거나, 방해하거나, 지연시키거나 역전시키는 본 발명에 청구된 화합물의 어느 하나 및 모든 용도를 포함한다. 따라서, 바람직하지 못한 질병 상황, 염증-기초 병변과 관련된 증상, 상태, 증후 또는 질환, 또는 신체의 면역 반응의 자극으로부터 이익을 얻는 기타 질병 또는 질환의 예방, 개선, 완화, 역전 또는 완전한 제거가 본 발명에 의해 포함된다.
본 발명의 목적을 위하여, 암 치료법에 적용되어지는 용어 "치료하는", "치료" 등의 의미는 광범위하고, 당 기술분야에서 일반적으로 허용되는 넓은 종류의 상이한 개념을 포함한다. 따라서, 여기에서 사용된 이러한 용어는 이에 한정되지 않지만 진행하는 질병의 시간 연장; 종양 감소; 질병 완화; 고통 경감; 삶의 질의 개선; 생명 연장; 통증, 호흡 곤란, 식욕 소실 및 중량 소실, 피로, 허약, 우울 및 근심, 혼동 등과 같은 증상의 개선 또는 제어; 환자 안락함의 향상 등을 포함한다. 별도의 목표는 질병을 완전히 치료하는 것이다
용어 "암"은 많은 정의를 갖는다. 미국 암 협회에 따르면, 암은 비정상 세포의 제어되지 않는 성장 (때때로 전파)을 특징으로 하는 질병의 군이다. 하나의 상태로 종종 언급되긴 하지만, 실제로 200개 이상의 상이한 질병으로 구성된다. 이러한 세포가 지극히 중요한 기관의 정상적인 기능을 막거나 신체 전체에 퍼져서 필수 체계를 손상시킬 때 암성 성장이 죽일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 화합물의 종양파괴적 유효량을 상기 치료가 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 민감한 신생물의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 화합물이 치료제로서 효과적일 수도 있는 상이한 유형의 암의 비제한적인 예는, 이에 한정되지 않지만, 암종, 예컨대 다형성아교모세포종, 별아교세포종, 희소돌기아교세포 종양, 뇌실막세포 및 맥락막총 종양, 솔방울샘 종양, 신경원성 종양, 속질모세포종, 신경집종, 수막종 및 수막 육종을 포함하는 중추 신경계의 신생물, 기저세포 암종, 편평세포 암종, 흑색종, 횡문근육종 및 망막모세포종을 포함하는 눈의 신생물; 뇌하수체 신생물, 갑상샘의 신생물, 부신피질의 신생물, 신경내분비의 신생물, 위창자췌장 내부 체계의 신생물, 및 생식샘의 신생물을 포함하는 내분비샘의 신생물; 머리 및 목 암, 구강, 인두 및 후두의 신생물, 및 치원종양을 포함하는 머리 및 목의 신생물; 큰 세포 폐 암종, 소 세포 폐 암종, 비-소 세포 폐 암종, 악성 중피종, 가슴샘종 및 가슴의 원발성 배아 세포 종양을 포함하는 가슴의 신생물; 식도, 위, 간, 담낭, 외분비 이자, 소장, 충수 및 복막의 신생물, 결장 및 직장의 샘암종, 및 항문의 신생물을 포함하는 소화관의 신생물; 콩팥세포 암종, 신우, 요관, 방광, 요도, 전립샘, 음경, 고환의 신생물을 포함하는 비뇨생식관의 신생물; 및 외음 및 질, 자궁경부의 신생물, 자궁 체의 샘암종, 난소암, 부인 과 육종 및 유방 신생물을 포함한 여성 생식 기관의 신생물; 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 피부섬유육종, 메르켈 종양 및 악성 흑색종을 포함한 피부의 신생물; 골 육종, 악성 섬유 조직구종, 연골육종, 유잉 육종, 원시 신경외배엽 종양 및 혈관육종을 포함하는 골 및 연질 조직의 신생물; 골수형성이상증후군, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, HTLV-1 및 5 T-세포 백혈병/림프종, 만성 림프성 백혈병, 털세포 백혈병, 호지킨 병, 비-호지킨 림프종 및 비만 세포 백혈병을 포함하는 조혈기관 계통의 신생물; 및 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 신경모세포종, 골종양, 횡문근육종, 림프종, 및 신종양을 포함하는 어린이의 신생물을 포함한다.
특정한 염증-기초 병변 또는 치료되어지는 기타 질병 또는 질환의 성질, 중증도, 및 환자의 전체 상태에 의존하여 변할 수도 있는 기간 동안 특정한 치료 섭생법이 지속될 수 있으며, 수 일, 수 주일, 수 개월 이상 동안 하루 한번 또는 몇 번에 걸쳐 화합물-함유 조성물을 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 치료 후에, 환자의 상태의 변화 및 질환 또는 질병 상황의 증상, 증후, 또는 상태의 완화에 대하여 환자를 검사한다. 환자가 현재의 용량 수준에 현저하게 반응하지 않는 경우에 조성물의 용량을 증가시킬 수 있거나, 또는 질환 또는 질병 상황의 증후의 완화가 관찰된다면, 또는 질환 또는 질병 상황이 제거된다면 용량을 저하시킬 수 있다.
본 발명의 화합물의 치료적 유효량을 전달하기 위하여 최적의 투여 스케줄이 사용된다. 본 발명의 목적을 위하여, 여기에 개시된 화합물에 대한 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은, 바람직하게는 독성, 자극 또는 알레르기성 반응과 같은 좋지 못한 부작용을 갖지 않으면서, 원하는 목적을 달성하기 위해 효과적인 화합물의 양을 가리킨다. 개별 환자 요구가 변할 수도 있긴 하지만 제약학적 조성물의 유효량의 최적 범위의 결정은 당 기술분야의 범위 내에 있다. 인간 용량은 동물 연구로부터 추정될 수 있다 [A.S.Katocs, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 제19판, A.R.Gennaro, ed., Mack Publishing Co., 펜실바니아주 이스톤 (1995), 제30장]. 일반적으로, 당업자에 의해 조절될 수 있는, 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 제공하기 위해 필요한 용량은, 연령, 건강, 신체 조건, 체중, 수용자의 질병 또는 질환의 유형 및 정도, 치료 빈도, 동시 치료의 성질 (존재한다면), 및 원하는 효과의 성질 및 범위에 의존하여 변할 것이다 [Nies 등, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 제9판, Hardman 등, eds. McGraw-Hill, New York, NY, 1996, 제3장].
고 위험 개인을 위한 예방 양식이 본 발명에 의해 포함된다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "고 위험 개인"은, 예를 들어 염증-기초 병변 또는 관련된 질병 또는 질환의 개시 또는 재발, 또는 신체의 면역 반응의 자극으로부터 이익을 얻게 되는 질병/질환에 민감할 가능성이 정상보다 상당히 높은, 개인 또는 가족 병력 또는 유전적 시험, 생활 또는 작업 환경, 또는 상태 등을 통해 결정되는 개인을 가리키는 것이다. 예를 들어, 환자는 특정한 질병 또는 질환의 빈번한 발생을 포함하는 개인 및/또는 가족 병력을 가질 수 있다. 다른 예로서, 환자는 당 기술분야에 공지된 기술에 따라서 유전자 선별에 의해 결정되는 감수성을 가질 수 있다 (예를 들어, 문헌 [U.S.Congress, Office of Technology Assessment, 제5장, Genetic Monitoring and Screening in the Workplace, OTA-BA-455, U.S.Government Printing Office, Washington,D.C., 1990, 75-99면] 참조). 바이러스성 질병의 경우에, 환경은 감염 요인일 수 있다. 암의 경우에 유전자 및 환경 양쪽 모두가 감염 요인일 수 있다. 고 위험 개인의 치료 섭생법의 일부로서, 염증-기초 병변을 예방하거나 질병, 질환, 증후, 증상 또는 상태의 개시 또는 재발, 또는 증진된 면역 반응으로부터 이익을 얻을 수 있는 질병/질환을 예방하기 위하여 개인을 예방적으로 치료할 수 있다. 용어 "예방적 유효량"은, 감염 또는 염증, 염증 질병, 증상, 증후, 상태 또는 질환의 개시 또는 재발, 또는 신체의 염증 반응의 자극으로부터 이익을 얻는 질병/질환의 예방으로서 관찰되는 효과를 일으키는 본 발명의 제약학적 조성물의 양을 가리키는 것을 의미한다. 제약학적 조성물의 예방적 유효량은, 활성 약제가 부족한 두 번째 제약학적 조성물을 유사한 상황의 개인에게 투여할 때 관찰되는 효과에 비교하는 효과에 의해 전형적으로 결정된다.
치료적 용도를 위하여, 여기에 개시된 면역조절 화합물을, 질병, 증상, 증후, 상태 또는 질환의 조짐을 감소시키는데 효과적인 양으로, 감염성 질병 또는 암 기초 병변을 앓고 있거나 증진된 면역 반응으로부터 이익을 얻는 질병 또는 질환을 앓고 있는 것으로 의심되는 환자에게 투여할 수 있다. 당업자라면, 일상적인 방법에 의해 치료 섭생법을 위한 최적의 용량 및 치료 스케줄을 결정할 수 있다.
본 발명은 인간 또는 동물 피험자에서 세균 농양 또는 유착 형성을 막기 위해 바람직할 때에는 언제라도 유용하다. 이것은 예정된 수술 절차뿐만 아니라 응급 상황에서 이러한 상태를 예방하기 위한 예방적 치료를 포함한다. 최적의 용량 및 투여 섭생법은 농양 및/또는 유착 형성의 발전을 억제할 뿐만 아니라 특정한 세균 유기체 또는 각종 세균 유기체에 의한 농양 또는 유착 형성에 대해 완전한 보호를 가져오는 것이긴 하지만, 세균 감염/오염 및 이후의 농양/유착 형성에 대해 증진된 면역 반응이 얻어지는 섭생법이 사용될 수 있다. 특정한 중합체의 다수 용량을 전달하기 위해 바람직한 시간 간격은 단지 통상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 방법은 환자가 골반 염증 질병, 염증성 장 질환, 요로 감염, 및 결장 암과 같은 농양 형성에 걸리기 쉽게 하는 질병과 관련하여 유용하다. 따라서, 본 방법은 구체적으로 이에 한정되지 않지만 여드름과 같은 피부 농양을 포함하여 실제로 조직 또는 기관의 농양에서 유용하다. 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련가라면, 본 발명이 적용될 수 있는 상태 및 절차의 범위를 쉽게 인지할 것이다.
투여를 위한 용량은 약 1 피코그램/킬로그램 체중 내지 약 1 밀리그램/킬로그램 체중의 범위일 수 있고, 또는 투여 방식에 의존하여 약 1 나노그램/킬로그램 체중 내지 약 1 마이크로그램/킬로그램 체중이 효과적일 것이다. 절대 량은 각종 요인 (투여가 예정 수술 또는 응급 수술과 함께 이루어지는지의 여부, 동시 치료, 투여 횟수, 및 연령, 신체 조건, 체격 및 체중을 포함한 개별 환자 매개변수 포함)에 의존될 것이고, 일상적인 실험을 통해 결정될 수 있다. 일반적으로, 최대 용량이 사용되고, 다시말해서 건전한 의학적 판단에 따라 최고의 안전한 용량을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제약학적 조성물의 다수 용량 투여가 유착 형성에 대한 보호를 유 도하기 위해 의도된다. 이러한 다수 용량 투여는 수술 이전의 날에 시작하여 3일에 걸쳐 투여될 수 있다. 마찬가지로 수술 후에 추가의 용량을 투여할 수 있다. 최적의 용량 및 투여 섭생법은 수술후 유착 형성의 발생을 억제할 뿐만 아니라 수술후 유착 형성에 대해 완전한 보호를 제공하는 것이긴 하지만, 수술후 유착 형성을 감소시키는 섭생법이 사용될 수 있다. 본 발명의 면역조절 중합체의 하나의 다수 용량을 전달하기 위해 바람직한 시간 간격은, 단지 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
전신적으로 또는 국소적으로 유착 형성 가능성을 감소시키기 원하는 부위에 본 발명의 화합물을 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은 수용액으로서, 가교된 겔로서, 또는 수용액과 가교된 겔의 일시적 또는 물리적 조합으로서 투여될 수 있다. 면역조절 중합체는 국소 부위에서 피하 투여될 때, 또는 유착이 형성될 가능성이 있는 부위에서 먼 부위에서 효과적일 수 있다.
본 발명의 제제는 감염과 "동시에" 투여될 수 있고, 이것은 농양 또는 유착 형성에 대한 보호 효과가 얻어지도록 농양 또는 유착 형성에 걸리기 쉬운 수술, 외상 또는 질병과 시간상 충분히 밀접함을 의미한다. 제제는 예정 수술의 경우에 수술 전 오래 전 (즉, 수 주일 또는 수 개월)에 투여될 수 있고, 바람직하게는 수술 시간 (및 심지어 수술 후)에 밀접하게 추가 투여될 수 있다. 특히, 응급 상황에서, 외상 또는 수술 전 (수 분 내지 수 시간) 및/또는 후에 제제를 즉시 투여할 수 있다. 세균 감염/오염에 대한 피험자의 면역 반응을 증진시키기 위하여 수술 시간에 충분히 밀접하게 제제를 투여하는 것이 중요하고, 이에 의해 성공적인 숙주 반응의 기회를 증가시키고 농양 또는 유착 형성의 가능성을 감소시킨다.
본 발명이 속하는 기술분야의 숙련가라면, 본 방법이 넓은 범위의 질병, 증상, 상태, 증후, 질환 및 절차에 적용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 농양 및 유착 이외에도, 본 발명의 항-염증성 모노- 및 폴리SPA, 조성물 및 방법이 적용될 수 있는 기타 염증 과정 및 병변은 다음을 포함한다:
알레르기성 질병, 예컨대 (전신) 과민증, 혈청병, 전신 약물 반응, 식품 알레르기, 곤충 독물 알레르기 및 비만세포증; 기도 알레르기, 예컨대 알레르기 비염 천식 및 과민성 폐렴; 피부 알레르기, 예컨대 두드러기, 혈관부종, 습진, 아토피 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 감염성 피부염, 다형홍반 및 스티븐스-존슨 증후군; 및 안 알레르기, 예컨대 알레르기 결막염, 아토피 각막결막염, 성병 각막결막염, 거대유두결막염 및 접촉 알레르기.
기관 특이적 자가면역 질병은, 이에 한정되지 않지만 다음을 포함한다:
내분비 체계; (갑상샘) 하시모토 갑상샘엽, 그레이브스 질병, 갑상선기능항진증을 가진 갑상샘엽; 유형 I 자가면역 다분비선증후군, 유형 II 자가면역 다분비선증후군, 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 면역매개 불임증 및 자가면역 애디슨씨 병 포함.
피부; 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 부신생물성 천포창, 수포성 유사천포창, 포진피부염, 계통 IgA 질병, 후천성 표피 수포증, 자가면역 탈모, 결절홍반, 임신성 유사천포창, 흉터 유사천포창, 및 소아의 만성 수포 질병 포함.
혈액 체계; 자가면역 용혈 빈혈, 자가면역 저혈소판증 자색반증 (특발성 및 약물-관련) 및 자가면역 호중성 백혈구 감소증 포함.
신경근육 체계; 중증근육무력증, 이톤-램버트 근육무력 증후군, 근육강직 증후군, 급성 파종뇌척수염, 다발경화증, 길레인-배르 증후군, 만성 염증 탈수초성 다발신경근병증, 전도 차단을 가진 다촛점 운동 신경염, 및 단클론 감마병증을 가진 만성 신경병증 포함.
신생물딸림 신경 질환; 안간대-간대성 근경련 증후군, 소뇌 변성, 뇌척수염, 망막병증 포함.
간쓸개 체계; 자가면역 만성 활동 간염, 원발성 쓸개 경화 및 경화쓸개관염 포함.
위장관; 글루텐-민감성 창자병증, 악성빈혈 및 염증성 장 질환 포함.
기관 비특이적 자가면역 질병은 이에 한정되지 않지만 다음을 포함한다.
연결 조직 질병; 전신 홍반루푸스, 류마티스 관절염, 전신 경화증 (공피증), 강직척수염, 반응성 관절염, 다발근육염/피부근육염, 쇼그렌 증후군, 혼합된 연결 조직 질병, 베체트병 및 건선 포함.
혈관염 증후군; 전신 괴사 혈관염, 표준 결절 다발 동맥염, 알레르기성 맥관염 및 육아종증 (쳐그-스트라우스(Churg-Strauss) 질병), 및 다발성 혈관염 중복 증후군; 과민성 혈관염, 베게너 육아종증, 일시적 관절염, 다까야스(Takayasu) 관절염, 가와사끼(Kawasaki) 질병, 중추 신경계의 단리된 혈관염, 폐쇄혈전 혈관염, 및 기타 혈관염; 사코이드증, 이식편 대 숙주 병 및 한랭병증 포함.
본 발명의 항-염증 화합물이 유용한 다른 질병 및 상태는, 패혈증; 대장염; 심장 동맥병; 간 섬유증; 급성 호흡 곤란 증후군; 급성 염증 췌장염; 내시경 역행 쓸개 이자 조영술-유도 췌장염; 화상; 심장, 뇌 및 말초 동맥의 아테로마생성; 충수염; 담낭염; 곁주머니염; 내장 섬유성 질병 (간, 폐, 창자); 상처 치유; 피부 흉터 질환 (켈로이드, 화농땀샘염); 육아종병 (사코이드증, 원발성 담도 경화); 괴저 농피증; 스위트 증후군; 세포, 조직 또는 기관 이식; 알쯔하이머 병; 파킨슨병; 아테롬성경화증; 비만 및 암을 포함한다.
염증성 모노- 및 폴리SPA 화합물, 그의 조성물 및 이러한 화합물 및 조성물을 사용한 방법이 적용될 수 있는 질병 및 병변은 항바이러스 요법, 예를 들어 간염 B 바이러스 및 간염 C 바이러스 감염의 치료 또는 예방; 항암 요법; 및 백신 아주반트로서의 사용을 포함한다.
수술후 유착 형성에 대한 보호를 유도하기 위해 본 발명의 제약학적 조성물의 다수 용량 투여가 계획된다. 이러한 다수 용량 투여는 수술 이전의 날에 시작하여 3일에 걸쳐 투여될 수 있다. 마찬가지로 수술 후에 추가의 용량을 투여할 수 있다. 최적의 용량 및 투여 섭생법은 수술후 유착 형성의 발생을 억제할 뿐만 아니라 수술후 유착 형성에 대한 완전한 보호를 가져오는 것이긴 하지만, 수술후 유착 형성을 감소시키는 섭생법이 사용될 수 있다. 본 발명의 면역조절 중합체의 하나의 다수 용량을 전달하기 위해 바람직한 시간 간격은 단지 통상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
염증성 모노- 및 폴리SPA, 그의 조성물, 및 이러한 화합물 및 조성물의 사용 방법이 적용될 수 있는 질병 및 병변은 항바이러스 요법, 예를 들어 간염 B 바이러 스 및 간염 C 바이러스 감염의 치료 또는 예방; 항균 요법; 항진균 요법; 항기생동물 요법; 항암 요법; 및 백신 아주반트로서의 용도를 포함한다.
상기 설명은 본 발명의 많은 측면의 포괄적인 개략을 제공한다. 하기 실시예는 다양한 측면을 예증하며, 어느 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되거나 의도되어서는 안된다. 본 발명은 여기에 기재된 특정한 실시예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 기능적으로 균등한 생성물, 조성물 및 방법은 명백하게 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명은 달리 나타내지 않는 한 분자생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술, 용액 중의 펩티드 합성, 고체상 펩티드 합성 및 면역학의 통상적인 기술을 사용하여 부당한 실험 없이 수행된다. 이러한 절차는 예를 들어 하기 참고문헌에 기재되어 있다.
Figure 112007082550753-PCT00043
본 발명은 하기 실시예에서 더욱 예증될 것이다.
실시예 1: 모노SPA 및 폴리SPA의 화합물의 제조
지질 II 전구체로부터 이당류 단위의 중합은 에피토프(들)의 공유 부착 전 또는 후에 실행될 수도 있다. 에피토프 분절의 생리화학적 성질은 보통 경로 선택에서 선택을 결정하는 요인일 것이다. 펩티드 또는 펩티드/탄수화물 분절이 가용성이라면, 충분히 동화된 지질II의 구성이 중합 이전에 달성될 수도 있다. 에피토프 가용성이 문제가 된다면, 미리-설치된 적절한 에피토프 부착 점, 즉 알킬 아지드를 가진 폴리SPA를 발생시킬 수 있다. 일반적으로 양쪽 대안이 예증된다. 설명되는 예는 억제성 모노/폴리SPA를 특징으로 한다; 자극 모노/폴리SPA가 정확하게 동일한 방식으로 제조된다.
실시예 1A: 에피토프 분절이 가용성이다: 중합 이전에 충분히 동화된 지질 II
비스노르-아지도-Lys 지질 II로의 펩티드 전구체의 합성. 세부 사항은 유기 합성 기술 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
Figure 112007082550753-PCT00044
비스노르-아지도-Lys 지질 II의 합성. 세부 사항은 유기 합성 기술 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 표시되는 경우에, WO 03075953호에 교시된 정확히 동 일한 공정이 사용되며, 여기에서 화합물 5 대신에 Ts-디펩티드가 치환되어진다.
Figure 112007082550753-PCT00045
문헌 [Rostovtsev 등 (2002) Angew.Chem.Int.Ed. 114: 2708] (여기에서 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 바와 같이 모노 또는 폴리 에피토프(들)가 아지도-지질 II에 정확하게 부착된다.
Figure 112007082550753-PCT00046
WO 03/075953호에 교시된 조건 하에서 촉매적 MtgA를 사용하여, 비치환 지질 II, 예를들어 WO 03/075953으로부터의 화합물 14를 에피토프 지질(들) II와 공중합하면, 에피토프 지질(들) II의 선택에 의해 결정되는 바와 같이, 모노SPA 또는 폴리SPA가 얻어진다. 비치환 및 에피토프-치환 지질 II의 상대적 중합 속도는, 에피토프 분자량이 1kDa 또는 그 미만일 때 거의 동일하다 (데이타가 표시되지 않음). 따라서, 에피토프는 다당류 주쇄를 따라 거의 고르게 분포된다.
Figure 112007082550753-PCT00047
실시예 1B: 모노SPA 및 폴리SPA의 화합물의 대안적인 제조
WO 03/075953호에 교시된 조건 하에서 촉매적 MtgA를 사용하여 비치환 지질 II, 예를 들어 WO 03/075953으로부터 화합물 14를 아지도-지질 II와 공중합하면, 혼합물 중에서 아지도-지질 II의 몰비에 의해 결정되는 선형 밀도에서 다당류 주쇄를 따라 분포된 에피토프를 위한 부착 점인 알킬 아지드를 가진 SPA가 얻어진다 (비치환 지질 II의 몰 분율 + 아지도 지질 II의 몰 분율 = 1.00). 비치환 및 아지드-치환된 지질 II의 상대 중합 속도는 실제로 동일하다.
Figure 112007082550753-PCT00048
중합 후에 아지드를 에피토프(들)로 치환한다. 명백하게, 선택된 에피토프의 수에 의존하여 모노SPA 또는 폴리SPA가 얻어질 것이다. 문헌 [Rostovtsev 등 (2002) Angew.Chem.Int.Ed. 114:2708]에 따라서 에피토프가 적용되고 WO 03075953호에서 화합물 15에 대해 기재된 바와 같이 SPA를 정제한다.
Figure 112007082550753-PCT00049
실시예 2: 모노SPA 및 폴리SPA의 화합물의 특징분석
모노SPA 및 폴리SPA를 포함한 모든 SPA의 다당류 부분은 라이소자임 소화에 동등하게 민감하다. SPA에 대한 분석 계획안을 발전시키기 위해 이러한 현상의 장 점이 취해질 수도 있다. 실온에서 라이소자임의 피코몰 농도가 반응하여, 거대분자 다당류 주쇄를 더욱 작은 다당류 분절으로 분해한다. 마이크로몰 라이소자임 (난백 또는 박테리오파지 T4)은 37℃에서 SPA를 완전히 및 특이적으로 성분 이당류-펩티드로 분해시킨다. 이러한 이당류 펩티드를 HPLC 피크 통합에 의해 상대적 다량으로 정량화한다. SPA의 이당류 펩티드 분절을 확인하고 정밀하게 특징화하기 위하여, 전자분무 이온화 질량 분광법 및 퓨리어(Fourier) 변형 질량 분광법과 조합된 HPLC를 사용한다.
다른 거대분자 생체분자, 예를 들어 항체, DNA, 단백질 등과 유사하게, SPA를 단순히 동결건조시킬 수 없고 수용액 중에서 농도를 결정하기 위해 측량한다. SPA는 매우 다량이지만 측정될 수 없는 양의 구조적 물을 함유한고, 이것은 동결건조에 의해 측정되거나 제거될 수 없다. SPA의 농도를 정확하게 결정하기 위하여 간접적인 방법이 사용된다. SPA의 이당류 펩티드 성분의 확실한 샘플을 아노머 치환에 의해 독립적으로 합성하고, 이러한 독립적으로 합성된 분절이 상응하는 라이소자임 소화 분절으로부터 크로마토그래피에 의해 분화될 수 있도록 한다. 아노머에 의해 표지화된 분절에 대하여 HPLC 피크 면적의 함수로서 질량의 표준 곡선이 결정될 때, 용액 중에서 주어진 SPA의 절대 농도가 결정된다. SPA의 동물 모델 및 임상 연구에서 용량의 정확한 결정을 위하여 이러한 기술이 유용하다.
실시예 3: 화학식 5, 6의 화합물 및 모노- 및 폴리SPA에 의하여 인간 PBMC에서 TNF-α의 차동 유도
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 의해 친염증 사이토카인 TNF-α의 생성을 유도하기 위한 화학식 5 및 6의 화합물, 및 모노- 및 폴리SPA의 능력을 하기 기재된 바와 같이 결정한다. 여기에 개시된 구조의 SPA가 TLR2를 자극하는지의 여부를 확립하기 위하여 이러한 시험을 사용할 수도 있고, 따라서 항원-특이적 억제 또는 친염증 효과를 전달하는 능력을 갖는다.
인간 PBMC에 의한 TNF-α의 생성이 TLR2를 통한 결찰 및 신호화에 의존되기 때문에, 허용되어지고 TLR2에 대한 결합을 가능하게 하는 에피토프 밀도를 결정하기 위하여 이러한 프로토콜이 사용될 수 있다. SPA 내 에피토프 밀도의 함수로서 TNF-α의 생성을 추적하고, 존재한다면 굴곡이 결정된다. 하기 염증-기초 분석에서 신호를 가능하게 하는 최대의 에피토프 밀도는 적절히 유도체화된 SPA에서 억제를 가능하게 하는 것과 동일한 에피토프 밀도인 것으로 추측된다.
10% FBS를 함유하는 RPMI 매질 (양쪽 모두 캘리포니아 칼스배드 인비트로겐 코포레이션으로부터 입수됨) 중에서 1.0×106 세포/ml의 밀도로 도말된 피콜 (스웨덴 업살라 파르마시아) 위에서 밀도 구배 원심분리에 의해 인간 공여체로부터의 PBMC를 단리하고, 별도로 화합물 2, 화합물 1, 또는 억제성 또는 친염증성 모노- 및 폴리SPA의 존재 또는 부재 하에서 5% CO2 대기 중에서 18 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 별도의 대조 세포를 동일한 조건 하에서 10 ng/ml S.아우레우스 펩티도글리칸 (시그마)과 함께 배양하였다. 배향 후에, 피펫팅에 의해 다양한 세포로 부터 조직 배양 배지를 제거하고, TNF-α에 대한 단클론 항체를 사용하는 통상적으로 입수가능한 샌드위치 ELISA 키트를 사용하여 그 안에 존재하는 TNF-α의 양을 결정 하였다 (BD OptEIATM 세트 인간 TNF, 파르밍겐 인코포레이티드). 이러한 ELISA 분석은 7.8 pg/ml의 TNF-α에 대한 검출 한계를 갖는다.
18 시간 동안에 500 mg/ml, 100 mg/ml 및 1 mg/ml의 화합물 2로의 배양은 각각 64.0 pg/ml, 17.6 pg/ml 및 1.82 pg/ml TNF-α의 생성을 유도하는 반면, 이러한 공여체 세포에서 동일한 농도의 화합물 1을 사용하면 검출가능한 TNF-α가 관찰되지 않는다. 10 ng/ml의 S.아우레우스 펩티도글리칸으로의 배양은 이러한 공여체 세포에서 26 pg/ml TNF-α를 유도한다.
실시예 4: SJL/J 생쥐에서 단백지질 단백질 139-151-유도된 실험적 자가면역 뇌염(EAE)의 개선
다발 경화증(MS)은 청년에 영향을 미치는 중추 신경계의 만성 자가면역 염증 질병이다. 미엘린 단백질로부터 유래된 펩티드, 다시 말해서 단백지질 단백질 (PLP) 139-151, 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질 (MOG) 35-55 또는 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 85-99의 투여에 의하여, 생쥐에서 MS의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌염(EAE)을 유도하였다. 어떠한 이론에 의해 구속되지 않지만, 이러한 모델에서 자기-반응성 CD4+ T 세포는 질병을 매개하는 친염증 사이토카인 IFN-γ를 생성한다. 억제성 사이토카인, 예컨대 IL-4 및 IL-10은 그의 중증도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다 [Stern 등, (2004) PNAS 101: 11743].
3가지 프로토콜: (i) 자가항원 및 화합물의 동시 투여 (예방); (ii) 화합물로의 예비-처리 (예방접종) 및 (iii) 질병 개시 후 화합물의 투여 (치료)를 사용함 으로써, PLP 139-151을 가진 SJL/J 생쥐에서 유도된 MS(EAE)의 동물 모델에서 본 발명의 다양한 화합물의 효능이 증명되었다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 생쥐 펩티드 서열을 가진 생쥐 모델을 수행하며; 인간 의약은 인간 펩티드 서열을 필요로 한다. 본 발명의 범위는 종-특이적 펩티드의 사용에 의해 제한되지 않는다.
PLP 139-151 및 화합물로 생쥐의 공동-면역화는 EAE 에 대해 보호한다
SJL/J 생쥐를 50㎍의 PLP 139-151 및 이 용량 범위의 화합물로 피하 면역화한다. PLP-면역화 군에서, EAE의 첫 번째 임상 징후는 약 8일에 나타나서 100%의 치사율을 나타낸다. 본 발명의 효과적인 항-염증성 모노- 또는 폴리SPA로 공동-면역화된 생쥐 (용량 군, 약 10 ng 내지 약 100 ㎍)는, 지연된 시점에서 EAE를 발생시킨 다음 다양한 용량-의존적 비율로 회복되거나 (최소의 포지티브 결과), 또는 45일 시험 기간 후에 필수적으로 질병을 발병하지 않는다 (최대의 포지티브 결과). 생쥐의 예비-면역화는 PLP 139-151-유도 EAE 에 대해 보호한다
완전 프뢴드 아주반트(CFA)에서 50㎍의 PLP 139-151을 투여하기 전 2일에 화합물 (투여 군, 약 10 ng 내지 약 100 ㎍)로 SJL/J 생쥐를 피하 면역하였다. 모든 대조 생쥐 (PLP 139-151/CFA)는 EAE를 발생시키고 100% 치사율까지 계속되었다. 2일에 본 발명의 효과적인 항-염증성 모노- 또는 폴리SPA로의 사전-주사는 증상을 개선시키고 치사율이 없었다. 이러한 방식으로 화합물의 효능 순위를 결정한다.
확립된 PLP 139-151-유도 EAE 를 화합물로 치료하면 질병 고생을 감소시킨다.
SJL/J 생쥐를 PLP 139-151 (CFA 중의 50㎍)으로 피하 면역화하였다. 약 10일에, 모든 생쥐들이 EAE (유연한 꼬리)의 경증 임상 증후를 발생시킬 때, 본 발명 의 모노- 또는 폴리SPA (투여 군, 약 10 ng 내지 약 100 ㎍)를 5일간 계속 동안 피하 투여하였다. 모든 대조 생쥐 (PLP 139-151/CFA)는 심각한 EAE 임상 증후를 발전시키고 100% 치사율까지 계속되었다. 치료 군에서 임상 증후의 억제를 평가한다.
EAE / MS 시험 화합물 및 임상 가설
시험 계획에서 첫 번째 화합물은 코팍손(Copaxone) (Cop1, 글라티라머 아세테이트), 랜덤 펩티드 공중합체 (Y,E,A,K)n이다. 이것은 포지티브 대조로서 작용하고, 인간 의약에서 MS 재발을 위한 치료의 표준이다.
시험 도식에서 두 번째 화합물은 화합물 1을 기초로 한다. 상기 제시된 바와 같이, 화합물 1은 염증 병변에 대해 전신 억제 효과를 나타내며, 모델에서 어느 수준의 효능을 갖는 것으로 기대된다.
시험 도식에서 세 번째 화합물은 미엘린 염기성 단백질 에피토프를 기초로 한 억제성 모노SPA (하기 참조)이다. 이러한 화합물은 단독 에피토프로부터 얻어질 수도 있는 억제 활성에서 상대적 효능 수준을 시험한다.
Figure 112007082550753-PCT00050
시험 도식에서 세 번째 화합물은 3개의 MS (EAE) 관련 에피토프를 기초로 하는 억제성 폴리SPA (하기 참조)이다. 이 화합물은 다중 MS- (EAE)-관련 에피토프로부터의 결과일 수도 있는 억제 활성에서 효능의 상대적 수준을 시험한다.
Figure 112007082550753-PCT00051
실시예 5: 인간 종양 항원에 대한 면역학적 반응의 유도
인간 흑색종 면역원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, 다수의 T-헬퍼 및 표적 에피토프를 포함하는 친염증성 폴리SPA의 능력을 평가하였다 [Chianese-Bullock 등 (2005) J.Immunol. 174: 3080, Slingluff 등 (2001) Clin.Cancer Res. 7:3012]. 3개의 HLA-A2-제한된 CTL 표적 에피토프: 티로시나제369 -377 (YMDGTMSQV), Gp100209-217 (IMDQVPFSV) 및 MAGE-A10254-263 (GLYDGMEHL)의 활성을 증대시키기 위하여, 원형 자극 폴리SPA 구조물은 3개의 T-헬퍼 에피토프를 함유한다: 개 홍역 바이러스-F로부터의 2개 (TLMTKNVKPLQSLGSGR, KLIPNASLEINCTLAEL) 및 파상풍 톡소이드로부터의 1개 (AQTIKANSKFIGITEL).
스템 펩티드가 Ala-D-이소-Gln 및 Ala-D-이소-Gln-비스노르-아지도-Lys를 각각 0.7 및 0.3의 몰 분율로 포함하는 2개의 지질 II의 공-중합에 의하여 폴리SPA를 제조하였다. 따라서, 얻어지는 폴리SPA의 스템 펩티드의 30%는 C-말단 아지드 잔기를 함유할 것이다. 최종 서열이 관련 T-헬퍼 펩티드, 예를 들어 AQTIKANSKFIGITELSGSG (프로파르길G)에 대해 스페이서 잔기 Ser-Gly-Ser-Gly-프로파르길Gly C-말단을 함유하고 표적 에피토프의 최종 서열이 관련 CTL 펩티드, 예를 들어 (프로파르길Gly)GSGSYMDGTMSQV에 대한 스페이서 잔기(프로파르길Gly)-Gly-Ser-Gly-Ser N-말단을 함유하도록, 표준 고체상 기술을 사용하여 시판 업자에 의해 다양한 에피토프를 합성한다. 모든 펩티드는 시판 공급업자에 의해 결정되는 바와 같이 HPLC 분석에 의해 균일하다. 최종 펩티드 서열, 3개의 T-헬퍼 및 3개의 CTL이 폴리SPA의 아지드-함유 단위에 대해 약간의 화학양론적 과량으로 존재하도록 수용액을 제조하였다. 아스코르브산 및 구리 금속 분말을 첨가하고 실온에서 14시간 동안 슬러리를 교반하였다 [Rostovtsev 등 (2002) Angew.Chem.Int.Ed. 114: 2708]. 구리를 원심분리에 의해 제거한 후에, 상층액을 교반-셀 농축기에 놓은 다음, 유출 전도도가 거의 제로가 될 때까지 주입용 수를 사용하여 농도 희석 주기로 처리하였다. 분취량을 제거하고 동결건조하여 대략적인 폴리SPA 농도를 결정한다. 이러한 폴리SPA는 도 5에서 정리된 도식의 특정한 예이다. 두 번째 분취량을 난백 라이소자임으로 철저히 처리하여 SPA의 다당류 주쇄를 특이적으로 제거하고, 성분 이당류-펩티드 성분을 나타낸다. HPLC/전기분무 질량 분광측정법 및 HPLC/퓨리어 변형 질량 분광측정법에 의하여 6개의 관련 이당류 펩티드 성분의 정확한 조성 및 상대적 과량을 결정하였다. 폴리SPA 용액의 나머지를 생체내 평가를 위해 취하였다.
HLA-A2 트랜스제닉 생쥐 (미들이스트 바 하버 잭슨 래보러토리즈)를 3개 복용 군: 1 ㎍, 10 ㎍ 및 100 ㎍에서 폴리SPA로 면역화하였다. 각각의 복용 군에서 예방접종을 0일, +21 일 및 +35 일에 목덜미에서 피하 실행하였다. +38 일에서, 표준 기술에 의해 말초 혈액을 분석하여 표적 에피토프의 어느 것 또는 전부에 특이적인 항체 적정값(들)을 결정하였다. 동물을 +39 일에 희생시키고, 배수 림프절을 수집하였다. 암 면역학의 실행을 경험한 사람에게 친숙한 표준 테트라머, 51Cr 이형 및 엘리스포트(Elispot) 분석을 사용하여 림프 절로부터 CD8+ T 세포 (CTL) 활성을 결정하였다. 포지티브 결과는 어느 하나 또는 모든 분석에서 배경에 대해 관찰된 항원-특이적 CTL 활성이다.
암 고환 항원(CTA), 예컨대 본 실시예에서 예증된 항원은 흑색종, 비-소 세 포 폐, 방광, 유방 및 전립선을 포함하여 다수의 암에서 발현된다 [Scanlan 등 (2004) Cancer Immun. 4:1]. 따라서, 본 실시예는 종양 임상 환경에서 널리 적용하기 위한 기초를 제공한다. 부착된 에피토프와 무관하게 TLR2를 통하여 신호화하는 능력에 기인하여 본 발명의 모노- 및 폴리SPA를 포함하는 자극 sPGN이 말초 혈액 단핵 세포로부터 TNF-α의 생성을 유도하기 때문에, 자극 sPGNs는 암 화학요법의 상황에서 항원의 제시를 위한 자기-아주반트 플랫폼으로서 특히 유용하다 (WO 2005/0305588). TNF-α는 정상 세포에 영향을 미치지 않으면서 조절되지 않은 멜라닌세포 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다. TNF-α는 또한 혈관신생의 종양-특이적 억제제로서 작용한다: 이것은 주위의 상피 세포를 통한 혈액 및 산소 공급을 제한함으로써 종양 성장을 억제한다 [Goldsby, Kindt, Osborne and Kuby; Immunology, 제5판, W.H.Freeman and Company, New York: 2003, pp.216-217].
모든 인용은 참고문헌으로 포함된다.
본 발명은 하나 이상의 구현양태에 관해 설명되었다. 그러나, 청구의 범위에 한정된 바와 같이 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서, 다수의 변형 및 변화가 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (26)

  1. 제1 에피토프 및 제2 에피토프가 각각 공유 부착된 TLR2-표적화 합성 펩티도글리칸(PGN) 잔기를 포함하고,
    제1 에피토프가 하나 이상의 제네릭 T 헬퍼 에피토프를 포함하고, 제2 에피토프가 하나 이상의 표적 에피토프를 포함하며; 제1 및 제2 에피토프가 SPA 내에 각각 하나 이상의 카피로 존재하고,
    각각의 표적 에피토프가 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고, 각각의 표적 에피토프가 CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원인,
    친염증성 합성 다당류 항원(SPA) 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
  2. 제1항에 있어서, SPA 내에 하나 이상의 카피로 존재하는 표적 에피토프 단일 종을 포함하는, 친염증성 SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
  3. 제1항에 있어서, SPA 내에 각각 하나 이상의 카피로 존재하는 2종 이상의 표적 에피토프를 포함하는, 친염증성 SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
  4. 제2항에 있어서, SPA가 다음 중에서 선택되는 것인 친염증성 SPA 및 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
    Figure 112007082550753-PCT00052
    , 또는
    Figure 112007082550753-PCT00053
    상기 식에서,
    W는 SPA 내 단량체 단위의 총 수이고 약 10 내지 약 375 범위의 정수이며;
    R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
    x는 SPA 내 비치환 반복 단위(UR)의 몰 분율이고;
    yn는 SPA 내 Th 에피토프 반복 단위(ThR)의 n번째 종의 몰 분율이고;
    z는 SPA 내 표적 에피토프 반복 단위(TR)의 몰 분율이고;
    ynz는 SPA 내 조합된 Th 에피토프/표적 에피토프 반복 단위(Th/TR)의 n번째 종의 몰 분율이고;
    스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하며;
    링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며, R은 저급 알킬이고;
    스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
    스페이서 2는 0 내지 약 10개 아미노산 길이이고;
    표적 에피토프는 CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원인 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고;
    (Th 에피토프)n는 n개의 상이한 Th 에피토프이고, 각각의 Th 에피토프는 독립적으로 선택되고 제네릭 T 헬퍼 에피토프를 포함한다.
  5. 제3항에 있어서, SPA가 다음 중에서 선택되는 것인 친염증성 SPA 및 제약학적으로 허용가능한 그의 염:
    Figure 112007082550753-PCT00054
    상기 식에서,
    W는 SPA 내 단량체 단위의 총 수이고 약 10 내지 약 375 범위의 정수이며;
    R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
    x는 SPA 내 비치환 반복 단위(UR)의 몰 분율이고;
    yn는 SPA 내 Th 에피토프 반복 단위(ThR)의 n번째 종의 몰 분율이고;
    zn는 SPA 내 표적 에피토프 반복 단위(TR)의 n번째 종의 몰 분율이고;
    ynzn는 SPA 내 조합된 Th 에피토프/표적 에피토프 반복 단위(Th/TR)의 n번째/n번째 종의 몰 분율이고;
    스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하며;
    링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
    스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
    스페이서 2는 0 내지 약 10개 아미노산 길이이고;
    (표적 에피토프)n는 n개의 상이한 표적 에피토프이고, 각각의 표적 에피토프는 독립적으로 선택되며, CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원인 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고;
    (Th 에피토프)n는 n개의 상이한 Th 에피토프이고, 각각의 Th 에피토프는 독립적으로 선택되고 제네릭 T 헬퍼 에피토프를 포함한다.
  6. 제3항 또는 제5항에 있어서, SPA가 각각 하나 이상의 카피로 존재하는, 약 2 내지 약 180개의 표적 에피토프 및 약 1 내지 약 180개의 Th 헬퍼 에피토프를 포함하는 것인 친염증성 SPA.
  7. SPA 내에 각각 하나 이상의 카피로 존재하는 하나 이상의 표적 에피토프가 공유 부착된 TLR2-표적화 합성 펩티도글리칸(PGN) 잔기를 포함하며, 표적 에피토프의 각각의 종이 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기인,
    억제성 합성 다당류 항원(SPA) 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
  8. 제7항에 있어서, SPA 내에 하나 이상의 카피로 존재하는 단일 표적 에피토프를 포함하는 억제성 SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
  9. 제7항에 있어서, SPA 내에 각각 하나 이상의 카피로 존재하는 2종 이상의 표적 에피토프를 포함하는 억제성 SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
  10. 제8항에 있어서, SPA가 하기 화학식인 억제성 SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
    Figure 112007082550753-PCT00055
    상기 식에서,
    W는 SPA 내 단량체 단위의 총 수이고 약 10 내지 약 375 범위의 정수이며;
    R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
    x는 SPA 내 비치환 반복 단위(UR)의 몰 분율이고;
    z는 SPA 내 표적 에피토프 반복 단위(TR)의 몰 분율이고;
    스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하지 않으며;
    링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
    스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
    표적 에피토프는 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이다.
  11. 제9항에 있어서, SPA가 하기 화학식인 억제성 SPA 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
    Figure 112007082550753-PCT00056
    상기 식에서,
    W는 SPA 내 단량체 단위의 총 수이고 약 10 내지 약 375 범위의 정수이며;
    R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
    x는 SPA 내 비치환 반복 단위(UR)의 몰 분율이고;
    zn는 SPA 내 표적 에피토프 반복 단위(TR)의 n번째 종의 몰 분율이고;
    스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미 드 기가 존재하지 않으며;
    링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
    스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
    (표적 에피토프)n는 n개의 상이한 표적 에피토프이고, 각각의 표적 에피토프는 독립적으로 선택되며, 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이다.
  12. 제9항 또는 제11항에 있어서, SPA가 각각 하나 이상의 카피로 존재하는 약 2 내지 약 180개의 표적 에피토프를 포함하는 것인 억제성 SPA.
  13. 하기 서열을 포함하는 중합체인 합성 다당류 항원 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
    X1-[-MO-]w-X2
    상기 식에서,
    X1 및 X2는 독립적으로 H 또는 터미네이터이고;
    W는 중합체에서 단량체 단위 (MO)의 수를 나타내고, 약 2 내지 약 375 범위 의 정수일 수도 있고,
    각각의 MO는 비치환 반복 단위(UR), 1종 이상의 Th 에피토프 반복 단위(ThR), 1종 이상의 표적 에피토프 반복 단위(TR), 1종 이상의 조합된 Th/표적 에피토프 반복 단위(Th/TR), 및 이들의 조합을 포함한 군에서 선택되는 단량체 단위이다.
  14. 제13항에 있어서, SPA가 랜덤 공중합체인 합성 다당류 항원.
  15. 제13항에 있어서, SPA가 블록 공중합체인 합성 다당류 항원.
  16. 제13항에 있어서, SPA가 교대 공중합체인 합성 다당류 항원.
  17. 제13항에 있어서, SPA가 제1 에피토프 및 제2 에피토프가 공유 부착된 TLR2-표적화 합성 펩티도글리칸(PGN) 잔기를 포함하는 친염증성 합성 다당류 항원이고; 제1 에피토프는 하나 이상의 제네릭 T 헬퍼 에피토프를 포함하고; 제2 에피토프는 하나 이상의 표적 에피토프를 포함하며; 제1 및 제2 에피토프가 SPA 내에 각각 하나 이상의 카피로 존재하고; 각각의 표적 에피토프는 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고, 여기에서 각각의 표적 에피토프는 CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원인, 합성 다당류 항원 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
  18. 제13항에 있어서, SPA가 하나 이상의 표적 에피토프가 공유 부착된 TLR2-표적화 합성 펩티도글리칸(PGN) 잔기를 SPA 내에 각각 하나 이상의 카피로 포함하는 억제성 합성 다당류 항원이고, 여기에서 각각의 표적 에피토프는 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기인 합성 다당류 항원 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
  19. 약 10 내지 약 375개의 단량체 단위를 포함하고, 단량체 단위가 하기 화학식으로부터 독립적으로 선택되는 것인 친염증성 합성 다당류 항원(SPA) 및 제약학적으로 허용가능한 그의 염:
    Figure 112007082550753-PCT00057
    , 또는
    Figure 112007082550753-PCT00058
    상기 식에서,
    R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
    스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하며;
    링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
    스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
    스페이서 2는 0 내지 약 10개 아미노산 길이이고;
    (표적 에피토프)n는 n개의 상이한 표적 에피토프이고, 각각의 표적 에피토프는 독립적으로 선택되며, CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원인 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고;
    (Th 에피토프)n는 n개의 상이한 Th 에피토프이고, 각각의 Th 에피토프는 독립적으로 선택되고 제네릭 T 헬퍼 에피토프를 포함한다.
  20. 약 10 내지 약 375개의 단량체 단위를 포함하고, 단량체 단위가 독립적으로 하기 화학식으로부터 선택되는 것인, 친염증성 합성 다당류 항원(SPA) 및 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
    Figure 112007082550753-PCT00059
    상기 식에서,
    R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
    스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하며;
    링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
    스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
    스페이서 2는 0 내지 약 10개 아미노산 길이이고;
    (표적 에피토프)n는 n개의 상이한 표적 에피토프이고, 각각의 표적 에피토프는 독립적으로 선택되며, CD8+ T 세포 또는 B 세포에 대한 면역원인 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이고;
    (Th 에피토프)n는 n개의 상이한 Th 에피토프이고, 각각의 Th 에피토프는 독립적으로 선택되고 제네릭 T 헬퍼 에피토프를 포함한다.
  21. 약 10 내지 약 375개의 단량체 단위를 포함하고, 단량체 단위가 하기 화학식으로부터 독립적으로 선택되는 것인, 억제성 합성 다당류 항원(SPA)및 제약학적으로 허용가능한 그의 염.
    Figure 112007082550753-PCT00060
    상기 식에서,
    R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬로부터 선택되고;
    스템 펩티드는 독립적으로 선택되고 약 2 내지 약 5개 아미노산을 포함하며, 아미노산이 α 또는 γ 카르복실 기에서, 그리고 α 또는 ε 아미노기에서 또는 이들의 조합에서 독립적으로 연결되고, 단, 매달린 카르복실레이트 또는 카르복사미드 기가 존재하지 않으며;
    링커 1 및 링커 2는 독립적으로 선택되고, 약 1 내지 약 6개 분절을 포함하며, 각각의 분절은 -CH2-, -CHR-, =CH-, 및 ≡CH-, -O-, -NH-, -NR-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 선택되고, 단 헤테로원자 분절들이 이웃하지는 않고 헤테로원자 분절들이 분절 1 및 2에 있지 않으며 R은 저급 알킬이고;
    스페이서 1은 약 1 내지 약 10개 아미노산 길이의 펩티드이고;
    (표적 에피토프)n는 n개의 상이한 표적 에피토프이고, 각각의 표적 에피토프는 독립적으로 선택되며, 펩티드 서열 또는 탄수화물 잔기이다.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 합성 다당류 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염 및 제약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 합성 다당류 항원 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염의 약제로서의 용도.
  24. 면역조절제로의 치료에 감수성인 질병 또는 질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염의 용도.
  25. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염의 유효량을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 면역조절제로의 치료에 감수성인 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 합성 다당류 항원 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법.
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