KR20020084841A - Ｉｌ5 활성을 다운-조절하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 호산성 백혈구 농도 증가로 특징지어지는 질환, 즉 천식 및 기타 만선 알러지성 질환의 치료 및 예방을 개선하는 방법에 관한 것이다. IL5에 대한 항체를 생산할 수 있는 인터류킨 5 (IL5)를 다운-조절함으로써 호산구 활성을 감소시키는 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 이 방법에 유용한 변형된 IL5의 제조방법과 변형된 IL5 자체를 제공한다. 또한, 본 발명은 변형된 IL5를 코딩하는 핵산 단편 및 이러한 핵산 단편을 지니는 벡터 및 그에 의해 형질전환된 숙주 세포 및 세포주도 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 유용한 IL5 유사체의 동정방법 및 변형된 IL5 함유 조성물 또는 IL5 유사체를 코딩하는 핵산 함유 조성물도 제공한다. 본 발명의 바람직한 구체예는 자가 IL5에 결합할 수 있는 가교성 항체 생산을 유도할 수 있도록, 외래 T 헬퍼 에피토프를 도입시키는, IL5 변이체의 이용방법을 포함한다.

Description

ＩＬ5 활성을 다운-조절하는 방법{METHOD FOR DOWN-REGULATING IL5 ACTIVITY}
천식은 전체 인구의 약 10%가 앓고 있는 기도와 관련된 일반적인 질환이다. 본 발명의 치료방법은 주로 스테로이드의 투여에 기초한 것으로 수십억 달러가 넘는 시장 규모를 갖는다. 아직까지 확실히 규명되지 않은 이유로 인해 천식 환자의 발병률과 사망률은 지난 20년간 전세계적으로 증가해왔다. 오늘날, 생화학 기술분야의 폭발적인 발전에 따라, 천식 증상과 관련된 면역학적 기구가 조금씩 이해되면서 이 질환을 치료할 수 있는 보다 효과적일 수 있는 대안 개발의 새로운 근거가 되고 있다.
천식 및 기타 만성 알러지성 질환의 병인학의 일반적인 특징은 호산구, 특히, 폐의 기관지 점막 중에서 호산구의 수가 증가하는 것인 것으로 밝혀졌다. 활성화될 경우 호산구는 염증성 기도 반응에 활성적으로 관여하는 매개체 (mediators)를 분비한다. 호산구의 활성화시, 인터류킨 5 (IL5)는 중요한 역할을 한다.
IL5는 많은 포유류 종에서 발견되며 그 중에서도 인간과 쥐의 IL5 유전자가 클로닝되었다 (Tanabe 외, 1987, Campbell 외, 1988). 인간의 유전자는 5번 염색체에 위치하는 3개의 인트론과 4개의 엑손으로 구성되며 SEQ ID NO: 62에 제시된 아미노산 세트를 갖는 19 아미노산 N-말단 리더 서열을 비롯하여 134개의 아미노산 잔기 전구체를 코딩한다. 번역후 절단에 의해 성숙한 115개의 아미노산 잔기 단백질 (SEQ ID NO: 1)이 생성된다. 마찬가지로 쥐의 IL5 (mIL5) 유전자는 SEQ ID NO: 64에 제시된 아미노산 서열을 갖는 20개의 아미노산 리더 서열을 비롯하여 133개의 아미노산 잔기 전구체를 코딩한다. 가공된 성숙한 mIL5는 이렇게 133개 아미노산 잔기 길이 (SEQ ID NO: 12)를 가지며, 인간 IL5와 비교정렬시 2개의 N-말단 아미노산 잔기가 모자란다. hIL5와 mIL5의 아미노산 서열은 70%의 상동성을 가지며, 코딩 영역의 뉴클레오타이드 수준에서는 77% 상동성을 갖는다 (Azuma 외, 1986). 인간과 유인원 사이에서는 이보다 높은 유사성이 보고되었으며; 인간과 Rhesus 원숭이의 뉴클레오타이드 서열의 코딩 대역에서는 99% 상동성이 보고되고 있다 (Villinger외, 1995).
인간의 아미노산 서열은 두개의 잠재적인 N-글리코실화 부위를 가지며, 쥐는 세개의 부위를 갖는다. 인간의 IL5는 두 부위 모두 N-글리코실화되고 Thr 3에서도 O-글리코실화 된 것으로 밝혀졌다. hIL5에 대한 연구 결과 글리코실화는 설사 안정성이 탈-글리코실화에 의해 영향을 받는 것처럼 보인다 해더, 글리코실화가 생물학적 활성에 반드시 필요한 것은 아닌 것으로 입증되었다 (Tominaga 외, 1990; Kodama 외, 1993).
IL5의 구조
활성적인 IL5는 호모-다이머이며 재조합 hIL5의 3차원 구조는 X-선 크리스탈로그래피 (Milburn외, 1993)에 의해 결정되었다. 2개의 모노머를 안티파럴렐 (antiparallel) 방식으로 조직하여 2개의 내부 체인 디설파이드 결합에 의해 결합시킴으로써 (44-87' 및 87-44'), 2 모노머의 모든 4개 시스테인을 한데 연결하였다.
이들 모노머의 2차 구조는 β-시트의 짧은 2개 스트레치를 비롯하여 3개의 연결 대역 (루프)에 의해 단속된 4α-헬릭스 (A-D)로 구성된다. 이 4α헬릭스 묶음은 IL-2, IL-4, GM-CSF 및 M-CSF에 대해서도 보고된 바 있는 "일반 시토카인 폴드 (common cytokine fold)"로서 알려져 있다. 그러나 이들은 모두 모노머이며 D-헬릭스가 반대편 모노머의 4α헬릭스 모티프를 완결시키는 호모다이머-구조는 IL5에만 특이적인 구조이다.
천연의 모노머 단독은 생물학적으로 불활성인 것으로 알려져 왔다 (Callard; Gearing, 1994; Takutsu 외, 1997 참조). 그럼에도 불구하고, 루프 3에 8개의 부가적인 아미노산 잔기를 삽입함으로써 생물학적으로 활성적인 모티프화된 재조합 모노머를 제조하는 것이 가능하다. 이에 의해, 헬릭스 D를 하나의 폴리펩타이드 체인 내에서 4 헬릭스 구조로 완결시킬 수 있고, 그에 따라 모노머가 그의 수용체와 상호작용하는 것이 가능해진다 (Dickason ; Huston, 1996; Dickason 외, 1996).
IL5 수용체는 주로 호산구상에 존재하며 α-체인과 β-체인으로 구성된다. 수용체의 α-체인은 IL5에 특이적이며, 고-친화성 결합과 시그날 형질도입 (transduction)을 가능케하는 β-체인은 IL-3 및 GM-CSF의 헤테로-다이머 수용체와 공유된다. 수용체 성분의 공유는 IL5, IL3 및 GM-CSF 사이에서 보여지는 교차-경쟁의 이유가 될 수 있다 (Lopez 외, 1992 참조). 그러나, 최근 IL5R의 조절은 IL-3R 및 GM-CSFR의 조절과 구별됨이 밝혀졌으며, 이는 나아가, 호산구적 응답의 조절에 있어서 IL5의 고도로 특화된 역할을 가리키는 것이다 (Wang 외, 1998).
IL5의 C-말단부는 IL5R에 대한 결합과 생물학적 활성의 두가지 측면 모두에서 중요한 것으로 보이는데, 이는, C-말단 아미노산 잔기를 세개 이상 제거하면 IL5R에 대한 결합친화성이 저하될 뿐만 아니라, IL5 바이오어쎄이시, 생물학적 활성이 저하되는 결과를 초래하기 때문이다 (Proudfoot 외, 1996). 기타의 잔기 역시 β-체인의 결합에 관련된 Glu12와 같은 수용체에 대한 결합에 중요한 것으로 밝혀졌다. 한편, Arg90과 Glu109 잔기는 수용체의 α-체인의 결합에 관여되어 있다. 일반적으로, IL5R에 대한 결합은 헬릭스 A와 D와 오버래핑되는 대역에서 일어나는 것으로 보여지며, 여기서 헬릭스 D는 주로 특정 IL5R α-체인에 대한 결합에 책임이있다 (Graber 외, 1995; Takastsu 외, 1997).
다른 단백질에 대한 IL5의 상동성
호모다이머에서 보여지는 2개의 4-헬릭스 도메인 모티프는 GM-CSF 및 M-CSF, IL-2, IL-4 및 인간과 돼지의 성장호르몬과 놀랍도록 유사한 2차 및 3차 구조를 갖는다 (Milburn 외, 1993). 그러나 이같은 극적인 유사성이 인트론/엑손 기관에서도 관찰되고 시스테인의 위치 (Tanabe 외, 1987; Cambell 외, 1988)가 IL-2, IL-4 및 GM-CSF와의 계통발생학적 연계성을 시사하긴 하나, 상기 아미노산 서열과 이들 중 어느 것이나 기타 시토카인과도 유의적인 상동성은 관찰되지 않았다.
IL5의 생물학적 활성
IL5는 완전히 분화된 Th2 세포, 마스트 세포 및 호산구에 의해 주로 분비된다 (Cousins 외, 1994; Takutsu 외, 1997). 이것은 호산구, 호염기구, 세포독성 T 임파구 및 쥐의 B 세포 상에 작용하는 것으로 나타났다 (Callard ; Gearing, 1994; Takutsu 외, 1997). 인간 B 세포에 미치는 IL5의 영향에 대해서는 여전히 논란의 여지가 있다. 특정 환경 하에서의 임뮤노글로불린 합성의 개시 및 다양한 인간 B 세포에의 결합이 입증된 바 있다. 인간의 B 세포에서 hIL5R에 대한 mRNA가 발견된 바 있긴 하지만, 이들 세포상에 수용체가 실제로 존재하는지는 아직 입증되지 않고 있다 (Baumann ; Paul, 1997; Huston 외, 1996).
호산구에 대한 IL5의 작용으로는 화학주성 (chemotaxis), 상피세포에 대한 증가된 흡착성, 세포 활성화 및 말단 분화를 들 수 있다. 또한 IL5는 성숙한 호산구가 세포자멸 (apoptosis)하는 것을 방지한다는 것이 입증된 바 있다 (Yamaguchi외, 1991). 호산구 분화에 있어서 IL5가 가장 중요한 시토카인이라는 본 발명의 개념은 이러한 발견에 기초한 것이다 (Corrigan ; Kay, 1996; Karlen 외, 1998).
생리학적으로, IL5와 그의 관련 호산구 활성화는 기생충 감염에 대한 방어 역할을 하며 가능하게는 특정 종양도 예방하는 것으로 여겨지고 있는데 이는, 이러한 질병이 주로 말초 혈액 호산성을 수반하기 때문이다 (Takutsu 외, 1997; Sanderson 외, 1992). 그러나, 이들 두 연구 결과는 다소 추상적인데, 이는, 이 저자들이 이들 기생충으로 감염된 마우스에 있어서 Nippostrongylus braziliensis 또는 Schistosoma mansoni에 대한 면역성에 대해 IL5에 대한 항체를 투여한 후 호산구의 다운- 조절 외에 어떠한 다른 효과도 제시하는데 실패했기 때문이다 (Sher ㅗ이, 1990: Coffman 외, 1989).
IL5 트랜스제닉 및 "녹-아웃 (knock-out)" 동물
IL5를 발현하는 트랜스제닉 (transgenic) 마우스 또는 IL-5가 결여된 녹-아웃 마우스에 대한 연구는 IL5의 생리학적 역할에 대한 지식을 확장시켜 주었다.
몇몇 IL5 트랜스제닉 마우스가 보고된 바 있다:
T 세포에서 IL5 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스는 B220+ B 임파구의 팽창 및 강력한 호산구 증가 (eosinophilia)에 의해 특징지어지는 증가된 백혈구 수준을 갖는 것으로 보고되었다. 이것은 호산구가 대부분을 차지하는 대량의 복강 세포 삼출물 및 거의 모든 기관에서 호산구가 관주 (infiltration)되는 증상을 수반하였다 (Lee 외, 1997a).
메탈로티오닌 프로모터의 제어 하에서 IL5 유전자를 발현하는 또 다른 트랜스제닉 마우스는 IgM 및 IgA의 혈청 농도 증가, 말초 혈액에서의 대규모 호산구 증가 및 자가-항체를 생산하는 독특한 CD5+ B 세포 집단의 팽창을 수반하는 많은 기관에 의해 특징지어진다 (Tominaga 외, 1991).
세번째 연구는 폐에서 연속적으로 IL5를 발현하는 트랜스제닉 마우스에 관한 것이다. 이 동물들은 말초 기관지 부위의 호산구 침입, 상피비대증 및 증가된 점막 생성을 비롯하여, 인간의 천식과 유사한 병리생리학적 변화를 겪었다. 또한, 항원의 부재시 기도의 과도한 응답 반응도 관찰되었다 (Lee 외, 1997b).
IL5-결핍 마우스 ('녹-아웃' 마우스)에 대해서도 연구되었다. 이 마우스들 (C57BL/6)은 명백한 질병의 징후는 보이지 않으며 임신가능하다. 임뮤노글로불린 수준과 DNP-OVA에 대한 특이적인 항체 응답도 정상적이었다. 호산구는 기초 수준으로 생성되나, 이는 대조군 동물에 비해 2~3배 낮은 것으로, 이는, 호산구가 IL5가 전혀 없어도 생성될 수 있음을 가리키는 것이다. 이 마우스들을 Mesocestoides corti로 감염시킨 경우, 일반적으로 관찰되는 호산구 증가는 회피되었으며 이러한 호산구의 증가 부재는 이 기생충에 의해 생성된 기생충 부담에 영향을 미치지 않았다 (Kopf 외, 1996).
Foster 등의 연구 (1996)에서는, 아토피성 기도 염증의 일반적인 모델에 대한 IL5 녹-아웃 효과가 연구되었다. 마우스를 감작화시켜 오브알부민으로 에어로졸 챌린지시킨 결과 천식에서 관찰되는 것과 유사한 심각한 폐 손상, 기도의 호산구 증가, 및 β-메타콜린에 대한 기도 과민반응이 초래되었다. IL5 결핍 마우스에 있어서는, 호산구 증가, 기도의 과민반응 및 폐 손상이 나타나지 않았다. 이 마우스들에서 IL5 발현을 재개하자, 에어로-알러젠 (aero-allergen)은 호산구증가를 유도하였고 기도장애가 복구되었다.
IL5의 병생리학적 역할
천식은 전세계 인구의 약 10%에 걸려있으며 아직까지 잘 알려지지 않은 원인으로 인해 그의 발명 및 치사율이 지난 20년간 증가추세에 있다 (Ortega ; Busse, 1997). 이 질환은 재발되고 일상적으로 가역화되는 공기 흐름 장애, 염증 및 과민성 반응에 의해 특징지어지는 만성 기도 질환이다 (Moxam 및 Costello, 1990). 이 질환은 숨을 헐떡이거나 숨이 참으로 해서 호흡 장애가 오는, 그래서 심각한 경우에는 치명적인 증상을 보인다.
폐에서 IL5를 조직적으로 발현하는 트랜스제닉 마우스를 이용한 상기의 동물 실험 (Lee 외, 197a) 및 IL5 결핍 "녹-아웃" 마우스를 이용한 동물 실험 (Foster 외, 1996)은 천식의 발병에 IL5가 중요한 역할을 함을 강력히 시사하고 있다. 이러한 가정을 뒷받침하는 또 다른 증거는 천식 환자에 대한 몇몇 연구로부터 유추될 수 있다.
호산구 증가는 천식환자의 기관지폐포 세정 (bronchoalveolar lavage: BAL) 유액과 기관지 점막 생검물에서 건출되었으며 질병의 위중도와 상관관계를 갖는다. 몇몇 호산구 생성물이 천식 환자의 BAL 유액에서 동정되었으며 몇몇 말초 혈액 호산구 증가는 천식의 위중도와 관계 있다 (Ortega ; Busse 1997).
대조군 대상자에 비해, 만성의 심각한 천식 환자 29명 중 15명에서 IL5 혈청 농도가 증가 (평균 농도 150 pg/ml)된 것으로 밝혀졌다 (Alexander 외, 1994).
비-아토피성 및 아토피성 천식 모두에 대한 또 다른 연구에서는, 헬퍼 T 세포에 의한 IL5 생성의 증가가 아토피성 천식과 비-아토피성 천식 모두의 호산구증가성 감염을 일으키는 것 같은 것을 밝혀졌다 (Mori 외, 1997).
또 다른 연구 결과 역시 IL5가 다른 아토피성 질환에서도 명백한 어떤 역할을 한다는 것을 가리키고 있다. 최근, 알러지성 비염 환자에 있어서 알러젠으로 유도된 전신적 증상발현은 IgE 보다는 알러젠 유도된 IL5 합성과 관계가 있는 것으로 밝혀졌다 (Ohashi 외, 1998). 아토피성 반응의 상관관계는 Barata 등 (1998)의 연구에서도 입증되었는데 이 연구에서는 피부 후기 반응 (cutaneous late phase reaction)에서 T-세포에 의한 IL5의 유의적인 발현이 입증되었다.
상기 및 기타의 연구 결과로부터 Corrigan ; Kay (1996), Danzig ; Cuss (1997)과 같은 몇명 학자들은 IL5가 천식 및 호산구성 염증과 관련된 아토피성 질환의 보다 효과적인 치료방법에서 주요 표적이 될 수 있음을 밝혀내었다. 기생충 감염, 국소적인 폐의 호산구증가 및 과다한 호산구증가 증상에 의해 유도되는 만성적인 조직 손상 과호산구증가 (hypereosinophilia)는 IL5 다운 조절에 의해 다루어질 수 있는 또 다른 질병 증상이다.
IL5의 역할의 생체내 입증
천식의 설치류 모델을 이용한 몇몇 연구결과, IL5에 대한 모노클로날 항체 (항-IL5 mAb)를 이용한 치료는 미치료 대조군에 비해 호산구 증가를 투여량-의존적으로 억제하는 것으로 나타났다 (Nagai 외, 1993a ; b; Chand 외, 1992; Coeffier 외, 1994; Kung 외, 1995; Underwood 외, 1996). Nagai등의 연구 (1993a)에 따르면, 이러한 효과는 감작화된 Balb/c 마우스를 가용성 IL5 수용체 α로 처리함으로써 관찰되었다.
Balb/c 마우스 (Hamelmann 외, 1997)를 이용한 한 연구와 기니픽을 이용한 4가지 연구에서는 또한, 항원 감작화된 동물에서 여러가지 물질로 유도된 기도과민반응성을 항-IL5 mAb가 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (Mauser 외, 1993; Akutsu 외, 1995; van Oosterhout 외, 1995 ; 1993). 몇몇 연구에서는 항-IL5 mAb 처리의 유리한 효과도 현미경으로 관찰되었다 (Mauser et al., 1993; Akutsu et al., 1995; Kung et al., 1995). 중요한 것은, Kung et al. (1995)의 연구에서 항-IL5 mAb를 항원 챌린지하기 수시간 전에 투여한 경우와 항원 챌린지 5시간 후에 투여한 경우의 두가지 경우 모두에 있어서 B6D2F1 마우스에 있어서 폐의 염증이 감소되었다는 것인데, 이는, 항-IL5 mAb의 효과가 기도 염증의 예방과 치료에 모두 효과가 있을지도 모름을 시사하는 것이다. 그러나, 이 효과는 항원 챌린지 2시간 후에 항-IL5 mAb를 기니픽에게 투여했을 때에는 관찰되지 않았다 (Underwood et al., 1996)
천식의 원숭이 모델을 이용한 연구에서, Mauser et al. (1995)은 항원 챌린지 1시간 전에 래트의 항 마우스-IL5 mAb를 투여한 경우, 항원 챌린지 후에 기도의 과민반응성이 억제되었다고 보고하였다. 또한, 미처리 대조군에 비해, 항체 처리된 동물의 기관지폐포 세정물 (BAL)에서는 호산구의 수가 75% 감소하였다. 항-IL5의 호산구 및 과민반응에 대한 효과는 치료한지 3개월이 지날때까지 지속되었다 (Mauser et al., 1995). 알러지성 과민반응과 관련해서, Nakai 등 (1993a 및 1993b)의 연구결과는 BAL에서 호산구 수의 감소와 연계된 과민반응의 감소를 보고하지 않고 있다.
지금까지 언급한 모든 항-IL5 mAb 생체내 실험은 래트의 항-마우스 모노클로날 항체와 관련하여 수행된 것이었다. Egan 등 (1995)은 Sch 55700이라 명명된, 인간화 래트-항-인간 IL5 모노클로날 항체를 이용한 실험결과를 보고하였다. 이들 mAb들은 감작화시킨 원숭이에게 투여시 0, 3 mg/kg의 투여량에서 75%까지 폐 세정 호산구증가를 억제하였다. 알러지 마우스에게 Sch 55700을 1 mg/kg 투여하자, 기도의 호산구 증가가 억제되는 것도 관찰되었다.
현재 및 향후의 천식 치료
앞서 언급한 바와 같이, 현재 천식의 치료방법으로 코르티코스테로이드에 의한 것을 들 수 있는데, 이 약물은 항염작용을 가지고 있어, 가장 강력한 약물이다. 이 외에도, 기관지확장을 유발하는 β2아고니스트 및 메틸 잔틴 유도체, 마스트 세포를 "안정화"시킴으로 해서, 매개자 (mediator) 방출을 방지하는 디소듐 크로모글리케이트 (disodium chromoglycate) 등이 모두 천식 환자에서 유리한 효과를 나타내느 것으로 밝혀졌다 (Ortega ; Busse 1997).
상기한 바와 같은 천식의 장래의 치료는 항-IL5 mAbs를 포함할 수 있다. Schering Plough사와 Celltech사는 천식치료를 위한 항-IL5 mAb를 이용한 임상 I상 연구를 시도하고 있다. 그러나, 모노클로날 항체를 이용한 치료방법은 몇가지 결점을 수반한다. 무엇보다도, 안정한 mAB (예컨대 인간화 mAB)의 개발과 생산 단가가 매우 고가여서, 최종 사용자가 값비싼 치료비용을 부담할 수밖에 없다. 두번째로,mABs는 비교적 짧은 간격으로 투여받아야 하기 때문에, 이는 환자 입장에서 볼 때, 불리한 점이라 하지 않을 수 없다. 세번째로, 본래부터 mABs는 항원의 단일 에피토프에 대해 좁을 특이성을 나타낸다. 마지막으로, mABs (인간화된 것 조차)는 면역원을 유발하므로, 치료가 진행될 수록 시간이 경과함에 따라 투여된 항체의 불활성화가 점점 빨리 일어나게 된다.
천식, 알러지 및 염증 치료를 위해 Hybridon사는 안티센스 요법을 위해 안티센스 IL5 올리고뉴클레오타이드를 이용할 것을 제안한 바 있다. 그러나, 안티센스 기술은 기술적으로 어렵고, 실제로, 인간에 있어서 안티센스의 유용성에 대한 결정적인 증거가 아직까지는 확입되어 있지 못한 실정이다.
마지막으로, WO 97/45448 (Bresagen Limited / Medvet Science)은 IL5의 천연 또는 돌연변이 형태에 의해 야기되는 비정상적인 효과를 완화, 회피 및 감소시키는데 있어서 "IL5의 활성을 길항시킬 수 있는 IL5 분자의 변이 및 다양화된 형태"를 이용하는 방안을 제시하였다. 길항효과 (antagonizing effect)는 IL5R의 고친화성 수용체가 아닌, 저친화성 α체인에 결합하는 IL5 결합의 다양한 형태의 결과인 것으로 보고되고 있다; 이러한 방식으로 변이체들은 IL5의 생리학적 효과를 발휘함이 없이 그의 수용체에 대한 결합을 놓고 IL5와 경쟁한다.
호산구 증가성 염증과 관련된 기타의 아토피성 질환은 알러젠 추출물에 의한 탈감작화 (hyposensitization)를 이용한 면역요법 (IT: immune therapy)과 천식에 대해 상기 언급한 심토마티카 (symptomatica)에 의해 치료된다. 후자 유형의 치료법은 하나 또는 수개의 항원에 대한 알러지를 치료하는데 효과적인 것으로 알려진반면, IT는 복수의 알러지를 치료하는데는 효과적이지 못한 듯 하다. 또한, 치료에 민감한 환자에서 개선된 임상효과를 얻는데 소요되는 기간이 통상적인 IT에서는 매우 길다.
따라서, 천식과 같은 만성적인 알러지성 질환을 치료하가 위한 기존의 그리고, 가능한 미래의 치료법이 있긴 하지만, 상기한 그리고 기타의 만성 알러지성 질환을 치료 및 경감시키기 위한 대안이 절실히 요청되고 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 호산구증가에 의해 특징지어지는 만성 알러지성 증상 (천식과 같은)에 대해 신규한 치료법을 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 천식 및 만성 기도 감염을 수반하는 기타의 병리학적 질환의 새로운 치료법을 얻기 위해, IL5에 대한 자가백신을 개발하는 것이다.
발명의 요약
상기한 바와 같이 T-세포 유도된 시토카인 IL5는 호산구 증가성 응답을 획책하는데 중요한 역할을 하며, 호산구의 생성, 국소화 및 활성화 모두에 있어 영향을 미친다. IL5는 방어적 면역 응답 개발에서 중심적인 역할을 갖는다고 보고된 바 없기 때문에, 본 발명자들의 의견으로는 이 특별한 시토카인이 천식 치료를 위한 주목할만한 치료 표적이 되리라고 생각한다.
호산구가 유도 및 활성화를 위해 IL5에 의존하므로, 본 발명의 주요 목적은 IL5 수준의 다운-조절에 의해 천식 환자의 기도에서 호산구의 병리적 농도를 감소시키는 것이다. 기도 점막에서 호산구 수가 감소되면 기도 감염도 그에 따라 감소될 것이며, 이는 천식 환자의 임상적 개선에 상당한다 할 것이다.
이러한 접근방식의 잠재적인 효과는 기도 감염의 동물 모델에 있어서 항 IL5 모노클로날 항체를 이용한 몇몇 연구에서 이미 입증된 바 있다 예컨대 "PREAMBLE TO EXAMPLES" 참조.
그러나, 본 발명은 자가백신화 개념을 통해 능동 면역응답을 발생시키는 접근방식을 이용함으로써 한 단계 더 나아간 수동 면역화를 통해 얻어진 결과를 취한다. 본 발명자들이 알고 있는 한, 이러한 접근방식은 이전까지는 결코 시도된 바 없다.
코르티코스테로이드 등을 이용한 기존의 천식 치료법에 비해, IL5 자가백신을 이용하여 천식을 치료할 경우의 장점은, 부작용의 감소 및/또는 제거와, 치료기간 측면에서 더 유리하다는 것이다. 폴리클로날 응답은 보다 광범한 특이성을 가지므로, 항-IL5 mAb에 비교할 때, 유도된 폴리클로날 Ab 응답의 효과는 수동적으로 주사된 모노클로날 임모뉴글로불린보다 더 우수할 것으로 기대된다. 투여 방식과 관련한 개선도 기대된다 (본 발명에서 설명된 효과적인 자가백신은 1년에 많아야 2 ~ 6회 투여를 요할 것이므로).
탈감작화에 비해, 본 발명은 비-특이성이라는 주목할만한 측면을 제공한다; 이것은 다중-알러지 환자를 치료하는데 특히 관련이 있다.
따라서, 최광의의, 그리고 가장 일반화된 측면에서, 본 발명은 인간을 비롯한 동물에서 인터류킨 5 (IL5) 활성을 생체내에서 다운-조절하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은, 동물의 면역계에
- 동물을 IL5 폴리펩타이드 또는 그의 서브서열 (subsequence)로 면역시킬 경우 IL5 폴리펩타이드에 대한 항체 생산을 유도할 수 있도록 조성된 적어도 하나의 IL5 폴리펩타이드 또는 그의 서브 서열 및/또는,
- IL5 아미노산 서열에 있어서 적어도 하나의 변형이 도입됨으로 해서, 동물을 그 IL5 유사체로 면역화시킬 경우 IL5 폴리펩타이드에 대한 항체 생성이 유도되는, 적어도 하나의 IL5 유사체
의 면역학적 유효량을 제시하는 것을 포함하여 이루어진다.
이러한 접근방식의 가장 주목할만한 측면은, 항-IL5 또는 그의 IL5 유사체에 대해 결합-친화성을 갖는 분자를 투여하는 것을 포함하는 치료방식에 비해, 주기적으로, 그러나 그다지 빈번하지 않은 면역화에 의해 천식을 제어할 수 있다는 것이다. 다른 IL5 활성 억제제의 경우 매일, 또는 적어도 주 1회 투여하거나, 투여하여야만 소기의 효과를 달성할 수 있는데 비해, 본 발명에 따른 면역원적 조성물을 연중 1 ~ 4회 주사하면 소망하는 효과를 얻는데 충분한 것으로 기대된다.
본 발명은 또한 IL5 유사체 및 그의 서브세트를 코딩하는 핵산 단편에 관한 것이다. 또한 유사체 또는 핵산 단편을 포함하는 면역원성 조성물 역시 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한, IL5 유사체의 동정방법 및 IL5 유사체를 함유하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 호산성 백혈구 (eosinophil leukocytes) 농도가 증가한다는 특징을 갖는 질환, 즉, 천식 및 기타 만성 알러지성 질환의 개선된 치료 및 예방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인터루킨 5 (IL5: interleukin 5)에 대한 항체 생산을 가능케 함으로써 호산구 (eosnophils)의 활성 수준을 감소시킴으로써 IL5를 다운-조절 (down-regulation)하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 IL5를 그 자체 뿐만 아니라 변형된 IL5를 제조하는 방법도 제공한다. 뿐만 아니라, 본 발명은 변형된 IL5를 코딩하는 핵산 단편, 이들 핵산 단편이 포함된 벡터 및 그에 의해 형질전환된 숙주 제포 및 세포주들도 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에서 유용한 IL5 유사체 (IL5 analogue)의 동정법 및 변형된 IL5를 함유하거나 또는 IL5 유사체를 코딩하는 핵산을 함유하는 조성물도 제공한다.
도 1은 성숙한 인간 IL5의 아미노산 서열이다 (SEQ ID NO: 1). 정렬된 쥐의 서열이 포함되어 있지만 (SEQ ID NO: 12) 인간의 서열과 다른 부분만 표시하였다. 두개의 "*"표는 쥐의 IL5의 결실된 N-말단 잔기를 가리킨다. N-글리코실화 부위는이중밑줄 표시하고, 인간 IL5의 O-글리코실화된 쓰레오닌은 이탤릭체로 표시하였으며, 시스테인은 굵은 문자로 나타내었다.
도 2는 인간 IL5의 다이머 및 모노머 구조를 나타낸다.
A: hIL5의 다이머 구조. 이 구조는 잔기 5-112에서만 얻어지며, 이는, Thr3에서의 O-글리코실화 부위가 포함되지 않음을 의미하는 것이다.
B: A에서와 동일한 구조이나, 헬릭스 배치를 나타낸다 (A-D 및 A'-D').
C: 담회색으로 표시된 mIL5와 상이한 아미노산 잔기를 갖는 모노머 hIL5.
도 3은 정렬된 성숙한 인간 IL5 (hIL5) 및 쥐의 IL5 (mIL5) 아미노산 서열 (SEQ ID NOs: 1 및 12)을 적절한 치환 대역을 표시하여 나타낸 것이다. 4α-헬릭스 A-D는 실선 박스로 둘러싸서 표시하고, β-시트는 이중밑줄 쳤으며, 2개의 시스테인의 위치는 "▼"로 표시하였다. 2개 서열 중 동일한 잔기는 "-"로 표시하고 동일하지 않은 잔기들은 "*"로 나타내었다. 루프 1은 헬릭스 A와 B 사이에, 루프 2는 헬릭스 B와 C 사이에, 그리고 루프 3은 헬릭스 C와 D 사이에 걸쳐있다. 외래 TH에피토프를 함유하는 펩타이드로 치환될 아미노산 서열은 굵은 문자로 나타내고; 다른 구조물 중에 이들 치환부분과 중복된 잔기들 때문에, 이 서열 중 하나는 점선 박스 안에 나타내었다. 10개 구조물의 아미노산 서열 (인간으로부터 유도된 것 5개, 쥐의 IL5로부터 유도된 것 5개)을 SEQ ID NOs: 2-11 및 13-22에 나타내었다.
도 4는 2개의 mIL5 자가백신 DNA 백신을 테스트하는 DNA 면역화의 ELISㅁ 결과를 나타낸 도면이다. 마우스들을 오브알부민, mIL5wt, mIL5.1 또는 mIL5.5중 어느 하나를 코딩하는 네이키드 (naked) 플라즈마 DNA로 DNA 백신화시켰다. 제 77일에 얻은 혈청을 오브알부민 및 쥐의 IL5에 대한 반응성에 대해 시험하였다. 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 (Maxisorp, Nunc)를 오브알부민 (1μ/웰, Sigma)로 코팅시키거나 또는 재조합된 쥐의 IL5 (0.1μg/웰, E1320)으로 코팅하였다. 웰에 첨가된 희석 혈청의 반응성을 염소의 항-마우스 2차 항체를 이용하여 가시화시켰다. 채혈전 OD490 판독값을 테스트 샘플의 OD490 판독값에서 빼고, 얻어진 값을 각각의 마우스에 대해 바아 (bars)로서 제시하였다. 채혈전 OD490 판독값 (1:25 희석)은 0.025 ~ 0.034 범위였다. 십자가 표시는 죽은 동물을 가리킨다.
도 5는 쥐의 IL5에 기초한 자가백신 구조물을 도식적으로 나타낸 것이다. 그림 윗부분은 헬릭스 A-C, 루프 1-3 및 유연한 C-말단 대역을 갖는 쥐의 야생형 IL5 모노머를 나타낸다. 나머지 그림은 여러 위치에서의 파상풍 독소 에피토프 P2 및 P30의 내부-치환 (in-substitutions)을 갖는 여러가지 자가백신 구조물을 나타낸다. 특별한 구조물을 실시예에서 설명한다.
정의
본 발명의 범위와 한계를 명확히 하기 위해, 다음에, 본 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 사용된 몇가지 용어를 상세히 정의 및 설명한다.
"T-임파구" 및 "T-세포"라 함은 체액성 면역 응답에서 헬퍼 활성 뿐만 아니라 다양한 세포 매개성 면역 응답에 책임이 있는 흉선 기원의 임파구를 가리키는 용어로서, 상호 동의로 사용된다. 마찬가지로, "B-임파구" 또는 "B-세포"라는 용어 역시 항체-생산 임파구로서 상호동의로 사용된다.
본문에서 "IL5 폴리펩타이드"는 인간과 마우스로부터 유도된 상기 IL5 단백질의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (또는 본래의 IL5와 실질적인 양의 B-세포 에시토프를 공유하는 그의 절단물 (truncates)) 을 의도하는 것이지만, 다른 종으로부터 분리된 이들 2가지 단백질의 제노-유사체 (xeno-analoges) 역시 이 용어의 정의에 포함된다. 또한, 예컨대 효모나 기타 비-포유동물의 진핵 발현계의 이용에 따른 다양한 글리코실화 패턴을 갖는 형태들과 마찬가지로, 원핵생물계에서 제조되는 IL5의 글리코실화되지 않은 형태도 이 용어의 정의에 포함된다. 그러나, "IL5 폴리펩타이드"라는 용어를 사용할 경우, 문제의 폴리펩타이드는 일반적으로 치료받고자 하는 동물에게 투여될 때 보통 비-면역원성인 것으로 의도됨을 숙지하여야 한다. 즉, IL5 폴리펩타이드는 자가-단백질이거나 또는 대개의 경우 문제의 동물의 IL5에 대해 면역 응답을 일으키지 않는 그러한 자가-단백질의 제노-유사체이다.
"IL5 유사체 (IL5 analogue)"라 함은 그의 일차 구조가 변화된 IL5 폴리펩타이드이다. 이러한 변화는 예컨대 IL5 폴리펩타이드의 적절한 융합 파트너와의 융합(즉 아미노산 잔기의 C- 및/또는 N-말단 부가만 관련된 일차 구조의 변화) 형태일 수 있으며/또는 IL5 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 삽입 및/또는 결실 및/또는 치환의 형태일 수도 있다. 또한, 이 용어는 유도된 IL5 분자, 즉, 후술될 IL5 변형도 포함한다.
IL5에 대한 소망되는 면역성을 생산하기 위해, 인간에 있어서 인간 IL5의 예컨대 개 (canine) 유사체를 백신으로 사용할 수 있는 가능성도 있음을 주목해야 한다. 면역화를 위한 이러한 제노-유사체의 용도 역시 상기 정의된 바와 같은 "IL5 유사체"로서 고려된다.
본문에서 "IL5"라는 약어를 사용하는 경우, 성숙한, 야생형 IL5의 아미노산 서열을 가리키는 것으로 의도된다 (본문에서 "IL5m" 및 "IL5wt"라고 표기되기도 함). 성숙한 인간 IL5는 hIL5, hIL5m 또는 hIL5wt로, 쥐의 성숙한 IL5는 mIL5, mIL5m 또는 mIL5wt로 표시된다. DNA 구조물이 리더 서열 또는 다른 물질을 코딩하는 정보를 포함할 경우, 이는 문맥 자체로부터 대개 명료하게 파악될 것이다.
본 발명에서 "폴리펩타이드"라는 용어는 2 내지 10개 아미노산 잔기로 된 짧은 펩타이드, 또는 11 내지 100개의 아미노산 잔기로 된 올리고펩타이드, 및 100개가 넘는 아미노산 잔기로 된 폴리펩타이드를 의도하는 것이다. 또한, 이 용어는 단백질, 즉, 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 기능성 바이오분자를 포함하도록 의도된 것이다: 적어도 2개의 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 이들은 복합체를 형성할수도 있고, 공유결합할 수도 있으며, 또는, 비-공유적으로 연결될 수도 있을 것이다. 단백질 중 폴리펩타이드(들)은 글리코실화될 수 있고/또는 지질화될 수 있으며/또는 보철기 (prosthetic groups)를 가질 수 있다.
"서브서열 (subsequence)"이라 함은 각각 천연발생적인 IL5 아미노산 서열 또는 핵산 서열로부터 직접 유도된 적어도 3개의 아미노산의 연속적인 스트레치, 또는 타당한 경우, 적어도 3개의 뉴클레오타이드의 연속적인 스트레치를 의미한다.
본 발명에서 "동물"이라 함은 일반적으로 호모 사피엔스 (Homo sapiens), 커니스 도메스티쿠스 (Canis domesticus)등과 같은 동물 종 (바람직하게는 포유류)을 지칭하는 것으로, 어떤 단수의 동물 한마리를 가리키는 것이 아니다. 그러나, 동일한 면역원(들)로 동물을 면역화할 수 있게 해주는 실질적으로 동일한 IL5를 산생시키는 것이 중요하므로, 이 용어는 또한 동물 종의 집단을 가리키기도 한다. 예컨대, IL5의 유전적 변이체가 상이한 인간 집단 중에 존재할 경우, 각각의 집단에서 IL5에 대한 자가관용성을 파괴시킬 수 있기 위해 이들 여러 집단 중에서 여러가지 면역원을 사용하는 것이 필요할 수 있다. 당업자에게는, 본 발명 명세서 중의 동물이 면역계를 갖는 살아있는 생명체라는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 동물은 포유동물과 같은 척추동물인 것이 바람직하다.
"IL5 활성의 생체내 다운-조절 (in vivodown-regulation of IL5 activity)"라는 용어는 살아있는 생명체 중에서 IL5와 그의 수용체 사이 (또는 IL5와 이 분자에 대해 기타 가능한 생물학적으로 중요한 결합 파트너 사이)의 상호반응의 횟수가 감소하는 것을 의미하는 것이다. 다운-조절은 몇몇 메카니즘에 의해 달성될 수 있다: 이들 중, 항체 결합에 의한 IL5 중의 활성부위와의 단순한 간섭이 가장 단순한 것이다. 그러나, 항체 결합이 스캐빈져 세포 (scavenger cells) (예컨대 대식세포와 기타 식세포)에 의해 IL5의 증가를 초래하는 경우도 본 발명의 범위에 포함된다.
"면역계에... 제시한다 (effecting presentation .... to the immune system)"이라는 표현은 그 동물의 면역계가 조절적인 방식으로 면역원에 의해 챌린지됨을 의도하는 것이다. 후술되는 바와 같이, 이러한 면역계의 챌린지는 몇명 방식으로 수행될 수 있으며, 그 중 가장 중요한 것은 "약백신 (pharmaccines)" (즉, 진행중인 질병을 치료 또는 완화시키기 위해 투여되는 백신)을 함유하는 폴리펩타이드를 이용하여 백신화하는 것 또는 핵산 "약백신" 백신화이다. 달성하고자 하는 주요 과제는 동물 중 면역 경쟁적인 세포를 면역학적으로 효과적인 방식으로 항원과 대질시키는 것인 반면, 이 결과를 달성하기 위한 정밀한 방식은 본 발명의 사상에 있어 덜 중요하다.
"면역학적 유효량"이라 함은 이 기술분야에서 통상적인 의미, 즉, 면역원과 면역학적 특성을 공유하는 병인 물질과 유의적으로 관련된, 면역 응답을 유도할 수 있는 면역원의 양이다.
본 발명에서 IL5가 "변형"되었다라는 표현은 IL5 골격을 구성하는 폴리펩타이드가 화학적으로 변형되었음을 의미하는 것이다. 이러한 변형은 예컨대 IL5 서열에 있어서 특정 아미노산 잔기의 유도 (예컨대 알킬화, 아실화, 에스테르화 등)일 수 있으나, 후술 내용으로부터 이해될 수 있는 바와 같이, 바람직한 변형은 IL5 아미노산 서열의 일차 구조의 변화 (또는 부가)이다.
"IL5에 대한 자가관용 (autotolerance towards IL5)"에 대해 언급할 경우,IL5는 백신화시키고자 하는 집단에서 자가-단백질이므로, 그 집단 중 일반적인 개체는 IL5에 대한 면역 응답을 유발하지 않는다; 그러나, 어떤 동물 집단의 임의의 개체들이 예컨대, 자가면역 질환의 일부로서 천연 IL5에 대한 항체를 생산할 수 있는 가능성을 전적으로 배제할 수는 없다. 어떻든, 동물은 일반적으로 그 자신의 IL5에 대해서만 자가관용적일 것이지만, 상이한 IL5 표현형을 갖는 다른 동물 종 또는 집단으로부터 유도된 IL5 유사체 역시 상기 동물에 의해 관용될 수 있을 가능성을 배제할 수는 없다.
"외래 T-세포 에피토프 (foreign T-cell epitope)" (또는: "외래 T-임파구 에피토프")라 함은 MHC 분자에 결합할 수 있는, 그리고 어떤 동물 종에서 T-세포를 자극하는 펩타이드이다. 본 발명에서 바람직한 외래 T-세포 에피토프는 "난교잡성 (promiscuous)" 에피토프, 즉, 어떤 동물 종이나 집단에서 MHC 분자의 특정 클래스의 실질적인 프랙션과 결합하는 에피토프이다. 이러한 난교잡성 T-세포 에피토프는 극히 제한된 수만이 알려져 있으며, 이하에서 상세히 다룬다. 본 발명에 따라 사용되는 면역원이 가능한 한 큰 동물 집단에서 효과적이려면 1) 몇몇 외래 T-세포 에피토프를 동일한 IL5 유사체에 삽입하거나 또는 2)각각의 유사체가, 삽입된 여러가지 난교잡성 에피토프를 갖는 것이 필요할 수 있다. 또한 외래 T-세포 에피토프의 개념은 은신성 (cryptic) T-세포 에피토프, 즉, 자가-단백질로부터 유도되고, 문제의 자가-단백질의 일부 없이 분리된 형태로서 존재할 경우에만 면역원적으로 행동하는 에피토프의 사용도 포함한다.
"외래 T 헬퍼 세포 임파구 에피토프" (외래의 TH에피토프)는 MHC 클래스 II 분자에 결합하여 MHC 클래스 II분자에 결합된 항원 제시 세포 (APC)의 표면에 제시될 수 있는 외래 T 세포 에피토프이다.
본 발명에서 (바이오)분자의 "기능성 부분"라 함은 그 분자에 의해 발휘되는 적어도 한가지의 생화학적 또는 생리학적 효과에 책임이 있는 분자의 일부를 의도하는 것이다. 당해 기술분야에 있어서 많은 효소와 기타의 이펙터 분자가 문제의 분자에 의해 발휘되는 효과에 책임이 있는 활성 부위를 갖는 다는 것이 익히 알려져 있다. 분자의 다른 부분은 안정화 또는 용해도 증가 목적에 이용될 수 있으며 따라서 이러한 목적이 본 발명의 특정 구체예의 관점에서 무관한 것이라면 방치될 수 있다. 예컨대 어떤 다른 시토카인을 IL5에 있어서 변형 부분으로서 이용하는 것이 가능하며 (이하에서 상술함), 이러한 경우, IL5에 대한 커플링은 안정성을 필연적으로 제공하므로, 안정성 문제는 무관하게 될 것이다.
"어쥬번트 (adjuvant)"라는 용어는 백시니 기술 분야에서 통상적으로 갖는 의미, 즉, 1) 그 자체로는 백신의 면역원에 대해 특이적인 면역 응답을 도출할 수는 없으나, 2) 그럼에도 불구하고 그 면역원에 대한 응답반응을 증가시킬 수 있는 물질 또는 조성물을 가리킨다. 또는, 달리 설명하면, 어쥬번트 단독으로 백신화하면 면역원에 대한 면역 응답을 제공하지 않고, 면역원을 이용한 백신화는 면역원에 대한 면역 응답을 일으키거나 일으키지 않을 수 있으나, 면역원과 어쥬번트를 이용한 백신화 조합은 면역원 단독에 의해 유도되는 것보다 강력한 면역응답을 일으킨다는 것이다.
본 발명에서 어떤 분자를 "표적화"한다 함은 동물 체내로 도입된 어떤 분자가 우선적으로 어떤 특정 조직(들)에 우선적으로 도입되거나 또는 특정 세포 또는 세포 유형과 우선적으로 연관되는 상황을 가리키는 것이다. 이 효과는 조성물 중의 분자 배합을 표적화를 용이하게 하도록 하거나 또는 표적화를 용이하게하는 그룹의 분자내로 도입시킴으로써 달성할 수 있다. 이 문제는 이하에서 보다 상세하게 설명한다.
"면역계의 자극 (stimulation of the immune system)"이라 함은 어떤 물질 또는 조성물이 일반적이고, 비특이적으로 면역자극적인 효과를 나타냄을 의미하는 것이다. 몇가지 어쥬번트와 추정적인 어쥬번트 (예컨대 특정 시토카인과 같은)는 면역게를 자극하는 능력을 공유한다. 면역자극제제를 사용하면 면역계의 "경계성 (alertness)"이 증가되며 이는 면역원을 이용한 동시적이거나 또는 후속적인 면역화가 면역원의 분리사용과 비교할 때 훨씬 효과적인 면역 응답을 유도함을 의미하는 것이다.
IL5 활성의 다운-조절의 바람직한 구체예
본 발명의 방법에서 면역원으로 사용되는 IL5 폴리펩타이드는 IL5 아미노산 서열 중에 적어도 하나의 변화가 있는 것인 변형된 분자가 바람직한데, 이는, IL5에 대한 자가관용의 모든-중요한 파괴를 얻을 기회가 그러한 방식을 대단히 용이하게 만들기 때문이다. 예컨대 후술되는 특정 어쥬번트를 함유하는 조성물과 같이, 이러한 변형 IL5를 조성물에 사용할 경우 IL5에 대해 자가관용의 파괴가 더 용이하게 되는 가능성이 완전히 배제되지 않음을 유의하여야 한다.
자가-단백질을 인식하는 잠재적으로 자가-반응성인 B-임파구가 정상적인 개체에서 생리적으로 존재한다는 것이 알려져 있다 (Dalum I 외, 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804). 그러나, 관련 자가-단백질과 반응성인 항체를 실제로 생산하기 위해 이러한 B-임파구를 유도할 수 있으려면, T-헬퍼 임파구 (TH-세포 또는 TH-임파구)를 생산하는 시토카인으로부터의 도움이 필요하다. 대개 T-임파구는 항원 제시 세포 (APCs)에 의해 제시된 경우 자가-단백질로부터 유도된 T-세포 에피토프를 인식하지 않기 때문에, 대체로 이러한 도움이 제공되지는 않는다. 그러나, 자가-단백질에 "외래성 (foregnness)"을 제공하면 (즉, 면역학적으로 유의적인 변형을 도입시킴으로써), APC 상에 외래 에피토프가 인식될 경우 (예컨대, 처음에는 단핵세포), 외래 물질을 인식하는 T-세포가 활성화된다. 변형된 자가-단백질 상의 자가-에피토프를 인식할 수 있는 폴리클로날 B-임파구 (이것 역시 특화된 APCs임) 역시 항원을 내면화시켜 그의 외래 T-세포 에피토프(들)을 제시하며, 활성화된 T-임파구는 이들 자가-반응성 폴리클로날 B-임파구에 시토카인의 보조를 제공하게 된다. 이러한 폴리클로날 B-임파구에 의해 생산되는 항체들은 천연 폴리펩타이드에도 존재하는 것들을 비롯하여, 변형된 폴리펩타이드 상의 여러가지 에피토프들과 반응을 하기 때문에, 비-변형 자가-단백질과 교차반응하는 항체들도 유도된다. 결론적으로, T-임파구는 폴리클로날 B-임파구 집단이 전적으로 외래인 항체를 인식하는 것처럼 유도될 수 있지만, 실제로는, 삽입된 에피토프(들)만이 숙주에 대해 외래적이다. 이러한 방식으로, 비-변형 자가-항원과 교차반응할 수 있는 항체가 유도된다.
기술분야에는 자가관용성을 파괴하기 위해 펩타이드 자가-항원을 변형시키는 방법이 여러가지 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 이러한 변형은
- 적어도 하나의 외래 T-세포 에피토프가 도입되고/또는,
- 항원 제시 세포 (APC)에 변형 분자를 표적화시키는 적어도 하나의 제 1 부분이 도입되고/또는,
- 면역계를 자극하는 적어도 하나의 제 2 부분이 도입되고/또는,
- 변형된 IL5 폴리펩타이드를 면역계에 제시하는 것을 최적화시키는 적어도 하나의 제 3 부분이 도입되는 것을 포함한다.
그러나, 이러한 모든 변형은 IL5 중 본래의 B-임파구 에피토프의 실질적인 분획을 유지하면서 수행되어야 하는데, 이는, 천연 분자의 B-임파구 인식이 그에 따라 증진되기 때문이다.
바람직한 한가지 구체예에서, 측쇄기 (외래 T-세포 에피토프 또는 상기한 제 1, 제 2 및 제 3 부분)는 공유적으로 또는 비공유적으로 도입되는 것이 좋다. 이것은 IL5로부터 유도된 아미노산 잔기의 스트레치가 1차 아미노산 서열을 변경시킴이 없이, 또는 적어도 체인 중 각각의 개별적인 아미노산 사이의 펩타이드 결합에 어떠한 변화도 일으킴이 없이 유도된다는 것을 의도하는 것이다.
또 다른 바람직한 구체에는 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 및/또는 부가를 이용하는 것이다 (이것은 재조합 수단 또는 펩타이드 합성 수단에 의해수행할 수 있으며; 아미노산의 보다 긴 스트레치를 포함하는 변형은 융합 폴리펩타이드를 야기시킬 수 있다). 이 구체예의 특히 바람직한 한가지 버젼은 자가 단백질의 유사체를 이용하여 면역화시킴으로써 자가 단백질을 다운-조절하는 방법을 개시하고 있는, WO95/05849호에 설명된 기술로서, 이 문헌에서는 몇몇 아미노산 서열(들)이 각각 외래 임뮤노도미넌트 (immunodominant) T-세포 에피토프를 포함하는 아미노산 서열(들)로 치환되고, 동시에 그 유사체 중에서 자가-단백질의 전체적인 3차 구조가 그대로 유지되도록 하고 있다. 본 발명의 목적상, 그러나, 그 변형이 (아미노산 삽입, 부가, 결실 또는 치환) 외래 T-세포 에피토프를 일으키는 동시에 IL5에서 B-세포 에피토프의 실질적인 수를 보존한다면 충분하다. 그러나, 유도된 면역 응답의 최대 효율을 얻기 위해서는, IL5의 전체적인 3차 구조가 변형된 분자 내에서 유지되는 것이 바람직하다.
다음의 공식은 본 발명에 의해 일반적으로 포괄되는 IL5 구조물을 설명해준다:
(MOD1)s1(IL5e1)n1(MOD2)s2(IL5e2)n2.... (MODx)sx(IL5ex)nx(I)
식 중, IL5e1-IL5ex는 외래 측쇄기를 갖거나 갖지 않을 수 있으며 같거나 같지 않을 수 있는 IL5의 x B-세포 에피토프 함유 물질이고, x는 정수≥3, n1-nx는 x 정수 ≥ 0 (적어도 하나는 ≥1), MOD1-MODx는 보존된 B-세포 에피토프 사이에 도입된 x 변형, s1-sx는 x 정수≥0 (IL5e서열 내로 측쇄기가 도입되지 않은 경우, 적어도 하나는 ≥1)이다. 따라서, 구조물의 면역원성에 일반적인 기능적 제한이 주어진상황에서, 본 발명은 본래의 IL5 서열의 모든 종류의 치환을 가능하게 하며, 그 안에서 모든 종류의 변형도 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 생체내에서 악영향을 미치는, 일부 IL5 서열의 결실 또는 소망되지 않은 면역학적 반응을 일으킬 수 있는 부분들의 결실에 의해 얻어지는 변형된 IL5도 포함한다.
실질적인 B-세포 에피토프 분획의 보존 또는 상기한 바와 같이 변형된 단백질의 3차원 전에 구조의 보존은 여러 가지 방식으로 달성할 수 있다. 한가지 방법은 IL5에 대해 지향된 폴리클로날 항혈청을 제조한 다음 (예컨대, 토끼에서 제조한 항혈청), 이 항혈청을 제조된 변형 단백질에 대한 테스트 시약 (예컨대 경쟁적 ELISA에서)으로 사용하는 것이다. IL5만큼 항혈청과 동일한 정도로 반응하는 변형된 버전 (유사체)는 IL5와 실질적으로 전체적으로 동일한 3차 구조를 갖는 것으로 간주되는 반면, 이러한 항혈청과 제한된 반응성을 나타내는 (그러나 유의적이고 특이적인 정도로) 유사체는 본래 B-세포 에피토프의 실질적인 분획을 유지하는 것으로 간주한다.
다른 한편, IL5 상의 여러 가지 에피토프와 반응하는 모노클로날 항체 선택군은 테스트 패널로서 제조 및 이용될 수 있다. 이러한 접근방식은 1) IL5의 에피토프 지도 작성 및 2) 제조된 유사체 중에 유지된 에피토프의 지도 작성을 가능케 해준다.
물론, 제 3의 접근방식은 IL5의 구조와 생물학적으로 활성적인 그의 절단물(예컨대 상기 내용)을 규명하고 이것을 비교하여 제조된 유사체의 3차원 구조를 규명하고자 하는 데 있다. 3차원 구조는 X-선 회절 연구와 NMR-분광광도 측정을 이용하여 분석할 수 있다. 그 밖의 3차원 구조에 관한 정보는 어느 정도 까지는 원형 2색성 (circular dichroism) 연구에 의해 달성될 수 있는데, 이 연구는 주어진 분자의 3차 구조에 대한 유용한 정보 제공을 위해 폴리펩타이드를 단지 순수한 형태로 제공하기만 하면 된다는 것이다 (반면 X-선 회절은 결정화 폴리펩타이드를 제공할 것을, NMR은 폴리펩타이드의 동위원소 변형물을 제공할 것을 요구한다). 그러나, 궁극적으로 원형 2색성은 단지 2차 구조 원소들을 통해 정확한 3차원 구조의 간접적인 증거만을 제시할 수 있을 뿐이기 때문에 X-선 회절 및/또는 NMR을 수행할 필요가 있다.
본 발명의 바람직한 한가지 구체예는 IL5의 B-임파구 에피토프의 복수 제시를 이용한다 (즉, 적어도 하나의 B-세포가 2개의 위치에 존재하는 구조식 I). 이 효과는 여러 가지 방식, 예컨대, 구조 (IL5)m(식 중, m은 정수 ≥2)를 갖는 융합 폴리펩타이드를 제조한 다음 IL5 서열 적어도 하나에 상기한 변형을 가하거나, 또는 IL5 아미노산 서열 적어도 2개 사이에 삽입하는 방식으로 달성할 수 있다. 도입된 변이는 B-임파구의 적어도 하나의 중복 및/또는 합텐 도입인 것이 바람직하다.
상기한 바와 같이, 외래 T-세포 에피토프의 도입은 적어도 하나의 아미노산의 삽입, 부가, 결실 EH는 치환에 의해 달성될 수 있다. 물론, 아미노산 서열에 1개 이상의 변화를 가하는 것이 일반적인 상황이겠지만 (예컨대 완전한 T-세포 에피토프에 의한 삽입 또는 치환), 달성하고자 하는 중요한 목적은 항원 제시 세포 (APC)에 의해 프로세스되는 경우, IL5 유사체가 APC 표면 상의 MHC 클래스 II 분자측면에서 제시되는 이러한 외래의 면역우성의 (immunodominant) T-세포 에피토프를 일으키는 것이다. 따라서, 적절한 위치에서 IL5 아미노산 서열이 외래 TH에피토프에서도 발견되는 몇 개의 아미노산 잔기를 함유한다면, 외래 TH에피토프의 도입은 아미노산 삽입, 부가, 결실 및 치환 수단에 의해 외래 에피토프의 나머지 아미노산을 제공함으로써 달성할 수 있다. 즉, 삽입 또는 치호나에 의해 완전한 TH에피토프를 도입할 필요가 없다는 EMt이다.
아미노산 삽입, 결실, 치환 EH는 부가의 숫자가 적어도 2개, 예컨대 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 및 25개의 삽입, 치환, 부가 또는 결실인 것이 바람직하다. 더욱 바랍직하게는 아미노산 부가, 치환, 삽입 또는 결실의 수가 150개 이하, 예컨대 100개 이하, 90개, 이하, 80개 이하, 및 70개 이하인 것이 더욱 바람직하다. 치환, 삽입, 결실 EH는 부가의 수가 60개 이하, 특히 50개 이하, 더욱 바람직하게는 40개 이하인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 30개 이하인 것이 좋다. 아미노산 부가관점에서, 결과적인 구조물이 융합 폴리펩타이드인 경우, 이것은 종종 150개를 넘을 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 적어도 하나의 외래의 면역우성의 TH에피토프를 도입하는 것을 포함한다. TH에피토프의 면역 우세성 (immune dominance) 문제는 문제의 동물 종에 의존하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명에서 "면역우성(immunodominance)"라 함은 백신화에서 단순히 유의적인 면역 응답을 일으키는 에피토프를 칭하는 것이나, 한 개체에서 면역우성의 TH에피토프가 동종의 다른 개체에서도 반드시 면역우성이 아님은 잘 알려진 사실이다. 이는 후자의 개체에서 MHC-II 분자와 결합할 수 있다 해도 그러하다.
또 다른 중요한 사항은 TH에피토프의 MHC 제한 문제이다. 일반적으로, 자연발생적인 TH에피토프는 MHC 제한된다. 즉, TH에피토프를 구성하는 특정 펩타이드는 MHC 클래스 II 분자의 서브세트에만 효과적으로 결합할 것이다. 이것은 대부분의 경우 하나의 특이적인 TH에피토프의 사용이 그 집단의 분획에서만 효과적인 백신 성분을 야기시킬 것이며, 그 분획의 크기에 의존할 것이라는 효과를 야기시킬 것이며, 도입된 TH에피토프의 특성에 EK라 서로 구별되는 IL5 변이체 성분을 갖는 복수-성분 백신을 제조하거나, 또는 동 분자에서 보다 많은 TH에피토프를 포함시키는 것이 필요할 수 있다.
사용된 T-세포의 MHC 제한이 완전히 알려지지 않았다면 (예컨대 백신화된 동물이 제대로 정의되지 않은 MHC 조성을 갖는 경우), 특이적인 백신 조성에 의해 커버되는 동물 집단은 다음 공식에 의해 결정될 수 있다:
식 중, pi는 백신 조성물 중에 존재하는 I번째 외래 T-세포 에피토프에 대한응답자 집단 중의 빈도이고, n은 백신 조성물 중 외래 T-세포 에피토프의 총 수이다. 따라서, 집단 중 각각 0.8, 0.7 및 0.6의 응답 빈도를 갖는 3개의 외래 T-세포 에피토프를 함유하는 백신 조성물은 다음 식으로 표시될 것이다.
1 - 0.2 x 0.3 x 0.4 = 0.976
즉, 그 집단의 97.6%가 통계적으로 백신에 대해 MHC-II 매개 응답을 일으킬 것이다.
상기 공식은 사용된 펩타이드의 다소 정확한 MHC 제한 패턴이 알려진 경우에는 적용되지 않는다. 예컨대, 특정 펩타이드가 HLA-DR 알릴리 (alleles) DR1, DR3, DR5 및 DR7에 의해 코딩되는 인간의 MHC-II 분자에만 결합한다면, HLA-DR 알릴리에 의해 코딩된 나머지 MHC-II 분자에 결합하는 다른 펩타이드를 이 펩타이드와 사용할 경우 문제의 집단을 100% 커버하게 될 것이다. 마찬가지로, 두 번째 펩타이드가 DR3과 DR5에만 결합한다면, 이 펩타이드를 부가한다 해서 커버 범위가 전혀 증가하지 않을 것이다. 만약 집단의 응답성 산출방식을 순전히 백신 중 T-세포 에피토프의 MHC 제한에만 의존한다면, 특정 백신 조성물에 의해 커버되는 집단의 부분은 다음 공식으로 결정될 수 있다.
식 중, φj는 백신 중에서, 집단 중 여하한 T-세포 에피토프에 결합하는 MHC 분자를 코딩하는 알릴리 배수체 빈도의 합으로서 3가지 공지 HLA 위치 (DP, DR 및 DQ)의 j번째에 속한다; 실제로, 어떤 MHC 분자가 백신 중 각각의 T-세포 에피토프를 인식할 것인지가 먼저 결정되고 그 후에 이들 MHC 분자들이 타잎 (DP, DR, 및 DQ)에 의해 리스팅되며- 이어서, 서로다른 리스트된 알릴리 배수체의 각각의 빈도가 각 유형별로 더해져서 φ1, φ2및 φ3을 산출하게 된다.
공식 II에서 pi값은 그에 대응하는 이론치 πi를 초과한다:
식 중, υj는 백신 중에서, 집단 중 i번째 T-세포 에피토프에 결합하는 MHC 분자를 코딩하는 알릴리 배수체 빈도의 합으로서 3가지 공지 HLA 위치 (DP, DR 및 DQ)의 j번째에 속한다. 이것은, 집단의 1-πi에서 fresidual-i= (pi-πi) / (1-πi)의 응답 빈도가 있음을 의미하는 것이다. 따라서, 공식 III을 변형하여 다음 공식 V를 얻을 수 있다.
식 중, 1-fresidual-i는 음수인 경우 0으로 세팅된다. 공식 V는 동일한 세트의 배수체에 대해 모든 에피토프가 배수체 매핑되었음을 요구한다.
따라서, IL5 유사체에 도입될 T-세포 에피토프를 선택할 경우, 에피토프에 대해 입수가능한 모든 지식을 포함시키는 것이 중요하다: 1) 집단 중 각각의 에피토프에 대한 응답 빈도, 2) MHC 제한 데이터 및 3) 집단 중 해당 배수체의 빈도.
어떤 동물 중의 대부분의 개체 또는 동물 집단에서 활성적인 자연발생적인 "난교잡성" T-세포 에피토프가 몇가지 있으며 이들을 백신 내로 도입하는 것이 바람직한데, 그럼으로써 동일한 백신 중 막대한 수의 서로 다른 IL5 유사체에 대한 필요성을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 난교잡성 에피토프들은 파상풍 독소 (예컨대 P2 및 P30 에피토프), 디프테리아 독소, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA), 및 P. falciparum CS 항원과 같이, 자연발생적인 인간의 T-세포 에피토프일 수 있다.
지난 몇 년간, 그 밖의 다른 난교잡성 T-세포 에피토프들이 동정되었다. 특히, 상이한 HLA-DR 알릴리에 의해 코딩된 HLA-DR 분자의 대부분에 결합할 수 있는 펩타이드들이 동정되었으며 이들은 본 발명에 따른 IL5 유사체 내로 도입되는 모든 가능한 T-세포 에피토프들이다. 또한, 다음에 언급되는, 본 발명에 모두 참조된 에피토프들도 들 수 있다: WO98/23635 (Frazer IH 외, University of Queensland에 양도); Southwood S. 외, 1998, J. Immunol. 160; 3363-3373; Sinigaglia F 외, 1988, Nature 336: 778-780; Chicz RM 외, 1993, J. Exp. med. 178: 27-47; Hammer J. 외, 1993, Cell 74: 197-203; 및 Falk K. 외, 1994, Immunogenetics 39: 230-242. 후자의 참조문헌 역시 HLA-DQ 및 -DP 리간드를 다루고 있다. 이들 5가지 문헌에 수록된 에피토프들 및 이들과 공통의 모티프를 공유하는 에피토프들은 모두 본 발명에서 사용될 수 있는 타당한 천연 에피토프의 후보이다.
한편, 에피토프는 MHC 클래스 II 분자 대부분에 결합할 수 있는 여하한 인공 T- 세포 에피토프일 수 있다. 이점에 있어서 WO95/07707 및 그에 대응하는 논문 Alexander J. 외, 1994, Immunity 1: 751-761 (두가지 문헌 모두 본 발명에 참조됨)에 설명된 판 (pan) DR 에피토프 펩타이드 ("PADRE")는 본 발명에 따라 사용되는 에피토프의 주목할만한 후보들이다. 이들 문헌에서 개시된 가장 효과적인 PADRE 펩타이드는 투여시 안정성 증진을 위해 C- 및 N-말단에 D-아미노산을 지니고 있음을 주목해야 한다. 그러나, 본 발명은 변형된 IL5의 일부로서 타당한 에피토프를 인코포레이션시켜서 APC의 리소좀 구획 내부에서 이것을 효소적으로 분해시킴으로써 MHC-II 분자의 후속적인 제시를 가능케 하는데 그의 주목적이 있으므로 본 발명에 사용된 에피토프에 D-아미노산을 인코포레이션시키는 것이 상책은 아니다.
한가지 특히 바람직한 PADRE 펩타이드는 아미노산 서열 AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 65) 또는 면역학적으로 효과적인 그의 서브서열이다. 이 에피토프 및 이와 동일하게 MHC 제한이 결여된 기타의 에피토프들은 본 발명의 방법에서 사용되는 IL5 유사체 중에 제시되어야 할 바람직한 T-세포 에피토프들이다. 이러한 초-난잡성 에피토프들은 백신화 동물의 면역계에 단 하나의 변형 IL5만이 제되는, 본 발명의 간단한 구체예에서 허용가능하다.
상기한 바와 같이, IL5의 변형 역시 변형된 IL5를 APC 또는 B-임파구에 표적화시키는 제 1 부분의 도입을 포함한다. 예컨대, 제 1 부분은 B-임파구 특이적인 표면 항원 또는 APC 특이적인 표면 항원에 대한 특이적 결합 파트너가 될 수 있다. 이러한 많은 특이적인 표면 항원들이 기술분야에 알려져 있다. 예컨대, 그러한 부분은 B-임파구 또는 APC 상에 수용체가 있는 탄수화물일 수 있다 (예컨대 만난 또는 만노스). 다른 한편, 제 2 부분은 합텐일 수 있다. 또한 APC 또는 임파구 상의 표면 분자를 특이적으로 인식하는 항체 단편 역시 제 1 부분으로서 이용가능하다 (표면 분자는 예컨대 마크로파지 및 단구의 FCγ 수용체, 예컨대 FCγRI 또는 CD40 또는 CTLA-4와 같은 기타의 특이적인 표면 마커일 수 있다). 이러한 모든 예시적인 표적화 분자들이 후술되는 바와 같은 어쥬번트의 일부로서 이용될 수 있음에 주목하여야 한다.
증가된 면역 응답을 달성하기 위해, 변형된 IL5 폴리펩타이드를 특정 세포 유형에 표적화시키기 위한 대체안 또는 보충안으로서, 면역계를 자극시키는 상기 제 2 부분을 포함시킴으로써 면역계의 응답성 수준을 증가시킬 수 있다. 이러한 제 2 부분의 전형적인 예로는 시토카인, 및 열-충격 단백질 또는 분자 샤페론 (chaperones), 및 이들의 유효한 일부분을 들 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 적절한 시토카인의 예로는 백신 조성물 중 보통, 어쥬번트로서도 기능하게되는 것들, 예컨대, 인터페론 γ (IFN-γ), Flt3L, 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 2 (IL-2), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 12 (IL-12), 인터류킨 13 (IL-13), 인터류킨 15 (IL-15), 및 과립구-마크로파지 집락 자극 인자 (GM-CSF: granulocyte-macrophage cology stimulating factor)를 들 수 있으며; 다른 한편, 시토카인 분자의 기능적 일부는 제 2 부분으로서 충분할 수 있다. 어쥬번트 물질로서 이러한 시토카인을 사용하는 것에 대해서는 하기 설명을 참조하면 된다. IL-4와 IL-13의 두가지 모두를 사용하는 것은 매우 신중하게 해야함을 명심해야 한다. 이는, 두가지 분자 모두가 아토피 및 천식의 발병학에 있어서 중요한 이펙터 분자인 것으로 알려져 있기 때문이다.
본 발명에 따른 제 2 부분으로서 사용되는 적절한 열-충격 단백질 또는 분자샤페론은 HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (gp96으로도 알려져 있음. Wearsch PA 외, 1998, Biochemistry 37: 5709-19 참조), 및 CRT (칼레티쿨린)일 수 있다.
다른 한편, 제 2 부분은 리스테리오라이신 (LLO: listeriolycin), 지질 A 및 열-불안정성 엔테로톡신과 같은 독소일 수 있다. 또한, MDP (뮤라밀 디펩타이드)와 같은 몇몇 미코박테리아계 유도체 및 트레할로스 디에스테르 TDM과 TDE도 흥미로운 가능성을 지닌다.
또한, 면역계에 변형된 IL5의 제시가능성을 증대시키는 제 3 부분을 도입하는 가능성도 본 발명의 중요한 구체예이다. 이러한 이론의 몇가지 예를 들 수 있다. 예컨대,Borrelia burgdorferi단백질 OspA 중 팔미토일 지질화 앵커가 자가-보조 (self-adjuvating) 폴리펩타이드를 제공하는데 이용될 수 있다는 것이 알려져 있다 (예컨대 WO96/40718). 지질화 단백질은 미셀-유사 구조를 형성하며 이는 폴리펩타이드의 지질화 앵커 부분을 구성하는 코어 부분과, 그로부터 돌출된 분자의 나머지 부분을 갖고, 항원 결정기를 복수개 제시할 수 있다. 따라서, 이러한 접근방법 및 상이한 지질화 앵커 (예컨대 미리스틸기, 미리스틸기, 파네실기, 제라닐-제라닐기, GPI-앵커 및 N-아실 디글리세라이드기)를 이용하느 관련 접근방식은 본 발명의 바람직한 구체예로서, 특히 이는 재조합적으로 생산된 단백질에 있어서 이러한 지질화 앵커의 제시가 매우 직설적이며 변형된 IL5 폴리펩타이드의 융합 파트너로서 단지 예컨대 자연발생적인 단일 서열을 이용하기만 하면 되기 때문이다. 또 다른 가능성은 보체 인자 (complement factor) C3 또는 C3 자체의 C3d 단편을 이용하는 것이다 (Dempsy 외, 1996, Science 271, 348-350 및 Lou ; Kohler, 1998,Nature Biotechnology 16, 458-462).
면역계에 IL5의 중요한 에피토프 대역의 복제물 복수개 (예컨대 적어도 2개)를 제시하기도 하는 본 발명의 또 다른 구체예는 IL5의 공유 또는 비공유 커플링, 특정 담체 분자에 대한 서브서열 또는 그의 변이체이다. 예컨대, 덱스트란과 같은 탄수화물 등 폴리머가 이용가능하다. 예컨대, Lees A 외, 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A 외, 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600. 만노스와 만난도 유용한 대안이 될 수 있다. 예컨대 E. coli 및 다른 세균으로부터의 통합 막 단백질 역시 유용한 컨쥬게이션 파트너이다. 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 파상풍 독소, 디프테리아 독소 및 소 혈청 알부민 (BSA)와 같은 전통적인 담체 분자 역시 바람직하고도 유용한 컨쥬게이션 파트너이다.
천연 IL5의 특정 부위는 변이를 수행하는데 극히 알맞은 부위인 것으로 믿어지고 있다. 루프 1-3 중 적어도 하나 또는 아미노산 잔기 C-말단에서 헬릭스 D에서의 변형 (도 3에 도시된 상기 루프 및 상기 헬릭스 D는 인간 및 쥐의 IL5에 해당함)은 소망하는 구조물 및 백신 결과를 얻는데 가장 그럴듯한 방법인 것으로 예상된다. 이러한 선택된 대역에서 고려할 사항은 a) 공지 및 예측된 B-세포 에피토프의 보존, b) 3차 및 4차 구조 등의 보전, 하기 실시예 선행부의 내용 참조). 어떻든, 상기한 바와 같이, 여러 가지 위치에서 T-세포 에피토프가 모두 도입된 일련의 변형된 IL5 분자를 스크리닝하는 것은 상당히 용이하다.
본 발명으 가장 바람직한 구체예는 인간 IL5의 다운-조절을 포함하므로, 상술한 IL5 폴리펩타이드가 인간의 IL5 폴리펩타이드인 것이 결론적으로 바람직하다.이 구체예에서, 인간의 IL5 폴리펩타이드가 SEQ ID NO:1에서 적어도 하나의 아미노산 서열을, 길이가 같거나 다르고 외래 TH에피토프를 갖는 적어도 하나의 아미노산 서열로 치환함으로써 변형된 것인 것이 특히 바람직하다: 단, 여기서 치환된 아미노산 잔기는 잔기 87-90, 잔기 32-43, 잔기 59-64, 잔기 86-91, 및 잔기 110-113 중에서 선택된다. 이러한 구조물의 배경이 되는 이론적 근거는 실시에에서 상술한다.
IL5 및 변형된 IL5 폴리펩타이드의 조성
IL5 폴리펩타이드 또는 변형된 IL5 폴리펩타이드를 동물에게 투여함으로써 그 동물의 면역계에 제시하는 경우, 폴리펩타이드의 조성은 일반적으로 기술분야에 알려진 원칙에 따른다.
활성성분으로서 펩타이드 서열을 함유하는 백신의 제조는 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예컨대 미국특허 4,608,251호; 4,601,903호; 4,599,231호; 4,599,230호; 4,596,792호; 및 4,578,770호에 예시되어 있으며, 이들 모두 본 발명에 참조되었다. 일반적으로, 이러한 백신은 액상 용액이나 현탁액으로서 주사가능하게 만들어지며; 주사하기 전 액상 용액이나 현탁액으로 하기에 적합한 고체 형태로도 바람직하게 제조할 수 있다. 이러한 제제는 유화시킬 수도 있다. 활성 면역원성 성분을 종종 약학적으로 허용가능하며 상기 활성 성분과 혼화가능한 부형제와 혼합한다. 적합한 부형제로는 예컨대 물, 실란, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이들의 혼합물을 들 수 있다. 또한, 소망되는 경우, 백신에 습윤제나 유화제, pH 완충제또는 백신의 효능을 증강시키는 어쥬번트와 같은 보조 물질을 소량 첨가할 수도 있다: 어쥬번트에 대해서는 후술한다.
백신은 통상적으로 주사, 예컨대 피하 (subcutaneously), 피내 (intracutaneously), 피내 (intradermally), 진피하 (subdermally), 또는 근육내 (intramuscularly) 등의 경로로 비경구투여하는 일반적이다. 다른 투여 경로에 적합한 부가적인 조성으로는 좌제, 몇몇 경우에는 경구, 볼내 (buccal), 설하, 복강내, 질내, 항문내, 경막외 (epidural), 척추내, 및 두개골내 투여용 조성물을 들 수 있다. 좌제에는, 예컨대 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세라이드와 같은 통상적인 결합제와 담체를 포함시킬 수 있으며; 이러한 좌제는 0.5 내지 10% 범위, 바람직하게는 1-2% 범위로 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 만들 수 있다. 경구 투여용 조성물은 예컨대 제약등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이 조성물들은 용액제, 현탁제, 정제, 알약, 캡슐제, 서방형 조성물 또는 분말제의 형태를 가지며, 활성성분 10-95%, 바람직하게는 25-70%를 포함하는 것이 좋다. 경구용 조성물의 경우, 콜레라 독소는 흥미로운 조성 파트너 (그리고 가능하게는 컨쥬게이션 파트너이기도 함)이다.
폴리펩타이드는 중성 또는 염 형태로서 백신 내로 조성될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염에는 산부가염 (펩타이드의 유리 아미노기로 형성됨)을 들 수 있으며 이들은 예컨대 염산, 인산등과 같은 무기산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산을 이용하여 조성된다. 유리 카르복실기를 이용하여 조성된 염류는 예컨대 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 또는 페릭 하이드록사이드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수도 있다.
백신은 투여 조성과 혼화가능한 방식으로, 치료적으로 유효하며 면역원적인 양으로 투여된다. 투여량은 면역 응답을 일으킬 환자의 면역계 능력, 소망되는 보호정도 등 치료될 환자의 특성에 따라 조절된다. 적절한 투여량 범위는 1회 백신화 당 활성성분 수백 마이크로그램 정도가 될 것이며, 바람직한 범위는 약 0.1 내지 2,000μg (1 ~ 10 mg 범위로 더 많은 양까지 고려될 수도 있다), 예컨대, 0.5 내지 1,000μg, 더욱 바람직하게는 1 내지 500 μg, 특히 10 내지 100 μg의 양인 것이 좋다. 적절한 초기 투여량과 부스터 주사 (booster shots) 역시 가변적이지만, 초기 투여에 이은 후속적인 접종 또는 부가적인 투여에 의해 정례화된다.
투여방법은 크게 다를 수 있다. 통상적인 모든 백신 투여방법이 적용가능하다. 이러한 예로는 고상의 생리적으로 허용가능한 베이스 상에 경구 투여하는 것 또는 생리적으로 허용가능한 분산제, 또는 주사 등에 의해 경구적으로 투여하는 것을 들 수 있다. 백신의 투여량은 투여 경로에 따라 달라질 수 있으며 백신화될 개체의 연령과 항원 조성에 따라서도 달라진다.
백신의 폴리펩타이드의 몇몇은 백신 중에서 충분히 면역원적이지만, 다른 것들은 백신이 어쥬번트 물질을 부가적으로 함유할 경우 면역 응답이 증강되는 것일 수 있다.
백신에 대해 어쥬번트 효과를 달성하는 다양한 방법이 알려져 있다. 일반적인 이론과 방법이 "The Theory and Practical Application of Adjuvants', 1995, Dancan E.S. Stewart-Tull (ed)., John Wiley ; Sons Ltd. ISBN 0-471-95170-6, 및 "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G. 외, (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9에 자세히 설명되어 있으며, 두 문헌 모두 본 발명에 참조되었다.
자가항원에 대해 자가관용성을 파괴시키기 쉬운 것으로 입증된 어쥬번트를 사용하는 것이 특히 바람직하며; 이것은 실제로, 자가백신 중에서 활성 성분으로서 미변형 IL5가 사용될 경우에는, 필수적이다. 적절한 어쥬번트의 비제한적인 예로는 면역 표적화 어쥬번트; 독소, 시토카인 및 미코박테리아 유도체와 같은 면역 조절 어쥬번트; 오일 조성물; 폴리머; 미셀 형성 어쥬번트; 사포닌; 면역자극 복합체 매트릭스 (ISCOM matrix: immunostimulating complex matrix); 입자 (particle); DDA; 알루미늄 어쥬번트; DNA 어쥬번트; γ-인슐린; 캡슐화 어쥬번트 등을 들 수 있다. 유사체 중 제 1, 제 2 및 제 3 부분으로서 유용한 화합물과 제제에 관련된 상기 내용은 본 발명의 백신의 어쥬번트의 용도에 대해서도 일반적으로 준용되는 것으로 이해되어야 한다.
어쥬번트의 적용은 완충 염수 중 대개 0.05 내지 0.1 퍼센트 용액으로 사용되는 알루미늄 하이드록사이드 또는 포스페이트 (명반), 0.25 퍼센트 용액으로서 사용되는 슈가의 합성 폴리머 (예컨대 Carbopol)와의 혼합물과 같은 제제를 사용하는 것을 들 수 있으며, 각각 30초 내지 2분의 기간 동안 70 내지 101℃의 온도범위로 열처리함으로써 백신 중에서 단백질 응집시키거나 가교제에 의해 응집시키는것도 가능하다. 펩신 처리된 항체 (Fab 단편)를 이용하여 재활성화시킴에 의한 알부민으로의 응집, C. parvum 또는 그램-음성 세균의 리포폴리사카라이드 성분과 같은 세균 세포와의 혼합물, 만나이드-모노-올리에이트 (Aracel A)과 같은 생리적으로 허용가능한 오일 담체 중의 유제 또는 블록 치환체로서 사용되는 퍼플루오로카본 (Fluosol-DA)의 20% 용액과의 에멀젼 등도 이용가능하다.
본 발명에 따라 DDA(디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드)는 DNA 및 γ-인슐린과 같은 보조제의 흥미로운 후보가 될 뿐만 아니라, Freund' 완전 및 불완전 어쥬번트와 QuilA 및 QS21과 같은quillaja사포닌도 RIBI처럼 흥미로운 후보이다. 또 다른 가능성은 모노포스포릴 지질 A (MPL)이며, 상술한 C3 및 C3d는 뮤라밀 디펩타이드 (MDP)이다.
리포좀 조성 역시 어쥬번트 효과를 부여하는 것으로 알려져 있으므로, 리포좀 어쥬번트도 본 발명에서 바람직하게 이용된다.
또 다른 면역자극 복합 매트릭스 타잎 (ISCOM매트릭스) 어쥬번트는 본 발명에 따른 바람직한 선택으로서, 특히 이 유형의 어쥬번트는 APCs에 의한 MHC 클래스 II 발현을 업-조절 (up-regulating) 할 수 있는 것으로 나타났다. ISCOM매트릭스는Quillaja saponaria로부터 얻은 사포닌 (트리테르페노이드), 콜레스테롤 및 인지질로 이루어진다. 면역원성 단백질과 한데 혼합되면, 얻어진 과립상 조성물은 ISCOM 입자라 알려진 조성으로 디며 여기서 사포닌은 60-70 %w/w, 콜레스테롤과 인지질은 10-15 %w/w, 그리고 단백질은 10-15 %w/w이다. 조성 및 면역자극의 용도에 관한 설명은 예컨대 어쥬번트를 다루고 있는 상기 텍스트에서, 그리고 Morein B외, 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475 및 Barr IG 및 Mitchell GF, 1996, Immunol. 및 Cell Biol. 74: 8-25 (두 문헌 모두 본 발명에 참조됨)에서 찾아볼 수 있으며 이들 문헌은 완전한 면역자극 복합체의 제조에 유용한 지침을 제공한다.
어쥬번트 효과를 얻기 위한 또 다른 매우 흥미로운 (따라서 바람직한) 가능성은 Gosselin 등의 방법 (1992, 본문에 참조됨)을 이용하는 것이다. 간단히 설명하면, 단구/마크로파지 상의 Fcγ수용체에 대한 항체 (또는 항원 결합 항체 단편본 발명의 항원과 같은 타당한 항원의 제시가 향상될 수 있다. 특히 항원과 항-FcγRI간의 컨쥬게이트는 백신화 목적을 위한 면역원성을 증강시키는 것으로 입증된 바 있다.
다른 가능성들은 IL5의 변형된 버젼에서 제 1 및 제 2 부분에 대한 후보로서 상기한 표적화 물질과 면역조절 물질 (즉 시토카인)을 사용하는 것이다. 이와 관련해서, 폴리 I:C와 같은 시토카인의 합성 인듀서 (inducers) 역시 가능하다.
적절한 미코박테리아 유도체는 뮤라밀 디펩타이드, 완전 Freund 어쥬번트, RIBI 및 TDM 및 TDE와 같은 트레할로스의 디에스테르 중에서 선택된다.
적절한 면역 표적화 어쥬번트는 CD40 리간드와 CD40 항체 또는 그의 특별히 결합된 단편 (상기 내용 참조), 만노스, Fab 단편 및 CTLA-4이다.
적절한 폴리머 어쥬번트는 덱스트란, PEG, 전분, 만난 및 만노스와 같은 탄수화물; 플라스틱 폴리머; 및 라텍스 비드와 같은 라텍스 중에서 선택된다.
면역 응답을 변형시키는 또 다른 바람직한 방식은 "버츄얼 임파절 (VLN: virtual lymph node)" [ImmunoTherapy, Inc. (360, Lexington Avenue, new York,NY 10017-6501) 에 의해 개발된 특허판매 의료장치]에 IL5 면역원 (임의로 어쥬번트 및 약학적으로 허용가능한 담체 및 비히클과 함께)을 포함시키는 것이다. VLN (얇은 튜브상 장치)은 임파절의 구조와 기능을 닮은 것이다. 피하에 VLN을 삽입하면 멸균 염증 부위 시토카인과 케모카인 (chemokines)의 급격한 증가와 함께 멸균 염증 부위가 생겨난다. T-세포와 B-세포 및 APC가 위험 신호에 신속히 대응하여, 염증 부위로 몰려들어 VLN의 다공성 매트릭스 내부에 축적된다. 항원에 대한 면역 응답을 일으키는데 필요한 항원 투여량은 VLN을 이용할 경우 감소되며 VLN을 이용한 백신화에 의해 부여되는 면역 보호는 어쥬번트로서 Ribi를 이용한 통상적인 면역화를 능가하는 것으로 나타났다. 이 기술은 Gelber C. 등의 1998, "Elicitatin of Robust Cellular and Humoral Immune Response to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node", in "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th ~ 15th, 198, Seascape Resort, Aptos, California"에 간략히 설명되어 있다.
백신은 적어도 1년에 1번, 예컨대 1년에 적어도 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 및 12회 투여하여야 하는 것으로 기대된다. 더욱 구체적으로, 1년에 1 내지 12회, 예컨대 백신을 필요로 하는 대상은 1년에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회 및 12회 투여하여야 하는 것으로 여겨진다. 앞서, 본 발명에 따른 바람직한 자가백신을 이용함으로써 유도된 기억 면역성 (memory immunity)가 영구적이지 않은 것으로 나타난 바 있고, 따라서, 면역계를 주기적으로 유사체로 챌린지시킬 필요가 있다.
유전적 변이로 인해, 여러 개체들이 동일한 폴리펩타이드에 대해 여러강도로 면역 응답반응할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 백신은 면역 응답 증강을 위해 여러가지 서로 다른 폴리펩타이드를 포함하며, 이에 대해서는 외래 T-세포 에피토프 도입과 관련한 선택에 대해 설명한 바 있다. 백신은 2가지 이상의 폴리펩타이드를 함유할 수 있으며, 이 때 상기 모든 폴리펩타이드는 상기 정의한 바와 같다.
백신은 결론적으로 3 내지 20개의 서로 다른 변형 또는 비변형 폴리펩타이드, 예컨대 3 내지 10개의 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 그러나, 대개는 폴리펩타이드의 수는 1개 또는 2개와 같이 최소한으로 유지될 것이다.
핵산 백신화
펩타이드-기제 백신의 클래식 투여의 한가지 대안으로서, 핵산 백신화 ("핵산 면역화", "유전적 면역화" 및 "유전자 면역화"라고도 부름) 기술이 주목할만한 몇몇 특성을 제시한다.
우선, 전통적인 백신 접근방식과 대조적으로, 핵산 백신화는 자원 소모적인 대규모 면역원 생산 (예컨대 변형된 IL5를 생성하는 미생물의 공업적 규모 발효 형태)을 필요로 하지 않는다. 뿐만 아니라, 면역원의 정제 및 리폴딩을 위한 장치도 필요하지 않다. 마지막으로, 핵산 백신화는 도입되는 핵산의 발현 산물을 생산하기 위해, 백신화된 개체의 생화학적 기구에 의존하므로, 발현 산물의 최적 후번역 가공이 일어날 것으로 기대되며; 이것은 상기한 바와 같이, 본래 IL5 B-세포 에피토프의 유의적인 분획이 변형된 분자 중에서 보존될 것이고, 이론적으로 B-세포 에피토프가 여하한 (바이오)분자 (예컨대 탄수화물, 지질, 단백질 등)의 일부들에 의해구성될 것이어서, 자가백신화의 경우 특히 종요하다. 따라서, 면역원의 자연적인 글리코실화 및 지질화 패턴은 전체적인 면역원성에 중요할 것이고 이것은 면역원 생산 숙주를 가짐으로써 확실해질 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 한가지 구체예는 변형된 IL5를 코딩하는 핵산(들)을 동물 세포내로 도입함으로써 변형된 IL5를 제시하고 그에 따라 도입된 핵산(들) 세포에 의한 생체 발현을 달성하는 것이다.
이 구체예에서, 도입된 핵산은 바람직하게는, 네이키드 DNA, 하전 또는 비하전 지질과 함께 조성된 DNA, 리포좀 내에 조성된 DNA, 바이러스 벡터 내에 포함된 DNA, 트랜스펙션-용이화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 표적화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 칼슘 침전제제와 함께 조성된 DNA, 불활성 담체 분자에 커플링된 DNA, 폴리머, 예컨대 PLGA 중에 캡슐화된 DNA (WO98/31398에 설명된 마이크로인캡슐레이션 기술 참조) 또는 키틴 또는 키토산 중에 캡슐화된 DNA, 및 어쥬번트와 함께 조성된 DNA의 형태일 수 있는 DNA인 것이 좋다. 여기서, 전통적인 백신 조성물 중 어쥬번트의 사용과 관련된 실제 모든 고려 사항이 DNA 백신 조성물에도 적용됨을 이해하여야 한다. 따라서, 폴리펩타이드 기제 백신의 관점에서 어쥬번트와 관련한 본 발명의 모든 설명은 핵산 백신화 기술 중 이들의 이용에 관해서도 준용된다.
상기 폴리펩타이드 기제 백신의 투여 계획 및 투여 경로에 관한 한, 이들은 본 발명의 핵산 백신에 또한 적용 가능하고 폴리펩티이드의 투여 계획 및 투여 경로에 관련된 상기 모든 논의를 핵산에 준용한다. 또한, 핵산 백신을 적절하게 정맥내 및 동맥내 투여할 수 있다. 게다가, 핵산 백신을 소위 유전자 건을 사용하여 투여할 수 있다는 것이 기술분야에 공지되어 있고, 따라서 상기의 것 및 투여와 등가 방식을 또한 본 발명의 일부분으로 간주한다. 마지막으로, 핵산의 투여에 VLN을 사용하는 것이 양호한 결과를 발생시킨다고 보고되어 있고, 따라서, 상기의 특별한 투여 방식이 특히 바람직하다.
게다가, 면역화 작용인자로 사용된 핵산이, 예컨대 유용한 어쥬번트로 논의되는 사이토카인(cytokines)과 같은 상기 면역조절 물질의 형태로, 1 번째, 2 번째 및/또는 3 번째 부분을 인코딩하는 영역을 포함할 수 있다. 이러한 구체예의 바람직한 버전은 유사체 코딩 영역 및 면역조절물질(immunomodulator) 코딩 영역을 상이한 리딩 프레임(reading frame) 내 또는 적어도 상이한 프로모터의 조절하에 포함하는 결과를 초래한다. 이에 의하여, 면역조절물질의 융합 파트너로서 유사체 또는 에피토프를 생성하는 것을 회피한다. 또한, 구별되는 두 뉴클레오타이드 단편을 사용할 수 있다. 그러나, 이는 동일한 분자 내에 포함된 두 코딩 영역을 함유시의 확실한 공동발현의 이점 때문에 덜 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 IL5에 대한 항체의 생성을 유도하는 조성물과 관련있으며, 상기 조성물은 다음을 포함한다:
- 본 발명의 백터 또는 핵산 단편(백터에 관한 논의는 하기 참조), 및
- 상기와 같은 약학적 및 면역학적으로 수용가능한 부형제(vehicle) 및/또는 담체 및/또는 어쥬번트.
정상적 환경하에서, IL5 변이체-인코딩 핵산이 벡터의 형태로 도입되며, 발현은 바이러스 프로모터의 조절하에서 일어난다. 본 발명에 따른 벡터 및 DNA 단편의 보다 상세한 논의를 위하여 하기 논의를 참조한다. 또한, 핵산 백신의 용도 및 포뮬레이션과 관련된 상세한 설명으로 Donnelly JJ 등, 1997, Annu. Rev. Immunol.15:617-648 및 Donnelly JJ 등, 1997, Life Sciences60:163-172를 참조할 수 있다. 이들 참고문헌은 모두 본 명세서의 참고문헌으로서 기재되어 있다.
생백신
변형 IL5의 면역계에 대한 프리젠테이션(presentation)을 초래하기 위한 세 번째 대안은 생백신 기술을 사용하는 것이다. 생백신에 있어서, 면역계에 대한 프리젠테이션은 동물에 핵산 단편과 같은 벡터 인코포레이팅 또는 변형 IL5를 인코딩하는 핵산 단편으로 형질전환된 비병원성 미생물을 투여함으로써 영향을 받는다. 비병원성 미생물은, 예컨대,마이코박테리움 비보스BCG(Mycobacterium bovisBCG), 비병원성스트렙토코커스spp.(Streptococcus spp.),이. 콜라이(E. coli),살모넬라 spp. (salmonella spp.),비브리오 콜레라(Vibrio cholerae),시겔라(shigella) 등과 같은, 모든 적절한 무독화(attenuated) 박테리아 계통(재조합 DNA 기술에 의한 병원성 발현 산물의 제거 또는 통과(passaging)에 의하여 무력화됨)일 수 있다. 최신 생백신의 제조에 대한 검토를 Saliu P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 및 Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990에서 찾을 수 있으며, 이들은 모두 본 명세서에 참고문헌으로 기재되어 있다. 이와 같은 생백신에 사용된 벡터 및 핵산 단편에 대한 상세한 설명을 위하여 하기의 논의를 참조한다.
박테리아 생백신에 대한 대안으로서, 하기하는 본 발명에 따른 핵산 단편을백시니아 계통 또는 다른 모든 적절한 폭스 (pox) 바이러스와 같은 비독성 (non-virulent) 바이러스 백신에 결합시킬 수 있다.
정상적으로, 비병원성 미생물 또는 바이러스를 동물에 단 한 번 주입하지만, 어떤 경우에는 방어 면역을 유지하기 위하여 라이프타임에 한 번 이상 미생물을 투여하는 것이 필요할 수 있다. 폴리펩타이드 백신화에 대한 상기된 바와 같은 면역화 설계가 생백신 또는 바이러스 백신을 사용할 때 유용할 것이라고 생각한다.
또한, 생백신 또는 바이러스 백신을 프리바이러스 또는 이어지는 폴리펩타이드 및/또는 핵산 백신과 조합시킬 수 있다. 예컨대, 생백신 또는 바이러스 백신에 의한 일차 면역화에 이은 폴리펩타이드 또는 핵산 접근에 의한 연속된 추가 면역화를 초래하는 것이 가능하다.
미생물 또는 바이러스를, 예컨대 유용한 어쥬번트로 논의되는 사이토카인과 같은 상기 면역조절 물질의 형태로, 1 번째, 2 번째 및/또는 3 번째 부분을 인코딩하는 영역을 포함하는 핵산을 사용하여 형질전화시킬 수 있다. 이러한 구체예의 바람직한 버전은 유사체 코딩 영역 및 면역조절물질 코딩 영역을 상이한 리딩 프레임 내 또는 적어도 상이한 프로모터의 조절하에 포함하는 결과를 초래한다. 이에 의하여, 면역조절물질에 대한 융합 파트너로서 유사체 또는 에피토프를 생성하는 것을 회피한다. 또한, 구별되는 두 뉴클레오타이드 단편을 형질전환 작용인자로 사용할 수 있다. 물론, 동일한 리딩 프레임 내에 1 번째, 2 번째 및/또는 3 번째 부분을 포함하는 것이 발현 산물, 본 발명의 유사체로서 제공할 수 있고 이러한 구체예는 본 발명에 있어서 특히 바람직하다.
질병 치료에 있어서 본 발명에 따른 방법의 사용
상기의 논의로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 방법의 제공은 호상백혈구증가증에 의하여 특징지어지는 질병의 조절을 가능하게 한다. 이러한 관계에 있어서, 본 발명에 따른 방법의 주요 표적은 천식(asthma)이지만 복합 알레르기(multiple allergy) 및 알레르기성 비염(allergic rhinitis)과 같은 다른 만성 알레르기성 증상 또한 치료/개선에 있어 가능한 표적이다. 따라서, IL5 활성을 감소시키는 본 발명에 따른 방법의 중요한 구체예는 천식 또는 호상백혈구증가증에 의하여 특징지어지는 다른 만성 알레르기성 증상의 치료 및/또는 예방 및/또는 개선을 포함하며, 본 발명의 방법에 따라 호상백혈구 세포의 수가 현저하게 감소한 이러한 범위에 대한 IL5 활성을 감소시키는 것을 포함한다.
이러한 관계에 있어서 이와 같은 호상백혈구 세포의 현저한 감소는 치료 전 호상백혈구 수와 비교하여 적어도 20 %이다. 그러나, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 % 및 심지어는 적어도 90 % 와 같이 보다 높은 퍼센티지를 예측할 수 있다. 상기 감소는 전신적 또는, 이 보다 자주, 예컨대 폐에서와 같이 국부적일 수도 있다. 호상백혈구 세포의 수는 기술 분야에서 잘 알려진 방법으로 측정하는데, 통상적으로 적절한 샘플(예컨대, BAL 액)을 현미경으로 검경하고 현미경하에서 호상백혈구 세포의 수를 수동으로 측정한다. 또한, 호상백혈구의 수는 흐름 혈구계산법(flow cytometry methods) 또는 호상백혈구를 확실히 인지할 수 있는 다른 모든 통상적인 혈구계산법을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드, 폴리펩타이드 및 조성물
상기한 바로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 호상백혈구 세포의 수의 감소를 직접적으로 얻기 위하여 IL5 항원에 대하여 각 개체를 면역화시키려는 구상에 기초를 두고 있다. 이러한 면역화를 얻기 위한 바람직한 방법은 IL5의 변형된 버전을 사용하는 것이며, 이로 인하여 이전에 기술분야에 알려지지 않은 분자를 제공한다.
본 명세서에서 논의된 변형 IL5 분자는 그 자체로 발명성이 있으며, 따라서 본 발명의 중요한 부분은 동물 IL5에서 유도된 IL5 유사체에 속하며, 상기 유사체로 동물을 면역화시키는 것이 비변형 IL5 폴리펩타이드와 교차-반응하는 항체의 생산을 유도하는 결과를 갖는 변형에 도입된다. 바람직하게, 상기 변형의 본질은 변형 IL5을 사용할 때의 본 발명에 따른 방법의 다양한 구체예의 논의시의 상기된 변형 유형에 합치한다. 따라서, 본 명세서에 나타난 변형 IL5 분자에 속하는 모든 설명은 본 발명에 따른 IL5 유사체를 설명하기 위한 목적과 관련있고, 이러한 모든 설명은 이들 유사체의 설명에 준용된다.
바람직한 변형 IL5 분자는 IL5 또는 적어도 10 아미노산 길이인 그들의 서브서열와 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 초래하는 변형을 포함한다. 예컨대, 적어도 75 % 또는 심지어 적어도 80 % 또는 85 % 와 같이 보다 높은 서열 동일성이 바람직하다. 단백질 및 핵산의 서열 동일성을 (N ref -N dif ) ·100/N ref 로 계산할 수 있으며, 여기서N dif 는 정렬시의 두 서열 내 비-상동 잔기의 총 수이고,N ref 는 서열들 중 한 서열 내 잔기의 총 수이다. 따라서, DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 AATCAATC와 75 %의 서열 상동성을 갖는다(N dif =2 및N ref =8).
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법의 실행에 있어서 유용한 조성물에 속한다. 따라서, 본 발명은 또한 동물 내 자가-단백질인 IL5 폴리펩타이드의 면역원적 유효량을 포함하는 면역원성 조성물과 관련된 것으로, 상기 IL5 폴리펩타이드는 IL5 폴리펩타이드에 대한 동물의 자가관용을 파괴하기 위하여 면역학적으로 수용가능한 어쥬번트와 함께 제조되며, 상기 조성물은 약학적 및 면역학적으로 수용가능한 부형제 및/또는 담체를 추가적으로 포함한다. 즉, 본 발명의 이러한 부분은 본 발명에 따른 방법의 구체예들과 관련하여 설명한 자연 발생적 IL5 폴리펩타이드의 조성(formulation)에 속한다.
또한, 본 발명은 상기 정의된 IL5 유사체의 면역학적 유효량을 포함하는 면역원성 조성물과 관련된 것으로, 상기 조성물은 약학적 및 면역학적으로 수용가능한 희석액 및/또는 부형제 및/또는 담체 및/또는 첨가제(excipient) 및 선택적으로 어쥬번트를 추가적으로 포함한다. 즉, 본 발명의 이러한 부분은, 특히 본 명세서에 상기된 바와 같이, 변형 IL5의 포뮬레이션과 관련있다. 따라서, 어쥬번트, 담체 및 부형제의 선택은 IL5의 감소를 위한 본 발명의 방법에 사용되는 변형 및 미변형 IL5의 포뮬레이션의 참조시 상기한 바에 따른다.
폴리펩타이드는 기술분야에 공지된 방법에 따라 제조한다. IL5 유사체를 인코딩하는 핵산 서열을 적절한 벡터에 도입시키고, 상기 백터로 적절한 숙주 세포를형질전환시키고, 상기 핵산 서열을 발현시키고, 발현 산물을 숙주 세포 또는 그들의 배양 상청액으로부터 회수한 후, 정제하고 선택적으로 리폴딩(refolding) 또는 유도화(derivatization)와 같은 추가적 변형 단계을 포함하는 재조합 유전자 기술에 의하여 더욱 긴 폴리펩타이드를 제조한다.
보다 짧은 펩타이드는 고체상 또는 액체상 펩타이드 합성의 공지된 기술에 의하여 제조하는 것이 바람직하다. 그러나, 이러한 기술의 새로운 이점은 이들 방법에 의하여 전장(full-length) 폴리펩타이드 및 전장 단백질의 제조가 가능하다는 것이며, 따라서, 합성 방법에 의하여 긴 구조를 제조하는 것도 또한 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명에 따른 핵산 단편 및 벡터
재조합 유전자 기술에 의하여 변형 IL5 폴리펩타이드를 제조할 수 있으나 또한 화학 합성 또는 반합성에 의하여도 이를 제조할 수 있다는 것은 상기에서 밝힌 바로부터 이해할 수 있을 것이다. 특히 단백질 운반체(KLH, 디프테리아 톡소이드, 티타누스 톡소이드, 및 BSA 등)와 탄수화물 중합체와 같은 비-단백질성 분자를 커플링하는 데 변형이 있는 경우에 후자의 두 선택 사항은 적절하며, 또한 상기 변형이 측쇄 또는 측기를 IL5 폴리펩타이드-유도 펩타이드 쇄로 첨가하는 내용을 포함하는 경우에도 적절하다.
재조합 유전자 기술의 목적으로, 또한 핵산 면역화의 목적으로, 변형 IL5를 암호화하는 핵산 단편은 중요한 화학 산물이다. 그러므로, 본 발명의 주요 부분은 IL5 유사체, 즉 융합 파트너로 첨가 또는 삽입되는 천연 IL5 서열을 포함하는, IL5유도 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 단편과 관계가 있으며, 바람직하게는 삽입 및/또는 첨가에 의하여, 바람직하게는 치환 및/또는 결실에 의하여 외래 T-세포 에피토프를 도입하는 IL5 유도 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 단편과 관계가 있다. 본 발명의 핵산 단편은 DNA 또는 RNA 단편이다.
본 발명의 핵산 단편은 적합한 벡터 내에 정상적으로 삽입되어 본 발명의 핵산 단편을 운반하는 클로닝 또는 발현 벡터를 형성시킬 것이다. 그러한 신규 벡터 또한 본 발명의 일부이다. 본 발명에 따른 이러한 벡터의 작제에 관한 세부 사항은 형질전환 세포 및 미생물에 관하여 기술하고 있는 하기 부분에서 고찰할 것이다. 적용 목적 및 형태에 따라 달라지겠지만, 벡터는 플라스미드, 파지 (phage), 코스미드, 미니-염색체, 또는 바이러스일 수 있으며, 또한 누드 DNA의 형태일 수 있다. 누드 DNA는 어떤 세포 내에서 단지 일시적으로 발현되는 중요 벡터이다. 본 발명의 바람직한 클로닝 및 발현 벡터는 자율 복제를 할 수 있으며, 따라서 차후의 클로닝에서 고-수준의 발현 또는 고-수준의 복제를 하기 위한 목적으로 고-복제수를 가능하게 한다.
본 발명에 따른 벡터의 일반적인 개요는 5' → 3' 방향과 작동가능한 연결에 있어 다음의 특징을 포함한다. 폴리펩타이드 단편의 막, 본 발명의 핵산 단편, 그리고 선택적으로 터미네이터를 암호화하는 핵산 서열 내로 분비(세포외 상으로의 분비 또는 적용 가능한 페리플라스마 내로의 분비) 또는 통합을 가능하게 하는 본 발명의 핵산 단편, 선택적으로 리더 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 구동하기 위한 프로모터. 생산 균주 또는 세포주의 발현 벡터로 작동하는 경우에는, 형질전환 세포의 유전자 안정성을 목적으로, 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 때, 벡터를 숙주 세포 게놈 내로 통합시키는 것이 바람직하다. 대조적으로 동물의 생체 내(in vivo) 발현에 영향을 미치기 위한 용도의 벡터로 실행하는 경우(즉 DNA 백신 접종에서 벡터를 사용하는 경우)에는, 바람직하게도 안전성을 이유로, 벡터를 숙주 세포 게놈 내에 통합할 수 없는 것은 아니다. 통상, 누드 DNA 또는 비-통합 바이러스 벡터를 사용하는데, 이는 당해 기술분야의 당업자에게 널리 알려진 특상의 것이다.
본 발명의 벡터는 숙주 세포를 형질전환시켜 본 발명의 변형 IL5 폴리펩타이드를 생산하는 데 이용된다. 그러한 형질전환 세포 또한 본 발명의 일부로서, 본 발명의 핵산 단편 및 벡터 증식을 위해 사용거나 또는 본 발명의 변형 IL5 폴리펩타이드의 재조합체 생산을 위해 사용되는 세포나 세포주로 배양시킬 수 있다. 다른 방편으로, 형질전환 세포는 변형 IL5의 세포벽 또는 박테리아성 막 내로 분비 또는 통합시키기 위하여 핵산 단편(하나의 단일 또는 다중 카피)을 삽입시킨 적합한 생(生)백신 균주일 수 있다.
본 발명의 바람직한 형질전환 세포는 박테리아(에스케리치아(Escherichia) 속[예컨대 이. 콜라이(E. coli) 바실러스(Bacillus) 속[예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)], 살모넬라(Salmonella) 속, 또는 미코박테리움 (Mycobacterium) 속[바람직하게는 비-병원성, 예컨대 엠. 보비스(M. bovis) BCG]), 효모(사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 등), 및 원생동물 등의 미생물이다. 다른 방편으로, 형질전환 세포는 곰팡이, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 포유동물 세포 등의 다세포 생물체로부터 유도된다. 인간으로부터 유도된 세포가 가장 바람직하다. 하기의 세포주와 벡터를 비교 참조토록 한다. 최근의 결과는 본 발명의 IL5 유사체의 재조합 생산을 위해 상업적으로 입수 가능한 초파리(Drosophila)의 멜라노가스터(melanogaster) 세포주(인비트로겐사로부터 입수 가능한 슈네이더 2(Schneider 2, S2) 세포주와 벡터 시스템) 용도의 전망이 아주 밝음을 보여준다. 따라서 이러한 발현 시스템이 특히나 바람직하다.
클로닝 및/또는 최적 발현의 목적으로, 바람직하게도 형질전환 세포는 본 발명의 핵산 단편을 복제할 수 있다. 핵산 단편을 발현하는 세포는 본 발명의 유용한 구체예로서 바람직하다. 이러한 구체예는 변형 IL5의 소규모 또는 대규모 제조를 위해 사용될 수 있으며, 또는 비-병원성 박테리아의 경우에 있어, 생백신에서 백신 구성체(constituent)로서 사용될 수 있다.
형질전환 세포에 의하여 본 발명의 변형 IL5를 생산하는 경우에는, 필수적이진 않더라도, 발현 산물을 배양액 내로 배출하거나 또는 형질전환된 세포의 표면 상에 운반하는 것이 편리하다.
효과적인 생산자 세포을 동정한 경우에는, 그것에 기초하여, 본 발명의 벡터를 운반하고 변형 IL5를 암호화하는 핵산 단편을 발현하는 안정한 세포주를 확립하는 것이 바람직하다. 바람직하게도, 이러한 안정한 세포주는 본 발명의 IL5 유사체를 분비 또는 운반함으로써 그 정제를 손쉽게 한다.
일반적으로, 숙주 세포에 적합한 종으로부터 유도되고 레플리콘(replicon)과 제어 서열(control sequence)을 함유한 플라스미드 벡터를 그 숙주와 관련하여 사용할 수 있다. 통상 벡터는 형질전환 세포에서 표현형(phenotypic) 선별을 제공할 수 있는 표지 서열(marking sequence)과 복제 부위를 운반한다. 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)는 통상적으로 이. 콜라이(E. coli) 속으로부터 유도된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다(예컨대 Bolivar 외, 1997 참조). pBR322 플라스미드는 암피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하고 따라서 형질전환 세포를 동정하는 간편한 수단을 제공한다. 또한 pBR 플라스미드 또는 그밖의 미생물 플라스미드나 파아지는 발현을 위해 원핵 미생물이 이용할 수 있는 프로모터를 함유하거나 함유하도록 변형되어야 한다.
원핵 생물의 재조합 DNA 작제시 가장 일반적으로 사용하는 프로모터는 B-락탐아제(페니실리나아제) 및 락토스 프로모터 시스템(Chang 외, 1978; Itakura 외, 1977; Goeddel 외, 1979)과 트립토판(trp) 프로모터 시스템(Goeddel 외, 1979; EP-A-0 036 776)을 포함한다. 이러한 프로모터가 가장 일반적으로 사용되는 반면, 그밖의 미생물 프로모터가 발견, 활용되고 있으며, 그 뉴클레오타이드 서열에 관한 상세 사항이 공표되고 있고, 숙련자가 이러한 프로모터를 작용적으로 플라스미드 벡터와 연결시키는 것을 가능하게 하고 있다(Siebwenlist 외, 1980). 인위적인 수단에 의하여 또 다른 프로모터 첨가의 필요성을 차단시키면서, 원핵 생물로부터 유래한 어떤 유전자는 그 자신의 프로모터 서열로부터 이. 콜라이(E. coli)에서 효과적으로 발현될 수 있다.
원핵 생물 외에, 효모 균체와 같은 진핵 미생물을 사용할 수 있으며, 여기서 프로모터가 발현을 구동할 수 있어야 한다. 다수의 기타 균주를 통상적으로 입수할수 있더라도, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 보통의 빵 효모를 진핵 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용한다. 사카로마이세스 (Saccharomyces)에서의 발현을 위하여는, 예컨대 플라스미드 YRp7를 일반적으로 사용한다(Stinchcomb 외, 1979; Kingsman 외, 1979; Tschemper 외, 1980). 이러한 플라스미드는 트립토판 존재시 증식능이 결핍되는 효모 변이 균주, 예컨대 ATCC 제 44076호 또는 PEP4-1의 선별 표지를 제공하는 trp1 유전자를 이미 함유한다(Jones, 1977). 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trp1 병소(lesion)의 존재는 트립토판 부재시의 증식에 의하여 형질 전환을 검출하는 데 있어 유효한 환경을 제공한다.
효모 벡터의 적합한 프로모팅 서열은 3-포스포글리세레이트 키나아제 (Hitzman 외, 1980) 또는 기타 해당(glycolytic) 효소, 예컨대 에놀라아제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라아제, 포스포프럭토키나아제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라아제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오스포스테이트 이소머라아제, 포스포글루코스 이소머라아제, 및 글루코키나아제(Hess 외, 1968; Holland 외, 1978)를 위한 프로모터를 포함한다. 적합한 발현 플라스미드를 작제하는 데 있어, 이러한 유전자와 관련된 종결 서열은 mRNA의 폴리아데닐화와 종결화를 제공하는 발현을 목적으로 하는 서열을 가진 발현 벡터의 3'로 연결한다.
증식조건에 의하여 전사를 제어한다는 추가적 잇점이 있는 그 밖의 프로모터는 알코올 디히드로게나아제 2, 이소시트크롬 C, 산 포스파타아제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 그리고 상기 언급한 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제, 그리고 말토스 및 갈락토스 활용에 책임이 있는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모-적합 프로모터, 복제 기점 및 종결 서열을 함유한 임의의 플라스미드 벡터가 적절하다.
미생물 외에, 다세포 생물체로부터 유도된 세포 배양균 또한 숙주로써 사용할 수 있다. 원칙적으로, 그러한 임의 세포 배양균은 척추 동물 배양균으로부터 또는 무척추 동물 배양균으로부터 실행 가능성이 있다. 그러나 척추동물 세포에 대한 관심이 더욱 커지고 있으며, 배양(조직 배양)에서의 척추 동물의 증식 (propagation)은 최근 몇 년 간 극히 당연한 과정이 되어 왔다(Tissue culture, 1973). 그러한 유용한 숙주세포주의 실례로는 VERO 또는 Hela 세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포주, W138, BHK, COS-7 293, 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda, SF) 세포(미국 코네티컷 06450 메리덴 리서치 파크웨이 1000에 위치한 프로테인 사이언스사와 인비트로겐사로부터 완전한 발현 시스템으로서 상업적으로 입수 가능), 그리고 MDCK 세포주를 들 수 있다. 본 발명에 있어, 특히 바람직한 세포주는 네덜란드 9704 CH 그로닌겐 사서함 2312호에 위치한 인비트로겐사로부터 입수 가능한 S2이다.
대개 그러한 세포의 발현 벡터는 임의의 필수 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위와 함께, (만일 필요하다면) 복제 기점, 발현되는 유전자의 앞에 위치한 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다.
포유동물 세포에서의 이용을 위하여는, 종종 바이러스 재료가 발현 벡터 상의 제어 기능을 제공한다. 예를 들어, 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스 2로부터 유래한 프로모터를 통상 이용하며, 시미안 바이러스(Simian Virus 40, SV40)를 가장 빈번하게 이용한다. SV40 바이러스의 초기(early) 및 후기(later) 프로모터가 특히 유용한데, 이는 SV40 복제 기점을 함유하는 단편으로서 바이러스로부터 초기 및 후기 프로모터 모두를 쉽게 얻기 때문이다(Fiers 외, 1978). HindIII 부위에서 바이러스 복제 기점에 위치한 BglI 부위쪽으로 확장시킨 약 250 bp 서열을 포함한다면, 또한 보다 소형 또는 보다 대형 SV40 단편을 사용할 수 있다. 추가로, 제어 서열이 숙주 세포 시스템에 적합하다면, 목적하는 유전자 서열과 정상적으로 결합된 제어 서열이나 프로모터를 활용하는 것 또한 가능하며, 흔히 그러는 것이 바람직하다.
예컨대 SV40 또는 그 밖의 바이러스 복제 기작으로부터 유도될 수 있는, 외인성 기점을 포함하도록 벡터를 작제함으로써 복제 기점을 제공할 수 있으며 또는 숙주 세포 염색체 복제 기작에 의하여 복제 기점을 제공할 수도 있다. 벡터를 숙주 세포 염색체 내로 통합시키는 경우에는, 대개 후자로 충분하다.
유용한 IL5 유사체의 동정
당업자에게는 천연 IL5의 모든 변이체나 변형물이 동물 중 천연 형태와 교차반응하는 항체를 유도할 수 있는 능력을 갖지 않으리라는 것이 자명하다. 그러나, 본 발명에서 논의된 면역학적 반응성에 대한 최소한의 요구사항을 만족하는 변형된 IL5 분자에 대해 효과적인 스크리닝 기준을 마련하는 것은 어렵지 않다. 따라서, 본 발명의 일부는 어떤 동물에서 비변형 IL5에 대해 (여기서 비변형 IL5 폴리펩타이드는 자가-단백질임) 항체를 유도할 수 있는 변형된 IL5 폴리펩타이드의 동정을 위한 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 다음 단계로 포함하여 이루어진다:
- 펩타이드 합성 또는 분자생물학적 수단에 의해, 어떤 동물 종의 IL5 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 부가, 삽입, 결실, 또는 치환시킴으로써 그 동물종에 외래인 T-세포 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 그 세트 내에 유도함으로써 상호 구별되는 일련의 변형된 IL5 폴리펩타이드 세트를 제조 하거나, 또는 상호 현저히 구별되는 변형된 IL5 폴리펩타이드 세트를 코딩하는 핵산 단편 세트를 제조한 다음,
- 상기 세트 멤버들이 그 동물종에 의해 비변형 IL5에 대한 항체 생산을 유도할 수 있는지를 테스트하고,
- 상기 세트 중 그 동물종에서 비변형 IL5에 대한 항체 생산을 현저히 유도하는 멤버들을 동정 및 임의로 분리하거나, 또는 그 동물 종에서 비변형 IL5 폴리펩타이드에 대한 항체 생산을 현저히 유도시키는 핵산 단편 세트의 멤버에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 발현산물을 동정하고 임의로 분리한다.
본 발명에서 "상호 구별되는 변형된 IL5 폴리펩타이드 세트"라 함은 예컨대 상기 기준 (예컨대, 원형 2색성, NMR 스펙트럼 및/또는 X-선 회절 패턴의 복합적 연구결과)에 기초하여 선택된, 동일하지 않은 변형 IL5 폴리펩타이드의 컬렉션이다. 이 세트는 단지 몇개의 멤버로 이루어질수도 있으나, 수백개의 멤버로 이루어질 수도 있다. 마찬가지로, 핵산 단편 세트는 동일 방식으로 선택된, 변형된 IL5 폴리펩타이드를 각각 코딩하는, 비-동일 핵산 단편의 컬렉션이다.
상기 세트의 멤버들에 대한 테스트는 궁극적으로 생체내 수행가능하지만, 생체외 테스트를 적용할 경우 본 발명의 목적을 달성해줄 변형된 분자들의 숫자를 좁혀준다.
외래 T-세포 에피토프의 도입 목적은 T-세포 보조에 의한 B-세포 응답을 도와주는 것으로, 그 선행조건은 T-세포 분화가 변형된 IL5에 의해 유도되어야 한다는 것이다. T-세포 분화는 표준 분화법에 의해 생체외 분석할 수 있다. 요약하면, T-세포가 풍부한 (enriched) 샘플을 대상으로부터 얻은 다음 배양시킨다. 배양된 T-세포를 변형된 분자를 이미 흡수시킨 대상자의 APc와 접촉 및 가공시켜 이를 그의 T-세포 에피토프에 제시한다. T-세포의 증식을 모니터링하고 적절한 대조군 (예컨대 고유의 변하지 않은 IL5 가공된 APCs와 접촉된 배양체 중의 T-세포)과 비교한다. 또는, 외래 T-세포의 인식에 응답하여 T-세포에 의해 방출된 타당한 시토카인의 농도를 측정함으로써 증식을 측정할 수도 있다.
세트 중 적어도 하나의 변형된 IL5를 IL5에 대한 항체 생산을 유도할 수 있도록 만듦으로써, 비변형 IL5 폴리펩타이드가 자가-단백질인, 어떤 동물 중에서 비변형 IL5에 대한 항체를 유도할 수 있는 적어도 하나의 변형된 IL5 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 것이 가능하며, 이 방법은 IL5와 반응성인 동물 종에서 항체 생산을 유의적으로 유도하는 세트 멤버(들)을 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 담체 및/또는 비히클 및/또는 희석제 및/또는 부형제, 임의로 적어도 하나의 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 어쥬번트와 혼합시키는 것을 포함하여 이루어진다.
마찬가지로, 면역원으로서 면역원성 IL5 유사체를 코딩하는 핵산 단편을 함유하는 면역원 조성물을 제조할 수 있으며, 핵산 백신화에 대한 설명은 전기한 바와 같다.
상기한 본 발명의 측면들은 본 발명의 상호 구별되는 핵산 서열 또는 벡터들 몇가지를 먼저 제조하고, 이들을 적절한 발현 벡터에 삽입하여, 이 벡터로 적절한 숙주 세포를 형질전환시킨 다음, 본 발명의 핵산 서열을 발현시킴으로써 통상적으로 수행한다. 이 단계에 이어 발현 산물의 분리를 수행할 수 있다. 핵신 서열 및/또는 벡터들을 PCR과 같은 분자 측폭 기술 또는 핵산 합성을 실시하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
실시예에 앞서
백신 디자인
AutoVacTM개념 (WO 95/05849에 설명됨)에 따라 공지의 난교잡성 T-세포 에피토프들을 인간의 IL5 야생형 단백질 내로 치환시킴으로써 IL5 자가백신의 예시적인 후보들을 제조한다. 이러한 치환은 삽입된 펩타이들은 야생형 서열에서 결실된 펩타이드의 길이와 길이가 같거나 다른, 펩타이드 치환이다.
생체내 테스트 및 스크리닝에 의한 개념의 초기 입증을 위해 쥐의 IL5 서열에서 구조물을 제조하기로 결정하였다. 그 일례로, 파상풍 독소 에피토프 P2 (SEQ ID NO: 23)과 P30 (SEQ ID NO: 24)를 치환 펩타이드로서 이용하였으나, 본 발명에 따른, 난교잡성 TH에피토프를 함유하거나 구성하는, 여하한 다른 적당한 펩타이드도 이용가능하다.
치환체의 크기 (P2 및 P30에 있어 각각 15개 또는 21개 잔기)에 대한 분자의 크기 (115개 잔기)ㅡ가 구조적인 비-파괴성 삽입물의 가능한 부위를 크게 제한함이 강조된다. 디설파이드 다리가 중요하기는 하나, 결정적으로 중요한 것은 아니므로, 다이머화를 위해, 몇몇 변이체들을 쌍으로 -/- 시스테인을 제거하여 만든다.
후보 분자들의 제조시, 2가지 기초적인 변수들이 고려되었다. 먼저, 야생형 hIL5의 3차원 구조를 가능한 최대한도로 보존함으로써, 자연적인 B-세포 에피토프 레퍼토리를 보존하려고 시도하였다. 이것은 무력화되는 것으로 알려진 IL5 B-세포 에피토프가 순응적 (conformational)임을 입증한 Dickason et al., (1994)에 의해 뒷받침된다. 3차원 구조의 보존은 루프 또는 별도의 세그멘트와 같이 구조적으로 "중성" 부위에서 변형을 도입함으로써 달성될 수 있다. N-말단 헬릭스 "A"와 헬릭스 "B" 및 "C"가 제 2의 분자와 함께 4차 구조로 폴딩될 수 있다는 사실은, 이들 3개의 헬릭스 구성성분이 안정한 폴딩-스캐폴드 (folding-scaffold)임을 가리키는 것이다.
둘째로, 백신 개념에 상대적인 생물학적 활성이 고려되었다. 일반적으로, 불활성 구조물은 그 분자의 추정적인 독성 효과를 감소시키고 일반적으로 면역 응답을 평가할 목적에서 바람직하다. 한편, 최적의 무력화 항체는 이론상 IL5R과 상호반응하는 IL5의 일부에 대해 특이성을 나타낸다. 이것은 활성 변이체를 이용하여 면역화시킬 때 달성가능성이 높은 것이다. 마지막으로, 면역계에 미치는 IL5의 생물학적 효과가 면역 응답에 대해 인핸서 역할을 할 수 있음으로 해서, 전체적인 효과를 증강시키는 것이 가능하다. 그러나 다른 분자들을 이용하여 행한 본 출원인의 이전의 실험에 따르면, "이론적으로 가능한 활성적인" 대다수 구조물은 활성이 낮거나 활성이 없는 것으로 예측된다.
따라서, 제안된 모든 변이체들은 잠재적으로 활성적이나, 소망되는 경우, 수용체 결합/활성화에 관여하는 "A" 및 "D"-헬릭스 대역에서의 변경 또는 활성적인 다이머 형성의 방해에 의해 비교적 쉽게 불활성화된다.
요약하면, 상기 구조 보존 및 생물학적 활성의 관점은 표적 대역을 C-말단 유연 대역과 루프 1-3 중 어느 하나로서 정의한다.
루프 3은 추정된 삼중-나선 (tri-helical) 폴딩 스캐폴드로부터 구조적으로 분리된 것이므로 주오 표적 대역으로서 선택된다. 이에 더해 생물학적으로 활성적인 모노머를 생산하는 것도 가능하므로, 루프 3을 연장함으로써 이 대역은 모든 유형의 변이체, 즉, 모노머/다이머 및 활성/불활성적인 변이체를 생산할 수 있는 가능성을 갖는다.
"루프 1"은 치환에 적절한 길이의 비-나선적 스트레치를 함유하는 두번째 대역이다. 이 대역으로부터의 변형은 이론적으로는 다이머화할 수 있는 경우에만 활성적이지만, 야생형 루프의 길이가 다소 유연하므로, 치환 후에 단백질을 정확하게 폴딩할 수 있으리라 기대할만하다.
"루프 2" 대역에서 치환을 포함하는 변이체들 역시 다이머만큼 활성적일 것이다. 치환될 수 있는 대역은 삽입물에 비해 짧으며 추정된 폴딩 스캐폴드에서 중심 위치를 가지며, 이는, 치한 후 단백질의 정확한 폴딩에 방해가 될 수 있는 루프2의 2가지 특징이다. 다른 한편, 루프 2는 IL5R과 상호작용하는 대역의 반대에 위치하여, 변형된 단백질이 정확히 폴딩되는 경우 소망되는 야생형 무력화 에피토프의 최적 프리젠테이션을 결과시킨다.
마지막으로, "헬릭스 D"에 이은 C-말단 유연 대역내의 삽입물이 제안된다. 단백질 구조관점에서 볼때, 이 개념은 매우 안전한 것어럼 보이지만, C-말단은 수용체 결합 및 다이머 계면 모두의 대역에 위치하므로, 이 대역에서의 변형은 다이머화와 생물학적 활성 두가지 모두에 영향을 미칠 것이다 (변형 단백질이 다이머된다면).
먼저 상기 관점을 고려하여 제작된 10가지 변이체의 아미노산 서열을 SEQ ID NOs: 2-11 및 13-22에 제시하였다. 수자의 단계에서 제작된 추가의 변이체들은 SEQ ID NOs 27-59에 제시하였다 (DNA 핵산 서열 및 아미노산 서열 모두 포함).
포지티브 구조물의 마우스로부터 인간에게로의 성공적인 전달 방법을 촉진하기 위해 hIL5로부터 mIL5로 보존된 플랭킹 (flanking) 아미노산 잔기를 포함하도록, 실시예 2에 따른 것을 제외한 모든 삽입물들을 제조하였다.
다음의 실시예에서, 쥐의 아미노산 잔기 서열 번호에 따라 치환 위치를 매겼으며; 대응하는 인간의 위치는 괄호 안에 나타내었다.
실시예 1
Cys84(86)을 보존하면서 루프 3에서 P2 치환 위치를 갖는 변이체
Cys84(86)의 제거를 배제하면서 P2 에피토프(SEQ ID NO:23)가 루프 3으로 치환된다. 이들 변이체(SEQ ID NOs:2와 28(인간), 아미노산 87-90 또는 88-91이 치환됨, 그리고 13과 46(쥐), 아미노산 85-88 또는 86-89가 치환됨)이 모노머(루프 3의 연장 때문에)와 다이머 모두로서 잠재적인 활성이 있다. SEQ ID NOs:28과 46은 또한 hIL5.1과 mIL5.1을 각각 의미한다.
실시예 2
Cys42(44)를 보존하면서 루프 1에서 P2 치환 위치를 갖는 변이체
Cys42(44)의 제거를 배제하면서 P2 에피토프(SEQ ID NO:23)가 루프 1로 치환된다. 이들 변이체(SEQ ID NOs:3과 36(인간), 아미노산 32-43 또는 33-43이 치환됨, 그리고 14과 56(쥐), 아미노산 30-41 또는 31-41이 치환됨)이 단지 다이머로서 잠재적인 활성이 있다. SEQ ID NOs:36과 56은 또한 hIL5.5와 mIL5.5를 각각 의미한다.
실시예 3
루프 2에서 P2 치환 위치를 갖는 변이체
P2 에피토프(SEQ ID NO:23)가 루프 2로 치환된다. 이들 변이체(SEQ ID NOs:4와 34(인간), 아미노산 59-64가 치환됨, 그리고 15와 50(쥐), 아미노산 57-62가 치환됨)이 단지 다이머로서 잠재적인 활성이 있다. SEQ ID NOs:34와 50은 또한 hIL5.4와 mIL5.4를 각각 의미한다.
실시예 4
Cys84(86)을 제거하면서 루프 3에서 P2 치환 위치를 갖는 변이체
Cys84(86)을 제거하면서 P2 에피토프(SEQ ID NO:23)가 루프 3으로 치환된다. 이들 변이체(SEQ ID NOs:5와 38(인간), 아미노산 86-91이 치환됨, 그리고 16과 54(쥐), 아미노산 84-89가 치환됨)은 타입 #1(SEQ ID NOs:2와 28 그리고 13과 46)의 변이체과 대체로 유사하나, 디설파이드 다리의 형성을 억제하고 루프 3의 길이를조절함으로써 모노머 생성물의 생성이 촉진된다. SEQ ID NOs:38과 54는 또한 hIL5.6과 mIL5.6을 각각 의미한다.
실시예 5
C-말단에서 P2 치환 위치 108-111(110-113)를 갖는 변이체
계속되는 헬릭스 D의 C-말단 영역으로 P2 에피토프(SEQ ID NO:23)가 치환된다. 이들 변이체(SEQ ID NOs:6과 17)은 단지 다이머로서 잠재적인 활성이 있다.
실시예 6
Cys84(86)을 보존하면서 루프 3에서 P30 치환 위치를 갖는 변이체
Cys84(86)의 제거를 배제하면서 P30 에피토프(SEQ ID NO:24)가 루프 3으로 치환된다. 이들 변이체(SEQ ID NOs:7과 40(인간), 아미노산 88-91 또는 87-90이 치환됨, 그리고 18과 58(쥐), 아미노산 85-88 또는 86-89가 치환됨)이 모노머(루프 3의 연장 때문에)와 다이머 모두로서 잠재적인 활성이 있다. SEQ ID NOs:40과 58은 또한 hIL5.7과 mIL5.7을 각각 의미한다.
실시예 7
Cys42(44)을 보존하면서 루프 1에서 P30 치환 위치를 갖는 변이체
Cys42(44)의 제거를 배제하면서 P2 에피토프(SEQ ID NO:24)가 루프 1로 치환된다. 이들 변이체(SEQ ID NOs:8과 30(인간), 아미노산 32-43이 치환됨, 그리고 19와 48(쥐), 아미노산 30-41이 치환됨)이 단지 다이머로서 잠재적인 활성이 있다. SEQ ID NOs:30과 48은 또한 hIL5.2과 mIL5.2를 각각 의미한다.
실시예 8
루프 2에서 P30 치환 위치를 갖는 변이체
P30 에피토프(SEQ ID NO:24)가 루프 2로 치환된다. 이들 변이체(SEQ ID NOs:9와 20, 여기서 각각 아미노산 59-64와 57-62가 치환됨)이 단지 다이머로서 잠재적인 활성이 있다.
실시예 9
C-말단에서 P30 치환 위치를 갖는 변이체
계속되는 헬릭스 D의 C-말단 영역으로 P30 에피토프(SEQ ID NO:24)가 치환된다. 이들 변이체(SEQ ID NOs:10과 21, 여기서 각각 아미노산 110-113과 108-111이 치환됨)이 단지 다이머로서 잠재적인 활성이 있다.
실시예 10
P2 치환 위치 84-89(86-91)과 P30 치환 위치 110-113을 갖는 변이체
Cys84(86)을 제거하면서 P2 에피토프(SEQ ID NO:23)가 루프 3으로 치환되고 계속되는 헬릭스 D의 C-말단 영역으로 P30 에피토프(SEQ ID NO:24)가 치환된다. 이들 변이체(SEQ ID NOs:11과 22)은 두가지 모두의 에피토프를 포함하는 단지 타입 #12의 변이체들과 함께 잠재적인 모노머 활성이 있다.
실시예 11
Cys84(86)을 제거하면서 루프 3에서 P30 치환 위치를 갖는 변이체
Cys84(86)을 제거하면서 P2 에피토프(SEQ ID NO:24)가 루프 3으로 치환된다. 이들 변이체(SEQ ID NOs:42(인간), 아미노산 86-91이 치환됨, 그리고 58(쥐), 아미노산 84-89가 치환됨)은 타입 #6의 변이체과 대체로 유사하나, 디설파이드 다리의형성을 억제하고 루프 3의 길이를 조절함으로써 모노머 생성물의 생성이 촉진된다. SEQ ID NOs:42과 58은 또한 hIL5.12와 mIL5.12를 각각 의미한다.
실시예 12
루프 3에서 P2와 P30 치환 위치를 갖는 변이체
Cys84(86)을 보존하면서 P2(SEQ ID NO:23)와 P30(SEQ ID NO:24) 에피토프가 루프 3으로 치환된다. 이들 변이체(SEQ ID NOs:44와 60, 여기서 각각 아미노산 88-91과 86-89가 치환됨)은 두가지 모두의 에피토프를 포함하고 잠재적인 모노머 활성이 있다. SEQ ID NOs:44와 60은 또한 hIL5.13과 mIL5.13을 각각 의미한다.
실시예 13
발현계의 선택
효모, 곤충 세포 및 CHO 세포를 포함하는 수많은 별개의 발현계에서 재조합 IL5를 발현시켰다(Tavernier 등, 1989).
본 발명에서 적절한 하나의 발현계는, hIL5를 생산하기 위해 이 숙주를 이용한 종래의 연구를 기초로 하여, 이.콜라이(E.coli)를 들 수 있다(Proudfoot 등, 1990, Graber 등, 1993). 재조합 단백질은, 정제 및 재-접힘(re-folding)과 동시에 생리적인 활성 다이머로 전환되는 함유체로서 발현된다(예컨대, US 5,739,281호에 기술된 일반적으로 적용되는 재접힘 방법을 이용한다). 이.콜라이(E.coli)의 발현 속도와 그 단순함은, 유전학적인 구성이 준비되었을 때 단백질의 생성을 즉시 개시하고, 따라서 IL5 자가백신 개념을 생체내에서 입증하기 위한 급속한 물질 생성을 촉진시킨다.
어떠한 이유로 그 가능성이 낮추어지는 것이 발견된다면(예컨대, 다음에 계속되는 재-접힘의 수율 저하, 생성물의 불안정성 또는 글리코실화와 관련된 약물동력학적인 변수의 증가 등), 효모내 생성물이 추가로 자가백신의 개발에 고려될 수 있다.
최근에, S2세포(Invitrogen에서 구입)를 이용한 드로소필리아 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 발현계에서 가능성 있는 결과를 얻었고. 현재 이 계는 본 발명의 IL5 동족체를 발현시키는데 바람직한 구체예가 된다.
IL5 구조물을 안정적으로 발현시키는 S2 드로소필리아 세포로부터 IL5 변이체 단백질을 생성하였다. 여러가지 별개의 형질도입(transfection) 방법을 시험하였고, Ca2PO4와 리포펙틴(Lipofectin) 두가지를 선택하였다. S2 세포의 두 별개의 서브클론을 이용하여, 각각 Ca2PO4와 리포펙틴으로 형질도입시켰다. ATCC와 코펜하겐 대학의 Lars Sodergaard로부터 두개의 클론을 각각 얻었다. 적절한 두 방법을 이용하여 2-10mg/L 범위로 mIL5와 mIL5.1 단백질을 발현시키는 안정한 라인을 선택하였다.
물질 ; 방법:
5-10% 우태아 혈청(FCS), 0.1% 플루론산 F68(Sigma), 페니실린/스트렙토마이신(Life Technlogies)을 포함하는 슈나이더 배지에서 S2 세포를 성장시키고 유지하며, 25℃에서 120rpm의 교반 플라스크를 이용하였다.
250ml 또는 1 1 교반 플라스크에서 리포펙틴의 형질 도입을 수행하였다. S2세포를 항생물질 없는 50ml Ex-cell 420(JRH Biosciences)로 2.5-3 x 106/ml씩 나누고, 250ml의 교반 플라스크에서 하룻밤동안 성장시켰다. 다음날 아침 리포펙틴 시약을 제조하였다: 튜브 1)대상이 되는 유전자를 포함하는 300-1200㎍ 플라스미드 DNA, 더하여 15-45ml 혈청 중 15-60㎍ pCoHYGRO 하이그로마이신 선별 플라스미드(플라스미드의 비율 20:1) 그리고 무-보충 배지; 튜브 2)5ml 혈청 중 1ml 리포펙틴과 무-보충 배지. 실온에서 1시간 후, 튜브 1과 2를 혼합하고 S2 세포를 서서히 첨가하기에 앞서 실온에서 15분간 그대로 두었다. 하룻밤동안 세포를 성장시킨 후 풍부한 보충물과 그에 더해 150-300㎍/ml 하이그로마이신을 포함하는 새로운 배지를 첨가시켰다.
무-혈청 Ex-cell 420 배지(JRH Biosciences)에서 48-72시간 동안 500μM 구리 술페이트 또는 10μM 카드뮴 클로라이드와 함께 일과성(transient)의 안정한 라인을 유발시켰다.
결과:
Ca2PO4에 의해 33의 안정한 라인과 리포펙틴에 의해 23의 안정한 라인을 생성하였다. 검출할 수 없음부터 11mg/L까지 다양한 발현을 산출한다. 다음 표는 단백질 생산에 이용된 몇몇 라인을 요약한 것이다.
최상의 mIL5 S2 세포의 형질도입으로 얻은 발현 결과 요약
플라스미드 구조물 S2 세포 형질도입 방법 산출량
p612IL5/His15/mIL5wt ATCC Ca2PO43.5mg/L
p767Bip/His15/mIL5wt LS 리포펙틴11mg/L
p613IL5/His15/mIL5.1 ATCC Ca2PO42.6mg/L
p768Bip/His15/mIL5.1 ATCC Ca2PO40*
p614IL5/His15/mIL5.5 LS 리포펙틴0*
*서열 변이가 포함된 발현 플라스미드
따라서, S2 세포는 칼슘 포스페이트 침전물 또는 리포펙틴에 의해 형질도입될 수 있다. 플라스미드 p612와 p767간 발현 수준이 다르기 때문에 Bip 시그날 펩타이드가 S2 세포 중 내인성 mIL5 리더보다 유효한 리더 서열처럼 보인다.
실시예 14
변형된 분자의 심사와 선택
발현에 이어서, 재조합 단백질을 정제하고 특성을 부여한다. 자가백신 후보의 특성화는 분석적인 크로마토그래피, 등전압 초점 맞추기(IEF), SDS-PAGE, 아미노산 조성 분석, N-말단의 서열 분석, 질량 스펙트로메트리, 저각 레이져 광분산, 표준 스펙트로스코피 및, 의도한 단백질 생성물을 정의하는 적절한 매개변수를 정밀하게 증명하는 한도까지 원편광 이색성 분광 분석을 포함한다.
His 표지 단백질은 최근까지 이-단계 방법으로 정제하였다. 그러나, 최종 킬레이트-단계 후 예상만큼의 높은 수율과 순도를 얻을 수 없었다. 신규한 한-단계 정제 방법으로 3가지의 주요한 이익을 달성할 수 있었다: 보다 높은 수율, 보다 높은 처리량 및 최종 생성물의 높은 순도. His 표지의 제거를 위한 절단 조건을 또한 수립하였다.
이-단계 IL5 정제 방법:
배지에 금속 이온을 첨가시켜 단백질 발현을 유발한다. 이들 금속 이온은 단백질을 킬레이트 칼럼에 적용시키기 전에 제거되어야 한다. 따라서, 총 20mM의 EDTA를 복합의 금속-이온에 첨가시키고 상등액을 SP-세파로스 칼럼위로 통과시켜 단백질을 포획한다. 결합되지 않은 단백질을 세척하여 제거시키고, NaCl의 단계-구배에 의해 결합 단백질을 용출시킨다. 이 단계는 두가지 목적을 만족시킨다: 30의 요소에 의해 부피를 감소시키는 농축 단계, 그리고 완충액-교환.
적절한 분획(SDS-PAGE에 의해 결정된대로)을 혼주(pooled)시키고 추가로 금속 킬레이트 칼럼상에서 정제시켰다.
단백질을 Ni2+-전하된 킬레이트 칼럼에 적용시키고 결합되지 않은 단백질을 세척하여 제거시켰다. 그리고 나서 이미다졸 구배를 이용하여 결합 단백질을 용출시켰다. SDS-PAGE와 점적법(dot-blot) 두가지 모두에 의해 모든 분획, 유량-통과 및 칼럼의 EDTA-세척을 관찰하였다.
적절한 분획(SDS-PAGE와 점적법에 의해 결정된대로)을 혼주시키고, pH가 6.9로 조절된 10 X 부피의 PBS에 대해 2회 투석시켰다.
여과 후, 적절한 농도를 얻을 때까지(바람직하게는 1mg/ml) 투석된 물질을 농축시켰다. 마지막으로, 단백질을 분별하고(aliqouted) -20℃에서 저장하였다.
다음의 구체적인 프로토콜을 이용하였다:
1)용인된 상등액을 2500 x g에서 15분간 원심분리시켰다(감염이 발생한다면, 22000 x g에서 30분간 원심분리시키는 것이 요구된다). 그리고 나서 상등액을 0.45㎛ 여과기에 이어서 0.22㎛ 여과기로 여과시켰다(때때로 먼저 5㎛ 여과기를 통해 여과시키는 것이 필요하다).
이 상등액을 40mM EDTA를 포함하는 완충액 A(단계 2 참고)와 1:1로 혼합시켜 0.2M NaH2PO4, 10% 글리세롤, 20mM EDTA, pH 6.0의 최종 완충 조성물을 생성하였다.
2)이어서 여과된 상등액을, 완충액 A와 평형화된 SP-세팔로스 칼럼에 적용시켰다. 총 1-2L(단백질 농도에 따라, 상기는 1-10mg IL5/L에 마련된 것이다)를 80ml 칼럼에 적용시킬 수 있다. 적용상 유량: 1-2ml/분(일반적으로 하룻밤동안), 통과-유량을 수집하고 이후의 분석을 위해 남겨두었다. 적용에 이어서, 안정한 기준선에 도달할 때까지 2-3 칼럼 부피(CV)의 A-완충액으로 칼럼을 세척하였다. 단계-구배를 이용하여 결합 단백질을 용출시켰다: 0-100-500-1000mM NaCl, 10ml의 분획을 수집하였고, 유량은 10ml/분이었다. 5℃에서 정제를 수행하였다.
각 경주 후, 유량 5ml/분의 2CV 1M NaCl을 이용하여 칼럼을 세척하고, 완충액 A로 재-평형화하였다.
완충액 A: 0.2M NaH2PO4, 10% 글리세롤, pH 6.0
완충액 B: 0.2M NaH2PO4, 1M NaCl, 40mM 이미다졸, 10% 글리세롤, pH 6.0
wt와 변이체에 대해 동일한 방법을 이용한다.
점적법과 SDS-PAGE로 모든 분획, 출발 물질과 통과-유량을 분석한다. IL5를 포함하는 분획을 혼주시키고 추가로 킬레이트-칼럼을 이용하여 정제시킨다.
한-단계 IL5 정제 방법:
ZnCl2로 전하된 70-ml 킬레이트-칼럼에 직접 상등액을 적용시킨다. 세척에 의해 결합되지 않은 물질을 제거한 후, 결합 단백질(IL5와 오염물)을 이미다졸의 구배를 적용시켜 용출시킨다. 이 방법은 최종 생성물의 높은 순도(>95%) 함께 한-단계 정제 방법으로 His 표지의 완전한 이점을 얻는다. 적절한 분획(SDS-PAGE와 점적법에 의해 결정된대로)을 혼주시키고, pH가 6.9로 조절되고 NaCl의 농도가 400mM로 조절된 10 X 부피의 PBS에 대해 2회 투석시켰다.
여과 후, 적절한 농도를 얻을 때까지(바람직하게는 1mg/ml) 투석된 물질을 농축시켰다. 마지막으로, 단백질을 분별하고 -20℃에서 저장하였다.
구체적인 프로토콜의 단계는 다음과 같다:
1)상등액을 0.45㎛ 여과기를 통해 여과시켜 불순물을 제거하고 완충액 A를 이용하여 1:1 희석시켰다.
5CV 물을 이용하여 70-ml 급속 흐름 킬레이트 칼럼을 씻어내고 pH 7의 10CV 10mM ZnCl2를 이용하여 전하를 띠게 하였다. 5CV A-완충액을 이용하여 평형화시킨 후, 펌프를 이용하여 샘플을 적용시켰다(유량 10ml/분). 통과-유량을 수집하고 이후의 분석을 위해 남겨 두었다. 30 CV 이상의 이미다졸을 0 내지 250mM으로 하며 이미다졸-구배를 이용하여 결합 단백질을 용출시켰다. 마지막으로, 5 CV의 완충액C에 의해 칼럼을 벗겨낸다.
10ml의 분획을 수집하였다.
완충액 A: 20mM NaH2PO4, 0.5M NaCl, 10% 글리세롤, pH 7
완충액 B: 2mM NaH2PO4, 0.5M NaCl, 10% 글리세롤, pH 7, 0.25M 이미다졸
완충액 C: 20mM NaH2PO4, 0.5M NaCl, 0.1M EDTA, pH 7.0.
SDS-PAGE로 모든 분획, 통과-유량과 출발 물질을 분석한다.
2)IL5를 포함하는 가장 순수한 분획(SDS-PAGE에 의해 결정된대로)을 혼주(이후의 분석을 위해 50㎕ 남겨둠)시키고, pH가 6.9로 조절된 10 X 부피의 PBS에 대해 6℃, MWCO 12-14kDa에서 2회 투석시켰다. 투석물을 0.22㎛ 여과기를 통해 여과시키고(이후의 분석을 위해 50㎕ 남겨둠) 대조군으로서 투석-완충액(0.45㎛를 통해 여과됨)을 이용하여 A280을 측정하였다. 투석 전과 후의 부피를 측정하고 투석/농축 단계를 표시하는 샘플은 이후 SDS-PAGE(단계 3 후)에 의한 분석을 위해 남겨두었다.
3)총 농도가 400mM이 될 때까지 NaCl을 투석된 단백질에 첨가하고, 아미콘(Amicon) 장치(부피가 50ml보다 큰 경우) 또는 비바스핀(Vivaspin) 농축기(10-50ml)를 이용하여 농축시켰다. 두 경우 모두, 샘플을 적용시키기 전에 막을 10ml PBS-완충액으로 흠뻑 적신다. 이 샘플은, 농도가 바람직하게 1mg/ml에 도달할 때까지(A280에 의해 측정) 농축시켜야 한다. 투석되고, 농축된 샘플을 0.22㎛ 여과기를 통해 여과시키고 E-nr로 기록하였다. 참조로서 통과-유량을 이용하여 A280을 측정하였다.
투석 및 농축 단계에서 얻은 모든 샘플을 SDS-PAGE로 분석하고 코마시-염색하였다. 정제된 단백질을 나누어서 냉동 저장하고 샘플을 설명하는 종이에 "IL5-단백질"-접힘재라고 기입하였다.
상기 기술한 방법으로, 여전히 His 표지를 포함하는, 약 90-95% 순도의 단백질을 얻는다. 서열화시, IL5wt와 변이체 IL5.1 모두 His 표지를 포함하는 예상된 N-말단 서열을 제공한다.
상기 언급한 정제 방법은 다음의 구체적인 구성에 따라 수행되었다:
1)혼주된 분획을 0.45㎛ 여과기를 통해 SP-세팔로스 칼럼으로부터 여과시키고 불순물을 제거하였다.
15ml 물을 이용하여 5-ml HiTrap 킬레이트 칼럼(단지 제공된 칼럼만을 이용)을 씻어내고 15ml 0.1M NiSO4를 이용하여 전하를 띠게 한 후, 15ml 물로 세척하였다. 이 칼럼을 아크타(Akta)-계에 연결시키고 2-3CV A-완충액을 이용하여 평형화시켰다. 부피에 따라(유량 4ml/분) 루프 또는 펌프를 이용하여 샘플을 적용시키고 통과-유량을 수집하였으며 이후의 분석을 위해 남겨 두었다. 20 CV 이상의 이미다졸을 0 내지 500mM로 하며 이미다졸-구배를 이용하여 결합 단백질을 용출시켰다. 5ml의 분획을 수집하였다. 마지막으로, 5 CV의 완충액 B2에 의해 칼럼을 벗겨낸다.
완충액 A: 0.2M NaH2PO4, 0.5M NaCl, 10% 글리세롤, pH 5.0
완충액 B1: 0.2M NaH2PO4, 0.5M NaCl, 0.5M 이미다졸, 10% 글리세롤, pH5.0
완충액 B2: 20mM Na-아세테이트, 0.5M NaCl, 0.1M EDTA, 10% 글리세롤, pH 4.5.
점적법으로 모든 분획, 통과-유량과 출발 물질을 분석하고, 모든 적절한 분획을 SDS-PAGE로 시험하였다.
2)IL5를 포함하는 가장 순수한 분획(SDS-PAGE에 의해 결정된대로)을 혼주(이후의 분석을 위해 50㎕ 남겨둠)시키고, pH가 6.9로 조절된 10 X 부피의 PBS에 대해 6℃, MWCO 12-14kDa에서 2회 투석시켰다. 투석물을 0.22㎛ 여과기를 통해 여과시키고(이후의 분석을 위해 50㎕ 남겨둠) 대조군으로서 여과된 투석-완충액을 이용하여 A280을 측정하였다. 투석 전과 후의 부피를 측정하고 투석/농축 단계를 표시하는 샘플은 이후 SDS-PAGE(단계 3 후)에 의한 분석을 위해 남겨두었다.
3)최종 농도가 400mM이 될 때까지 NaCl을 추가로 첨가한 후, 아미콘(Amicon) 장치(부피가 50ml보다 큰 경우) 또는 비바스핀(Vivaspin) 농축기(10-50ml)를 이용하여 투석된 단백질을 농축시켰다. 두 경우 모두, 샘플을 적용시키기 전에 막을 10ml PBS 완충액으로 흠뻑 적신다. 이 샘플은, 농도가 바람직하게 1mg/ml에 도달할 때까지(A280에 의해 측정) 농축시켜야 한다. 참조로서 통과-유량을 이용하여 A280을 측정하였다. 투석되고, 농축된 샘플을 0.22㎛ 여과기를 통해 여과시키고 E-nr로 기록하였다.
투석 및 농축 단계에서 얻은 모든 샘플을 SDS-PAGE로 분석하고 코마시-염색하였다. 정제된 단백질을 나누어서 냉동 저장하였다.
평가된 그밖의 정제 방법은 다음과 같다:
Zn 2+ -킬레이트 정제: 증가시킨 이미다졸 구배를 이용하여 단백질을 용출시킴으로써 wt-단백질이 칼럼에 강력하게 결합하기 때문에 매우 효과가 있다는 것을 입증하였다. 드로소필리아(Drosophila) 상등액을 직접 이용할 수 있고, 세척 후 IL5wt이 이미다졸에 의해 용출될 수 있다. 이 칼럼을 10 CV 10mM ZnCl2로 하전시키고 물로 세척한다. 결합 및 용출 완충액의 pH는, 그렇지 않으면 ZnCl2가 침전되므로 6.5 이상이어야 한다.
Con A 친화 크로마토그래피가 연구 중에 있다. 글리코실화의 이용 가능성이 친화성-표지로서 IL5상에 존재하고, 이것이 또한 비-His 표지된 구조물에 적용될 수 있기 때문에 모노사카라이드-동족체의 적용에 의한 용출이 관심사가 될 것이다.
His 표지의 제거:
공급자(Unizyme)의 지시에 따라 15 aa His 표지(SEQ ID NO:25)의 제거를 수행하였다.
정제 및 투석/농축된 His 표지 IL5는 두개의 효소, DAP1과 글루타민 시클로트랜스퍼라제의 연속적인 첨가에 의해 탈-His 표지된다. DAP1은 QCT 동안 자유 N-말단으로부터 두개의 아미노산을 제거한다.
효소는 우선 활성화되어야 한다:
9㎕ HT-DAP1(10U/ml)을 9㎕ 20mM 시스티아민-HCl과 혼합하였다. 실온에서 5분간 배양 후, 총 108㎕ HP-GCT(100U/ml)와 54㎕ 태그자임(TAGZyme) 완충액을 첨가하였다. 이것을 15분 이내에 이용해야 한다.
이 단백질은 1mg의 His 표지된 단백질을 분해할 것이다.
His 표지된 단백질을 150㎕의 활성화 효소와 혼합하고 37℃에서 120분간 배양하였다. 0, 10, 30, 60 및 120분 후 SDS-PAGE 분석(10㎕)을 위해 샘플을 회수하였다. 분해의 중단을 위해 이 샘플을 얼음 위에 두었다.
완충액:
1.태그자임 완충액 : 20mM NaPO4완충액, pH 7.5; 150mM NaCl
2.20mM 시스티아민-HCl
분해된 단백질(SDS-PAGE 분석 또는 N-터미날의 서열화에서 결정된대로)을 PBS에서 평형화된 1-ml Ni-킬레이트에 적용시켰다. 모든 것을 수집하였다.
적용물로부터 얻은 통과-유량은 이후의 분석을 위해 남겨 두었다. 3 CV PBS를 첨가시킴으로써 칼럼이 용출되고 0.5ml의 분획을 수집하였다. 이 칼럼을 2 CV 0.5M 이미다졸로 세척하여 깨끗하게 하고 분석을 위해 분획을 남겨 두었다.
모든 분획을 SDS-PAGE에서 분석하고, IL5를 포함하는 분획을 혼주시켰으며 참조로서 PBS를 이용하여 A280을 측정하였다. 마지막으로, 1mg/ml의 온도를 얻을 때까지 비바스핀 농축기를 이용하여 단백질을 농축시켰다.
His 표지의 제거는 소규모 실험(0.1-1mg)으로 수행되었고 그 규모를 확장시키지 않았다. 표지의 제거는, 블록되지 않고 비-변형된 N-말단을 필요로 한다는 것을 유념해야 한다.
His 표지된 단백질을 두가지 효소, 즉 동시에 두개의 아미노산을 제거하는 디펩티딜 아미노 펩티다제 및 피로-글루타민산으로 글루타민산의 전환을 촉매화하는 글루타민산 시클로트랜스퍼라제와 함께 배양하였다. 이러한 전환은 디펩티딜 아미노 펩티다제에 의한 추가 분해를 방해한다. 그리고 나서 효소(His 표지된), 칼럼에 결합한 오염 단백질 및 비-분해되거나 부분적으로 분해된 단백질을 소유할 수 있는 킬레이트 칼럼을 통해 분해된 단백질을 통과시켰다. 탈-표지된 단백질은 칼럼을 통과하고 통과-유량으로 수집된다. 피로-글루타민산을 제거하는 효소로 이차 분해 후, 이차 효소를 제거하기 위해 다시 킬레이트-칼럼위로 단백질을 통과시켰다. 이 최종 단계에서 단백질은 다시 농축될 필요가 있을 것으로 예상된다.
일반적인 관찰:
UniHis-IL5wt의 pI는 9.5이고, 단백질의 최적 pH-수치는 6.5-7.0인 것으로 보인다(완전하게 연구되지 않음). NaCl-농도 400mM는 농축 중 단백질을 안정화시키는 것으로 보인다.
실시예 15
시험관내 심사
주된 시험관내 심사는 효소-면역 측정법(ELISA)의 형태로 이루어진다: 야생-타입 IL5에 대한 경쟁적인 ELISA는 이것을 동물에 도입하기에 앞서 변형된 IL5 구조물 중 적절한 B-세포 에피토프의 존재를 평가할 수 있게 한다.
통상적인 ELISA 분석은 백신화 동물의 혈청 중 자가-항체의 역가를 측정하는데 이용될 수 있다. 쥐의 IL5 뿐 아니라 인간에 대한 항체(단일-특이적이고 모노클로날의)는 R ;D Symtems, 614 Mckinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA에서 시판된다.
생성물의 생리적 활성 및/또는 유발된 자가-항체의 중화 역량은 IL5 바이오분석으로 검사할 수 있다. 이전에 보고된 이러한 바이오분석의 구체예는 다음과 같다: TF1 세포(인간의 IL5에 대한)의 IL5 유발된 증식의 측정 및 BCL1 세포 또는 B13 B 세포(쥐의 IL5에 대한)의 IL5 유발된 증식의 측정(Callard ; Gearing 1994, Dickason 등, 1994).
자가백신의 기도 반응성에 대한 효과를 또한 시험관내 분석으로 조사할 수 있고, 이 때 백신화 마우스에서 얻은 기관을 제거하고 장기액 중 후크(hook)상에 위치시킨다. 히스타민 투여 검사 후 기관의 장력을 측정하였다(van Oosterhout 등, 1995).
결과적으로, 재조합 mIL5(및 mIL5 자가백신) 단백질 샘플의 생리적 활성을 측정하려면, 쥐의 IL5에 대한 세포의 바이오활성 분석이 수행되어야 한다. 이 분석은 배양 배지에 첨가된 mIL5에 반응하여 증식하는 B 세포 림프종 라인 BCL1의 능력을 기초로 한다. 별개의 두 BCL1 클론, BCL1 클론 5B1b(ATCC CRL-1669)와 BCL1 클론 CW13.20.3B3(ATCC TIB-197)을 ATCC로부터 얻었다.
통상적인 BCL1 증식 실험에서, 극소역가 플레이트 중 우태아 혈청(FCS)이 보충된 완전한 RPMI 배지에 세포를 평판하고 쥐 IL5의 희석 시리즈와 함께 배양하였다. 삼중수소의 티미딘을 병합시켜 BCL1 세포의 증식을 측정하였다. 구입한 촉진용재조합 mIL5(R ;D Systems)의 희석 시리즈를 이용하여 여러가지 최적화 실험을 수행하였다. 가변적인 매개변수는 다음을 포함한다: 배양 간격,3H-티미딘 진동 간격, 웰(well) 당 평판된 세포의 수, 우태아 혈청(FCS)의 농도 및 첨가된 mIL5의 농도. 약 3회의 배경(mIL5를 첨가하지 않은 BCL1 세포) 중 최대한의 증식을 갖는 BCL1 세포의 복용량-의존성 증식을 얻었다.
드로소필리아(Drsophila) S2 세포에서 발현되고 상기 기술에 따라 정제된 다음 샘플의 생리적 활성을 측정하기 위해 BCL1 분석을 이용하였다: HIS-mIL5wt 물질(E1320), HIS-mIL5wt 물질(EI422), HIS-mIL5.1 물질(EI1396) 및 "S2-배경-제제"(E0016). 하나의 HIS-mIL5wt(E1320) 제제에 대한 반응 증식은 "S2-배경-제제"에 반응하는 것보다 현저하게 높게 증식하며, 한편 mIL5.1 변이체과 하나의 야생 타입 제제(E1422)는 생리적으로 불활성이다.
진행중인 연구로는 항-mIL5를 이용한 BCL1 증식의 저해를 들 수 있고, 최적화 연구를 위해 항-mIL5 모노클로날 항체 TRFK5를 이용한다. 이는, mIL5의 생리적 활성을 저해하는, 면역된 마우스로부터 얻은 항-mIL5 면역 혈청의 능력을 측정하는데 이 분석을 이용하기 위해 수행된 것이다.
실시예 16
생체내 모델
자가백신의 생체내 효과를 측정하기 위해, 잘-알려진 천식용 동물 모델을 이용하였다. 일반적으로 이 동물은 화합물(알레르겐/항원)에 감응성이고 에어로졸화화합물을 이용한 시험감염 후 체적 변동 기록기를 이용하여 기관지-수축(기도 전도성)을 측정하였다. BAL 유체 중 호산구 세포를 또한 계수하였다.
마우스에서 항-IL5 mAb의 영향을 조사하는 여러가지 연구를 성공적으로 수행하였다. 쥐 모델의 이용을 배경으로, IL5가 쥐의 항체 반응을 간섭하면서 B-세포의 성장 인자로서 작용한다는 사실이 보고되었다. 그러나, IL5-녹아웃 마우스를 이용한 연구에서 보여진대로, 세포독성 T-세포의 성장이 정상으로 나타났을 뿐 아니라 T-세포 의존성 항체가 오브알부민에 반하여 반응한다(Kopf 등, 1996). 또한 마우스는 기니 돼지 또는 원숭이와 비교할 때 가장 실용적이고 경제적인 모델이기 때문에, Hamelman 등(1997)이 이용한대로 천식/기도 과민성인 오브알부민 감응성 Bal/c 마우스 모델을 이용한다.
그러나, 마우스 모델에서 B-세포에 대한 IL5의 효과가 문제시된다면, 당해 분야에 알려진 그밖의 적절한 동물 모델이 이용될 것이다.
실시예 17
마우스의 IL5(murine IL5) 및 이들의 변이체를 인코딩하는 DNA 구조의 제조
pcDNA3.1+ 내 변이체 제조
에피토프 서열을 포함하는 중복(overlapping) 프라이머로 SOE-PCR 시킴으로써 야생형 mIL5 내로 P2 및 P30 에피토프를 삽입하였다. 리더 서열 (SEQ ID NO: 63)을 포함하고, 코작(Kozak) 공통 서열(플라스미드 p815 포함)을 갖는 pcDNA3.1+ 내로 클로닝시킨 야생형 mIL5 유전자를 PCR-반응의 주형으로 사용하였다. 얻어진 단편을NheI 및NotI으로 절단시키고, 정제시킨 후, PCR의 주형으로 사용된 p815내로 클로닝시켰다.
BiP 리더 및 UNI-His 태그(tag)을 갖는 pMT 초파리 벡터 내로 변이체 클로닝:
적적한 제한 부위를 포함하고, 또한 초파리 코작 유사 서열을 인코딩하는 서열 다음에 초파리 BiP 리더 서열을, 그 다음에 성숙한 mIL5를 인코딩하는 서열의 5' 말단과 결합된 UNI-HIS 태그(SEQ ID NO: 25)을 인코딩하는 서열을 포함하는 mIL5 특이적 프라이머로 PCR 단편을 생성함으로써 야생형 mIL5을 pMT 초파리 발현 벡터열(pMTDrosophilaexpression vector series, Invitrogen) 내로 클로닝시켰다. 야생형 mIL5 cDNA 서열을 주형으로 사용하였다. 얻어진 단편을EcoRI 및NotI 으로 절단시킨 후 pMT/V5-HisA 벡터(Invitrogen) 내로 클로닝시켰다. 얻어진 프라스미드(p818)를 변이체를 포함하는 에피토프를 pMT 내로 클로닝시키는데 사용하였다. pcDNA3.1+에 만들어진 변이체를SacI 및NotI으로 절단시키고 얻어진 단편들을 p818 내로 클로닝시킴으로써 이들을 클로닝하였다.
pAC5 내로의 변이체이 클로닝
pMT 내의 변이체를EcoRI 및NotI 으로 절단시키고 얻어진 단편을 pAC5.1/V5-HisA 벡터(Invitrogen) 내로 클로닝시킴으로써 야생형 mIL5 및 이의 변이체를 pAC5 구성 초파리 발현 벡터(pAC5 constitutive Drosophila expression vector) 내로 클로닝하였다.
실시예 18
인간 IL5 및 이들의 변이체를 인코딩하는 DNA 구조의 제조
다섯 라인의 플라스미드가 변형되지 않은 IL5 및 9 개의 IL5 변이체 모두 또는 일부를 포함하고 있다고 예측된다. 상기 라인은 다음을 포함한다: 1) 인간 세포에서의 발현에 적합한 pCI 벡터내의 DNA 백신화를 위한 인간 IL5, 2) 초파리에서의 유도 발현을 위한 pMT/V5/HIS 벡터 내 BiP 리더 서열 및 15 aa His 태그(SEQ ID NO: 25, Denmark, Hoersholm의 UNIZYME에서 입수. 여기에서는 상기 태그를 "UNI" 또는 "UNI-His"로 칭한다.)를 포함하는 인간 IL5, 3) 상기 2)와 같지만 His 태그를 포함하지 않는 인간 IL5, 4) 상기 3)과 같은 마우스 IL5 및 5) 바큘로-바이러스 계에서의 발현을 위한 벡터 pVL1393 내 DAPI 리더 서열 및 15 aa HIS 태그를 포함하는 인간 IL5.
pCI 벡터 내 DNA-백신화를 위한 플라스미드:
pMT/V5/HIS 내 UNI-HIS 태그 및 BiP 리더 서열을 포함하는 인간 IL5의 초파리에서의 발현을 위한 플라스미드:
pMT/V5/HIS 내 BiP 리더 서열을 포함하고, UNI-HIS 태그는 포함하지 않는 인간 IL5의 초파리에서의 발현을 위한 플라스미드:
pMT/V5/HIS 내 BiP 리더 서열을 포함하고, 15 aa His 태그는 포함하지 않는 마우스 IL5의 초파리에서의 발현을 위한 플라스미드:
벡터 pVL1393 내 DAPI 리더 서열 pVL1393 및 UNI-HIS 태그를 포함하는 인간 IL5의 바큘로-바이러스 계에서의 발현을 위한 플라스미드:
실시예 19
DNA 면역화 조사
DNA 백신화를 위한 코작 서열을 포함하는 mIL5, mIL5.1 및 mIL5.5를 인코딩하는 벡터의 생성
자연 리더 서열(SEQ ID NO: 63)을 포함하는 mIL5, mIL5.1 및 mIL5.5를 인코딩하는 DNA 단편을 pcDNA3.1에 삽입하여 플라스미드 p521, p522 및 p523을 제조하였다. 포유류 세포 내 cDNA의 발현을 증진시키기 위하여, PCR 기술을 사용하여 코작 공통 서열을 코딩 서열의 상류(upstream)에 삽입하였다. p521, p522 및 p523을 주형으로 사용하고, mIL5 리더 서열 개시 코돈의 인접 상류 코작 서열을 인코딩하는 정 프라이머(forward primer)로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 제한 엔도뉴클레아제BamHI 및NotI를 사용하여 정제한 PCR 산물을 pcDNA3.1+로 클로닝하였다. 각각 얻어진 플라스미드 p815, p816 및 p817을 DNA 서열결정(DNA sequencing)함으로써 확인하였다. DNA 백신화를 위하여 사용된 다른 모든 플라스미드는 p521 플라스미드를 출발 물질로 사용하여 제조하였다.
프로메가 키트(Promega Kit)를 사용한 DNA 백신화 플라스미드의 생체외(in vitro) 번역:
생체 외 번역 단백질 산물 플라스미드 DNA를 생성하기 위하여 토끼 망상적혈구(reticulocyte) 추출물을 사용하는 시판되는 키트는 예컨대 오브알부민(ovalbumin) cDNA를 인코딩하는 pcDNA로부터의 단백질 발현을 모니터하는데 성공적으로 사용한 바 있다. 마우스 IL5 DNA 백신화 플라스미드를 일반적인 방법에 따라서 키트 시약에 첨가하였다. 그러나, 양성제어(positive controls)를 수행하였으나 발현된 mIL5 물질을 자동방사선사진(autoradiogram) 상에서 탐지하려는 몇몇 시도는 실패하였다. COS 세포 트랜스펙션 및 DNA 백신화의 결과는 유전자 산물이 발현되었다는 것을 보여주며, 더 이상의 이러한 기술적 문제점을 발견할 수 없었다.
발현 정도를 측정하기 위한 DNA 백신화 플라스미드를 사용한 COS 세포의 일시적 트랜스펙션:
DNA 백신화 실험에 사용되는 플라스미드의 트랜스펙션/발현 효율을 모니터하기 위하여, COS 세포를 사용하는 일시적 트랜스펙션을 수행하였다. COS 세포를 트립신처리하고 T25 배양 프라스크 내 10 % FCS를 충진한 DMEM 배지에 도말하였다. 제 2 일 째에 도탭 키트(Dotap Kit, Roche Diagnostics))를 사용하여 세포를 트랜스펙션 시켰고, 제 5 일 째에 회수하였다. 항 mIL5 반응성 발현 산물을 측정하기 위하여 배양 상청액, 전 세포 용해물 및 막 농축 표본을 웨스턴 블러팅으로 검사하였다. 표준(바큘로바이러스에서 발현, R ;D 시스템)으로 사용된 mIL5 모노머의 분자량은 15 - 18 kD 인 것에 반하여, 세포 표본 내 항-mIL5 반응성 산물은 SDS-PAGE에서 21 - 28 kD의 분리된 2 - 3 개의 밴드만큼 일관되게 이동하였다. 비-변성 환경을 사용시, 21 - 28 kD 물질이 다이머를 형성하므로, 상기 물질이 mIL5이고, 아마도 몇 몇 상이하게 글리코시리화된 형태일 것이라고 생각한다. DNA 백신화 결과(아래 참조)가 이러한 결론을 명백하게 뒷받침해준다.
마우스 IL5 오토백(AutoVac) 구조를 사용한 마우스의 DNA 백신화:
마우스 IL5에 특이적인 항체 반응이 8 개의 상이한 마우스 IL5 돌연변이체를 인코딩하는 나출 플라스미드 DNA(naked plasmid DNA)로 면역화된 마우스에 의하여 유도될 수 있는지 여부를 알아보기 위하여 DNA 백신화 조사를 수행하였다. IL5가 B 세포 분화에 작용한다는 것이 이미 보고되어 있기 때문에, 항-mIL5 자기항체가 마우스 내에서 생성될 수 있고 mIL5 에 대한 B 세포 관용(tolerance)이 파괴될 수 있다는 것을 밝혀내는 것이 필요하다.
DNA 백신화 실험의 일반적 설계는 6 - 8 주된 C3H/Hen 마우스 (H-2k) 또는 Balb/cA 마우스 (H-2d) 를 사용하며, 각각 5 마리의 마우스 군으로 나눈다. 0, 14, 28, 42, 62 및 76 일 째에 hypnorm/dormicum s.c.를 사용하여 마우스를 마취시키고 시험할 mIL5 변이체, mIL5wt(야생형) 또는 오브알부민(컨트롤)을 인코딩하는 발현 플라스미드를 마우스에 주입하였다. 엔도프리(endofree) GigaPrep 키트(Qiagen)를 사용하여 DNA 물질을 제조하고 0.15 M NaCl 또는 0.1 % 부피바케인(bupivacaine)을 함유하는 0.15 M NaCl에 상기 DNA 물질 1 ㎍/ml을 용해시킨다. 물질 100 ㎕ 를 각 마우스의 등쪽 하부의 2 주입 부위에 주입하였다. 2 일 이전에 예비출혈(prebleed)을 얻었고, 3, 5, 8 및 11 주 째에 시험출혈을 얻었다. 원심분리하여 혈청을 분리하고 정제 오브알부민 및 mIL5 단백질에 대한 반응성 측정을 위한 ELISA 검사시까지 -20 ℃에서 저장하였다.
DNA 백신화 실험의 전형적인 결과를 도 4에 나타내었다. 상기한 일반적 설계에 따라, 40 마리의 Balb/cA 마우스를 난맥알부민 컨트롤 플라스미드, mIL5wt 인코딩 플라스미드 또는 mIL5 오토백 변이체 mIL5.1 또는 mIL5.5를 인코딩하는 플라스미드로 변역화시켰다. 이 실험에서, mIL5 야생형 또는 mIL5 변이체 인코딩 DNA를 주입받은 마우스에서는 항-오브알부민 반응이 유도되지 않은 반면, 오브알부민 인코딩 플라스미드로 면역화된 9 마리 마우스 중 9마리는 항-오브알부민 항체를 형성하였다. mIL5.1 플라스미드로 면역화된 10 마리 마우스 중 4 마리 및 mIL5.5 인코딩 플라스미드 DNA로 면역화된 9 마리 마우스 중 7 마리에서 mIL5에 대한 B 세포 관용이 파괴된 것에 반하여, mIL5wt 인코딩 플라스미드의 주입에 의하여 항-mIL5 반응이 유발되지 않았다.
전체적인 일련의 DNA 백신화 실험의 주요한 결과를 하기 표에 요약하였다. 면역화 군 내 응답개체의 수는 상이한 mIL5 오토백 구조 간 상이하며 마우스 계에 따라 달라진다. 확실히, mIL5.2 오토백 구조는 다른 변이체보다 우수하여, 두 마우스 계 모두에서 100 % 비율로 항 mIL5 항체 반응을 유도할 수 있다. 플라스미드(p820) 또한 COS 트랜스펙션 검사에서 최고의 발현 정도를 나타내었다.
강조하기 위한 또 다른 예는 면역원으로 mIL5.4 인코딩 플라스미드 DNA를 사용시 보여지는 분명한 MHC 구속(MHC restriction)이다. C3H/Hen 마우스 중 단지 1/10 이 DNA 백신에 대하여 반응하는 반면, 10 마리 Balb/vA 마우스 중 9 마리가 반응한다. mIL5.6 구조를 사용할 때에는 반대현상(전적으로 단언할 수 없지만)이 나타난다. 그러나, mIL5.2 백신은 불규칙하게 면역원성인 것처럼 보인다.
280 마우스의 DNA 백신화 결과의 요약. DNA 백신화의 효과와 관련이 없는 이유로 6 마리 마우스가 실험 중에 죽었다. 반응개체(고 또는 중간 항-mIL5 역가로)가 각 면역화 군 내 마우스의 총 수와 관련하여 나타나 있다.*) 출혈은 제 55 일 째에 얻었다. 다른 모든 출혈은 제 77 일 째에 얻었다.
언급하고자 하는 또 다른 특징은 mIL5 루프 1에 삽입된 외래 T 헬퍼 에피토프를 갖는 mIL5 변이체가 루프 3에 삽입된 T 헬퍼 에피토프를 갖는 변이체보다 더 강력한 DNA 백신화 면역원이라는 경향이다. 이는 상대적으로 높은 발현 정도 때문일 수 있다. 시험된 루프 2 변이체, 즉, mIL5.4-pcDNA 만이, 상기한 바와 같이, Balb/cA 계에서만 강력한 면역원이다.
DNA 백신화에 의하여 유도되는 항체 반응의 또 다른 특성:
삽입된 T 헬퍼 에피토프에 특이적인 항체를 항-mIL5 양성 마우스에서 측정할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 ELISA 실험을 설계하였다. 각 면역화 군에 대하여, 항-mIL5 양성 마우스로부터 취한 혈청을 혼합하고(pooled), AquaBind 마이크로타이터 플레이트에 고정화된 P2 및 P30 펩타이드에 대한 반응성을 특정하였다. 다른 항혈청은 P2 또는 P30과 반응하지 않았음에 반하여, 두 마우스 계 모두에 있어서 mIL5.2에 대한 DNA 백신화에 의하여 유도되는 항혈청은 삽입된 P30에 대하여확실하게 반응하였다. 이는 보다 높은 항체 역가 및 mIL5.2 DNA 백신화 구조에 대하여 관찰되는 침투도와 관련 있을 것이다. 이러한 ELISA 장치를 이용하여 mIL5.1에 대하여 유도되는 항혈청에서의 항-P2 반응성을 측정할 수 있을 것이다.
또한, DNA 백신화된 마우스로부터 취한 양성 항-mIL5 항혈청 풀을 가용성 미변성 마우스 IL5와, 둘 다 중화 항체인, 단클론 항체 TRFK4 또는 TRFK5 간의 상호작용을 억제하는 그들의 능력에 대한 경쟁 ELISA로 시험하였다. 항 mIL5 항혈청 풀의 희석 시리즈를 가용성 미변성 mIL5와 함께 예비배양하고 샘플을 전염(catching) 항체 TRFK5로 코팅된 ELISA 플레이트에 넣었다. 다음으로, 결합 마우스 IL5 (항혈청에 의하여 흡수되지 않음)을 바이오티닐화된 (biotinylated) TRFK4 층과 이어서 마 무 퍼옥시다아제 표지 스트렙타비딘(horse radish peroxidase labeled streptavidin)를 사용하여 가시화하였다. DNA 백신화에 포함된 모든 항-mIL5 양성 항혈청이 가용성 mIL5 및 TRFK4 또는 TRFK5 간의 상호작용을 억제할 수 있는 것은 아니다. 가장 높은 TRFK4/5 억제 능력을 갖는 항혈청을 mIL5.2 인코딩 DNA로 면역화된 C3H/Hen 마우스로부터 얻었다. 억제에 있어서 관찰되는 차이가 직접적인 역가 차이의 측정값인지 또는 상이한 항혈청의 미세한 특이성과 관련있는지 시험하지 않았다. 아마도, 이는 상기 두 요소의 조합일 것이다.
mIL5 오토백 DNA 면역화된 마우스에서의 호산백혈구증가증(eosinophilia)의 동물 모델
호산백혈구증가증의 동물 모델에서의 시험을 위하여 40 마리의 DNA 백신화된 마우스를 선태그하였다: mIL5wt DNA로 면역확된 Balb/cA 10 마리, mIL5.2 DNA로 면역확된 Balb/cA 10 마리, mIL5wt DNA로 면역확된 C3H/Hen 마우스 10 마리 및 mIL5.2 DNA로 면역화된 C3H/Hen 10 마리. 각각의 이들 마우스에 호산백혈구증가증을 유도하기 위하여 난백단백질로 증감화(sesitization)/감염화(challenging) 처방(regimen)을 실행하였다. 일주일에 한 번씩 3 주일 동안 Adjuphos와 1:1로 혼합된 0.9 % 살린 내 오브알부민(OVA) 50 ㎍을 피하 주입하여 마우스를 증감화시켰다. 마지막 OVA 증감화 4 일 후, 0.9 % 살린 내 OVA 12.5 ㎍으로 총 3 번 감염화 될 때까지 매일 비강내 감염화시켰다. 마지막 증감화 1 일 후, 기관을 캐뉼레이팅(cannulating)하고 1 ml PBS로 기도 내강을 세척시킴으로써 폐포성세기관지 세척액(bronchioalveolar lavage fluid, BALF)을 채취하였다. 약 30,000 ~ 60,000 개의 BALF 세포를 슬라이드상에서 1,500 rpm 으로 20 분 동안 회전시켰다. 슬라이드를 하룻밤 동안 건조시키고 May-Grunwald 염색제(Sigma)로 2.5 분 동안 염색시키고, 트리스 완충 살린에서 4 분 동안 세척하고, 김자(Geimsa) 염색제(ddH20와 1:20로 혼합; Sigma)로 20 분 동안 염색시키고 ddH2O 로 간단하게 씻어내었다. 염색된 슬라이드를 하룻밤 동안 건조시키고 광학 현미경을 이용하여 세포형을 동정하였다. 슬라이드 당 약 100 ~ 200 개의 세포를 카운팅하였고 마우스 당 3 개의 슬라이드를 카운팅하였다. 100 세포 당 카운팅된 호산성 백혈구의 수로 호산성 백혈구 총 수를 나타내었다. mIL5.2 DNA 백신화 C3H/Hen 마우스에 있어서, 폐 호산성 백혈구증가증이 야생형 mIL5wt DNA 백신화 군과 비교하여 현저하게 감소되었다(mIL5.2 DNA: 14.6 ±8.9 호산성 백혈구/100 세포; mIL5wt DNA: 51.1 ±9.9 호산성 백혈구/100 세포). 그러나, Balb/cA 계에 있어서, 면역화 군 간 호산성 백혈구 총 수의 현저한 차이가 없었다(mIL5.2 DNA: 23.3 ±6.8 호산성 백혈구/100 세포; mIL5wt DNA: 27.7 ±9.3 호산성 백혈구/100 세포). Balb/cA 마우스는 모델에 대한 민감성이 약하다고 할 수 있다. 이는 BALF 채취 일주일 전 Balb/cA의 혈청 내 항-오브알부민 역가가 C3H/Hen의 혈청보다 낮다는 것을 보여주는 항-오브알부민 ELISA 데이터에 의하여 뒷받침된다. Balb/cJ 아계가 OVA 증감화/감염화 모델에 민감하다고 보고되어 있다.
실시예 20
단백질 백신화 조사
Balb/cJ를 마우스 IL5(mIL5) 단백질로 면역화시키고 시험 대상 마우스의 폐에 호산성 백혈구를 유도시키는 오브알부민 비강내 모델을 수행하였다. UniHis-mIL5 및 UniHis-mIL5.1 단백질이 모두 R ;D 시스템에서 구입한 sf9 세포 내 생성된 mIL5와 교차반응하는 항체를 유도하였다. 호산성 백혈구 수가 PBS 군 및 UniHis-mIL5 군 모두에서 감소한 반면, OVA 대조군 및 Unihis-mIL5.1 군에서 있어서의 호산성 백혈구증가증 모델은 높은 호산성 백혈구 수를 유도하였다. 이러한 결과로 군들이 혼합되었을지 모른다고 할 수 있다.
재료 ; 방법
UniHis-mIL-5 E1320 ; E01397
UniHis-mIL-5.1 E01337 ; E01396
면역화
6 ~ 8 주된 암컷 Balb/cJ(M ;B) 마우스를 1)면역화시키지 않거나, 완전 프로인드 아쥬반트(CFA; Sigma)에서 2) PBS, 3)UniHis-mIL5, 또는 4) UniHis-mIL5.1로 면역화시키고 불완전 프로인드 아쥬반트(IFA; Sigma)에서 항원으로 3 주 간격으로 3 번 부스팅(boost)시켰다. 혈청을 채취하고 각 부스팅 10일 후 ELISA로 시험하였다.
ELISAs:
항-UniHis-mIL5 ELISA:
2 및 3 면역화 후 32일(채혈1) 및 54일(채혈2) 째에 각각 혈청을 얻었다. 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(Maxisorp, Nunc)를 정제 HIS-mIL5wt(0.1 ㎍/웰, E1320)으로 코팅하였다. 산양 항-마우스 이차항체를 사용하여 웰에 첨가한 희석 혈청의 반응성을 가시화하였다. 프로인드 아쥬반트에서 PBS로 면역화된 마우스의 컨트롤 혈청의 OD490 리딩(readings)을 테스트 샘플의 OD490 리딩에서 공제하였다.
항-mIL5 ELISA:
75일(채혈3) 째에 혈청을 얻었다. 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(Maxisorp, Nunc)를 구입한 mIL5(0.1 ㎍/웰, R ;D cat. no. 405-ML)으로 코팅하였다. 산양 항-마우스 이차항체를 사용하여 웰에 첨가한 1:1000 희석 혈청의 반응성을 가시화하였다. 래빗 항-래트 이차항체를 사용하여 TRFK5 (2㎍/ml)의 반응성을 가시화하였다.
경쟁 ELISA:
항혈청의 희석액을 가용성 IL5로 1 시간 동안 예비배양하고 전염 항체 TRFK5로 코팅된 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(Maxisorp, Nunc)에 넣었다. TRFK4및 HRP 표지 산양 항-마우스 이차항체를 사용하여 비오티닐화 결합 mIL5를 가시화하였다.
항-P2 ELISA:
HIS-mIL5wt, HIS-mIL5.1 또는 PBS 면역화 마우스의 항혈청 풀의 P2 펩타디드에 대한 반응성을 ELISA에서 시험하였다. 특수 마이크로타이터 플레이트(Aquabind, M ;E Biotech)를 0.5 ㎍/웰의 합성 P2 펩타이드로 코팅하였다. HRP 표지 산양 항-마우스 이차항체(1:2000, Dako)를 사용하여 웰에 첨가된 희석 혈청의 반응성을 가시화하였다.
항-UniHis ELISA:
HIS-mIL5wt, HIS-mIL5.1 또는 PBS 면역화 마우스의 항혈청 풀의 HIS-태그 펩타이드(UNIZYME)에 대한 반응성을 ELISA에서 시험하였다. 특수 마이크로타이터 플레이트(Aquabind, M ;E Biotech)를 0.5 ㎍/웰의 합성 HIS-태그 펩타이드로 코팅하였다. HRP 표지 산양 항-마우스 이차항체(1:2000, Dako)를 사용하여 웰에 첨가된 희석 혈청의 반응성을 가시화하였다.
항-S2 백그라운드 단백질 ELISA:
HIS-mIL5wt, HIS-mIL5.1 또는 PBS 면역화 마우스의 항혈청 풀의 S2 백그라운드 프레파레이션에 대한 반응성을 ELISA에서 시험하였다. 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(Maxisorp, Nunc)를 0.1 ㎍/웰의 합성 S2 백그라운드 프레파레이션으로 코팅하였다. HRP 표지 산양 항-마우스 이차항체(1:2000, Dako)를 사용하여 웰에 첨가된 희석 혈청의 반응성을 가시화하였다.
항-BSA ELISA:
HIS-mIL5wt, HIS-mIL5.1 또는 PBS 면역화 마우스의 항혈청 풀의 BSA에 대한 반응성을 ELISA에서 시험하였다. 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(Maxisorp, Nunc)를 10 ㎍/웰의 BSA(Intergen)로 코팅하였다. HRP 표지 산양 항-마우스 이차항체(1:2000, Dako)를 사용하여 웰에 첨가된 희석 혈청의 반응성을 가시화하였다.
호산성 백혈구증가증 모델:
알룸 아쥬반트로서의 Adjuphos와 1:1로 혼합된 0.9 % 살린 내 50 ㎍의 오브알부민(OVA)을 피하 주입하여 Balb/cJ 마우스를 증감화시켰다. 4 주일 동안 일주일에 한 번씩 OVA 면역화를 반복하였다. 마지막 OVA 증감화 일주일 후, 마우스를 0.9 % 살린 내 12.5 ㎍ 의 OVA로 총 3회 감염화 동안 매일 비강내 감염화시켰다. 마지막 증감화 1 일 후 기관을 캐뉼레이팅하고 1 ml 의 0.9 % 살린 또는 PBS로 기도 내강을 세척하여 폐포성세기관지 세척액(BALF)을 채취하였다.
BAL 염색:
약 30,000 ~ 60,000 개의 BALF 세포를 슬라이드상에서 1,500 rpm 으로 20 분 동안 회전시켰다. 슬라이드를 하룻밤 동안 건조시키고 May-Grunwald 염색제(Sigma)로 2.5 분 동안 염색시키고, TBS에서 4 분 동안 세척하고, 김자(Geimsa) 염색제(ddH20와 1:20로 혼합; Sigma)로 20 ~ 30 분 동안 염색시키고 ddH2O 로 간단하게 씻어내었다. 염색된 슬라이드를 하룻밤 동안 건조시키고 광학 현미경을 이용하여 세포형을 동정하였다. 슬라이드 당 약 100 ~ 200 개의 세포를 카운팅하였고 마우스 당 3 개의 슬라이드를 카운팅하였다.
결과:
항-IL5 항체의 측정:
HIS-mIL5wt 및 HIS-mIL5.1 단백질 재료로 면역화된 마우스에서 마우스 IL5에 특이적인 항체반응이 유도되는지 여부를 조사하기 위하여 일련의 ELISA 실험을 수행하였다. 우선, 각 마우스로부터 얻은 항혈청의 희석액을 HIS-mIL5wt 재료로 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 시험함으로써 HIS-mIL5wt 면역화 물질에 대한 항체가 유도되는지 여부를 측정하였다. 이전의 채혈에 의하여, 모든 마우스가 약 95 % 순도인 HIS-mIL5wt 재료(E1320, 초파리 S2 세포에서 발현되고 정제됨)에 대한 고-역가 항체 반응을 일으킨다는 것을 발견하였다.
이러한 결과가 항혈청이 마우스 IL5와 교차-반응한다는 확실한 증거는 아니다. 이러한 실험에 있어서, S2 배지(예컨대, 변성 mIL5 B 세포 에피토프 뿐 아니라 HIS-태그, 우태아혈청(fetal calf serum)에서 얻은 BSA를 함유)의 초파리 S2 세포에서의 이물질에 대한 반응성을 또한 측정하였다. 유도된 항체가 미변성 마우스 IL5에 대한 반응성을 갖는다는 것을 증명하기 위하여, 혈청을 R ;D 시스템에서 구입한 mIL5로 코팅된 ELISA 플레이트에서 시험하였다. 이러한 물질(R ;D cat. no. 405-ML)은 생물학적으로 활성이 있고, HIS-태그를 포함하지 않으며, 바큘로바이러스 SF21 계에서 발현하고, 또한 매우 순도가 높으며(순도97%), 담체-단백질(BSA) 없이 구입가능하다. 양 면역화 군의 혈청 풀은 구입한 ELISA 플레이트 상에 코팅된 구입한 mIL5와 반응하였으나, PBS 면역화 마우스의 혈청은 반응하지 않았다. 이는 4 번째 면역화 11일 후, 제 75일 째에 얻은 채혈 3의 혈청의 시험시 나타나며, 또한 채혈 1 및 2의 혈청은 비슷한 실험에서 구입한 mIL5와 반응한다. BSA 담체와의 교차-반응의 신호를 배제하기 위하여, 구입한 mIL5 재료의 무-담체 버젼 및 무-BSA ELISA 버퍼를 사용하여 채혈 1 및 2에 대하여 반복하여 실험하였고 여전히 높은 항-mIL5 반응을 나타내었다. 유도된 항혈청이 미변성 mIL5와 교차-반응한다는 것을 더욱 확실하게 하기 위하여, 경쟁 ELISA를 수행하였다. 이러한 ELISA는 상이한 항혈청이 가용성 미변성 마우스 IL5와 모두 중화 항체인 단클론 항체 TRFK4 또는 TRFK5 간의 상호작용을 억제하는 능력을 검사한다. 항혈청의 희석 시리즈를 가용성 미변성 mIL5로 예비배양시키고, 그 샘플을 전염 항체 TRFK5로 코팅된 ELISA 플레이트에 넣었다. 그 다음에, 비오니틸화 TRFK4 층과 이어서 마 무 퍼옥시다제 표지 스트렙타비딘을 사용하여 결합 마우스 IL5(항혈청에 의하여 흡수되지 않음)를 가시화하였다. 대조군과 같이 DNA 백신화 마우스로부터 얻은 항-mIL5 양성 및 항-mIL5 음성 항혈청이 유도되었다. HIS-mIL5wt 및 HIS-mIL5.1 면역화 마우스 모두에서 얻은 항혈청이 가용성 mIL5 및 TRFK4 또는 TRFK5 간의 상호작용을 억제할 수 있다는 것을 증명하였다.
상기 기재사항에 근거하여 mIL5 특이적 자기항체가 HIS-mIL5wt 또는 HIS-mIL5.1 단백질 프레파레이션으로 면역화시킨 마우스에서 유도된다(시험대상 마우스의 100 %에서)는 것을 결론을 내렸다. 즉, 야생형 및 오토백 마우스 IL5 모두의 재조합 HIS-태그 버전을 사용하여 mIL5에 대한 B 세포 관용을 파괴할 수 있다. 야생형 단백질에 대한 B 세포 관용이 파괴되는 현상에 대하여 이들 마우스의 HIS-태그가 "외래" 면역원 T 헬퍼 에피토프로서 작용한다고 설명할 수 있다. 또는, 완전 프로인드 아쥬반트의 투여가 mIL5에 대한 관용을 파괴하였다고도 설명할 수 있다. 이러한 가설들은 비-HIS 태그 항원 및/또는 선택적으로, AdjuPhos와 같이 보다 덜 강력한 아쥬반트를 사용하여 시험할 수 있다.
mIL5 오토백 단백질로 면역화된 마우스에 있어서의 항체 반응의 또 다른 특성:
삽입 T 헬퍼 에피토프에 특이적인 항체를 mIL5 단백질 면역화 마우스의 혈청에서 측정 가능한지 여부를 결정하기 위하여 ELISA 실험을 설계하였다. 각 면역화 군에서, 항혈청(채혈 2) 풀을 만들고 AquaBind 마이크로타이터 플레이트에 고정화된 합성 P2 펩타이드에 대한 반응성을 시험하였다. 항-HIS-mIL5wt도 항-PBS/CFA도 P2 펩티이드와 반응하지 않는 반면, 항-HIS-mIL5.1 항혈청은 삽입 P2 펩타이드에 대하여 반응하였다.
또한, 항-HIS-mILwt 및 항-HIS-mIL5.1 항혈청이 야생형 및 오토백 mIL5 단백질 모두의 N-말단에 융합된 15-mer HIS-태그(UNIZYME HIS-tag, SEQ ID NO: 25)에 대한 반응성을 갖는지 여부를 시험하였다. 펩타이드를 합성하고 AquaBind 마이크로타이터 플레이트에 공유적으로 고정화시키고, 각 면역화 군(채혈 1, 2 및 3)의 항혈청 풀의 결합 단백질에 대한 반응성을 시험하였다. 모든 단백질 면역화 마우스의 항혈청은 합성 HIS-태그 펩타이드와 반응하였다.
또한, 항-HIS-mIL5wt 및 항-HIS-mIL5.1 항혈청을 S2 초파리 세포 또는 배양 배지의 성분과 반응하는지 여부를 시험하였다. ELISA 플레이트를 BSA(주요 배지 성분) 또는 S2-백그라운드 프레파레이션(Her2 발현 초파리 S2 세포의 배양 상청액을mIL5 정제 과정과 유사하게 정제시켜서 제조)로 코팅하였다. 이러한 분석의 결과는 항-BSA 반응이 매우 낮은 반면, S2-백그라운드 재료와의 반응성은 현저하다는 것을 보여주었다.
BALF 내의 호산성 백혈구 수:
백신화 마우스 내 항-IL5 항체가 IL5의 생체 내(in vivo) 활성을 감소시킬 수 있는지 여부를 측정하기 위하여, 백신화 마우스의 폐 내 IL5-의존 호산성 백혈구를 유도하였다. OVA로 비강내 증감화된 마우스를 감염화시킴으로써 호산성 백혈구를 유도하였다. 대조군 OVA 마우스 또는 UniHis-mIL5.1로 백신화된 마우스에서는 호산성 백혈구 수치가 높았으나, Uni-His-mIL5 또는 PBS 백신화 마우스에서는 그렇지 않았다. 대조군(OVA 및 PBS)과 실험군(UniHis-mIL5.1) 간의 호산성 백혈구 수의 불일치, 및 상기한 DNA 백신화 마우스로부터 얻은 양성 결과에 의하여, 상기 군들이 스위치되었다고 생각할 수 있다. 그러나, 스위치를 증명하는 어떠한 시도도 상기 해석을 뒷받침하지 않았다. 이러한 논의를 명백하게 하기 위하여 동일한 실험설계에서 단백질 백신화를 반복하였다.
토의:
UniHis-mIL5 및 UniHis-mIL5.1 단백질이 야생형 마우스 IL5와의 교차-반응을 하는 항체를 유도하는 능력을 명확히 나타내었다. UniHis-mIL5 단백질이 면역학적 관용을 회피하는 능력이 UniHis-태그 때문인지, 또는 다른 이유(예컨대, CFA 아쥬반트) 때문인지 여부는 여전히 증명되어야할 문제로 남아있다. 호산성 백혈구증가증 모델에 있어서 mIL5의 UniHis-mIL5 구조만이 내인성 생체 내 활성을 감소시킬수 있다는 것을 발견하였다는 것이 의외였다. UniHis-mIL5.1 단백질 백신화로부터 생성된 항혈청이 호산성 백혈구 증가증을 억제할 수 없음 및 이들이 DNA 백신화를 경유하여 호산성 백혈구증가증을 억제할 수 있다는 사실이 상기 실험에 기술적 실수가 있었을 수 있음을 제시한다. 또한, 이는 호산성 백혈구증가증을 억제하는 PBS 백신화의 통상적인 조사에 의하여 뒷받침된다. 이 들 두 군(PBS 및 UniHis-mIL5.1)이 스위치되었다는 것이 가장 적절한 설명이다.
참조문헌 목록

Claims (68)

  1. - 동물을 IL5 폴리펩타이드 또는 그의 서브서열 (subsequence)로 면역시킬 경우 IL5 폴리펩타이드에 대한 항체 생산을 유도할 수 있도록 조성된 적어도 하나의 IL5 폴리펩타이드 또는 그의 서브 서열 및/또는,
    - IL5 아미노산 서열에 있어서 적어도 하나의 변형이 도입됨으로 해서, 동물을 그 IL5 유사체로 면역화시킬 경우 IL5 폴리펩타이드에 대한 항체 생성이 유도되는, 적어도 하나의 IL5 유사체
    의 면역학적 유효량을 상기 동물의 면역계에 제시하는 것을 포함하여 이루어지는, 인간을 비롯한 동물에 있어서 인터류킨 5 (IL5)의 생체내 다운-조절 (down-regulation) 방법.
  2. 제 1항에 있어서, IL5 유사체에 IL5 아미노산 서열의 적어도 한가지 변형이 제시되는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 변형의 결과, IL5 B-세포 에피토프의 실질적인 분획이 보존되고,
    - 적어도 하나의 외래 T-헬퍼 임파구 에피토프 (TH에피토프)가 도입되고/또는,
    - 항원 제시 세포 (APC) 또는 B-임파구에 변형 분자를 표적화시키는 적어도 하나의 제 1 부분이 도입되고/또는,
    - 면역계를 자극하는 적어도 하나의 제 2 부분이 도입되고/또는,
    - 변형된 IL5 폴리펩타이드를 면역계에 제시하는 것을 최적화시키는 적어도 하나의 제 3 부분이 도입되는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 변형이 IL5 또는 그의 서브서열 중 적절한 화학기에 공유결합 또는 비공유결합에 의해, 외래 TH에피토프 및/또는 제 1 및/또는 제 2 및/또는 제 3 부분을 도입하는 것을 포함하여 이루어지는 방법.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 변형이 아미노산의 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 및/또는 부가를 포함하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 변형의 결과 융합 폴리펩타이드가 제공되는 방법.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 아미노산의 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 및/또는 부가 결과, IL5의 전체적인 3차 구조가 실질적으로 보존되는 방법.
  8. 제 2항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 적어도 하나의 IL5B-세포 에피토프의 복제 및/또는 합텐 도입을 포함하는 방법.
  9. 제 3항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 외래 T-세포 에피토프가 상기 동물 중에서 면역우성 (immunodominant)인 방법.
  10. 제 3항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 외래 T-세포 에피토프가 난교잡성 (promiscuous) 것인 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 적어도 하나의 외래 T-세포 에피토프가 천연적인 난교잡성 T-세포 에피토프 및 인공적인 MHC-II 결합 펩타이드 서열 중에서 선택되는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 천연의 T-세포 에피토프가 P2 또는 P30과 같은 파상풍 독소 에피토프, 디프테리아 독소 에피토프, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 에피토프 및 P. Falcifarum CS 에피토프 중에서 선태고디는 것인 방법.
  13. 제 3항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 부분은 B-임파구 또는 APC상의 수용체를 갖는 합텐 또는 탄수화물과 같이, B-임파구 특이적 표면 항원 또는 APC 특이적인 표면 항원에 대해 실질적으로 특이적인 결합 파트너인 방법.
  14. 제 3항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 부분이 시토카인, 호르몬 및 열-충격 단백질 중에서 선택되는 방법.
  15. 제 6항에 있어서, 시토카인은 인터페론 γ (IFN-γ), Flt3L, 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 2 (IL-2), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 12 (IL-12), 인터류킨 13 (IL-13), 인터류킨 15 (IL-15), 및 과립구-마크로파지 집락 자극 인자 (GM-CSF: granulocyte-macrophage cology stimulating factor)의 유효 부분 중에서 선택되고, 열-충격 단백질은 HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 및 칼레티쿨린 (CRT: calreticulin) 중에서 선택되거나 또는 그의 유효 부분인 방법.
  16. 제 3항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 부분은 팔미토일기, 미리스틸기, 파네실기, 제라닐-제라닐기, GPI-앵커, 및 N-아실 디글리세라이드기와 같은 지질 특성을 갖는 방법.
  17. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, IL5 폴리펩타이드는 적어도 하나의 루프 1-3 또는 아미노산 잔기 C-말단에서 헬릭스 D에서 변형된 것이고, 상기 루프와 상기 헬릭스 D는 인간 및 쥐의 IL5에 대해 도 3에 도시된 것에 해당하는 것인 방법.
  18. 제 17항에 있어서, IL5 폴리펩타이드가 인간의 IL5 폴리펩타이드인 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 인간의 IL5 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1 중의 적어도 하나의 아미노산 서열을 그와 같거나 다른 길이의 적어도 하나의 아미노산 서열로 치환시킴으로써, 외래 TH에피토프를 유도시킴으로써 변형된 것이고, 여기서, 치환된 아미노산 잔기는 잔기 87-90, 잔기 32-43, 잔기 59-64, 잔기 86-91, 및 잔기 110-113 중에서 선택되는 방법.
  20. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역계에 대한 제시가 IL5 폴리펩타이드의 적어도 2개 복제물, 그의 서브 서열 또는 변형된 IL5 폴리펩타이드를 항원 결정기의 복수개 복제물을 제시할 수 있는 담체 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합시킴으로써 수행되는 방법.
  21. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, IL5 폴리펩타이드, 그의 서브서열 또는 변형된 IL5 폴리펩타이드를 자가항원에 대한 자가관용을 파괴시키는 것을 용이하게 해주는 어쥬번트와 함께 조성시킨 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 어쥬번트가 면역 표적화 어쥬번트; 독소, 시토카인 및 미코박테리아 유도체와 같은 면역 조절 어쥬번트; 오일 조성물; 폴리머; 미셀 형성 어쥬번트; 사포닌; 면역자극 복합체 매트릭스 (ISCOM matrix: immunostimulating complex matrix); 입자 (particle); DDA; 알루미늄 어쥬번트; DNA 어쥬번트; γ-인슐린; 및 캡슐화 어쥬번트 중에서 선택되는 방법.
  23. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, IL5 폴리펩타이드 또는 IL5 유사체의 유효량을 피내 (intradermal), 진피하 (subdermal), 피내 (intracutaneous), 피하 (subcutaneous), 근육내 (intramuscular) 경로와 같은 비경구 경로; 복강 경로; 경구 경로; 볼내 (buccal) 경로; 경막외 (epidural) 경로; 척추 경로; 항문 경로; 및 두개내 (intracranial) 경로 중에서 선택된 경로를 통해 동물에게 투여하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 유효량이 IL5 폴리펩타이드, 그의 서브서열 또는 그의 유사체 0.5 내지 2,000μg 범위인 방법.
  25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 연간 IL5 폴리펩타이드 또는 그의 유사체를 적어도 1회, 예컨대 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 6회, 및 적어도 12회 투여하는 방법.
  26. 제 23항 내지 25항 중 어느 한 항에 있어서, IL5 폴리펩타이드 또는 그의 유사체가 버츄얼 임파절 (VLN:virtual lymph node) 장치 중에 함유된 방법.
  27. 제 1항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL5를 코딩하는 핵산(들)을 동물 세포에 도입함으로써 도입된 핵산(들)이 세포에 의해 생체내 발현되도록함으로써, 변형된 IL5를 면역계에 제시하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 도입된 핵산(들)이 네이키드 DNA, 하전 또는 비하전 지질과 함께 조성된 DNA, 리포좀 내에 조성된 DNA, 바이러스 벡터 내에 포함된 DNA, 트랜스펙션-용이화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 표적화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 칼슘 침전제제와 함께 조성된 DNA, 불활성 담체 분자에 커플링된 DNA, 키틴 또는 키토산 내에 캡슐화된 DNA, 및 제 22항에 정의된 어쥬번트와 같은 어쥬번트와 함께 조성된 DNA 중에서 선택되는 방법.
  29. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 핵산을 동맥내, 정맥내 또는 제 23항에 정의된 경로로 투여하는 방법.
  30. 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 핵산(들)을 VLN 장치에 함유시키는 방법.
  31. 제 28항 내지 30항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산을 연간 적어도 1회, 예컨대 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 6회, 및 적어도 12회 투여하는 방법.
  32. 호산성 세포의 수를 질병 특성에 따라 전신적으로 또는 국소적으로, 예컨대 적어도 20% 감소시키는 것과 같이, 유의적으로 감소시키는 정도로, IL5 활성을 제1항 내지 31항 중 어느 한 항에 따른 본 발명의 방법으로 다운-조절하는 것을 특징으로 하는, 천식 또는 기타 만성 알러지성 질환의 치료 및/또는 예방 및/또는 경감 방법.
  33. 동물의 IL5 폴리펩타이드로부터 유도된 IL5 유사체로서, 동물을 그 유사체로 면역화시킬 경우 IL5 폴리펩타이드에 대한 항체 생산을 유도시킬 수 있도록 변형된것이 특징인 IL5 유사체.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 변형이 제 1항 내지 22항 중 어느 한 항에서 정의된 것이 특징인 IL5 유사체.
  35. IL5 폴리펩타이드에 대한 동물의 자가관용서을 파괴시킬 수 있도록 면역학적으로 허용가능한 어쥬번트와 함께 조성된, 동물에 대해 자가적인 (autologous) IL5 폴리펩타이드의 면역원적 유효량, 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 담체 및/또는 비히클을 포함하여 이루어지는 면역원성 조성물.
  36. 제 33항 또는 제 34항에 따른 IL5 유사체의 면역원적 유효량, 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 담체 및/또는 비히클 및 임의로 어쥬번트를 포함하여 이루어지는 면역원성 조성물.
  37. 제 35항 또는 36항에 있어서, 어쥬번트가 제 22항의 어쥬번트 중에서 선택되는 면역원성 조성물.
  38. 제 33항 또는 제 34항에 따른 IL5 유사체를 코딩하는 핵산 단편.
  39. 제 38항에 따른 핵산 단편을 담지하는 벡터.
  40. 제 39항에 있어서, 자율복제가 가능한 벡터.
  41. 제 39항 또는 40항에 있어서, 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니-염색체 및 방러스 중에서 선택된 벡터.
  42. 제 39항 내지 41항 중 어느 한 항에 있어서, 5' → 3' 방향과 작동가능한 연결에 있어서, 제 38항에 따른 핵산 단편의 발현을 추진할 수 있는 프로모터, 폴리펩타이드를 분비하거나 또는 막 내부로 통합할 수 있는 리더 펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산 서열, 제 38항에 따른 핵산 단편 및 임의로 터미네이터를 포함하여 이루어지는 벡터.
  43. 제 39항 내지 42항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 벡터.
  44. 제 39항 내지 42항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 없는 벡터.
  45. 제 39항 내지 44항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 진핵 세포 및/또는 원핵 세포 중에서의 발현을 추진하는 벡터.
  46. 제 39항 내지 45항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 담지하는 형질전환된 세포.
  47. 제 46항에 있어서, 제 38항에 따른 핵산 단편을 복제할 수 있는 형질전환된 세포.
  48. 제 47항에 있어서, 세균, 효모, 원생동물 중에서 선택된 미생물 또는 진균, S2또는 SF 세포와 같은 곤충 세포, 식물 세포 및 포유동물의 세포 중에서 선택된 다세포 생명체로부터 유도된 세포인 형질전환된 세포.
  49. 제 48항에 있어서, 에스케리치아 (Escherichia)속, 바실러스 (Bacillus) 속, 살모넬라 (Salmonella) 속, 또는 미코박테리움 (Mycobacterium)속의 세균인 것이 특징인 형질전환된 세포.
  50. 제 52항에 있어서, 이. 콜라이(E. coli) 및 엠. 보비스 BCG (M. bovisBCG)와 같은 비-병원성 미코박테리움 (Mycobacterium) 세포 중에서 선택되는 형질전환된 세포.
  51. 제 46항 내지 50항 중 어느 한 항에 있어서, 제 38항에 따른 핵산 단편을 발현하는 형질전환된 세포.
  52. 제 55항에 있어서, 표면에 제 33항 또는 34항에 따른 IL5 유사체를 분비하거나 담지하는 형질전환된 세포.
  53. 제 1항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, IL5 폴리펩타이드 또는 그의 유사체를 코딩 및 발현하는 핵산 단편을 담지하는 비-병원성 미생물 또는 바이러스를 투여함으로써 면역계에 대한 제시를 수행하는 방법.
  54. 제 53항에 있어서, 바이러스가 백시니아 바이러스와 같은 비-독성 폭스 바이러스인 방법.
  55. 제 54항에 있어서, 미생물이 제 49항 또는 50항에 정의된 세균과 같은 세균인 방법.
  56. 제 53항 내지 55항 중 어느 한 항에 있어서, 비-병원성 미생물 또는 바이러스를 동물에게 단 1회 투여하는 방법.
  57. - 제 38항에 따른 핵산 단편 또는 제 39항 내지 45항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 및
    - 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 담체 및/또는 비히클 및/또는 어쥬번트를 포함하여 이루어지는, IL5에 대한 항체 생산 유도용 조성물.
  58. 제 57항에 있어서, 핵산 단편이 제 28항 또는 30항에 따라 조성되는 조성물.
  59. 제 39항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 담지하고 제 38항에 따른 핵산 단편을 발현시키겨, 제 33항 또는 제 34항에 따른 IL5 동족체를 그 표면에 임의로 분비하거나 담지하는 안정한 세포주.
  60. 제 38항에 따른 핵산 단편 또는 제 39항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 것을 포함하여 이루어지는, 제 46항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 따른 세포의 제조방법.
  61. - 펩타이드 합성 또는 유전공학적 기술에 의해, 어떤 동물 종의 IL5 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 부가, 삽입, 결실, 또는 치환시킴으로써 그 동물종에 외래인 T-세포 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 그 세트 내에 유도함으로써 상호 구별되는 일련의 변형된 IL5 폴리펩타이드 세트를 제조 하거나, 또는 상호 구별되는 변형된 IL5 폴리펩타이드 세트를 코딩하는 핵산 단편 세트를 제조한 다음,
    - 상기 세트 멤버들이 그 동물종에 의해 비변형 IL5에 대한 항체 생산을 유도할 수 있는지를 테스트하고,
    - 상기 세트 중 그 동물종에서 비변형 IL5에 대한 항체 생산을 현저히 유도하는 멤버(들)을 동정 및 임의로 분리하거나, 또는 그 동물 종에서 비변형 IL5 폴리펩타이드에 대한 항체 생산을 현저히 유도시키는 핵산 단편 세트의 멤버에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 발현산물을 동정 및 임의로 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는, 어떤 동물에 있어서, 자가-단백질인 비변형 IL5에 대한 항체를 유도할 수 있는 변형된 IL5 폴리펩타이드를 동정하는 방법.
  62. - 펩타이드 합성 또는 유전공학적 기술에 의해, 어떤 동물 종의 IL5 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 부가, 삽입, 결실, 또는 치환시킴으로써 그 동물종에 외래인 T-세포 에피토프를 포함하는 아미노산 서열을 그 세트 내에 유도함으로써 상호 구별되는 일련의 변형된 IL5 폴리펩타이드 세트를 제조한 다음,
    - 상기 세트 멤버들이 그 동물종에 의해 비변형 IL5에 대한 항체 생산을 유도할 수 있는지를 테스트하고,
    - IL5와 반응성인 동물 종에서 항체 생산을 현저히 유도하는 세트의 멤버(들)을 임의로, 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 적어도 하나의 어쥬번트와 결합된, 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 담체 및/또는 비히클과 혼합하는 단계를 포함하여 이루어지는, 어떤 동물에 있어서, 자가-단백질인 비변형 IL5에 대한 항체를 유도할 수 있는 적어도 하나의 변형된 IL5 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물의 제조방법.
  63. 제 61항 또는 제 62항에 있어서, 세트 멤버들의 제조가, 제 38항에 따른 핵산 서열인 상호 구별되는 핵산 서열을 제조하고, 상기 핵산 서열을 적절한 발현 벡터내로 삽입한 다음, 적절한 숙주 세포를 상기 벡터로 형질전환시켜, 상기 핵산 서열을 발현시킨 다음, 임의로 발현산물을 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 방법.
  64. 제 63항에 있어서, 핵산 서열 및/또는 벡터의 제조가 PCR과 같은 분자 증폭 기술 또는 핵산 합성 수단의 보조를 받아 달성되는 방법.
  65. 동물에서 IL5 활성을 다운-조절하기 위한, 어쥬번트를 포함하는 면역원성 조성물의 제조를 위한 IL5 또는 그의 서브서열의 용도.
  66. 천식 또는 기타 만성 알러지성 증상의 치료, 예방, 또는 경감을 위한, 어쥬번트를 포함하는 면역원성 조성물의 제조를 위한 IL5 또는 그의 서브서열의 용도.
  67. 동물에서 IL5 활성을 다운-조절하기 위한, 임의로 어쥬번트를 포함하는 면역원성 조성물의 제조를 위한 IL5 유사체의 용도.
  68. 천식 또는 기타 만성 알러지성 증상의 치료, 예방, 또는 경감을 위한, 임의로 어쥬번트를 포함하는 면역원성 조성물의 제조를 위한 IL5 유사체의 용도.
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