JP2002543098A - Ｉｌ５活性のダウン−レギュレート方法 - Google Patents
Ｉｌ５活性のダウン−レギュレート方法Info
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Abstract
(57)【要約】
この発明は、好酸球レベルの上昇で特徴付けられる症状、つまり喘息及び他の慢性的なアレルギー性疾患の症状の治療及び予防における改善に関する。インターロイキン5(IL5)をダウン-レギュレートするための方法は、IL5に対する抗体産生を可能にし、それにより好酸球の活性レベルを低下することによって提供される。この発明は、この方法で有用な修飾IL5の産生方法ならびに修飾IL5それ自体をも提供する。また、修飾IL5をエンコードする核酸フラグメントならびにこれらの核酸フラグメントを挿入したベクター、それで形質転換した宿主細胞及び細胞系がこの発明に包含される。この発明は、本発明の方法で有用なIL5類似体の同定方法ならびに修飾IL5からなるか、もしくはIL5類似体をエンコードする核酸からなる組成物をも提供する。この発明の好ましい具体例は、IL5変異体の使用を伴うものであり、外来Tヘルパーエピトープが導入されて、オートロガスIL5に結合し得る交差反応性の抗体の産生を誘発する。
Description
【０００１】発明の分野 本発明は、好酸球のレベルの上昇で特徴付けられる症状、つまり喘息及び他の
慢性アレルギー疾患のような症状の治療と予防における改善に関する。より詳細
には、この発明は、インターロイキン5 (IL5)に対する抗体産生を可能にし、そ
れにより好酸球の活性レベルを低下するIL5のダウン-レギュレート方法を提供す
る。また、この発明は、この方法で有用な修飾IL5の生産方法ならびに修飾IL5そ
れ自体を提供する。修飾IL5をエンコードする核酸フラグメントならびにこれら
の核酸フラグメントを挿入しているベクター、及びそれらで形質転換された宿主
細胞ならびに細胞系も、この発明に包含される。また、この発明は、この発明の
方法で有用なIL5類似体の同定方法ならびに修飾IL5からなるか、又はIL5類似体
をエンコードする核酸からなる組成物を提供する。
慢性アレルギー疾患のような症状の治療と予防における改善に関する。より詳細
には、この発明は、インターロイキン5 (IL5)に対する抗体産生を可能にし、そ
れにより好酸球の活性レベルを低下するIL5のダウン-レギュレート方法を提供す
る。また、この発明は、この方法で有用な修飾IL5の生産方法ならびに修飾IL5そ
れ自体を提供する。修飾IL5をエンコードする核酸フラグメントならびにこれら
の核酸フラグメントを挿入しているベクター、及びそれらで形質転換された宿主
細胞ならびに細胞系も、この発明に包含される。また、この発明は、この発明の
方法で有用なIL5類似体の同定方法ならびに修飾IL5からなるか、又はIL5類似体
をエンコードする核酸からなる組成物を提供する。
【０００２】発明の背景 喘息は気道に関する一般的な疾患で、人口の約10%に影響を及ぼしている。現
在の治療は、主としてステロイドの投与に基づいており、10億ドル以上に及ぶ市
場価値を示している。原因が不明であるために、喘息の発症と罹患は、過去20年
以上世界的に拡大している。今日、バイオテクノロジーにおける爆発的な進展と
組合わさって喘息症状に伴う免疫機序の理解は深まっており、これは、代替的で
、おそらくはより良好な治療ストラテジの開発の新たな基礎となっている。 喘息及び他の慢性アレルギー疾患の病状における一般的な特徴は、特に気管支
粘膜と肺における好酸球数の上昇であることが分かっている。好酸球は、活性化
により、炎症性気道応答に積極的に関与する多数の媒介物を分泌する。好酸球の
活性化で、インターロイキン5 (IL5)は、重要な役割を果たす。
在の治療は、主としてステロイドの投与に基づいており、10億ドル以上に及ぶ市
場価値を示している。原因が不明であるために、喘息の発症と罹患は、過去20年
以上世界的に拡大している。今日、バイオテクノロジーにおける爆発的な進展と
組合わさって喘息症状に伴う免疫機序の理解は深まっており、これは、代替的で
、おそらくはより良好な治療ストラテジの開発の新たな基礎となっている。 喘息及び他の慢性アレルギー疾患の病状における一般的な特徴は、特に気管支
粘膜と肺における好酸球数の上昇であることが分かっている。好酸球は、活性化
により、炎症性気道応答に積極的に関与する多数の媒介物を分泌する。好酸球の
活性化で、インターロイキン5 (IL5)は、重要な役割を果たす。
【０００３】 IL5は、多くの哺乳動物種にみられるサイトカインで、特にヒトとマウスの双
方のIL5遺伝子がクローンされている(Tanabeら、1987, Campbellら、1988)。ヒ
ト遺伝子は、第5染色体に位置する3つのイントロンを有する4つのエキソンから
なり、19アミノ酸N-末端リーダー配列(アミノ酸配列をSEQ ID NO: 62に示す)を
含む134アミノ酸残基の前駆体をコードしている。翻訳後切断により、115アミノ
酸残基の成熟タンパク質(SEQ ID NO: 1)が生じる。マウスIL5 (mIL5)遺伝子は、
同様に20アミノ酸リーダー配列(アミノ酸配列をSEQ ID NO: 64に示す)を有する1
33アミノ酸残基前駆体をコードしている。処理された成熟mIL5は、この結果、ヒ
トIL5とのアラインメントによれば2つのN-末端アミノ酸残基を欠いている113ア
ミノ酸残基長(SEQ ID NO: 12)である。hIL5及びmIL5のアミノ酸配列は70%同一で
、コード化領域のヌクレオチドレベルでは77%に匹敵している(Azumaら、1986)。
より高い類似性は、ヒト霊長類で報告されている。99%の同一性は、ヒトのコー
ド領域とアカゲザルのヌクレオチド配列について報告されている(Villingerら、
1995)。 ヒトアミノ酸配列は、2つの潜在的なN-グリコシル化部位を有しており、マウ
スは3つを有している。ヒトIL5は、Thr 3でN-グリコシル化されるだけでなく、O
-グリコシル化されることが分かっている。hIL5についての研究は、安定化が脱
グリコシル化によって影響と及ぼされているとしても、グリコシル化が生物学的
な活性に必ずしも必要ではないことを立証している(Tominagaら、 1990; Kodam
aら、1993)。
方のIL5遺伝子がクローンされている(Tanabeら、1987, Campbellら、1988)。ヒ
ト遺伝子は、第5染色体に位置する3つのイントロンを有する4つのエキソンから
なり、19アミノ酸N-末端リーダー配列(アミノ酸配列をSEQ ID NO: 62に示す)を
含む134アミノ酸残基の前駆体をコードしている。翻訳後切断により、115アミノ
酸残基の成熟タンパク質(SEQ ID NO: 1)が生じる。マウスIL5 (mIL5)遺伝子は、
同様に20アミノ酸リーダー配列(アミノ酸配列をSEQ ID NO: 64に示す)を有する1
33アミノ酸残基前駆体をコードしている。処理された成熟mIL5は、この結果、ヒ
トIL5とのアラインメントによれば2つのN-末端アミノ酸残基を欠いている113ア
ミノ酸残基長(SEQ ID NO: 12)である。hIL5及びmIL5のアミノ酸配列は70%同一で
、コード化領域のヌクレオチドレベルでは77%に匹敵している(Azumaら、1986)。
より高い類似性は、ヒト霊長類で報告されている。99%の同一性は、ヒトのコー
ド領域とアカゲザルのヌクレオチド配列について報告されている(Villingerら、
1995)。 ヒトアミノ酸配列は、2つの潜在的なN-グリコシル化部位を有しており、マウ
スは3つを有している。ヒトIL5は、Thr 3でN-グリコシル化されるだけでなく、O
-グリコシル化されることが分かっている。hIL5についての研究は、安定化が脱
グリコシル化によって影響と及ぼされているとしても、グリコシル化が生物学的
な活性に必ずしも必要ではないことを立証している(Tominagaら、 1990; Kodam
aら、1993)。
【０００４】IL5の構造 活性なIL5はホモ-ダイマーで、組換えhIL5の三次元構造はX-線 結晶学により
決定されている(Milburnら、1993)。2つのモノマーは、非平行な様式で構成され
、2つの鎖内ジスルフィド架橋(44-87'及び87-44')によって共有結合されており
、これにより2つのモノマーについて全部で4つのシステインを確保している。 モノマーの二次構造は、β-シートの2つの短いストレッチを含む3つの架橋領
域(ループ)によって中断される4つのα-ヘリックス(A-D)からなる。この4αヘリ
ックスバンドルは「共通のサイトカインフォールド」として知られ、IL-2、IL-4
、GM-CSF及び M-CSFについても報告されている。しかし、これらは全てモノマー
で、 D-ヘリックスが正反対のモノマーの4αヘリックスモチーフを完成している
ホモダイマー-構造は、IL5に独特である。 天然のモノマーは、単独で生物学的に不活性であることが分かっている(レビ
ュウにはCallard & Gearing, 1994; Takutsuら、1997参照)。それにもかかわら
ず、ループ3に8つのアミノ酸残基をさらに挿入し、ヘリックスC及びDを連結する
ことにより、修飾した組換えの生物学的に活性なモノマーを調製することができ
る。これにより、1つのポリペプチド鎖内でヘリックスDが4つのヘリックス構造
を完成することができ、この結果モノマーをその受容体と相互作用させることが
できる(Dickason & Huston, 1996; Dickasonら、1996)。
決定されている(Milburnら、1993)。2つのモノマーは、非平行な様式で構成され
、2つの鎖内ジスルフィド架橋(44-87'及び87-44')によって共有結合されており
、これにより2つのモノマーについて全部で4つのシステインを確保している。 モノマーの二次構造は、β-シートの2つの短いストレッチを含む3つの架橋領
域(ループ)によって中断される4つのα-ヘリックス(A-D)からなる。この4αヘリ
ックスバンドルは「共通のサイトカインフォールド」として知られ、IL-2、IL-4
、GM-CSF及び M-CSFについても報告されている。しかし、これらは全てモノマー
で、 D-ヘリックスが正反対のモノマーの4αヘリックスモチーフを完成している
ホモダイマー-構造は、IL5に独特である。 天然のモノマーは、単独で生物学的に不活性であることが分かっている(レビ
ュウにはCallard & Gearing, 1994; Takutsuら、1997参照)。それにもかかわら
ず、ループ3に8つのアミノ酸残基をさらに挿入し、ヘリックスC及びDを連結する
ことにより、修飾した組換えの生物学的に活性なモノマーを調製することができ
る。これにより、1つのポリペプチド鎖内でヘリックスDが4つのヘリックス構造
を完成することができ、この結果モノマーをその受容体と相互作用させることが
できる(Dickason & Huston, 1996; Dickasonら、1996)。
【０００５】 IL5受容体は主として好酸球に存在し、α-鎖とβ-鎖とからなる。受容体のα-
鎖はIL5に特異的で、高度な結合親和性とシグナル変換を確保するβ-鎖はIL-3及
びGM-CSFのヘテロ-ダイマー受容体と共有されている。受容体成分の共有は、IL5
、IL-3及びGM-CSFとのあいだにみられる交差競合の原因である可能性がある(レ
ビュウには、Lopezら、1992参照)。しかし、近年、IL5RのレギュレーションはIL
-3R及びGM-CSFRのレギュレーションとは別個であり、さらに好酸球応答のレギュ
レーションにおけるIL5の役割は高度に特化されていることが示された(Wangら、
1998)。 IL5のC-末端部分は、IL5Rへの結合と生物学的活性の双方において重要であると
思われる。というのは、2つ以上のC-末端アミノ酸残基の除去は、IL5 Rに対する
結合親和性及びIL5バイオアッセイにおける生物学的活性の双方を低下させるか
らである(Proudfootら、1996)。他の残基は受容体への結合に重要であることも
分かっており、例えばGlu12はβ-鎖への結合に関与するが、Arg90及びGlu109残
基は受容体のα-鎖への結合に関与している。一般に、IL5Rへの結合は、ヘリッ
クスA 及びDの重複領域で生じると思われるが、ヘリックスD は主として特異的
なIL5R α-鎖への結合の原因である(Graberら、1995; Takastsuら、 1997)。
鎖はIL5に特異的で、高度な結合親和性とシグナル変換を確保するβ-鎖はIL-3及
びGM-CSFのヘテロ-ダイマー受容体と共有されている。受容体成分の共有は、IL5
、IL-3及びGM-CSFとのあいだにみられる交差競合の原因である可能性がある(レ
ビュウには、Lopezら、1992参照)。しかし、近年、IL5RのレギュレーションはIL
-3R及びGM-CSFRのレギュレーションとは別個であり、さらに好酸球応答のレギュ
レーションにおけるIL5の役割は高度に特化されていることが示された(Wangら、
1998)。 IL5のC-末端部分は、IL5Rへの結合と生物学的活性の双方において重要であると
思われる。というのは、2つ以上のC-末端アミノ酸残基の除去は、IL5 Rに対する
結合親和性及びIL5バイオアッセイにおける生物学的活性の双方を低下させるか
らである(Proudfootら、1996)。他の残基は受容体への結合に重要であることも
分かっており、例えばGlu12はβ-鎖への結合に関与するが、Arg90及びGlu109残
基は受容体のα-鎖への結合に関与している。一般に、IL5Rへの結合は、ヘリッ
クスA 及びDの重複領域で生じると思われるが、ヘリックスD は主として特異的
なIL5R α-鎖への結合の原因である(Graberら、1995; Takastsuら、 1997)。
【０００６】他のタンパク質に対するIL5のホモロジー ホモダイマーに見られる2つの4-ヘリックスドメインモチーフは、GM-CSF及びM
-CSF、IL-2、IL-4及びヒトならびにブタの成長ホルモンに見られるサイトカイン
フォールドと比較して際立って類似した二次構造と三次構造を有する(Milburnら
、1993)。しかし、IL-2、IL-4及びGM-CSFの系統発生学的な関係を示唆する著し
い類似性がイントロン/エキソンの組織ならびにシステインの位置にも認められ
たとしても(Tanabeら、1987; Cambellら、1988)、これらの又は他のサイトカイ
ンのいずれかとの著しいホモロジーは、アミノ酸配列からは認められない。
-CSF、IL-2、IL-4及びヒトならびにブタの成長ホルモンに見られるサイトカイン
フォールドと比較して際立って類似した二次構造と三次構造を有する(Milburnら
、1993)。しかし、IL-2、IL-4及びGM-CSFの系統発生学的な関係を示唆する著し
い類似性がイントロン/エキソンの組織ならびにシステインの位置にも認められ
たとしても(Tanabeら、1987; Cambellら、1988)、これらの又は他のサイトカイ
ンのいずれかとの著しいホモロジーは、アミノ酸配列からは認められない。
【０００７】IL5の生物学的活性 IL5は、主として十分に分化したTh2細胞、乳房細胞及び好酸球によって分泌さ
れる(Cousinsら、1994; Takutsuら、1997)。それは、好酸球、好塩基球、細胞毒
性Tリンパ球ならびにマウスB細胞で作用することが分かっている(Callard & Gea
ring, 1994; Takutsuら、1997)。ヒトB細胞に対するIL5の作用は、依然として論
議課題である。ある環境下における免疫グロブリン合成の増強及び種々のヒトB
細胞系への結合が、立証されている。hIL5RについてのmRNAがヒトB-細胞で認め
られていても、これらの細胞に対する受容体の実際的な存在は依然として確認し
なければいけない(Baumann & Paul, 1997; Hustonら、1996)。 好酸球に対するIL5の作用には、走化性、内皮細胞に対する付着の増強、細胞
の活性化及び最終的な分化が含まれる。さらに、IL5は成熟好酸球をアポトーシ
スから妨げることが立証されている(Yamaguchiら、1991)。これらの知見は、好
酸球の分化にもっとも重要なサイトカインであるとのIL5に関する現在の考えに
寄与している(Corrigan & Kay, 1996; Karlenら、1998)。
れる(Cousinsら、1994; Takutsuら、1997)。それは、好酸球、好塩基球、細胞毒
性Tリンパ球ならびにマウスB細胞で作用することが分かっている(Callard & Gea
ring, 1994; Takutsuら、1997)。ヒトB細胞に対するIL5の作用は、依然として論
議課題である。ある環境下における免疫グロブリン合成の増強及び種々のヒトB
細胞系への結合が、立証されている。hIL5RについてのmRNAがヒトB-細胞で認め
られていても、これらの細胞に対する受容体の実際的な存在は依然として確認し
なければいけない(Baumann & Paul, 1997; Hustonら、1996)。 好酸球に対するIL5の作用には、走化性、内皮細胞に対する付着の増強、細胞
の活性化及び最終的な分化が含まれる。さらに、IL5は成熟好酸球をアポトーシ
スから妨げることが立証されている(Yamaguchiら、1991)。これらの知見は、好
酸球の分化にもっとも重要なサイトカインであるとのIL5に関する現在の考えに
寄与している(Corrigan & Kay, 1996; Karlenら、1998)。
【０００８】 生理学的には、IL5とその関連する好酸球の活性化は、蠕虫感染、可能性ある
場合にはある種の腫瘍に対して保護的な役割を果たすと考えられる。なぜなら、
これらの疾患は、一般に末梢血液の好酸球増加を伴うからである(Takutsuら、19
97; Sandersonら、1992)。しかし、それは、2つの研究で、これらの寄生体に感
染したマウスでIL5に対する抗体投与後のNippostrongylus braziliensis 又は S
chistosoma mansoniに対する免疫(例えばIgEレベル)の好酸球のダウン-レギュレ
ーションのほかに、著者らがいかなる作用も示していないので、幾分推論的であ
る(Sherら、1990; Coffmanら、1989)。
場合にはある種の腫瘍に対して保護的な役割を果たすと考えられる。なぜなら、
これらの疾患は、一般に末梢血液の好酸球増加を伴うからである(Takutsuら、19
97; Sandersonら、1992)。しかし、それは、2つの研究で、これらの寄生体に感
染したマウスでIL5に対する抗体投与後のNippostrongylus braziliensis 又は S
chistosoma mansoniに対する免疫(例えばIgEレベル)の好酸球のダウン-レギュレ
ーションのほかに、著者らがいかなる作用も示していないので、幾分推論的であ
る(Sherら、1990; Coffmanら、1989)。
【０００９】IL5のトランスジェニック及び「ノック-アウト」動物 IL5を発現するトランスジェニックマウス又はIL5を欠損しているノック-アウ
トマウスの研究は、IL5の生理学的な役割についてさらに知見を示している。 幾つかのIL5トランスジェニックマウスが報告されている: T細胞でIL5遺伝子を発現するトランスジェニックマウスは、B220+ Bリンパ球
の拡張によって特徴付けられる白血球レベルを増強し、かつ十分な好酸球増加を
有することが報告された。これは、好酸球によって支配される、広範囲に及ぶ腹
腔細胞滲出及びほとんど全ての器官系での好酸球の浸潤を伴う(Leeら、 1997a)
。 メタロチオニンプロモーター制御下でIL5遺伝子を発現する別のトランスジェ
ニックマウスは、IgM及びIgAの血清レベルでの増加、末梢血液及び特徴的なCD5
＋B細胞群(自己抗体を産生する)の拡張を伴う多くの他の器官での広範囲に及ぶ
好酸球増加によって特徴付けられた(Tominagaら、1991)。
トマウスの研究は、IL5の生理学的な役割についてさらに知見を示している。 幾つかのIL5トランスジェニックマウスが報告されている: T細胞でIL5遺伝子を発現するトランスジェニックマウスは、B220+ Bリンパ球
の拡張によって特徴付けられる白血球レベルを増強し、かつ十分な好酸球増加を
有することが報告された。これは、好酸球によって支配される、広範囲に及ぶ腹
腔細胞滲出及びほとんど全ての器官系での好酸球の浸潤を伴う(Leeら、 1997a)
。 メタロチオニンプロモーター制御下でIL5遺伝子を発現する別のトランスジェ
ニックマウスは、IgM及びIgAの血清レベルでの増加、末梢血液及び特徴的なCD5
＋B細胞群(自己抗体を産生する)の拡張を伴う多くの他の器官での広範囲に及ぶ
好酸球増加によって特徴付けられた(Tominagaら、1991)。
【００１０】 第三の研究は、肺でIL5を本質的に発現するトランスジェニックマウスに関す
るものであった。これらの動物は、気管支周囲空間の好酸球の浸潤、上皮肥大及
び粘液産生の増加を含む、ヒトの喘息に似た異常生理学上の変化を顕した。さら
に、気道の応答過敏の発症が、抗原の不在下で認められた(Leeら、1997b)。 IL5-欠損マウス(「ノック-アウト」マウス)も、研究された。これらのマウス(
C57BL/6)は疾患の明らかな徴候がなく、繁殖力がある。免疫グロブリンレベル及
びDNP-OVAに対する特異的な抗体応答は、正常だった。基底レベルの好酸球は産
生されるが、対照動物でのレベルよりも2〜3倍低かった。これは、好酸球がIL5
の完全な不在下で産生され得ることを示している。これらのマウスがMesocestoi
des cortiで感染した場合、通常認められる好酸球増加は完全に解消した。好酸
球増加がないことは、この寄生体によって生じる虫の悩みに影響を及ぼさなかっ
た(Kopfら、1996)。 Fosterらによる研究(1996)で、一般的なモデルのアトピー性気道炎症に対する
IL5ノック-アウトの作用が研究された。オバルブミンでのマウスの感作と噴霧攻
撃(aerosol challenge)は、気道の好酸球増加、β-メタコリンに対する気道の活
性亢進及び喘息にみられるものに似た広範囲に及ぶ肺の損傷を生じる。IL5欠損
マウスでは、好酸球増加、気道の活性亢進及び肺損傷がなかった。これらのマウ
スでのIL5発現が再構築される場合には、気道-アレルゲン誘発性の好酸球増加及
び気道機能不全が復活した。
るものであった。これらの動物は、気管支周囲空間の好酸球の浸潤、上皮肥大及
び粘液産生の増加を含む、ヒトの喘息に似た異常生理学上の変化を顕した。さら
に、気道の応答過敏の発症が、抗原の不在下で認められた(Leeら、1997b)。 IL5-欠損マウス(「ノック-アウト」マウス)も、研究された。これらのマウス(
C57BL/6)は疾患の明らかな徴候がなく、繁殖力がある。免疫グロブリンレベル及
びDNP-OVAに対する特異的な抗体応答は、正常だった。基底レベルの好酸球は産
生されるが、対照動物でのレベルよりも2〜3倍低かった。これは、好酸球がIL5
の完全な不在下で産生され得ることを示している。これらのマウスがMesocestoi
des cortiで感染した場合、通常認められる好酸球増加は完全に解消した。好酸
球増加がないことは、この寄生体によって生じる虫の悩みに影響を及ぼさなかっ
た(Kopfら、1996)。 Fosterらによる研究(1996)で、一般的なモデルのアトピー性気道炎症に対する
IL5ノック-アウトの作用が研究された。オバルブミンでのマウスの感作と噴霧攻
撃(aerosol challenge)は、気道の好酸球増加、β-メタコリンに対する気道の活
性亢進及び喘息にみられるものに似た広範囲に及ぶ肺の損傷を生じる。IL5欠損
マウスでは、好酸球増加、気道の活性亢進及び肺損傷がなかった。これらのマウ
スでのIL5発現が再構築される場合には、気道-アレルゲン誘発性の好酸球増加及
び気道機能不全が復活した。
【００１１】IL5の異常生理学上の役割 喘息は世界人口の約10％に影響を及ぼしており、いまだ原因が不明であるため
に、発症と罹患が過去20年にわたって増加している(Ortega & Busse, 1997)。そ
れは、再発性で通常は可逆性の気流閉塞、炎症及び活性亢進によって特徴付けら
れる慢性の気道疾患である(Moxam及びCostello, 1990)。これは、ゼイゼイする
症状と息切れを生じ、深刻な場合には死に至らしめ得る。 肺でIL5を構造的に発現するトランスジェニックマウス(Leeら、1997a)及びIL5
欠損「ノック-アウト」マウス(Fosterら、1996) を用いる上記で言及した動物実
験は、喘息の病因におけるIL5の重要な役割に多大な影響を与えている。さらに
、喘息をもつ個体を含む幾つかの研究から、これを支持する証拠を導くことがで
きる。 好酸球増加は、喘息及び関連する重篤な疾患患者の気管支の肺胞洗浄(BAL)液
及び気管支粘膜の生検で同定されている。幾つかの好酸球生成物は、喘息患者の
BAL液及び喘息の重篤度に関連する多数の末梢血液の好酸球で同定されている(Or
tega & Busse 1997)。
に、発症と罹患が過去20年にわたって増加している(Ortega & Busse, 1997)。そ
れは、再発性で通常は可逆性の気流閉塞、炎症及び活性亢進によって特徴付けら
れる慢性の気道疾患である(Moxam及びCostello, 1990)。これは、ゼイゼイする
症状と息切れを生じ、深刻な場合には死に至らしめ得る。 肺でIL5を構造的に発現するトランスジェニックマウス(Leeら、1997a)及びIL5
欠損「ノック-アウト」マウス(Fosterら、1996) を用いる上記で言及した動物実
験は、喘息の病因におけるIL5の重要な役割に多大な影響を与えている。さらに
、喘息をもつ個体を含む幾つかの研究から、これを支持する証拠を導くことがで
きる。 好酸球増加は、喘息及び関連する重篤な疾患患者の気管支の肺胞洗浄(BAL)液
及び気管支粘膜の生検で同定されている。幾つかの好酸球生成物は、喘息患者の
BAL液及び喘息の重篤度に関連する多数の末梢血液の好酸球で同定されている(Or
tega & Busse 1997)。
【００１２】 IL5血清濃度は、対照被験者と比較して慢性的で深刻な喘息患者の29人中15人
で上昇(平均濃度150pg/ml)することが認められた(Alexanderら、1994)。 非アトピー性及びアトピー性両方の喘息を含む別の研究では、ヘルパーT細胞
によるIL5産生の増加は、アトピー性及び非アトピー性両方の喘息に関し好酸球
増加の炎症を引起こしているものと認められた(Moriら、1997)。 また、他の結果は、IL5が他のアトピー性疾患で独特な役割を有していること
を示している。アレルギー性鼻炎を有する個体におけるアレルゲン誘発性の全身
性エピソードは、IgEよりむしろアレルゲン誘発性IL5合成に相関していることが
最近示されている(Ohashiら、1998)。アトピー性反応の相関関係はBarataら (19
98)による研究でも立証されており、ここでは皮膚の後期相反応におけるT-細胞
によるIL5の著しい発現が認められている。 これらの結果と他の結果により、Corrigan & Kay (1996)、Danzig & Cuss (19
97)のような数人の著者らが、喘息及び好酸球炎症を伴うアトピー性疾患のより
良好な治療の開発における一次的な標的としてIL5を同定し、推奨するに至って
いる。寄生体感染で誘発される慢性的な組織損傷性の好酸球増加亢進、局所的な
肺の好酸球増加及び好酸球増加亢進症状は、IL5ダウン-レギュレーションによっ
て指向される他の病状の一例である。
で上昇(平均濃度150pg/ml)することが認められた(Alexanderら、1994)。 非アトピー性及びアトピー性両方の喘息を含む別の研究では、ヘルパーT細胞
によるIL5産生の増加は、アトピー性及び非アトピー性両方の喘息に関し好酸球
増加の炎症を引起こしているものと認められた(Moriら、1997)。 また、他の結果は、IL5が他のアトピー性疾患で独特な役割を有していること
を示している。アレルギー性鼻炎を有する個体におけるアレルゲン誘発性の全身
性エピソードは、IgEよりむしろアレルゲン誘発性IL5合成に相関していることが
最近示されている(Ohashiら、1998)。アトピー性反応の相関関係はBarataら (19
98)による研究でも立証されており、ここでは皮膚の後期相反応におけるT-細胞
によるIL5の著しい発現が認められている。 これらの結果と他の結果により、Corrigan & Kay (1996)、Danzig & Cuss (19
97)のような数人の著者らが、喘息及び好酸球炎症を伴うアトピー性疾患のより
良好な治療の開発における一次的な標的としてIL5を同定し、推奨するに至って
いる。寄生体感染で誘発される慢性的な組織損傷性の好酸球増加亢進、局所的な
肺の好酸球増加及び好酸球増加亢進症状は、IL5ダウン-レギュレーションによっ
て指向される他の病状の一例である。
【００１３】IL5の役割についてのインビボでの立証 喘息のげっし動物モデルでの幾つかの研究において、IL5に対するモノクロー
ナル抗体(抗-IL5 mAb)での治療は、非治療の対照と比較して用量-関連性の好酸
球増加阻害を生じることが示されている(Nagaiら、1993a & b; Chandら、1992;
Coeffierら、1994; Kungら、1995; Underwoodら、1996)。Nagaiら(1993a)の研究
では、可溶性のIL5受容体αを用いて感作したBalb/cマウスを処理することでも
作用が認められた。 Balb/cマウスを用いるある研究(Hamelmannら、1997)及びモルモットを用いる4
つの研究では、抗-IL5 mAbが、抗原感作動物において種々の物質で引き出される
気道の反応亢進を阻害しうることをさらに示した(Mauserら、1993; Akutsuら、1
995; van Oosterhoutら、1995 & 1993)。幾つかの研究では、抗-IL5 mAb処理の
有用な作用(表1参照)は、顕微鏡的にも認められた(Mauserら、1993; Akutsuら、
1995; Kungら、1995)。重要なことに、Kungらの研究(1995)では、B6D2F1マウス
における肺炎症の減少が、抗原攻撃の数時間前に抗-IL5 mAbを投与した場合及び
抗原攻撃から5日後まで投与した場合の双方で認められた。これは、抗-IL5 mAb
の作用が気道炎症に予防性かつ治療性であり得ることを示している。しかし、こ
の作用は、Underwoodらによれば、抗原攻撃から2時間後にモルモットに抗-IL5 m
Abを与えた場合には認められなかった(Underwoodら、1996)。
ナル抗体(抗-IL5 mAb)での治療は、非治療の対照と比較して用量-関連性の好酸
球増加阻害を生じることが示されている(Nagaiら、1993a & b; Chandら、1992;
Coeffierら、1994; Kungら、1995; Underwoodら、1996)。Nagaiら(1993a)の研究
では、可溶性のIL5受容体αを用いて感作したBalb/cマウスを処理することでも
作用が認められた。 Balb/cマウスを用いるある研究(Hamelmannら、1997)及びモルモットを用いる4
つの研究では、抗-IL5 mAbが、抗原感作動物において種々の物質で引き出される
気道の反応亢進を阻害しうることをさらに示した(Mauserら、1993; Akutsuら、1
995; van Oosterhoutら、1995 & 1993)。幾つかの研究では、抗-IL5 mAb処理の
有用な作用(表1参照)は、顕微鏡的にも認められた(Mauserら、1993; Akutsuら、
1995; Kungら、1995)。重要なことに、Kungらの研究(1995)では、B6D2F1マウス
における肺炎症の減少が、抗原攻撃の数時間前に抗-IL5 mAbを投与した場合及び
抗原攻撃から5日後まで投与した場合の双方で認められた。これは、抗-IL5 mAb
の作用が気道炎症に予防性かつ治療性であり得ることを示している。しかし、こ
の作用は、Underwoodらによれば、抗原攻撃から2時間後にモルモットに抗-IL5 m
Abを与えた場合には認められなかった(Underwoodら、1996)。
【００１４】 喘息のサルのモデルを用いる研究では、Mauserら(1995)が、抗原攻撃の1時間
前にラット抗マウス-IL5 mAbを与えた場合の、抗原攻撃後の気道の反応亢進阻害
を報告した。さらに、非処理対照と比較して、抗体処理した動物の気管支肺胞洗
浄(BAL)における好酸球数は75%低下した。好酸球増加及び反応性亢進に対する抗
-IL5 mAbの作用は、処理後3ヶ月まで認められた(Mauserら、1995)。アレルギー
性反応性亢進に関して、Nagaiらによる研究(1993a 及び1993b)結果は、BAL中の
好酸球数の低下に関連した反応性亢進の低下はないことを証明している。 これまでに述べた抗-IL5 mAbインビボ実験は、全てラット-抗-マウス モノク
ローナル抗体を用いて行われている。Eganら(1995)は、Sch 55700と呼ばれる、
ヒト化ラット-抗-ヒトIL5モノクローナル抗体を用いる実験を報告している。こ
れらのmAbsは、感作したサルに投与した場合に0.3mg/kg用量で75%まで肺洗浄好
酸球増加を阻害した。Sch 55700をアレルギー性マウスに1 mg/kgで与えた場合は
、気道の好酸球増加の阻害も認められた。
前にラット抗マウス-IL5 mAbを与えた場合の、抗原攻撃後の気道の反応亢進阻害
を報告した。さらに、非処理対照と比較して、抗体処理した動物の気管支肺胞洗
浄(BAL)における好酸球数は75%低下した。好酸球増加及び反応性亢進に対する抗
-IL5 mAbの作用は、処理後3ヶ月まで認められた(Mauserら、1995)。アレルギー
性反応性亢進に関して、Nagaiらによる研究(1993a 及び1993b)結果は、BAL中の
好酸球数の低下に関連した反応性亢進の低下はないことを証明している。 これまでに述べた抗-IL5 mAbインビボ実験は、全てラット-抗-マウス モノク
ローナル抗体を用いて行われている。Eganら(1995)は、Sch 55700と呼ばれる、
ヒト化ラット-抗-ヒトIL5モノクローナル抗体を用いる実験を報告している。こ
れらのmAbsは、感作したサルに投与した場合に0.3mg/kg用量で75%まで肺洗浄好
酸球増加を阻害した。Sch 55700をアレルギー性マウスに1 mg/kgで与えた場合は
、気道の好酸球増加の阻害も認められた。
【００１５】現在及び将来的な喘息の治療 喘息の現在の治療は、上記のようにコルチコステロイドである。これは、その
抗炎症作用により、もっとも強力な医薬である。この他、いずれもが気管支拡張
を引起こすβ2アゴニスト及びメチルキサンチン誘導体及び肥満細胞を「安定化
」するクロモグリケートジナトリウムが媒介物の放出を防止し、全てが喘息患者
で有用であることが分かっている(Ortega & Busse 1997)。 喘息の将来的な治療は、上記のように抗-IL5 mAbsを含む可能性がある。Cellt
echは、Schering Ploughと協力して、抗-IL5 mAbを喘息治療のフェーズI臨床試
験に供している。しかし、モノクローナル抗体を用いる治療は、幾つかの欠点を
伴う。まず最初に、安全なmAB (例えばヒト化mAB)の開発と生産費用は非常に高
く、最終的な使用者には高価な治療品となる。第二に、mABは、比較的短い間隔
で投与しなければならないという患者の観点からみれば不利な特徴がある。第三
に、本来、mABは抗原の1つのエピトープに狭い特異性を示す。そして、最後にmA
Bは(ヒト化したものでさえ)免疫原性で、処置が進行するにつれて投与した抗体
に関しますます迅速な不活性化をもたらす。
抗炎症作用により、もっとも強力な医薬である。この他、いずれもが気管支拡張
を引起こすβ2アゴニスト及びメチルキサンチン誘導体及び肥満細胞を「安定化
」するクロモグリケートジナトリウムが媒介物の放出を防止し、全てが喘息患者
で有用であることが分かっている(Ortega & Busse 1997)。 喘息の将来的な治療は、上記のように抗-IL5 mAbsを含む可能性がある。Cellt
echは、Schering Ploughと協力して、抗-IL5 mAbを喘息治療のフェーズI臨床試
験に供している。しかし、モノクローナル抗体を用いる治療は、幾つかの欠点を
伴う。まず最初に、安全なmAB (例えばヒト化mAB)の開発と生産費用は非常に高
く、最終的な使用者には高価な治療品となる。第二に、mABは、比較的短い間隔
で投与しなければならないという患者の観点からみれば不利な特徴がある。第三
に、本来、mABは抗原の1つのエピトープに狭い特異性を示す。そして、最後にmA
Bは(ヒト化したものでさえ)免疫原性で、処置が進行するにつれて投与した抗体
に関しますます迅速な不活性化をもたらす。
【００１６】 アンチセンス治療のためのアンチセンスIL5オリゴヌクレオチドの使用は、喘
息、アレルギー及び炎症の治療用にHybridon社によっても提案されている。しか
し、アンチセンス技術は技術的に難しいことが分かっており、実際、ヒトにおけ
るアンチセンス治療の可能性に関する決定的な確証は依然として確立されていな
い。 最後に、WO 97/45448 (Bresagen Limited / Medvet Science)は、IL5の天然型
又は突然変異型によって引き起こされる異常作用を改善、緩和あるいは低下させ
る「IL5の活性に拮抗し得る修飾及び変異型のIL5分子」の使用を提案している。
拮抗作用は、IR5Rの低親和性α鎖に結合するが、高親和性受容体には結合しない
変異型IL5の結果であると報告されている。こうして、変異型は、生理学上のIL5
の作用を発揮せずにその受容体に結合するためIL5と競合している。
息、アレルギー及び炎症の治療用にHybridon社によっても提案されている。しか
し、アンチセンス技術は技術的に難しいことが分かっており、実際、ヒトにおけ
るアンチセンス治療の可能性に関する決定的な確証は依然として確立されていな
い。 最後に、WO 97/45448 (Bresagen Limited / Medvet Science)は、IL5の天然型
又は突然変異型によって引き起こされる異常作用を改善、緩和あるいは低下させ
る「IL5の活性に拮抗し得る修飾及び変異型のIL5分子」の使用を提案している。
拮抗作用は、IR5Rの低親和性α鎖に結合するが、高親和性受容体には結合しない
変異型IL5の結果であると報告されている。こうして、変異型は、生理学上のIL5
の作用を発揮せずにその受容体に結合するためIL5と競合している。
【００１７】 好酸球炎症を伴う他のアトピー性疾患は、喘息について挙げられる徴候又はア
レルゲン抽出物での低感作を用いる免疫治療(IT)のいずれかで治療される。後者
のタイプの治療は、1つか少数の抗原に対するアレルギーに有効であることが知
られているが、ITは複数のアレルギーの治療には可能性がない。さらに、治療に
感受性の患者では臨床的な改善を生じる時間スケールは、従来のITに対して極め
て長い。 したがって、喘息のような慢性のアレルギー性疾患に対する既存の治療及び将
来的に可能性ある治療にもかかわらず、喘息及び他の慢性的なアレルギー性疾患
を治療し、改善する代替的な方法が明らかに求められている。
レルゲン抽出物での低感作を用いる免疫治療(IT)のいずれかで治療される。後者
のタイプの治療は、1つか少数の抗原に対するアレルギーに有効であることが知
られているが、ITは複数のアレルギーの治療には可能性がない。さらに、治療に
感受性の患者では臨床的な改善を生じる時間スケールは、従来のITに対して極め
て長い。 したがって、喘息のような慢性のアレルギー性疾患に対する既存の治療及び将
来的に可能性ある治療にもかかわらず、喘息及び他の慢性的なアレルギー性疾患
を治療し、改善する代替的な方法が明らかに求められている。
【００１８】発明の目的 この発明の目的は、好酸球増加で特徴付けられる慢性的なアレルギー性症状(
例えば喘息)に対する新規な治療を提供することである。さらに、喘息及び慢性
的な気道炎症を伴う他の病理的疾患用の新規な治療を得るために、IL5に対する
自家ワクチンを開発することが、目的である。
例えば喘息)に対する新規な治療を提供することである。さらに、喘息及び慢性
的な気道炎症を伴う他の病理的疾患用の新規な治療を得るために、IL5に対する
自家ワクチンを開発することが、目的である。
【００１９】発明の要約 T-細胞由来サイトカインIL5は、上記のように、好酸球の産生、局在化及び活
性化に影響を及ぼす好酸球応答の組織化において重要な役割を有する。IL5が保
護免疫応答の発生において中心的な役割を有することは報告されていないが、こ
の特殊なサイトカインは、発明者らの見解では、喘息治療の魅力的な治療ターゲ
ットである。 この発明による全体的な目的は、IL5レベルのダウン−レギュレートによって
喘息患者の気道における好酸球の発病レベルを低下させることである。というの
は、好酸球は、誘引(attraction)及び活性化のためにIL5に依存しているからで
ある。気道粘膜中の好酸球数が減少した結果、付随して気道の炎症が減少し、喘
息患者において相当する臨床的な改善がみられるであろう。 このようなアプローチの可能性は、気道炎症の動物モデルにおける抗IL5モノ
クローナル抗体を用いる研究で既に立証されている("実施例序文"参照)。
性化に影響を及ぼす好酸球応答の組織化において重要な役割を有する。IL5が保
護免疫応答の発生において中心的な役割を有することは報告されていないが、こ
の特殊なサイトカインは、発明者らの見解では、喘息治療の魅力的な治療ターゲ
ットである。 この発明による全体的な目的は、IL5レベルのダウン−レギュレートによって
喘息患者の気道における好酸球の発病レベルを低下させることである。というの
は、好酸球は、誘引(attraction)及び活性化のためにIL5に依存しているからで
ある。気道粘膜中の好酸球数が減少した結果、付随して気道の炎症が減少し、喘
息患者において相当する臨床的な改善がみられるであろう。 このようなアプローチの可能性は、気道炎症の動物モデルにおける抗IL5モノ
クローナル抗体を用いる研究で既に立証されている("実施例序文"参照)。
【００２０】 しかし、まさにこの発明は、自家ワクチン化の概念により活性な免疫応答を生
じるアプローチをさらに用いることで、受動性免疫化の一工程を介して得られた
結果に由来する。発明者の知る限り、このようなアプローチはこれまでに提案さ
れていない。 コルチコステロイドなどでの現在の治療と比較して、IL5自家ワクチンを用い
る喘息治療の利点は、副作用の減少及び/又は除去、ならびに最も見込みのある
持続期間に関するより良好な効果である。抗-IL5 mAbsと比較すると、誘発され
るポリクローナルAb応答の作用は、受動注射したモノクローナル免疫グロブリン
より優れているものと予想される。というのは、ポリクローナル応答は、より広
い特異性を有するからである。投与管理に関する改善も予想される(なぜなら、
ここに記載する有効な自家ワクチンは一般に1年当たり最大2〜6回の投与を要す
るであろうからである)。 低感作化と比較すると、この発明は、非特異的という魅力的な面を持っている
。これは、複数のアレルギーを持つ患者の治療の際に特に関連性がある。
じるアプローチをさらに用いることで、受動性免疫化の一工程を介して得られた
結果に由来する。発明者の知る限り、このようなアプローチはこれまでに提案さ
れていない。 コルチコステロイドなどでの現在の治療と比較して、IL5自家ワクチンを用い
る喘息治療の利点は、副作用の減少及び/又は除去、ならびに最も見込みのある
持続期間に関するより良好な効果である。抗-IL5 mAbsと比較すると、誘発され
るポリクローナルAb応答の作用は、受動注射したモノクローナル免疫グロブリン
より優れているものと予想される。というのは、ポリクローナル応答は、より広
い特異性を有するからである。投与管理に関する改善も予想される(なぜなら、
ここに記載する有効な自家ワクチンは一般に1年当たり最大2〜6回の投与を要す
るであろうからである)。 低感作化と比較すると、この発明は、非特異的という魅力的な面を持っている
。これは、複数のアレルギーを持つ患者の治療の際に特に関連性がある。
【００２１】 つまり、その最も広くかつもっとも一般的な範囲で、この発明は、 - インターロイキン5 (IL5)ポリペプチド又はそのサブ配列での動物の免疫化で
IL5ポリペプチドに対する抗体産生を誘発するように処方された、少なくとも1つ
のIL5ポリペプチド又はそのサブ配列、及び/又は - IL5アミノ酸配列に少なくとも1つの修飾が導入されている少なくとも1つの I
L5類似体であって、この類似体での動物の免疫化により、結果としてIL5ポリペ
プチドに対する抗体産生が誘発される、少なくとも1つの IL5類似体 の免疫学的に有効な量を、ヒトを含む動物の免疫系に提示することからなる、動
物における IL5活性のインビボのダウン-レギュレーション方法に関する。
IL5ポリペプチドに対する抗体産生を誘発するように処方された、少なくとも1つ
のIL5ポリペプチド又はそのサブ配列、及び/又は - IL5アミノ酸配列に少なくとも1つの修飾が導入されている少なくとも1つの I
L5類似体であって、この類似体での動物の免疫化により、結果としてIL5ポリペ
プチドに対する抗体産生が誘発される、少なくとも1つの IL5類似体 の免疫学的に有効な量を、ヒトを含む動物の免疫系に提示することからなる、動
物における IL5活性のインビボのダウン-レギュレーション方法に関する。
【００２２】 このアプローチの最も魅力的な面は、例えば喘息が、抗-IL5又はIL5類似体に
結合親和性を有する分子の投与を伴う治療アプローチに対して、周期的ではある
があまり頻繁ではない免疫化によって制御され得るということである。所望の効
果を得るには、この発明による免疫原性組成物を用いる年1〜4回の注射で十分で
あると思われるが、他のIL5活性阻害剤の投与は、毎日あるいは少なくとも毎週
投与が必要か、そうであるように考えられる。 また、この発明は、IL5類似体ならびにこれらのサブセットをエンコードする
核酸フラグメントに関する。類似体又は核酸フラグメントからなる免疫原性組成
物も、この発明の一部である。 この発明は、IL5類似体の同定方法ならびにIL5類似体からなる組成物の製造方
法にも関する。
結合親和性を有する分子の投与を伴う治療アプローチに対して、周期的ではある
があまり頻繁ではない免疫化によって制御され得るということである。所望の効
果を得るには、この発明による免疫原性組成物を用いる年1〜4回の注射で十分で
あると思われるが、他のIL5活性阻害剤の投与は、毎日あるいは少なくとも毎週
投与が必要か、そうであるように考えられる。 また、この発明は、IL5類似体ならびにこれらのサブセットをエンコードする
核酸フラグメントに関する。類似体又は核酸フラグメントからなる免疫原性組成
物も、この発明の一部である。 この発明は、IL5類似体の同定方法ならびにIL5類似体からなる組成物の製造方
法にも関する。
【００２３】図面の説明 図1: 成熟ヒトIL5のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 1)。アラインしたマウス配列を
含める(SEQ ID NO: 12)が、ヒト配列と異なる位置のみを示す。2つの"*"は、マ
ウスIL5の欠損しているN-末端残基を示す。N-グリコシル化位置を二重下線で示
し、ヒトIL5のO-グリコシル化トレオニンを斜体で示し、システインを太字で示
す。 図2: ヒトIL5のダイマー及びモノマー構造。A: hIL5のダイマー構造。構造は5-
112残基についてのみ得られている。これは、Thr3でO-グリコシル化部位が含ま
れていないことを意味する。B: ヘリックスの割り当て(assignment)を有するAと
同じ構造(A-D 及びA'-D')。C: 明るい灰色で示すmIL5 とは異なるアミノ酸残基
を有するモノマーhIL5。
含める(SEQ ID NO: 12)が、ヒト配列と異なる位置のみを示す。2つの"*"は、マ
ウスIL5の欠損しているN-末端残基を示す。N-グリコシル化位置を二重下線で示
し、ヒトIL5のO-グリコシル化トレオニンを斜体で示し、システインを太字で示
す。 図2: ヒトIL5のダイマー及びモノマー構造。A: hIL5のダイマー構造。構造は5-
112残基についてのみ得られている。これは、Thr3でO-グリコシル化部位が含ま
れていないことを意味する。B: ヘリックスの割り当て(assignment)を有するAと
同じ構造(A-D 及びA'-D')。C: 明るい灰色で示すmIL5 とは異なるアミノ酸残基
を有するモノマーhIL5。
【００２４】 図3: 適当な置換領域を示す、アラインした成熟ヒトIL5 (hIL5)及びマウスIL5
(mIL5) アミノ酸配列(SEQ ID NOs: 1 及び12)。4つのα-ヘリックスA-Dは、連
続した線のボックスで囲み、β-シートは二重下線、2つのシステインの位置は"
▼"で示している。2つの配列に同一の残基は"-" で、同一でない残基は"*"で示
す。ループ1はヘリックスAとBに及んでおり、ループ2はヘリックスBとCに及んで
おり、ループ3はループCとDに及んでいる。ペプチドを含む外来THエピトープで
置換されるアミノ酸配列は、太字で示す。そのような配列は、残基が異なる構築
物で置換される残基と重複しているために、点線のボックスで囲んでいる。10個
の構築物(ヒト由来の5つ及びマウスIL5由来の5つ)のアミノ酸配列を、SEQ ID NO
s: 2-11及び13-22に示す。
(mIL5) アミノ酸配列(SEQ ID NOs: 1 及び12)。4つのα-ヘリックスA-Dは、連
続した線のボックスで囲み、β-シートは二重下線、2つのシステインの位置は"
▼"で示している。2つの配列に同一の残基は"-" で、同一でない残基は"*"で示
す。ループ1はヘリックスAとBに及んでおり、ループ2はヘリックスBとCに及んで
おり、ループ3はループCとDに及んでいる。ペプチドを含む外来THエピトープで
置換されるアミノ酸配列は、太字で示す。そのような配列は、残基が異なる構築
物で置換される残基と重複しているために、点線のボックスで囲んでいる。10個
の構築物(ヒト由来の5つ及びマウスIL5由来の5つ)のアミノ酸配列を、SEQ ID NO
s: 2-11及び13-22に示す。
【００２５】 図4: 2つのmIL5自家ワクチンDNAワクチンを試験するDNA免疫化のELISAの結果。
オバルブミン、mIL5wt、mIL5.1 又はmIL5.5のいずれかをエンコードする裸のプ
ラスミドDNAを用いて、マウスをDNAワクチン化した。77日目に得られた血清を、
オバルブミン及びマウスIL5に対する反応性について試験した。ポリスチレンマ
イクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)を、オバルブミン(1μg/ウエル、Sigm
a)又は精製組換えマウスIL5 (0.1 μg/ウエル、E1320)でコートした。ウエルに
加えた希釈血清の反応性を、ヤギ抗-マウス二次抗体を用いて可視化した。プレ
ブリードの OD490示数を試験試料のOD490示数から控除し、得られた値をバー(ba
r)として個々のマウスそれぞれに示した。プレブリードのOD490示数(1:25希釈)
は、0.025-0.034の範囲であった。十字架は、死亡した動物を示す。 図5: マウスIL5ベースの自家ワクチン構築物ベースの概略図。上の図は、ヘリ
ックスA-C、ループ1-3及び可変性C-末端領域を有するマウスの野生型IL5モノマ
ーを示す。残りの図は、種々の位置で破傷風トキソイドエピトープP2及びP30が
内部で置換された種々の自家ワクチン構築物を示す。詳細な構築物は、実施例に
詳述する。
オバルブミン、mIL5wt、mIL5.1 又はmIL5.5のいずれかをエンコードする裸のプ
ラスミドDNAを用いて、マウスをDNAワクチン化した。77日目に得られた血清を、
オバルブミン及びマウスIL5に対する反応性について試験した。ポリスチレンマ
イクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)を、オバルブミン(1μg/ウエル、Sigm
a)又は精製組換えマウスIL5 (0.1 μg/ウエル、E1320)でコートした。ウエルに
加えた希釈血清の反応性を、ヤギ抗-マウス二次抗体を用いて可視化した。プレ
ブリードの OD490示数を試験試料のOD490示数から控除し、得られた値をバー(ba
r)として個々のマウスそれぞれに示した。プレブリードのOD490示数(1:25希釈)
は、0.025-0.034の範囲であった。十字架は、死亡した動物を示す。 図5: マウスIL5ベースの自家ワクチン構築物ベースの概略図。上の図は、ヘリ
ックスA-C、ループ1-3及び可変性C-末端領域を有するマウスの野生型IL5モノマ
ーを示す。残りの図は、種々の位置で破傷風トキソイドエピトープP2及びP30が
内部で置換された種々の自家ワクチン構築物を示す。詳細な構築物は、実施例に
詳述する。
【００２６】発明の詳細な説明 定義 以下に、本発明の境界を明確にするために、本明細書及び請求項において使用
する用語を幾つか定義し、詳細に説明する。 "T-リンパ球"及び"T-細胞"という用語は、様々の細胞介在免疫応答ならびに体
液性免疫応答におけるヘルパー活性の原因となる胸腺由来リンパ球と互換可能に
使用される。同様に、"B-リンパ球"及び"B-細胞"という用語は、抗体産生リンパ
球と互換可能に使用される。
する用語を幾つか定義し、詳細に説明する。 "T-リンパ球"及び"T-細胞"という用語は、様々の細胞介在免疫応答ならびに体
液性免疫応答におけるヘルパー活性の原因となる胸腺由来リンパ球と互換可能に
使用される。同様に、"B-リンパ球"及び"B-細胞"という用語は、抗体産生リンパ
球と互換可能に使用される。
【００２７】 "IL5ポリペプチド"は、ここで、ヒト及びマウス由来の上記IL5 タンパク質の
アミノ酸配列を有するポリペプチド(又は無傷のIL5と実質的な量のB-細胞エピト
ープを共有するその切断型(truncated))を意味し、ならびに他種から単離される
これらの2つのタンパク質の外来-類似体と同一のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドがこの用語に含まれる。また、原核生物系で調製される非グリコシル化型IL
5は、例えば酵母又は他の非哺乳動物の真核の発現系の使用により様々なグリコ
シル化パターンを有する型のように、この用語の境界内に含まれる。しかし、"I
L5ポリペプチド"の用語を用いる場合、当該ポリペプチドは治療される動物に提
示される際に通常非免疫原性であることが意味されることに留意すべきである。
言い換えれば、IL5ポリペプチドは自己タンパク質であるか、又は当該動物のIL5
に対する免疫応答を通常は生じないような自己タンパク質の外来-類似体である
。
アミノ酸配列を有するポリペプチド(又は無傷のIL5と実質的な量のB-細胞エピト
ープを共有するその切断型(truncated))を意味し、ならびに他種から単離される
これらの2つのタンパク質の外来-類似体と同一のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドがこの用語に含まれる。また、原核生物系で調製される非グリコシル化型IL
5は、例えば酵母又は他の非哺乳動物の真核の発現系の使用により様々なグリコ
シル化パターンを有する型のように、この用語の境界内に含まれる。しかし、"I
L5ポリペプチド"の用語を用いる場合、当該ポリペプチドは治療される動物に提
示される際に通常非免疫原性であることが意味されることに留意すべきである。
言い換えれば、IL5ポリペプチドは自己タンパク質であるか、又は当該動物のIL5
に対する免疫応答を通常は生じないような自己タンパク質の外来-類似体である
。
【００２８】 "IL5類似体"は、その一次構造において変化が付されているIL5ポリペプチドで
ある。このような変化は、例えば適当な融合パートナーへのIL5ポリペプチドの
融合形態(つまり、アミノ酸残基のC-及び/又はN-末端付加をもっぱら伴う一次構
造における変化)であってもよく、及び/又はIL5ポリペプチドアミノ酸配列にお
ける挿入及び/又は欠失及び/又は置換形態であってもよい。誘導化IL5分子も、
この用語に含まれる(IL5の修飾に関する以下の論議参照)。 例えばヒトIL5のイヌ科類似体をヒトでワクチンとして使用することは、IL5に
対する所望の免疫性を生じるものと想像されることに留意すべきである。免疫化
にこのような外来-類似体を使用することも、上記のように"IL5類似体"であると
みなされる。 ここで略語"IL5"を用いる際に、これは、成熟した野生型IL5のアミノ酸配列(
ここで"IL5m"及び"IL5wt"としても示す)を基準として示される。成熟ヒトIL5はh
IL5、hIL5m又はhIL5wtと示し、マウス成熟IL5はmIL5、mIL5m又はmIL5wtと示す。
DNA構築物がリーダー配列又は他の物質をエンコードする情報を含む場合には、
これは、通常状況から明らかとなるであろう。
ある。このような変化は、例えば適当な融合パートナーへのIL5ポリペプチドの
融合形態(つまり、アミノ酸残基のC-及び/又はN-末端付加をもっぱら伴う一次構
造における変化)であってもよく、及び/又はIL5ポリペプチドアミノ酸配列にお
ける挿入及び/又は欠失及び/又は置換形態であってもよい。誘導化IL5分子も、
この用語に含まれる(IL5の修飾に関する以下の論議参照)。 例えばヒトIL5のイヌ科類似体をヒトでワクチンとして使用することは、IL5に
対する所望の免疫性を生じるものと想像されることに留意すべきである。免疫化
にこのような外来-類似体を使用することも、上記のように"IL5類似体"であると
みなされる。 ここで略語"IL5"を用いる際に、これは、成熟した野生型IL5のアミノ酸配列(
ここで"IL5m"及び"IL5wt"としても示す)を基準として示される。成熟ヒトIL5はh
IL5、hIL5m又はhIL5wtと示し、マウス成熟IL5はmIL5、mIL5m又はmIL5wtと示す。
DNA構築物がリーダー配列又は他の物質をエンコードする情報を含む場合には、
これは、通常状況から明らかとなるであろう。
【００２９】 "ポリペプチド"という用語は、本文において、アミノ酸残基が2〜10の短いペ
プチド、アミノ酸残基が11〜100のオリゴペプチド、ならびにアミノ酸残基が100
より多いポリペプチドを意味する。さらに、この用語はタンパク質、すなわち少
なくとも1つのポリペプチドからなり、また少なくとも2つのポリペプチドからな
る場合には複合体を形成するか、共有結合するか、又は非共有結合する機能的生
体分子をも含む。タンパク質中のポリペプチドはグリコシル化及び/又は脂質化
されていてもよく、及び/又は補欠分子団を含んでいてもよい。 "サブ配列"という用語は、それぞれ天然に存在するIL5アミノ酸配列又は核酸
配列から直接誘導される、少なくとも3つのアミノ酸、又は関連するときは少な
くとも3つのヌクレオチドのいずれかの連続的なストレッチを意味する。
プチド、アミノ酸残基が11〜100のオリゴペプチド、ならびにアミノ酸残基が100
より多いポリペプチドを意味する。さらに、この用語はタンパク質、すなわち少
なくとも1つのポリペプチドからなり、また少なくとも2つのポリペプチドからな
る場合には複合体を形成するか、共有結合するか、又は非共有結合する機能的生
体分子をも含む。タンパク質中のポリペプチドはグリコシル化及び/又は脂質化
されていてもよく、及び/又は補欠分子団を含んでいてもよい。 "サブ配列"という用語は、それぞれ天然に存在するIL5アミノ酸配列又は核酸
配列から直接誘導される、少なくとも3つのアミノ酸、又は関連するときは少な
くとも3つのヌクレオチドのいずれかの連続的なストレッチを意味する。
【００３０】 用語"動物"は、本文において一般にホモ・サピエンス、カニス・ドメスティカ
ス（Canis domesticus）などの動物種（好ましくは哺乳動物）を意味し、ただ1
種の動物ではない。しかし、この用語は、そのような動物種の個体群も意味する
。なぜなら、この発明の方法によって免疫化された個体は全て、同じ免疫原での
動物の免疫化を可能にする、実質的に同一のIL5を有することが重要であるから
である。例えばIL5の遺伝変異型が異なるヒト個体群で存在する場合には、各群
におけるIL5に対する自己耐性を破壊できるように、これらの異なる個体群で異
なる免疫原を使用する必要がある。本文における動物が免疫系を有する生物であ
ることは、当業者には明らかであろう。動物は脊椎動物、例えば哺乳動物である
ことが好ましい。 "IL5活性のインビボのダウン-レギュレーション"という用語は、ここでは生き
ている生物におけるIL5とその受容体との相互作用数(又はIL5とこの分子に可能
性のある他の生物学的に重要な結合パートナーとの相互作用数)の低下を意味す
る。ダウンレギュレーションは、いくつかの機序によって生じることができる。
これらのうち、抗体結合によるIL5の活性部位での単純な干渉が最も簡単である
。しかし、抗体結合が、スカベンジャー細胞(例えばマクロファージ及びその他
の食細胞)によるIL5の除去をもたらすことも、本発明の範囲内である。
ス（Canis domesticus）などの動物種（好ましくは哺乳動物）を意味し、ただ1
種の動物ではない。しかし、この用語は、そのような動物種の個体群も意味する
。なぜなら、この発明の方法によって免疫化された個体は全て、同じ免疫原での
動物の免疫化を可能にする、実質的に同一のIL5を有することが重要であるから
である。例えばIL5の遺伝変異型が異なるヒト個体群で存在する場合には、各群
におけるIL5に対する自己耐性を破壊できるように、これらの異なる個体群で異
なる免疫原を使用する必要がある。本文における動物が免疫系を有する生物であ
ることは、当業者には明らかであろう。動物は脊椎動物、例えば哺乳動物である
ことが好ましい。 "IL5活性のインビボのダウン-レギュレーション"という用語は、ここでは生き
ている生物におけるIL5とその受容体との相互作用数(又はIL5とこの分子に可能
性のある他の生物学的に重要な結合パートナーとの相互作用数)の低下を意味す
る。ダウンレギュレーションは、いくつかの機序によって生じることができる。
これらのうち、抗体結合によるIL5の活性部位での単純な干渉が最も簡単である
。しかし、抗体結合が、スカベンジャー細胞(例えばマクロファージ及びその他
の食細胞)によるIL5の除去をもたらすことも、本発明の範囲内である。
【００３１】 "免疫系に…提示する"という表現は、動物の免疫系が制限された方法で免疫原
性の攻撃に付されるとことを意味する。下記の開示から明らかであるように、こ
のような免疫系の攻撃は多くの方法によって行うことができる。そのなかで最も
重要なものは、"ファーマシン（pharmaccines）"を含有するポリペプチドでのワ
クチン注射(すなわち進行中の疾患を治療又は改善するために投与されるワクチ
ン)、又は核酸"ファーマシン"のワクチン注射である。達成されるべき重要な結
果は、動物中の免疫受容細胞が免疫学的に有効な方法で抗原と相対することであ
って、この結果に達する方法そのものは、この発明の基礎をなす発明的な思想ほ
ど重要ではない。 "免疫学的に有効な量"という用語は、当該技術において通常の意味を有する。
つまり、免疫学的特徴を免疫原と共有している発病剤を著しく連動させる免疫応
答を誘発し得る免疫原の量である。
性の攻撃に付されるとことを意味する。下記の開示から明らかであるように、こ
のような免疫系の攻撃は多くの方法によって行うことができる。そのなかで最も
重要なものは、"ファーマシン（pharmaccines）"を含有するポリペプチドでのワ
クチン注射(すなわち進行中の疾患を治療又は改善するために投与されるワクチ
ン)、又は核酸"ファーマシン"のワクチン注射である。達成されるべき重要な結
果は、動物中の免疫受容細胞が免疫学的に有効な方法で抗原と相対することであ
って、この結果に達する方法そのものは、この発明の基礎をなす発明的な思想ほ
ど重要ではない。 "免疫学的に有効な量"という用語は、当該技術において通常の意味を有する。
つまり、免疫学的特徴を免疫原と共有している発病剤を著しく連動させる免疫応
答を誘発し得る免疫原の量である。
【００３２】 IL5が"修飾"されたという表現を使用するときは、ここではIL5の骨格を構成す
るポリペプチドの化学的修飾を意味する。そのような修飾は、例えばIL5配列中
のあるアミノ酸残基の誘導 (例えばアルキル化、アシル化、エステル化等)であ
る。しかし、以下の開示から明らかであるように、好ましい修飾は、IL5アミノ
酸配列の一次構造の変更(又は一次構造に対する付加)からなる。 "IL5に対する耐性"を論じるときは、IL5がワクチン注射される個体群で自己タ
ンパク質であるため、個体群の正常な個体がIL5に対する免疫応答を増さないこ
とが理解される。しかし、動物個体群において、例えば自家免疫異常の一部とし
て、天然のIL5に対する抗体を産生できる偶発的な個体があり得ることは否定で
きない。いずれにしても、動物は通常、それ自身のIL5に対してのみ自己耐性で
あるが、その他の動物種又は表現型が異なるIL5を有する個体群に由来するIL5類
似体もまた、その動物により耐性であろうことは否定できない。
るポリペプチドの化学的修飾を意味する。そのような修飾は、例えばIL5配列中
のあるアミノ酸残基の誘導 (例えばアルキル化、アシル化、エステル化等)であ
る。しかし、以下の開示から明らかであるように、好ましい修飾は、IL5アミノ
酸配列の一次構造の変更(又は一次構造に対する付加)からなる。 "IL5に対する耐性"を論じるときは、IL5がワクチン注射される個体群で自己タ
ンパク質であるため、個体群の正常な個体がIL5に対する免疫応答を増さないこ
とが理解される。しかし、動物個体群において、例えば自家免疫異常の一部とし
て、天然のIL5に対する抗体を産生できる偶発的な個体があり得ることは否定で
きない。いずれにしても、動物は通常、それ自身のIL5に対してのみ自己耐性で
あるが、その他の動物種又は表現型が異なるIL5を有する個体群に由来するIL5類
似体もまた、その動物により耐性であろうことは否定できない。
【００３３】 "外来T-細胞エピトープ"(又は"外来T-リンパ球エピトープ")は、MHC分子に結
合でき、かつ動物種でT-細胞を刺激するペプチドである。この発明において好ま
しい外来T-細胞エピトープは、"乱交雑"エピトープ、すなわち動物種又は個体群
における特定のMHC分子クラスの実質的なフラクションに結合するエピトープで
ある。そのような乱交雑T-細胞エピトープは、ごく限られた数しか知られていな
いが、それらについては以下に詳細に論じる。本発明に基づいて使用される免疫
原が動物個体群のできるだけ大きいフラクションで有効となるためには、1)数個
の外来T-細胞エピトープを同一のIL5類似体に挿入するか、又は2)それぞれに異
なる乱交雑エピトープが挿入された数個のIL5類似体を製造する必要があり得る
ことは理解されたい。外来T-細胞エピトープの概念が、クリプティックT-細胞エ
ピトープ、すなわち自己タンパク質に由来するエピトープであって、問題の自己
タンパク質の一部ではなく、単離した形態で存在するときにのみ免疫原性行動を
発揮するエピトープの使用をも包含することは理解されたい。 "外来Tヘルパーリンパ球エピトープ"(外来THエピトープ)は、MHCクラスII分子
に結合し、MHCクラスII分子に結合した抗原提示細胞（APC）の表面に提示されう
る外来T細胞エピトープである。
合でき、かつ動物種でT-細胞を刺激するペプチドである。この発明において好ま
しい外来T-細胞エピトープは、"乱交雑"エピトープ、すなわち動物種又は個体群
における特定のMHC分子クラスの実質的なフラクションに結合するエピトープで
ある。そのような乱交雑T-細胞エピトープは、ごく限られた数しか知られていな
いが、それらについては以下に詳細に論じる。本発明に基づいて使用される免疫
原が動物個体群のできるだけ大きいフラクションで有効となるためには、1)数個
の外来T-細胞エピトープを同一のIL5類似体に挿入するか、又は2)それぞれに異
なる乱交雑エピトープが挿入された数個のIL5類似体を製造する必要があり得る
ことは理解されたい。外来T-細胞エピトープの概念が、クリプティックT-細胞エ
ピトープ、すなわち自己タンパク質に由来するエピトープであって、問題の自己
タンパク質の一部ではなく、単離した形態で存在するときにのみ免疫原性行動を
発揮するエピトープの使用をも包含することは理解されたい。 "外来Tヘルパーリンパ球エピトープ"(外来THエピトープ)は、MHCクラスII分子
に結合し、MHCクラスII分子に結合した抗原提示細胞（APC）の表面に提示されう
る外来T細胞エピトープである。
【００３４】 （生体）分子の"機能的部分"とは、本文においては、分子によって発揮される
生化学的又は生理学的作用の少なくともひとつの原因となる分子の一部を意味す
る。多くの酵素及び他のエフェクター分子が、問題の分子によって発揮される作
用の原因となる活性部位を有することは、当該技術において周知である。その分
子の他の部分は、安定化又は可溶性の増強目的に役立っている可能性がある。し
たがって、これらの目的が本発明の特定の実施例に関連がない場合は、排除され
得る。例えば、IL5において特定の他のサイトカインを修飾部分として使用する
ことができる(下記の詳細な論述を参照)。そのような場合には、IL5への結合は
必要な安定性を生ずるので、安定性の問題は無関係であるかもしれない。 "アジュバント"という用語は、ワクチン技術の分野において通常の意味を有す
る。つまり、1)それ自体ではワクチンの免疫原に対する特異免疫応答を増加する
ことはできないが、2)それにもかかわらず、免疫原に対する免疫応答を高めるこ
とができる物質又は組成物である。つまり、言い換えれば、アジュバントのみの
ワクチン注射は免疫原に対する免疫応答を生じない。免疫原でのワクチン注射は
免疫原に対する免疫応答を生じさせるかもしれないし、させないかもしれない。
しかし、免疫原とアジュバントとのワクチン注射の組合わせは、免疫原のみで誘
発されるよりも強い免疫原への免疫応答を誘発する。
生化学的又は生理学的作用の少なくともひとつの原因となる分子の一部を意味す
る。多くの酵素及び他のエフェクター分子が、問題の分子によって発揮される作
用の原因となる活性部位を有することは、当該技術において周知である。その分
子の他の部分は、安定化又は可溶性の増強目的に役立っている可能性がある。し
たがって、これらの目的が本発明の特定の実施例に関連がない場合は、排除され
得る。例えば、IL5において特定の他のサイトカインを修飾部分として使用する
ことができる(下記の詳細な論述を参照)。そのような場合には、IL5への結合は
必要な安定性を生ずるので、安定性の問題は無関係であるかもしれない。 "アジュバント"という用語は、ワクチン技術の分野において通常の意味を有す
る。つまり、1)それ自体ではワクチンの免疫原に対する特異免疫応答を増加する
ことはできないが、2)それにもかかわらず、免疫原に対する免疫応答を高めるこ
とができる物質又は組成物である。つまり、言い換えれば、アジュバントのみの
ワクチン注射は免疫原に対する免疫応答を生じない。免疫原でのワクチン注射は
免疫原に対する免疫応答を生じさせるかもしれないし、させないかもしれない。
しかし、免疫原とアジュバントとのワクチン注射の組合わせは、免疫原のみで誘
発されるよりも強い免疫原への免疫応答を誘発する。
【００３５】 分子の"標的化"とは、本文において、動物に導入される分子が特定組織で優先
的に現れるか、又は特定の細胞又は細胞型に優先的に結合している状態を意味す
る。これは、標的化を促進する組成物に分子を処方することを含む多くの方法、
又は標的化を促進する基を分子に導入することによって達成することができる。
これらの問題は以下に詳細に論述する。 "免疫系の刺激"とは、物質又は組成物が一般に非特異免疫刺激作用を示すこと
を意味する。多くのアジュバント及び推定上のアジュバント（例えば特定のサイ
トカイン）は、免疫系を刺激する能力を共有する。免疫刺激剤を使用すると、免
疫系の"機敏性(alertness)"が増加する。これは免疫源を用いた同時又はその後
の免疫化が、免疫原のみの使用と比較して、著しく有効な免疫応答を誘発するこ
とを意味する。
的に現れるか、又は特定の細胞又は細胞型に優先的に結合している状態を意味す
る。これは、標的化を促進する組成物に分子を処方することを含む多くの方法、
又は標的化を促進する基を分子に導入することによって達成することができる。
これらの問題は以下に詳細に論述する。 "免疫系の刺激"とは、物質又は組成物が一般に非特異免疫刺激作用を示すこと
を意味する。多くのアジュバント及び推定上のアジュバント（例えば特定のサイ
トカイン）は、免疫系を刺激する能力を共有する。免疫刺激剤を使用すると、免
疫系の"機敏性(alertness)"が増加する。これは免疫源を用いた同時又はその後
の免疫化が、免疫原のみの使用と比較して、著しく有効な免疫応答を誘発するこ
とを意味する。
【００３６】IL5活性のダウン-レギュレーションの好ましい実施態様 この発明の方法で免疫原として用いられるIL5ポリペプチドは、少なくとも1つ
の変更がIL5アミノ酸配列に存在する修飾分子であることが好ましい。というの
は、IL5に対する自己耐性に関して極めて重要な破壊を生じさせる機会はあのよ
うにかなり容易化されているからである。このことが、IL5に対する自己耐性の
破壊をさらに容易にする剤型、例えば以下に詳述するある種のアジュバントを含
む剤型でかかる修飾IL5を用いる可能性を排除しないことは、留意すべきである
。 潜在的に自己反応性のB-リンパ球を認識する自己-タンパク質が正常な個体に
おいて生理学的に存在することが分かっている(Dalum Iら、1996, J. Immunol.
157: 4796-4804)。しかし、これらのB-リンパ球が、関連する自己-タンパク質と
反応性の抗体を実際に産生するよう誘発するためには、サイトカイン産生T-ヘル
パーリンパ球(TH-細胞又はTH-リンパ球)からの補助が必要である。通常、この助
力は、提供されない。なぜなら、T-リンパ球は、一般に、抗原提示細胞(APC)に
よって提示される場合に、自己タンパク質由来のT-細胞エピトープを認識しない
からである。しかし、自己-タンパク質に「外来」要素を生ずることによって(つ
まり、免疫学的に有意な修飾を導入することによって)、外来要素を認識するT-
細胞は、APC(例えば、最初は単核細胞)上で外来エピトープを認識することによ
って活性化される。修飾自己タンパク質で自己エピトープを認識し得るポリクロ
ーナルB-リンパ球(特化されたAPCでもある)も抗原を内在化し、次いでその外来T
-細胞エピトープを提示し、活性化されたT-リンパ球が、その後、これらの自己
反応性ポリクローナルB-リンパ球へのサイトカインの助力を提供する。これらの
ポリクローナルB-リンパ球で産生される抗体は、天然のポリペプチドに存在する
ものも含めて修飾ポリペプチドで種々のエピトープと反応性であるので、非修飾
自己タンパク質との抗体の交差反応が誘発される。結論として、T-リンパ球は、
あたかもポリクローナルB-リンパ球の群が完全に外来の抗原を認識するかのよう
に作用するに至るのであるが、事実は、挿入されたエピトープのみが宿主に外来
であるにすぎない。こうして、非修飾自己抗原と交差反応しうる抗体が誘発され
る。
の変更がIL5アミノ酸配列に存在する修飾分子であることが好ましい。というの
は、IL5に対する自己耐性に関して極めて重要な破壊を生じさせる機会はあのよ
うにかなり容易化されているからである。このことが、IL5に対する自己耐性の
破壊をさらに容易にする剤型、例えば以下に詳述するある種のアジュバントを含
む剤型でかかる修飾IL5を用いる可能性を排除しないことは、留意すべきである
。 潜在的に自己反応性のB-リンパ球を認識する自己-タンパク質が正常な個体に
おいて生理学的に存在することが分かっている(Dalum Iら、1996, J. Immunol.
157: 4796-4804)。しかし、これらのB-リンパ球が、関連する自己-タンパク質と
反応性の抗体を実際に産生するよう誘発するためには、サイトカイン産生T-ヘル
パーリンパ球(TH-細胞又はTH-リンパ球)からの補助が必要である。通常、この助
力は、提供されない。なぜなら、T-リンパ球は、一般に、抗原提示細胞(APC)に
よって提示される場合に、自己タンパク質由来のT-細胞エピトープを認識しない
からである。しかし、自己-タンパク質に「外来」要素を生ずることによって(つ
まり、免疫学的に有意な修飾を導入することによって)、外来要素を認識するT-
細胞は、APC(例えば、最初は単核細胞)上で外来エピトープを認識することによ
って活性化される。修飾自己タンパク質で自己エピトープを認識し得るポリクロ
ーナルB-リンパ球(特化されたAPCでもある)も抗原を内在化し、次いでその外来T
-細胞エピトープを提示し、活性化されたT-リンパ球が、その後、これらの自己
反応性ポリクローナルB-リンパ球へのサイトカインの助力を提供する。これらの
ポリクローナルB-リンパ球で産生される抗体は、天然のポリペプチドに存在する
ものも含めて修飾ポリペプチドで種々のエピトープと反応性であるので、非修飾
自己タンパク質との抗体の交差反応が誘発される。結論として、T-リンパ球は、
あたかもポリクローナルB-リンパ球の群が完全に外来の抗原を認識するかのよう
に作用するに至るのであるが、事実は、挿入されたエピトープのみが宿主に外来
であるにすぎない。こうして、非修飾自己抗原と交差反応しうる抗体が誘発され
る。
【００３７】 自己耐性の破壊を生じるためにペプチド自己抗原を修飾する方法は、幾つか当
業者に知られている。つまり、この発明によれば、修飾は、 - 少なくとも1つの外来T-細胞エピトープを導入し、及び/又は - 少なくとも1つの第一部分(first moiety)を導入し、抗原提示細胞(APC)に修
飾分子を標的化し、及び/又は - 少なくとも1つの第二部分を導入し、免疫系を刺激し、及び/又は - 少なくとも1つの第三部分を導入し、免疫系に対して修飾IL5ポリペプチドの
提示を最適化する ことを含み得る。 しかし、これらの修飾は、全てIL5に本来のB-リンパ球エピトープの実質的な
フラクションを維持しているあいだに行われるべきである。というのは、天然分
子のB-リンパ球の認識は、それにより増強されるからである。
業者に知られている。つまり、この発明によれば、修飾は、 - 少なくとも1つの外来T-細胞エピトープを導入し、及び/又は - 少なくとも1つの第一部分(first moiety)を導入し、抗原提示細胞(APC)に修
飾分子を標的化し、及び/又は - 少なくとも1つの第二部分を導入し、免疫系を刺激し、及び/又は - 少なくとも1つの第三部分を導入し、免疫系に対して修飾IL5ポリペプチドの
提示を最適化する ことを含み得る。 しかし、これらの修飾は、全てIL5に本来のB-リンパ球エピトープの実質的な
フラクションを維持しているあいだに行われるべきである。というのは、天然分
子のB-リンパ球の認識は、それにより増強されるからである。
【００３８】 ひとつの好ましい具体例において、(外来T-細胞エピトープ又は上記の第一、
第二及び第三部分の形態の)側基(side group)は、共有的又は非共有的に導入さ
れる。これは、IL5から誘導されるアミノ酸残基のストレッチが、主たるアミノ
酸配列を変更することなく、あるいは少なくとも鎖内の個々のアミノ酸間のペプ
チド結合に変更を加えることなく、誘導されることを意味する。 代替的かつ好ましくは、具体例は、アミノ酸の置換及び/又は欠失及び/又は挿入
及び/又は付加を利用する(組換え手段又はペプチド合成の手法により行っても良
い：長いアミノ酸のストレッチを伴う修飾は、融合ポリペプチドを生じ得る)。
この具体例の特に好ましい変形は、WO 95/05849に記載される技術である。これ
は、多数のアミノ酸配列が免疫優勢の外来T-細胞エピトープからそれぞれなる相
当数のアミノ酸配列で置換されているが、同時に類似体における自己タンパク質
の全体的な三次構造を維持している自己タンパク質類似体での免疫化によって自
己タンパク質をダウン-レギュレートする方法を開示している。しかし、この発
明の目的には、修飾(アミノ酸の挿入、付加、欠失又は置換)により外来のT-細胞
エピトープが生じ、同時にIL5において実質的な数のB-細胞エピトープが保持さ
れれば、十分である。しかし、誘発される免疫応答の効率を最大限にするために
は、IL5の全体的な三次構造を修飾分子内で維持することが好ましい。
第二及び第三部分の形態の)側基(side group)は、共有的又は非共有的に導入さ
れる。これは、IL5から誘導されるアミノ酸残基のストレッチが、主たるアミノ
酸配列を変更することなく、あるいは少なくとも鎖内の個々のアミノ酸間のペプ
チド結合に変更を加えることなく、誘導されることを意味する。 代替的かつ好ましくは、具体例は、アミノ酸の置換及び/又は欠失及び/又は挿入
及び/又は付加を利用する(組換え手段又はペプチド合成の手法により行っても良
い：長いアミノ酸のストレッチを伴う修飾は、融合ポリペプチドを生じ得る)。
この具体例の特に好ましい変形は、WO 95/05849に記載される技術である。これ
は、多数のアミノ酸配列が免疫優勢の外来T-細胞エピトープからそれぞれなる相
当数のアミノ酸配列で置換されているが、同時に類似体における自己タンパク質
の全体的な三次構造を維持している自己タンパク質類似体での免疫化によって自
己タンパク質をダウン-レギュレートする方法を開示している。しかし、この発
明の目的には、修飾(アミノ酸の挿入、付加、欠失又は置換)により外来のT-細胞
エピトープが生じ、同時にIL5において実質的な数のB-細胞エピトープが保持さ
れれば、十分である。しかし、誘発される免疫応答の効率を最大限にするために
は、IL5の全体的な三次構造を修飾分子内で維持することが好ましい。
【００３９】 以下の式は、この発明で全体的に包含されるIL5構築物を記載している: (MOD1)s1(IL5e1)n1(MOD2)s2(IL5e2)n2....(MODx)sx(IL5ex)nx (I) - ここで、IL5e1-IL5ex は、xのB-細胞エピトープを含有するIL5のサブ配列で
、個々に同一であるか又は非同一であり、外来側基を含んでいてもよく含まなく
てもよい。xは3以上の整数で、n1-nxは0以上の整数(少なくとも1つは1以上)であ
り、MOD1-MODx は保存されたB-細胞エピトープ間に挿入されたx の修飾で、かつ
s1-sx は0以上のx整数である(側基がIL5e配列に導入されないならば、少なくと
も1つは1以上である)。したがって、全般的な機能が構築物の免疫原性を制限す
るので、この発明は本来のIL5配列のあらゆる種類の置換及びそれにおけるあら
ゆる種類の修飾を可能にする。つまり、例えばインビボで副作用を示すIL5配列
の一部を省くか、あるいは望ましくない免疫学的反応を生じる部分を省くことに
よって得られる修飾IL5は、本発明に含まれる。
、個々に同一であるか又は非同一であり、外来側基を含んでいてもよく含まなく
てもよい。xは3以上の整数で、n1-nxは0以上の整数(少なくとも1つは1以上)であ
り、MOD1-MODx は保存されたB-細胞エピトープ間に挿入されたx の修飾で、かつ
s1-sx は0以上のx整数である(側基がIL5e配列に導入されないならば、少なくと
も1つは1以上である)。したがって、全般的な機能が構築物の免疫原性を制限す
るので、この発明は本来のIL5配列のあらゆる種類の置換及びそれにおけるあら
ゆる種類の修飾を可能にする。つまり、例えばインビボで副作用を示すIL5配列
の一部を省くか、あるいは望ましくない免疫学的反応を生じる部分を省くことに
よって得られる修飾IL5は、本発明に含まれる。
【００４０】 B-細胞エピトープの実質的なフラクション又は上記の修飾に付されるタンパク
質の全体的な三次構造の維持は、幾通りかの方法によって達成することができる
。ひとつは、単にIL5に対するポリクローナル抗血清(例えばウサギで調製した抗
血清)を調製し、その後この抗血清を、製造した修飾タンパク質に対する試験薬
として(例えば競合ELISAで)使用する方法である。IL5と同程度まで抗血清と反応
する修飾形(類似体)は、IL5と同じ全体的な三次構造を有しているとみなさなけ
ればならない。しかし、そのような抗血清に対して制限された(それでも依然と
して有意かつ特異的な)反応性を示す類似体は、本来のB-細胞エピトープの実質
的なフラクションを維持しているものとみなされる。 あるいは、IL5での異なるエピトープと反応性のモノクローナル抗体の選択は
、テストパネルとして用意し、使用することができる。この方法は、1)IL5のエピ
トープマッピング、及び2)調製した類似体に維持されるエピトープのマッピング
を可能にするという利点がある。
質の全体的な三次構造の維持は、幾通りかの方法によって達成することができる
。ひとつは、単にIL5に対するポリクローナル抗血清(例えばウサギで調製した抗
血清)を調製し、その後この抗血清を、製造した修飾タンパク質に対する試験薬
として(例えば競合ELISAで)使用する方法である。IL5と同程度まで抗血清と反応
する修飾形(類似体)は、IL5と同じ全体的な三次構造を有しているとみなさなけ
ればならない。しかし、そのような抗血清に対して制限された(それでも依然と
して有意かつ特異的な)反応性を示す類似体は、本来のB-細胞エピトープの実質
的なフラクションを維持しているものとみなされる。 あるいは、IL5での異なるエピトープと反応性のモノクローナル抗体の選択は
、テストパネルとして用意し、使用することができる。この方法は、1)IL5のエピ
トープマッピング、及び2)調製した類似体に維持されるエピトープのマッピング
を可能にするという利点がある。
【００４１】 当然のことながら、第三の方法は、IL5又は生物学的に活性な切断型(上記参照
)の三次元構造を解析し、これを調製した類似体について解析した三次元構造と
比較することである。三次元構造は、X線回折研究及びNMR分光法によって解析す
ることができる。三次構造に関するさらなる情報は、ある程度までは、純粋型の
ポリペプチドを要するという利点があるにすぎない円偏光二色性研究から得るこ
とができ(X線回折では結晶化ポリペプチドの供給、NMRではポリペプチドの同位
体変異型の供給を要する)、所定の分子の三次構造についての有用な情報が提供
される。しかしながら、最終的には、X線回折及び/又はNMRが確実なデータを得
るために必要である。なぜなら、円二色性は、二次構造要素の情報を介すると正
確な三次元構造については間接的な証拠しか提供できないからである。
)の三次元構造を解析し、これを調製した類似体について解析した三次元構造と
比較することである。三次元構造は、X線回折研究及びNMR分光法によって解析す
ることができる。三次構造に関するさらなる情報は、ある程度までは、純粋型の
ポリペプチドを要するという利点があるにすぎない円偏光二色性研究から得るこ
とができ(X線回折では結晶化ポリペプチドの供給、NMRではポリペプチドの同位
体変異型の供給を要する)、所定の分子の三次構造についての有用な情報が提供
される。しかしながら、最終的には、X線回折及び/又はNMRが確実なデータを得
るために必要である。なぜなら、円二色性は、二次構造要素の情報を介すると正
確な三次元構造については間接的な証拠しか提供できないからである。
【００４２】 この発明の1つの好ましい具体例は、IL5のB-リンパ球エピトープ(つまり、少
なくとも1つのB-細胞エピトープが2つの位置に存在する式I)の複数提示を利用し
ている。このことは、様々な方法、例えば、単に構造(IL5)m（式中mは2以上の整
数）からなる融合ポリペプチドを調製し、次いでここに論ずる修飾をIL5配列の
少なくとも1つに導入するか、あるいは少なくとも2つのIL5アミノ酸配列間に挿
入することによって達成することができる。導入された修飾は、B-リンパ球エピ
トープの少なくとも1つの複製及び/又はハプテンの導入を含むことが好ましい。 上記のように、外来T-細胞エピトープの導入は、少なくとも1つのアミノ酸の
挿入、付加、欠失又は置換の導入によって完成される。当然ながら、正常な状況
は、アミノ酸配列における1以上の変更の導入(例えば、完全なT-細胞エピトープ
の挿入又はそれによる置換)であろうが、達成されるべき重要な目標は、抗原提
示細胞(APC)によって処理される際に、IL5類似体が、APC表面にMHCクラスII分子
の状況で提示されるような免疫優勢の外来T-細胞エピトープを生じることである
。したがって、適当な位置でのIL5アミノ酸配列が外来THエピトープでも見られ
るアミノ酸残基を幾つか含むならば、外来THエピトープの導入は、アミノ酸の挿
入、付加、欠失及び置換で外来エピトープの残りのアミノ酸を生じることによっ
て達成され得る。言い換えれば、挿入又は置換で完全なTHエピトープを導入する
ことは、必ずしも必要ではない。
なくとも1つのB-細胞エピトープが2つの位置に存在する式I)の複数提示を利用し
ている。このことは、様々な方法、例えば、単に構造(IL5)m（式中mは2以上の整
数）からなる融合ポリペプチドを調製し、次いでここに論ずる修飾をIL5配列の
少なくとも1つに導入するか、あるいは少なくとも2つのIL5アミノ酸配列間に挿
入することによって達成することができる。導入された修飾は、B-リンパ球エピ
トープの少なくとも1つの複製及び/又はハプテンの導入を含むことが好ましい。 上記のように、外来T-細胞エピトープの導入は、少なくとも1つのアミノ酸の
挿入、付加、欠失又は置換の導入によって完成される。当然ながら、正常な状況
は、アミノ酸配列における1以上の変更の導入(例えば、完全なT-細胞エピトープ
の挿入又はそれによる置換)であろうが、達成されるべき重要な目標は、抗原提
示細胞(APC)によって処理される際に、IL5類似体が、APC表面にMHCクラスII分子
の状況で提示されるような免疫優勢の外来T-細胞エピトープを生じることである
。したがって、適当な位置でのIL5アミノ酸配列が外来THエピトープでも見られ
るアミノ酸残基を幾つか含むならば、外来THエピトープの導入は、アミノ酸の挿
入、付加、欠失及び置換で外来エピトープの残りのアミノ酸を生じることによっ
て達成され得る。言い換えれば、挿入又は置換で完全なTHエピトープを導入する
ことは、必ずしも必要ではない。
【００４３】 アミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加の数は、好ましくは少なくとも2、例え
ば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20及び25
の挿入、置換、付加又は欠失である。アミノ酸挿入、置換、付加又は欠失の数は
、150を超えないことがさらに好ましく、例えば多くても100、多くても90、多く
ても80、ならびに多くても70である。置換、挿入、欠失又は付加の数は、60を超
えないことが特に好ましく、とりわけその数は50又は40を超えるべきではない。
最も好ましいのは、30以下の数である。アミノ酸付加に関して、得られた構築物
が融合ポリペプチドの形態である場合には、これらはしばしば150よりもかなり
多いことに留意すべきである。 本発明の好ましい実施態様は、少なくとも1つの免疫優勢な外来THエピトープ
の導入による修飾を含む。TH-エピトープの免疫優勢の問題が当該の動物種に依
存することは、理解されたい。ここで使用する限り、"免疫優勢"という用語は単
に、ワクチン注射した個体において顕著な免疫応答をもたらすエピトープに関す
る。しかし、一個体において免疫優勢なTH-エピトープが、同一種の別の個体に
おいてMHC-II分子を結合できるからといって、必ずしも後者の個体において免疫
優勢であるとは限らないことは周知の事実である。
ば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20及び25
の挿入、置換、付加又は欠失である。アミノ酸挿入、置換、付加又は欠失の数は
、150を超えないことがさらに好ましく、例えば多くても100、多くても90、多く
ても80、ならびに多くても70である。置換、挿入、欠失又は付加の数は、60を超
えないことが特に好ましく、とりわけその数は50又は40を超えるべきではない。
最も好ましいのは、30以下の数である。アミノ酸付加に関して、得られた構築物
が融合ポリペプチドの形態である場合には、これらはしばしば150よりもかなり
多いことに留意すべきである。 本発明の好ましい実施態様は、少なくとも1つの免疫優勢な外来THエピトープ
の導入による修飾を含む。TH-エピトープの免疫優勢の問題が当該の動物種に依
存することは、理解されたい。ここで使用する限り、"免疫優勢"という用語は単
に、ワクチン注射した個体において顕著な免疫応答をもたらすエピトープに関す
る。しかし、一個体において免疫優勢なTH-エピトープが、同一種の別の個体に
おいてMHC-II分子を結合できるからといって、必ずしも後者の個体において免疫
優勢であるとは限らないことは周知の事実である。
【００４４】 もう一つの重要な点は、TH -エピトープのMHC制限の問題である。一般に、天
然に存在するTH -エピトープはMHC制限性である。すなわち、TH-エピトープを構
成するあるペプチドのみがMHCクラスII分子のサブセットに効果的に結合する。
これはその結果、多くの場合において、1つの特異的なTH-エピトープの使用が個
体群のフラクションにのみ有効なワクチン成分を生じるという効果を有する。ま
た、フラクションのサイズ次第でより多くのTH-エピトープを同一分子内に必然
的に含めることができ、あるいは導入されたTH-エピトープの性質によって互い
に識別されるIL5変異体が成分である多成分ワクチンを調製することができる。 使用するT-細胞のMHC制限が全く未知である場合（例えばワクチン注射した動
物があまり確定されていないMHC組成を有している場合）、特異的なワクチン組
成によってカバーされる動物個体群のフラクションは以下の式によって決定する
ことができる。
然に存在するTH -エピトープはMHC制限性である。すなわち、TH-エピトープを構
成するあるペプチドのみがMHCクラスII分子のサブセットに効果的に結合する。
これはその結果、多くの場合において、1つの特異的なTH-エピトープの使用が個
体群のフラクションにのみ有効なワクチン成分を生じるという効果を有する。ま
た、フラクションのサイズ次第でより多くのTH-エピトープを同一分子内に必然
的に含めることができ、あるいは導入されたTH-エピトープの性質によって互い
に識別されるIL5変異体が成分である多成分ワクチンを調製することができる。 使用するT-細胞のMHC制限が全く未知である場合（例えばワクチン注射した動
物があまり確定されていないMHC組成を有している場合）、特異的なワクチン組
成によってカバーされる動物個体群のフラクションは以下の式によって決定する
ことができる。
【数１】 [式中、piはワクチン組成中に存在するiの外来T-細胞エピトープに対して応答
する個体群における頻度、nはワクチン組成中の外来T-細胞エピトープの総数で
ある]。このように、個体群において0.8、0.7及び0.6の応答頻度をそれぞれ有す
る3個の外来T-細胞エピトープを含むワクチン組成は 1 - 0.2 × 0.3 × 0.4 = 0.976 となり、すなわち、個体群のうち97.6％がMHC-IIを介したワクチンへの応答を統
計的に高める。
する個体群における頻度、nはワクチン組成中の外来T-細胞エピトープの総数で
ある]。このように、個体群において0.8、0.7及び0.6の応答頻度をそれぞれ有す
る3個の外来T-細胞エピトープを含むワクチン組成は 1 - 0.2 × 0.3 × 0.4 = 0.976 となり、すなわち、個体群のうち97.6％がMHC-IIを介したワクチンへの応答を統
計的に高める。
【００４５】 上記の式は、使用されるペプチドについて多少とも明確なMHC制限パターンが
知られている場合には適用されない。例えば、あるペプチドのみがHLA-DRアレレ
DR1、DR3、DR5及びDR7によってエンコードされるヒトMHC-II分子に結合する場合
には、このペプチドを、HLA-DRアレレによってエンコードされる残りのMHC-II分
子に結合する別のペプチドとともに使用することにより、当該個体群で100％の
到達範囲が達成される。同様に、第二のペプチドがDR3及びDR5のみに結合する場
合には、このペプチドの付加は到達範囲を全く増加させない。個体群応答の算出
の基礎を完全にワクチン中のT-細胞エピトープのMHC制限におく場合、特異的な
ワクチン成分でカバーされる個体群のフラクションは以下の式によって決定され
る：
知られている場合には適用されない。例えば、あるペプチドのみがHLA-DRアレレ
DR1、DR3、DR5及びDR7によってエンコードされるヒトMHC-II分子に結合する場合
には、このペプチドを、HLA-DRアレレによってエンコードされる残りのMHC-II分
子に結合する別のペプチドとともに使用することにより、当該個体群で100％の
到達範囲が達成される。同様に、第二のペプチドがDR3及びDR5のみに結合する場
合には、このペプチドの付加は到達範囲を全く増加させない。個体群応答の算出
の基礎を完全にワクチン中のT-細胞エピトープのMHC制限におく場合、特異的な
ワクチン成分でカバーされる個体群のフラクションは以下の式によって決定され
る：
【数２】 [式中、ψjはワクチン中のT-細胞エピトープのいずれか1つを結合し、かつjの3
つの公知のHLA座(DP、DR及びDQ)に属するMHC分子をエンコードするアレリックハ
プロタイプの個体群における頻度の合計である。実際には、どのMHC分子がワク
チン中の各T-細胞エピトープを認識するかをまず測定し、その後、これらのMHC
分子を型(DP、DR及びDQ)によってリストする。次いで、リストした種々のアレリ
ックハプロタイプの個々の頻度を型ごとに合計し、ψ1、ψ2及びψ3を得る]。
つの公知のHLA座(DP、DR及びDQ)に属するMHC分子をエンコードするアレリックハ
プロタイプの個体群における頻度の合計である。実際には、どのMHC分子がワク
チン中の各T-細胞エピトープを認識するかをまず測定し、その後、これらのMHC
分子を型(DP、DR及びDQ)によってリストする。次いで、リストした種々のアレリ
ックハプロタイプの個々の頻度を型ごとに合計し、ψ1、ψ2及びψ3を得る]。
【００４６】 式IIの値piは対応する理論値πiを超えることがあるかもしれない。
【数３】 [式中、νjは ワクチン中のiのT-細胞エピトープを結合し、かつjの3つの公知
のHLA座(DP、DR及びDQ)に属するMHC分子をエンコードするアレリックハプロタイ
プの個体群における頻度の合計である。これは、1-πiの個体群では、応答頻度
はf誤差(residual)#i = (pi-πi)/(1-πi)となることを意味する。したがって、
式IIIを調整して式Vとすることができる:
のHLA座(DP、DR及びDQ)に属するMHC分子をエンコードするアレリックハプロタイ
プの個体群における頻度の合計である。これは、1-πiの個体群では、応答頻度
はf誤差(residual)#i = (pi-πi)/(1-πi)となることを意味する。したがって、
式IIIを調整して式Vとすることができる:
【数４】 [式中、用語1−f誤差#iは、負のときは0に設定される]。全てのエピトープが同
一セットのハプロタイプにハプロタイプマップ(haplotype mapped)されているこ
とを式Vが要求することに留意されたい。 したがって、IL5類似体に導入されるT細胞エピトープを選択するときは、エピ
トープに関する利用可能な全ての知識: 1)個体群における各エピトープへの応答
頻度、2)MHC制限データ及び3)関連するハプロタイプ個体群における頻度を含め
ることが重要である。 動物種の個体又は動物個体群の大部分において活性な、天然に存在する“乱交
雑”T-細胞エピトープが多量に存在する。これらは好ましくはワクチンに導入さ
れ、それによって同一ワクチンにおける極めて多量の異なるIL5類似体の必要性
を低減する。
一セットのハプロタイプにハプロタイプマップ(haplotype mapped)されているこ
とを式Vが要求することに留意されたい。 したがって、IL5類似体に導入されるT細胞エピトープを選択するときは、エピ
トープに関する利用可能な全ての知識: 1)個体群における各エピトープへの応答
頻度、2)MHC制限データ及び3)関連するハプロタイプ個体群における頻度を含め
ることが重要である。 動物種の個体又は動物個体群の大部分において活性な、天然に存在する“乱交
雑”T-細胞エピトープが多量に存在する。これらは好ましくはワクチンに導入さ
れ、それによって同一ワクチンにおける極めて多量の異なるIL5類似体の必要性
を低減する。
【００４７】 本発明によれば、乱交雑エピトープは、破傷風トキソイド(例えばP2及びP30エ
ピトープ)、ジフテリアトキソイド、インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)及
びピー・ファルシパルム(P.falciparum) CS抗原由来エピトープのような天然に
存在するヒトT-細胞エピトープであってもよい。 長年にわたり、その他の乱交雑T-細胞エピトープが多数同定されている。特に
、異なるHLA-DRアレレによってエンコードされるHLA-DR分子の大部分に結合しう
るペプチドが同定されており、これらは全て本発明にしたがって使用されるIL5
類似体に導入される可能性のあるT-細胞エピトープである。すべてここに引用し
て組み込まれる以下の文献に記載のエピトープも参照のこと: WO 98/23635 (Fra
zer IH ら、The University of Queenslandに譲渡); Southwood S ら、1998, J.
Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F ら、1988, Nature 336: 778-780; Ch
icz RM ら、1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J ら., 1993, Cell 74: 19
7-203; 及びFalk K ら、1994, Immunogenetics 39: 230-242。最後の文献は、HL
A-DQリガンド及びHLA-DPリガンドについても論じている。これら5文献に挙げら
れるエピトープは、全て本発明で使用される天然エピトープと共通のモチーフを
共有するため、その候補として適切である。
ピトープ)、ジフテリアトキソイド、インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)及
びピー・ファルシパルム(P.falciparum) CS抗原由来エピトープのような天然に
存在するヒトT-細胞エピトープであってもよい。 長年にわたり、その他の乱交雑T-細胞エピトープが多数同定されている。特に
、異なるHLA-DRアレレによってエンコードされるHLA-DR分子の大部分に結合しう
るペプチドが同定されており、これらは全て本発明にしたがって使用されるIL5
類似体に導入される可能性のあるT-細胞エピトープである。すべてここに引用し
て組み込まれる以下の文献に記載のエピトープも参照のこと: WO 98/23635 (Fra
zer IH ら、The University of Queenslandに譲渡); Southwood S ら、1998, J.
Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F ら、1988, Nature 336: 778-780; Ch
icz RM ら、1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J ら., 1993, Cell 74: 19
7-203; 及びFalk K ら、1994, Immunogenetics 39: 230-242。最後の文献は、HL
A-DQリガンド及びHLA-DPリガンドについても論じている。これら5文献に挙げら
れるエピトープは、全て本発明で使用される天然エピトープと共通のモチーフを
共有するため、その候補として適切である。
【００４８】 あるいは、エピトープはMHCクラスII分子の大部分を結合しうるいずれかの人
為的なT-細胞エピトープであってもよい。この明細書において、WO 95/07707及
び対応する論文Alexander J ら、1994, Immunity 1: 751-761 (両者ともここに
引用して組み込む)に記載のpan DR エピトープペプチド("PADRE")が、本発明に
したがって使用されるエピトープの候補として興味深い。これらの論文に開示さ
れる最も有効なPADREペプチドは、投与時の安定性を改善するためにC-末端及びN
-末端にD-アミノ酸を担持することに留意されたい。しかしながら、本発明は第
一に、適切なエピトープを修飾IL5の一部として組み込むことを目的とする。こ
れはその後、APCのリソソーム分画内で酵素的に破壊し、続いてMHC-II分子に関
連して提示を行う。したがって、本発明において使用されるエピトープにD-アミ
ノ酸を組み込むことは得策ではない。 特に好ましいPADREペプチドのひとつは、アミノ酸配列AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID
NO:65)又は免疫学的に有効なそのサブ配列を有するペプチドである。これと、
同じMHC制限を欠いている他のエピトープが、本発明の方法で使用されるIL5類似
体に存在すべき好ましいT-細胞エピトープである。このような超-乱交雑エピト
ープは、ワクチン注射した動物の免疫系に単一の修飾IL5のみを提示する、本発
明の最も簡単な実施態様を可能にする。
為的なT-細胞エピトープであってもよい。この明細書において、WO 95/07707及
び対応する論文Alexander J ら、1994, Immunity 1: 751-761 (両者ともここに
引用して組み込む)に記載のpan DR エピトープペプチド("PADRE")が、本発明に
したがって使用されるエピトープの候補として興味深い。これらの論文に開示さ
れる最も有効なPADREペプチドは、投与時の安定性を改善するためにC-末端及びN
-末端にD-アミノ酸を担持することに留意されたい。しかしながら、本発明は第
一に、適切なエピトープを修飾IL5の一部として組み込むことを目的とする。こ
れはその後、APCのリソソーム分画内で酵素的に破壊し、続いてMHC-II分子に関
連して提示を行う。したがって、本発明において使用されるエピトープにD-アミ
ノ酸を組み込むことは得策ではない。 特に好ましいPADREペプチドのひとつは、アミノ酸配列AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID
NO:65)又は免疫学的に有効なそのサブ配列を有するペプチドである。これと、
同じMHC制限を欠いている他のエピトープが、本発明の方法で使用されるIL5類似
体に存在すべき好ましいT-細胞エピトープである。このような超-乱交雑エピト
ープは、ワクチン注射した動物の免疫系に単一の修飾IL5のみを提示する、本発
明の最も簡単な実施態様を可能にする。
【００４９】 上記のように、IL5の修飾は、修飾IL5をAPC又はB-リンパ球に標的化する第一
部分の導入を含んでいてもよい。例えば、第一部分は、B-リンパ球の特異的な表
面抗原又はAPC特異的な表面抗原に特異的な結合パートナーであってもよい。そ
のような特異的な表面抗原の多くは、当該技術において公知である。例えば、部
分はB-リンパ球又はAPCに受容体がある炭水化物であってもよい(例えばマンナン
又はマンノース)。又は、第二部分はハプテンであってもよい。APC又はリンパ球
で表面分子を特異的に認識する抗体フラグメントも、第一部分として使用するこ
とができる(表面分子は、例えばFCγRIのようなマクロファージ及び単球のFCγ
受容体、あるいはCD40又はCTLA-4等のようないずれかの他の特異的な表面マーカ
ーであってもよい)。これら全ての代表的な標的化分子は、アジュバントの一部
としても使用できることは理解されたい(以下を参照のこと)。 免疫応答を増強するために修飾IL5ポリペプチドをある細胞型に標的化するこ
との代案又は補足として、免疫系を刺激する上記第二部分を含むことによって免
疫系の応答性レベルを増強することができる。このような第二部分の一般的な例
としては、サイトカイン、熱ショックタンパク質又は分子シャペロンならびにそ
れらの有効な部分がある。
部分の導入を含んでいてもよい。例えば、第一部分は、B-リンパ球の特異的な表
面抗原又はAPC特異的な表面抗原に特異的な結合パートナーであってもよい。そ
のような特異的な表面抗原の多くは、当該技術において公知である。例えば、部
分はB-リンパ球又はAPCに受容体がある炭水化物であってもよい(例えばマンナン
又はマンノース)。又は、第二部分はハプテンであってもよい。APC又はリンパ球
で表面分子を特異的に認識する抗体フラグメントも、第一部分として使用するこ
とができる(表面分子は、例えばFCγRIのようなマクロファージ及び単球のFCγ
受容体、あるいはCD40又はCTLA-4等のようないずれかの他の特異的な表面マーカ
ーであってもよい)。これら全ての代表的な標的化分子は、アジュバントの一部
としても使用できることは理解されたい(以下を参照のこと)。 免疫応答を増強するために修飾IL5ポリペプチドをある細胞型に標的化するこ
との代案又は補足として、免疫系を刺激する上記第二部分を含むことによって免
疫系の応答性レベルを増強することができる。このような第二部分の一般的な例
としては、サイトカイン、熱ショックタンパク質又は分子シャペロンならびにそ
れらの有効な部分がある。
【００５０】 本発明にしたがって使用される適切なサイトカインは、通常ワクチン組成物に
おいてアジュバントとして機能するもの、例えばインターフェロンγ(IFN-γ)、
Flt3L、インターロイキン1(IL-1)、インターロイキン2(IL-2)、インターロイキ
ン4(IL-4)、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン12(IL-12)、インター
ロイキン13(IL-13)、インターロイキン15(IL-15)及び顆粒球-マクロファージコ
ロニー刺激因子(GM-CSF)である。あるいは、サイトカイン分子の機能的部分が第
二部分として十分である。このようなサイトカインのアジュバント物質としての
使用に関しては、下記の記載を参照のこと。IL-4及びIL-3双方の分子はアトピー
及び喘息の病状において主要なエフェクター分子として知られているので、あっ
たとしても、それらの使用は極めて注意深く行われるべきであることに留意され
たい。 本発明によれば、第二部分として使用される適当な熱ショックタンパク質又は
分子シャペロンは、HSP70、HSP90、HSC70、GRP94(gp96としても公知、Wearsch P
Aら、1998, Biochemistry 37: 5709-19参照)ならびにCRT(カルレチクリン(calre
ticulin))であってもよい。
おいてアジュバントとして機能するもの、例えばインターフェロンγ(IFN-γ)、
Flt3L、インターロイキン1(IL-1)、インターロイキン2(IL-2)、インターロイキ
ン4(IL-4)、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン12(IL-12)、インター
ロイキン13(IL-13)、インターロイキン15(IL-15)及び顆粒球-マクロファージコ
ロニー刺激因子(GM-CSF)である。あるいは、サイトカイン分子の機能的部分が第
二部分として十分である。このようなサイトカインのアジュバント物質としての
使用に関しては、下記の記載を参照のこと。IL-4及びIL-3双方の分子はアトピー
及び喘息の病状において主要なエフェクター分子として知られているので、あっ
たとしても、それらの使用は極めて注意深く行われるべきであることに留意され
たい。 本発明によれば、第二部分として使用される適当な熱ショックタンパク質又は
分子シャペロンは、HSP70、HSP90、HSC70、GRP94(gp96としても公知、Wearsch P
Aら、1998, Biochemistry 37: 5709-19参照)ならびにCRT(カルレチクリン(calre
ticulin))であってもよい。
【００５１】 あるいは、第二部分はリステリオリシン(listeriolycin)(LLO)、脂質A及び非
耐熱性エンテロトキシンのような毒素であってもよい。また、MDP(ムラミルジペ
プチド)及びトレハロースジエステルTDM及びTDEなどの多数のマイコバクテリア
誘導体が、興味深い可能性のあるものである。 免疫系への修飾IL5の提示を高める第三部分を導入しうることもまた、本発明
の重要な実施態様である。この原理のいくつかの例が当該技術において示されて
いる。例えば、Borrelia burgdorferiタンパク質OspAのパルミトイル脂質化アン
カーを利用して、自己アジュバント化ポリペプチドを提供できることが知られて
いる(例えばWO 96/40718を参照)。脂質化したタンパク質は、ポリペプチドの脂
質化アンカー部分とそこから突出する残りの分子部分からなる核を有するミセル
状構造を形成し、その結果、抗原決定基を多数提示するものと考えられる。した
がって、これの使用及び異なる脂質化アンカー(例えばミリスチル基、ミリスチ
ル基、ファルネシル基、ゲラニル-ゲラニル基、GPIアンカー及びN-アシルジグリ
セライド基)を用いた関連の研究は、特に、組換えて製造したタンパク質内の脂
質化アンカーの供給がかなり簡単で、例えば天然に存在するシグナル配列を修飾
IL5ポリペプチドの融合パートナーとして使用することのみを要求するため、本
発明の好ましい実施態様である。もう一つの可能性として、相補因子C3のC3dフ
ラグメント又はC3自体の使用が挙げられる(Dempsey ら、1996, Science 271, 34
8-350及びLou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462参照)。
耐熱性エンテロトキシンのような毒素であってもよい。また、MDP(ムラミルジペ
プチド)及びトレハロースジエステルTDM及びTDEなどの多数のマイコバクテリア
誘導体が、興味深い可能性のあるものである。 免疫系への修飾IL5の提示を高める第三部分を導入しうることもまた、本発明
の重要な実施態様である。この原理のいくつかの例が当該技術において示されて
いる。例えば、Borrelia burgdorferiタンパク質OspAのパルミトイル脂質化アン
カーを利用して、自己アジュバント化ポリペプチドを提供できることが知られて
いる(例えばWO 96/40718を参照)。脂質化したタンパク質は、ポリペプチドの脂
質化アンカー部分とそこから突出する残りの分子部分からなる核を有するミセル
状構造を形成し、その結果、抗原決定基を多数提示するものと考えられる。した
がって、これの使用及び異なる脂質化アンカー(例えばミリスチル基、ミリスチ
ル基、ファルネシル基、ゲラニル-ゲラニル基、GPIアンカー及びN-アシルジグリ
セライド基)を用いた関連の研究は、特に、組換えて製造したタンパク質内の脂
質化アンカーの供給がかなり簡単で、例えば天然に存在するシグナル配列を修飾
IL5ポリペプチドの融合パートナーとして使用することのみを要求するため、本
発明の好ましい実施態様である。もう一つの可能性として、相補因子C3のC3dフ
ラグメント又はC3自体の使用が挙げられる(Dempsey ら、1996, Science 271, 34
8-350及びLou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462参照)。
【００５２】 IL5の重要なエピトープ領域の多数(例えば少なくとも2つ)の複製を免疫系に好
ましく提示することを結果として生じる本発明の別の実施態様として、ある担体
分子に対するIL5、そのサブ配列又は変異型の共有又は非共有結合がある。例え
ば、デキストランのような炭水化物などのポリマーが使用可能である(例えば、L
ees A ら、 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A ら、 1990, J Immunol. 145
: 3594-3600を参照のこと)。しかし、マンノースやマンナンもまた有用な代替手
段である。例えば、大腸菌及び他の細菌からの膜内在性タンパク質もまた、有用
な接合パートナーである。キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)、破傷風ト
キソイド、ジフテリアトキソイド及びウシ血清アルブミン(BSA)のような従来の
担体分子も好ましく、有用な接合パートナーである。
ましく提示することを結果として生じる本発明の別の実施態様として、ある担体
分子に対するIL5、そのサブ配列又は変異型の共有又は非共有結合がある。例え
ば、デキストランのような炭水化物などのポリマーが使用可能である(例えば、L
ees A ら、 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A ら、 1990, J Immunol. 145
: 3594-3600を参照のこと)。しかし、マンノースやマンナンもまた有用な代替手
段である。例えば、大腸菌及び他の細菌からの膜内在性タンパク質もまた、有用
な接合パートナーである。キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)、破傷風ト
キソイド、ジフテリアトキソイド及びウシ血清アルブミン(BSA)のような従来の
担体分子も好ましく、有用な接合パートナーである。
【００５３】 天然のIL5のある領域は、修飾を行うのに極めて適していると考えられる。ル
ープ1〜3の少なくとも1つ又はヘリックスDに対するC-末端アミノ酸残基における
修飾(このループとヘリックスDはヒト及びマウスIL5について図3に示すものに相
当)は、所望の構築物を生産し、ワクチン注射の結果をもたらす可能性が高いと
予想される。これらの選択領域の基礎をなす見解は、a)既知で予想されるB-細胞
エピトープの保存、b)三次構造及び四次構造の保存等である(実施例序文参照)。
いずれにせよ、上記のとおり、種々の位置でT-細胞エピトープの導入に付されて
いる一連の修飾IL5分子のスクリーンは、極めて容易である。 この発明の最も好ましい実施態様はヒトIL5のダウン-レギュレーションを伴う
ので、それ故、上記のIL5ポリペプチドはヒトIL5ポリペプチドであることが好ま
しい。この具体例で、ヒトIL5ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1中の少なくとも1つ
のアミノ酸配列を長さが同じか又は異なるアミノ酸配列の少なくとも1つで置換
し、外来THエピトープを含むことによって修飾することが特に好ましい。置換さ
れるアミノ酸残基は、87-90残基、32-43残基、59-64残基、86-91残基及び110-113
残基からなる群から選択される。このような構築物の理論的解釈は、実施例に詳
細に論じる。
ープ1〜3の少なくとも1つ又はヘリックスDに対するC-末端アミノ酸残基における
修飾(このループとヘリックスDはヒト及びマウスIL5について図3に示すものに相
当)は、所望の構築物を生産し、ワクチン注射の結果をもたらす可能性が高いと
予想される。これらの選択領域の基礎をなす見解は、a)既知で予想されるB-細胞
エピトープの保存、b)三次構造及び四次構造の保存等である(実施例序文参照)。
いずれにせよ、上記のとおり、種々の位置でT-細胞エピトープの導入に付されて
いる一連の修飾IL5分子のスクリーンは、極めて容易である。 この発明の最も好ましい実施態様はヒトIL5のダウン-レギュレーションを伴う
ので、それ故、上記のIL5ポリペプチドはヒトIL5ポリペプチドであることが好ま
しい。この具体例で、ヒトIL5ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1中の少なくとも1つ
のアミノ酸配列を長さが同じか又は異なるアミノ酸配列の少なくとも1つで置換
し、外来THエピトープを含むことによって修飾することが特に好ましい。置換さ
れるアミノ酸残基は、87-90残基、32-43残基、59-64残基、86-91残基及び110-113
残基からなる群から選択される。このような構築物の理論的解釈は、実施例に詳
細に論じる。
【００５４】IL5及び修飾IL5ポリペプチドの処方 動物に投与することによってIL5ポリペプチド又はIL5修飾ポリペプチドを動物
の免疫系に提示するとき、ポリペプチドの処方は、当該技術において一般に承認
されている原理に基づく。 ペプチド配列を有効成分として含有するワクチンの調製法は、ここに引用して
すべて組み込まれる米国特許第4,608,251号；第4,601,903号；第4,599,231号；
第4,599,230号；第4,596,792号及び4,578,770号に例示されるように、一般に当
該技術においてよく理解されている。通常、このようなワクチンは液体溶液又は
懸濁液のいずれかにような注射剤；溶液又は懸濁液に入れるのに適した固体、注
射前の液体として調製されてもよい。製剤は乳化されていてもよい。有効な免疫
原性成分は、しばしば医薬的に受容され有効成分に和合する賦形剤と混合される
。適当な賦形剤は、例えば水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノー
ル等及びそれらの組み合わせである。また、望ましい場合には、ワクチンは少量
の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝薬、又はワクチンの有効性を高め
るアジュバントを含んでいてもよい(アジュバントについての下記の詳細な記述
を参考のこと)。
の免疫系に提示するとき、ポリペプチドの処方は、当該技術において一般に承認
されている原理に基づく。 ペプチド配列を有効成分として含有するワクチンの調製法は、ここに引用して
すべて組み込まれる米国特許第4,608,251号；第4,601,903号；第4,599,231号；
第4,599,230号；第4,596,792号及び4,578,770号に例示されるように、一般に当
該技術においてよく理解されている。通常、このようなワクチンは液体溶液又は
懸濁液のいずれかにような注射剤；溶液又は懸濁液に入れるのに適した固体、注
射前の液体として調製されてもよい。製剤は乳化されていてもよい。有効な免疫
原性成分は、しばしば医薬的に受容され有効成分に和合する賦形剤と混合される
。適当な賦形剤は、例えば水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノー
ル等及びそれらの組み合わせである。また、望ましい場合には、ワクチンは少量
の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝薬、又はワクチンの有効性を高め
るアジュバントを含んでいてもよい(アジュバントについての下記の詳細な記述
を参考のこと)。
【００５５】 ワクチンは従来、例えば、表皮下、表皮内、真皮内、真皮下又は筋肉内のいず
れかの注射によって非経口的に投与される。他の投与方法に適した追加的な処方
としては坐剤があり、時に経口、口腔内、舌下、腹腔内、鞘膜内、肛門、硬膜外
、脊髄及び頭蓋内処方がある。坐剤は例えばポリアルカレングリコール又はトリ
グリセライドなどの従来の結合剤及び担体を含んでもよい。このような坐剤は有
効成分を0.5-10％の範囲で、好ましくは1-2％の範囲で含有する混合物から形成
してもよい。経口処方は、例えば医薬等級マンニトール、ラクトース、澱粉、ス
テアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウ
ム等の通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸
剤、カプセル剤、持続放出処方又は粉剤の形状をとり、10-95％、好ましくは25-
70％の有効成分を含有する。経口処方については、コレラ毒素が興味深い処方パ
ートナーである（可能性のある接合パートナーでもある）。 ポリペプチドは、中性又は塩の形態としてワクチンに処方してもよい。医薬的
に受容な塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）及び塩
酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有
機酸で形成される塩が含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば
ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機
塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2−エチルアミノエタ
ノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。
れかの注射によって非経口的に投与される。他の投与方法に適した追加的な処方
としては坐剤があり、時に経口、口腔内、舌下、腹腔内、鞘膜内、肛門、硬膜外
、脊髄及び頭蓋内処方がある。坐剤は例えばポリアルカレングリコール又はトリ
グリセライドなどの従来の結合剤及び担体を含んでもよい。このような坐剤は有
効成分を0.5-10％の範囲で、好ましくは1-2％の範囲で含有する混合物から形成
してもよい。経口処方は、例えば医薬等級マンニトール、ラクトース、澱粉、ス
テアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウ
ム等の通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸
剤、カプセル剤、持続放出処方又は粉剤の形状をとり、10-95％、好ましくは25-
70％の有効成分を含有する。経口処方については、コレラ毒素が興味深い処方パ
ートナーである（可能性のある接合パートナーでもある）。 ポリペプチドは、中性又は塩の形態としてワクチンに処方してもよい。医薬的
に受容な塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）及び塩
酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有
機酸で形成される塩が含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば
ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機
塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2−エチルアミノエタ
ノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。
【００５６】 ワクチンは、容量処方に適合する方法で、治療的に有効かつ免疫原性となる量
で投与される。投与量は、例えば免疫応答を増加させる個体の免疫系の能力、及
び所望の防御の程度を含めて、治療される被験者に依存する。適当な用量範囲は
、1回のワクチン注射あたりで有効成分が数百μgのオーダーであり、好ましい範
囲は(1-10 mg範囲でのより多い量を考慮しても)約0.1μg〜2,000μgであり、例
えば約0.5μg〜1,000μg、好ましくは1μg〜500μg、特に約10μg〜100μgであ
る。初回投与のための適当な養生法及び追加注射も変えられるが、典型的には初
回投与の後に続けて接種するか、又はその他の投与が行われる。 適用方法は、広く異なっていてもよい。いずれの従来のワクチン投与法も適用
可能である。これらは生理的に受容な固体の基剤での経口投与、又は注射等によ
る生理的に受容な分散液の非経口的投与を含む。ワクチンの用量は投与経路に依
存し、ワクチン注射を受ける人の年齢及び抗原処方に応じて変化する。 ワクチンのポリペプチドには、ワクチン内で十分に免疫原性のものもあるが、
その他の幾つかにおいては、ワクチンがアジュバント物質をさらに含む場合に免
疫応答を高める。
で投与される。投与量は、例えば免疫応答を増加させる個体の免疫系の能力、及
び所望の防御の程度を含めて、治療される被験者に依存する。適当な用量範囲は
、1回のワクチン注射あたりで有効成分が数百μgのオーダーであり、好ましい範
囲は(1-10 mg範囲でのより多い量を考慮しても)約0.1μg〜2,000μgであり、例
えば約0.5μg〜1,000μg、好ましくは1μg〜500μg、特に約10μg〜100μgであ
る。初回投与のための適当な養生法及び追加注射も変えられるが、典型的には初
回投与の後に続けて接種するか、又はその他の投与が行われる。 適用方法は、広く異なっていてもよい。いずれの従来のワクチン投与法も適用
可能である。これらは生理的に受容な固体の基剤での経口投与、又は注射等によ
る生理的に受容な分散液の非経口的投与を含む。ワクチンの用量は投与経路に依
存し、ワクチン注射を受ける人の年齢及び抗原処方に応じて変化する。 ワクチンのポリペプチドには、ワクチン内で十分に免疫原性のものもあるが、
その他の幾つかにおいては、ワクチンがアジュバント物質をさらに含む場合に免
疫応答を高める。
【００５７】 ワクチンへのアジュバント効果を達成するための様々の方法が公知である。一
般的な原理及び方法は、ともに引用してここに組み込まれる"The Theory and Pr
actical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (編集)
, John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6及び"Vaccines: New Generation
n Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G ら (編集), Plenum Press,
New York, ISBN 0-306-45283- 9に詳細に述べられている。 自己抗原に対する自己耐性の破壊の促進が立証され得るアジュバントを使用す
ることが特に好ましい。実際、これは、自家ワクチンにおいて非修飾IL5を有効
成分として用いる場合に必須である。適当なアジュバントの非制限的な例は、免
疫標識化アジュバント；毒素、サイトカイン及びマイコバクテリア誘導体などの
免疫調節アジュバント；油製剤；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン
；免疫刺激複合体マトリクス(ISCOMマトリクス)；粒子；DDA；アルミニウムアジ
ュバント；DNAアジュバント；γ-イヌリン；及びカプセル化アジュバントからな
る群より選択される。一般に、類似体において第一、第二及び第三の部分として
有用な化合物及び薬剤に関する上記の開示は、本発明によるワクチンのアジュバ
ントにおけるそれらの使用にも必要な変更を加えて言及することに留意されたい
。
般的な原理及び方法は、ともに引用してここに組み込まれる"The Theory and Pr
actical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (編集)
, John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6及び"Vaccines: New Generation
n Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G ら (編集), Plenum Press,
New York, ISBN 0-306-45283- 9に詳細に述べられている。 自己抗原に対する自己耐性の破壊の促進が立証され得るアジュバントを使用す
ることが特に好ましい。実際、これは、自家ワクチンにおいて非修飾IL5を有効
成分として用いる場合に必須である。適当なアジュバントの非制限的な例は、免
疫標識化アジュバント；毒素、サイトカイン及びマイコバクテリア誘導体などの
免疫調節アジュバント；油製剤；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン
；免疫刺激複合体マトリクス(ISCOMマトリクス)；粒子；DDA；アルミニウムアジ
ュバント；DNAアジュバント；γ-イヌリン；及びカプセル化アジュバントからな
る群より選択される。一般に、類似体において第一、第二及び第三の部分として
有用な化合物及び薬剤に関する上記の開示は、本発明によるワクチンのアジュバ
ントにおけるそれらの使用にも必要な変更を加えて言及することに留意されたい
。
【００５８】 アジュバントの投与は、通常緩衝食塩水中0.05〜0.1％溶液として使用される
水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム(alum)等の薬剤、0.25％溶液として
使用される糖の合成ポリマー（例えばカルボポル（登録商標））との混和物の使
用を含み、70〜101℃の温度でそれぞれ30秒〜2分熱処理することによるワクチン
内でのタンパク質の凝集、ならびに架橋剤による凝集も可能である。ペプシンで
処理した抗体(Fabフラグメント)での再活性化によるアルブミンへの凝集、シー
・パルブム(C. parvum)、内毒素又はグラム陰性細菌のリポ多糖類成分などの細
菌細胞との混合物、マンニッドモノ-オレエート(Aracel A)のような生理的に受
容な油性ビヒクル中のエマルジョン、又は阻害基体として使用されるパーフルオ
ロカーボン(Fluosol-DA)の20％溶液エマルジョンとのエマルジョンもまた、利用
可能である。スクアレン及びIFAなどの油との混和物も好ましい。 本発明によれば、DDA (ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド)はDNA
やγ-イヌリンと同様、アジュバントの候補として興味深い。しかし、フロイン
ト完全アジュバント及び不完全アジュバント、ならびにQuilA及びQS21のような
キラヤサポニンもまたRIBIであるので興味深い。さらなる可能性としては、モノ
ホスホリルリピドA(MPL)、上記のC3とC3d及びムラミルジペプチド(MDP)がある。
水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム(alum)等の薬剤、0.25％溶液として
使用される糖の合成ポリマー（例えばカルボポル（登録商標））との混和物の使
用を含み、70〜101℃の温度でそれぞれ30秒〜2分熱処理することによるワクチン
内でのタンパク質の凝集、ならびに架橋剤による凝集も可能である。ペプシンで
処理した抗体(Fabフラグメント)での再活性化によるアルブミンへの凝集、シー
・パルブム(C. parvum)、内毒素又はグラム陰性細菌のリポ多糖類成分などの細
菌細胞との混合物、マンニッドモノ-オレエート(Aracel A)のような生理的に受
容な油性ビヒクル中のエマルジョン、又は阻害基体として使用されるパーフルオ
ロカーボン(Fluosol-DA)の20％溶液エマルジョンとのエマルジョンもまた、利用
可能である。スクアレン及びIFAなどの油との混和物も好ましい。 本発明によれば、DDA (ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド)はDNA
やγ-イヌリンと同様、アジュバントの候補として興味深い。しかし、フロイン
ト完全アジュバント及び不完全アジュバント、ならびにQuilA及びQS21のような
キラヤサポニンもまたRIBIであるので興味深い。さらなる可能性としては、モノ
ホスホリルリピドA(MPL)、上記のC3とC3d及びムラミルジペプチド(MDP)がある。
【００５９】 リポソーム処方もまたアジュバント効果を与えることが知られている。したが
ってリポソームアジュバントは本発明において好ましい。 免疫刺激複合体マトリクス型(ISCOM（登録商標）マトリクス)アジュバントも
また、本発明において好ましい選択肢である。なぜなら特にこの種のアジュバン
トがAPCによるMHCクラスIIの発現をアップレギュレートできるからである。ISCO
M（登録商標）マトリクスは、キラヤ・サポナリア(Quillaja saponaria)由来の(
任意に分画した)サポニン(トリテルペノイド)、コレステロール、及びリン脂質
からなる。免疫原性タンパク質と混和した場合、得られる粒状処方は、サポニン
成分60-70％ w/w、コレステロール及びリン脂質10-15％ w/w及びタンパク質10-1
5％ w/wからなるISCOM粒子として既知のものである。免疫刺激複合体の組成及び
使用に関する詳細は例えばアジュバントに関する上記教本にみられるが、Morein
B ら、1995, Clin. Immunother. 3: 461-475ならびにBarr IG 及び Mitchell G
F, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (両者とも引用してここに組み込
まれる)にも完全な免疫刺激複合体の製法に関する有用な教示が示されている。
ってリポソームアジュバントは本発明において好ましい。 免疫刺激複合体マトリクス型(ISCOM（登録商標）マトリクス)アジュバントも
また、本発明において好ましい選択肢である。なぜなら特にこの種のアジュバン
トがAPCによるMHCクラスIIの発現をアップレギュレートできるからである。ISCO
M（登録商標）マトリクスは、キラヤ・サポナリア(Quillaja saponaria)由来の(
任意に分画した)サポニン(トリテルペノイド)、コレステロール、及びリン脂質
からなる。免疫原性タンパク質と混和した場合、得られる粒状処方は、サポニン
成分60-70％ w/w、コレステロール及びリン脂質10-15％ w/w及びタンパク質10-1
5％ w/wからなるISCOM粒子として既知のものである。免疫刺激複合体の組成及び
使用に関する詳細は例えばアジュバントに関する上記教本にみられるが、Morein
B ら、1995, Clin. Immunother. 3: 461-475ならびにBarr IG 及び Mitchell G
F, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (両者とも引用してここに組み込
まれる)にも完全な免疫刺激複合体の製法に関する有用な教示が示されている。
【００６０】 アジュバント効果を達成するもう一つの非常に興味深い(ゆえに好ましい)可能
性は、Gosselinら、1992(ここに引用して組み込まれる)に記載の手法を採用する
ことである。要約すると、本発明の抗原のような関連抗原の提示は、単球/マク
ロファージのFcγ受容体に対する抗体(又は抗原結合抗体フラグメント)に抗原を
接合することによって高められる。特に、抗原と抗-FcγRIの接合体がワクチン
注射を目的とした免疫原性を高めることが証明されている。 その他の可能性としては、上記した標的化物質及び免疫調節物質(とりわけサ
イトカイン)を、IL5の修飾変異型で第一及び第二の部分の候補物として使用する
ことが含まれる。これに関して、ポリI:Cのようなサイトカインの合成誘導物質
もまた可能性がある。 適切なマイコバクテリア誘導体は、ムラミルジペプチド、完全フロイントアジ
ュバント、RIBI、ならびにTDM及びTDEなどのトレハロースジエステルからなる群
より選択される。 適切な免疫標的化アジュバントは、CD40リガンド及びCD40抗体、又はその特異
的結合フラグメント(上記論述を参照)、マンノース、Fabフラグメント及びCTLA-
4からなる群より選択される。
性は、Gosselinら、1992(ここに引用して組み込まれる)に記載の手法を採用する
ことである。要約すると、本発明の抗原のような関連抗原の提示は、単球/マク
ロファージのFcγ受容体に対する抗体(又は抗原結合抗体フラグメント)に抗原を
接合することによって高められる。特に、抗原と抗-FcγRIの接合体がワクチン
注射を目的とした免疫原性を高めることが証明されている。 その他の可能性としては、上記した標的化物質及び免疫調節物質(とりわけサ
イトカイン)を、IL5の修飾変異型で第一及び第二の部分の候補物として使用する
ことが含まれる。これに関して、ポリI:Cのようなサイトカインの合成誘導物質
もまた可能性がある。 適切なマイコバクテリア誘導体は、ムラミルジペプチド、完全フロイントアジ
ュバント、RIBI、ならびにTDM及びTDEなどのトレハロースジエステルからなる群
より選択される。 適切な免疫標的化アジュバントは、CD40リガンド及びCD40抗体、又はその特異
的結合フラグメント(上記論述を参照)、マンノース、Fabフラグメント及びCTLA-
4からなる群より選択される。
【００６１】 適切なポリマーアジュバントは、デキストラン、PEG、澱粉、マンナン及びマ
ンノース等の炭水化物；プラスチックポリマー自体；及びラテックスビーズ等の
ラテックスからなる群より選択される。 免疫応答を調節するさらに別の興味深い方法は、IL5免疫原を(任意にアジュバ
ント及び医薬的に受容な担体及びビヒクルとともに)"仮想リンパ節(virtual lym
ph node)" (VLN) (ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY
10017-6501により開発された特許医療装置)に含めることである。VLN(細管状装
置)は、リンパ節の構造と機能を模倣している。VLNを皮膚下に挿入することによ
り、サイトカイン及びケモカインを増加させた滅菌炎症部位が形成される。T-細
胞及びB-細胞ならびにAPCは、危険信号に迅速に応答し、炎症箇所に戻り、VLNの
多孔質マトリクス内部に蓄積する。抗原に対する免疫応答を増加させるために要
求される必要抗原用量はVLNを使用すると減少すること、VLNを使用したワクチン
注射によって付与される免疫防御はRibiをアジュバントとして使用する従来の免
疫化を凌ぐものであることが、分かっている。この技術はとりわけ"From the La
boratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th - 15th 1998, Sea
scape Resort, Aptos, California"中のGelber C ら、1998, "Elicitation of R
obus T-cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunog
ens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node"に簡
潔に記載されている。
ンノース等の炭水化物；プラスチックポリマー自体；及びラテックスビーズ等の
ラテックスからなる群より選択される。 免疫応答を調節するさらに別の興味深い方法は、IL5免疫原を(任意にアジュバ
ント及び医薬的に受容な担体及びビヒクルとともに)"仮想リンパ節(virtual lym
ph node)" (VLN) (ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY
10017-6501により開発された特許医療装置)に含めることである。VLN(細管状装
置)は、リンパ節の構造と機能を模倣している。VLNを皮膚下に挿入することによ
り、サイトカイン及びケモカインを増加させた滅菌炎症部位が形成される。T-細
胞及びB-細胞ならびにAPCは、危険信号に迅速に応答し、炎症箇所に戻り、VLNの
多孔質マトリクス内部に蓄積する。抗原に対する免疫応答を増加させるために要
求される必要抗原用量はVLNを使用すると減少すること、VLNを使用したワクチン
注射によって付与される免疫防御はRibiをアジュバントとして使用する従来の免
疫化を凌ぐものであることが、分かっている。この技術はとりわけ"From the La
boratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th - 15th 1998, Sea
scape Resort, Aptos, California"中のGelber C ら、1998, "Elicitation of R
obus T-cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunog
ens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node"に簡
潔に記載されている。
【００６２】 ワクチンは少なくとも一年に1回、例えば、一年に少なくとも1、2、3、4、5、
6及び12回投与すべきであると予想される。より具体的には、一年に1-12回、例
えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12回、必要に応じて個体に投与
することが期待される。本発明による好ましい自家ワクチンの使用によって誘発
される記憶免疫性が永続的ではないことは、先に示している。したがって、免疫
系を類似体で定期的に攻撃させる必要がある。 遺伝的変異のため、異なる個体は、同一ポリペプチドに異なる強度の免疫応答
で反応する可能性がある。したがって、本発明のワクチンは、免疫応答を増加す
るために数個の異なるポリペプチドから構成されていてもよい(外来T-細胞エピ
トープ導入の選択に関する上記記載も参照のこと)。ワクチンは、2以上のポリペ
プチドから構成されていてもよい。その場合、全てのポリペプチドは上記で定義
したものである。 したがって、ワクチンは3-20個の異なる修飾又は非修飾ポリペプチド、例えば
、3-10個の異なるポリペプチドで構成されていてもよい。しかしながら、通常は
ポリペプチドの数は最小、例えば1又は2個のペプチドに保たれるべきであろう。
6及び12回投与すべきであると予想される。より具体的には、一年に1-12回、例
えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12回、必要に応じて個体に投与
することが期待される。本発明による好ましい自家ワクチンの使用によって誘発
される記憶免疫性が永続的ではないことは、先に示している。したがって、免疫
系を類似体で定期的に攻撃させる必要がある。 遺伝的変異のため、異なる個体は、同一ポリペプチドに異なる強度の免疫応答
で反応する可能性がある。したがって、本発明のワクチンは、免疫応答を増加す
るために数個の異なるポリペプチドから構成されていてもよい(外来T-細胞エピ
トープ導入の選択に関する上記記載も参照のこと)。ワクチンは、2以上のポリペ
プチドから構成されていてもよい。その場合、全てのポリペプチドは上記で定義
したものである。 したがって、ワクチンは3-20個の異なる修飾又は非修飾ポリペプチド、例えば
、3-10個の異なるポリペプチドで構成されていてもよい。しかしながら、通常は
ポリペプチドの数は最小、例えば1又は2個のペプチドに保たれるべきであろう。
【００６３】核酸ワクチン注射 ペプチドベースワクチンの標準的な投与の代替案として、核酸ワクチン注射技
術("核酸免疫化"、"遺伝的免疫化"及び"遺伝子免疫化" としても知られる)は、
多くの興味ある特徴を提供する。 まず、従来のワクチン法と対比して、核酸ワクチン注射は、免疫原性剤の資源
を消費するような大規模製造(例えば、修飾IL5を製造する微生物の産業規模の発
酵形態)を必要としない。さらに、装置の清浄化及び免疫原の再生スキームの必
要がない。最後に、核酸ワクチン注射は、ワクチン注射した個体の生化学的器官
に依存して導入した核酸の発現生成物を生ずるため、発現生成物について最適な
翻訳後プロセシングが起こることが期待される。これは、自家ワクチン注射の場
合には特に重要である。なぜなら、上記したように、最初のIL5 B-細胞エピトー
プに関し有意なフラクションは修飾分子で保持されるべきであり、B-細胞エピト
ープは原則としていずれかの(生体)分子の部分(例えば炭水化物、脂質、タンパ
ク質など)から構成できるからである。したがって、免疫原の天然のグリコシル
化及び脂質化パターンは免疫原性全体に極めて重要であり、これは宿主に免疫原
を生じさせることによって確実となることが予想される。
術("核酸免疫化"、"遺伝的免疫化"及び"遺伝子免疫化" としても知られる)は、
多くの興味ある特徴を提供する。 まず、従来のワクチン法と対比して、核酸ワクチン注射は、免疫原性剤の資源
を消費するような大規模製造(例えば、修飾IL5を製造する微生物の産業規模の発
酵形態)を必要としない。さらに、装置の清浄化及び免疫原の再生スキームの必
要がない。最後に、核酸ワクチン注射は、ワクチン注射した個体の生化学的器官
に依存して導入した核酸の発現生成物を生ずるため、発現生成物について最適な
翻訳後プロセシングが起こることが期待される。これは、自家ワクチン注射の場
合には特に重要である。なぜなら、上記したように、最初のIL5 B-細胞エピトー
プに関し有意なフラクションは修飾分子で保持されるべきであり、B-細胞エピト
ープは原則としていずれかの(生体)分子の部分(例えば炭水化物、脂質、タンパ
ク質など)から構成できるからである。したがって、免疫原の天然のグリコシル
化及び脂質化パターンは免疫原性全体に極めて重要であり、これは宿主に免疫原
を生じさせることによって確実となることが予想される。
【００６４】 したがって、本発明の好ましい実施態様は、修飾IL5をエンコードする核酸を
動物細胞に導入し、それにより、導入された核酸に関し細胞でインビボ発現をさ
せることによる、免疫系への修飾IL5の提示からなる。 この実施態様において、導入された核酸は、裸のDNA、荷電又は非荷電脂質で
製剤化したDNA、リポソームで製剤化したDNA、ウイルスベクターに含めたDNA、
トランスフェクション促進タンパク質又はポリペプチドで製剤化したDNA、標的
タンパク質又はポリペプチドで製剤化したDNA、カルシウム沈殿剤で製剤化したD
NA、不活性担体分子に結合したDNA、ポリマー、例えばPLGA(WO98/31398に記載の
マイクロカプセル化技術参照)又はキチン又はキトサンでカプセル化したDNA、な
らびにアジュバントで製剤化したDNAの形態になり得るDNAであることが好ましい
。本文において、従来のワクチン処方におけるアジュバントの使用に関するほと
んど全ての考察が、DNAワクチンの処方に適用されることに留意されたい。した
がって、ポリペプチドベースワクチンに関連したアジュバントの使用に関するこ
こでの全ての開示は、必要な変更を加えて、核酸ワクチン注射技術におけるその
使用に適用される。
動物細胞に導入し、それにより、導入された核酸に関し細胞でインビボ発現をさ
せることによる、免疫系への修飾IL5の提示からなる。 この実施態様において、導入された核酸は、裸のDNA、荷電又は非荷電脂質で
製剤化したDNA、リポソームで製剤化したDNA、ウイルスベクターに含めたDNA、
トランスフェクション促進タンパク質又はポリペプチドで製剤化したDNA、標的
タンパク質又はポリペプチドで製剤化したDNA、カルシウム沈殿剤で製剤化したD
NA、不活性担体分子に結合したDNA、ポリマー、例えばPLGA(WO98/31398に記載の
マイクロカプセル化技術参照)又はキチン又はキトサンでカプセル化したDNA、な
らびにアジュバントで製剤化したDNAの形態になり得るDNAであることが好ましい
。本文において、従来のワクチン処方におけるアジュバントの使用に関するほと
んど全ての考察が、DNAワクチンの処方に適用されることに留意されたい。した
がって、ポリペプチドベースワクチンに関連したアジュバントの使用に関するこ
こでの全ての開示は、必要な変更を加えて、核酸ワクチン注射技術におけるその
使用に適用される。
【００６５】 上記のポリペプチドベースワクチンの投与経路及び投与スキームに関する限り
は、本発明の核酸ワクチンにも適用可能であり、ポリペプチドについての投与経
路及び投与スキームに適する上記の論議は全て、必要な変更を加えて核酸に適用
される。このことに、核酸ワクチンが静脈内及び動脈内で適当に投与され得るこ
とが追記される。さらに、核酸ワクチンがいわゆる遺伝子銃の使用で投与でき、
それ故に、この方法及び等価な投与方法が本発明の一部としてみなされることは
、当該分野で周知である。最後に、核酸の投与でVLNを使用することも良い結果
をもたらすことが報告されており、したがって、この特異的な投与方法が特に好
ましい。 さらに、免疫化剤として使用される核酸は、例えば有用なアジュバントとして
論じたサイトカインのような上記免疫調節物質の形態で、第一、第二及び/又は
第三の部分をエンコードする領域を含むことができる。この実施態様の好ましい
例には、異なるリーディングフレーム中又は少なくとも異なるプロモーターの制
御下で類似体をコードする領域と免疫調節物質をコードする領域を有することが
包含される。これにより、類似体又はエピトープが免疫調節物質に対する融合パ
ートナーとして生じることが回避される。あるいは、2つの異なるヌクレオチド
フラグメントを使用することができるが、これは両方のコード領域が同一分子に
含まれる際に確実に同時発現されるという利点から、あまり好ましくない。
は、本発明の核酸ワクチンにも適用可能であり、ポリペプチドについての投与経
路及び投与スキームに適する上記の論議は全て、必要な変更を加えて核酸に適用
される。このことに、核酸ワクチンが静脈内及び動脈内で適当に投与され得るこ
とが追記される。さらに、核酸ワクチンがいわゆる遺伝子銃の使用で投与でき、
それ故に、この方法及び等価な投与方法が本発明の一部としてみなされることは
、当該分野で周知である。最後に、核酸の投与でVLNを使用することも良い結果
をもたらすことが報告されており、したがって、この特異的な投与方法が特に好
ましい。 さらに、免疫化剤として使用される核酸は、例えば有用なアジュバントとして
論じたサイトカインのような上記免疫調節物質の形態で、第一、第二及び/又は
第三の部分をエンコードする領域を含むことができる。この実施態様の好ましい
例には、異なるリーディングフレーム中又は少なくとも異なるプロモーターの制
御下で類似体をコードする領域と免疫調節物質をコードする領域を有することが
包含される。これにより、類似体又はエピトープが免疫調節物質に対する融合パ
ートナーとして生じることが回避される。あるいは、2つの異なるヌクレオチド
フラグメントを使用することができるが、これは両方のコード領域が同一分子に
含まれる際に確実に同時発現されるという利点から、あまり好ましくない。
【００６６】 したがって、本発明は、 - 本発明の核酸フラグメント又はベクター(後述のベクターの論述参照)、及び
- 上述の、医薬的かつ免疫学的に受容なビヒクル及び/又は担体及び/又はアジ
ュバント からなる、IL5に対する抗体の産生を誘発する組成物にも関する。 通常の状況では、IL5変異体をエンコードする核酸は、発現がウイルスプロモ
ーター制御下にあるベクターの形態で導入される。本発明によるベクター及びDN
Aフラグメントについてのさらに詳細な論述については、下記の記載を参照のこ
と。また、核酸ワクチンの処方及び使用に関する詳細な記載も利用可能である：
Donnelly JJ ら、 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648及びDonnelly JJ ら
、 1997, Life Sciences 60: 163-172を参照のこと。これらの文献は両者ともこ
こに引用して組み込まれる。
- 上述の、医薬的かつ免疫学的に受容なビヒクル及び/又は担体及び/又はアジ
ュバント からなる、IL5に対する抗体の産生を誘発する組成物にも関する。 通常の状況では、IL5変異体をエンコードする核酸は、発現がウイルスプロモ
ーター制御下にあるベクターの形態で導入される。本発明によるベクター及びDN
Aフラグメントについてのさらに詳細な論述については、下記の記載を参照のこ
と。また、核酸ワクチンの処方及び使用に関する詳細な記載も利用可能である：
Donnelly JJ ら、 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648及びDonnelly JJ ら
、 1997, Life Sciences 60: 163-172を参照のこと。これらの文献は両者ともこ
こに引用して組み込まれる。
【００６７】生ワクチン 免疫系への修飾IL5の提示をもたらす第三の代替例は、生ワクチン技術の使用
である。生ワクチン注射において、免疫系への提示は、修飾IL5をエンコードす
る核酸フラグメント又はそのような核酸フラグメントを挿入したベクターで形質
転換した非病原性微生物を動物に投与することによって行われる。非病原性微生
物は、いずれかの適当な弱毒化細菌株(継代培養又は組換えDNA技術による病原性
発現生成物の除去によって弱毒化)であってもよく、例えばマイコバクテリウム
・ボビスBCG、非病原性ストレプトコッカス種、大腸菌、サルモネラ種、ビブリ
オ・コレラ、シゲラなどが挙げられる。最先端技術を用いた生ワクチンの調製法
に関する考察は、例えば両者ともここに引用して組み込まれるSaliou P, 1995,
Rev. Prat. 45: 1492-1496 及び Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990に見る
ことができる。このような生ワクチンで使用される核酸フラグメント及びベクタ
ーの詳細については、以下の記載を参照のこと。
である。生ワクチン注射において、免疫系への提示は、修飾IL5をエンコードす
る核酸フラグメント又はそのような核酸フラグメントを挿入したベクターで形質
転換した非病原性微生物を動物に投与することによって行われる。非病原性微生
物は、いずれかの適当な弱毒化細菌株(継代培養又は組換えDNA技術による病原性
発現生成物の除去によって弱毒化)であってもよく、例えばマイコバクテリウム
・ボビスBCG、非病原性ストレプトコッカス種、大腸菌、サルモネラ種、ビブリ
オ・コレラ、シゲラなどが挙げられる。最先端技術を用いた生ワクチンの調製法
に関する考察は、例えば両者ともここに引用して組み込まれるSaliou P, 1995,
Rev. Prat. 45: 1492-1496 及び Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990に見る
ことができる。このような生ワクチンで使用される核酸フラグメント及びベクタ
ーの詳細については、以下の記載を参照のこと。
【００６８】 細菌性生ワクチンの別の例として、後述する本発明の核酸フラグメントを非毒
性ウイルスワクチンベクター、例えばワクシニア株又はいずれかの他の適当なポ
ックスウイルスに組み込むことができる。 通常、非病原性の微生物又はウイルスは、動物に対して1回だけ投与される。
しかし、ある場合においては、免疫保護を維持するために、微生物を一生のうち
で1回以上投与する必要があるかもしれない。ポリペプチドワクチン注射につい
て上述したような免疫化スキームは、生ワクチン又はウイルスワクチンを使用す
る場合に有用であることさえ予期される。
性ウイルスワクチンベクター、例えばワクシニア株又はいずれかの他の適当なポ
ックスウイルスに組み込むことができる。 通常、非病原性の微生物又はウイルスは、動物に対して1回だけ投与される。
しかし、ある場合においては、免疫保護を維持するために、微生物を一生のうち
で1回以上投与する必要があるかもしれない。ポリペプチドワクチン注射につい
て上述したような免疫化スキームは、生ワクチン又はウイルスワクチンを使用す
る場合に有用であることさえ予期される。
【００６９】 あるいは、生又はウイルスのワクチン注射は、前述あるいは後述のポリペプチ
ド及び/又は核酸のワクチン注射と組合わせられる。例えば、ポリペプチド又は
核酸のアプローチを用いて、生もしくはウイルスのワクチンで一次免疫化し、次
いでブースター免疫化によって作用させることができる。 微生物又はウイルスは、例えば有用なアジュバントとして記載したサイトカイ
ンなどの上記の免疫調節物質の形態で、第一、第二及び/又は第三の部分をエン
コードする領域を含む核酸で形質転換することができる。この実施態様の好まし
い例は、異なるリーディングフレームにおいて、又は少なくとも異なるプロモー
ターの制御下で、類似体のコード領域と免疫調節物質のコード領域を有すること
を包含する。これにより、類似体又はエピトープが免疫調節物質の融合パートナ
ーとして調製されることが回避される。あるいは、2つの異なるヌクレオチドフ
ラグメントを形質転換剤として使用することができる。当然ながら、本発明の類
似体は、発現生成物として同じリーディングフレーム中に第一及び/又は第二及
び/又は第三の部分を生じることができるので、このような実施態様は、本発明
によれば特に好ましい。
ド及び/又は核酸のワクチン注射と組合わせられる。例えば、ポリペプチド又は
核酸のアプローチを用いて、生もしくはウイルスのワクチンで一次免疫化し、次
いでブースター免疫化によって作用させることができる。 微生物又はウイルスは、例えば有用なアジュバントとして記載したサイトカイ
ンなどの上記の免疫調節物質の形態で、第一、第二及び/又は第三の部分をエン
コードする領域を含む核酸で形質転換することができる。この実施態様の好まし
い例は、異なるリーディングフレームにおいて、又は少なくとも異なるプロモー
ターの制御下で、類似体のコード領域と免疫調節物質のコード領域を有すること
を包含する。これにより、類似体又はエピトープが免疫調節物質の融合パートナ
ーとして調製されることが回避される。あるいは、2つの異なるヌクレオチドフ
ラグメントを形質転換剤として使用することができる。当然ながら、本発明の類
似体は、発現生成物として同じリーディングフレーム中に第一及び/又は第二及
び/又は第三の部分を生じることができるので、このような実施態様は、本発明
によれば特に好ましい。
【００７０】疾患治療における本発明の方法の使用 上記から明らかであるように、本発明の方法により、好酸球増加によって特徴
付けられる疾患を制御することができる。本文において喘息は発明の方法の主た
るターゲットであるが、他の慢性的なアレルギー性症状、例えば複数のアレルギ
ー及びアレルギー性鼻炎も治療/緩和のターゲットとなる可能性がある。したが
って、IL5活性をダウン-レギュレートするためのこの発明の方法の重要な実施態
様は、好酸球増加で特徴付けられる喘息又は他の慢性的なアレルギー性症状の治
療及び/又は予防及び/又は緩和からなり、本発明の方法により好酸球細胞数が著
しく減少するほどにIL5活性をダウン-レギュレートすることからなる。 本文で、好酸球細胞数のこのような有意な減少は、治療前の好酸球数に比較し
て少なくとも20％であるが、より高い％、例えば少なくとも30％、少なくとも40
％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％及び少
なくとも90％さえもが予想される。減少は、全身性であってもよく、あるいはよ
り頻繁には、例えば肺でのように局部的であってもよい。 好酸球細胞数は、当該分野で公知の方法、一般には適当な試料(例えばBAL液)
の顕微鏡検査を用い、顕微鏡下で手動で好酸球細胞数を計測して測定される。あ
るいは、好酸球数は、フローサイトメトリー法又は好酸球を区別し得るいずれか
の他の従来のサイトメトリー法を用いて計測することができる。
付けられる疾患を制御することができる。本文において喘息は発明の方法の主た
るターゲットであるが、他の慢性的なアレルギー性症状、例えば複数のアレルギ
ー及びアレルギー性鼻炎も治療/緩和のターゲットとなる可能性がある。したが
って、IL5活性をダウン-レギュレートするためのこの発明の方法の重要な実施態
様は、好酸球増加で特徴付けられる喘息又は他の慢性的なアレルギー性症状の治
療及び/又は予防及び/又は緩和からなり、本発明の方法により好酸球細胞数が著
しく減少するほどにIL5活性をダウン-レギュレートすることからなる。 本文で、好酸球細胞数のこのような有意な減少は、治療前の好酸球数に比較し
て少なくとも20％であるが、より高い％、例えば少なくとも30％、少なくとも40
％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％及び少
なくとも90％さえもが予想される。減少は、全身性であってもよく、あるいはよ
り頻繁には、例えば肺でのように局部的であってもよい。 好酸球細胞数は、当該分野で公知の方法、一般には適当な試料(例えばBAL液)
の顕微鏡検査を用い、顕微鏡下で手動で好酸球細胞数を計測して測定される。あ
るいは、好酸球数は、フローサイトメトリー法又は好酸球を区別し得るいずれか
の他の従来のサイトメトリー法を用いて計測することができる。
【００７１】本発明のペプチド、ポリペプチド及び組成物 上記から明らかであるように、本発明は、好酸球細胞数を間接的に減少させる
ため、IL5抗原に対して個体を免疫化するとの概念に基づいている。このような
免疫化を生ずるのに好ましい方法は、IL5の修飾変異型を使用し、それにより当
該分野でこれまでに開示されていない分子を提供することである。 ここで論じられる修飾IL5分子はそれ自体が発明であり、それ故に、本発明の
重要な部分は、修飾が導入された、動物IL5由来のIL5類似体に関するものと考え
られる。結果として、類似体での動物の免疫化により非修飾IL5ポリペプチドと
交差反応性の抗体の産生が誘発される。好ましくは、修飾の性質は、修飾IL5を
用いる際の本発明の方法の種々の実施態様を論じている場合の上記修飾型に適合
している。したがって、修飾IL5分子に関してここに示す開示は、いずれも本発
明のIL5類似体を記載する目的に関連しており、このような開示はいずれも、こ
れらの類似体の記載に変更を加えて適用される。
ため、IL5抗原に対して個体を免疫化するとの概念に基づいている。このような
免疫化を生ずるのに好ましい方法は、IL5の修飾変異型を使用し、それにより当
該分野でこれまでに開示されていない分子を提供することである。 ここで論じられる修飾IL5分子はそれ自体が発明であり、それ故に、本発明の
重要な部分は、修飾が導入された、動物IL5由来のIL5類似体に関するものと考え
られる。結果として、類似体での動物の免疫化により非修飾IL5ポリペプチドと
交差反応性の抗体の産生が誘発される。好ましくは、修飾の性質は、修飾IL5を
用いる際の本発明の方法の種々の実施態様を論じている場合の上記修飾型に適合
している。したがって、修飾IL5分子に関してここに示す開示は、いずれも本発
明のIL5類似体を記載する目的に関連しており、このような開示はいずれも、こ
れらの類似体の記載に変更を加えて適用される。
【００７２】 好ましい修飾IL5分子は、IL5又は少なくとも10アミノ酸長のそのサブ配列と配
列が少なくとも70％同一のポリペプチドを生じる修飾を含むことに留意されたい
。配列同一性はより高いことが好ましく、例えば少なくとも75％又は少なくとも
80％もしくは85％でさえある。タンパク質及び核酸の配列同一性は、(Nref-Ndif )・100/Nref（式中、Ndif は、アラインしている際の2つの配列における非同一
残基総数、Nref は一方の配列における残基数）として計算され得る。従って、D
NA配列AGTCAGTCは、配列AATCAATC (Ndif=2及びNref=8)と75％の配列同一性を有
するであろう。 また、本発明は、本発明の方法の実行に有用な組成物に関する。したがって、
本発明は、動物で自己タンパク質であるIL5ポリペプチドの免疫学的に有効な量か
らなる免疫原性組成物にも関する。このIL5ポリペプチドは、IL5ポリペプチドに
対する動物の自己耐性を破壊するように、免疫学的に受容なアジュバントととも
に処方される。組成物は、さらに、医薬的及び免疫学的に受容なビヒクル及び/
又は担体からなる。言い換えれば、本発明のこの一部は、本発明の方法の実施態
様に関連して記載される天然に存在するIL5ポリペプチドの処方に関する。
列が少なくとも70％同一のポリペプチドを生じる修飾を含むことに留意されたい
。配列同一性はより高いことが好ましく、例えば少なくとも75％又は少なくとも
80％もしくは85％でさえある。タンパク質及び核酸の配列同一性は、(Nref-Ndif )・100/Nref（式中、Ndif は、アラインしている際の2つの配列における非同一
残基総数、Nref は一方の配列における残基数）として計算され得る。従って、D
NA配列AGTCAGTCは、配列AATCAATC (Ndif=2及びNref=8)と75％の配列同一性を有
するであろう。 また、本発明は、本発明の方法の実行に有用な組成物に関する。したがって、
本発明は、動物で自己タンパク質であるIL5ポリペプチドの免疫学的に有効な量か
らなる免疫原性組成物にも関する。このIL5ポリペプチドは、IL5ポリペプチドに
対する動物の自己耐性を破壊するように、免疫学的に受容なアジュバントととも
に処方される。組成物は、さらに、医薬的及び免疫学的に受容なビヒクル及び/
又は担体からなる。言い換えれば、本発明のこの一部は、本発明の方法の実施態
様に関連して記載される天然に存在するIL5ポリペプチドの処方に関する。
【００７３】 また、本発明は、免疫学的に有効な量の上記IL5類似体からなる免疫原性組成
物に関する。この組成物は、さらに医薬的及び免疫学的に受容な希釈剤及び/又
はビヒクル及び/又は担体及び/又は賦形剤及び任意のアジュバントからなる。言
い換えれば、本発明のこの一部は、本質的に上述するように、修飾IL5の処方に
関する。したがって、アジュバント、担体及びビヒクルの選択は、IL5をダウン-
レギュレーションするために発明の方法で用いられる修飾及び非修飾のIL5の処
方に言及する際に上述したことと一致する。 ポリペプチドは、当該分野で周知の方法にしたがって調製される。通常は、IL
5類似体をエンコードする核酸配列の適当なベクターへの導入、ベクターでの適
当な宿主細胞の形質転換、核酸配列の発現、宿主細胞又はそれらの培養上清から
の発現生成物の回収、その後の精製及び任意のさらなる修飾、例えば再生又は誘
導化を含む組換え遺伝子技術により、より長いポリペプチドが調製される。 好ましくは、固相又は液相のペプチド合成の周知技術によって、より短いペプ
チドが調製される。しかし、この技術での近年の進歩により、これらの手段によ
る全長ポリペプチド及びタンパク質の生産が可能となっており、したがって、合
成手段による長い構築物の調製も本発明の範囲内である。
物に関する。この組成物は、さらに医薬的及び免疫学的に受容な希釈剤及び/又
はビヒクル及び/又は担体及び/又は賦形剤及び任意のアジュバントからなる。言
い換えれば、本発明のこの一部は、本質的に上述するように、修飾IL5の処方に
関する。したがって、アジュバント、担体及びビヒクルの選択は、IL5をダウン-
レギュレーションするために発明の方法で用いられる修飾及び非修飾のIL5の処
方に言及する際に上述したことと一致する。 ポリペプチドは、当該分野で周知の方法にしたがって調製される。通常は、IL
5類似体をエンコードする核酸配列の適当なベクターへの導入、ベクターでの適
当な宿主細胞の形質転換、核酸配列の発現、宿主細胞又はそれらの培養上清から
の発現生成物の回収、その後の精製及び任意のさらなる修飾、例えば再生又は誘
導化を含む組換え遺伝子技術により、より長いポリペプチドが調製される。 好ましくは、固相又は液相のペプチド合成の周知技術によって、より短いペプ
チドが調製される。しかし、この技術での近年の進歩により、これらの手段によ
る全長ポリペプチド及びタンパク質の生産が可能となっており、したがって、合
成手段による長い構築物の調製も本発明の範囲内である。
【００７４】発明の核酸フラグメント及びベクター 修飾IL5ポリペプチドが組換え遺伝子技術のみならず化学的合成又は半合成に
よっても調製できることが上記の開示から理解できるであろう。この後者2つの
選択肢は、修飾がタンパク質担体（例えばKLH、ジフテリアトキソイド、破傷風
トキソイド及びBSA）及び炭水化物ポリマーのような非タンパク質分子に結合す
ることからなる場合、また、当然のことながら修飾が側鎖又は側群のIL5ポリペ
プチド由来ペプチド鎖への付加からなる場合、特に適切である。 組換遺伝子技術のために、また当然のことながら核酸免疫化のために、修飾IL
5をエンコードする核酸フラグメントは重要な化学的生成物である。従って、発
明の重要な部分は、IL5類似体をエンコードする核酸フラグメント、つまり融合
パートナーを加えるか、もしくはこれを挿入した天然のIL5配列からなるIL5由来
ポリペプチド、好ましくは、挿入及び/又は付加、好ましくは置換及び/又は欠失
によって外来T-細胞エピトープを導入したIL5由来ポリペプチドに関する。発明
の核酸フラグメントは、DNA又はRNAフラグメントのいずれかである。
よっても調製できることが上記の開示から理解できるであろう。この後者2つの
選択肢は、修飾がタンパク質担体（例えばKLH、ジフテリアトキソイド、破傷風
トキソイド及びBSA）及び炭水化物ポリマーのような非タンパク質分子に結合す
ることからなる場合、また、当然のことながら修飾が側鎖又は側群のIL5ポリペ
プチド由来ペプチド鎖への付加からなる場合、特に適切である。 組換遺伝子技術のために、また当然のことながら核酸免疫化のために、修飾IL
5をエンコードする核酸フラグメントは重要な化学的生成物である。従って、発
明の重要な部分は、IL5類似体をエンコードする核酸フラグメント、つまり融合
パートナーを加えるか、もしくはこれを挿入した天然のIL5配列からなるIL5由来
ポリペプチド、好ましくは、挿入及び/又は付加、好ましくは置換及び/又は欠失
によって外来T-細胞エピトープを導入したIL5由来ポリペプチドに関する。発明
の核酸フラグメントは、DNA又はRNAフラグメントのいずれかである。
【００７５】 本発明の核酸フラグメントは、通常適切なベクターに挿入されて発明の核酸フ
ラグメントを有するクローニング又は発現ベクターを形成する。このような新規
なベクターもまた発明の一部である。本発明のこれらのベクターの構築に関する
詳細は、形質転換細胞及び微生物との関連で下記に記載する。ベクターは用途の
目的及び種類に応じてプラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体又はウイル
スの形態であってよいが、ある種の細胞で一時的に発現されるにすぎない裸のDN
Aも重要なベクターである。本発明の好ましいクローニング及び発現ベクターは
自律複製でき、続くクローニング用の高レベルの発現又は高レベルの複製のため
に高いコピー数を可能にする。 本発明のベクターの概要は、5’→3’方向及び操作可能な連鎖において次の特
徴を含む：本発明の核酸フラグメントの発現を駆動するプロモーター、ポリペプ
チドフラグメントの(細胞外相又は適用可能な場合には、細胞周辺腔への)分泌あ
るいは膜への組み込みを可能にするリーダーペプチドをエンコードする任意の核
酸配列、本発明の核酸フラグメント、及び任意に転写終結区をエンコードする核
酸配列。産生株あるいは細胞系で発現ベクターを操作する場合、宿主細胞への導
入時にベクターを宿主細胞ゲノムに組み込むことが、形質転換細胞の遺伝的安定
性のため好ましい。一方、動物でのインビボ発現を行うために使用されるベクタ
ーを用いて操作する場合(即ち、DNAワクチン注射にベクターを用いる場合)は、
ベクターが宿主細胞ゲノムに組込まれ得ないことが安全性のため好ましい。通常
、裸のDNA又は非組込み型ウイルスベクターが用いられる。これらの選択は当業
者には周知である。
ラグメントを有するクローニング又は発現ベクターを形成する。このような新規
なベクターもまた発明の一部である。本発明のこれらのベクターの構築に関する
詳細は、形質転換細胞及び微生物との関連で下記に記載する。ベクターは用途の
目的及び種類に応じてプラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体又はウイル
スの形態であってよいが、ある種の細胞で一時的に発現されるにすぎない裸のDN
Aも重要なベクターである。本発明の好ましいクローニング及び発現ベクターは
自律複製でき、続くクローニング用の高レベルの発現又は高レベルの複製のため
に高いコピー数を可能にする。 本発明のベクターの概要は、5’→3’方向及び操作可能な連鎖において次の特
徴を含む：本発明の核酸フラグメントの発現を駆動するプロモーター、ポリペプ
チドフラグメントの(細胞外相又は適用可能な場合には、細胞周辺腔への)分泌あ
るいは膜への組み込みを可能にするリーダーペプチドをエンコードする任意の核
酸配列、本発明の核酸フラグメント、及び任意に転写終結区をエンコードする核
酸配列。産生株あるいは細胞系で発現ベクターを操作する場合、宿主細胞への導
入時にベクターを宿主細胞ゲノムに組み込むことが、形質転換細胞の遺伝的安定
性のため好ましい。一方、動物でのインビボ発現を行うために使用されるベクタ
ーを用いて操作する場合(即ち、DNAワクチン注射にベクターを用いる場合)は、
ベクターが宿主細胞ゲノムに組込まれ得ないことが安全性のため好ましい。通常
、裸のDNA又は非組込み型ウイルスベクターが用いられる。これらの選択は当業
者には周知である。
【００７６】 本発明のベクターは、宿主細胞を形質転換し、本発明の修飾IL5ポリペプチド
を産生するのに用いられる。そのような形質転換細胞も発明の一部であり、本発
明の核酸フラグメント及びベクターの増殖に用いられるか又は本発明の修飾IL5
ポリペプチドの組換え産生に用いられる培養細胞あるいは細胞系であってもよい
。あるいは、形質転換細胞は、細菌膜や細胞壁への修飾IL5の分泌又は組込みを
行うように核酸フラグメント(単コピーあるいは多コピー)が挿入された適切な生
ワクチン株であってもよい。 発明の好ましい形質転換細胞は、細菌(エシェリキア種(例えば大腸菌)、バチ
ルス(例えば、バチルス・ズブチリス)、サルモネラ菌又はマイコバクテリウム(
好ましくは非病原性のもの例えば.エム・ボビスBCG))、酵母(サッカロマイセス
・セレビジエ等)等の微生物及び原生動物である。あるいは、形質転換細胞は、
真菌、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞等の多細胞生物由来のものである。
最も好ましいものはヒト由来の細胞である。細胞系とベクターについての下記の
記載を参照のこと。最近の結果は、本発明のIL5類似体の組換え産生には、市場
で入手可能なDrosophila melanogaster細胞系(Invitrogenより入手可能なSchnei
der 2 (S2)細胞系及びべクター系)の使用がかなり有望であることを示しており
、したがって、この発現系が特に好ましい。 クローニング及び/又は最適発現のために、形質転換細胞が本発明の核酸配列
を複製できることが好ましい。核酸フラグメントを発現する細胞は、本発明の好
ましい有用な実施態様である。それらは、修飾IL5の小規模あるいは大規模調製
や、非病原性細菌の場合には、生ワクチンのワクチン成分として用いることがで
きる。
を産生するのに用いられる。そのような形質転換細胞も発明の一部であり、本発
明の核酸フラグメント及びベクターの増殖に用いられるか又は本発明の修飾IL5
ポリペプチドの組換え産生に用いられる培養細胞あるいは細胞系であってもよい
。あるいは、形質転換細胞は、細菌膜や細胞壁への修飾IL5の分泌又は組込みを
行うように核酸フラグメント(単コピーあるいは多コピー)が挿入された適切な生
ワクチン株であってもよい。 発明の好ましい形質転換細胞は、細菌(エシェリキア種(例えば大腸菌)、バチ
ルス(例えば、バチルス・ズブチリス)、サルモネラ菌又はマイコバクテリウム(
好ましくは非病原性のもの例えば.エム・ボビスBCG))、酵母(サッカロマイセス
・セレビジエ等)等の微生物及び原生動物である。あるいは、形質転換細胞は、
真菌、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞等の多細胞生物由来のものである。
最も好ましいものはヒト由来の細胞である。細胞系とベクターについての下記の
記載を参照のこと。最近の結果は、本発明のIL5類似体の組換え産生には、市場
で入手可能なDrosophila melanogaster細胞系(Invitrogenより入手可能なSchnei
der 2 (S2)細胞系及びべクター系)の使用がかなり有望であることを示しており
、したがって、この発現系が特に好ましい。 クローニング及び/又は最適発現のために、形質転換細胞が本発明の核酸配列
を複製できることが好ましい。核酸フラグメントを発現する細胞は、本発明の好
ましい有用な実施態様である。それらは、修飾IL5の小規模あるいは大規模調製
や、非病原性細菌の場合には、生ワクチンのワクチン成分として用いることがで
きる。
【００７７】 形質転換細胞を用いて本発明の修飾IL5を産生する場合、発現生成物を培養培
地に運び出すか形質転換細胞表面に保持することが便利であるが、かならずしも
必須ではない。 有効な産生細胞を同定した際には、それに基づいて、本発明のベクターを担持
し修飾IL5をエンコードする核酸フラグメントを発現する安定な細胞系を確立す
ることが好ましい。この安定な細胞系は、本発明のIL5類似体を分泌あるいは担
持することによってその精製を簡単にするのが好ましい。 一般に、宿主細胞と和合性の種由来のレプリコン及びコントロール配列を含む
プラスミドベクターが、宿主と組み合せて用いられる。ベクターは元来複製部位
と、形質転換細胞に表現型の選択を与えることができる標識配列とを有する。例
えば、大腸菌は、通常大腸菌種由来のプラスミドpBR322を用いて形質転換される
（例えば、Bolivarら、1977参照）。pBR322プラスミドはアンピシリン及びテト
ラサイクリン耐性遺伝子を含み、このために形質転換細胞の同定に簡単な手段を
提供している。pBRプラスミド又は他の微生物プラスミドもしくはファージも、
発現のために原核微生物によって用いられるプロモーターを含むか、あるいは含
むように修飾する必要がある。
地に運び出すか形質転換細胞表面に保持することが便利であるが、かならずしも
必須ではない。 有効な産生細胞を同定した際には、それに基づいて、本発明のベクターを担持
し修飾IL5をエンコードする核酸フラグメントを発現する安定な細胞系を確立す
ることが好ましい。この安定な細胞系は、本発明のIL5類似体を分泌あるいは担
持することによってその精製を簡単にするのが好ましい。 一般に、宿主細胞と和合性の種由来のレプリコン及びコントロール配列を含む
プラスミドベクターが、宿主と組み合せて用いられる。ベクターは元来複製部位
と、形質転換細胞に表現型の選択を与えることができる標識配列とを有する。例
えば、大腸菌は、通常大腸菌種由来のプラスミドpBR322を用いて形質転換される
（例えば、Bolivarら、1977参照）。pBR322プラスミドはアンピシリン及びテト
ラサイクリン耐性遺伝子を含み、このために形質転換細胞の同定に簡単な手段を
提供している。pBRプラスミド又は他の微生物プラスミドもしくはファージも、
発現のために原核微生物によって用いられるプロモーターを含むか、あるいは含
むように修飾する必要がある。
【００７８】 原核生物の組換えDNAの構築に最も一般的に用いられるプロモーターには、β-
ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)及びラクトースプロモーター系(Changら、1978;
Itakuraら、1977; Goeddelら、1979)及びトリプトファン(trp)プロモーター系が
含まれる(Goeddel ら, 1979; EP-A-0 036 776)。これらが最も普通に用いられる
一方、他の微生物プロモーターが発見され利用されている。それらのヌクレオチ
ド配列については詳細が公表されており、当業者はそれらをプラスミドベクター
と機能的に結合することができる(Siebwenlistら, 1980)。原核生物由来のある
種の遺伝子は人工的な手段で別のプロモーターを付加する必要がなく、それ自体
のプロモーター配列から大腸菌中で効率的に発現され得る。 原核生物に加えて酵母培養物のような真核微生物もまた使用でき、ここでもプ
ロモーターが発現を駆動できるはずである。サッカロマイセス・セレビジエある
いは通常のパン酵母が真核微生物の中で最も普通に用いられるが、いくつかの他
の株も一般に利用可能である。サッカロマイセスでの発現には、例えばプラスミ
ドYRp7が通常用いられる（Stinchcomb ら, 1979; Kingsman ら, 1979; Tschempe
r ら, 1980）。このプラスミドはtrpl遺伝子をすでに含んでおり、これにより例
えばATCC No. 44076あるいはPEP4-1のようなトリプトファン中で成長できる能力
を欠く酵母変異株に対する選択標識を提供する(Jones, 1977)。酵母宿主細胞ゲ
ノムの特徴としてのtrpl欠陥の存在は、次いで、トリプトファンの不在下での成
長によって形質転換を検出する有効な環境となる。
ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)及びラクトースプロモーター系(Changら、1978;
Itakuraら、1977; Goeddelら、1979)及びトリプトファン(trp)プロモーター系が
含まれる(Goeddel ら, 1979; EP-A-0 036 776)。これらが最も普通に用いられる
一方、他の微生物プロモーターが発見され利用されている。それらのヌクレオチ
ド配列については詳細が公表されており、当業者はそれらをプラスミドベクター
と機能的に結合することができる(Siebwenlistら, 1980)。原核生物由来のある
種の遺伝子は人工的な手段で別のプロモーターを付加する必要がなく、それ自体
のプロモーター配列から大腸菌中で効率的に発現され得る。 原核生物に加えて酵母培養物のような真核微生物もまた使用でき、ここでもプ
ロモーターが発現を駆動できるはずである。サッカロマイセス・セレビジエある
いは通常のパン酵母が真核微生物の中で最も普通に用いられるが、いくつかの他
の株も一般に利用可能である。サッカロマイセスでの発現には、例えばプラスミ
ドYRp7が通常用いられる（Stinchcomb ら, 1979; Kingsman ら, 1979; Tschempe
r ら, 1980）。このプラスミドはtrpl遺伝子をすでに含んでおり、これにより例
えばATCC No. 44076あるいはPEP4-1のようなトリプトファン中で成長できる能力
を欠く酵母変異株に対する選択標識を提供する(Jones, 1977)。酵母宿主細胞ゲ
ノムの特徴としてのtrpl欠陥の存在は、次いで、トリプトファンの不在下での成
長によって形質転換を検出する有効な環境となる。
【００７９】 酵母ベクター中の適切なプロモーター配列には、3‐ホスホグリセレートキナ
ーゼ(Hitzman ら, 1980)又は他の解糖酵素(Hess ら, 1968; Holland ら, 1978)
、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ
、ヘキソキナーゼ、ピルべートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、
グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピ
ルべートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイ
ソメラーゼ及びグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。適切な発現プラスミ
ドの構築では、mRNAのポリアデニル化と終結を生じるように、これらの遺伝子に
関連する終結配列も発現が望まれる配列の発現ベクター3'に結合される。 成長条件によって転写が制御されるという別の利点を有する他のプロモーター
には、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロームC、酸ホスファターゼ、
窒素代謝関連分解酵素、及び上記のグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ、マルトース及びガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域が
ある。酵母和合性プロモーター、複製起点及び終結配列を含むプラスミドベクタ
ーは、いずれも適切である。
ーゼ(Hitzman ら, 1980)又は他の解糖酵素(Hess ら, 1968; Holland ら, 1978)
、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ
、ヘキソキナーゼ、ピルべートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、
グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピ
ルべートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイ
ソメラーゼ及びグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。適切な発現プラスミ
ドの構築では、mRNAのポリアデニル化と終結を生じるように、これらの遺伝子に
関連する終結配列も発現が望まれる配列の発現ベクター3'に結合される。 成長条件によって転写が制御されるという別の利点を有する他のプロモーター
には、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロームC、酸ホスファターゼ、
窒素代謝関連分解酵素、及び上記のグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ、マルトース及びガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域が
ある。酵母和合性プロモーター、複製起点及び終結配列を含むプラスミドベクタ
ーは、いずれも適切である。
【００８０】 微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物を宿主として用いてもよい。原
則として、そのような細胞培養物は、脊椎動物の培養物であれ無脊椎動物の培養
物であれ、いずれも使用可能である。しかしながら、脊椎動物細胞に対する関心
が大きく、培養での脊椎動物の増殖(組織培養)は近年常套手段となっている(Tis
sue Culture, 1973）。そのような有益な宿主細胞系の例は、VERO及びHeLa細胞
、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系、及びW138、BHK、COS-7 293、Spo
dopetera frugiperda(SF)細胞(Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Mer
iden, CT 064450, U.S.A.及びInvitrogenから完全な発現系として市場で入手可
能)及びMDCK細胞系である。本発明において、特に好ましい細胞系はInvitrogen
(PO Box 2312, 9704 CH Groningen, オランダ)から入手可能なS2である。 このような細胞用の発現ベクターは、通常(必要であれば)複製起点、発現すべ
き遺伝子の前に位置するプロモーター、いずれかの必要なリボソーム結合部位と
共に、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転移終結配列を含む。
則として、そのような細胞培養物は、脊椎動物の培養物であれ無脊椎動物の培養
物であれ、いずれも使用可能である。しかしながら、脊椎動物細胞に対する関心
が大きく、培養での脊椎動物の増殖(組織培養)は近年常套手段となっている(Tis
sue Culture, 1973）。そのような有益な宿主細胞系の例は、VERO及びHeLa細胞
、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞系、及びW138、BHK、COS-7 293、Spo
dopetera frugiperda(SF)細胞(Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Mer
iden, CT 064450, U.S.A.及びInvitrogenから完全な発現系として市場で入手可
能)及びMDCK細胞系である。本発明において、特に好ましい細胞系はInvitrogen
(PO Box 2312, 9704 CH Groningen, オランダ)から入手可能なS2である。 このような細胞用の発現ベクターは、通常(必要であれば)複製起点、発現すべ
き遺伝子の前に位置するプロモーター、いずれかの必要なリボソーム結合部位と
共に、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転移終結配列を含む。
【００８１】 哺乳動物細胞で用いるため、コントロール機能がウイルス性の材料によって発
現ベクターにしばしば付与される。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポ
リオーマ、アデノウィルス2、最も頻繁にはシミアンウィルス40 (SV40)由来であ
る。SV40ウイルスの初期及び後期プロモーターは、いずれもSV40ウイルスの複製
起点も含むフラグメントとしてウイルスから簡単に得ることができるので、特に
有用である(Fiers ら, 1978)。HindIII部位からウイルスの複製起点に位置するB
glI部位に向かって伸びる約250bpの配列を含む場合には、より小さいかより大き
いSV40フラグメントを使用してもよい。さらに、所望の遺伝子配列と通常結合し
ているプロモーターあるいはコントロール配列を利用することも、そのようなコ
ントロール配列が宿主細胞系と和合性であれば、可能であるし、利用することが
しばしば望ましい。 複製起点は、ベクターを構築して外来の起点、例えばSV40やその他のウイルス
(例えばポリオーマ、アデノ、VSV、BPV)由来であり得る起点を含むように生じて
もよいし、宿主細胞染色体複製機構により生じてもよい。ベクターが宿主細胞染
色体に組み込まれるのであれば、後者で十分であることがよくある。
現ベクターにしばしば付与される。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポ
リオーマ、アデノウィルス2、最も頻繁にはシミアンウィルス40 (SV40)由来であ
る。SV40ウイルスの初期及び後期プロモーターは、いずれもSV40ウイルスの複製
起点も含むフラグメントとしてウイルスから簡単に得ることができるので、特に
有用である(Fiers ら, 1978)。HindIII部位からウイルスの複製起点に位置するB
glI部位に向かって伸びる約250bpの配列を含む場合には、より小さいかより大き
いSV40フラグメントを使用してもよい。さらに、所望の遺伝子配列と通常結合し
ているプロモーターあるいはコントロール配列を利用することも、そのようなコ
ントロール配列が宿主細胞系と和合性であれば、可能であるし、利用することが
しばしば望ましい。 複製起点は、ベクターを構築して外来の起点、例えばSV40やその他のウイルス
(例えばポリオーマ、アデノ、VSV、BPV)由来であり得る起点を含むように生じて
もよいし、宿主細胞染色体複製機構により生じてもよい。ベクターが宿主細胞染
色体に組み込まれるのであれば、後者で十分であることがよくある。
【００８２】有用なIL5類似体の同定 天然のIL5の変異体又は修飾体の全てが天然型と交差反応性の動物で抗体を誘
発する能力を有しているとは限らないことは、当業者には明らかであろう。しか
し、ここに論じる免疫学的反応性の最小限の要件を満たす修飾IL5分子について
有効な標準的なスクリーンを行うことは、難しくはない。つまり、本発明の別の
観点は、非修飾IL5ポリペプチドが自己タンパク質の動物種で非修飾IL5に対する
抗体を誘発し得る修飾IL5ポリペプチドの同定方法に関する。その方法は、 - 動物種のIL5ポリペプチドのアミノ酸配列にアミノ酸が付加され、挿入され、
それから欠失されているか、又は置換されている、相互に異なる修飾IL5ポリペ
プチドのセットをペプチド合成又は分子生物学的な手段により調製し、それによ
り、動物種に外来のT-細胞エピトープからなるセットでアミノ酸配列を生じるか
、又は相互に異なる修飾IL5ポリペプチドのセットをエンコードする核酸フラグ
メントのセットを調製し、 - 非修飾IL5に対する動物種による抗体産生を誘発する能力について該セットを
のメンバーを試験し、かつ - 動物種における非修飾IL5に対する抗体産生を有意に誘発するセットのメンバ
ーを同定し、任意に単離するか、又は動物種において非修飾IL5に対する抗体産
生を有意に誘発する核酸フラグメントのセットのメンバーによってエンコードさ
れるポリペプチド発現生成物を同定し、任意に単離する ことからなる。
発する能力を有しているとは限らないことは、当業者には明らかであろう。しか
し、ここに論じる免疫学的反応性の最小限の要件を満たす修飾IL5分子について
有効な標準的なスクリーンを行うことは、難しくはない。つまり、本発明の別の
観点は、非修飾IL5ポリペプチドが自己タンパク質の動物種で非修飾IL5に対する
抗体を誘発し得る修飾IL5ポリペプチドの同定方法に関する。その方法は、 - 動物種のIL5ポリペプチドのアミノ酸配列にアミノ酸が付加され、挿入され、
それから欠失されているか、又は置換されている、相互に異なる修飾IL5ポリペ
プチドのセットをペプチド合成又は分子生物学的な手段により調製し、それによ
り、動物種に外来のT-細胞エピトープからなるセットでアミノ酸配列を生じるか
、又は相互に異なる修飾IL5ポリペプチドのセットをエンコードする核酸フラグ
メントのセットを調製し、 - 非修飾IL5に対する動物種による抗体産生を誘発する能力について該セットを
のメンバーを試験し、かつ - 動物種における非修飾IL5に対する抗体産生を有意に誘発するセットのメンバ
ーを同定し、任意に単離するか、又は動物種において非修飾IL5に対する抗体産
生を有意に誘発する核酸フラグメントのセットのメンバーによってエンコードさ
れるポリペプチド発現生成物を同定し、任意に単離する ことからなる。
【００８３】 本文で、「相互に異なる修飾IL5ポリペプチドのセット」は、例えば上記の基
準(例えば円二色、NMRスペクトル及び/又はX-線回折パターン研究との組合わせ)
に基づいて選択される非同一の修飾IL5ポリペプチドの集団である。このセット
はごくわずかなメンバーからなっていてもよいが、数100のメンバーからなるこ
とも考えられる。また、核酸フラグメントのセットは、同様にして選択される修
飾IL5ポリペプチドをそれぞれエンコードする非同一の核酸フラグメントの集団
である。 セットのメンバーの試験は、最終的にはインビボで行われるが、数回のインビ
トロ試験により、本発明の目的に役立つと思われる修飾分子数を絞り込むことが
できる。
準(例えば円二色、NMRスペクトル及び/又はX-線回折パターン研究との組合わせ)
に基づいて選択される非同一の修飾IL5ポリペプチドの集団である。このセット
はごくわずかなメンバーからなっていてもよいが、数100のメンバーからなるこ
とも考えられる。また、核酸フラグメントのセットは、同様にして選択される修
飾IL5ポリペプチドをそれぞれエンコードする非同一の核酸フラグメントの集団
である。 セットのメンバーの試験は、最終的にはインビボで行われるが、数回のインビ
トロ試験により、本発明の目的に役立つと思われる修飾分子数を絞り込むことが
できる。
【００８４】 外来T-細胞エピトープを導入する目的はT-細胞の助力でB-細胞の応答を支持す
ることであるので、T-細胞の増殖が修飾IL5によって誘発されることが必須要件
である。T-細胞の増殖は、インビトロで標準的な増殖アッセイによって試験する
ことができる。手短に言えば、T-細胞を増強した試料は被験者から得て、その後
培養して保持される。培養したT-細胞を、修飾分子を予め回収(take up)してい
る被験者のAPCと接触させ、処理して、そのT-細胞エピトープを提示する。T-細
胞の増殖をモニターし、適当な対照(例えば無傷で天然のIL5を処理したAPCと接
触した培養中のT-細胞)と比較する。あるいは、増殖は、外来T-細胞の認識に応
じてT-細胞によって放出される関連するサイトカインの濃度を計測して測定する
ことができる。 セットの少なくとも1つの修飾IL5がIL5に対する抗体産生を誘発できる可能性
はかなり高いので、非修飾IL5ポリペプチドが自己タンパク質の動物種において
非修飾IL5に対する抗体を誘発できる修飾IL5ポリペプチドの少なくとも1つから
なる免疫原性組成物を調製することができる。その方法は、IL5と反応性の動物
種における抗体産生を有意に誘発するセットのメンバーを、医薬的及び免疫学的
に受容なアジュバントの少なくとも1つと任意に組合わせて、医薬的及び免疫学
的に受容な担体及び/又はビヒクル及び/又は希釈剤及び/又は賦形剤と混合する
ことからなる。
ることであるので、T-細胞の増殖が修飾IL5によって誘発されることが必須要件
である。T-細胞の増殖は、インビトロで標準的な増殖アッセイによって試験する
ことができる。手短に言えば、T-細胞を増強した試料は被験者から得て、その後
培養して保持される。培養したT-細胞を、修飾分子を予め回収(take up)してい
る被験者のAPCと接触させ、処理して、そのT-細胞エピトープを提示する。T-細
胞の増殖をモニターし、適当な対照(例えば無傷で天然のIL5を処理したAPCと接
触した培養中のT-細胞)と比較する。あるいは、増殖は、外来T-細胞の認識に応
じてT-細胞によって放出される関連するサイトカインの濃度を計測して測定する
ことができる。 セットの少なくとも1つの修飾IL5がIL5に対する抗体産生を誘発できる可能性
はかなり高いので、非修飾IL5ポリペプチドが自己タンパク質の動物種において
非修飾IL5に対する抗体を誘発できる修飾IL5ポリペプチドの少なくとも1つから
なる免疫原性組成物を調製することができる。その方法は、IL5と反応性の動物
種における抗体産生を有意に誘発するセットのメンバーを、医薬的及び免疫学的
に受容なアジュバントの少なくとも1つと任意に組合わせて、医薬的及び免疫学
的に受容な担体及び/又はビヒクル及び/又は希釈剤及び/又は賦形剤と混合する
ことからなる。
【００８５】 また、免疫原性のIL5類似体をエンコードする核酸フラグメントを免疫原とし
て含む免疫原性組成物を調製することもできる(上記の核酸ワクチン注射の論述
参照)。 本発明の上記の観点は、本発明の相互に異なる核酸配列又はベクターを幾つか
最初に調製し、これらを適当な発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞をベクタ
ーで形質転換し、かつ本発明の核酸配列を発現して簡便に行われる。これらの工
程に続いて、発現生成物の単離を行ってもよい。核酸配列及び/又はベクターは
、PCRのような分子増幅技術の実施からなる方法又は核酸合成の手段により調製
することが好ましい。
て含む免疫原性組成物を調製することもできる(上記の核酸ワクチン注射の論述
参照)。 本発明の上記の観点は、本発明の相互に異なる核酸配列又はベクターを幾つか
最初に調製し、これらを適当な発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞をベクタ
ーで形質転換し、かつ本発明の核酸配列を発現して簡便に行われる。これらの工
程に続いて、発現生成物の単離を行ってもよい。核酸配列及び/又はベクターは
、PCRのような分子増幅技術の実施からなる方法又は核酸合成の手段により調製
することが好ましい。
【００８６】実施例序文 ワクチンのデザイン IL5自家ワクチンの例示的候補は、AutoVacTM 概念（国際出願第WO 95/05849号
に詳載）によって、公知の乱交雑T細胞エピトープをヒトのIL5野生型タンパク質
中に置換することによって構築される。置換はペプチド置換であり、挿入される
ペプチドは野生型配列中の欠失されたペプチドと長さが同じか又は異なるもので
あってもよい。 インビボでの試験及びスクリーニングによって概念を最初に証明するために、
マウスIL5配列で構築物を調製することを決定した。例として、破傷風トキソイ
ドエピトープP2（SEQ ID NO: 23）及びP30 (SEQ ID NO: 24)を置換ペプチドとし
て用いるが、乱交雑THエピトープを含むかあるいはこれを構成する他のいずれか
の適当なペプチドを本発明に従って用いてもよい。
に詳載）によって、公知の乱交雑T細胞エピトープをヒトのIL5野生型タンパク質
中に置換することによって構築される。置換はペプチド置換であり、挿入される
ペプチドは野生型配列中の欠失されたペプチドと長さが同じか又は異なるもので
あってもよい。 インビボでの試験及びスクリーニングによって概念を最初に証明するために、
マウスIL5配列で構築物を調製することを決定した。例として、破傷風トキソイ
ドエピトープP2（SEQ ID NO: 23）及びP30 (SEQ ID NO: 24)を置換ペプチドとし
て用いるが、乱交雑THエピトープを含むかあるいはこれを構成する他のいずれか
の適当なペプチドを本発明に従って用いてもよい。
【００８７】 置換の大きさ（P2及びP30についてそれぞれ15又は21残基）と比較した分子の
大きさ(115残基)から、構造を損なわない挿入断片の部位の可能性は非常に限ら
れていることが強調されるべきである。ダイマー化のためにジスルフィド架橋は
重要であるが必須ではないため、いくつかの変異体をシステインの+/-対除去で
作製する。 候補分子の構築において、2つの基本パラメータが考えられてきた。まず、野生
型hIL5の三次元構造の最大のフラクションを維持することよって天然B細胞エピ
トープのレパートリーを維持することを試みる。これは、中和すべきことが知ら
れているIL5 B細胞エピトープが構造的であることを立証したDickasonら、(1994
)によって裏付けられている。三次構造の維持は、ループ又は分離セグメントの
ような構造上“中立な”部位に修飾をもたらすことによって求められ達成される
。へリックス"B"及び"C"と共にN末端へリックス"A"が第二分子で四次構造に折り
たたみ可能であるという事実は、これら3つのへリックスが安定した折りたたみ
スカホールドを構成することを示す。
大きさ(115残基)から、構造を損なわない挿入断片の部位の可能性は非常に限ら
れていることが強調されるべきである。ダイマー化のためにジスルフィド架橋は
重要であるが必須ではないため、いくつかの変異体をシステインの+/-対除去で
作製する。 候補分子の構築において、2つの基本パラメータが考えられてきた。まず、野生
型hIL5の三次元構造の最大のフラクションを維持することよって天然B細胞エピ
トープのレパートリーを維持することを試みる。これは、中和すべきことが知ら
れているIL5 B細胞エピトープが構造的であることを立証したDickasonら、(1994
)によって裏付けられている。三次構造の維持は、ループ又は分離セグメントの
ような構造上“中立な”部位に修飾をもたらすことによって求められ達成される
。へリックス"B"及び"C"と共にN末端へリックス"A"が第二分子で四次構造に折り
たたみ可能であるという事実は、これら3つのへリックスが安定した折りたたみ
スカホールドを構成することを示す。
【００８８】 次に、ワクチン概念に関係する生物学的活性を考慮した。通常、不活性構築物
は、分子の推定上の毒性作用を減らす目的及び一般に免疫応答を検定するのに好
ましい。一方、最適な中和抗体は理論上、IL5Rと相互作用するIL5の一部に特異性
を示すはずである。 これはおそらく活性変異体で免疫処理することによって達成
されるであろう。最後に、免疫系へのIL5の生物学的作用が、免疫応答にエンハ
ンサーとして作用することで総合的な作用を改善し得ることが考えられる。しか
し、他の分子についての出願人のこれまでの経験に基づけば、“理論上可能な活
性の”構築物の大部分は低活性か又は不活性であると思われる。 従って、提案される全ての変異体は潜在的に活性であるが、所望であれば、活
性ダイマーの形成を妨げることによって、又は受容体の結合/活性にかかわる"A"
-及び"D"-ヘリックスの領域の交替によって比較的容易に不活性にできる。
は、分子の推定上の毒性作用を減らす目的及び一般に免疫応答を検定するのに好
ましい。一方、最適な中和抗体は理論上、IL5Rと相互作用するIL5の一部に特異性
を示すはずである。 これはおそらく活性変異体で免疫処理することによって達成
されるであろう。最後に、免疫系へのIL5の生物学的作用が、免疫応答にエンハ
ンサーとして作用することで総合的な作用を改善し得ることが考えられる。しか
し、他の分子についての出願人のこれまでの経験に基づけば、“理論上可能な活
性の”構築物の大部分は低活性か又は不活性であると思われる。 従って、提案される全ての変異体は潜在的に活性であるが、所望であれば、活
性ダイマーの形成を妨げることによって、又は受容体の結合/活性にかかわる"A"
-及び"D"-ヘリックスの領域の交替によって比較的容易に不活性にできる。
【００８９】 要約すると、構造の維持及び生物学的活性についての上記の検討により、目的
領域を、C末端の可変性領域とループ1〜3のいずれか1つとして定義する。 ループ3は、tri-へリックス折りたたみスカホールドと想定されるものから構
造上分離しているため、主要な目的領域として選択される。その上、ループ3を伸
長(Dickason, 1996)することによって生物学的に活性なモノマーを生ずることが
可能であるため、この領域はあらゆる型の変異体：モノマー/ダイマー及び活性/
不活性を生ずる可能性を有している。 "ループ 1"は、置換に適当な長さの非ヘリックスストレッチを含む第二の領域
である。この領域の変異体は、 ダイマー化が可能な場合に限り理論上活性であ
ろうが、野生型ループの長さはこれを変化しやすくするため、置換後タンパク質
の正確な折りたたみを期待するのが妥当である。
領域を、C末端の可変性領域とループ1〜3のいずれか1つとして定義する。 ループ3は、tri-へリックス折りたたみスカホールドと想定されるものから構
造上分離しているため、主要な目的領域として選択される。その上、ループ3を伸
長(Dickason, 1996)することによって生物学的に活性なモノマーを生ずることが
可能であるため、この領域はあらゆる型の変異体：モノマー/ダイマー及び活性/
不活性を生ずる可能性を有している。 "ループ 1"は、置換に適当な長さの非ヘリックスストレッチを含む第二の領域
である。この領域の変異体は、 ダイマー化が可能な場合に限り理論上活性であ
ろうが、野生型ループの長さはこれを変化しやすくするため、置換後タンパク質
の正確な折りたたみを期待するのが妥当である。
【００９０】 "ループ 2"領域に置換を含む変異体もまた、ダイマーとしてのみ活性であろう
。置換し得る領域は挿入断片と比較して短く、想定される折りたたみスカホール
ドに中心位置を有する。これらは置換後タンパク質の正確な折りたたみを阻害す
るであろうループ2の2つの特性である。一方、ループ2はIL5Rと相互に作用する領
域に対向して位置し、結果として、修飾タンパク質が正確に折りたたまれるので
あれば、期待される最適な野生型中和エピトープが提示される。 最後に、"ヘリックス D"に続くC末端可変性領域への挿入を提案する。タンパ
ク質の構造という観点から、この概念はなかなか無難に思われるが、C末端が受
容体結合の領域及びダイマー境界面の双方に位置するため、この領域で修飾を行
うと、ダイマー及び(修飾タンパク質がダイマー化された場合)生物学的活性の両
方に影響を及ぼす可能性がある。
。置換し得る領域は挿入断片と比較して短く、想定される折りたたみスカホール
ドに中心位置を有する。これらは置換後タンパク質の正確な折りたたみを阻害す
るであろうループ2の2つの特性である。一方、ループ2はIL5Rと相互に作用する領
域に対向して位置し、結果として、修飾タンパク質が正確に折りたたまれるので
あれば、期待される最適な野生型中和エピトープが提示される。 最後に、"ヘリックス D"に続くC末端可変性領域への挿入を提案する。タンパ
ク質の構造という観点から、この概念はなかなか無難に思われるが、C末端が受
容体結合の領域及びダイマー境界面の双方に位置するため、この領域で修飾を行
うと、ダイマー及び(修飾タンパク質がダイマー化された場合)生物学的活性の両
方に影響を及ぼす可能性がある。
【００９１】 上記の検討によって、はじめに構築した10個の変異体のアミノ酸配列は、SEQ
ID NOs: 2〜11 及び 13〜22として示す。後の段階で構築したさらなる変異体は
、SEQ ID NOs: 27〜59（DNA核酸配列及びアミノ酸配列の両方を含む）に示す。 実施例2以外の全ての挿入は、正の構築物のマウスからヒトへの転移工程をう
まく促進するためhIL5からmIL5に保存されるフランキングアミノ酸残基を含むよ
うに調整されることに留意すべきである。 以下の実施例では、置換位置をマウスのアミノ酸残基配列番号によって示す。
対応するヒトの位置は括弧で表す。
ID NOs: 2〜11 及び 13〜22として示す。後の段階で構築したさらなる変異体は
、SEQ ID NOs: 27〜59（DNA核酸配列及びアミノ酸配列の両方を含む）に示す。 実施例2以外の全ての挿入は、正の構築物のマウスからヒトへの転移工程をう
まく促進するためhIL5からmIL5に保存されるフランキングアミノ酸残基を含むよ
うに調整されることに留意すべきである。 以下の実施例では、置換位置をマウスのアミノ酸残基配列番号によって示す。
対応するヒトの位置は括弧で表す。
【００９２】実施例1 Cys84(86)を維持しながらループ3にP2置換位置を有する変異体 P2 エピトープ(SEQ ID NO: 23)をCys84(86)の除去を避けながらループ3に置換
する。これらの変異体(SEQ ID NOs: 2及び28 (ヒト)、ここでアミノ酸87〜90又は
88〜91が置換され、13及び46 (マウス)、ここでアミノ酸85〜88又は86〜89が置
換される)は、モノマー（ループ3の伸長のため）及びダイマーの両方として潜在
的に活性である。SEQ ID Nos: 28 及び46を、それぞれhIL5.1及びmIL5.1と示す。 実施例2 Cys42(44)を維持しながらループ1にP2置換位置を有する変異体 P2エピトープ(SEQ ID NO: 23)をCys42(44)の除去を避けながらループ1に置換
する。これらの変異体（ SEQ ID NOs: 3及び36 (ヒト)、ここで、アミノ酸32〜43
又は33〜43が置換され、 14及び56 (マウス)、ここでアミノ酸30〜41又は31〜41
が置換される）は、ダイマーとしてのみ潜在的に活性である。SEQ ID Nos: 36及
び56を、それぞれhIL5.5及びd mIL5.5と示す。
する。これらの変異体(SEQ ID NOs: 2及び28 (ヒト)、ここでアミノ酸87〜90又は
88〜91が置換され、13及び46 (マウス)、ここでアミノ酸85〜88又は86〜89が置
換される)は、モノマー（ループ3の伸長のため）及びダイマーの両方として潜在
的に活性である。SEQ ID Nos: 28 及び46を、それぞれhIL5.1及びmIL5.1と示す。 実施例2 Cys42(44)を維持しながらループ1にP2置換位置を有する変異体 P2エピトープ(SEQ ID NO: 23)をCys42(44)の除去を避けながらループ1に置換
する。これらの変異体（ SEQ ID NOs: 3及び36 (ヒト)、ここで、アミノ酸32〜43
又は33〜43が置換され、 14及び56 (マウス)、ここでアミノ酸30〜41又は31〜41
が置換される）は、ダイマーとしてのみ潜在的に活性である。SEQ ID Nos: 36及
び56を、それぞれhIL5.5及びd mIL5.5と示す。
【００９３】実施例3 ループ2にP2置換位置を有する変異体 P2エピトープ(SEQ ID NO: 23)をループ2に置換する。 これらの変異体(SEQ ID
NOs: 4及び34（ヒト）、ここでアミノ酸59〜64が置換され、15及び50（マウス）
ここで、アミノ酸57〜62が置換される)は、ダイマーとしてのみ潜在的に活性で
ある。SEQ ID Nos: 34及び50を、それぞれhIL5.4及びmIL5.4と示す。実施例4 Cys84(86)を除去しながらループ3にP2置換位置を有する変異体 P2 エピトープ(SEQ ID NO: 23)を、Cys84(86)を除去しながらループ3に置換す
る。これらの変異体（SEQ ID NOs: 5及び38（ヒト）ここで、アミノ酸86〜91が
置換され、16及び54（マウス）、ここでアミノ酸84〜89が置換される）は、#1型
の変異体(SEQ ID NOs: 2及び28ならびに13及び46)に原理上類似しているが、モ
ノマー生成物の生成は、ジスルフィド架橋の形成を妨げ、ループ3の長さを調整
することによって促進される。SEQ ID Nos: 38及び54を、それぞれhIL5.6及びmI
L5.6と示す。
NOs: 4及び34（ヒト）、ここでアミノ酸59〜64が置換され、15及び50（マウス）
ここで、アミノ酸57〜62が置換される)は、ダイマーとしてのみ潜在的に活性で
ある。SEQ ID Nos: 34及び50を、それぞれhIL5.4及びmIL5.4と示す。実施例4 Cys84(86)を除去しながらループ3にP2置換位置を有する変異体 P2 エピトープ(SEQ ID NO: 23)を、Cys84(86)を除去しながらループ3に置換す
る。これらの変異体（SEQ ID NOs: 5及び38（ヒト）ここで、アミノ酸86〜91が
置換され、16及び54（マウス）、ここでアミノ酸84〜89が置換される）は、#1型
の変異体(SEQ ID NOs: 2及び28ならびに13及び46)に原理上類似しているが、モ
ノマー生成物の生成は、ジスルフィド架橋の形成を妨げ、ループ3の長さを調整
することによって促進される。SEQ ID Nos: 38及び54を、それぞれhIL5.6及びmI
L5.6と示す。
【００９４】実施例5 C末端にP2置換位置108〜111(110〜113)を有する変異体 P2エピトープ(SEQ ID NO: 23)をヘリックスDに続くC末端領域に置換する。こ
れらの変異体（SEQ ID NOs: 6及び17）は唯一ダイマーとして潜在的に活性であ
る。実施例6 Cys84(86)を維持しながらループ3にP30置換位置を有する変異体 P30エピトープ(SEQ ID NO: 24)をCys84(86)の除去を避けてループ3に置換する
。これらの変異体（SEQ ID NOs: 7及び40 (ヒト)、ここでアミノ酸88〜91又は87
〜90が置換され、18及び58 (マウス)、ここでアミノ酸85〜88又は86〜89が置換
される）は、モノマー（ループ3の伸長のため）及びダイマーの両方として潜在
的に活性である。SEQ ID Nos: 40及び58を、それぞれhIL5.7及びmIL5.7と示す。
れらの変異体（SEQ ID NOs: 6及び17）は唯一ダイマーとして潜在的に活性であ
る。実施例6 Cys84(86)を維持しながらループ3にP30置換位置を有する変異体 P30エピトープ(SEQ ID NO: 24)をCys84(86)の除去を避けてループ3に置換する
。これらの変異体（SEQ ID NOs: 7及び40 (ヒト)、ここでアミノ酸88〜91又は87
〜90が置換され、18及び58 (マウス)、ここでアミノ酸85〜88又は86〜89が置換
される）は、モノマー（ループ3の伸長のため）及びダイマーの両方として潜在
的に活性である。SEQ ID Nos: 40及び58を、それぞれhIL5.7及びmIL5.7と示す。
【００９５】実施例7 Cys42(44)を維持しながらループ1にP30置換位置を有する変異体 P30エピトープ(SEQ ID NO: 24)をCys42(44)の除去を避けてループ1に置換する
。これらの変異体(SEQ ID NOs: 8及び30 (ヒト)、ここでアミノ酸32〜43が置換さ
れ、19及び48 (マウス)、ここでアミノ酸30〜41が置換される)は、ダイマーとし
てのみ潜在的に活性である。SEQ ID Nos:30及び48 を、それぞれhIL5.2及びmIL5.
2と示す。実施例8 ループ２にP30置換位置を有する変異体 P30 エピトープ(SEQ ID NO: 24)をループ2に置換する。これらの変異体（SEQ
ID NOs: 9及び20、ここでアミノ酸59〜64及び7〜62 がそれぞれ置換される）は
、ダイマーとしてのみ潜在的に活性である。
。これらの変異体(SEQ ID NOs: 8及び30 (ヒト)、ここでアミノ酸32〜43が置換さ
れ、19及び48 (マウス)、ここでアミノ酸30〜41が置換される)は、ダイマーとし
てのみ潜在的に活性である。SEQ ID Nos:30及び48 を、それぞれhIL5.2及びmIL5.
2と示す。実施例8 ループ２にP30置換位置を有する変異体 P30 エピトープ(SEQ ID NO: 24)をループ2に置換する。これらの変異体（SEQ
ID NOs: 9及び20、ここでアミノ酸59〜64及び7〜62 がそれぞれ置換される）は
、ダイマーとしてのみ潜在的に活性である。
【００９６】実施例9 C末端にP30置換位置を有する変異体 P30エピトープ(SEQ ID NO: 24)をヘリックスDに続くC末端領域に置換する。こ
れらの変異体（SEQ ID NOs: 10及び21、ここでアミノ酸110〜113及び108〜111が
それぞれ置換される）は、ダイマーとしてのみ潜在的に活性である。実施例10 P2置換位置84〜89 (86〜91)及びP30置換位置110〜113を有する変異体 P2 エピトープ(SEQ ID NO: 23)を、Cys84(86)を除去してループ3に置換し、P3
0 エピトープ(SEQ ID NO: 24)をヘリックスDに続くC末端領域に置換する。これら
の変異体(SEQ ID NOs: 11及び22)は#12型の変異体と同様に唯一両方のエピトー
プを含み、潜在的に活性なモノマーである。
れらの変異体（SEQ ID NOs: 10及び21、ここでアミノ酸110〜113及び108〜111が
それぞれ置換される）は、ダイマーとしてのみ潜在的に活性である。実施例10 P2置換位置84〜89 (86〜91)及びP30置換位置110〜113を有する変異体 P2 エピトープ(SEQ ID NO: 23)を、Cys84(86)を除去してループ3に置換し、P3
0 エピトープ(SEQ ID NO: 24)をヘリックスDに続くC末端領域に置換する。これら
の変異体(SEQ ID NOs: 11及び22)は#12型の変異体と同様に唯一両方のエピトー
プを含み、潜在的に活性なモノマーである。
【００９７】実施例11 Cys84(86)を除去しながらループ3にP30置換位置を有する変異体 P2エピトープ(SEQ ID NO: 24)をCys84(86)を除去しながらループ3に置換する。 これらの変異体(SEQ ID NOs: 42 (ヒト)、ここでアミノ酸86〜91が置換され、5
8（マウス）ここで、アミノ酸84〜89が置換される)は、#6型の変異体に原理上類
似しているが、モノマー生成物の生成は、ジスルフィド架橋の形成を阻害し、ル
ープ3の長さを調整することによって促進される。SEQ ID Nos: 42及び58を、そ
れぞれhIL5.12及びmIL5.12と示す。実施例12 ループ3にP2及びP30置換位置を有する変異体 P2 (SEQ ID NO: 23)及びP30 (SEQ ID NO: 24)エピトープを、Cys84(86)を維持
しながらループ3に置換する。これらの変異体（SEQ ID NOs: 44及び60、ここで
アミノ酸88〜91及び86〜89がそれぞれ置換される）は、両方のエピトープを含み
、潜在的に活性なモノマーである。SEQ ID NOs: 44及び60を、それぞれhIL5.13
及びmIL5.13と示す。
8（マウス）ここで、アミノ酸84〜89が置換される)は、#6型の変異体に原理上類
似しているが、モノマー生成物の生成は、ジスルフィド架橋の形成を阻害し、ル
ープ3の長さを調整することによって促進される。SEQ ID Nos: 42及び58を、そ
れぞれhIL5.12及びmIL5.12と示す。実施例12 ループ3にP2及びP30置換位置を有する変異体 P2 (SEQ ID NO: 23)及びP30 (SEQ ID NO: 24)エピトープを、Cys84(86)を維持
しながらループ3に置換する。これらの変異体（SEQ ID NOs: 44及び60、ここで
アミノ酸88〜91及び86〜89がそれぞれ置換される）は、両方のエピトープを含み
、潜在的に活性なモノマーである。SEQ ID NOs: 44及び60を、それぞれhIL5.13
及びmIL5.13と示す。
【００９８】実施例13 発現系の選択 組換えIL5を、酵母、昆虫細胞及びCHO細胞を含む多くの異なる発現系で発現さ
せた(Tavernierら、1989)。 hIL5を生成するための宿主の使用を報告している先の研究（Proudfootら、199
0, Graberら、1993）に基づけば、本発明による1つの適切な発現系は大腸菌であ
る。組換えタンパク質は封入体として発現し、精製及び(例えば、米国特許第5,73
9,281号で開示された一般的に適用可能な再折りたたみ法を用いる)再度の折りた
たみにより生物学的に活性なダイマーに変換される。遺伝的な構築物が整った場
合、大腸菌発現の速度及び単純性により即座にタンパク質の産生を開始できるた
め、IL5自家ワクチン概念のインビボの証拠を確立する材料の迅速な生成が促進
される。 何らかの理由で可能性が低いと分かる場合は（例えば、再折りたたみの結果と
して生ずる低収率、生成物の不安定性又はグリコシル化に関連する薬物動態学的
パラメータの改善等）、酵母での産出により自家ワクチンをさらに増進させるこ
とが考えられるだろう。
せた(Tavernierら、1989)。 hIL5を生成するための宿主の使用を報告している先の研究（Proudfootら、199
0, Graberら、1993）に基づけば、本発明による1つの適切な発現系は大腸菌であ
る。組換えタンパク質は封入体として発現し、精製及び(例えば、米国特許第5,73
9,281号で開示された一般的に適用可能な再折りたたみ法を用いる)再度の折りた
たみにより生物学的に活性なダイマーに変換される。遺伝的な構築物が整った場
合、大腸菌発現の速度及び単純性により即座にタンパク質の産生を開始できるた
め、IL5自家ワクチン概念のインビボの証拠を確立する材料の迅速な生成が促進
される。 何らかの理由で可能性が低いと分かる場合は（例えば、再折りたたみの結果と
して生ずる低収率、生成物の不安定性又はグリコシル化に関連する薬物動態学的
パラメータの改善等）、酵母での産出により自家ワクチンをさらに増進させるこ
とが考えられるだろう。
【００９９】 最近、S2細胞（Invitrogenから入手可能）を使用するDrosophila melanogaste
r発現系を用いて有望な結果が得られており、現在この系は本発明のIL5類似体の
発現に好ましい実施形態である。 IL5変異体タンパク質を、IL5構築物を安定的に発現するS2ショウジョウバエ細
胞から産生させた。いくつかの異なるトランスフェクション方法を試験し、Ca2PO 4 及びリポフェクチンの両方を選択した。 S2細胞の2つの異なるサブクローンを用
いて、それぞれCa2PO4及びリポフェクチンでトランスフェクトした。 2つのクロ
ーンをATCC及びLars Sondergaard of the University of Copenhagenからそれぞ
れ得た。両方の方法を用いて、2〜10 mg/Lの範囲でmIL5 及びmIL5.1タンパク質を
発現する適当な安定した系を選択した。
r発現系を用いて有望な結果が得られており、現在この系は本発明のIL5類似体の
発現に好ましい実施形態である。 IL5変異体タンパク質を、IL5構築物を安定的に発現するS2ショウジョウバエ細
胞から産生させた。いくつかの異なるトランスフェクション方法を試験し、Ca2PO 4 及びリポフェクチンの両方を選択した。 S2細胞の2つの異なるサブクローンを用
いて、それぞれCa2PO4及びリポフェクチンでトランスフェクトした。 2つのクロ
ーンをATCC及びLars Sondergaard of the University of Copenhagenからそれぞ
れ得た。両方の方法を用いて、2〜10 mg/Lの範囲でmIL5 及びmIL5.1タンパク質を
発現する適当な安定した系を選択した。
【０１００】 材料及び方法： S2細胞を25℃かつ120 rpmで振とうフラスコ中で5〜10％のウシ胎仔血清(FCS)
、0.1％のプルロニックF68 (Sigma)、ペニシリン/ストレプトマイシン（Life Te
chnologies）を含むシュナイダ−の培地(Sigma)で生長、維持した。 リポフェクチントランスフェクションを、250 ml又は1L振とうフラスコで行っ
た。 S2 細胞は、2.5〜3×106/mlに分け抗生物質が入っていない50 ml Excell 4
20 (JRH Biosciences)に入れ、250 ml振とうフラスコで一晩増殖させた。 翌朝、
リポフェクチン試薬を調製した：チューブ1）当該の遺伝子を含む300〜1200μg
のプラスミドDNA、15〜45 mlの血清中 15〜60 μgの pCoHYGRO ハイグロマイシ
ン選択プラスミド(プラスミド比20:1)及び補助剤なしの培地；チューブ2）5 ml
の血清中1ml のリポフェクチン及び補助剤なしの培地。室温で1時間後、チュー
ブ1と2を混合し、S2細胞を徐々に加える前に室温で15分間放置した。細胞を一晩
成長させた後、十分な補助剤と150〜300μg/ml のハイグロマイシンを含む新し
い培地を加えた。 遷移系と安定系を、無血清Ex-cell 420培地(JRH Biosciences)中の 500μM硫
酸銅又は10μMの塩化カドミウムのどちらかで48〜72時間誘発した。
、0.1％のプルロニックF68 (Sigma)、ペニシリン/ストレプトマイシン（Life Te
chnologies）を含むシュナイダ−の培地(Sigma)で生長、維持した。 リポフェクチントランスフェクションを、250 ml又は1L振とうフラスコで行っ
た。 S2 細胞は、2.5〜3×106/mlに分け抗生物質が入っていない50 ml Excell 4
20 (JRH Biosciences)に入れ、250 ml振とうフラスコで一晩増殖させた。 翌朝、
リポフェクチン試薬を調製した：チューブ1）当該の遺伝子を含む300〜1200μg
のプラスミドDNA、15〜45 mlの血清中 15〜60 μgの pCoHYGRO ハイグロマイシ
ン選択プラスミド(プラスミド比20:1)及び補助剤なしの培地；チューブ2）5 ml
の血清中1ml のリポフェクチン及び補助剤なしの培地。室温で1時間後、チュー
ブ1と2を混合し、S2細胞を徐々に加える前に室温で15分間放置した。細胞を一晩
成長させた後、十分な補助剤と150〜300μg/ml のハイグロマイシンを含む新し
い培地を加えた。 遷移系と安定系を、無血清Ex-cell 420培地(JRH Biosciences)中の 500μM硫
酸銅又は10μMの塩化カドミウムのどちらかで48〜72時間誘発した。
【０１０１】 結果: 33個の安定したラインがCa2PO4によって、23個がリポフェクチンによって生じ
た。発現収量には、検出不可能な量から11 mg/Lまでのばらつきがあった。 以下
の表に、タンパク質の生成に使用した幾つかの系を要約する。
た。発現収量には、検出不可能な量から11 mg/Lまでのばらつきがあった。 以下
の表に、タンパク質の生成に使用した幾つかの系を要約する。
【表１】 従って、S2細胞は、リン酸カルシウムの沈殿又はリポフェクションのどちらか
によってトランスフェクトされ得る。プラスミドp612とp767との発現レベルが異
なるため、Bipシグナルペプチドは、 S2細胞中の内因性mIL5リーダーよりもより
効率的なリーダー配列であると思われる。
によってトランスフェクトされ得る。プラスミドp612とp767との発現レベルが異
なるため、Bipシグナルペプチドは、 S2細胞中の内因性mIL5リーダーよりもより
効率的なリーダー配列であると思われる。
【０１０２】実施例14 修飾分子のスクリーニング及び選択 以下の説明にしたがって、組換えタンパク質を精製し、特徴付けた。自家ワク
チンの候補の特徴付けには、目的のタンパク質生成物を定義する関連パラメータ
を正確に証明する程度の、分析クロマトグラフィー、等電点電気泳動(IEF)、SDS
-PAGE、アミノ酸組成分析、N-末端配列分析、質量分析計、低角度レーザー光散
乱、標準分光学及び円偏光二色性分光分析が含まれる。 Hisタグ標識されたタンパク質は最近まで2段階の手順を用いて精製されてきた
。しかし、最終のキレート段階後、収量及び純度は予測されていたほど高くなか
った。新しい1段階の精製手順は3つの主な利点：最終生成物のより高い収量、よ
り高い処理量及びより高い純度を達成することが示唆されている。Hisタグを除
去するための切断条件もまた確立されている。
チンの候補の特徴付けには、目的のタンパク質生成物を定義する関連パラメータ
を正確に証明する程度の、分析クロマトグラフィー、等電点電気泳動(IEF)、SDS
-PAGE、アミノ酸組成分析、N-末端配列分析、質量分析計、低角度レーザー光散
乱、標準分光学及び円偏光二色性分光分析が含まれる。 Hisタグ標識されたタンパク質は最近まで2段階の手順を用いて精製されてきた
。しかし、最終のキレート段階後、収量及び純度は予測されていたほど高くなか
った。新しい1段階の精製手順は3つの主な利点：最終生成物のより高い収量、よ
り高い処理量及びより高い純度を達成することが示唆されている。Hisタグを除
去するための切断条件もまた確立されている。
【０１０３】2段階IL5 精製手順： タンパク質の発現は、培地に金属イオンを加えることによって誘発される。こ
れらの金属イオンは、タンパク質をキレートカラムに付す前に除去しなければな
らない。従って、総量20 mMのEDTAを金属イオンを錯体化するために加え、次い
で上清をSP-セファロースカラムに通し、タンパク質を得る。洗浄によって非結
合タンパク質を除去した後、結合タンパク質をNaCl の段階勾配によって溶出す
る。この工程は2つの目的：因子30により体積を減らす濃縮工程及び緩衝液の交換
にかなう。 関連フラクション（SDS-PAGE により決定されたもの）を貯留し、さらに金属
キレートカラムで精製する。 タンパク質をNi2+-帯電キレートカラムに加え、非結合タンパク質を洗い流す
。次いで、結合タンパク質を、イミダゾール勾配を用いて溶出する。次いでカラ
ムの全てのフラクション、流出物及びEDTA−洗浄液をSDS-PAGE及びドットブロッ
トの両方で調べる。 関連フラクション (SDS-PAGE及びドットブロットにより決定されたもの) を貯
留し、pH6.9に調節した10倍容量のいPBSで2回透析する。 濾過後、透析した物質を適した濃度(好ましくは1 mg/ml)に達するまで濃縮する
。最後に、タンパク質をアリコートし、-20℃で貯蔵する。
れらの金属イオンは、タンパク質をキレートカラムに付す前に除去しなければな
らない。従って、総量20 mMのEDTAを金属イオンを錯体化するために加え、次い
で上清をSP-セファロースカラムに通し、タンパク質を得る。洗浄によって非結
合タンパク質を除去した後、結合タンパク質をNaCl の段階勾配によって溶出す
る。この工程は2つの目的：因子30により体積を減らす濃縮工程及び緩衝液の交換
にかなう。 関連フラクション（SDS-PAGE により決定されたもの）を貯留し、さらに金属
キレートカラムで精製する。 タンパク質をNi2+-帯電キレートカラムに加え、非結合タンパク質を洗い流す
。次いで、結合タンパク質を、イミダゾール勾配を用いて溶出する。次いでカラ
ムの全てのフラクション、流出物及びEDTA−洗浄液をSDS-PAGE及びドットブロッ
トの両方で調べる。 関連フラクション (SDS-PAGE及びドットブロットにより決定されたもの) を貯
留し、pH6.9に調節した10倍容量のいPBSで2回透析する。 濾過後、透析した物質を適した濃度(好ましくは1 mg/ml)に達するまで濃縮する
。最後に、タンパク質をアリコートし、-20℃で貯蔵する。
【０１０４】 以下の特定のプロトコルを適用した： 1) 得られた上清を2500×g で15分間遠心分離する(感染が生じた場合、22000
×gで30分間遠心分離をする必要がある)。 次いで、上清を0.45 μmのろ紙続いて
0.22μmのろ紙を用いて濾過する(はじめに5μmのろ紙での濾過が必要な場合が時
々ある)。 次いで上清を40 mMのEDTAを含有する緩衝液A（工程2を参照）と1：1に混合し
、0.2 M NaH2PO4、10%グリセロール、20 mM EDTA、pH 6.0を有する最終的な緩衝
組成物とする。 2) 次いで、濾過した上清を緩衝液Aで平衡化したSP-セファロースカラムに加え
る。総量1〜2L(タンパク質の濃度によるが、上記は1L当り1〜10 mgのIL5を有する
)を80 mlカラムに加えてもよい。 使用中の流量： 1〜2 ml/分 (通常一晩)、流出
物を回収し、後の分析用に貯蔵する。使用後、安定したベースラインに達するま
で2〜3カラム容量(CV)のA緩衝液でカラムを洗浄する。結合タンパク質を段階勾
配：0〜100〜500〜1000 mM のNaClを用いて溶出する：10 mlのフラクションを回
収する。流量は10 ml/分である。精製は5℃で行う。
×gで30分間遠心分離をする必要がある)。 次いで、上清を0.45 μmのろ紙続いて
0.22μmのろ紙を用いて濾過する(はじめに5μmのろ紙での濾過が必要な場合が時
々ある)。 次いで上清を40 mMのEDTAを含有する緩衝液A（工程2を参照）と1：1に混合し
、0.2 M NaH2PO4、10%グリセロール、20 mM EDTA、pH 6.0を有する最終的な緩衝
組成物とする。 2) 次いで、濾過した上清を緩衝液Aで平衡化したSP-セファロースカラムに加え
る。総量1〜2L(タンパク質の濃度によるが、上記は1L当り1〜10 mgのIL5を有する
)を80 mlカラムに加えてもよい。 使用中の流量： 1〜2 ml/分 (通常一晩)、流出
物を回収し、後の分析用に貯蔵する。使用後、安定したベースラインに達するま
で2〜3カラム容量(CV)のA緩衝液でカラムを洗浄する。結合タンパク質を段階勾
配：0〜100〜500〜1000 mM のNaClを用いて溶出する：10 mlのフラクションを回
収する。流量は10 ml/分である。精製は5℃で行う。
【０１０５】 各操作後、カラムを2 CVの1 M NaOH、流量5 ml/分で清潔にし、緩衝液Aで再平
衡化した。 緩衝液A：0.2 M NaH2PO4、10%グリセロール、pH 6.0 緩衝液B：0.2 M NaH2PO4、1 M NaCl、40 mMイミダゾール、10%グリセロール、pH
6.0 wt及び変異体の両方に同じ手順を使用する 。 全てのフラクション、出発物質及び流出物をドットブロット及びSDS-PAGEで試
験する。 IL5を含むフラクションを貯留し、さらにキレートカラムを使用して精
製する。
衡化した。 緩衝液A：0.2 M NaH2PO4、10%グリセロール、pH 6.0 緩衝液B：0.2 M NaH2PO4、1 M NaCl、40 mMイミダゾール、10%グリセロール、pH
6.0 wt及び変異体の両方に同じ手順を使用する 。 全てのフラクション、出発物質及び流出物をドットブロット及びSDS-PAGEで試
験する。 IL5を含むフラクションを貯留し、さらにキレートカラムを使用して精
製する。
【０１０６】1段階IL5精製手順： ZnCl2を充填した70-mlキレート−カラムに上清を直接加える。 洗浄によって非
結合物質を取り除いた後、結合タンパク質（IL5及び汚染物質）をイミダゾール
の勾配を加えることによって溶出する。この方法はHisタグを十分に利用して、
高純度の最終生成物 (>95%)を得る1段階の精製手順を提供する。関連フラクショ
ン（SDS-PAGE及びドットブロットにより決定されたもの）を貯留し、pH 6.9、Na
Cl濃度、400 mMに調節したPBSの10倍容量で2回透析する。 濾過後、透析した物質を適切な濃度（好ましくは1 mg/ml）に達するまで濃縮す
る。最後に、タンパク質をアリコートし、-20℃で貯蔵する。
結合物質を取り除いた後、結合タンパク質（IL5及び汚染物質）をイミダゾール
の勾配を加えることによって溶出する。この方法はHisタグを十分に利用して、
高純度の最終生成物 (>95%)を得る1段階の精製手順を提供する。関連フラクショ
ン（SDS-PAGE及びドットブロットにより決定されたもの）を貯留し、pH 6.9、Na
Cl濃度、400 mMに調節したPBSの10倍容量で2回透析する。 濾過後、透析した物質を適切な濃度（好ましくは1 mg/ml）に達するまで濃縮す
る。最後に、タンパク質をアリコートし、-20℃で貯蔵する。
【０１０７】 特定のプロトコルは以下の工程に従う 1) 上清を0.45μmろ紙で濾過し、不純物を除去して緩衝液Aで1：1に希釈する。 70-ml Fast Flowキレートカラムを5 CVの水ですすぎ、次いで10 CV の10 mM Z
nCl2 pH 7で充填する。5CVの緩衝液Aで平衡化した後、サンプルをポンプ（流量
10 ml/分）を用いて加える。 流出物を回収し、後の分析用に貯蔵する。30 CV以上
のイミダゾール0〜250 mMにわたるイミダゾール勾配を利用して、結合タンパク
質を溶出する。最後に、カラムを5 CVの緩衝液Cで除去する。 10 mlのフラクションを回収する。 緩衝液： A： 20 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、10%グリセロール、pH 7 B： 20 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、10%グリセロール、pH 7、0.25 Mイミダゾール
C：20 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、0.1 M EDTA pH 7.0 全てのフラクション、流出物及び出発物質をSDS-PAGEで試験する。
nCl2 pH 7で充填する。5CVの緩衝液Aで平衡化した後、サンプルをポンプ（流量
10 ml/分）を用いて加える。 流出物を回収し、後の分析用に貯蔵する。30 CV以上
のイミダゾール0〜250 mMにわたるイミダゾール勾配を利用して、結合タンパク
質を溶出する。最後に、カラムを5 CVの緩衝液Cで除去する。 10 mlのフラクションを回収する。 緩衝液： A： 20 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、10%グリセロール、pH 7 B： 20 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、10%グリセロール、pH 7、0.25 Mイミダゾール
C：20 mM NaH2PO4、0.5 M NaCl、0.1 M EDTA pH 7.0 全てのフラクション、流出物及び出発物質をSDS-PAGEで試験する。
【０１０８】 2) IL5を含む最も純粋なフラクション(SDS-PAGEで決定されたもの)を貯留し(50
μlを後の分析用に貯蔵する)、10倍容量のPBS、6.9に調節したpH、12〜14 kDaの
MWCO、6℃で2回透析する。透析物を0.22μmろ紙で濾過し（50μlを後の分析用に
貯蔵する）、透析緩衝液(0.45μmで濾過)を参考として用いてA280を測定する。
透析前後の容量を測定し、透析/濃縮工程を示すサンプルを、後のSDS-PAGEによ
る分析用に(後の工程3)貯蔵する。 3) NaClを透析したタンパク質に総濃度が400 mMになるまで加え、次いでAmicon
装置(50 ml以上の容量用)又はVivaspin濃縮装置(10〜15 ml 用)のどちらかを用
いて濃縮する。いずれの場合にも、サンプルを加える前に膜を10 mlの PBS-緩衝
液で飽和する。サンプルを、好ましくは1 mg/mlの濃度に達するまで(A280で測定
される)濃縮すべきである。透析し、濃縮したサンプルを0.22μmろ紙で濾過し、
E-nrでしるしをつける。流出物を参考として用いてA280 を測定する。 透析及び濃縮工程からの全サンプルをSDS-PAGEならびにクーマシー染色により
分析する。精製したタンパク質をアリコートで凍結状態で貯蔵し、サンプルを記
述するシートを"IL5-タンパク質 "-ホルダーで保管する。
μlを後の分析用に貯蔵する)、10倍容量のPBS、6.9に調節したpH、12〜14 kDaの
MWCO、6℃で2回透析する。透析物を0.22μmろ紙で濾過し（50μlを後の分析用に
貯蔵する）、透析緩衝液(0.45μmで濾過)を参考として用いてA280を測定する。
透析前後の容量を測定し、透析/濃縮工程を示すサンプルを、後のSDS-PAGEによ
る分析用に(後の工程3)貯蔵する。 3) NaClを透析したタンパク質に総濃度が400 mMになるまで加え、次いでAmicon
装置(50 ml以上の容量用)又はVivaspin濃縮装置(10〜15 ml 用)のどちらかを用
いて濃縮する。いずれの場合にも、サンプルを加える前に膜を10 mlの PBS-緩衝
液で飽和する。サンプルを、好ましくは1 mg/mlの濃度に達するまで(A280で測定
される)濃縮すべきである。透析し、濃縮したサンプルを0.22μmろ紙で濾過し、
E-nrでしるしをつける。流出物を参考として用いてA280 を測定する。 透析及び濃縮工程からの全サンプルをSDS-PAGEならびにクーマシー染色により
分析する。精製したタンパク質をアリコートで凍結状態で貯蔵し、サンプルを記
述するシートを"IL5-タンパク質 "-ホルダーで保管する。
【０１０９】 上記の手順は、純度およそ90〜95％を有し、なおHisタグを含むタンパク質を
生じる。 配列を決定したところ、IL5wt及び変異体IL5.1はいずれもHis タグを含む目的
のN-末端配列を示した。 上述の精製手順を以下の特定の動作で実行した： 1) SP-セファロースカラムから貯留したフラクションを0.45μmろ紙で濾過し、
不純物を除去する。 5-ml HiTrap キレートカラム(専用カラムのみ使用)を15 mlの水(シリンジを用
いる)ですすぎ、 次いで0.1 MのNiSO4 15 mlで充填し15 mlの水で洗浄する。カラ
ムをAkta-システムに接続し、2〜3 CVのA緩衝液で平衡化する。サンプルを用量(
流量4 ml/分)に応じてループ又はポンプのどちらかを用いて加え、流出物を回収
し、後の分析用に貯蔵する。20 CV以上のイミダゾールの0〜500 mMにわたるイミ
ダゾール勾配を用いて結合タンパク質を溶出する。5 mlのフラクションを回収す
る。最後に、カラムを5 CVの緩衝液B2を用いて除去する。 緩衝液A: 0.2 M NaH2PO4、0.5 M NaCl、10 %グリセロール、pH 5.0 緩衝液B1: 0.2 M NaH2PO4, 0.5 M NaCl、0.5 M イミダゾール 10 %グリセロール
、pH 5.0 緩衝液B2: 50 mM Na-アセテート、0.5 M NaCl、0.1 M EDTA、10 %グリセロール
、pH 4.5 全てのフラクション、流出物及び出発物質をドットブロットで試験し、全関連
フラクションをSDS-PAGEで試験する。
生じる。 配列を決定したところ、IL5wt及び変異体IL5.1はいずれもHis タグを含む目的
のN-末端配列を示した。 上述の精製手順を以下の特定の動作で実行した： 1) SP-セファロースカラムから貯留したフラクションを0.45μmろ紙で濾過し、
不純物を除去する。 5-ml HiTrap キレートカラム(専用カラムのみ使用)を15 mlの水(シリンジを用
いる)ですすぎ、 次いで0.1 MのNiSO4 15 mlで充填し15 mlの水で洗浄する。カラ
ムをAkta-システムに接続し、2〜3 CVのA緩衝液で平衡化する。サンプルを用量(
流量4 ml/分)に応じてループ又はポンプのどちらかを用いて加え、流出物を回収
し、後の分析用に貯蔵する。20 CV以上のイミダゾールの0〜500 mMにわたるイミ
ダゾール勾配を用いて結合タンパク質を溶出する。5 mlのフラクションを回収す
る。最後に、カラムを5 CVの緩衝液B2を用いて除去する。 緩衝液A: 0.2 M NaH2PO4、0.5 M NaCl、10 %グリセロール、pH 5.0 緩衝液B1: 0.2 M NaH2PO4, 0.5 M NaCl、0.5 M イミダゾール 10 %グリセロール
、pH 5.0 緩衝液B2: 50 mM Na-アセテート、0.5 M NaCl、0.1 M EDTA、10 %グリセロール
、pH 4.5 全てのフラクション、流出物及び出発物質をドットブロットで試験し、全関連
フラクションをSDS-PAGEで試験する。
【０１１０】 2) IL5を含む最も純粋なフラクション(SDS-PAGEにより決定されたもの)を貯
留(後の分析用に50μlを貯蔵)し、 10倍容量のPBS、6.9に調節したpH、 MWCO 12
14 kDa、6℃で2回透析する。透析物を0.22μmろ紙で濾過(後の分析用に50μlを貯
蔵)し、ろ過した透析緩衝液を基準として用いてA280を測定する。透析前後の容量
を測定し、透析/濃縮工程を示すサンプルを、後のSDS-PAGEによる分析用に(後の
工程3)貯蔵する。 3) さらに400 mM の最終濃度になるまで余剰のNaClを添加後、Amicon装置（
50 ml以上の容量用）又はVivaspin濃縮装置（10〜50 ml用）のどちらかを使用し
て透析したタンパク質を濃縮する。いずれの場合にも、サンプルを加える前に膜
を10 mlのPBS緩衝液で飽和する。サンプルを、好ましくは1 mg/mlの濃度に達す
るまで濃縮するべきである(A280で測定)。流出物を基準として用いてA280を測定
する。透析し、濃縮したサンプルを0.22μmろ紙で濾過し、E-nrでしるしをつける
。 透析及び濃縮工程から全てのサンプルをSDS-PAGE及びクーマシー染色で分析す
る。精製したタンパク質をアリコートで凍結状態で貯蔵する。
留(後の分析用に50μlを貯蔵)し、 10倍容量のPBS、6.9に調節したpH、 MWCO 12
14 kDa、6℃で2回透析する。透析物を0.22μmろ紙で濾過(後の分析用に50μlを貯
蔵)し、ろ過した透析緩衝液を基準として用いてA280を測定する。透析前後の容量
を測定し、透析/濃縮工程を示すサンプルを、後のSDS-PAGEによる分析用に(後の
工程3)貯蔵する。 3) さらに400 mM の最終濃度になるまで余剰のNaClを添加後、Amicon装置（
50 ml以上の容量用）又はVivaspin濃縮装置（10〜50 ml用）のどちらかを使用し
て透析したタンパク質を濃縮する。いずれの場合にも、サンプルを加える前に膜
を10 mlのPBS緩衝液で飽和する。サンプルを、好ましくは1 mg/mlの濃度に達す
るまで濃縮するべきである(A280で測定)。流出物を基準として用いてA280を測定
する。透析し、濃縮したサンプルを0.22μmろ紙で濾過し、E-nrでしるしをつける
。 透析及び濃縮工程から全てのサンプルをSDS-PAGE及びクーマシー染色で分析す
る。精製したタンパク質をアリコートで凍結状態で貯蔵する。
【０１１１】 評価された他の精製手順は： Zn2+-キレート精製： イミダゾール勾配を増加させてタンパク質を溶出するこ
とは、wt-タンパク質がカラムに強く固着するので、非常に有効であると証明さ
れた。ショウジョウバエ上清を直接加え、洗浄後、IL5wtをイミダゾールで溶出す
ることができる。カラムを10 mMのZnCl2 10CVで充填し、水で洗浄する。結合及び
溶離用緩衝液のpHを6.5より高くすべきである。さもなければ、ZnCl2が沈殿する
であろう。 Con Aアフィニティクロマトグラフィーは、研究中である。アフィニティタグ
としてIL5に存在するグリコシル化及び単糖類似体を用いた溶出の可能性は、His
タグ標識されない構築物にも適用できるため、興味深いであろう。
とは、wt-タンパク質がカラムに強く固着するので、非常に有効であると証明さ
れた。ショウジョウバエ上清を直接加え、洗浄後、IL5wtをイミダゾールで溶出す
ることができる。カラムを10 mMのZnCl2 10CVで充填し、水で洗浄する。結合及び
溶離用緩衝液のpHを6.5より高くすべきである。さもなければ、ZnCl2が沈殿する
であろう。 Con Aアフィニティクロマトグラフィーは、研究中である。アフィニティタグ
としてIL5に存在するグリコシル化及び単糖類似体を用いた溶出の可能性は、His
タグ標識されない構築物にも適用できるため、興味深いであろう。
【０１１２】 Hisタグの除去： 15 aa His タグ(SEQ ID NO: 25)の除去は、製造業者 (Unizyme)の指示に従っ
て行う： 精製し、透析/濃縮したHisタグ標識 IL5は、2つの酵素、DAP1及びグルタミン
シクロトランスフェラーゼを順に添加することにより脱Hisタグされる。DAP1はQ
CT しながら遊離のN-末端から2つのアミノ酸を除去する。 まず酵素を活性化させる必要がある： 9 μlの HT-DAP1 (10 U/ml)を20 mMのシステアミン-HCl 9μl と混合する。室温
で5分インキュベートした後、108μlのHP-GCT (100 U/ml)及び54μlのTAGZyme
緩衝液の総量を加える。これを15分以内で使用しなければならない。 この一部は、1 mgのHisタグ標識されたタンパク質を消化するであろう。 Hisタグ標識したタンパク質を150μlの活性化酵素と混合し、37℃で120分間イ
ンキュベートする。サンプルを0、10、30、60及び 120分後、 SDS-PAGE分析用に
回収する(10μl)。サンプルを氷にのせ消化を止める。
て行う： 精製し、透析/濃縮したHisタグ標識 IL5は、2つの酵素、DAP1及びグルタミン
シクロトランスフェラーゼを順に添加することにより脱Hisタグされる。DAP1はQ
CT しながら遊離のN-末端から2つのアミノ酸を除去する。 まず酵素を活性化させる必要がある： 9 μlの HT-DAP1 (10 U/ml)を20 mMのシステアミン-HCl 9μl と混合する。室温
で5分インキュベートした後、108μlのHP-GCT (100 U/ml)及び54μlのTAGZyme
緩衝液の総量を加える。これを15分以内で使用しなければならない。 この一部は、1 mgのHisタグ標識されたタンパク質を消化するであろう。 Hisタグ標識したタンパク質を150μlの活性化酵素と混合し、37℃で120分間イ
ンキュベートする。サンプルを0、10、30、60及び 120分後、 SDS-PAGE分析用に
回収する(10μl)。サンプルを氷にのせ消化を止める。
【０１１３】 緩衝液： 1．TAGZyme緩衝液：20 mMのNaPO4緩衝液、pH 7.5； 150 mMのNaCl 2．20mM システアミン-HCl 消化したタンパク質(SDS-PAGE分析又はN-末端配列から決定)を、PBSで平衡化
した 1-mlのNi-キレートカラムに加える。全てのものを回収する。 添加からの流出物を後の分析用に貯蔵する。カラムを3 CVのPBSを加えて溶出し
、0.5 mlのフラクションを回収する。カラムを0.5 Mイミダゾールの2 CVで洗浄し
て清潔にし、フラクションを分析用に貯蔵する。 全てのフラクションをSDS-PAGE で試験し、IL5を含むフラクションを貯留して
PBSを基準として用いてA280を測定する。最後に、タンパク質を1 mg/mlの濃度に
達するまでVivaspin濃縮装置を用いて濃縮する。 Hisタグの除去は小規模の実験（0.1〜1 mg）で行われ、大規模には行われてい
ない。タグの除去には、遮断及び改変されていないN-末端が必要なことに留意さ
れたい。
した 1-mlのNi-キレートカラムに加える。全てのものを回収する。 添加からの流出物を後の分析用に貯蔵する。カラムを3 CVのPBSを加えて溶出し
、0.5 mlのフラクションを回収する。カラムを0.5 Mイミダゾールの2 CVで洗浄し
て清潔にし、フラクションを分析用に貯蔵する。 全てのフラクションをSDS-PAGE で試験し、IL5を含むフラクションを貯留して
PBSを基準として用いてA280を測定する。最後に、タンパク質を1 mg/mlの濃度に
達するまでVivaspin濃縮装置を用いて濃縮する。 Hisタグの除去は小規模の実験（0.1〜1 mg）で行われ、大規模には行われてい
ない。タグの除去には、遮断及び改変されていないN-末端が必要なことに留意さ
れたい。
【０１１４】 Hisタグ標識したタンパク質を2つの酵素、一度に2つのアミノ酸を除去するジ
ペプチジルアミノペプチターゼ及びグルタミン酸のピログルタミン酸への転化を
触媒するグルタミン酸シクロトランスフェラーゼとインキュベートする。この転
化は、ジペプチジルアミノペプチターゼによってさらに分解されるのを遮断する
。次いで消化混合物を、(Hisタグ標識した)酵素、カラムに結合する混入タンパク
質及び全く分解されてないか、もしくは部分的に分解されたタンパク質を保持し
ているはずであるキレートカラムに通す。脱タグタンパク質はカラムを通過し、
流出物中で回収される。ピログルタミン酸を除去する酵素を用いて2回消化した後
、タンパク質を再度キレート−カラムに通し、2番目の酵素を除去する。この最終
段階でタンパク質を再濃縮する必要があると予測される。 一般的な観察： UniHis-IL5wtのpIは9.5 で、タンパク質の最適pH値は6.5〜7.0であると思われ
る(完全に調査したわけではない)。濃縮中に、400 mM のNaCl濃度がタンパク質
を安定化させると考えられる。
ペプチジルアミノペプチターゼ及びグルタミン酸のピログルタミン酸への転化を
触媒するグルタミン酸シクロトランスフェラーゼとインキュベートする。この転
化は、ジペプチジルアミノペプチターゼによってさらに分解されるのを遮断する
。次いで消化混合物を、(Hisタグ標識した)酵素、カラムに結合する混入タンパク
質及び全く分解されてないか、もしくは部分的に分解されたタンパク質を保持し
ているはずであるキレートカラムに通す。脱タグタンパク質はカラムを通過し、
流出物中で回収される。ピログルタミン酸を除去する酵素を用いて2回消化した後
、タンパク質を再度キレート−カラムに通し、2番目の酵素を除去する。この最終
段階でタンパク質を再濃縮する必要があると予測される。 一般的な観察： UniHis-IL5wtのpIは9.5 で、タンパク質の最適pH値は6.5〜7.0であると思われ
る(完全に調査したわけではない)。濃縮中に、400 mM のNaCl濃度がタンパク質
を安定化させると考えられる。
【０１１５】実施例15 インビトロスクリーニング 一次的なインビトロスクリーニングは、酵素結合イムノソルベント検定法(ELI
SA)であろう：野生型IL5に対する競合的ELISA は、動物への導入前の修飾IL5構
築物における関連B-細胞エピトープの存在の推定量を示す。 従来のELISA検定法は、ワクチン注射した動物の血清中の自己抗体の力価を測
定するのに使用することができる。マウスのIL5と同様にヒトに対する抗体（単特
異性及びモノクローナルの両方）は、R&D Systems、614 McKinley Place NE、Mi
nneapolis、MN 55413、USAで市販されている。 生成物の生物学的活性及び/又は誘発された自己抗体の中和能力は、IL5バイオ
アッセイで試験できる。以前に報告されたそのようなバイオアッセイの例は：IL5
の誘発によるTF1細胞の増殖査定(ヒトIL5用)及びIL5の誘発によるBCL1細胞又はB
13 B細胞の増殖査定(マウスIL5用)(Callard & Gearing 1994, Dickasonら、1994
)である。 自家ワクチンの気道応答の効果も、インビトロアッセイで試験することができ
、この試験では、ワクチン注射したマウスから気管を取り除き、オーガンバス（
organ bath）中のフックにかける。ヒスタミン投与した後、気管の緊張(tension)
を測定する (van Oosterhoutら、1995)。
SA)であろう：野生型IL5に対する競合的ELISA は、動物への導入前の修飾IL5構
築物における関連B-細胞エピトープの存在の推定量を示す。 従来のELISA検定法は、ワクチン注射した動物の血清中の自己抗体の力価を測
定するのに使用することができる。マウスのIL5と同様にヒトに対する抗体（単特
異性及びモノクローナルの両方）は、R&D Systems、614 McKinley Place NE、Mi
nneapolis、MN 55413、USAで市販されている。 生成物の生物学的活性及び/又は誘発された自己抗体の中和能力は、IL5バイオ
アッセイで試験できる。以前に報告されたそのようなバイオアッセイの例は：IL5
の誘発によるTF1細胞の増殖査定(ヒトIL5用)及びIL5の誘発によるBCL1細胞又はB
13 B細胞の増殖査定(マウスIL5用)(Callard & Gearing 1994, Dickasonら、1994
)である。 自家ワクチンの気道応答の効果も、インビトロアッセイで試験することができ
、この試験では、ワクチン注射したマウスから気管を取り除き、オーガンバス（
organ bath）中のフックにかける。ヒスタミン投与した後、気管の緊張(tension)
を測定する (van Oosterhoutら、1995)。
【０１１６】 その結果として、組換えmIL5（及びmIL5 AutoVac）タンパク質サンプルの生物
学的活性を測定できるように、マウスIL5に対する細胞の生体活性アッセイが確
立されている。そのアッセイは、培養培地に加えたmIL5に応じたB細胞リンパ球
線BCL1の増殖能力に基づく。2つの異なるBCL1クローンがATCCから得られた：BCL1
クローン5B1b (ATCC CRL-1669)及びBCL1クローンCW13.20.3B3 (ATCC TIB-197)。 典型的なBCL1増殖実験で、細胞をマイクロタイタープレート中のウシ胎仔血清
(FCS)で捕捉した完全RPMI培地で培養し、マウスの IL5の希釈系とともにインキ
ュベートする。BCL1細胞の増殖は、トリチウム化チミジンの導入により測定する
。いくつかの最適化実験は、購入された組換えmIL5（R&D Systems）の連続希釈を
刺激のために用いて行った。種々のパラメータには、インキュベート間隔、3H-チ
ミジンパルス間隔、ウェル当たりで培養し細胞数、ウシ胎仔血清(FCS)濃度及び
加えたmIL5の濃度を含む。バックグラウンド（mIL5を全く加えないBCL1細胞）の
約3倍の最高増殖を示すBCL1細胞の用量-依存増加が認められた。
学的活性を測定できるように、マウスIL5に対する細胞の生体活性アッセイが確
立されている。そのアッセイは、培養培地に加えたmIL5に応じたB細胞リンパ球
線BCL1の増殖能力に基づく。2つの異なるBCL1クローンがATCCから得られた：BCL1
クローン5B1b (ATCC CRL-1669)及びBCL1クローンCW13.20.3B3 (ATCC TIB-197)。 典型的なBCL1増殖実験で、細胞をマイクロタイタープレート中のウシ胎仔血清
(FCS)で捕捉した完全RPMI培地で培養し、マウスの IL5の希釈系とともにインキ
ュベートする。BCL1細胞の増殖は、トリチウム化チミジンの導入により測定する
。いくつかの最適化実験は、購入された組換えmIL5（R&D Systems）の連続希釈を
刺激のために用いて行った。種々のパラメータには、インキュベート間隔、3H-チ
ミジンパルス間隔、ウェル当たりで培養し細胞数、ウシ胎仔血清(FCS)濃度及び
加えたmIL5の濃度を含む。バックグラウンド（mIL5を全く加えないBCL1細胞）の
約3倍の最高増殖を示すBCL1細胞の用量-依存増加が認められた。
【０１１７】 BCL1 アッセイは、Drosophila S2細胞から発現し、上記のように精製した以下
のサンプル：HIS-mIL5wt物質(E1320)、HIS-mIL5wt 物質(E1422)、HIS-mIL5.1物
質(E1396) 及び "S2-バックグラウンド-組織標本" (E0016)の生物学的活性を測
定するために用いた。1つのHIS-mIL5wt (E1320)組織標本に応じた増殖は"S2-バ
ックグラウンド-組織標本"に応ずる増殖よりも著しく高いが、mIL5.1変異体及び
1つの野生型組織標本(E1422) は生物学的に不活性として測定された。 進行中の作業には、抗mIL5によるBCL1の増殖の阻害が含まれ、抗mIL5 モノク
ローナル抗体TRFK5を最適化研究に使用する。これは、免疫化したマウス由来の抗
mIL5抗血清に関してmIL5の生物学的活性の阻害能力を測定するアッセイを用いる
ために行われる。
のサンプル：HIS-mIL5wt物質(E1320)、HIS-mIL5wt 物質(E1422)、HIS-mIL5.1物
質(E1396) 及び "S2-バックグラウンド-組織標本" (E0016)の生物学的活性を測
定するために用いた。1つのHIS-mIL5wt (E1320)組織標本に応じた増殖は"S2-バ
ックグラウンド-組織標本"に応ずる増殖よりも著しく高いが、mIL5.1変異体及び
1つの野生型組織標本(E1422) は生物学的に不活性として測定された。 進行中の作業には、抗mIL5によるBCL1の増殖の阻害が含まれ、抗mIL5 モノク
ローナル抗体TRFK5を最適化研究に使用する。これは、免疫化したマウス由来の抗
mIL5抗血清に関してmIL5の生物学的活性の阻害能力を測定するアッセイを用いる
ために行われる。
【０１１８】実施例16 インビボのモデル 自家ワクチンのインビボでの効果の測定用に、周知の喘息の動物モデルが存在
する。通常、化合物(アレルゲン/抗原)で動物を感作し、噴霧化化合物投与後、
体幹体積変動計を用いて気管支収縮(伝導状態)が測定される。BAL液体中の好酸球
細胞計数も、決定する。 抗IL5 mAbの効果を調べる幾つかの研究は、マウスで首尾よく行われている。IL
5がB-細胞成長因子として作用する事実を伝えているマウスモデルの使用に反し
て、マウスの抗体応答との干渉が可能になる。しかし、IL5ノックアウトマウス
を使用する研究で示されるように、細胞毒性T-細胞の発達だけでなくオバルブミ
ンに対してT-細胞依存性抗体反応は正常であった(Kopfら、1996)。マウスは、モ
ルモット又はサルと比較して最も実用的かつ経済的なモデルでもあるので、Hame
lmanら(1997)によって用いられるようなオバルブミンで感作した喘息/気管過敏
症のBal/cマウスモデルが使用されるであろう。 しかしながら、マウスモデルでB-細胞上のIL5の効果に問題があることが分か
った場合には、当該技術で公知の他の適当な動物モデルが使用されるであろう。
する。通常、化合物(アレルゲン/抗原)で動物を感作し、噴霧化化合物投与後、
体幹体積変動計を用いて気管支収縮(伝導状態)が測定される。BAL液体中の好酸球
細胞計数も、決定する。 抗IL5 mAbの効果を調べる幾つかの研究は、マウスで首尾よく行われている。IL
5がB-細胞成長因子として作用する事実を伝えているマウスモデルの使用に反し
て、マウスの抗体応答との干渉が可能になる。しかし、IL5ノックアウトマウス
を使用する研究で示されるように、細胞毒性T-細胞の発達だけでなくオバルブミ
ンに対してT-細胞依存性抗体反応は正常であった(Kopfら、1996)。マウスは、モ
ルモット又はサルと比較して最も実用的かつ経済的なモデルでもあるので、Hame
lmanら(1997)によって用いられるようなオバルブミンで感作した喘息/気管過敏
症のBal/cマウスモデルが使用されるであろう。 しかしながら、マウスモデルでB-細胞上のIL5の効果に問題があることが分か
った場合には、当該技術で公知の他の適当な動物モデルが使用されるであろう。
【０１１９】実施例17 マウスIL5及びその変異体をエンコードするDNA構築物の調製pcDNA3.1+中の変異体の構築： 野生型mIL5へのP2及びP30エピトープの挿入は、エピトープ配列を含む重複プ
ライマーを用いてSOE-PCRによって行った。リーダー配列(SEQ ID NO: 63)を含む
野生型mIL5遺伝子は、コンセンサスKozak配列を有するpcDNA3.1+にクローンし(
プラスミドp815とした)、PCR反応用の鋳型として使用した。その結果生じたフラ
グメントをNheI及び NotIで消化し、精製してp815にクローンし、PCR用の鋳型と
して使用した。
ライマーを用いてSOE-PCRによって行った。リーダー配列(SEQ ID NO: 63)を含む
野生型mIL5遺伝子は、コンセンサスKozak配列を有するpcDNA3.1+にクローンし(
プラスミドp815とした)、PCR反応用の鋳型として使用した。その結果生じたフラ
グメントをNheI及び NotIで消化し、精製してp815にクローンし、PCR用の鋳型と
して使用した。
【０１２０】BiP リーダー及びUNI- Hisタグを有するpTM Drosophilaベクターへの変異体のク ローニング： 野生型mIL5を、適切な制限部位を含み、さらにDrosophila Kozak様配列をエン
コードする配列、次いでDrosophila BiPリーダー配列、続いて成熟mIL5をエンコ
ードする配列の5'末端に融合させたUNI-HIS タグ(SEQ ID NO: 25)をエンコード
する配列を含むmIL5特異性プライマーを用いてPCRフラグメントを生ずることに
よってpMT Drosophila発現ベクター系（Invitrogen）にクローンした。野生型mI
L5のcDNA配列を鋳型として用いた。その結果生じたフラグメントをEcoRI及びNotI
で消化し、続いてpMT/V5-HisAベクター (Invitrogen)にクローンした。その結果
生じたプラスミド(p818)は、変異体を含むエピトープをpMTにクローンするため
に用いた。これらをSacI及びNotIを用いてpcDNA3.1+でつくられた変異体を消化し
てクローンし、生じたフラグメントをp818にクローニングした。変異体のpAC5へのクローニング： mIL5の野生型及び変異体を、EcoRI及びNotIでpMT中の変異体を消化し、その結
果生じたフラグメントをpAC5.1/V5-HisAベクター (Invitrogen) にクローニング
することによって、pAC5構成性 Drosophila発現ベクターにクローンした。
コードする配列、次いでDrosophila BiPリーダー配列、続いて成熟mIL5をエンコ
ードする配列の5'末端に融合させたUNI-HIS タグ(SEQ ID NO: 25)をエンコード
する配列を含むmIL5特異性プライマーを用いてPCRフラグメントを生ずることに
よってpMT Drosophila発現ベクター系（Invitrogen）にクローンした。野生型mI
L5のcDNA配列を鋳型として用いた。その結果生じたフラグメントをEcoRI及びNotI
で消化し、続いてpMT/V5-HisAベクター (Invitrogen)にクローンした。その結果
生じたプラスミド(p818)は、変異体を含むエピトープをpMTにクローンするため
に用いた。これらをSacI及びNotIを用いてpcDNA3.1+でつくられた変異体を消化し
てクローンし、生じたフラグメントをp818にクローニングした。変異体のpAC5へのクローニング： mIL5の野生型及び変異体を、EcoRI及びNotIでpMT中の変異体を消化し、その結
果生じたフラグメントをpAC5.1/V5-HisAベクター (Invitrogen) にクローニング
することによって、pAC5構成性 Drosophila発現ベクターにクローンした。
【０１２１】実施例18 ヒトIL5及びその変異体をエンコードするDNA 構築物の調製 5つのラインのプラスミドを、非修飾IL5及び9つのIL5変異体の全て又は幾つか
を含むように考慮する。ラインには以下が含まれる：1）ヒト細胞における発現
に適したpCIベクター中のDNAワクチン注射用ヒトIL5、2)ショウジョウバエにお
ける誘導性発現のためのpMT/V5/HISベクター中のBiPリーダー配列及び15 aa His
タグ（SEQ ID NO: 25, Horsholm, DenmarkのUNIZYMEから得られる。タグはここ
で"UNI"又は"UNI-His タグ"と呼ばれる）を有するヒトIL5、3) Hisタグを有さな
い以外は2と同様、4)マウスIL5を有する以外は3と同様及び5) バキュロウイルス
系での発現用ベクターpVL1393中のDAPIリーダー配列及び15 aa HISタグを有する
ヒトIL5。
を含むように考慮する。ラインには以下が含まれる：1）ヒト細胞における発現
に適したpCIベクター中のDNAワクチン注射用ヒトIL5、2)ショウジョウバエにお
ける誘導性発現のためのpMT/V5/HISベクター中のBiPリーダー配列及び15 aa His
タグ（SEQ ID NO: 25, Horsholm, DenmarkのUNIZYMEから得られる。タグはここ
で"UNI"又は"UNI-His タグ"と呼ばれる）を有するヒトIL5、3) Hisタグを有さな
い以外は2と同様、4)マウスIL5を有する以外は3と同様及び5) バキュロウイルス
系での発現用ベクターpVL1393中のDAPIリーダー配列及び15 aa HISタグを有する
ヒトIL5。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
【表４】
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
【表６】
【０１２７】実施例19 DNA 免疫化の研究DNA ワクチン注射実験用のKozak配列とmIL5wt、mIL5.1及びmIL5.5とをエンコー
ドするベクターの生成： 天然のリーダー配列(SEQ ID NO: 63)を含むmIL5wt、mIL5.1及びmIL5.5をエン
コードするDNAフラグメントをpcDNA3.1に挿入し、新しいプラスミドp521, 522及
びp523を得た。哺乳動物細胞中のcDNAの発現を促進するため、Kozakコンセンサ
ス配列を、PCR技術を用いてコード配列の上流に挿入した。 PCR 反応をp521, p52
2及びp523を鋳型及びmIL5リーダー開始コドンのすぐ上流のKozak配列をエンコー
ドするフォワードプライマーとして用いて行った。精製したPCR 生成物を、制限
エンドヌクレアーゼBamHI及びNotIを用いてpcDNA3.1+ベクターにクローンした。
その結果得たプラスミドp815、p816及びp817をそれぞれ、DNAシーケンシングに
よって確認した。DNAワクチン注射実験用に使用した他のプラスミドは全て、p521
プラスミドを出発物質として用いて構築した。
ドするベクターの生成： 天然のリーダー配列(SEQ ID NO: 63)を含むmIL5wt、mIL5.1及びmIL5.5をエン
コードするDNAフラグメントをpcDNA3.1に挿入し、新しいプラスミドp521, 522及
びp523を得た。哺乳動物細胞中のcDNAの発現を促進するため、Kozakコンセンサ
ス配列を、PCR技術を用いてコード配列の上流に挿入した。 PCR 反応をp521, p52
2及びp523を鋳型及びmIL5リーダー開始コドンのすぐ上流のKozak配列をエンコー
ドするフォワードプライマーとして用いて行った。精製したPCR 生成物を、制限
エンドヌクレアーゼBamHI及びNotIを用いてpcDNA3.1+ベクターにクローンした。
その結果得たプラスミドp815、p816及びp817をそれぞれ、DNAシーケンシングに
よって確認した。DNAワクチン注射実験用に使用した他のプラスミドは全て、p521
プラスミドを出発物質として用いて構築した。
【０１２８】Promega キットを用いるDNA ワクチン注射プラスミドのインビトロでの翻訳： 翻訳したタンパク質生成物のプラスミドDNAを生体外で生成するウサギ網赤血
球抽出物を用いる市販のキットを用いて、例えばオバルブミンcDNAをエンコード
するpcDNAプラスミドからのタンパク質の発現を調べることは、以前我々の研究
室で成功している。マウスIL5 のDNA ワクチン注射プラスミドを、標準の手順に
従ってキット試薬に加えた。しかし、発現したmIL5物質を放射能写真で検出する
幾つかの試みは失敗に終わったが、陽性の対照は作用した。COS細胞トランスフェ
クション及びDNAワクチン注射から得た結果により、遺伝子生成物が発現されて
いることは明らかなため、我々はこれらの技術問題をこれ以上調査しなかった。
球抽出物を用いる市販のキットを用いて、例えばオバルブミンcDNAをエンコード
するpcDNAプラスミドからのタンパク質の発現を調べることは、以前我々の研究
室で成功している。マウスIL5 のDNA ワクチン注射プラスミドを、標準の手順に
従ってキット試薬に加えた。しかし、発現したmIL5物質を放射能写真で検出する
幾つかの試みは失敗に終わったが、陽性の対照は作用した。COS細胞トランスフェ
クション及びDNAワクチン注射から得た結果により、遺伝子生成物が発現されて
いることは明らかなため、我々はこれらの技術問題をこれ以上調査しなかった。
【０１２９】発現レベルを決定するためのDNAワクチン注射プラスミドでのCOS細胞の過渡的ト ランスフェクション： DNAワクチン注射実験に用いられるプラスミドのトランスフェクション/発現効
率を調べるため、COS細胞を使用する過渡的トランスフェクションアッセイを確
立した。COS細胞をトリプシン処理し、T25培養フラスコ中の10%のFCSを補った DM
EM培地に培養した。細胞をDotapキット（Roche Diagnostics）を用いて2日目に
形質移入し、5日目に回収した。培養上清、全ての細胞溶解物及び膜がリッチな
調製物を、抗mIL5反応性発現生成物を検出するためウェスタンブロッティング法
で試験した。細胞調製物中の抗mIL5反応性生成物はSDS-PAGEで21〜28 kDの2〜3つ
の分離バンドとして確実に移動したが、標準として用いたmIL5モノマー（バキュ
ロウイルスで発現される、R&D Systems）のMWはわずか15〜18 kDである。非変性
環境を用いると、21〜28kDの物質がダイマーを形成するので、物質はおそらくい
くつかの異なったグリコシル化形態のmIL5であると考えられる。DNA ワクチン注
射の結果は（以下参照）、この結論を明確に裏付けている。
率を調べるため、COS細胞を使用する過渡的トランスフェクションアッセイを確
立した。COS細胞をトリプシン処理し、T25培養フラスコ中の10%のFCSを補った DM
EM培地に培養した。細胞をDotapキット（Roche Diagnostics）を用いて2日目に
形質移入し、5日目に回収した。培養上清、全ての細胞溶解物及び膜がリッチな
調製物を、抗mIL5反応性発現生成物を検出するためウェスタンブロッティング法
で試験した。細胞調製物中の抗mIL5反応性生成物はSDS-PAGEで21〜28 kDの2〜3つ
の分離バンドとして確実に移動したが、標準として用いたmIL5モノマー（バキュ
ロウイルスで発現される、R&D Systems）のMWはわずか15〜18 kDである。非変性
環境を用いると、21〜28kDの物質がダイマーを形成するので、物質はおそらくい
くつかの異なったグリコシル化形態のmIL5であると考えられる。DNA ワクチン注
射の結果は（以下参照）、この結論を明確に裏付けている。
【０１３０】マウスIL5 AutoVac構築物を用いるマウスの DNA ワクチン注射： DNAワクチン注射の研究は、マウスIL5に特異的な抗体応答がマウスの8つの異
なるIL5突然変異体をエンコードする裸のプラスミドDNAでマウスを免疫化するこ
とによって誘発され得るかどうか調べるために行った。IL5はB細胞の分化で役割
を果たすことが以前に報告されているため、抗mIL5自己抗体がマウス中で生じ、
mIL5に対するB細胞の耐性が破壊され得ることを立証することが必要である。 DNAワクチン注射実験の一般的な設定でC3H/Hen マウス (H-2k)又はBalb/cA マ
ウス (H-2d)のどちらかを使用し、6〜8週齢のマウスを5匹ずつのグループに分け
た。0、14、28、42、62及び76日目に、ヒプノルム/ドルミカム(hypnorm/dormicu
m)を皮下で用いてマウスに麻酔をし、オバルブミン(対照)、mIL5wt(野生型)又は
試験されるべきmIL5変異体をエンコードする発現プラスミドを注入した。 DNA物
質をendofree GigaPrepキット(Qiagen)を用いて生成し、0.15 MのNaCl又は0.1％
のブピバカインを含む0.15 MのNaCl中1μg/mlで溶解した。100μlの物質を、2つ
の注射部位に分けて各マウスの腰にi.d.で注射した。予備採血を2日前に行い、試
験採血を3、5、8及び11週目で行った。血清を遠心分離によって単離し、精製した
オバルブミン及びmIL5タンパク質に対する反応性についてELISAで試験するまで-
20℃で貯蔵した。
なるIL5突然変異体をエンコードする裸のプラスミドDNAでマウスを免疫化するこ
とによって誘発され得るかどうか調べるために行った。IL5はB細胞の分化で役割
を果たすことが以前に報告されているため、抗mIL5自己抗体がマウス中で生じ、
mIL5に対するB細胞の耐性が破壊され得ることを立証することが必要である。 DNAワクチン注射実験の一般的な設定でC3H/Hen マウス (H-2k)又はBalb/cA マ
ウス (H-2d)のどちらかを使用し、6〜8週齢のマウスを5匹ずつのグループに分け
た。0、14、28、42、62及び76日目に、ヒプノルム/ドルミカム(hypnorm/dormicu
m)を皮下で用いてマウスに麻酔をし、オバルブミン(対照)、mIL5wt(野生型)又は
試験されるべきmIL5変異体をエンコードする発現プラスミドを注入した。 DNA物
質をendofree GigaPrepキット(Qiagen)を用いて生成し、0.15 MのNaCl又は0.1％
のブピバカインを含む0.15 MのNaCl中1μg/mlで溶解した。100μlの物質を、2つ
の注射部位に分けて各マウスの腰にi.d.で注射した。予備採血を2日前に行い、試
験採血を3、5、8及び11週目で行った。血清を遠心分離によって単離し、精製した
オバルブミン及びmIL5タンパク質に対する反応性についてELISAで試験するまで-
20℃で貯蔵した。
【０１３１】 DNAワクチン注射実験の代表的な結果を、図4に示す。上記の一般的な設定によ
り、オバルブミン対照プラスミド、プラスミドをエンコードするmIL5wt又はmIL5
AutoVac変異体mIL5.1あるいはmIL5.5.をエンコードするプラスミドで40匹の Ba
lb/cAマウスを免疫化した。この実験では、オバルブミンをエンコードするプラ
スミドで免疫化した9匹のマウスのうち9匹が抗オバルブミン抗体を形成したが、
抗-オバルブミン応答は、mIL5野生型又はmIL5 変異体をエンコードするDNAを受
けたマウスで誘発されなかった。mIL5wtをエンコードするプラスミドの注射では
抗mIL5応答は生じなかったが、mIL5に対するB細胞の耐性は、mIL5.1プラスミド
で免疫化した10匹のマウスのうち4匹中で破壊され、mIL5.5をエンコードするプ
ラスミドDNAで免疫化した9匹のマウスのうち7匹で破壊された。
り、オバルブミン対照プラスミド、プラスミドをエンコードするmIL5wt又はmIL5
AutoVac変異体mIL5.1あるいはmIL5.5.をエンコードするプラスミドで40匹の Ba
lb/cAマウスを免疫化した。この実験では、オバルブミンをエンコードするプラ
スミドで免疫化した9匹のマウスのうち9匹が抗オバルブミン抗体を形成したが、
抗-オバルブミン応答は、mIL5野生型又はmIL5 変異体をエンコードするDNAを受
けたマウスで誘発されなかった。mIL5wtをエンコードするプラスミドの注射では
抗mIL5応答は生じなかったが、mIL5に対するB細胞の耐性は、mIL5.1プラスミド
で免疫化した10匹のマウスのうち4匹中で破壊され、mIL5.5をエンコードするプ
ラスミドDNAで免疫化した9匹のマウスのうち7匹で破壊された。
【０１３２】 DNA ワクチン注射実験の全シリーズの主な結果を、下記の表に要約する。免疫
化群内の応答動物数は、種々のmIL5 AutoVac構築物間で相違し、マウスの系統に
よって決まる。明らかに、mIL5.2 AutoVac構築物は他の変異体よりも優れており
、100％の浸透度で両系統のマウスに抗mIL5抗体応答を誘発し得る。このプラスミ
ド(p820)、COSトランスフェクションアッセイで最も高い発現レベルも生じた。 強調すべきもう１つの実施例は、免疫原としてmIL5.4をエンコードするプラス
ミドDNAを用いる場合に見られる明らかなMHC制限である。唯一10匹中1匹のC3H/H
enマウスが DNA ワクチンに応答するのに対して、10匹中9匹のBalb/cAマウスが
応答動物である。 反対の現象（ほとんど表明されていないが）はmIL5.6構築物
に見られる。しかしながら、mIL5.2 DNAワクチンは、乱交雑な免疫原性であると
思われる。
化群内の応答動物数は、種々のmIL5 AutoVac構築物間で相違し、マウスの系統に
よって決まる。明らかに、mIL5.2 AutoVac構築物は他の変異体よりも優れており
、100％の浸透度で両系統のマウスに抗mIL5抗体応答を誘発し得る。このプラスミ
ド(p820)、COSトランスフェクションアッセイで最も高い発現レベルも生じた。 強調すべきもう１つの実施例は、免疫原としてmIL5.4をエンコードするプラス
ミドDNAを用いる場合に見られる明らかなMHC制限である。唯一10匹中1匹のC3H/H
enマウスが DNA ワクチンに応答するのに対して、10匹中9匹のBalb/cAマウスが
応答動物である。 反対の現象（ほとんど表明されていないが）はmIL5.6構築物
に見られる。しかしながら、mIL5.2 DNAワクチンは、乱交雑な免疫原性であると
思われる。
【０１３３】
【表７】
【０１３４】 280匹のマウスのDNAワクチン注射の結果の要約。実験中、DNAワクチン注射の
影響には関係ない理由で、6匹のマウスが死んだ。応答動物の数（高いか又は中間
の抗mIL5力価を有する）は、各免疫化群内のマウスの総数に対して示す。*)採血
は55日目に行った。他の全ての採血は77日目に行った。 言及すべき他の特色は、外来TヘルパーエピトープをmIL5ループ1に挿入したmI
L5変異体は、Tヘルパーエピトープをループ3に挿入した変異体よりも強いDNAワ
クチン注射免疫原になるという傾向である。これは、比較的高い発現レベルによ
るものであろう。ループ2変異体だけ試験したところ、mIL5.4-pcDNAは上記のよ
うにBalb/cA 系で唯一強い免疫原である。
影響には関係ない理由で、6匹のマウスが死んだ。応答動物の数（高いか又は中間
の抗mIL5力価を有する）は、各免疫化群内のマウスの総数に対して示す。*)採血
は55日目に行った。他の全ての採血は77日目に行った。 言及すべき他の特色は、外来TヘルパーエピトープをmIL5ループ1に挿入したmI
L5変異体は、Tヘルパーエピトープをループ3に挿入した変異体よりも強いDNAワ
クチン注射免疫原になるという傾向である。これは、比較的高い発現レベルによ
るものであろう。ループ2変異体だけ試験したところ、mIL5.4-pcDNAは上記のよ
うにBalb/cA 系で唯一強い免疫原である。
【０１３５】DNA ワクチン注射によって誘発された抗体応答のさらなる特徴付け： ELISA 実験は、挿入したTヘルパーエピトープに特異的な抗体が抗mIL5陽性の
マウスで検出され得るかどうかを測定するために行った。各免疫群について抗mIL
5陽性マウスからの血清を貯留し、AquaBindマイクロタイタープレートで固定化
したP2又はP30のペプチドに対する反応を試験した。マウスの両系統でmIL5.2に
対するDNAワクチン注射によって誘発される抗血清は、挿入したP30に対する反応
を明らかに含んでいるが、他の抗血清でP2又はP30に反応するものは1つもなかっ
た。これは、より高い抗体力価及びmIL5.2 DNAワクチン注射構築物で通常観察さ
れる浸透度におそらく関係する。このELISA設定を用いて、当然にmIL5.1に対し
て誘発された抗血清中の抗P2反応性を検出することができた。
マウスで検出され得るかどうかを測定するために行った。各免疫群について抗mIL
5陽性マウスからの血清を貯留し、AquaBindマイクロタイタープレートで固定化
したP2又はP30のペプチドに対する反応を試験した。マウスの両系統でmIL5.2に
対するDNAワクチン注射によって誘発される抗血清は、挿入したP30に対する反応
を明らかに含んでいるが、他の抗血清でP2又はP30に反応するものは1つもなかっ
た。これは、より高い抗体力価及びmIL5.2 DNAワクチン注射構築物で通常観察さ
れる浸透度におそらく関係する。このELISA設定を用いて、当然にmIL5.1に対し
て誘発された抗血清中の抗P2反応性を検出することができた。
【０１３６】 また、DNA ワクチン注射したマウス由来の陽性の抗mIL5抗血清のプールも、可
溶性で天然のマウスIL5と、ともに中和抗体であるモノクローナル抗体TRFK4又は
TRFK5との相互作用を阻害する能力について競合ELISA で試験した。抗mIL5抗血
清プールの希釈系を、可溶性で天然のmIL5でプレインキュベーションし、捕捉(c
atching)抗体TRFK5で被覆したELISAプレートにサンプルを加えた。次に、マウス
の結合IL5(抗血清で吸収されなかった)をビオチン化TRFK4の層、次いでワサビペ
ルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用いて明視化した。DNAワクチン注射
によって誘発された抗mIL5陽性抗血清が、全て可溶性mIL5とTRFK4又はTRFK5との
相互作用を阻害できるとは限らない。最も高いTRFK4/5阻害能を有する抗血清は、
mIL5.2をエンコードするDNAで免疫化したC3H/Hen マウス由来であった。阻害に
ついて認められた相違が力価の相違の直接的尺度であるか、又は異なる抗血清の
優れた特異性に関係しているかどうかは、試験されていない。おそらく、それは
これらの2つの因子の組み合わせであると思われる。
溶性で天然のマウスIL5と、ともに中和抗体であるモノクローナル抗体TRFK4又は
TRFK5との相互作用を阻害する能力について競合ELISA で試験した。抗mIL5抗血
清プールの希釈系を、可溶性で天然のmIL5でプレインキュベーションし、捕捉(c
atching)抗体TRFK5で被覆したELISAプレートにサンプルを加えた。次に、マウス
の結合IL5(抗血清で吸収されなかった)をビオチン化TRFK4の層、次いでワサビペ
ルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用いて明視化した。DNAワクチン注射
によって誘発された抗mIL5陽性抗血清が、全て可溶性mIL5とTRFK4又はTRFK5との
相互作用を阻害できるとは限らない。最も高いTRFK4/5阻害能を有する抗血清は、
mIL5.2をエンコードするDNAで免疫化したC3H/Hen マウス由来であった。阻害に
ついて認められた相違が力価の相違の直接的尺度であるか、又は異なる抗血清の
優れた特異性に関係しているかどうかは、試験されていない。おそらく、それは
これらの2つの因子の組み合わせであると思われる。
【０１３７】mIL5 AutoVac DNA免疫化マウス中の好酸球増加症の動物モデル： DNAワクチン注射したマウス40匹を、好酸球増加症の動物モデルでの試験に選
んだ：mIL5wt DNA で免疫化した10匹の Balb/cA マウス、mIL5.2 DNA で免疫化
した10匹の Balb/cA マウス、mIL5wt DNAで免疫化した10匹の C3H/Henマウス及
びmIL5.2 DNAで免疫化した10匹の C3H/Henマウス。好酸球増加症を誘発するため
、オバルブミンを用いる感作/攻撃飼育規制をこれらの各マウスで実行した。週
に1回で3週間 Adjuphosと1：1に 混合した0.9 %の塩水中50μgのオバルブミン(O
VA)の皮下注射でマウスを感作した。最後のOVA感作から4日後に、1日おきで合計
3回0.9 %の塩水中12.5μgのOVAを鼻腔内でマウスに投与した。気管支肺胞洗浄液(
BALF)を、気管にカニューレを挿入し、1 mlのPBSで気道管腔を洗浄することによ
って最後の感作から1日後に回収した。
んだ：mIL5wt DNA で免疫化した10匹の Balb/cA マウス、mIL5.2 DNA で免疫化
した10匹の Balb/cA マウス、mIL5wt DNAで免疫化した10匹の C3H/Henマウス及
びmIL5.2 DNAで免疫化した10匹の C3H/Henマウス。好酸球増加症を誘発するため
、オバルブミンを用いる感作/攻撃飼育規制をこれらの各マウスで実行した。週
に1回で3週間 Adjuphosと1：1に 混合した0.9 %の塩水中50μgのオバルブミン(O
VA)の皮下注射でマウスを感作した。最後のOVA感作から4日後に、1日おきで合計
3回0.9 %の塩水中12.5μgのOVAを鼻腔内でマウスに投与した。気管支肺胞洗浄液(
BALF)を、気管にカニューレを挿入し、1 mlのPBSで気道管腔を洗浄することによ
って最後の感作から1日後に回収した。
【０１３８】 およそ30,000〜60,000のBALF細胞を、1,500 rpmで20分間スライドガラス上に
かけた。スライドを一晩乾燥させ、May-Grunwald染色(Sigma)で2.5分間染色し、
トリス緩衝食塩水で4分間洗浄し、ギムザ染色（ddH2Oで1：20；Sigma）で20〜30
分間染色し、ddH2Oで素早くすすいだ。染色したスライドガラスを一晩乾燥させ、
細胞の型を、光学顕微鏡観察法を用いて同定した。1つのスライドにつき約100〜2
00の細胞が計測され、1匹のマウスにつき3つのスライドが計測された。好酸球の
算定は、算出した100個の細胞当りの好酸球数として示した。mIL5.2DNAワクチン
注射C3H/Henマウスでの肺の好酸球増加症の誘発は、野生型mIL5wt DNAワクチン
注射した群と比較して有意にダウン-レギュレートした（mIL5.2 DNA：100個の細
胞当りの好酸球14.6±8.9；mIL5wt DNA：100個の細胞当りの好酸球51.1±9.9）
。しかし、Balb/cA系で、免疫化群間の好酸球計測には大きな相違がなかった（m
IL5.2 DNA：100個の細胞当りの好酸球23.3±6.8；mIL5wt DNA：100個の細胞当り
の好酸球27.7±9.3）。説明として、Balb/cAのマウスがモデルにわずかしか影響
されないということが考えられる。これは、BALF を回収する一週間前に、Balb/c
Aマウス由来血清の抗オバルブミン力価がC3H/Hen由来血清より低かったことを示
す抗オバルブミンELISAデータによって裏付けられる。Balb/cJサブ系は、OVA感
作/攻撃モデルに影響されやすいことが報告されている。
かけた。スライドを一晩乾燥させ、May-Grunwald染色(Sigma)で2.5分間染色し、
トリス緩衝食塩水で4分間洗浄し、ギムザ染色（ddH2Oで1：20；Sigma）で20〜30
分間染色し、ddH2Oで素早くすすいだ。染色したスライドガラスを一晩乾燥させ、
細胞の型を、光学顕微鏡観察法を用いて同定した。1つのスライドにつき約100〜2
00の細胞が計測され、1匹のマウスにつき3つのスライドが計測された。好酸球の
算定は、算出した100個の細胞当りの好酸球数として示した。mIL5.2DNAワクチン
注射C3H/Henマウスでの肺の好酸球増加症の誘発は、野生型mIL5wt DNAワクチン
注射した群と比較して有意にダウン-レギュレートした（mIL5.2 DNA：100個の細
胞当りの好酸球14.6±8.9；mIL5wt DNA：100個の細胞当りの好酸球51.1±9.9）
。しかし、Balb/cA系で、免疫化群間の好酸球計測には大きな相違がなかった（m
IL5.2 DNA：100個の細胞当りの好酸球23.3±6.8；mIL5wt DNA：100個の細胞当り
の好酸球27.7±9.3）。説明として、Balb/cAのマウスがモデルにわずかしか影響
されないということが考えられる。これは、BALF を回収する一週間前に、Balb/c
Aマウス由来血清の抗オバルブミン力価がC3H/Hen由来血清より低かったことを示
す抗オバルブミンELISAデータによって裏付けられる。Balb/cJサブ系は、OVA感
作/攻撃モデルに影響されやすいことが報告されている。
【０１３９】実施例20 タンパク質ワクチン注射の研究 Balb/c J マウスをマウスIL5(mIL5)タンパク質で免疫化し、処理したマウスの
肺に好酸球を誘発するオバルブミン鼻腔内モデルに付した。UniHis-mIL5及びUniH
is-mIL5.1のタンパク質は、いずれもR&D Systemsのsf9細胞からなるmIL-5と交差
反応する抗体を誘発した。好酸球増加症のモデルは、OVA対照群及びUniHis-mIL5.
1群で多数の好酸球を誘発し、一方PBS群及びUniHis-mIL5群の両方では、好酸球
数が減少した。この結果により、群を混合してもよいことが考えられた。
肺に好酸球を誘発するオバルブミン鼻腔内モデルに付した。UniHis-mIL5及びUniH
is-mIL5.1のタンパク質は、いずれもR&D Systemsのsf9細胞からなるmIL-5と交差
反応する抗体を誘発した。好酸球増加症のモデルは、OVA対照群及びUniHis-mIL5.
1群で多数の好酸球を誘発し、一方PBS群及びUniHis-mIL5群の両方では、好酸球
数が減少した。この結果により、群を混合してもよいことが考えられた。
【０１４０】 物質及び方法： UniHis-mIL-5 E1320 & E01397 UniHis-mIL-5.1 E01337 & E01396 免疫化： 6〜8週齢のメスのBalb/c J (M&B)マウスを、1）なし、完全フロイントアジュ
バント(CFA； Sigma)中の2）PBS、3）UniHis-mIL5又は4）UniHis-mIL-5.1のいず
れかで免疫化し、3週間間隔で不完全フロイントアジュバント(IFA; Sigma)中の
抗原を用いて3回ブースター注射した。血清を回収し、各ブースター注射から10日
後に ELISA で試験した。
バント(CFA； Sigma)中の2）PBS、3）UniHis-mIL5又は4）UniHis-mIL-5.1のいず
れかで免疫化し、3週間間隔で不完全フロイントアジュバント(IFA; Sigma)中の
抗原を用いて3回ブースター注射した。血清を回収し、各ブースター注射から10日
後に ELISA で試験した。
【０１４１】 ELISA：抗UniHis-mIL5 ELISA： 2又は3で免疫化してから32日後（採血1）及び54日後（採血2）それぞれに、血
清を得た。ポリスチレンマイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)を、精製HIS
-mIL5wt (0.1 μg/ウェル, E1320)で被覆した。ウェルに加えた希釈血清の反応
性を、ヤギ抗マウス二次抗体を用いて明視化した。フロイントアジュバント中の
PBSで免疫化したマウス由来の対照血清に関し、OD490測定値をテストサンプルの
OD490測定値から引いた。抗-mIL5 ELISA： 血清を75日目に得た（採血3）。ポリスチレンマイクロタイタープレート(Maxis
orp, Nunc)を、購入したmIL5(0.1 μg/ウェル, R&D cat. no. 405-ML)で被覆し
た。ウェルに加えた1：1000の希釈血清の反応性を、ヤギ抗マウス二次抗体を用い
て明視化した。TRFK5 (2 μg/ml)の反応性を、ウサギ抗ラット二次抗体を用いて
明視化した。
清を得た。ポリスチレンマイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)を、精製HIS
-mIL5wt (0.1 μg/ウェル, E1320)で被覆した。ウェルに加えた希釈血清の反応
性を、ヤギ抗マウス二次抗体を用いて明視化した。フロイントアジュバント中の
PBSで免疫化したマウス由来の対照血清に関し、OD490測定値をテストサンプルの
OD490測定値から引いた。抗-mIL5 ELISA： 血清を75日目に得た（採血3）。ポリスチレンマイクロタイタープレート(Maxis
orp, Nunc)を、購入したmIL5(0.1 μg/ウェル, R&D cat. no. 405-ML)で被覆し
た。ウェルに加えた1：1000の希釈血清の反応性を、ヤギ抗マウス二次抗体を用い
て明視化した。TRFK5 (2 μg/ml)の反応性を、ウサギ抗ラット二次抗体を用いて
明視化した。
【０１４２】競合ELISA： 抗血清の希釈物を可溶性IL5で1時間予めインキュベーションし、捕捉抗体TRFK
5で被覆したポリスチレンマイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)に加えた。
結合mIL5を、ビオチン化TRFK4及びHRP標識ヤギ抗マウス二次抗体を用いて明視化
した。抗-P2 ELISA： P2ペプチドに対する反応性について、HIS-mIL5wt、HIS-mIL5.1又はPBSで免疫
化したマウス由来の抗血清のプールをELISAで試験した。専用のマイクロタイター
プレート(Aquabind, M&E Biotech) を、0.5μg/ウェルの合成P2ペプチドで被覆
した。ウェルに加えた希釈血清の反応性を、HRP標識ヤギ抗マウス二次抗体(1:200
0, Dako)を用いて明視化した。
5で被覆したポリスチレンマイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)に加えた。
結合mIL5を、ビオチン化TRFK4及びHRP標識ヤギ抗マウス二次抗体を用いて明視化
した。抗-P2 ELISA： P2ペプチドに対する反応性について、HIS-mIL5wt、HIS-mIL5.1又はPBSで免疫
化したマウス由来の抗血清のプールをELISAで試験した。専用のマイクロタイター
プレート(Aquabind, M&E Biotech) を、0.5μg/ウェルの合成P2ペプチドで被覆
した。ウェルに加えた希釈血清の反応性を、HRP標識ヤギ抗マウス二次抗体(1:200
0, Dako)を用いて明視化した。
【０１４３】抗−UniHis ELISA： HISタグペプチド(UNIZYME)に対する反応性について、HIS-mIL5wt、HIS-mIL5.1
又はPBSで免疫化したマウス由来抗血清のプールをELISAで試験した。 専用のマイ
クロタイタープレート(AquaBind, M&E Biotech)を、0.5μg/ウェルの合成HIS タ
グペプチドで被覆した。ウェルに加えた希釈血清の反応性を、HRP標識ヤギ抗マウ
ス二次抗体(1:2000, Dako)を用いて明視化した。 抗-S2 バックグラウンドタンパク質ELISA： S2バックグラウンド調製物に対する反応性について、HIS-mIL5wt、HIS-mIL5.1
又はPBSで免疫化したマウス由来抗血清のプールをELISAで試験した。ポリスチレ
ンマイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)を、0.1μg/ウェルのS2バックグ
ラウンド調製物で被覆した。ウェルに加えた希釈血清の反応性を、HRP 標識ヤギ
抗マウス二次抗体(1:2000, Dako)を用いて明視化した。
又はPBSで免疫化したマウス由来抗血清のプールをELISAで試験した。 専用のマイ
クロタイタープレート(AquaBind, M&E Biotech)を、0.5μg/ウェルの合成HIS タ
グペプチドで被覆した。ウェルに加えた希釈血清の反応性を、HRP標識ヤギ抗マウ
ス二次抗体(1:2000, Dako)を用いて明視化した。 抗-S2 バックグラウンドタンパク質ELISA： S2バックグラウンド調製物に対する反応性について、HIS-mIL5wt、HIS-mIL5.1
又はPBSで免疫化したマウス由来抗血清のプールをELISAで試験した。ポリスチレ
ンマイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)を、0.1μg/ウェルのS2バックグ
ラウンド調製物で被覆した。ウェルに加えた希釈血清の反応性を、HRP 標識ヤギ
抗マウス二次抗体(1:2000, Dako)を用いて明視化した。
【０１４４】抗-BSA ELISA： BSA に対する反応性について、HIS-mIL5wt、HIS-mIL5.1又はPBSで免疫化した
マウス由来の抗血清のプールをELISAで試験した。ポリスチレンマイクロタイター
プレート(Maxisorp, Nunc)を、10μg/ウェルのBSA (Intergen) で被覆した。ウェ
ルに加えた希釈血清の反応性を、HRP標識ヤギ抗マウス二次抗体(1:2000, Dako)
を用いて可視化した。好酸球増加症のモデル： ミョウバンアジュバントとしてAdjuphosと1：1に混合した0.9% の塩水中50μg
のオバルブミン(OVA)の皮下注射で、Balb/c J のマウスを感作した。OVA 免疫化
を、週に1回4週間繰り返した。最後のOVA感作の1週間後、1日おきに合計3回0.9%
の塩水中 12.5μgのOVAでマウス を鼻腔内攻撃に付した。気管支肺胞洗浄液(BAL
F)を、気管にカニューレを挿入し、0.9%の塩水1 ml又はPBSで気道管腔を洗浄す
ることにより、最後の感作から1日後に回収した。BAL染色： およそ30,000〜60,000 のBALF 細胞を、1,500 rpmで20分間スライドにかけた
。スライドを一晩乾燥させ、May-Grunwald染色(Sigma)で2.5分間 染色し、TBS
で4分間洗浄して、ギムザ染色(ddH2Oで 1：20 ；Sigma)で20〜30分間染色し、dd
H2Oで簡単にすすいだ。染色したスライドを一晩乾燥させ、細胞の型を光学顕微
鏡を用いて同定した。1つのスライドにつき約100〜200個の細胞が計測され、１
匹のマウスにつき3つのスライドが計測された。
マウス由来の抗血清のプールをELISAで試験した。ポリスチレンマイクロタイター
プレート(Maxisorp, Nunc)を、10μg/ウェルのBSA (Intergen) で被覆した。ウェ
ルに加えた希釈血清の反応性を、HRP標識ヤギ抗マウス二次抗体(1:2000, Dako)
を用いて可視化した。好酸球増加症のモデル： ミョウバンアジュバントとしてAdjuphosと1：1に混合した0.9% の塩水中50μg
のオバルブミン(OVA)の皮下注射で、Balb/c J のマウスを感作した。OVA 免疫化
を、週に1回4週間繰り返した。最後のOVA感作の1週間後、1日おきに合計3回0.9%
の塩水中 12.5μgのOVAでマウス を鼻腔内攻撃に付した。気管支肺胞洗浄液(BAL
F)を、気管にカニューレを挿入し、0.9%の塩水1 ml又はPBSで気道管腔を洗浄す
ることにより、最後の感作から1日後に回収した。BAL染色： およそ30,000〜60,000 のBALF 細胞を、1,500 rpmで20分間スライドにかけた
。スライドを一晩乾燥させ、May-Grunwald染色(Sigma)で2.5分間 染色し、TBS
で4分間洗浄して、ギムザ染色(ddH2Oで 1：20 ；Sigma)で20〜30分間染色し、dd
H2Oで簡単にすすいだ。染色したスライドを一晩乾燥させ、細胞の型を光学顕微
鏡を用いて同定した。1つのスライドにつき約100〜200個の細胞が計測され、１
匹のマウスにつき3つのスライドが計測された。
【０１４５】 結果：抗−mIL5抗体の検出： 一連のELISAの実験は、マウスIL5に特異的な抗体応答がHIS-mIL5wt及びHIS-mI
L5.1タンパク質物質で免疫化したマウスで誘発されたかどうかを調べるために行
った。まず、HIS-mIL5wt物質で被覆したELISAプレート上で各マウスの抗血清の希
釈物を試験することによって、HIS-mIL5wt免疫化物質に対する抗体が誘発したか
どうかを決定した。全てのマウスが、純度約95%と見積もられるHIS-mIL5wt物質（
El320、Drosophila S2細胞から発現し精製した）に対して高力価の抗体応答を生
じたことは、採血によって既知であった。
L5.1タンパク質物質で免疫化したマウスで誘発されたかどうかを調べるために行
った。まず、HIS-mIL5wt物質で被覆したELISAプレート上で各マウスの抗血清の希
釈物を試験することによって、HIS-mIL5wt免疫化物質に対する抗体が誘発したか
どうかを決定した。全てのマウスが、純度約95%と見積もられるHIS-mIL5wt物質（
El320、Drosophila S2細胞から発現し精製した）に対して高力価の抗体応答を生
じたことは、採血によって既知であった。
【０１４６】 この結果は、抗血清がマウスIL5と交差反応することを十分に確証するもので
はない。この状況において、反応性は、Drosophila S2細胞、S2培地(例えばウシ
胎仔血清由来BSAを含む)、HISタグ及び変性mIL5 B細胞エピトープ由来の不純物
に対しても検出されるだろう。誘発された抗体が天然のマウスIL5に対する反応
性を含むことを立証するため、R&D systemsから購入したmIL5で被覆したELISAプ
レートで血清を試験した。この物質(R&D cat. no. 405-ML)は生物的に活性で、HI
Sタグを含まず、バキュロウイルスSf21系で発現し、また非常に純粋（97％）で
あり、担体タンパク質(BSA)なしに購入することができる。両方の免疫化群から
貯留した血清は、ELISAプレートで被覆した購入mIL5と反応したが、PBS免疫化し
たマウス由来の血清は反応しなかった。これは、4回目の免疫化から11日後に、75
日目に得た採血3の血清を試験した場合に示されたが、採血1及び2の血清も同様
の手順で購入したmIL5と反応する。BSA担体との交差反応からシグナルを除くため
、購入したmIL5物質の担体のない型及びBSAを含まないELISA緩衝液を用いて、採
血1及び2について実験を繰り返した。高い抗mIL5応答が、依然として見られる。
はない。この状況において、反応性は、Drosophila S2細胞、S2培地(例えばウシ
胎仔血清由来BSAを含む)、HISタグ及び変性mIL5 B細胞エピトープ由来の不純物
に対しても検出されるだろう。誘発された抗体が天然のマウスIL5に対する反応
性を含むことを立証するため、R&D systemsから購入したmIL5で被覆したELISAプ
レートで血清を試験した。この物質(R&D cat. no. 405-ML)は生物的に活性で、HI
Sタグを含まず、バキュロウイルスSf21系で発現し、また非常に純粋（97％）で
あり、担体タンパク質(BSA)なしに購入することができる。両方の免疫化群から
貯留した血清は、ELISAプレートで被覆した購入mIL5と反応したが、PBS免疫化し
たマウス由来の血清は反応しなかった。これは、4回目の免疫化から11日後に、75
日目に得た採血3の血清を試験した場合に示されたが、採血1及び2の血清も同様
の手順で購入したmIL5と反応する。BSA担体との交差反応からシグナルを除くため
、購入したmIL5物質の担体のない型及びBSAを含まないELISA緩衝液を用いて、採
血1及び2について実験を繰り返した。高い抗mIL5応答が、依然として見られる。
【０１４７】 誘発された抗血清が天然のmIL5と交差反応することをさらに確証するため、競
合ELISA を行った。このELISA は、種々の抗血清に関し、可溶性で天然のマウス
IL5及びともに中和抗体であるモノクローナル抗体TRFK4又はTRFKとの相互作用を
阻害する能力を試験する。抗血清プールの希釈系を可溶性で天然のmIL5と予めイ
ンキュベーションし、サンプルを捕捉抗体TRFK5で被覆したELISAプレートに加え
た。次いで、マウスの結合IL5（抗血清で吸収されなかった）をビオチン化TRFK4
と、続いてワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンの層を用いて明視化
した。DNAワクチン注射したマウス由来の抗mIL5陽性抗血清及び抗mIL5陰性抗血
清を、対照として含めた。HIS-mIL5wt及びHIS-mIL5.1で免疫化したマウス由来の
抗血清が、可溶性のmIL5とTRFK4又はTRFK5との相互作用を阻害し得ることが立証
された。 上記に基づけば、mIL5特異性自己抗体は、(試験したマウスの100％で)HIS-mIL
5wt又はHIS-mIL5.1タンパク質調製物のどちらかで免疫化したマウスで誘発され
ると結論される。すなわち、mIL5に対するB細胞の耐性は、野生型及びAutoVac双
方の組換えHISタグ標識型マウスIL5を用いて破壊され得る。B細胞の耐性が野生
型タンパク質に破壊されるという知見についてのもっともらしい説明は、これら
のマウスのHIS タグが“外来”免疫原性Tヘルパーエピトープとして機能すると
いうことである。あるいは、完全フロイントアジュバントの投与がmIL5に対する
B細胞の耐性を破壊しているのかもしれない。これらの仮説は、HISタグ標識して
いない抗原及び/又はあるいは、AdjuPhosのようなあまり強力でないアジュバン
ドを用いて試験することができる。
合ELISA を行った。このELISA は、種々の抗血清に関し、可溶性で天然のマウス
IL5及びともに中和抗体であるモノクローナル抗体TRFK4又はTRFKとの相互作用を
阻害する能力を試験する。抗血清プールの希釈系を可溶性で天然のmIL5と予めイ
ンキュベーションし、サンプルを捕捉抗体TRFK5で被覆したELISAプレートに加え
た。次いで、マウスの結合IL5（抗血清で吸収されなかった）をビオチン化TRFK4
と、続いてワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンの層を用いて明視化
した。DNAワクチン注射したマウス由来の抗mIL5陽性抗血清及び抗mIL5陰性抗血
清を、対照として含めた。HIS-mIL5wt及びHIS-mIL5.1で免疫化したマウス由来の
抗血清が、可溶性のmIL5とTRFK4又はTRFK5との相互作用を阻害し得ることが立証
された。 上記に基づけば、mIL5特異性自己抗体は、(試験したマウスの100％で)HIS-mIL
5wt又はHIS-mIL5.1タンパク質調製物のどちらかで免疫化したマウスで誘発され
ると結論される。すなわち、mIL5に対するB細胞の耐性は、野生型及びAutoVac双
方の組換えHISタグ標識型マウスIL5を用いて破壊され得る。B細胞の耐性が野生
型タンパク質に破壊されるという知見についてのもっともらしい説明は、これら
のマウスのHIS タグが“外来”免疫原性Tヘルパーエピトープとして機能すると
いうことである。あるいは、完全フロイントアジュバントの投与がmIL5に対する
B細胞の耐性を破壊しているのかもしれない。これらの仮説は、HISタグ標識して
いない抗原及び/又はあるいは、AdjuPhosのようなあまり強力でないアジュバン
ドを用いて試験することができる。
【０１４８】mIL5 AutoVacタンパク質で免疫化したマウスにおける抗体応答のさらなる特徴： ELISA実験は、挿入したTヘルパーエピトープに特異的な抗体がmIL5タンパク質
で免疫化したマウス由来血清に検出し得るかどうかを決定するために行った。各
免疫群について、抗血清（採血2）を貯留し、AquaBindマイクロタイタープレー
トに固定化した合成P2ペプチドに対する反応性について試験した。抗HIS-mIL5.1
抗血清は挿入したP2ペプチドに対する反応性を含むが、抗HIS-mIL5wtも抗PBS/CF
Aもペプチドに反応しなかった。 抗HIS-mILwt及び抗HIS-mIL5.1抗血清が、野生型及びAutoVac mIL5タンパク質
両方のN末端に融合している15-マーの HISタグ(UNIZYME HIS-タグ, SEQ ID NO:
25)に対する反応性を含むかどうかも試験した。ペプチドを合成し、共有結合の形
でAquaBindマイクロタイタープレートに固定して、各免疫群から貯留した抗血清
（採血1、2及び3）を結合ペプチドに対する反応について試験した。タンパク質で
免疫化した全てのマウスの血清は、合成HISタグペプチドと反応した。 抗HIS-mIL5wt及び抗HIS-mIL5.1抗血清がS2 Drosophila細胞又は培養培地の成
分と反応するかどうかも試験した。ELISAプレートをBSA（主な培地成分）又はS2
バックグラウンド調製物（Drosophila S2細胞を発現するHer2の培養上清をmIL5
精製手順に類似した精製方法に付すことによって生じる）で被覆した。これらの
分析結果により、抗BSA応答は非常に低い一方、S2バックグラウンド物質との反
応が明確であることが分かった。
で免疫化したマウス由来血清に検出し得るかどうかを決定するために行った。各
免疫群について、抗血清（採血2）を貯留し、AquaBindマイクロタイタープレー
トに固定化した合成P2ペプチドに対する反応性について試験した。抗HIS-mIL5.1
抗血清は挿入したP2ペプチドに対する反応性を含むが、抗HIS-mIL5wtも抗PBS/CF
Aもペプチドに反応しなかった。 抗HIS-mILwt及び抗HIS-mIL5.1抗血清が、野生型及びAutoVac mIL5タンパク質
両方のN末端に融合している15-マーの HISタグ(UNIZYME HIS-タグ, SEQ ID NO:
25)に対する反応性を含むかどうかも試験した。ペプチドを合成し、共有結合の形
でAquaBindマイクロタイタープレートに固定して、各免疫群から貯留した抗血清
（採血1、2及び3）を結合ペプチドに対する反応について試験した。タンパク質で
免疫化した全てのマウスの血清は、合成HISタグペプチドと反応した。 抗HIS-mIL5wt及び抗HIS-mIL5.1抗血清がS2 Drosophila細胞又は培養培地の成
分と反応するかどうかも試験した。ELISAプレートをBSA（主な培地成分）又はS2
バックグラウンド調製物（Drosophila S2細胞を発現するHer2の培養上清をmIL5
精製手順に類似した精製方法に付すことによって生じる）で被覆した。これらの
分析結果により、抗BSA応答は非常に低い一方、S2バックグラウンド物質との反
応が明確であることが分かった。
【０１４９】BALF中の好酸球の数： ワクチン注射したマウス中の抗IL5抗体がIL5のインビボ活性をダウン-レギュ
レートし得るかどうか立証するため、ワクチン注射したマウスの肺にIL5依存性
好酸球増加症を引き起こした。好酸球は、感作マウスに鼻腔からOVAを付して誘発
させた。多数の好酸球を対照OVAマウス及びUniHis-mIL5.1ワクチン注射マウスで
誘発したが、Uni-His-mIL5又はPBSでワクチン注射したマウスでは誘発しなかっ
た。対照群（OVA 及びPBS）と実験群（UniHis-mIL5及びUniHis-mIL5.1）間の好
酸球数の不一致、及び上記のDNAワクチン注射マウスからの陽性結果により、群
が交換(switch)された可能性が考えられた。しかし、この解釈を裏付ける交換を
立証することは試みなかった。タンパク質ワクチン注射は、この議論を明らかに
するため同じ手順で繰り返されるている。
レートし得るかどうか立証するため、ワクチン注射したマウスの肺にIL5依存性
好酸球増加症を引き起こした。好酸球は、感作マウスに鼻腔からOVAを付して誘発
させた。多数の好酸球を対照OVAマウス及びUniHis-mIL5.1ワクチン注射マウスで
誘発したが、Uni-His-mIL5又はPBSでワクチン注射したマウスでは誘発しなかっ
た。対照群（OVA 及びPBS）と実験群（UniHis-mIL5及びUniHis-mIL5.1）間の好
酸球数の不一致、及び上記のDNAワクチン注射マウスからの陽性結果により、群
が交換(switch)された可能性が考えられた。しかし、この解釈を裏付ける交換を
立証することは試みなかった。タンパク質ワクチン注射は、この議論を明らかに
するため同じ手順で繰り返されるている。
【０１５０】 考察： UniHis-mIL5及びUniHis-mIL5.1双方のタンパク質が野生型マウスIL5と交差反
応する抗体を誘発する能力は、明白に立証された。免疫耐性を回避するUniHis-m
IL5タンパク質の能力がUniHis-タグによるのか、又は他の幾つかの理由（例えば
、CFAアジュバント）によるのかどうかはまだ明確にされていない。唯一UniHis-
mIL5構築物が好酸球増加症のモデルでmIL5の内因的なインビボ活性をダウン-レ
ギュレートし得ることが見出されことは、驚くべきことであった。UniHis-mIL5.1
タンパク質ワクチン注射から生じた抗血清の好酸球増加症を阻害できない能力と
、DNAワクチン注射によって好酸球増加症を阻害できる能力は、この実験で技術
的な誤りが生じた可能性があることを示唆している。これは、好酸球増加症を阻
害するPBSワクチン注射の珍しい知見によっても裏付けられる。もっとも可能性
のある説明は、2つの群（PBS 及びUniHis-mIL5.1）が交換されたというものであ
ろう。
応する抗体を誘発する能力は、明白に立証された。免疫耐性を回避するUniHis-m
IL5タンパク質の能力がUniHis-タグによるのか、又は他の幾つかの理由（例えば
、CFAアジュバント）によるのかどうかはまだ明確にされていない。唯一UniHis-
mIL5構築物が好酸球増加症のモデルでmIL5の内因的なインビボ活性をダウン-レ
ギュレートし得ることが見出されことは、驚くべきことであった。UniHis-mIL5.1
タンパク質ワクチン注射から生じた抗血清の好酸球増加症を阻害できない能力と
、DNAワクチン注射によって好酸球増加症を阻害できる能力は、この実験で技術
的な誤りが生じた可能性があることを示唆している。これは、好酸球増加症を阻
害するPBSワクチン注射の珍しい知見によっても裏付けられる。もっとも可能性
のある説明は、2つの群（PBS 及びUniHis-mIL5.1）が交換されたというものであ
ろう。
【０１５１】 参考文献リスト Akutsu I.ら、1995, Immunol. Lett., 45: 109-116. Alexander A.G.ら、1994, Thorax, 49(12): 1231-1233. Azuma C.ら、1986, Nucleic Acid Res. 1986, 14(22): 9149-9158. Barata L.T.ら、1998, J. Allergy and Clin. Immunol, 101: 222-230. Baumann M.A.ら、1997, Methods, 11: 88-97 Callard R.E. & Gearing A.J.H., 'IL-5', Cytokine Facts Book 1994, Academi
c Press. Campbell H.D.ら、1988, Eur. J. Biochem., 174: 345-352. Chand N.ら、1992, Eur. J. Immunol., 211: 121-123. Coeffier E.ら、1994, Br. J. Pharmacol., 113(3): 749-56. Coffman R.L.ら、1989, Science, 245: 308-310. Corrigan C.J. & Kay A.B., 1996, Eur. Resp. J., 9, suppl. 22: 72s-78s. Cousins D.J.ら、1994, Am. J. Resp. Crit. Care. Med., 150: S50-S53. Danzig M.ら、1997, Allergy, 52(8): 787-794. Dickason R.R.ら、1994, Cytokine, 6(6): 647-656. Dickason R.R.ら、1996a, Nature, 379: 652-655. Dickason R.R.ら、1996b, J. Mol. Med., 74(9), 535-546 Egan R.W.ら、1995, Int. Arch. Allergy Immunol., 107: 321-322. Foster P.S.ら、1996, J. Exp. Med., 183: 195-201. Graber P.ら、1993, Eur. J. Biochem., 212(3): 751-755. Graber P.ら、1995, J. Biol. Chem., 270(26): 15762-15769. Hamelmann E.ら、1997, Am. J. Crit. Care Med., 155(3): 819-825. Huston M.M.ら、1996, J. Immunol., 156(4): 1392-1401. Karlen S.ら、1998, Int. Rev. Immunol., 16(3-4): 227-247. Kodama S.ら、1993, Eur. J. Biochem., 211(3): 903-908. Kopf M.ら、1996, Immunity, 4: 15-24. Kung T.T.ら、1995, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 13: 360-365. Lee N.A.ら、1997a, J. Immunol., 158: 1332-1344. Lee J.J.ら、1997b, J. Exp. Med. 1997b, 185(12): 2143-2156. Lopez A.F.ら、1992, Immunology Today, 13: 495-500. Mauser P.J.ら、1993, Am. Rev. Respir. Dis., 148: 1623-1627. Mauser P.J.ら、1995, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152(2): 467-472. Milburn M.V.ら、1993, Nature, 363: 172-176. Mori A.ら、1997, J. Allergy Clin. Immunol., 100(6) Pt 2: S56-64. Moxham J. & Costello J.F., 'Respiratory diseases', chapt. 14, Textbook o
f Medicine, Churchill Livingstone 1990, Ed. Souhami R.L. 及びMoxham J. Nagai H.ら、1993a, Ann. N.Y. Acad.Sci., 91-96. Nagai H.ら、1993b, Life Sciences, 53: PL 243-247. Ohashi Y.ら、1998, Scand. J. Immunol, 47: 596-602. Ortega D. & Busse W.W., 'Asthma: Pathogenesis and treatment', chapt. 28,
Allergy, W.B. Saunders Company 1997, Ed. Kaplan A.P. Proudfoot A.E.ら、1990, Biochem J., 270(2): 357-361. Proudfoot A.E.ら、1996, J. Protein Chem., 15(5): 491-499. Rose K.ら、1992, Biochem J, 286(Pt 3): 825-828. Sanderson C.J., 1992, Blood, 79(12): 3101-3109. Sher A.ら、1990, J. Immunol., 145: 3911-3916. Takatsu K.ら、Interleukin-5, Growth Factors and Cytokines in Health and
Disease 1997, vol.2A, JAI Press Inc., Ed. Leroith D. & Bondy C. Tanabe T.ら、1987, J. Biol. Chem., 262: 16580-16584. Tavernier J.ら、1989, DNA, 8(7), 491-501. Tominaga A.ら、1990, J. Immunol., 144(4): 1345-1352. Tominaga A.ら、1991, J. Exp. Med., 173(2): 429-437. Underwood D.C.ら、1996, Am. J. Resp. Crit. Care Med., 154: 850-857. van Oosterhout A.J.M.ら、1993, Am. Rev. Resp. Dis., 147: 548-552. van Oosterhout A.J.M.ら、1995, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 151: 177-
183. Villinger F.ら、1995, J. Immunol., 155: 3946-3954. Wang P. et al., 1998, J. Immunol., 160: 4427-4432. Yamaguchi Y.ら、1991, Blood, 78(10): 2542-2547
c Press. Campbell H.D.ら、1988, Eur. J. Biochem., 174: 345-352. Chand N.ら、1992, Eur. J. Immunol., 211: 121-123. Coeffier E.ら、1994, Br. J. Pharmacol., 113(3): 749-56. Coffman R.L.ら、1989, Science, 245: 308-310. Corrigan C.J. & Kay A.B., 1996, Eur. Resp. J., 9, suppl. 22: 72s-78s. Cousins D.J.ら、1994, Am. J. Resp. Crit. Care. Med., 150: S50-S53. Danzig M.ら、1997, Allergy, 52(8): 787-794. Dickason R.R.ら、1994, Cytokine, 6(6): 647-656. Dickason R.R.ら、1996a, Nature, 379: 652-655. Dickason R.R.ら、1996b, J. Mol. Med., 74(9), 535-546 Egan R.W.ら、1995, Int. Arch. Allergy Immunol., 107: 321-322. Foster P.S.ら、1996, J. Exp. Med., 183: 195-201. Graber P.ら、1993, Eur. J. Biochem., 212(3): 751-755. Graber P.ら、1995, J. Biol. Chem., 270(26): 15762-15769. Hamelmann E.ら、1997, Am. J. Crit. Care Med., 155(3): 819-825. Huston M.M.ら、1996, J. Immunol., 156(4): 1392-1401. Karlen S.ら、1998, Int. Rev. Immunol., 16(3-4): 227-247. Kodama S.ら、1993, Eur. J. Biochem., 211(3): 903-908. Kopf M.ら、1996, Immunity, 4: 15-24. Kung T.T.ら、1995, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 13: 360-365. Lee N.A.ら、1997a, J. Immunol., 158: 1332-1344. Lee J.J.ら、1997b, J. Exp. Med. 1997b, 185(12): 2143-2156. Lopez A.F.ら、1992, Immunology Today, 13: 495-500. Mauser P.J.ら、1993, Am. Rev. Respir. Dis., 148: 1623-1627. Mauser P.J.ら、1995, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152(2): 467-472. Milburn M.V.ら、1993, Nature, 363: 172-176. Mori A.ら、1997, J. Allergy Clin. Immunol., 100(6) Pt 2: S56-64. Moxham J. & Costello J.F., 'Respiratory diseases', chapt. 14, Textbook o
f Medicine, Churchill Livingstone 1990, Ed. Souhami R.L. 及びMoxham J. Nagai H.ら、1993a, Ann. N.Y. Acad.Sci., 91-96. Nagai H.ら、1993b, Life Sciences, 53: PL 243-247. Ohashi Y.ら、1998, Scand. J. Immunol, 47: 596-602. Ortega D. & Busse W.W., 'Asthma: Pathogenesis and treatment', chapt. 28,
Allergy, W.B. Saunders Company 1997, Ed. Kaplan A.P. Proudfoot A.E.ら、1990, Biochem J., 270(2): 357-361. Proudfoot A.E.ら、1996, J. Protein Chem., 15(5): 491-499. Rose K.ら、1992, Biochem J, 286(Pt 3): 825-828. Sanderson C.J., 1992, Blood, 79(12): 3101-3109. Sher A.ら、1990, J. Immunol., 145: 3911-3916. Takatsu K.ら、Interleukin-5, Growth Factors and Cytokines in Health and
Disease 1997, vol.2A, JAI Press Inc., Ed. Leroith D. & Bondy C. Tanabe T.ら、1987, J. Biol. Chem., 262: 16580-16584. Tavernier J.ら、1989, DNA, 8(7), 491-501. Tominaga A.ら、1990, J. Immunol., 144(4): 1345-1352. Tominaga A.ら、1991, J. Exp. Med., 173(2): 429-437. Underwood D.C.ら、1996, Am. J. Resp. Crit. Care Med., 154: 850-857. van Oosterhout A.J.M.ら、1993, Am. Rev. Resp. Dis., 147: 548-552. van Oosterhout A.J.M.ら、1995, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 151: 177-
183. Villinger F.ら、1995, J. Immunol., 155: 3946-3954. Wang P. et al., 1998, J. Immunol., 160: 4427-4432. Yamaguchi Y.ら、1991, Blood, 78(10): 2542-2547
【０１５２】
【配列表】
【図１】 成熟ヒトIL5のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 1)。アラインしたマ
ウス配列を含める(SEQ ID NO: 12)が、ヒト配列と異なる位置のみを示す。2つの
"*"は、マウスIL5の欠損しているN-末端残基を示す。N-グリコシル化位置を二重
下線で示し、ヒトIL5のO-グリコシル化トレオニンを斜体で示し、システインを
太字で示す。
ウス配列を含める(SEQ ID NO: 12)が、ヒト配列と異なる位置のみを示す。2つの
"*"は、マウスIL5の欠損しているN-末端残基を示す。N-グリコシル化位置を二重
下線で示し、ヒトIL5のO-グリコシル化トレオニンを斜体で示し、システインを
太字で示す。
【図２】 ヒトIL5のダイマー及びモノマー構造。A: hIL5のダイマー構造
。構造は5-112残基についてのみ得られている。これは、Thr3でO-グリコシル化
部位が含まれていないことを意味する。B: ヘリックスの割り当て(assignment)
を有するAと同じ構造(A-D 及びA'-D')。C: 明るい灰色で示すmIL5 とは異なるア
ミノ酸残基を有するモノマーhIL5。
。構造は5-112残基についてのみ得られている。これは、Thr3でO-グリコシル化
部位が含まれていないことを意味する。B: ヘリックスの割り当て(assignment)
を有するAと同じ構造(A-D 及びA'-D')。C: 明るい灰色で示すmIL5 とは異なるア
ミノ酸残基を有するモノマーhIL5。
【図３】適当な置換領域を示す、アラインした成熟ヒトIL5 (hIL5)及びマ
ウスIL5 (mIL5) アミノ酸配列(SEQ ID NOs: 1 及び12)。4つのα-ヘリックスA-D
は、連続した線のボックスで囲み、β-シートは二重下線、2つのシステインの位
置は"▼"で示している。2つの配列に同一の残基は"-" で、同一でない残基は"*"
で示す。ループ1はヘリックスAとBに及んでおり、ループ2はヘリックスBとCに及
んでおり、ループ3はループCとDに及んでいる。ペプチドを含む外来THエピトー
プで置換されるアミノ酸配列は、太字で示す。そのような配列は、残基が異なる
構築物で置換される残基と重複しているために、点線のボックスで囲んでいる。
10個の構築物(ヒト由来の5つ及びマウスIL5由来の5つ)のアミノ酸配列を、SEQ
ID NOs: 2-11及び13-22に示す。
ウスIL5 (mIL5) アミノ酸配列(SEQ ID NOs: 1 及び12)。4つのα-ヘリックスA-D
は、連続した線のボックスで囲み、β-シートは二重下線、2つのシステインの位
置は"▼"で示している。2つの配列に同一の残基は"-" で、同一でない残基は"*"
で示す。ループ1はヘリックスAとBに及んでおり、ループ2はヘリックスBとCに及
んでおり、ループ3はループCとDに及んでいる。ペプチドを含む外来THエピトー
プで置換されるアミノ酸配列は、太字で示す。そのような配列は、残基が異なる
構築物で置換される残基と重複しているために、点線のボックスで囲んでいる。
10個の構築物(ヒト由来の5つ及びマウスIL5由来の5つ)のアミノ酸配列を、SEQ
ID NOs: 2-11及び13-22に示す。
【図４】 2つのmIL5自己ワクチンDNAワクチンを試験するDNA免疫化のELI
SAの結果。オバルブミン、mIL5wt、mIL5.1 又はmIL5.5のいずれかをエンコード
する裸のプラスミドDNAを用いて、マウスをDNAワクチン化した。77日目に得られ
た血清を、オバルブミン及びマウスIL5に対する反応性について試験した。ポリ
スチレンマイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)を、オバルブミン(1μg/ウ
エル、Sigma)又は精製組換えマウスIL5 (0.1 μg/ウエル、E1320)でコートした
。ウエルに加えた希釈血清の反応性を、ヤギ抗-マウス二次抗体を用いて可視化
した。プレブリードの OD490示数を試験試料のOD490示数から控除し、得られた
値をバー(bar)として個々のマウスそれぞれに示した。プレブリードのOD490示数
(1:25希釈)は、0.025-0.034の範囲であった。十字架は、死亡した動物を示す。
SAの結果。オバルブミン、mIL5wt、mIL5.1 又はmIL5.5のいずれかをエンコード
する裸のプラスミドDNAを用いて、マウスをDNAワクチン化した。77日目に得られ
た血清を、オバルブミン及びマウスIL5に対する反応性について試験した。ポリ
スチレンマイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)を、オバルブミン(1μg/ウ
エル、Sigma)又は精製組換えマウスIL5 (0.1 μg/ウエル、E1320)でコートした
。ウエルに加えた希釈血清の反応性を、ヤギ抗-マウス二次抗体を用いて可視化
した。プレブリードの OD490示数を試験試料のOD490示数から控除し、得られた
値をバー(bar)として個々のマウスそれぞれに示した。プレブリードのOD490示数
(1:25希釈)は、0.025-0.034の範囲であった。十字架は、死亡した動物を示す。
【図５】 マウスIL5ベースの自己ワクチン構築物ベースの概略図。上
の図は、ヘリックスA-C、ループ1-3及び可変性C-末端領域を有するマウスの野生
型IL5モノマーを示す。残りの図は、種々の位置で破傷風トキソイドエピトープP
2及びP30が内部で置換された種々の自己ワクチン構築物を示す。詳細な構築物は
、実施例に詳述する。
の図は、ヘリックスA-C、ループ1-3及び可変性C-末端領域を有するマウスの野生
型IL5モノマーを示す。残りの図は、種々の位置で破傷風トキソイドエピトープP
2及びP30が内部で置換された種々の自己ワクチン構築物を示す。詳細な構築物は
、実施例に詳述する。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年４月２７日（２００１．４．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 11/06 ４Ｃ０８５ 37/08 37/08 ４Ｃ０８７ Ｃ０７Ｋ 14/54 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/54 ＺＮＡ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:19 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 1:07 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:42 (Ｃ１２Ｎ 1/21 1:32 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:32） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA26 CA02 DA05 EA02 EA03 EA06 GA11 HA03 HA17 4B063 QA18 QQ02 QQ79 QR59 QS25 4B064 AG03 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA15 AA26 AA36 AA46 AB01 CA24 CA45 4C076 AA19 AA53 BB01 BB11 BB15 BB16 BB22 BB29 CC06 DD22H EE37H EE41H FF36 FF68 GG16 4C084 AA13 CA53 CA56 DA17 MA66 NA14 ZA591 ZB131 4C085 AA03 AA13 AA38 BB11 BB17 CC08 CC21 DD22 DD23 EE06 FF03 FF11 FF13 4C087 AA01 BB65 BC29 BC33 BC35 BC64 BC83 MA66 NA14 ZA59 ZB13 4H045 AA10 AA20 AA30 CA40 DA02 DA75 EA22 EA31 FA74
Claims (68)
- 【請求項１】 - インターロイキン5 (IL5)ポリペプチド又はそのサブ配列
での動物の免疫化でIL5ポリペプチドに対する抗体産生を誘発するように処方さ
れた、少なくとも1つのIL5ポリペプチド又はそのサブ配列、及び/又は - IL5アミノ酸配列に少なくとも1つの修飾が導入されている少なくとも1つの I
L5類似体であって、この類似体での動物の免疫化により、結果としてIL5ポリペ
プチドに対する抗体産生が誘発される、少なくとも1つの IL5類似体 の免疫学的に有効な量を、ヒトを含む動物の免疫系に提示することからなる、動
物における IL5活性のインビボのダウン-レギュレーション方法。 - 【請求項２】 IL5アミノ酸配列の少なくとも1つの修飾を有するIL5類似体
を提示する請求項１による方法。 - 【請求項３】 修飾の結果として、IL5 B-細胞エピトープの実質的なフラク
ションが保存され、 - 少なくとも1つの外来Tヘルパーリンパ球エピトープ(THエピトープ)が導入さ
れ、及び/又は - 抗原提示細胞(APC)又はB-リンパ球に修飾分子を標的化する少なくとも1つの
第一部分が導入され、及び/又は - 免疫系を刺激する少なくとも1つの第二部分が導入され、及び/又は - 免疫系への修飾IL5ポリペプチドの提示を最適化する少なくとも1つの第三部
分が導入される請求項２による方法。 - 【請求項４】 修飾が、外来THエピトープ及び/又は第一及び/又は第二及び
/又は第三の部分のIL5もしくはそのサブ配列中の適当な化学基への共有又は非共
有的な結合による側基としての導入を含む請求項３による方法。 - 【請求項５】 修飾が、アミノ酸の置換及び/又は欠失及び/又は挿入及び/又
は付加を含む請求項３又は４による方法。 - 【請求項６】 修飾により、融合ポリペプチドが生じる請求項５による方法
。 - 【請求項７】 アミノ酸の置換及び/又は欠失及び/又は挿入及び/又は付加
の導入により、IL5の全体的な三次構造が実質的に保存される請求項５又は６に
よる方法。 - 【請求項８】 修飾が、少なくとも1つのIL5 B-細胞エピトープの複製及び/
又はハプテンの導入を含む請求項２〜７のいずれか１つによる方法。 - 【請求項９】 外来T-細胞エピトープが動物において免疫優勢である請求項
３〜８のいずれか１つによる方法。 - 【請求項１０】 外来T-細胞エピトープが乱交雑である請求項３〜９のいず
れか１つによる方法。 - 【請求項１１】 少なくとも1つの外来T-細胞エピトープが、天然の乱交雑T
-細胞エピトープ及び人為的なMHC-II結合ペプチド配列から選択される請求項１
０による方法。 - 【請求項１２】 天然のT-細胞エピトープが、P2又はP30のような破傷風ト
キソイドエピトープ、ジフテリアトキソイドエピトープ、インフルエンザウイル
ス血球凝集素エピトープ及びピー・ファルシパルムCSエピトープから選択される
請求項１１による方法。 - 【請求項１３】 第一部分が、B-リンパ球特異的表面抗原又はAPC特異的表
面抗原に実質的に特異的な結合パートナー、例えばB-リンパ球もしくはAPCに受
容体があるハプテン又は炭水化物である請求項３〜１２のいずれか１つによる方
法。 - 【請求項１４】 第二部分が、サイトカイン、ホルモン及び熱ショックタン
パク質から選択される請求項３〜１３のいずれか１つによる方法。 - 【請求項１５】 サイトカインが、インターフェロンγ（IFN-γ）、Flt3L
、インターロイキン1（IL-1）、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン
4（IL-4）、インターロイキン6（IL-6）、インターロイキン12（IL-12）、イン
ターロイキン13（IL-13）、インターロイキン15（IL-15）と顆粒球-マクロファ
ージコロニー刺激因子（GM-CSF）から選択されるか、もしくはその有効部分であ
り、熱ショックタンパク質が、HSP70、HSP90、HSC70、GRP94とカルレチクリン（
CRT）から選択されるか、もしくはそのいずれかの有効部分である請求項６によ
る方法。 - 【請求項１６】 第三部分が、パルミトイル基、ミリスチル基、ファルネシ
ル基、ゲラニル-ゲラニル基、GPI-アンカー及びN-アシルグリセリド基のような
脂質性である請求項３〜１５のいずれか１つによる方法。 - 【請求項１７】 IL5ポリペプチドが少なくとも1つのループ1〜3又はヘリッ
クスDに対するC-末端アミノ酸残基で修飾され、ループとヘリックスDはヒト及び
マウスIL5について図3に示すものに相当する前記請求項のいずれか１つによる方
法。 - 【請求項１８】 IL5ポリペプチドがヒトIL5ポリペプチドである請求項１７
による方法。 - 【請求項１９】 ヒトIL5ポリペプチドが、SEQ ID NO:1中の少なくとも1つ
のアミノ酸配列を、長さが同じかもしくは異なる少なくとも1つのアミノ酸配列
で置換し、それにより外来THエピトープを生じることで修飾され、置換されたア
ミノ酸残基は、残基87-90、残基88-91、残基32-43、残基33-43、残基59-64、残
基86-91及び残基110-113からなる群から選択される請求項１８による方法。 - 【請求項２０】 免疫系への提示が、抗原決定基の複数のコピーを提示し得
る担体分子に非共有結合したIL5ポリペプチド、そのサブ配列又は修飾IL5ポリペ
プチドの少なくとも2つのコピーを有することによって行われる、前記請求項の
いずれか１つによる方法。 - 【請求項２１】 IL5ポリペプチド、そのサブ配列又は修飾IL5ポリペプチド
が、自己抗原に対する自己耐性の破壊を容易にするアジュバントを用いて処方さ
れている前記請求項のいずれかによる方法。 - 【請求項２２】 アジュバントが、免疫標識化アジュバント；毒素、サイト
カイン及びマイコバクテリア誘導体などの免疫調節アジュバント；油製剤；ポリ
マー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫刺激複合体マトリクス(ISCOMマ
トリクス)；粒子；DDA；アルミニウムアジュバント；DNAアジュバント；γ-イヌ
リン；及びカプセル化アジュバントからなる群より選択される請求項２１による
方法。 - 【請求項２３】 有効量のIL5ポリペプチド又はIL5類似体が、非経口経路、
例えば表皮内、表皮下、真皮内、真皮下及び筋肉内経路；腹腔内経路；経口経路
；口腔経路；舌下経路；硬膜外経路；脊髄経路；肛門経路；及び頭蓋内経路から
選択される経路を介して動物に投与される前記請求項のいずれか１つによる方法
。 - 【請求項２４】 IL5ポリペプチド、そのサブ配列又はその類似体の有効量
が、0.5〜2,000μgである請求項２３による方法。 - 【請求項２５】 IL5ポリペプチド又は類似体について1年に少なくとも1回
の投与、例えば1年に少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくと
も6回及び少なくとも12回の投与が含まれる請求項２３又は２４による方法。 - 【請求項２６】 IL5ポリペプチド又はの類似体が、仮想リンパ節(VLN)装置
に含まれる請求項２３〜２５のいずれか１つによる方法。 - 【請求項２７】 免疫系への修飾IL5の提示が、動物細胞に修飾IL5をエンコ
ードする核酸を導入し、次いで導入された核酸について細胞によるインビボ発現
をさせることで行われる請求項１〜２０のいずれか１つによる方法。 - 【請求項２８】 導入された核酸が、裸のDNA、荷電又は非荷電脂質で製剤
化したDNA、リポソームで製剤化したDNA、ウイルスベクターに含めたDNA、トラ
ンスフェクション促進タンパク質又はポリペプチドで製剤化したDNA、標的タン
パク質又はポリペプチドで製剤化したDNA、カルシウム沈殿剤で製剤化したDNA、
不活性担体分子に結合したDNA、キチン又はキトサンでカプセル化したDNA、なら
びに請求項２２に定義するようなアジュバントで製剤化したDNAから選択される
請求項２７による方法。 - 【請求項２９】 核酸が、動脈内、静脈内又は請求項２３に定義する経路で
投与される請求項２７又は２８による方法。 - 【請求項３０】 核酸が、VLN装置に含まれる請求項２８又は２９による方
法。 - 【請求項３１】 核酸について1年に少なくとも1回の投与、例えば1年に少
なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも6回及び少なくとも12
回の投与が含まれる請求項２８〜３０のいずれか１つによる方法。 - 【請求項３２】 請求項１〜３１のいずれか１つの方法により、全身的な又
は病巣に局部的ないずれかの好酸球細胞数が例えば少なくとも20％の減少のよう
に著しく低下するほどにIL5活性をダウン-レギュレートすることからなる、好酸
球増加で特徴付けられる喘息又は他の慢性的なアレルギー性症状の治療及び/又
は予防及び/又は緩和方法。 - 【請求項３３】 結果として、類似体での動物の免疫化によりIL5ポリペプ
チドに対する抗体産生を誘発する修飾が導入された動物のIL5ポリペプチド由来I
L5類似体。 - 【請求項３４】 修飾が請求項１〜２２のいずれか１つに定義される請求項
３３によるIL5類似体。 - 【請求項３５】 IL5ポリペプチドがIL5ポリペプチドに対する動物の自己耐
性を破壊するように免疫学的に受容なアジュバントとともに処方され、さらに医
薬的及び免疫学的に受容な担体及び/又はビヒクルを含む、動物において免疫学
的に有効な量のオートロガスIL5ポリペプチドからなる免疫原性組成物。 - 【請求項３６】 さらに医薬的及び免疫学的に受容な担体及び/又はビヒク
ル及び任意のアジュバントを含む、請求項３３又は３４によるIL5類似体の免疫
学的に有効な量からなる免疫原性組成物。 - 【請求項３７】 アジュバントが、請求項２２のアジュバントからなる群か
ら選択される請求項３５又は３６による免疫原性組成物。 - 【請求項３８】 請求項３３又は３４によるIL5類似体をエンコードする核
酸フラグメント。 - 【請求項３９】 請求項３８による核酸フラグメントを有するベクター。
- 【請求項４０】 自律複製しうる請求項３９によるベクター。
- 【請求項４１】 プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ-染色体及びウイ
ルスからなる群から選択される請求項３９又は４０によるベクター。 - 【請求項４２】 5'→3'方向及び操作可能な連鎖において、請求項３８によ
る核酸フラグメントの発現を駆動するプロモーター、ポリペプチドフラグメント
の分泌又は膜への組み込みを可能にするリーダーペプチドをエンコードする任意
の核酸配列、請求項３８による核酸フラグメント及び任意の転写終結区からなる
、請求項３９〜４１のいずれか1つによるベクター。 - 【請求項４３】 宿主細胞に導入する場合に、宿主細胞ゲノムに組みこまれ
る請求項３９〜４２のいずれか１つによるベクター。 - 【請求項４４】 宿主細胞に導入する場合に、宿主細胞ゲノムに組み込むこ
とができない請求項３９〜４２のいずれか１つによるベクター。 - 【請求項４５】 プロモーターが、真核細胞及び/又は原核細胞で発現を駆
動する請求項３９〜４４のいずれか１つによるベクター。 - 【請求項４６】 請求項３９〜４５のいずれか１つのベクターを有する形質
転換細胞。 - 【請求項４７】 請求項３８による核酸フラグメントを複製しうる請求項４
６による形質転換細胞。 - 【請求項４８】 微生物が、細菌、酵母、原生動物、又は真菌、S2もしくは
SF細胞のような昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞から選択される多細胞生物
由来細胞から選択される請求項４７による形質転換細胞。 - 【請求項４９】 エシェリキア、バチルス、サルモネラ又はマイコバクテリ
ウム種の細菌である請求項４８による形質転換細胞。 - 【請求項５０】 大腸菌細胞、及びエム・ボビスBCGのような非病原性マイコ
バクテリウム細胞からなる群から選択される請求項５２による形質転換細胞。 - 【請求項５１】 請求項３８による核酸フラグメントを発現する請求項４６
〜５０のいずれか１つによる形質転換細胞。 - 【請求項５２】 請求項３３又は３４によるIL5類似体を分泌するか、その
表面で担持する請求項５５による形質転換細胞。 - 【請求項５３】 免疫系への提示が、IL5ポリペプチド又は類似体をエンコ
ードして発現する核酸フラグメントを有する非病原性微生物又はウイルスを投与
して行われる請求項１〜２０のいずれか１つによる方法。 - 【請求項５４】 ウイルスが、ワクシニアウイルスのような非毒性ポックス
ウイルスである請求項５３による方法。 - 【請求項５５】 微生物が、請求項４９又は５０に定義される細菌のような
細菌である請求項５４による方法。 - 【請求項５６】 非病原性の微生物又はウイルスが、動物に一回投与される
請求項５３〜５５のいずれか１つによる方法。 - 【請求項５７】 - 請求項３８による核酸フラグメント又は請求項３９〜
４５のいずれか１つによるベクター、及び - 医薬的及び免疫学的に受容な担体及び/又はビヒクル及び/又はアジュバント
からなる、IL5に対する抗体産生を誘発する組成物。 - 【請求項５８】 核酸フラグメントが請求項２８又は３０によって処方され
る請求項５７による組成物。 - 【請求項５９】 請求項３９〜４５のいずれか１つによるベクターを有し、
請求項３８による核酸フラグメントを発現し、請求項３３又は３４によるIL5類
似体を任意に分泌するか、その表面に担持する安定な細胞系。 - 【請求項６０】 請求項３８による核酸フラグメント又は請求項３９〜４５
のいずれか１つによるベクターで宿主細胞を形質転換することからなる、請求項
４６〜５２のいずれか１つによる細胞の調製方法。 - 【請求項６１】 - 動物種のIL5ポリペプチドのアミノ酸配列にアミノ酸が
付加され、挿入され、それから欠失されているか、又は置換されている、相互に
異なる修飾IL5ポリペプチドのセットをペプチド合成又は遺伝子工学技術の手段
により調製し、それにより、 動物種に外来のT-細胞エピトープからなるセット
でアミノ酸配列を生じるか、又は相互に異なる修飾IL5ポリペプチドのセットを
エンコードする核酸フラグメントのセットを調製し、 - 非修飾IL5に対する動物種による抗体産生を誘発する能力について該セットの
メンバーを試験し、かつ - 動物種における非修飾IL5に対する抗体産生を有意に誘発するセットのメンバ
ーを同定し、任意に単離するか、又は動物種において非修飾IL5に対する抗体産
生を有意に誘発する核酸フラグメントのセットのメンバーによってエンコードさ
れるポリペプチド発現生成物を同定し、任意に単離する ことからなる、非修飾IL5ポリペプチドが自己タンパク質の動物種で非修飾IL5に
対する抗体を誘発し得る修飾IL5ポリペプチドの同定方法。 - 【請求項６２】 - 動物種のIL5ポリペプチドのアミノ酸配列にアミノ酸が
付加され、挿入され、それから欠失されているか、又は置換されている、相互に
異なる修飾IL5ポリペプチドのセットをペプチド合成又は遺伝子工学技術の手段
により調製し、それにより、 動物に外来のT-細胞エピトープからなるセットで
アミノ酸配列を生じ、 - 非修飾IL5に対する動物種による抗体産生を誘発する能力について該セットの
メンバーを試験し、かつ - IL5と反応性の動物種における抗体産生を有意に誘発するセットのメンバーを
、医薬的及び免疫学的に受容な担体及び/又はビヒクルと混合し、任意に医薬的
及び免疫学的に受容なアジュバントの少なくとも1つと組合わせる ことからなる、非修飾IL5ポリペプチドが自己タンパク質の動物種で非修飾IL5に
対する抗体を誘発し得る少なくとも1つの修飾IL5ポリペプチドからなる免疫原性
組成物の調製方法。 - 【請求項６３】 セットのメンバーの調製が、各配列が請求項３８による核
酸配列である相互に異なる核酸配列の調製、適当な発現ベクターへの核酸配列の
挿入、ベクターでの適当な宿主細胞の形質転換と核酸配列の発現、任意にその後
の発現生成物の単離からなる請求項６１又は６２による方法。 - 【請求項６４】 核酸配列及び/又はベクターの調製が、PCRのような分子増
幅技術によって又は核酸合成によって達成される請求項６３による方法。 - 【請求項６５】 動物におけるIL5活性をダウン-レギュレートするためのア
ジュバントを含む免疫原性組成物を製造するためのIL5又はそのサブ配列の使用
。 - 【請求項６６】 喘息又は他の慢性的なアレルギー性症状の治療、予防又は
緩和のためのアジュバントを含む免疫原性組成物を製造するためのIL5又はその
サブ配列の使用。 - 【請求項６７】 動物においてIL5活性をダウン-レギュレートするためのア
ジュバントを任意に含む免疫原性組成物を製造するためのIL5類似体の使用。 - 【請求項６８】 喘息又は他の慢性的なアレルギー性症状の治療、予防又は
緩和のためのアジュバントを任意に含む免疫原性組成物を製造するためのIL5類
似体の使用。
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