KR102313053B1 - 키메라 주요 조직적합성 복합체(ｍｈｃ) 제ｉ 부류 분자를 발현하는 유전자전이 마우스 - Google Patents
키메라 주요 조직적합성 복합체(ｍｈｃ) 제ｉ 부류 분자를 발현하는 유전자전이 마우스 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드 및/또는 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물 뿐만 아니라, 이를 포함하는 배아, 세포 및 조직을 제공한다. 또한, 상기 유전적으로 변형된 동물을 생성하기 위한 작제물 및 이의 생성 방법이 제공된다. 상기 유전적으로 변형된 동물을 사용하여 사람 면역계의 다양한 양상을 연구하는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2013년 3월 11일자로 출원된 미국 출원 제13/793,812호에 대한 우선권의 이익을 청구하고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
본 발명의 분야
본 발명은 사람 또는 사람화된 조직적합성 복합체(MHC) 제I 부류 분자를 발현하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예를 들면, 마우스 또는 래트)에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 사람 또는 사람화된 MHC I 단백질(예를 들면, MHC I α쇄) 및/또는 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린을 발현하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물 뿐만 아니라, 이를 발현하는 배아, 조직 및 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 사람 또는 사람화된 MHC I 단백질(예를 들면, MHC I α쇄) 및/또는 β2 마이크로글로불린을 발현하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 사람화된 시험관내 세포성 면역계의 범주에서 또는 유전적으로 변형된 비-사람 동물에서 펩타이드를 동정하고 평가하는 방법 및 비-사람 동물, 예를 들면, 마우스 또는 래트의 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 사람 또는 사람화된 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린을 발현하도록 변형시키는 방법을 제공한다.
적응 면역반응(adaptive immune response)에서, 외래 항원들은 B 림프구상의 수용체 분자(예를 들면, 면역글로불린) 및 T 림프구상의 수용체 분자(예를 들면, T 세포 수용체 또는 TCR)에 의해 인식된다. 이들 외래 항원은 일반적으로 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자들로서 언급되는 특수화된 단백질들에 의해 펩타이드 단편들로서 세포의 표면 상에 제시된다. MHC 분자는 약 4Mb에 걸친 유전자들의 연결된 클러스터(cluster)로 발견되는 다수의 유전자좌에 의해 암호화된다. 마우스에서, MHC 유전자들은 17번 염색체 상에서 발견되며, 조직학적 이유로 조직적합성 2(H-2) 유전자로서 언급된다. 사람에서, 상기 유전자들은 6번 염색체 상에서 발견되며, 사람 백혈구 항원(HLA) 유전자라고 칭해진다. 마우스 및 사람에서의 상기 유전자좌는 다유전자성이고, 이들은 사람 및 뮤린 게놈에서 유사한 조직화를 나타내는 3가지의 고도로 다형성인 MHC 유전자 부류들(제I, 제II 및 제III 부류)을 포함한다(각각 도 2 및 도 3 참조).
MHC 유전자좌는 게놈 내에서 최대의 다형성(polymorphism)을 나타내며, 일부 유전자는 300개 초과의 대립유전자(예를 들면, 사람 HLA-DRβ 및 사람 HLA-B)로 나타내진다. 모든 제I 및 제II 부류 MHC 유전자들은 펩타이드 단편을 제시하지만, 각각의 유전자는 다형성을 반영하는 상이한 결합 특성을 갖는 단백질 및 대립유전자 변이체들을 발현한다. 어떠한 정해진 개체라도 면역반응 과정에서 B 및 T 세포에 대해 세포 표면 상에 제시될 수 있는 펩타이드 단편의 고유한 범위를 갖는다.
사람 및 마우스는 둘 다 제I 부류 MHC 유전자(도 2 및 도 3 참조)을 갖는다. 사람에서, 전통적인 제I 부류 유전자는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C로 명명되는 반면에, 마우스에서 이는 H-2K, H-2D 및 H-L이다. 제I 부류 분자는 2개의 쇄: 다형성 α-쇄(때때로 중쇄로 지칭됨) 및 일반적으로 다형성은 아닌, β2-마이크로글로불린이라 지칭되는 보다 작은 쇄(또한 경쇄로도 공지됨)로 이루어진다(도 1). 이들 2개의 쇄는 세포 표면에서 비-공유적 이종이량체를 형성한다. α-쇄는 3개의 도메인(α1, α2 및 α3)을 함유한다. α-쇄 유전자의 엑손 1은 리더 서열을 암호화하고, 엑손 2 및 3은 α1 및 α2 도메인을 암호화하고, 엑손 4는 α3 도메인을 암호화하고, 엑손 5는 막관통(transmembrane) 도메인을 암호화하고, 엑손 6 및 7은 세포질 테일을 암호화한다. α-쇄는 (Ig-유사 도메인과 유사한) α1 및 α2 도메인에 이어 β2-마이크로글로불린과 유사한 α3 도메인을 수반하는 펩타이드-결합 틈(cleft)을 형성한다.
β2 마이크로글로불린은 비당화된 12 kDa 단백질로서, 이의 기능 중의 하나는 MHC 제I 부류 α-쇄를 안정화시키는 것이다. α-쇄와는 달리, β2 마이크로글로불린은 막에 걸쳐있지 않는다. 사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌는 15번 염색체 상에 있으며, 마우스 유전자좌는 2번 염색체 상에 있다. β2 마이크로글로불린 유전자는 4개의 엑손 및 3개의 인트론으로 이루어져 있다. 순환형의 β2 마이크로글로불린은 혈청, 뇨 및 기타 체액 중에 존재하며, 따라서 비-공유적 MHC I-관련 β2 마이크로글로불린은 생리학적 조건 하에서 순환성 β2 마이크로글로불린과 교환될 수 있다.
제1 부류 MHC 분자는 종양 세포를 포함한 모든 유핵 세포 상에서 발현된다. 이들은 특히 다른 세포들 중에서 T 및 B 림프구, 대식구, 수지상 세포 및 호중구 상에서 발현되며, CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)에 대해 표면 상에 펩타이드 단편(통상 8 내지 10개 아미노산 길이)을 디스플레이하도록 작용한다. CTL은 자신의 막-결합 TCR에 의해 인식되는 MHC I-결합 펩타이드를 갖는 세포를 사멸시키록 특수화된다. 세포가 (예를 들면, 바이러스, 종양 또는 기타 비-자기 기원의) 정상적으로는 존재하지 않는 세포성 단백질로부터 유도되는 펩타이드를 나타내는 경우, 이러한 펩타이드는 CTL에 의해 인식되고, CTL은 활성화되어 이러한 펩타이드를 디스플레이하는 세포를 사멸시킬 것이다.
전형적으로, MHC I 분자의 상황에서 정상적인(즉, 자기) 단백질의 제시는 내성(tolerance) 기작으로 인해 CTL 활성화를 유도하지 않는다. 그러나, 일부 질환(예: 암, 자가면역 질환)에서, 자가-단백질로부터 유도되는 펩타이드가 면역계의 세포성 성분의 표적이 되고, 그 결과 이러한 펩타이드를 제시하는 세포가 파괴된다. 비록 세포성 면역 반응을 유도하는 일부 자가-유래의 항원(예: 다양한 암과 관련된 항원)을 인식하는데 있어 진전이 있었지만, MHC 제I 부류 분자를 통한 사람 CTL에 의해 인식되는 펩타이드의 동정을 개선하기 위해, 사람 세포성 면역계의 양상을 모방하는 생체내 및 시험관내 시스템 둘 다가 필요하다. 사람 세포성 면역계를 모방하는 시스템은 사람 치료제, 예를 들면, 백신 및 기타 생물제제를 개발하기 위해 질환-관련 항원을 동정하는데 사용될 수 있다. 사람 면역계의 상황에서 항원 인식을 평가하기 위한 시스템은 (예를 들면, 사람 질환을 연구하고 퇴치하는데 유용한) 치료학적으로 유용한 CTL 집단을 동정하는 것을 도울 수 있다. 또한, 이러한 시스템은 감염 및 외래 항원-보유 실체를 보다 효과적으로 퇴치하도록 사람 CTL 집단의 활성을 증진시키는 것을 도울 수 있다. 따라서, 사람 면역계의 기능을 모방하는 성분들을 디스플레이하는 면역계를 생성할 수 있는 생물학적 시스템(예: 유전적으로 조작된 동물)이 필요하다.
사람 MHC 제1 부류 단백질 및 이의 키메라와 연관되고 CD8+ T 세포에 결합하는 펩타이드를 생성하거나 동정하기 위한 생물학적 시스템이 제공된다. 세포성 면역 반응에 작용하는 사람 또는 사람화된 분자를 발현하는 비-사람 세포를 포함하는 비-사람 동물이 제공된다. 또한, 사람 또는 사람화된 MHC I 및 β2 마이크로글로불린 단백질을 암호화하는 사람화된 설치류 유전자좌가 제공된다. 또한, 사람 또는 사람화된 MHC 및 β2 마이크로글로불린 분자를 발현하는 사람화된 설치류 세포가 제공된다. 하나 이상의 사람 또는 사람화된 면역계 분자를 발현하는 사람화된 설치류 세포를 포함하는 생체내 및 시험관내 시스템이 제공된다.
게놈 내에 키메라 사람/비-사람(예: 사람/설치류, 예를 들면, 사람/마우스 또는 사람/래트) MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함하는 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예: 마우스 또는 래트)가 제공된다. 구체적으로는, 내인성 MHC I 유전자좌에, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물이 제공되며, 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함하고, 상기 동물은 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 발현한다. 하나의 양상에서, 상기 동물은 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌로부터 내인성 비-사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 발현하지 않는다. 본 발명의 하나의 양상에서, 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)은 키메라 사람/비-사람(예: 사람/설치류, 예를 들면, 사람/마우스 또는 사람/래트) MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2개 카피의 MHC I 유전자좌를 포함한다. 본 발명의 또 다른 양상에서, 동물은 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 1개 카피의 MHC I 유전자좌를 포함한다. 따라서, 동물은 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 MHC I 유전자좌에 대해 동형접합성(homozygous) 또는 이형접합성(heterozygous)일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 래트 또는 마우스)의 배선(germline)에 포함된다.
하나의 양상에서, 키메라 사람/비-사람 MHC I을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 조절 요소, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 사일런서(silencer) 등에 작동적으로 연결된다. 하나의 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 리더 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 비-사람 리더, 예를 들면, 내인성 비-사람 리더 서열을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2, 및 α3 도메인을 포함한다. 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-a 폴리펩타이드, 예를 들면, HLA-A2 폴리펩타이드, 예를 들면, HLA-A2.1 폴리펩타이드이다. 다른 실시형태에서, 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-B 폴리펩타이드, 예를 들면, HLA-B27 폴리펩타이드이다.
하나의 양상에서, 유전적으로 조작된 비-사람 동물은 설치류이다. 하나의 실시형태에서, 설치류는 마우스이다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 내인성 비-사람 유전자좌는 마우스 유전자좌, 예를 들면, 마우스 H-2K, H-2D 또는 H-2L 유전자좌이다. 하나의 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 내인성 비-사람 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 따라서, 비-사람 동물이 마우스인 실시형태에서, 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌는 H-2K 유전자좌(예: H-2Kb 유전자좌)일 수 있고, 내인성 비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 H-2K 폴리펩타이드일 수 있으며; 따라서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 H-2K 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 비-사람 동물이 마우스인 또 다른 실시형태에서, 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌는 H-2D 유전자좌일 수 있고, 내인성 비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 H-2D 폴리펩타이드일 수 있으며; 따라서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 H-2D 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 유사하게, 또 다른 실시형태에서, 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌는 마우스 H-2L 유전자좌일 수 있고, 내인성 비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 H-2L 폴리펩타이드일 수 있으며; 따라서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 H-2L 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함할 수 있다.
또한, 내인성 H-2K 유전자좌에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 본원에 제공되며, 여기서 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-A(예: HLA-A2) 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함하고 마우스 부분은 마우스 H-2K 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하고, 상기 마우스는 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 실시형태에서, 마우스는 내인성 H-2K 유전자좌로부터 마우스 H-2K 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 발현하지 않는다(예를 들면, 기능성 세포외 도메인을 발현하지 않는다). 하나의 양상에서, 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 마우스 조절 요소에 작동적으로 연결된다. 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 리더 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2, 및 α3 도메인을 포함할 수 있다. 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-A 폴리펩타이드, 예를 들면, HLA-A2.1 폴리펩타이드일 수 있다. 하나의 양상에서, 마우스 H-2K 유전자좌는 H-2Kb
유전자좌이다.
또한, 내인성 H-2D 유전자좌에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 본원에 제공되며, 여기서 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-B(예: HLA-B27) 폴리펩타이드를 포함하고, 마우스 부분은 마우스 H-2D(예: H-2D1) 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하고, 상기 마우스는 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 실시형태에서, 마우스는 내인성 H-2D 유전자좌로부터 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 세포외 도메인(예: 기능성 세포외 도메인)을 발현하지 않는다. 하나의 양상에서, 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드는 내인성 마우스 조절 요소에 작동적으로 연결된다. 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 리더 서열을 포함할 수 있다. 키메라 폴리펩타이드는 또한 마우스 리더 서열을 포함할 수 있다. 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 또한 사람 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함할 수 있다. 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-B 폴리펩타이드, 예를 들면, HLA-B27 폴리펩타이드일 수 있다. 하나의 양상에서, 마우스 H-2D 유전자좌는 H-2D1 유전자좌이다.
추가 실시형태에서, 본원에는 내인성 마우스 MHC I 유전좌자에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분이 HLA-A2, HLA-A3, HLA-B27 및 HLA-B7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사람 MHC I의 세포외 도메인을 포함하는 마우스가 제공된다. 다른 실시형태에서, 본원에는, 내인성 MHC I 유전자좌에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 1종 이상, 예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 마우스가 제공되고, 여기서 상기 키메라 폴리펩타이드(들)의 사람 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함하고, 상기 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드(들)의 마우스 부분은 마우스 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하고, 상기 마우스는 1종 이상, 예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드(들)을 발현한다. 따라서, 마우스는 MHC I 폴리펩타이드는 H-2D, H-2K 및 H-2L로부터 선택될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-A2/H-2K, HLA-A3/H-2K, HLA-B27/H-2D, HLA-B7/H-2D 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 1종, 2종 또는 3종의 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드(들)이 각각의 자매 염색체 17번 상에 암호화될 수 있고, 따라서 마우스 MHC I 유전자좌는 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 1종 이상, 예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 마우스는 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 2종의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 2종의 뉴클레오타이드 서열은 HLA-A2/H-2K 및 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 마우스는 키메라 HLA-A2/H-2K 및 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 발현한다. 하나의 실시형태에서, 본원에 제공된 마우스는 내인성 마우스 MHC I 유전자좌로부터 어떠한 기능성 내인성 마우스 MHC I 폴리펩타이드도 발현하지 않는다. 따라서, 하나의 양상에서, 마우스는 오직 사람화된, 예를 들면 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드만을 발현하며, 키메라 사람/마우스 MHC I 서열을 포함하지 않는 나머지 MHC I 유전자좌(예를 들면, 내인성 마우스 MHC I 뉴클레오타이드 서열의 키메라 사람/마우스 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로의 대체를 포함하지 않는 MHC I 유전자좌)는 결실에 의해 제거된다. 다른 실시형태에서, 마우스는 기능성 내인성 마우스 MHC I 폴리펩타이드(예: H-2L 폴리펩타이드)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 유지한다.
본 발명의 다른 양상은 게놈 내에 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예: 마우스 또는 래트)에 관한 것이다. 따라서, 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌에, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물이 제공되고, 여기서 상기 동물은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현한다. 하나의 양상에서, 상기 동물은 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능성 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 하나의 양상에서, 상기 동물은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 2개 카피의 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하고, 다른 실시형태에서, 상기 동물은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 1개 카피의 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함한다. 따라서, 상기 동물은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 래트 또는 마우스)의 배선에 포함된다. 하나의 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 MHC I 단백질에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 조절 요소에 작동적으로 연결된다. 하나의 양상에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 양상에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 또한 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-사람 동물은 설치류(예: 마우스 또는 래트)이며, 따라서 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌는 설치류(예: 마우스 또는 래트) β2 마이크로글로불린 유전자좌이다.
또한, 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 제공되며, 여기서 상기 마우스는 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 마우스는 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능성 내인성 마우스 β2 마이크로글로불린을 발현하지 않는다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 내인성 마우스 조절 요소에 연결될 수 있다. 하나의 양상에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 대안적으로, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 추가로 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 MHC I 단백질에 결합할 수 있다.
본 발명은 추가로 게놈 내에 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 게놈 내에 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열(상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다) 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물을 제공하며, 여기서 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌에 위치되고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 위치되고, 상기 동물은 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현한다. 하나의 양상에서, 동물은 마우스이다. 따라서, 내인성 MHC I 유전자좌는 H-2K, H-2D 및 H-2L 유전자좌로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 내인성 마우스 유전자좌는 H-2K 유전자좌(예: H-2Kb 유전자좌)이다. 하나의 실시형태에서, 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 양상에서, 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-A, 예를 들면, HLA-A2(예: HLA-A2.1)이다. 다른 실시형태에서, 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-B, 예를 들면, HLA-B27이다. 다양한 실시형태에서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)의 배선에 포함된다.
따라서, 하나의 실시형태에서, 본 발명은 게놈 내에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열(상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-A(예: HLA-A2)의 세포외 도메인을 포함하고 마우스 부분은 마우스 H-2K의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다); 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스를 제공하며, 여기서 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 H-2K 유전자좌에 위치되고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 위치되고, 상기 마우스는 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 게놈 내에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열(상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-B(예: HLA-B27)의 세포외 도메인을 포함하고 마우스 부분은 마우스 H-2D의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다); 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스를 제공하며, 여기서 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 H-2D 유전자좌에 위치되고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 위치되고, 상기 마우스는 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현한다. 하나의 실시형태에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드와 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드 둘 다를 포함하는 비-사람 동물(예: 마우스)은 내인성 비-사람 MHC I 폴리펩타이드(예: 마우스 H-2K 또는 H-2D 폴리펩타이드)의 세포외 도메인(예: 기능성 세포외 도메인) 및/또는 기능성 내인성 비-사람(예: 마우스) β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 이들의 각각의 내인성 유전자좌로부터 발현하지 않는다. 하나의 양상에서, 동물(예: 마우스)은 각각 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열의 2개 카피를 포함한다. 다른 양상에서, 동물(예: 마우스)은 제1 뉴클레오타이드 서열의 1개 카피 및 제2 뉴클레오타이드 서열의 1개 카피를 포함한다. 따라서, 동물은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열 둘 다에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다.
하나의 양상에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람(예: 마우스) MHC I 조절 요소에 작동적으로 연결되고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람(예: 마우스) β2 마이크로글로불린 요소에 작동적으로 연결된다. 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함할 수 있다. 제2 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제2 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 하나의 양상에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드와 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드 둘 다를 포함하는 마우스는, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린의 발현이 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드 부재 하의 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드의 발현과 비교하여 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드의 발현을 증가시키도록 하는 것일 수 있다.
추가로, 게놈 내에, 예를 들면, 내인성 MHC I 유전좌자에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 1종 이상, 예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하고 추가로 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 제공된다. 하나의 실시형태에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드(들)의 사람 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함하고, 마우스 부분은 마우스 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 따라서, 상기 마우스는 1종 이상, 예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드(들) 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현할 수 있다.
또한, 본원에서 기술되는 유전적으로 조작된 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)를 생성하는 방법이 제공된다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람, 예를 들면, 사람/설치류(예: 사람/마우스 또는 사람/래트) MHC I 폴리펩타이드를 발현하도록 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예: 마우스 또는 래트)의 MHC I 유전자좌를 변형시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 내인성 MHC I 유전자좌에서 설치류 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예: 마우스 또는 래트)의 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하도록 변형시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 내인성 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예: 마우스 또는 래트) β2 마이크로글로불린 유전자좌에서 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예: 마우스 또는 래트) β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키는 것을 포함한다. 이러한 방법에서, 대체는 단일 ES 세포에서 이루어질 수 있고, 단일 ES 세포는 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예: 마우스 또는 래트)에 도입되어 배아를 생성할 수 있다. 생성된 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예: 마우스 또는 래트)를 육종하여 이중의 사람화된 동물을 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 이중의 사람화된 동물, 예를 들면, 설치류(예: 마우스 또는 래트)을 생성하는 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서, (a) 내인성 마우스 MHC I 유전자좌에서, 마우스 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하는 것을 포함하여, 제1 마우스의 MHC I 유전자좌를 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 발현하도록 변형시키는 단계, (b) 내인성 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서, 마우스 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키는 것을 포함하여, 제2 마우스의 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하도록 변형시키는 단계, 및 (c) 제1 마우스 및 제2 마우스를 육종하여, 게놈 내에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스를 생성하는 단계를 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법이 제공되며, 상기 유전적으로 변형된 마우스는 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 실시형태에서, MHC I 유전자좌는 H-2K, H-2D 및 H-2L로부터 선택되고, 일부 실시형태에서, 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, MHC I 유전자좌는 H-2K 유전자좌이고, 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-A(예: HLA-A2)이며, 상기 마우스는 키메라 HLA-A/H-2K 폴리펩타이드(예: HLA-A2/H-2K 폴리펩타이드)를 발현한다. 하나의 양상에서, 키메라 HLA-A2/H-2K 폴리펩타이드는 HLA-A2 폴리펩타이드의 세포외 도메인 및 H-2K 폴리펩타이드의 세포질 도메인 및 막관통 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, MHC I 유전자좌는 H-2D 유전자좌이고, 사람 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-B(예: HLA-B27)이고, 마우스는 키메라 HLA-B2/H-2D 폴리펩타이드(예: HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드)를 발현한다. 하나의 양상에서, 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드는 HLA-B27 폴리펩타이드의 세포외 도메인 및 H-2D 폴리펩타이드의 세포질 도메인 및 막광통 도메인을 포함한다. 하나의 양상에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3, 및 4(예: 엑손 2 내지 엑손 4)에 제시된 뉴클레오타이드 서열 및 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한, 본원에는, 비-사람 MHC I 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 사람 MHC I 세포외 도메인을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 비-사람 키메라 MHC I 유전자좌가 제공된다. 하나의 양상에서, 키메라 MHC I 유전자좌는 비-사람 동물의 게놈 내의 내인성 MHC I 위치에 있다. 하나의 양상에서, 키메라 MHC I 유전자좌는 키메라 사람/비-사람(예: 사람/설치류, 예를 들면, 사람/마우스 또는 사람/래트) MHC I 폴리펩타이드를 발현한다. 하나의 실시형태에서, 사람 MHC I은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C(예: HLA-B27 또는 HLA-A2)로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 MHC I은 H-2D, H-2K 및 H-2L로부터 선택된 마우스 MHC I(예: H-2D 또는 H-2K)이다. 하나의 실시형태에서, 키메라 MHC I 유전자좌는 하나 이상의 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드(들)을 발현한다.
또한, 본원에는 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 β2 마이크로글로불린 유전자좌가 제공된다. 하나의 양상에서, 상기 유전자좌는 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4(예: 엑손 2-4)에 제시된 서열을 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 비-사람(예: 설치류, 예를 들면, 래트 또는 마우스) β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1에 제시된 서열을 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 제1 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된다. 하나의 양상에서, 유전적으로 변형된 β2 마이크로글로불린 유전자좌는 비-사람 동물의 게놈 내의 내인성 β2 마이크로글로불린 위치에 있다. 하나의 양상에서, 유전적으로 변형된 β2 마이크로글로불린 유전자좌는 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현한다.
하나의 양상에서, 비-사람 키메라 MHC I 유전자좌는 유전적으로 변형된 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 래트 또는 마우스)을 생성시키기 위한 본원에 기술된 어떠한 방법에 의해서도 수득될 수 있다. 하나의 양상에서, 유전적으로 변형된 β2 마이크로글로불린 유전자좌는 유전적으로 변형된 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 래트 또는 마우스)을 생성시키기 위한 본원에 기술된 어떠한 방법에 의해서도 수득될 수 있다.
또한, 본원에서 기술되는 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)로부터 유래된 세포, 예를 들면, 단리된 항원-제시 세포가 제공된다. 또한, 본원에서 기술되는 비-사람 동물로부터 유래된 조직 및 배아가 본원에 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 면역 반응을 유도하는 항원 또는 항원 에피토프의 동정 방법, 백신 후보물의 평가 방법, 사람 병원체 또는 암 항원에 대한 고 친화성 T 세포의 동정 방법을 제공한다.
본원에 기술되는 임의의 실시형태 및 양상은, 문맥으로부터 달리 지시되거나 분명하지 않은 한, 서로 연대하여 사용될 수 있다. 다른 실시형태들은 하기의 상세한 설명의 검토로부터 당업자에게 분명해질 것이다. 하기의 상세한 설명은, 청구되는 본 발명을 제한하지 않는, 본 발명의 다양한 실시형태에 대한 예시적 설명을 포함한다. 첨부된 도면은 본 명세서의 일부를 이루며, 설명과 함께 단지 실시형태들을 설명하는 것일 뿐 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
도 1은 제I 부류 MHC 분자의 4개의 도메인: α1, α2 및 α3 도메인을 포함하는 α-쇄 및 비-공유적으로 결합된 제4 도메인인 β2-마이크로글로불린(β2m)의 도식이다. 회색 원은 펩타이드-결합 틈에 결합된 펩타이드를 나타낸다.
도 2는 제I 부류, 제II 부류 및 제III 부류 유전자를 나타내는 사람 HLA의 상대적 게놈 구조에 대한 도식적 설명(축척에 따른 것이 아님)이다.
도 3은 제I 부류, 제II 부류 및 제III 부류 유전자를 나타내는 마우스 HLA의 상대적 게놈 구조에 대한 도식적 설명(축척에 의한 것이 아님)이다.
도 4는 IRES-GFP 리포터와 함께 키메라 HLA-A/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA를 함유하는 바이러스 벡터 작제물(A); 및 각각 단독으로(좌측) 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린과 함께 공동형질도입된(우측), HLAA2로 형질도입되거나(파선), HLA-A2/H-2K로 형질도입되거나(점선), 형질도입되지 않은(실선) MG87 세포에서의 사람 HLA-A2 발현을 비교하는 히스토그램(B)을 도시한다. (B)에서 그래프로 나타낸 수평 게이트로부터의 데이터는 (C)의 표에서 작제물을 발현하는 세포의 %로서 제시된다.
도 5는 사람 HLA-A2 단백질의 세포외 영역을 발현하는 키메라 H-2K 유전자좌를 생성하는데 사용된 표적화 전략에 대한 개략도(축척에 따른 것이 아님)이다. 마우스 서열은 검은색으로 표시되어 있고, 사람 서열은 백색으로 표시되어 있다. L=리더, UTR=비해독 영역, TM=막관통 도메인, CYT=세포질 도메인, HYG=하이그로마이신.
도 6a는 키메라 HLA-A2/H-2K 유전자좌(HLA-A/H-2K HET)를 보유하는 야생형(WT) 마우스 또는 이형접합 마우스로부터 단리된 세포에서의 HLA-A2(좌측) 및 H-2K(우측)의 발현(전체 세포의 %)을 나타낸다.
도 6b는 키메라 HLA-A2/H-2K 유전자좌를 보유하는 이형접합 마우스에서 키메라 HLA-A2/H-2K 단백질의 생체내 발현에 대한 점도표이다.
도 7은 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서 β2 마이크로글로불린 유전자의 사람화를 위한 표적화 전략(축척에 따른 것이 아님)을 나타낸다. 마우스 서열은 검은색이고, 사람 서열은 백색이다. NEO=네오마이신.
도 8은 야생형(WT) 마우스, 키메라 HLA-A2/H-2K에 대해 이형접합성인 마우스, 및 키메라 HLA-A2/H-2K에 대해 이형접합성이고 사람화된 β2 마이크로글로불린에 대해 이형접합성인(이중 이형접합; 제I 부류/β2m HET) 마우스의 혈액으로부터 단리된 세포 상에서의 HLA 제I 부류 및 사람 β2 마이크로글로불린 발현에 대한 대표적 점도표를 도시한다.
도 9는 야생형(WT) 마우스, 키메라 HLA-A2/H-2K 이형접합성인(제I 부류 HET) 마우스 및 키메라 HLA-A2/H2K/사람화된 β2 마이크로글로불린 이중 이형접합성인(제I 부류/β2m HET) 마우스의 혈액으로부터 단리된 세포 상에서의 사람 HLA 제I 부류 발현(X축)의 대표적 히스토그램을 도시한다.
도 10은 플루(flu)(좌측) 또는 EBV(우측) 펩타이드의 존재 하에 야생형 마우스로부터의 항원-제시 세포(APC)(WT APC) 또는 키메라 HLA-A2/H-2K와 사람화된 β2 마이크로글로불린 둘 다에 대해 이형접합성인 마우스로부터의 항원-제시 세포(이중 HET APC)에 노출된 사람 T 세포에 대한 IFNγ Elispot 검정 결과를 도시한다. 통계 분석은 터키 다중 비교 사후 검정(Tukey's Multiple Comparison Post Test)으로 일원 ANOVA를 이용하여 수행되었다.
도 11은 사람 HLA-B27 유전자의 세포외 도메인(도시된 특정한 실시형태에서, 사람 α1, α2 및 α3 도메인), 및 내인성 마우스 H-2D 리더, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 발현하는 키메라 HLA-B27/H-2Dl 유전자좌를 생성하기 위한 표적화 전략의 개략도(축적에 따른 것이 아님)이다. 유전형 결정(genotyping)을 위해 사용된 프로브의 위치(표 2 참조)가 또한 포함된다. hEX1= 사람 엑손 1; mEX1= 마우스 엑손 1; h2, h3, h4= 사람 엑손 2, 3 및 4; m5, m6, m7, m8= 마우스 엑손 5, 6, 7 및 8; mTM= m5의 마우스 막관통 도메인. 달리 나타내지 않는 한, 마우스 서열은 검은색으로 표시되고, 사람 서열은 백색으로 표시되어 있다.
도 12에서, 상단의 두 그래프는 야생형(WT; 우측 상단 도면) 마우스 또는 키메라 HLA-B27/H-2D 이형접합/사람화된 β2 마이크로글로불린 이형접합(B27/hB2M Het/Het; 좌측 상단 도면) 마우스의 혈액으로부터 단리된 세포 상에서의 HLA 제1 부류 발현의 대표적 히스토그램이고; 하단의 두 그래프는 WT 또는 B27/hB2M Het/Het 마우스의 혈액으로부터 단리된 세포 상에서의 사람 β2 마이크로글로불린 발현의 대표적 히스토그램을 도시한다. MFI= 평균 형광 강도; sec 단독= 단독의 2차 항체 염색.
도 2는 제I 부류, 제II 부류 및 제III 부류 유전자를 나타내는 사람 HLA의 상대적 게놈 구조에 대한 도식적 설명(축척에 따른 것이 아님)이다.
도 3은 제I 부류, 제II 부류 및 제III 부류 유전자를 나타내는 마우스 HLA의 상대적 게놈 구조에 대한 도식적 설명(축척에 의한 것이 아님)이다.
도 4는 IRES-GFP 리포터와 함께 키메라 HLA-A/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA를 함유하는 바이러스 벡터 작제물(A); 및 각각 단독으로(좌측) 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린과 함께 공동형질도입된(우측), HLAA2로 형질도입되거나(파선), HLA-A2/H-2K로 형질도입되거나(점선), 형질도입되지 않은(실선) MG87 세포에서의 사람 HLA-A2 발현을 비교하는 히스토그램(B)을 도시한다. (B)에서 그래프로 나타낸 수평 게이트로부터의 데이터는 (C)의 표에서 작제물을 발현하는 세포의 %로서 제시된다.
도 5는 사람 HLA-A2 단백질의 세포외 영역을 발현하는 키메라 H-2K 유전자좌를 생성하는데 사용된 표적화 전략에 대한 개략도(축척에 따른 것이 아님)이다. 마우스 서열은 검은색으로 표시되어 있고, 사람 서열은 백색으로 표시되어 있다. L=리더, UTR=비해독 영역, TM=막관통 도메인, CYT=세포질 도메인, HYG=하이그로마이신.
도 6a는 키메라 HLA-A2/H-2K 유전자좌(HLA-A/H-2K HET)를 보유하는 야생형(WT) 마우스 또는 이형접합 마우스로부터 단리된 세포에서의 HLA-A2(좌측) 및 H-2K(우측)의 발현(전체 세포의 %)을 나타낸다.
도 6b는 키메라 HLA-A2/H-2K 유전자좌를 보유하는 이형접합 마우스에서 키메라 HLA-A2/H-2K 단백질의 생체내 발현에 대한 점도표이다.
도 7은 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서 β2 마이크로글로불린 유전자의 사람화를 위한 표적화 전략(축척에 따른 것이 아님)을 나타낸다. 마우스 서열은 검은색이고, 사람 서열은 백색이다. NEO=네오마이신.
도 8은 야생형(WT) 마우스, 키메라 HLA-A2/H-2K에 대해 이형접합성인 마우스, 및 키메라 HLA-A2/H-2K에 대해 이형접합성이고 사람화된 β2 마이크로글로불린에 대해 이형접합성인(이중 이형접합; 제I 부류/β2m HET) 마우스의 혈액으로부터 단리된 세포 상에서의 HLA 제I 부류 및 사람 β2 마이크로글로불린 발현에 대한 대표적 점도표를 도시한다.
도 9는 야생형(WT) 마우스, 키메라 HLA-A2/H-2K 이형접합성인(제I 부류 HET) 마우스 및 키메라 HLA-A2/H2K/사람화된 β2 마이크로글로불린 이중 이형접합성인(제I 부류/β2m HET) 마우스의 혈액으로부터 단리된 세포 상에서의 사람 HLA 제I 부류 발현(X축)의 대표적 히스토그램을 도시한다.
도 10은 플루(flu)(좌측) 또는 EBV(우측) 펩타이드의 존재 하에 야생형 마우스로부터의 항원-제시 세포(APC)(WT APC) 또는 키메라 HLA-A2/H-2K와 사람화된 β2 마이크로글로불린 둘 다에 대해 이형접합성인 마우스로부터의 항원-제시 세포(이중 HET APC)에 노출된 사람 T 세포에 대한 IFNγ Elispot 검정 결과를 도시한다. 통계 분석은 터키 다중 비교 사후 검정(Tukey's Multiple Comparison Post Test)으로 일원 ANOVA를 이용하여 수행되었다.
도 11은 사람 HLA-B27 유전자의 세포외 도메인(도시된 특정한 실시형태에서, 사람 α1, α2 및 α3 도메인), 및 내인성 마우스 H-2D 리더, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 발현하는 키메라 HLA-B27/H-2Dl 유전자좌를 생성하기 위한 표적화 전략의 개략도(축적에 따른 것이 아님)이다. 유전형 결정(genotyping)을 위해 사용된 프로브의 위치(표 2 참조)가 또한 포함된다. hEX1= 사람 엑손 1; mEX1= 마우스 엑손 1; h2, h3, h4= 사람 엑손 2, 3 및 4; m5, m6, m7, m8= 마우스 엑손 5, 6, 7 및 8; mTM= m5의 마우스 막관통 도메인. 달리 나타내지 않는 한, 마우스 서열은 검은색으로 표시되고, 사람 서열은 백색으로 표시되어 있다.
도 12에서, 상단의 두 그래프는 야생형(WT; 우측 상단 도면) 마우스 또는 키메라 HLA-B27/H-2D 이형접합/사람화된 β2 마이크로글로불린 이형접합(B27/hB2M Het/Het; 좌측 상단 도면) 마우스의 혈액으로부터 단리된 세포 상에서의 HLA 제1 부류 발현의 대표적 히스토그램이고; 하단의 두 그래프는 WT 또는 B27/hB2M Het/Het 마우스의 혈액으로부터 단리된 세포 상에서의 사람 β2 마이크로글로불린 발현의 대표적 히스토그램을 도시한다. MFI= 평균 형광 강도; sec 단독= 단독의 2차 항체 염색.
정의
본 발명은 사람 또는 사람화된 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물(예: 마우스, 래트, 토끼 등), 이를 포함하는 배아, 세포 및 조직, 이를 생성하는 방법, 뿐만 아니라 이를 이용하는 방법을 제공한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 용어 및 어구는 반대의 것이 분명이 지시되지 않거나 상기 용어 및 구가 사용되는 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 상기 용어 및 구가 당업계에서 달성하는 의미를 포함한다.
용어 "보존적"은, 보존적 아미노산 치환을 기술하기 위해 사용되는 경우, 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 그룹을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 보존적 치환을 암호화할 뉴클레오타이드 변화를 도입하도록 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 관심대상의 기능적 특성, 예를 들면 관심대상의 펩타이드를 제시하는 MHC I의 능력을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹들의 예는 지방족 측쇄, 예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 지방족-하이드록실 측쇄, 예를 들면, 세린 및 트레오닌; 아미드-함유 측쇄, 예를 들면, 아스파라긴 및 글루타민; 방향족 측쇄, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 염기성 측쇄, 예를 들면 리신, 아르기닌 및 히스티딘; 산성 측쇄, 예를 들면 아스파트산 및 글루탐산; 및 황-함유 측쇄, 에를 들어 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 보존적 아미노산 치환 그룹은, 예를 들면, 발린/류신/이소류신, 페닐알라닌/티로신, 리신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파테이트 및 아스파라긴/글루타민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 단백질 내의 임의의 천연 잔기를, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에서 사용되는 바와 같이, 알라닌으로 치환하는 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 문헌[참조: Gonnet et al. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45), 본원에서 참조로 인용됨]에 개시된 PAM250 로그-우도(log likelihood) 행렬에서 양의 값을 갖는 보존적 치환이 이루어진다. 일부 실시형태에서, 치환은 PAM250 로그-우도 행렬에서 비음(非陰)의 값을 갖는 중간 정도의 보존적 치환이다.
따라서, 게놈이 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드 및/또는 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물도 본 발명에 포함되고, 상기 폴리펩타이드(들)은 본원에서 기술되는 아미노산 서열(들)의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
당업자는 본원에서 기술되는 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드 및/또는 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 핵산 잔기 이외에, 유전자 코드의 축퇴로 인해 다른 핵산이 본 발명의 폴리펩타이드(들)을 암호화할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 게놈 내에 보존적 아미노산 치환을 갖는 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물 이외에, 게놈이 유전자 코드의 축퇴로 인해 본원에서 기술되는 뉴클레오타이드 서열(들)과 상이한 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 비-사람 동물도 제공된다.
용어 "동일성"은, 서열과 함께 사용되는 경우, 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 다수의 상이한 알고리즘에 의해 결정되는 동일성을 포함한다. 본원에서 기술되는 일부 실시형태에서, 동일성은 10.0의 개방 갭 페널티, 0.1의 연장 갭 페널티를 이용하는 ClustalW v. 1.83(slow) 정렬을 이용하고 고넷(Gonnet) 유사성 행렬(MacVectorTM 10.0.2, MacVector Inc., 2008)을 사용하여 결정된다. 서열 동일성에 대해서 비교되는 서열의 길이는 특정 서열에 따라 좌우될 것이다. 다양한 실시형태에서, 동일성은 성숙한 단백질의 서열을 이의 N-말단부터 이의 C-말단까지 비교함으로써 결정된다. 다양한 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람 서열을 사람 서열에 대해 비교하는 경우, 키메라 사람/비-사람 서열의 사람 부분(그러나, 비-사람 부분은 아님)은 사람 서열과 키메라 사람/비-사람 서열의 사람 부분 간의 동일성 수준을 확인하기 위한 목적으로 비교(예: 키메라 사람/마우스 단백질의 사람 엑토도메인을 사람 단백질의 사람 엑토도메인에 대해 비교)하는데 사용된다.
서열, 예를 들면, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 관련하여, 용어 "상동" 또는 "상동성"은, 최적 정렬 및 비교시, 적어도 약 75%의 뉴클레오타이드 또는 아미노산, 적어도 약 80%의 뉴클레오타이드 또는 아미노산, 적어도 약 90 내지 95%의 뉴클레오타이드 또는 아미노산, 예를 들면, 97% 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 동일한 2개의 서열을 의미한다. 당업자는, 최적 유전자 표적화를 위해, 표적화 작제물이 내인성 DNA 서열에 대해 상동성인 암(arm)(즉, "상동성 암")을 포함함으로써 표적화 작제물과 표적화된 내인성 서열 간에 상동성 재조합이 발생할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
용어 "작동적으로 연결된"은, 이렇게 기술되는 성분들이 의도된 방식으로 작용하도록 하는 관계에 있는 병렬 상태를 말한다. 이와 같이, 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 적절한 전사 조절을 유지하도록 조절 서열(예: 프로모터, 인핸서, 사일런서 서열 등)에 작동적으로 연결될 수 있다. 또한, 본 발명의 키메라 또는 사람화된 단백질의 다양한 부분은 세포에서 단백질의 적절한 폴딩, 프로세싱, 표적화, 발현 및 기타 기능성 특성을 유지하도록 작동적으로 연결될 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 본 발명의 키메라 또는 사람화된 단백질의 다양한 도메인은 서로 작동적으로 연결된다.
용어 "MHC I 복합체" 등은, 본원에서 사용되는 바와 같이, MHC I α쇄 폴리펩타이드와 β2-마이크로글로불린 폴리펩타이드 간의 복합체를 포함한다. 용어 "MHC I 폴리펩타이드" 등은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 단독의 MHC I α쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 전형적으로, 용어 "사람 MHC" 및 "HLA"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
유전자 대체와 관련하여 용어 "대체"는 내인성 유전자 유전자좌에 외인성 유전 물질을 위치시킴으로써 내인성 유전자 전체 또는 일부를 이종상동성(orthologous) 또는 상동성 핵산 서열로 대체하는 것을 말한다. 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 마우스 MHC I 및 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드의 부분을 암호화하는 내인성 유전자좌의 핵산 서열이 각각 사람 MHC I 및 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드의 부분들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 대체되었다.
예를 들면, 기능성 폴리펩타이드와 관련하여 본원에서 사용되는 "기능성"은 정상적으로는 천연 단백질과 관련된 하나 이상의 생물학적 활성을 유지하는 폴리펩타이드를 말한다. 예를 들면, 본 발명의 일부 실시형태에서, 내인성 유전자좌에서의 대체(예를 들면, 내인성 비-사람 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서의 대체)로 인해 기능성 내인성 폴리펩타이드를 발현하지 못하는 유전자좌가 발생한다. 마찬가지로, 단백질의 기능성 세포외 도메인과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "기능성"은 이의 기능성, 예를 들면, MHC I의 경우 항원에 결합하는 능력, T 세포 공동수용체에 결합하는 능력 등을 유지하는 세포외 도메인을 말한다. 일부 실시형태에서, 내인성 MHC 유전자좌에서의 대체로 인해 사람 MHC의 세포외 도메인(예를 들면, 기능성 세포외 도메인)은 발현하면서 내인성 MHC의 세포외 도메인(예를 들면, 기능성 세포외 도메인)을 발현하지 못하는 유전자좌가 발생한다.
유전적으로 변형된 MHC I 비-사람 동물, 예를 들면, 동물 유형; 동물 스트레인; 세포 유형; 스크리닝, 검출 및 기타 방법; 이용 방법 등에 대해 하기에서 기술되는 몇몇 양상이 유전적으로 조작된 β2 마이크로글로불린 및 MHC I/β2 마이크로글로불린 동물에 적용될 수 있을 것이다.
유전적으로 변형된 MHC I 동물
다양한 실시형태에서, 본 발명은 일반적으로 게놈 내에 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 제공하고, 따라서 상기 동물은 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드를 발현한다.
MHC 유전자는 3가지 부류: 제I 부류, 제II 부류 및 제III 부류(이들 모두는 사람 6번 염색체 또는 마우스 17번 염색체 상에 암호화되어 있다)로 분류된다. 사람 및 마우스 MHC 부류의 상대적 구성의 도식이 각각 도 2 및 3에 제시되어 있다. MHC 유전자는 마우스 및 사람 게놈의 가장 다형성인 유전자에 속한다. MHC 다형성은 진화적 이점을 제공하는데 있어 중요한 것으로 추측되고, 서열의 변화는 병원체를 세포독성 T 세포에 더욱 잘 제시하도록 하는 펩타이드 결합의 차이를 야기할 수 있다.
MHC 제I 부류 단백질은 세포외 도메인(α1, α2 및 α3의 3가지 도메인을 포함), 막관통 도메인 및 세포질 테일을 포함한다. α1 및 α2 도메인은 펩타이드-결합 틈을 형성하는 한편, α3는 β2-마이크로글로불린과 상호작용한다.
α3 도메인은, 이의 β2-마이크로글로불린과의 상호작용 이외에도, TCR 공동수용체 CD8와 상호작용하여 항원-특이적 활성화를 촉진시킨다. MHC 제I 부류의 CD8에의 결합이 TCR의 MHC 제I 부류에의 결합보다 약 100배 약하지만, CD8 결합은 TCR 결합의 친화도를 증진시킨다[참조: Wooldridge et al. (2010) MHC Class I Molecules with Superenhanced CD8 Binding Properties Bypass the Requirement for Cognate TCR Recognition and Nonspecifically Activate CTLs, J. Immunol. 184:3357-3366]. 흥미롭게도, CD8에 대한 MHC 제I 부류 결합의 증가는 CTL 활성화시 항원 특이성을 제거하였다[상기 참조].
MHC 제I 부류 분자에 대한 CD8 결합은 종-특이적이며; CD8의 마우스 상동체인 Lyt-2는 α3 도메인에서 H-2Dd 분자에 결합하는 것으로 밝혀졌으나, HLA-A 분자에는 결합하지 않았다[참조: Connolly et al. (1988) The Lyt-2 Molecule Recognizes Residues in the Class I α3 Domain in Allogeneic Cytotoxic T Cell Responses, J. Exp. Med. 168:325-341]. 차등 결합은 아마도 사람과 마우스 간에 보존되지 않았던 CD8 상의 CDR-유사 결정인자(CDR1- 및 CDR2-유사)에 기인한 듯 하였다[참조: Sanders et al. (1991) Mutations in CD8 that Affect Interactions with HLA Class I and Monoclonal Anti-CD8 Antibodies, J. Exp. Med. 174:371-379; Vitiello et al. (1991) Analysis of the HLA-restricted Influenza-specific Cytotoxic T Lymphocyte Response in Transgenic Mice Carrying a Chimeric Human-Mouse Class I Major Histocompatibility Complex, J. Exp. Med. 173:1007-1015; and, Gao et al. (1997) Crystal structure of the complex between human CD8αα and HLAA2, Nature 387:630-634]. CD8은 (223번 내지 229번 위치에서) α3 도메인의 보존 영역 내의 HLA-A2에 결합하는 것으로 보고된 바 있다. HLA-A에서의 단일 치환(V245A)은 T 세포-매개성 분해를 크게 감소시키는 것과 동시에 HLAA에 대한 CD8의 결합을 감소시켰다[참조: Salter et al. (1989), Polymorphism in the α3 domain of HLA-A molecules affects binding to CD8, Nature 338:345-348]. 일반적으로, HLA-A 분자의 α3 도메인에서의 다형성은 CD8에 대한 결합에도 영향을 끼쳤다[참조: Salter et al. (1989) 상기 참조]. 마우스에서, H-2Dd의 잔기 227에서의 아미노산 치환은 H-2Dd에 대한 마우스 Lyt-2의 결합에 영향을 끼쳤으며, 돌연변이체 H-2Dd로 형질감염시킨 세포는 CD8+ T 세포에 의해 용해되지 않았다[참조: Potter et al. (1989) Substitution at residue 227 of H-2 class I molecules abrogates recognition by CD8-dependent, but not CD8-independent, cytotoxic T lymphocytes, Nature 337:73-75].
따라서, MHC 제I 부류 α3 도메인과 CD8 간의 상호작용의 종 특이성 때문에, H-2K α3 도메인의 사람 HLA-A2 α3 도메인으로의 대체를 포함하는 MHC I 복합체는 사람 CD8의 부재 하에 마우스에서(즉, 생체내에서) 비기능적이었다. HLA-A2에 대해 유전자전이된 동물에서, 마우스 α3 도메인을 사람 α3 도메인으로 치환시키면 T 세포 반응이 회복되었다[참조: Irwin et al. (1989) Species-restricted interactions between CD8 and the α3 domain of class I influence the magnitude of the xenogeneic response, J. Exp. Med. 170:1091-1101; Vitiello et al. (1991) 상기 참조].
또한, 마우스 MHC 제I 부류 단백질의 막관통 도메인 및 세포질도 중요한 기능을 갖는다. MHC I 막관통 도메인의 한가지 기능은, 아마도 표면 MHC 분자의 가교결합(또는 연결)의 결과로서, (부착을 증진시키거나 억제하도록) HLA-A2에 의한 동형 세포 부착의 조절을 촉진시키는 것이다[참조: Wagner et al. (1994) Ligation of MHC Class I and Class II Molecules Can Lead to Heterologous Desensitization of Signal Transduction Pathways That Regulate Homotypic Adhesion in Human Lymphocytes, J. Immunol. 152:5275-5287]. 세포 부착은 HLA-A2 분자의 다양한 에피토프에 결합하는 mAb에 의해 영향을 받을 수 있으며, 이는 동형 세포 부착의 조절에 연루된 HLA-A2 상의 다수 부위가 있음을 시사하고, 결합되는 에피토프에 따라 그 영향은 HLA-A2-의존적 부착을 증진시키거나 억제시킬 수 있다[상기 참조].
보고에 따르면, MHC I 유전자의 엑손 6 및 7에 의해 암호화되는 세포질 테일은 세포 표면 상의 적절한 발현 및 NK 세포 세포독성의 LIR1-매개성 억제를 위해 필수적인 것이다[참조: Gruda et al. (2007) Intracellular Cysteine Residues in the Tail of MHC Class I Proteins Are Crucial for Extracellular Recognition by Leukocyte Ig-Like Receptor 1, J. Immunol. 179:3655-3661]. 세포질 테일은 시스테인 잔기 상의 디설파이드 결합을 통해 적어도 일부의 MHC I 분자를 다량체화하는데 필요하므로, 클러스터링(clustering) 및 NK 세포에 의한 인식에서 한 역할을 할 수 있다[참조: Lynch et al. (2009) Novel MHC Class I Structures on Exosomes, J. Immunol. 183:1884-1891].
비록 Jurkat 세포에서 세포질 도메인이 결여된 돌연변이체 HLA-A2 분자가 발현, 세포골격 결합, 응집 및 세포내이입 내재화에 대해 정상적인 것으로 보이지만, HLA-A2의 세포질 도메인은 구성적으로 인산화된 세린 잔기 및 인산화가능한 티로신을 함유한다[참조: Gur et al. (1997) Structural Analysis of Class I MHC Molecules: The Cytoplasmic Domain Is Not Required for Cytoskeletal Association, Aggregation, and Internalization, Mol. Immunol. 34(2):125-132]. 세포질 도메인이 결여된 절두된(truncated) HLA-A2 분자는 외견상 분명히 정상적으로 발현되고 β2 마이크로글로불린과 결합한다[상기 참조].
그러나, 몇몇 연구는 세포질 테일이 세포내 트래피킹(trafficking), 수지상 세포(DC)-매개성 항원 제시 및 CTL 프라이밍에 중요하다는 것을 입증하였다. 엑손 6에 의해 암호화되는 티로신 잔기가 엔도솜 구획을 통한 MHC I 트래피킹, 외인성 항원 제시 및 CTL 프라이밍에 필요한 것으로 밝혀졌으며, 엑손 7의 결실은 항-바이러스 CTL 반응을 증진시켰다[참조: Lizee et al. (2003) Control of Dendritic Cross-Presentation by the Major Histocompatibility Complex Class I Cytoplasmic Domain, Nature Immunol. 4:1065-73; Basha et al. (2008) MHC Class I Endosomal and Lysosomal Trafficking Coincides with Exogenous Antigen Loading in Dendritic Cells, PLoS ONE 3: e3247; and Rodriguez-Cruz et al. (2011) Natural Splice Variant of MHC Class I Cytoplasmic Tail Enhances Dendritic Cell-Induced CD8+ T-Cell Responses and Boosts Anti-Tumor Immunity,
PLoS ONE 6:e22939].
다양한 실시형태에서, 본 발명은 게놈 내에 사람 또는 사람화된 MHC 제I 부류 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물(예: 마우스, 래트, 토끼 등)을 제공한다. 비-사람 동물은 게놈 내에 부분적으로 사람 및 부분적으로 비-사람의 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, 예를 들면 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 비-사람 동물이다. 하나의 양상에서, 비-사람 동물은 오직 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드, 예를 들면, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드만을 발현하고, 내인성 MHC I 유전자좌로부터 내인성 비-사람 MHC I 단백질은 발현하지 않는다.
하나의 실시형태에서, 게놈 내에, 예를 들면, 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌에 사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류, 예를 들면, 래트 또는 마우스가 제공된다. 다른 실시형태에서, 게놈 내에, 예를 들면, 내인성 MHC I 유전자좌에 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류, 예를 들면, 래트 또는 마우스가 제공된다.
하나의 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 이의 사람 부분에 사람 MHC I 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 도메인을 포함한다. 하나의 양상에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I의 세포외 도메인을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I의 α쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I의 α1 및 α2 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분(예를 들면, 키메라 폴리펩타이드의 세포외 도메인)은 사람 리더 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드(예를 들면, 키메라 폴리펩타이드의 세포외 도메인)는 비-사람 리더 서열(예를 들면, 세포외 비-사람 리더 서열)을 포함한다.
사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G 유전자좌 중 어느 하나에 의해 암호화되는 기능성 사람 HLA 분자로부터 유래될 수 있다. 통상적으로 사용되는 HLA 항원의 목록은 문헌[참조: Shankarkumar et al. (2004) The Human Leukocyte Antigen (HLA) System, Int. J. Hum. Genet. 4(2):91-103), 본원에서 참조로 인용됨]에 기재되어 있다. 산카르쿠마르(Shankarkumar) 등도 또한 당업계에서 사용되는 HLA 명명법의 간단한 설명을 제시한다. HLA 명명법 및 다양한 HLA 대립유전자에 대한 추가의 정보는 문헌[참조: Holdsworth et al. (2009) The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens, Tissue Antigens 73:95-170, and a recent update by Marsh et al. (2010) Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291-455, 둘 다 본원에서 참조로 인용됨]에서 찾아 볼 수 있다. 따라서, 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드는 본원에 기술된 임의의 기능성 사람 HLA 제I 부류 분자로부터 유래될 수 있다.
하나의 구체적 양상에서, 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드는 사람 HLA-A로부터 유래된다. 구체적 실시형태에서, HLA-A 폴리펩타이드는 HLA-A2 폴리펩타이드(예: HLA-A2.1 폴리펩타이드)이다. 하나의 실시형태에서, HLA-A 폴리펩타이드는 HLA-A*0201 대립유전자, 예를 들면, HLA-A*02:01:01:01 대립유전자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드이다. HLA-A*0201 대립유전자는 북아메리카인 집단 사이에서 통상적으로 사용된다. 본원의 실시예가 이러한 특정 HLA 서열을 기술하지만, 임의의 적합한 HLA-A 서열, 예를 들면 사람 집단에서 나타난 HLA-A2의 다형성 변이체, 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 아미노산 변형을 갖는 서열, 유전자 코드의 축퇴 등으로 인해 본원에서 기술된 서열과 상이한 핵산 서열이 본원에 포함된다.
하나의 양상에서, 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 변형을 포함하는 사람 HLA-A2 서열을 발현하는 비-사람 동물이 제공된다.
하나의 양상에서, 사람 HLA-A2 서열을 발현하는 비-사람 동물이 제공되고, 여기서 상기 사람 HLA-A2 서열은 사람 HLA-A2 서열과 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 구체적 실시형태에서, 사람 HLAA2 서열은 실시예에서 기술되는 사람 HLA-A2 서열과 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 하나의 실시형태에서, 사람 HLA-A2 서열은 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 사람 HLA-A2 서열은 하나 이상의 비-보존적 치환을 포함한다.
다른 구체적 양상에서, 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-B 및 HLA-C로부터 선택된 사람 MHC I으로부터 유래된다. 하나의 양상에서, 사람 또는 사람화된 MHC I은 HLA-B, 예를 들면, HLA-B27로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 MHC I은 HLA-A3, HLA-B7, HLA-B27, HLA-Cw6 등으로부터 유래된다.
따라서, 하나의 양상에서, 사람 또는 사람화된 MHC I은 HLA-B로부터 유래된다. 구체적 실시형태에서, HLA-B 폴리펩타이드는 HLA-B27이다. 하나의 실시형태에서, HLA-B27 폴리펩타이드는 HLA-B27 대립유전자 아형 B*2701-2759에 의해 암호화되는 폴리펩타이드이다. HLA-B27 사용은 통상적으로 사람 집단에서 강직성 척추염과 상관관계가 있다. 본 실시예가 이러한 특정 HLA 서열을 기술하지만, 임의의 적합한 HLA-B27 서열, 예를 들면 사람 집단에서 나타난 HLA-B27의 다형성 변이체, 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 아미노산 변형을 갖는 서열, 유전자 코드의 축퇴 등으로 인해 본원에서 기술된 서열과 상이한 핵산 서열이 본원에 포함된다.
하나의 양상에서, 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 변형을 포함하는 사람 HLA-B27 서열을 발현하는 비-사람 동물이 제공된다.
하나의 양상에서, 사람 HLA-B27 서열을 발현하는 비-사람 동물이 제공되고, 여기서 상기 사람 HLA-27 서열은 사람 HLA-B27 서열과 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 구체적 실시형태에서, 상기 사람 HLA-B27 서열은 실시예에서 기술되는 HLA-B27 서열과 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 하나의 실시형태에서, 사람 HLA-B27 서열은 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 사람 HLA-B27 서열은 하나 이상의 비-보존적 치환을 포함한다.
하나의 양상에서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드의 비-사람 부분은 비-사람 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스이고, 비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 H-2K, H-2D 및 H-2L로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 H-2K, 예를 들면, H-2Kb이다. 다른 실시형태에서, 비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 H-2D, 예를 들면, H-2D1이다. 비록 특정 H-2K 서열이 실시예에서 기술되지만, 임의의 적합한 H-2K 또는 H-2D 서열, 예를 들면, 다형성 변이체, 보존적/비보존적 아미노산 치환체 등이 본원에 포함된다.
본원에서 기술되는 비-사람 동물은 게놈 내에 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드, 예를 들면, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌(예: H-2K 유전자좌 또는 H-2D 유전자좌)에 위치된다. 하나의 양상에서, 이는 내인성 MHC I 유전자 또는 이의 일부를 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체, 예를 들면 본원에서 기술되는 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 키메라 유전자로 대체시킨다. 하나의 실시형태에서, 대체는 비-사람 MHC I 펩타이드 결합 도메인 또는 비-사람 MHC I 세포외 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열을 동일한 것을 암호화하는 사람 뉴클레오타이드 서열(예: HLA-A2 또는 HLA-B27 뉴클레오타이드 서열)로 대체하는 것을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 대체는 비-사람 MHC I 폴리펩타이드(예: H-2K 또는 H-2D 폴리펩타이드)의 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인을 암호화하는 MHC I 서열로 대체하는 것을 포함하지 않는다. 따라서, 비-사람 동물은 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌에 키메라 사람/비-사람 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌로부터 키메라 사람/비-사람 MHC 폴리펩타이드를 발현한다.
키메라 사람/비-사람 폴리펩타이드는 사람 또는 비-사람 리더(시그널) 서열을 포함하는 것일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 사람 MHC I 단백질, 예를 들면, HLA-A2 단백질의 리더 서열(예: HLA-A2.1 리더 서열)을 포함한다. 따라서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 암호호하는 뉴클레오타이드 서열은 사람 MHC I 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결될 수 있다.
다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 MHC I 단백질의 비-사람 리더 서열, 예를 들면, 내인성 MHC I 단백질의 비-사람 리더 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 키메라 폴리펩타이드는 비-사람 MHC I 단백질, 예를 들면, 마우스 H-2D 단백질의 리더 서열(예: 마우스 H-2D1 리더 서열)을 포함한다. 따라서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 비-사람 MHC I 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결될 수 있다.
키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 이의 사람 부분에 사람 MHC I 폴리펩타이드의 완전하거나 실질적으로 완전한 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 사람 부분은 사람 MHC I 폴리펩타이드(예: HLA-A2 폴리펩타이드, HLA-B27 폴리펩타이드)의 세포외 도메인을 암호화하는 아미노산의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들면, 95% 이상을 포함할 수 있다. 하나의 예에서, 사람 MHC I 폴리펩타이드의 실질적으로 완전한 세포외 도메인은 사람 MHC I 리더 서열이 결여된다. 다른 예에서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드는 사람 MHC I 리더 서열을 포함한다.
또한, 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 내인성 비-사람 조절 요소, 예를 들면, 설치류 MHC I 조절 요소의 제어 하에 발현될 수 있다. 이러한 배열은 비-사람 동물에서, 예를 들면 비-사람 동물에서 면역 반응 동안, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 적절한 발현을 촉진시킬 것이다.
유전적으로 변형된 비-사람 동물은 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소(예: 암소(cow), 황소(bull), 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰담비, 영장류(예: 마모셋, 붉은털 원숭이)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 적합한 유전적으로 변형가능한 ES 세포가 즉시 이용가능하지 않은 비-사람 동물의 경우, 유전적 변형을 포함하는 비-사람 동물을 생성하기 위해 다른 방법이 이용된다. 이러한 방법은, 예를 들면 비-ES 세포 게놈(예: 섬유아세포 또는 유도성 다능성 세포)을 변형시키는 것 및 변형된 게놈을 적합한 세포, 예를 들면, 난모세포로 전달하기 위해 핵 전달을 이용하는 것 및 변형된 세포(예: 변형된 난모세포)를 배아를 형성하기 위한 적합한 조건 하에 비-사람 동물에 임신시키는 것을 포함한다.
하나의 양상에서, 비-사람 동물은 포유동물이다. 하나의 양상에서, 비-사람 동물은, 예를 들면, 디포도이대(Dipodoidea) 또는 뮤로이대(Muroidea) 상과의 작은 포유동물이다. 하나의 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 설치류이다. 하나의 실시형태에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 설치류는 뮤로이대 상과로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 유전적으로 변형된 동물은 칼로미시대(Calomyscidae)(예: 마우스-유사 햄스터),크리세티대(Cricetidae)(예: 햄스터, 뉴 월드 래트 및 마우스, 보울(vole)), 뮤리대(Muridae)(순수 마우스 및 래트, 저빌(gerbil), 가시가 있는(spiny) 마우스, 볏이 있는(crested) 래트), 네소미이대(Nesomyidae)(클라이밍(climbing) 마우스, 바위(rock) 마우스, 꼬리가 있는(with-tailed) 래트, 말라가시(Malagasy) 래트 및 마우스), 플라타칸토미이대(Platacanthomyidae)(예: 가시가 있는 겨울잠쥐(dormouse)), 및 스팔라시대(Spalacidae)(예: 두더지 래트(mole rate), 대나무(bamboo) 래트 및 조커(zokor))로부터 선택되는 과로부터의 동물이다. 구체적 실시형태에서, 유전적으로 변형된 설치류는 순수 마우스 또는 래트(뮤리대 과), 저빌, 가시가 있는 마우스 및 볏이 있는 래트로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스는 뮤리대 과의 구성원으로부터의 마우스이다. 하나의 실시형태에서, 동물은 설치류이다. 구체적 실시형태에서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스이다.
특정 실시형태에서, 비-사람 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 스트레인의 마우스인 설치류이다. 다른 실시형태에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예: 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 스트레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 129 스트레인이다[참조: 예를 들면, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, see also, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines]. 구체적 실시형태에서, 유전적으로 변형된 마우스는 상술된 129 스트레인과 상술된 C57BL/6 스트레인의 혼합형이다. 다른 구체적 실시형태에서, 마우스는 상술된 129 스트레인의 혼합형 또는 상술된 BL/6 스트레인의 혼합형이다. 구체적 실시형태에서, 혼합형의 129 스트레인은 129S6(129/SvEvTac) 스트레인이다. 다른 실시형태에서, 마우스는 BALB 스트레인, 예를 들면, BALB/c 스트레인이다. 또 다른 실시형태에서, 마우스는 BALB 스트레인과 다른 상술된 스트레인의 혼합형이다.
하나의 실시형태에서, 비-사람 동물은 래트이다. 하나의 실시형태에서, 래트는 위스타(Wistar) 래트, LEA 스트레인, 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 스트레인, 피셔(Fischer) 스트레인, F344, F6 및 다크 아구티(Dark Agouti)로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 래트 스트레인은 위스타, LEA, 스프라그 다울리, 피셔, F344, F6 및 다크 아구티로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2종 이상의 스트레인의 혼합형이다.
따라서, 하나의 실시형태에서, 본 발명은 게놈 내에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스에 관한 것으로서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I(예: 사람 HLA-A 또는 HLA-B, 예를 들면, 사람 HLA-A2 또는 HLA-B27(예: 사람 HLA-A2.1))의 펩타이드 결합 도메인 또는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 마우스는 내인성 마우스 유전자좌로부터 내인성 마우스 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 발현하지 않는다. 사람 MHC I의 펩타이드 결합 도메인은 α1 및 α2 도메인을 포함할 수 있다. 대안으로서, 사람 MHC I의 펩타이드 결합 도메인은 α1, α2, 및 α3 도메인을 포함할 수 있다. 하나의 양상에서, 사람 MHC I의 세포외 도메인은 사람 MHC I α쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 내인성 마우스 유전자좌는 H-2K 또는 H-2D 유전자좌(예: H-2Kb 또는 H-2D1)이고, 키메라 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2K 또는 H-2D 폴리펩타이드(예: H-2Kb 또는 H-2D1)의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다.
따라서, 하나의 실시형태에서, 내인성 H-2K(예: H-2Kb) 유전자좌에, 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되고, 여기서 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-A2(예: HLA-A2.1) 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함하고 마우스 부분은 마우스 H-2K(예: H-2Kb) 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 하나의 양상에서, 마우스는 내인성 MHC I 유전자좌로부터 마우스 H-2K(예: H-2Kb) 폴리펩타이드의 세포외 도메인, 예를 들면, 기능성 세포외 도메인을 발현하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 마우스는 내인성 H-2K(예: H-2Kb) 유전자좌로부터 키메라 HLA-A2/H-2K(예: 키메라 HLA-A2.1/H-2Kb) 폴리펩타이드를 발현한다. 다양한 실시형태에서, 키메라 유전자의 발현은 내인성 마우스 MHC 제I 부류 조절 요소의 제어 하에 있다. 일부 양상에서, 마우스는 키메라 HLA-A2/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 키메라 MHC I 유전자좌의 2개 카피를 포함하는 한편, 다른 양상에서, 마우스는 키메라 HLAA2/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 키메라 MHC I 유전자좌의 1개 카피를 포함한다. 따라서, 마우스는 키메라 HLA-A2/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다.
본원에서 기술되는 일부 실시형태에서, 내인성 마우스 H-2K 유전자좌에 위치된 키메라 MHC I 유전자좌를 포함하는 마우스가 제공된다. 키메라 유전자좌는 사람 HLA-A2 단백질의 세포외 도메인, 예를 들면, 사람 HLA-A2 유전자의 α1, α2, 및 α3 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 키메라 유전자좌는 마우스 H-2K 단백질의 세포외 도메인(예: 마우스 H-2K의 α1, α2, 및 α3 도메인)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 결여된다. 하나의 양상에서, 키메라 유전자좌는 마우스 H-2K의 리더 펩타이드, α1, α2, 및 α3 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 결여되고; 사람 HLA-A2의 리더 펩타이드, α1, α2, 및 α3 도메인 및 마우스 H-2K의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 키메라 유전자좌의 다양한 도메인은 키메라 유전자좌가 기능성 키메라 사람/마우스 MHC I 단백질을 발현하도록 서로 작동적으로 연결된다.
다른 실시형태에서, 내인성 H-2D(예: H-2D1) 유전자좌에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분이 HLA-B(예: HLA-B27) 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함하고 마우스 부분이 마우스 H-2D(예: H-2D1)의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 유전적으로 변형된 동물이 제공된다. 하나의 양상에서, 마우스는 내인성 MHC I 유전자좌로부터 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 세포외 도메인, 예를 들면, 기능성 세포외 도메인을 발현하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 마우스는 내인성 H-2D 유전자좌로부터 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 발현한다. 다양한 실시형태에서, 키메라 유전자의 발현은 내인성 마우스 MHC I 조절 요소의 제어하에 있다. 일부 양상에서, 마우스는 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 키메라 MHC I 유전자좌의 2개 카피를 포함하는 한편, 다른 양상에서, 마우스는 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 키메라 MHC I 유전자좌의 1개 카피를 포함한다. 따라서, 마우스는 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다.
본원에서 기술되는 일부 실시형태에서, 내인성 마우스 H-2D 유전자좌에 위치된 키메라 MHC I 유전자좌를 포함하는 마우스가 제공된다. 키메라 유전자좌는 사람 HLA-B27 단백질의 세포외 도메인, 예를 들면, 사람 HLA-B27 유전자의 α1, α2, 및 α3 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 키메라 유전자좌는 마우스 H-2D 단백질의 세포외 도메인(예: 마우스 H-2D의 α1, α2, 및 α3 도메인)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 결여된다. 하나의 양상에서, 키메라 유전자좌는 마우스 H-2D의 α1, α2, 및 α3 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 결여되고, 사람 HLA-B27의 α1, α2, 및 α3 도메인, 및 마우스 H-2D의 리더 서열 및 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 키메라 유전자좌의 다양한 도메인은 키메라 유전자좌가 기능성 키메라 사람/마우스 MHC I 단백질을 발현하도록 서로 작동적으로 연결된다.
다양한 실시형태에서, 본원에서 기술되는 바와 같이 키메라 MHC I 유전자좌로부터 기능성 키메라 MHC I 단백질을 발현하는 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예: 마우스 또는 래트)은 세포 표면 상에 키메라 단백질을 디스플레이한다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 동물은 사람에서 관찰되는 바와 동일한 세포 분포로 세포 표면 상에 키메라 MHC I 단백질을 발현한다. 하나의 양상에서, 세포는 키메라 MHC I 단백질의 세포외 부분(예: 사람 HLA-A2 또는 HLA-B27 세포외 부분)에 결합된 펩타이드 단편(항원 단편)을 디스플레이한다. 하나의 실시형태에서, 이러한 키메라 단백질의 세포외 부분은 상기 세포의 표면 상에 다른 단백질, 예를 들면, β2-마이크로글로불린과 상호작용한다.
다양한 실시형태에서, 키메라 MHC I 단백질, 예를 들면, HLA-A2/H-2K 단백질 또는 HL-B27/H-2D 단백질을 디스플레이하는 세포는 유핵 세포이다. 다양한 양상에서, 세포는 항원-제시 세포(APC)이다. 체내의 대부분의 세포가 MHC I의 상황에서 항원을 제시할 수 있지만, 항원 제시 세포의 일부 비제한적 예는 대식구, 수지상 세포 및 B 세포를 포함한다. 전문적 및 비전문적 APC를 포함하는 기타 항원 제시 세포가 당업계에 공지되어 있으며 본원에 포함된다. 일부 실시형태에서, 키메라 MHC I 단백질을 디스플레이하는 세포는 종양 세포이며, 상기 키메라 단백질에 의해 제시되는 펩타이드는 종양으로부터 유도된다. 다른 실시형태에서, 키메라 MHC I 단백질에 의해 제시되는 펩타이드 단편은 병원체, 예를 들면. 세균 또는 바이러스로부터 유도된다.
본원에서 기술되는 키메라 MHC I 단백질은 동일 세포 또는 제2 세포의 표면 상의 다른 단백질과 상호작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 MHC I 단백질은 상기 세포 표면 상의 내인성 비-사람 단백질과 상호작용한다. 키메라 MHC I 단백질은 또한 동일 세포 또는 제2 세포의 표면 상의 사람 또는 사람화된 단백질과 상호작용할 수 있다.
동일 세포 상에서, HLA 제I 부류 분자는 비-사람(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트) 및 사람 β2-마이크로글로불린 둘 다와 기능적으로 상호작용할 수 있다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 키메라 MHC I 단백질, 예를 들면, HLA-A2/H-2K 또는 HLA-B27/H-2D 단백질은 마우스 β2-마이크로글로불린과 상호작용한다. 비록 일부 사람 HLA 제I 부류 분자와 마우스 β2-마이크로글로불린 간의 상호작용이 가능하지만, 이러한 상호작용은 사람 HLA 제I 부류와 사람 β2-마이크로글로불린 간의 상호작용과 비교하여 상당히 감소될 수 있다. 따라서, 사람 β2-마이크로글로불린의 부재 하에, 세포 표면 상의 사람 MHC I의 발현은 감소될 수 있다[참조: Perarnau et al. (1988) Human β2-microglobulin Specifically Enhances Cell-Surface Expression of HLA Class I Molecules in Transfected Murine Cells, J. Immunol. 141:1383-89]. 다른 HLA 분자, 예를 들면, HLA-B27은 마우스 β2-마이크로글로불린과 상호작용하지 않는다[참조: 예를 들면, Tishon et al. (2000) Transgenic Mice Expressing Human HLA and CD8 Molecules Generate HLA-Restricted Measles Virus Cytotoxic T Lymphocytes of the Same Specificity as Humans with Natural Measles Virus Infection, Virology 275:286-293; 이는 유전자전이 마우스에서 HLA-B27 작용이 사람 β2-마이크로글로불린과 사람 CD8 둘 다를 필요로 한다는 것을 보고한다. 따라서, 다른 실시형태에서, 키메라 MHC I 단백질은 사람 또는 사람화된 β2-마이크로글로불린과 상호작용한다. 일부 이러한 실시형태에서, 하기에서 기술되는 바와 같이, 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류(예: 마우스 또는 래트)은 이의 게놈에 사람 또는 사람화된 β2-마이크로글로불린 유전자를 포함하고, 동물은 기능성 사람 또는 사람화된 β2-마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하며, 따라서, 키메라 MHC I 단백질은 사람 또는 사람화된 β2-마이크로글로불린 폴리펩타이드와 상호작용한다.
다양한 양상에서, 키메라 단백질(예: HLA-A2/H-2K 또는 HLA-B27/H-2D 단백질)은 또한 제2 세포의 표면 상의 단백질과 (이의 세포외 부분을 통해) 상호작용한다. 제2 세포는 비-사람, 예를 들면, 마우스 또는 사람 기원일 수 있다. 제2 세포는 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 발현하는 세포와 동일한 비-사람 동물 또는 동일한 비-사람 동물종으로부터 유도될 수 있다. 키메라 단백질(예: HLA-A2/H-2K 또는 HLA-B27/H-2D)의 세포외 부분이 상호작용할 수 있는 단백질의 비제한적 예는 T 세포 수용체(TCR) 및 이의 공동수용체 CD8을 포함한다. 따라서, 제2 세포는 T 세포일 수 있다. 또한, 키메라 MHC I 단백질의 세포외 부분은 천연 살해(NK) 세포 표면 상의 단백질, 예를 들면, NK 세포 표면 상의 살해 면역글로불린 수용체(KIR)에 결합할 수 있다.
T 세포 또는 NK 세포는 키메라 MHC I 폴리펩타이드와 이의 디스플레이된 펩타이드 단편 사이에 형성된 복합체에 결합할 수 있다. 이러한 결합으로 각각 T 세포를 활성화시키거나 NK-매개성 세포 사멸을 억제시킬 수 있다. 하나의 가설은 NK 세포가 MHC I 복합체를 하향조절함으로써 T 세포 매개된 세포독성을 모면한 감염된 세포 또는 종양 세포를 사멸시키도록 발달한다는 것이다. 그러나, MHC I 복합체가 세포 표면 상에 발현되는 경우, NK 세포 수용체가 이를 인식하고 NK-매개성 세포 사멸이 억제된다. 따라서, 일부 양상에서, NK 세포가, 키메라 MHC I 폴리펩타이드(예: HLA-A2/H-2K 또는 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드)와 감염된 세포 또는 종양 세포 표면 상에 디스플레이된 펩타이드 단편 사이에 형성된 복합체에 결합하는 경우, NK-매개성 세포 사멸이 억제된다.
하나의 예에서, 본원에서 기술되는 키메라 MHC I 폴리펩타이드, 예를 들면, 키메라 HLA-A2/H-2K 또는 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드는 제2 세포의 표면 상의 CD8 단백질과 상호작용한다. 하나의 실시형태에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드, 예를 들면, HLA-A2/H-2K 또는 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드는 제2 세포의 표면 상의 내인성 설치류(예: 마우스 또는 래트) CD8 단백질과 상호작용한다. 하나의 실시형태에서, 제2 세포는 T 세포이다. 다른 실시형태에서, 제2 세포는 CD8을 발현하도록 조작된다. 특정 양상에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드, 예를 들면, HLA-A2/H-2K 또는 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드는 제2 세포(예: 사람 세포 또는 설치류 세포)의 표면 상의 사람 CD8과 상호작용한다. 일부 이러한 실시형태에서, 비-사람 동물, 예를 들면, 마우스 또는 래트는 사람 CD8 전이유전자를 포함하고, 마우스 또는 래트는 기능성 사람 CD8 단백질을 발현한다.
본원에서 기술되는 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 또한 제2 세포 상의 비-사람(예: 마우스 또는 래트) TCR, 사람 TCR 또는 사람화된 TCR과 상호작용할 수 있다. 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 제2 세포 표면 상의 내인성 TCR(예: 마우스 또는 래트 TCR)과 상호작용할 수 있다. 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 또한 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 발현하는 세포와 동일한 동물 또는 동물 종(예: 마우스 또는 래트)로부터 유래되는 제2의 세포의 표면 상에 발현된 사람 또는 사람화된 TCR과 상호작용할 수 있다. 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 사람 세포의 표면 상에 발현된 사람 TCR과 상호작용할 수 있다.
유전적으로 조작된 비-사람 동물 이외에, 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)로부터 유래되는 공여 ES 세포를 포함하는 비-사람 배아(예: 설치류 배아, 예를 들면, 마우스 또는 래트 배아)가 또한 제공된다. 하나의 양상에서, 배아는 키메라 MHC I 유전자를 포함하는 ES 공여 세포 및 숙주 배아 세포를 포함한다.
또한, 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물(예: 마우스 또는 래트)로부터 유래되고 키메라 MHC I 폴리펩타이드(예: HLA-A2/H-2K 폴리펩타이드 또는 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드)를 발현하는 조직이 제공된다.
또한, 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물로부터 단리된 비-사람 세포가 제공된다. 하나의 실시형태에서, 세포는 ES 세포이다. 하나의 실시형태에서, 세포는 항원-제시 세포, 예를 들면, 수지상 세포, 대식구, B 세포이다. 하나의 실시형태에서, 세포는 면역 세포이다. 하나의 실시형태에서, 면역 세포는 림프구이다.
또한, 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물의 염색체 또는 이의 단편을 포함하는 비-사람 세포가 제공된다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 세포는 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물의 핵을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 세포는 핵 전이의 결과로서 염색체 또는 이의 단편을 포함한다.
하나의 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 키메라 MHC I 폴리펩타이드(예: HLA-A2/H-2K 폴리펩타이드 또는 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드)를 암호화하는 유전자를 포함하는 비-사람 유도성 다능성 세포가 제공된다. 하나의 실시형태에서, 유도성 다능성 세포는 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물로부터 유래된다.
하나의 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물의 세포로부터 유래된 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)가 제공된다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스 또는 래트이다.
또한, 본원에서 기술되는 유전적으로 조작된 비-사람 동물(예: 유전적으로 조작된 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)을 생성하는 방법이 제공된다. 유전적으로 조작된 비-사람 동물의 생성 방법으로, 게놈이 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 동물이 생성된다. 하나의 실시형태에서, 상기 방법으로, 게놈이 내인성 MHC I 유전자좌, 예를 들면, H-2K 유전자좌에, 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 HLA-A2 또는 사람 HLA-B27의 세포외 도메인을 포함하고 마우스 부분이 마우스 H-2K 또는 마우스 H-2D의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 각각 포함하는 유전적으로 조작된 마우스가 생성된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은, 실시예에서 기술되는 바와 같이, VELOCIGENE® 기술을 이용하여 표적화 작제물을 생성하고, 이 작제물을 ES 세포로 도입하고, 표적화된 ES 세포 클론을 VELOCIMOUSE® 기술을 이용하여 마우스 배아로 도입하는 것을 이용한다. 하나의 실시형태에서, ES 세포는 129 마우스 스트레인과 C57BL/6 마우스 스트레인의 혼합형이다. 다른 실시형태에서, ES 세포는 BALB/c 마우스 스트레인과 129 마우스 스트레인의 혼합형이다.
따라서, 본원에서 기술되는 유전적으로 조작된 비-사람 동물을 생성하는데 사용되는 뉴클레오타이드 작제물이 또한 제공된다. 하나의 양상에서, 뉴클레오타이드 작제물은 5' 및 3' 비-사람 상동성 암, 사람 HLA-A 유전자 서열을 포함하는 사람 DNA 단편 및 재조합 부위가 플랭킹된 선별 카세트를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 사람 DNA 단편은 사람 HLA-A 유전자의 인트론과 엑손 둘 다를 포함하는 게놈 단편이다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 상동성 암은 비-사람 MHC 제I 부류 유전자좌(예: 마우스 H-2K 유전자좌 또는 H-2D 유전자좌)에 대해 상동성이다.
하나의 실시형태에서, 게놈 단편은 사람 HLA-A(예: HLA-A2) 리더, α1 도메인, α2 도메인 및 α3 도메인 암호화 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 사람 DNA 단편은, 5'로부터 3'으로, HLA-A 리더 서열, HLA-A 리더/α1 인트론, HLA-A α1 엑손, HLA-A α1-α2 인트론, HLA-A α2 엑손, HLA-A α2-α3 인트론 및 HLA-A α3 엑손을 포함한다.
다른 실시형태에서, 게놈 단편은 사람 HLA-B(예: HLA-B27) α1 도메인, α2 도메인 및 α3 도메인 암호화 서열을 포함한다. 따라서, 유전적으로 조작된 동물을 생성하기 위한 뉴클레오타이드 서열은 비-사람, 예를 들면, 마우스, 예를 들면, 마우스 H-2D, 리더 서열을 또한 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 사람 DNA 단편은, 5'로부터 3'으로, 사람 HLA-B27 α1 인트론, HLA-B27 α1-α2 인트론, HLA-B27 α2 엑손, HLA-B27 α2-α3 인트론 및 HLA-B27 α3 엑손을 포함한다.
선별 카세트는 관심대상의 작제물이 통합된 세포(예: ES 세포)의 선별을 용이하게 하기 위해 표적화 작제물로 삽입되는 뉴클레오타이드 서열이다. 다수의 적합한 선별 카세트가 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 선별 카세트는 특정 항생제(예: Neo, Hyg, Pur, CM, Spec 등)의 존재 하에서 양성 선별을 가능하게 한다. 또한, 선별 카세트는 재조합효소로 처리시 선별 카세트를 결실시키는 재조합 부위가 플랭킹될 수 있다. 일반적으로 사용되는 재조합 부위는 각각 Cre 및 Flp 효소에 의해 인식되는 loxP 및 Frt이지만, 다른 부위들도 당업계에 공지되어 있다.
하나의 실시형태에서, 선별 카세트는 사람 DNA 단편의 5' 말단에 위치된다. 다른 실시형태에서, 선별 카세트는 사람 DNA 단편의 3' 말단에 위치된다. 다른 실시형태에서, 선별 카세트는 사람 DNA 단편 내에 위치된다. 다른 실시형태에서, 선별 카세트는 사람 DNA 단편의 인트론 내에 위치된다. 다른 실시형태에서, 선별 카세트는 α2-α3 인트론 내에 위치된다. 또 다른 실시형태에서, 선별 카세트는 비-사람 동물의 게놈 내로 삽입될 서열의 일부분인 비-사람 서열 내에 위치될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 5' 및 3' 비-사람 상동성 암은 각각 내인성 비-사람(예: 뮤린) MHC 제I 부류 유전자 유전자좌의 5' 및 3' 위치(예: 제1 리더 서열의 5' 및 비-사람 MHC I 유전자의 α3 엑손의 3')에 게놈 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 5' 비-사람 상동성 암은 비-사람 MHC I 유전자의 α1 엑손의 상류에 게놈 서열, 예를 들면, 비-사람 리더 서열 엑손을 포함하는 게놈 서열을 포함할 수 있고, 이러한 실시형태에서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 단백질은 비-사람 리더 서열을 유지한다. 하나의 실시형태에서, 내인성 MHC 제I 부류 유전자좌는 마우스 H-2K, H-2D 및 H-2L로부터 선택된다.
구체적 실시형태에서, 내인성 MHC 제I 부류 유전자좌는 마우스 H-2K이다. 따라서, 하나의 양상에서, 5'로부터 3'으로, 내인성 마우스 H-2K 유전자좌의 5'에 마우스 게놈 서열을 함유하는 5' 상동성 암, HLA-A 유전자의 제1 게놈 서열을 포함하는 제1 사람 DNA 단편, 5' 재조합 서열 부위(예: loxP), 선별 카세트, 3' 재조합 서열 부위(예: loxP), HLA-A 유전자의 제2 게놈 서열을 포함하는 제2 사람 DNA 단편 및 내인성 H-2K α3 엑손의 3'에 마우스 게놈 서열을 함유하는 3' 상동성 암을 포함하는 뉴클레오타이드 작제물이 제공된다. 하나의 실시형태에서, 뉴클레오타이드 작제물은, 5'로부터 3'으로, 내인성 마우스 H-2K 유전자좌의 5'에 마우스 게놈 서열을 함유하는 5' 상동성 암, HLA-A 리더를 포함하는 사람 게놈 서열, HLA-A 리더/α1 인트론 서열, HLA-A α1 엑손, HLA-A α1-α2 인트론, HLA-A α2 엑손, α2-α3 인트론의 제1 5' 부분, 재조합 부위가 플랭킹된 선별 카세트, α2-α3 인트론의 제2 3' 부분, HLA-A α3 엑손 및 내인성 마우스 H-2K α3 엑손의 3'에 비-마우스 게놈 서열을 함유하는 3' 상동성 암을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 5' 상동성 암 서열은 서열번호 1에 제시되고, 3' 상동성 암 서열은 서열번호 2에 제시된다.
다른 구체적 실시형태에서, 내인성 MHC 제I 부류 유전자좌는 마우스 H-2D이다. 따라서, 하나의 양상에서, 5'로부터 3'으로, 내인성 마우스 H-2D1 유전자의 5'에 마우스 게놈 서열을 함유하는 5' 상동성 암, HLA-B27 유전자의 게놈 서열을 함유하는 사람 DNA 단편 및 내인성 H-2D 유전자의 3'에 마우스 게놈 서열을 함유하는 3' 상동성 암을 포함하는 뉴클레오타이드 작제물이 제공된다. 하나의 실시형태에서, 뉴클레오타이드 작제물은, 5'로부터 3'으로, 내인성 마우스 H-2D 유전자좌의 5'에 리더 서열 엑손 및 H-2D1 리더-α1 인트론을 포함하는 마우스 게놈 서열을 함유하는 5' 상동성 암, HLA-B27 α1 엑손, HLA-B27 α1-α2 인트론, HLA-B27 α2 엑손, 5' loxP 부위 삽입을 갖는 HLA-B27 α2-α3 인트론, HLA-B27 α3 엑손, 마우스 H-2D α3 막관통 도메인 인트론, 마우스 막관통 도메인 및 세포질 도메인 게노 ㅁ서열 및 폴리A 테일, 5' FRT 부위, 하이그로마이신 카세트, 3' FRT 부위, 3' loxP 부위 및 마우스 H-2D 유전자의 하부에 게놈 서열을 함유하는 3' 상동성 암을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 5' 상동성 암 서열은 내인성 마우스 H-2D 유전자의 49.8 kb 상류에서 마우스 게놈 서열에 걸쳐있으며 H-2D 리더 서열을 포함하고, 3' 상동성 암은 내인성 H-2D 유전자의 155.6 kb 하류에서 마우스 게놈 서열에 걸쳐있다.
유전자 표적화가 완료되면, ES 세포 또는 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 관심대상의 외인성 뉴클레오타이드 서열의 성공적인 혼입 또는 외인성 폴리펩타이드의 발현을 확인하기 위해 스크리닝한다. 다수의 기술이 당업자에게 공지되어 있으며, (이로 제한됨이 없이) 서던 블롯팅, 긴(long) PCR, 정량적 PCT(예: TAQMAN®을 이용하는 실시간 PCR), 형광 원위치(in situ) 하이브리드화, 노던 블롯팅, 유세포분석, 웨스턴 분석, 면역세포화학, 면역조직화학 등을 포함한다. 하나의 예에서, 관심대상의 유전자 변형을 보유한 비-사람 동물(예: 마우스)은 문헌[참조: Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659]에 기술된 대립유전자 검정의 변형을 이용하여 마우스 대립유전자의 상실 및/또는 사람 대립유전자의 수득을 스크리닝함으로써 동정할 수 있다. 유전적으로 변형된 동물에서 구체적 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 동정하는 기타 검정은 당업자에게 공지되어 있다.
본원은 또한, 비-사람 동물의 MHC I 유전자좌를 본원에서 기술되는 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 발현하도록 변형시키는 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 내인성 MHC I 유전자좌에서 마우스 MHC 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 MHC I 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하는 것을 포함하는, 마우스의 MHC I 유전자좌를 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 발현하도록 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 마우스 MHC I의 세포외 도메인의 뉴클레오타이드 서열은 사람 MHC I의 세포외 도메인의 뉴클레오타이드 서열로 대체된다. 마우스는 내인성 MHC I 유전자좌로부터 마우스 MHC I의 펩타이드 결합 도메인 또는 세포외 도메인을 발현하지 못할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 마우스 H-2K의 세포외 도메인의 뉴클레오타이드 서열이 사람 HLA-A2의 세포외 도메인의 뉴클레오타이드 서열로 대체됨으로써, 변형된 마우스 MHC I 유전자좌는 키메라 HLA-A2/H-2K 폴리펩타이드를 발현한다. 하나의 실시형태에서, 마우스 H-2D의 세포외 도메인의 뉴클레오타이드 서열이 사람 HLA-B27의 세포외 도메인의 뉴클레오타이드 서열로 대체됨으로써, 변형된 마우스 MHC I 유전자좌는 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 발현한다.
하나의 양상에서, 단일 세포에서 뉴클레오타이드 작제물로부터 키메라 HLA-A/H-2K 또는 HLA-B/H-2D 단백질을 발현시키는 것을 포함하는, 키메라 사람 HLA 제I 부류/비-사람 MHC 제I 부류 분자를 생성하는 방법이 제공되고, 여기서 상기 뉴클레오타이드 작제물은 HLA-A 또는 HLA-B 단백질의 α1, α2, 및 α3 도메인을 각각 암호화하고 비-사람 H-2K 또는 HLA-B 단백질, 예를 들면, 마우스 H-2K 또는 HLA-B 단백질의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 암호화하는 cDNA 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 뉴클레오타이드 작제물은 바이러스 벡터이고, 구체적 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 하나의 실시형태에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예: PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
하나의 양상에서, 키메라 사람 HLA 제I 부류/비-사람 MHC I 단백질(예: HLA-A/H-2K 단백질)을 발현하는 세포가 제공된다. 하나의 실시형태에서, 세포는 키메라 MHC 제I 부류 유전자를 포함하는 발현 벡터를 포함하고, 상기 키메라 MHC 제I 부류 유전자는 비-사람 H-2K 또는 H-2D 유전자, 예를 들면, 마우스 H-2K 또는 H-2D 유전자의 서열과 작동적으로 연결되어 융합된 사람 HLA-A 또는 HLA-B 유전자의 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 사람 HLA-A 또는 HLA-B 유전자의 서열은 HLA-A 또는 HLA-B 단백질의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 엑손을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 H-2K 또는 H-2D 유전자의 서열은 각각 H-2K 또는 H-2D 단백질의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 암호화하는 엑손을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예: PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
또한, 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물에 의해 생성되는, 사람 HLA-A 또는 HLA-B 단백질로부터의 α1, α2, 및 α3 도메인 및 비-사람, 예를 들면, 마우스, H-2K 또는 H-2D 단백질로부터의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 MHC 제I 부류 분자가 제공된다. 본원에서 기술되는 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 항-HLA-A 항체에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 디스플레이하는 세포는 항-HLA-A 항체를 사용하여 검출되고/되거나 선별될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 항-HLA-A2 항체에 의해 검출될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본원에서 기술되는 키메라 HLA-B/H-2D 폴리펩타이드는 항-HLA-B 항체에 의해 검출될 수 있고, 예를 들면, 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드는 항-HLA-B27 항체에 의해 검출될 수 있다.
비록 하기 실시예가, 게놈이 마우스 H-2K 또는 H-2D 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 각각 내인성 마우스 H-2K 유전자좌에서 사람 HLA-A2의 세포외 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 또는 내인성 마우스 H-2D 유전자좌에서 사람 HLA-B27의 세포외 도메인을 암호화하는 서열로의 대체를 포함하는 유전적으로 조작된 동물을 기술하지만, 당업자라면 유사한 전략을 이용하여 다른 마우스 MHC I 유전자좌(예: H-2L)를 이들의 상응하는 사람 HLA 유전자좌(예: HLA-C)로 대체시킬 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 게놈 내에 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 폴리펩타이드의 사람 부분이 또 다른 HLA 제I 부류 단백질로부터 유래되는, 비-사람 동물이 또한 제공된다.
또한, 다수의 MHC I 유전자좌에서의 대체도 제공된다. 따라서, 내인성 MHC I 유전자좌에 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드(들), 예를 들면, 키메라 사람/비-사람(예: 사람/설치류, 예를 들면, 사람/마우스) MHC I 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 1종 이상, 예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 비-사람 동물, 예를 들면, 설치류, 예를 들면, 마우스가 제공된다. 하나의 경우에서, 2개의 마우스 자매 염색체 17번 각각은 H-2K, H-2L 및 H-2D 유전자를 포함하는 MHC I 유전자좌를 함유하고, 따라서 하나의 양상에서, 각 자매 염색체는 이의 내인성 게놈 위치에 최대 3개의 키메라 사람/마우스 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비-사람 동물, 예를 들면, 마우스는 이의 내인성 MHC 유전자좌에 최대 6개의 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드(들), 예를 들면, 최대 6개의 키메라 사람/비-사람, 예를 들면, 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 최대 6개의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 다른 경우에서, 2개의 마우스 자매 염색체 17번 각각은 H-2K 및 H-2D 유전자를 포함하는 MHC I 유전자좌를 함유하고, 따라서 하나의 양상에서, 각 자매 염색체는 이의 내인성 게놈 위치에 최대 2개의 키메라 사람/마우스 폴리펩타이드를 암호화할 수 있고, 유전적으로 변형된 비-사람 동물, 예를 들면, 마우스는 최대 4개의 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 최대 4개의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본원에는, 내인성 MHC I 유전자좌에 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드(들), 예를 들면, 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상, 예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 마우스가 제공되고, 여기서 상기 키메라 폴리펩타이드(들)은 사람 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함하고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하고, 상기 마우스는 1종 이상, 예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드(들)을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 마우스 MHC I는 H-2D, H-2K 및 H-2L로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 사람 MHC는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C로부터 선택된다.
따라서, 본원에는 내인성 MHC I 유전자좌에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 2종의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스가 제공되고, 여기서 상기 2종의 뉴클레오타이드 서열은 키메라 HLA-A2/H-2K 및 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 마우스는 HLA-A2/H-2K 및 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 발현한다. 하나의 실시형태에서, HLA-A2/H-2K 및 HLA-B27/H-2D를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 내인성 H-2K 및 H-2D 유전자좌에 위치한다. 하나의 양상에서, 마우스는 어떠한 기능성 내인성 마우스 MHC I 폴리펩타이드도 발현하지 않는다. 다른 양상에서, 마우스는 내인성 마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 보유하고, 예를 들면, 기능성 마우스 MHC 폴리펩타이드(예: H-2L 폴리펩타이드)를 발현한다.
추가로, 본원에서는, 다수의 내인성 MHC 유전자좌에서의 대체를 포함하는 비-사람 동물, 예를 들면, 마우스, 예를 들면, 키메라 사람/비-사람, 예를 들면, 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 1종 이상, 예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 비-사람, 예를 들면, 마우스의 생성 방법이 제공된다. 염색체 17번상에서 다양한 MCH I 유전자좌들의 밀접한 연결로 인해, 일부 실시형태에서, 상기 방법은 유전자좌에서의 연속적 대체를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 방법은 ES 세포에서 제1 마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제1 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키는 단계, 상기 제1 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 발현하는 마우스를 생성시키는 단계, 상기 마우스로부터 ES 세포를 생성하는 단계, 상기 ES 세포에서 제2 마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제2 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키는 단계 및 2종의 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 발현하는 마우스를 생성하는 단계를 포함한다. 제3 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스는 2종의 키메라 MHC I 유전자를 포함하는 ES 세포에서 제3 마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 제3 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로의 대체를 실시함으로써, 유사한 방식으로 생성시킬 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 ES 세포에서 제1 마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제1 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시킨 다음, 동일한 ES 세포에서 제2 마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제2 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키고, 2종의 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 발현하는 마우스를 생성시키는 것을 포함하며, 3종의 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 포함하는 마우스를 동일한 ES 세포에서 생성시킬 수 있다. 연속적 대체에 의해 생성된 1종, 2종 또는 3종의 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 포함하는 마우스는 키메라 MHC I 서열에 대해 이형성접합성 또는 동형접합성일 수 있다. 4종, 5종 또는 6종의 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 포함하는 마우스는 각각 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2마리 동물을 육종하여, 하나의 실시형태에서 각각의 키메라 MHC I 서열에 대해 이형접합성인 동물을 생성시킴으로써 생성시킬 수 있다. 당업자라면 2종, 3종 또는 4종의 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 포함하는 마우스를 연속적 대체 대신에 육종에 의해 생성시킬 수 있도 있음을 이해할 것이고, 이러한 동물은 키메라 MHC I 서열에 대해 이형접합성일 수 있다(예를 들면, 각각의 자매 염색체 상에 상이한 키메라 유전자를 포함하는 마우스는 2종의 MHC 유전자 등에 대해 이형접합성일 것이다).
유전적으로 변형된 β2 마이크로글로불린 동물
본 발명은 일반적으로, 게놈 내에 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함함으로써 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 제공한다.
MHC 제I 부류 복합체의 β2 마이크로글로불린 또는 경쇄(또한, "β2M"로 약칭됨)는, 주로 MHC I α쇄를 안정화시키는 작용을 하는 비당화된 소형(12 kDa) 단백질이다. 사람 β2 마이크로글로불린 유전자는 리더 서열을 암호화하는 20개 N-말단 아미노산을 갖는 119개 아미노산의 단백질을 암호화한다. 성숙 단백질은 99개 아미노산을 포함한다. 유전자는 4개의 엑손을 포함하며, 제1 엑손은 5' 비해독 영역, 전체 리더 서열 및 성숙 폴리펩타이드의 제1의 2개의 아미노산을 포함하고; 제2 엑손은 성숙 단백질의 대부분을 암호화하고; 제3 엑손은 성숙 단백질의 마지막 4개의 아미노산 및 정지 코돈을 암호화하고; 제4 엑손은 3' 비-해독 영역을 포함한다[참조: Gussow et al. (1987) The β2-Microglobulin Gene. Primary Structure and Definition of the Transcriptional Unit, J. Immunol. 139:3131-38]. β2 마이크로글로불린은 MHC I과 비-공유적으로 결합된다. 비결합된 β2 마이크로글로불린은 체액, 예를 들면, 혈장에서 발견되며, 분비를 위해 신장으로 운반된다. 신장 기능이상은 β2 마이크로글로불린의 축적을 야기하며, 이는 병원성일 수 있으며(예: 투석 관련된 아밀로이드증); 축적된 단백질은 관절 및 결합 조직에서 아밀로이드 플라크와 유사한 필라멘트성 피브릴을 형성한다.
투석 관련된 아밀로이드증 이외에도, β2 마이크로글로불린은 다수의 다른 질환에도 연루되었다. 상승된 β2 마이크로글로불린 수준은 림프구성 암, 예를 들면, 비-호지킨 림프종 및 다발성 골수종에서 검출되었다[참조: 예를 들면, Shi et al. (2009) β2 마이크로글로불린: Emerging as a Promising Cancer Therapeutic Target, Drug Discovery Today 14:25-30]. 상승된 β2 마이크로글로불린 수준을 갖는 일부 다른 암은 유방암, 전립선암, 폐암, 신장암, 소화기암 및 비인두암을 포함한다. β2 마이크로글로불린의 과발현은 종양 성장 촉진 효과를 갖는 것으로 제안되었다 [참조: Shi et al. (2009) 상기 참조]. 또한, 최근에는 β2 마이크로글로불린이 상피의 중간엽으로의 전이를 유도하여 유방암, 전립선암, 폐암 및 신장암에서 암의 뼈 및 연조직 전이를 촉진한다는 것이 제시되었다[참조: Josson et al. (2011) β2 마이크로글로불린 Induces Epitelial to Mesenchymal Transition and Confers Cancer Lethality and Bone Metastasis in Human Cancer Cells. Cancer Res. 71(7): 1-11]. β2 마이크로글로불린은 비-전형적 MHC I 구성원인 혈색소증(HFE) 단백질 및 트랜스페린 수용체와 상호작용하고, 철 항상성을 조절한다[상기 참조]. 악성 암의 다른 특징(자가-재생, 혈관신생 증진, 치료에 대한 내성)에의 β2 마이크로글로불린의 관여는 당업계에서 널리 입증되어 있다.
β2 마이크로글로불린이 결핍된 마우스는 보고된 바 있다[참조: Koller et al. (1990) Normal development of mice deficient in β2m, MHC class I proteins, and CD8+ T cells, Science 248: 1227-1230]. 콜러(Koller) 등에 의해 보고된 바와 같이, 이들 마우스는 건강해 보이나, MHC 제I 부류 발현이 검출되지 않았다. 또한, 대부분의 T 세포 집단은 일부 조직에서는 정상적으로 보였으나, 다른 조직에서 현저한 CD8+ T 세포 감소가 관찰되었다. 이러한 MHC I 발현의 결여는 문헌[참조: Allen et al. ((1986) β2 마이크로글로불린 Is Not Required for Cell Surface Expression of the Murine Class I Histocompatibility Antigen H-2Db or of a Truncated H-2Db, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7447-7451]에 의해 입수된 이전 결과와 일치하지 않는다. 알렌(Allen) 등은 β2 마이크로글로불린이 결여된 세포가 H-2Db를 발현할 수 있기 때문에 β2 마이크로글로불린이 모든 MHC I 복합체의 세포 표면 발현에 절대적으로 필요하지 않다고 보고하였다. 그러나, 이들 세포에서 H-2Db의 기능이 아마도 손상되었을 수 있으며, H-2Db의 입체구조는 천연 단백질과 상이하였는데, 이것은 콜러와 동료들이 본래의 H-2Db에 대한 항체를 사용하여 이러한 단백질을 검출할 수 없었다는 것을 설명한다. 그러나, 보고에 따르면 β2 마이크로글로불린이 결여된 세포가 (정상 마우스로부터의 외인성 CD8+ T 세포를 포함하는) CD8+ T 세포에 대한 내인성 항원을 제시할 수 있고, 보고에 따르면, 효과적인 면역 반응을 지속하기 위해서 β2 마이크로글로불린이 필요하긴 하지만, 마우스에서 항원 시험감염(challenge)에 반응하여 높은 수준의 H-2d MHC 제I 부류-제한된 CD8+ CTL을 발달시키기 위해 β2 마이크로글로불린이 필요하지 않다[참조: Quinn et al. (1997) Virus-Specific, CD8+ Major Histocompatibility Complex Class I-Restricted Cytotoxic T Lymphocytes in Lymphocytic Choriomeningitis Virus-Infected β2-Microglobulin-Deficient Mice, J. Virol. 71:8392-8396]. 보고에 따르면, β2 마이크로글로불린 부재 하에 이러한 높은 수준의 T 세포 생성 능력이 H-2d MHC 제I 부류-제한된 반응으로 한정된다는 것이 중요하다. β2 마이크로글로불린이 결핍된 마우스는 다수의 극적인 특징, 예를 들면, 일부 기생충 질환에 대한 감수성 증가, 간염 감염에 대한 감수성 증가, 철 대사의 결함 및 손상된 육종 표현형을 갖는다고 보고되었다[참조: Cooper et al. (2007) An impaired breeding phenotype in mice with a genetic deletion of Beta-2 microglobulin and diminished MHC class I expression: Role in reproductive fitness, Biol. Reprod. 77:274-279].
무작위로 삽입된 전이유전자 상의 사람 β2 마이크로글로불린 뿐만 아니라 사람 HLA 제I 부류 분자(즉, HLA-B7)를 발현하는 마우스가 보고되었다[참조: Chamberlain et al. (1988) Tissue-specific and cell surface expression of human major histocompatibility complex class I heavy (HLA-B7) and light (β2-microglobulin) chain genes in transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7690-7694]. 사람 HLA 제I 부류의 발현은 간에서 현저한 감소를 갖는 내인성 제I 부류의 발현과 일치하였다[상기 참조]. 또한, 사람 β2 마이크로글로불린의 발현은 내인성 β2 마이크로글로불린과 일치하였으며, 사람 HLA 제I 부류 분자의 발현은 이중 유전자전이 마우스에서 10배 내지 17배 증가하였다[상기 참조]. 그러나, 저자들은 마우스 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌로 대체하는 것을 시도하지 않았다.
따라서, 게놈이 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)이 본원에 기술된다. 하나의 양상에서, 동물은 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린을 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 부분적으로는 사람이고 부분적으로는 비-사람인, 예를 들면 사람에 상응하는 일부 아미노산 및 비-사람 β2 마이크로글로불린에 상응하는 일부 아미노산을 포함하는 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 양상에서, 비-사람 동물은 내인성 비-사람 유전자좌로부터 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하지 않고 오직 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드만을 발현한다. 하나의 예에서, 비-사람 동물은 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 완전한 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하지 않고 오직 비-사람 내인성 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드의 일부만을 발현한다. 따라서, 다양한 실시형태에서, 동물은 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능성 비-사람 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 구체적 양상에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 위치된다. 하나의 양상에서, 동물은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 2개 카피의 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함한다. 다른 양상에서, 동물은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 1개 카피의 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함한다. 따라서, 동물은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린의 뉴클레오타이드 서열은 사람군에서 천연적으로 발견되는 β2 마이크로글로불린 서열 무리로부터 유도될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 유전적으로 조작된 비-사람 동물은 이의 점라인에 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 폴리펩타이드는 MHC I 단백질에 결합할 수 있다.
사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 전체 사람 β2 마이크로글로불린 유전자에 상응하는 핵산 잔기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 단백질의 아미노산 21-119(즉, 성숙한 사람 β2 마이크로글로불린에 상응하는 아미노산 잔기)에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 잔기를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 단백질의 아미노산 23번 내지 115번에 제시된 아미노산 서열, 예를 들면, 사람 β2 마이크로글로불린 단백질의 아미노산 23번 내지 119번에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 잔기를 포함할 수 있다. 사람 β2 마이크로글로불린의 핵산 및 아미노산 서열은 문헌[참조: Gussow et al. 상기 참조, 본원에서 참조로 인용됨]에 기술되어 있다.
따라서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 사람 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드의 아미노산 23번 내지 115번에 제시된 아미노산 서열, 예를 들면, 사람 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드의 아미노산 23번 내지 119번에 제시된 아미노산 서열, 예를 들면, 사람 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드의 아미노산 21번 내지 119번에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 사람 β2 마이크로글로불린은 사람 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드의 아미노산 1번 내지 119번을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 대안적으로, 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 엑손 2, 3 및 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 유전자의 정상적인 전사 및 해독이 가능하도록 작동적으로 연결된다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 사람 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 사람 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4 후의 약 267 bp에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 사람 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 약 2.8 kb를 포함한다.
따라서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 사람 β2 마이크로글로불린의 엑손 2 내지 엑손 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면, 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 상응하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드는 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4 후의 약 267 bp에 상응하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 다른 구체적 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 폴리펩타이드는 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 약 2.8 bp를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 4가 5' 비해독 영역을 포함하기 때문에, 사람 또는 사람화된 폴리펩타이드는 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 및 3을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다.
비록 유전적으로 조작된 동물을 생성하기 위한 특정 핵산 및 아미노산 서열이 본 실시예에 기술되지만, 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 또는 유전자 코드의 축퇴로 인해 본원에서 기술되는 서열과 상이한 서열도 또한 제공된다는 것을 당업자는 알 수 있을 것이다.
따라서, 사람 β2 마이크로글로불린 서열과 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 사람 β2 마이크로글로불린 서열을 발현하는 비-사람 동물이 제공된다. 구체적 실시형태에서, β2 마이크로글로불린 서열은 본 실시예에서 기술되는 사람 β2 마이크로글로불린 서열과 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 하나의 실시형태에서, 사람 β2 마이크로글로불린 서열은 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 사람 β2 마이크로글로불린 서열은 하나 이상의 비-보존적 치환을 포함한다.
또한, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 또한 포함하는 비-사람 동물이 제공된다. 따라서, 구체적 실시형태에서, 비-사람 동물은 이의 게놈 내에 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 서열은 비-사람 β2 마이크로글로불린의 엑손 1 및 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함한다. 따라서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1 및 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4(예: 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 및 3)에 의해 암호화된다.
키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물과 유사하게, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물은 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소(예: 암소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰담비, 영장류(예:마모셋, 붉은털 원숭이)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-사람 동물은 포유동물이다. 특정 실시형태에서, 비-사람 동물은 뮤린, 예를 들면, 설치류(예: 마우스 또는 래트)이다. 하나의 실시형태에서, 동물은 마우스이다.
따라서, 일부 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 마우스가 제공된다. 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드(예: 사람 또는 실질적으로 사람 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 마우스가 제공된다. 일부 실시형태에서, 마우스는 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 내인성 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드(예: 기능성 내인성 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드)를 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 조작된 마우스는 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1 및 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 마우스는 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현한다.
하나의 양상에서, 이종 β2 마이크로글로불린 서열을 포함하는 변형된 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌가 제공된다. 하나의 실시형태에서, 이종의 β2 마이크로글로불린 서열은 사람 또는 사람화된 서열이다.
하나의 실시형태에서, 변형된 유전자좌는 설치류 유전자좌이다. 구체적 실시형태에서, 설치류 유전자좌는 마우스 또는 래트 유전자좌로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 유전자좌는 적어도 하나의 사람 β2 마이크로글로불린 암호화 서열로 변형된다.
하나의 실시형태에서, 이종 β2 마이크로글로불린 서열은 내인성 조절 요소, 예를 들면, 내인성 프로모터 및/또는 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 구체적 실시형태에서, 이종 β2 마이크로글로불린 서열은 사람 서열이고, 사람 서열은 내인성 프로모터 및/또는 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된다.
하나의 양상에서, 내인성 프로모터 및/또는 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 사람 서열을 포함하는 변형된 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌가 제공된다.
다양한 양상에서, 유전적으로 변형된 비-사람 동물 또는 비-사람 동물로부터 유도되는 세포, 배아, 또는 조직에 의해 발현되는 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린은 내인성 및/또는 사람 β2 마이크로글로불린의 모든 기능성 양상을 보존한다. 예를 들면, 바람직하게는 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린은 MHC I 폴리펩타이드(예: 내인성 비-사람 또는 사람 MHC I 폴리펩타이드)의 α쇄에 결합한다. 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 임의의 다른 분자, 예를 들면, 내인성 비-사람 및/또는 사람 β2 마이크로글로불린과 결합하는 수용체, 앵커 또는 신호전달 분자(예: HFE 등)와 결합하거나, 이를 동원하거나, 그렇지 않으면 이와 연합할 수 있다.
유전적으로 변형된 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트) 이외에도, 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물로부터 유래되고 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열, 즉, 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 조직 또는 세포가 또한 제공된다. 하나의 실시형태에서, 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 서열이다. 바람직하게는, 세포는 유핵 세포이다. 세포는 MHC I 복합체를 발현하는 것으로 공지된 임의의 세포, 예를 들면, 항원 제시 세포일 수 있다. 상기 세포에 의해 발현되는 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 내인성 비-사람 MHC I(예: 설치류 MHC I)과 상호작용하여 기능성 MHC I 복합체를 형성할 수 있다. 생성된 MHC I 복합체는 T 세포, 예를 들면, 세포독성 T 세포과 상호작용할 수 있다. 따라서, 본원에서 기술되는 비-사람 동물로부터의 세포 및 T 세포의 시험관내 복합체도 제공된다.
또한, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 서열 및 추가의 사람 또는 사람화된 서열, 예를 들면, 본원에 기술되는 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 포함하는 비-사람 세포가 제공된다. 이러한 경우에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는, 예를 들면, 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드와 상호작용할 수 있고, 기능성 MHC I 복합체가 형성될 수 있다. 일부 양상에서, 이러한 복합체는 T 세포, 예를 들면, 사람 또는 비-사람 T 세포 상의 TCR과 상호작용할 수 있다. 따라서, 본원에서 기술되는 비-사람 동물로부터의 세포 및 사람 또는 비-사람 T 세포의 시험관내 복합체도 제공된다.
본 기술의 다른 양상은 본원에서 기술되는 바와 같은 이종의 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열을 포함하는 설치류 배아(예: 마우스 또는 래트 배아)이다. 하나의 실시형태에서, 배아는 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열을 포함하는 ES 공여자 세포 및 숙주 배아 세포를 포함한다. 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열이다.
본 발명은 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물의 염색체 또는 이의 단편(예를 들면, 상기 염색체 또는 이의 단편은 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다)을 포함하는 비-사람 세포를 또한 포함한다. 비-사람 세포는 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물의 핵을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 세포는 핵 전이의 결과로서 염색체 또는 이의 단편을 포함한다.
하나의 양상에서, 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열을 포함하는 비-사람 유도성 다능성 세포가 제공된다. 하나의 실시형태에서, 유도된 다능성 세포는 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물로부터 유도된다. 하나의 실시형태에서, 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열은 사람 또는 사람화된 유전자 또는 서열이다.
또한, 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물의 세포로부터 유도되는 하이브리도마 또는 쿼드로마가 제공된다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 동물은 마우스 또는 래트이다.
본원은 또한 본원에서 기술되는 유전적으로 조작된 비-사람 동물(예: 유전적으로 조작된 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 의해 게놈이 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 동물이 생성된다. 하나의 양상에서, 상기 방법에 의해 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 게놈을 갖는 유전적으로 조작된 마우스가 생성된다. 일부 예에서, 마우스는 내인성 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능성 마우스 β2 마이크로글로불린을 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은, 실시예에서 기술되는 바와 같이, VELOCIMOUSE® 기술을 이용하여 표적화 작제물을 생성하고, 상기 작제물을 ES 세포 내로 도입시키고, 표적화된 ES 세포 클론을 VELOCIGENE® 기술을 이용하여 마우스 배아 내로 도입시키는 것을 이용한다. 하나의 실시형태에서, ES 세포는 129 마우스 스트레인과 C57BL/6 마우스 스트레인의 혼합형이고, 다른 실시형태에서, ES 세포는 BALB/c 마우스 스트레인과 129 마우스 스트레인의 혼합형이다.
또한, 유전적으로 조작된 비-사람 동물을 생성하는데 사용되는 뉴클레오타이드 작제물이 제공된다. 뉴클레오타이드 작제물은 5' 및 3' 비-사람 상동성 암, 사람 β2 마이크로글로불린 서열을 포함하는 사람 DNA 단편 및 재조합 부위가 플랭킹된 선별 카세트를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 사람 DNA 단편은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 인트론과 엑손 둘 다를 포함하는 게놈 단편이다. 하나의 실시형태에서, 비-사람 상동성 암은 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 대해 상동성이다. 게놈 단편은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3, 및 4를 포함할 수 있다. 하나의 예에서, 게놈 단편은, 5'로부터 3'로 사람 β2 마이크로글로불린 서열의 엑손 2, 인트론, 엑손 3, 인트론, 및 엑손 4 모두를 포함한다. 선별 카세트는 β2 마이크로글로불린 암호화 영역 밖의 작제물 내의 어디에라도 위치될 수 있으며, 예를 들면, 선별 카세트는 사람 β2 마이크로글로불린의 엑손 4의 3'에 위치될 수 있다. 5' 및 3' 비-사람 상동성 암은 각각 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 5' 및 3'에 게놈 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 5' 및 3' 비-사람 상동성 암은 각각 내인성 비-사람 유전자의 엑손 2의 5' 및 엑손 4의 3'에 게놈 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)의 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 본원에서 기술되는 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하도록 변형시키는 방법에 관한 것이다. 마우스의 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하도록 변형시키는 한 가지 방법은 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서 마우스 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 하나의 실시형태에서, 마우스는 내인성 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능성 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 일부 구체적 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
유전적으로 변형된 MHC I/β2 마이크로글로불린 동물
다양한 실시형태에서, 본 발명은 일반적으로 게놈 내에 사람 또는 사람화된 MHC I 및 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드 둘 다를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 제공하고, 따라서 상기 동물은 사람 또는 사람화된 MHC I 및 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드 둘 다를 발현한다.
기능성 차이는 혼합된 사람/비-사람 시스템 성분들을 사용하는 것에서 발생한다. HLA 제I 부류는 마우스 제I 부류보다 더 단단히 β2 마이크로글로불린에 결합한다[참조: Bernabeu (1984) β2-microgobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells, Nature 308:642-645]. 기능성 차이를 없애고자 하는 시도가 특정한 사람화된 MHC 마우스를 작제하는데 반영된다. 사람 β2-마이크로글로불린의 C-말단에 링커를 통해 N-말단에 부착된, 사람 HLA-A2.1의 α1 및 α2 및 마우스 H-2Db의 α3를 갖는 무작위로 통합된 사람 HLA-A2.1/HLA-DR1 키메라 전이유전자를 발현하는 (마우스 β2 마이크로글로불린 KO 백그라운드에서의) H-2 제1 부류 및 제2 부류 녹아웃 마우스가 개발되었다[참조: 예를 들면, Pajot et al. (2004) A mouse model of human adaptive immune functions: HLA-A2.1-/HLA-DR1-transgenic H-2 class I-/class II-knockout mice, Eur. J. Immunol. 34:3060-3069]. 보고에 의하면, 이들 마우스는 B형 간염 바이러스에 대해 항원-특이적 항체 및 CTL 반응을 발생시키는 반면, 단지 HLA-A2.1 또는 H-2 제I 부류에 대해서만 유전자전이된 마우스/제II 부류 녹아웃 마우스는 그렇지 않다. 단지 상기 유전자에 대해 유전자전이된 마우스의 결핍은, 아마도 MHC 녹아웃 마우스가 이용할 수 없는 옵션인, 임의의 전이유전자를 피하기 위해 내인성 제I 부류 및/또는 제II 부류 유전자를 이용하는 이러한 마우스의 능력으로부터 비롯되는 듯 하다. 그러나, 마우스는 아마도 마우스 β2 마이크로글로불린 녹아웃 마우스 배경으로의 육종으로 인해 적어도 H-2Db를 발현할 수 있다[참조: Pajot et al. 상기 참조; 외견상 분명히 온전한 내인성 제1 부류 및 제II 부류 유전자좌를 포함하였다].
보고에 의하면, 사람 β2 마이크로글로불린과의 키메라 융합체의 세포 표면 발현은 내인성 MHC 발현보다 낮지만, 생존가능성/NK 사멸율은 보고되지 않았으며, NK 자가-사멸율도 보고되지 않았다[참조: Pajot et al. 상기 참조]. CD8+ T 세포수에 있어서 MHC 제I 부류-결핍 β2-마이크로글로불린 녹아웃 마우스에 비해서 약간의 개선이 관측되었다(β2 KO 마우스에서의 0.6 내지 1%와 비교해, 총 비장세포의 2 내지 3%). 그러나, T 세포 가변 영역 사용은 BV 5.1, BV 5.2, 및 BV 11 유전자 절편에 대해 변경된 프로파일을 나타냈다. 비록 단지 하나의 항원으로만 면역화된 적어도 2마리의 마우스가 항원 중 어느 하나를 갖는 세포를 사멸시켰지만(이는 NK 세포 억제의 결여 또는 NK 세포 선택성의 결여에 기인할 수 있다), 보고에 의하면 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응 둘 다는 마우스를 면역화시키기 위해 사용된 적합한 B형 간염 항원으로 제한되었다.
상술한 바와 같이, 사람 MHC I 및 사람 β2 마이크로글로불린 둘 다에 대해 유전자전이된 마우스는, 키메라 MHC I/β2 마이크로글로불린 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 상기 MHC I 및 β2 마이크로글로불린 부분은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 함유되어 MHC I α쇄 및 β2 마이크로글로불린이 서로 공유적으로 연결되고 이로써 세포 표면에 테더링된다(tethered). 게놈 내에 2개의 독립적인 뉴클레오타이드 서열(하나는 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이고, 다른 하나는 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이다)을 포함하는 마우스가 제공된다. 본원에서 제공되는 마우스는 자연에 존재하는 MHC I 복합체와 매우 많이 유사한 MHC I 복합체를 발현할 것이며, MHC I α쇄와 β2 마이크로글로불린은 MHC I α쇄와 비공유적으로 결합하는 β2 마이크로글로불린이 2개의 분리된 폴리펩타이드 상에 제공된다.
따라서, 본원은 게놈 내에 사람 또는 사람화된 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물을 제공한다. 하나의 양상에서, 게놈 내에 (a) 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 MHC I(예: HLA-A, HLA-B, 또는 HLA-C; 예를 들면, HLA-A2 또는 HLA-B27)의 펩타이드 결합 도메인 또는 세포외 도메인을 포함한다) 및 (b) 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물을 제공한다.
제1 뉴클레오타이드 서열은, 동물이 MHC I 유전자좌에서 내인성 MHC I 유전자 전체 또는 일부(예: 펩타이드 결합 도메인 또는 세포외 도메인을 암호화하는 부분)의 상응하는 사람 MHC I 서열로의 대체를 이의 게놈 내에 포함하도록, 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌에 위치될 수 있다. 따라서, 동물은 내인성 MHC I 유전자좌에 사람 MHC I(예: HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C, 예를 들면, HLA-A2 또는 HLA-B27)의 세포외 도메인 및 내인성 비-사람 MHC I(예: H-2K, H-2D, H-2L, 예를 들면, H-2K 또는 H-2D)의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 하나의 양상에서, 동물은 마우스이며, 제1 뉴클레오타이드 서열은 사람 HLA-A2(예: HLA-A2.1)의 세포외 도메인 및 마우스 H-2K(예: H-2Kb)의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 동물은 마우스이며, 제1 뉴클레오타이드 서열은 사람 HLA-B27의 세포외 도메인 및 마우스 H-2D(예: H-2D1)의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
제2 뉴클레오타이드 서열은, 동물이 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자 전체 또는 일부의 상응하는 사람 β2 마이크로글로불린 서열로의 대체를 이의 게놈 내에 포함하도록, 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 위치될 수 있다. 제2 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제2 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 서로 작동적으로 연결된다. 제2 뉴클레오타이드 서열은 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1의 서열을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 양상에서, 동물은 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌로부터 기능성 MHC I을 발현하지 않으며(예를 들면, 내인성 MHC I의 기능성 펩타이드 결합 도메인 또는 기능성 세포외 도메인을 발현하지 않는다), 하나의 양상에서, 동물은 내인성 비-사람 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능성 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 일부 양상에서, 동물은 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 MHC I 유전자좌 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌 둘 다에 대해 동형접합성이다. 다른 양상에서, 동물은 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 MHC I 유전자좌 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌 둘 다에 대해 이형접합성이다.
바람직하게는, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 발현 제어 요소(예: 프로모터, 인핸서, 사일런서 등)에 작동적으로 연결된다.
본원에 포함되는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열(및 이들이 암호화하는 폴리펩타이드)의 다양한 다른 실시형태들은 본 명세서 전반에 걸쳐 기술되는 실시형태들, 예를 들면, 유전적으로 조작된 MHC I 동물 및 유전적으로 조작된 β2 마이크로글로불린 동물과 관련된 부분에서 기술되는 실시형태들로부터 쉽게 이해될 수 있다.
하나의 양상에서, 본원은 게놈 내에 (a) 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드(구체적으로, HLA-A2/H-2K 또는 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드)를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열(여기서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분은 사람 HLA-A2의 세포외 도메인을 포함하고 마우스 부분은 마우스 H-2K의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다) 및 (b) 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 상기 뉴클레오타이드 서열은 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다)을 포함하는 마우스가 제공되고, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 H-2K 유전자좌에 위치되고, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 위치된다. 하나의 실시형태에서, 마우스는 각각의 내인성 유전자좌로부터 기능성 H-2K 및 마우스 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 하나의 실시형태에서, 마우스는 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드 둘 다를 발현한다.
하기 실시예에 제시한 바와 같이, 사람 또는 사람화된 MHC I 및 β2 마이크로글로불린 둘 다를 공동발현하도록 유전적으로 조작된 동물은, 단독의 MHC I에 대해서만 사람화된 동물과 비교하여 세포 표면 상에 증가된 키메라 MHC 제I 부류 발현을 나타냈다. 일부 실시형태에서, 사람 또는 사람화된 MHC I 및 β2 마이크로글로불린의 공동발현은 사람 또는 사람화된 MHC I의 세포 표면 발현을 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 부재 하의 사람 또는 사람화된 MHC I 발현보다 약 10% 초과, 예를 들면, 약 20% 초과, 예를 들면, 약 50% 이상, 예를 들면 70% 증가시킨다.
또한, 본원은 게놈이 본원에서 기술되는 바와 같은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 래트 또는 마우스)을 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 게놈이 본원에서 기술되는 제1 뉴클레오타이드 서열(즉, 사람 또는 사람화된 MHC I 서열)을 포함하는 제1의 유전적으로 조작된 비-사람 동물을 생성시키고, 게놈이 본원에서 기술되는 제2 뉴클레오타이드 서열(즉, 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 서열)을 포함하는 제2의 유전적으로 조작된 비-사람 동물을 생성시키고, 제1 및 제2 동물을 육종하여, 게놈이 뉴클레오타이드 서열 둘 다를 함유하는 자손을 수득하는 것을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 제1 및 제2 동물은 각각 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열에 대해 이형접합성이다. 하나의 실시형태에서, 제1 및 제2 동물은 각각 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열에 대해 동형접합성이다. 하나의 실시형태에서, 제1 및 제2 동물은 내인성 비-사람 유전자좌를 각각 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열로 대체시키는 것을 통해 생성된다. 하나의 양상에서, 제1 및 제2 동물은 VELOCIGENE® 기술을 통해 생성된 작제물을 이용하고, 이러한 작제물을 보유한 표적화된 ES 세포 클론을 VELOCIMOUSE® 방법을 통해 배아(예: 설치류 배아, 예를 들면, 마우스 또는 래트 배아) 내로 도입하는 것을 통해서 생성된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 게놈 내에 1종 이상(예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종) 키메라 사람/비-사람(예를 들면, 키메라 사람/마우스) MHC I 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들) 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)를 제공한다. 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드(들) 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드의 다양한 양상은 본 명세서 전반에 걸쳐 개시되어 있으며 본 개시내용으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 1종 이상(예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종) 키메라 사람/비-사람(예를 들면, 키메라 사람/마우스) MHC I 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들) 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비-사람 동물을 생성하는 방법도 또한 본원에 제공된다.
유전적으로 변형된 동물의 이용
다양한 실시형태에서, 본원에서 기술되는 유전적으로 변형된 비-사람 동물은 세포 표면에 사람 또는 사람화된 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린을 갖는 APC를 생성하며, 그 결과, 복합체의 실질적으로 모든 성분들이 사람 또는 사람화되기 때문에, 사람-유사 방식으로 CTL에 대한 에피토프로서 세포질 단백질로부터 유래된 펩타이드를 제시한다. 본 발명의 유전적으로 변형된 비-사람 동물은 사람화된 동물에서 사람 면역계의 기능을 연구하고; 예를 들면, 백신 개발에 사용하기 위해, 면역 반응을 유도하는 항원 및 항원 에피토프(예: T 세포 에피토프, 예를 들면, 특유의 사람 암 에피토프)를 동정하고; 예를 들면, 적응 T 세포 치료요법에 사용하기 위해, 사람 병원체 또는 암 항원에 대한 고 친화성 T 세포(즉, 사람 MHC I 복합체의 상황에서 항원에 고 친화성으로 결합하는 T 세포)를 동정하고; 백신 후보물 및 다른 백신 전략들을 평가하고; 사람 자가면역을 연구하고; 사람 감염성 질환을 연구하고; 사람 MHC 발현에 기초한 보다 우수한 치료 전략을 고안하는데 사용될 수 있다.
MHC I 복합체는 펩타이드에 결합하고 세포 표면에 이들을 제시한다. 일단 이러한 복합체의 상황에서 펩타이드가 표면에 제시되면, 펩타이드는 T 세포에 의해 인식될 수 있다. 예를 들면, 펩타이드가 병원체 또는 다른 관심대상의 항원(예: 종양 항원)으로부터 유래되는 경우, T 세포 인식은 T 세포 활성화, 제시된 펩타이드 서열을 보유한 세포의 대식구 사멸 및 제시된 서열에 결합하는 항체의 B 세포 활성화를 야기할 수 있다.
T 세포는 펩타이드-결합 MHC 제I 부류 엑토도메인 및 T 세포의 CD8 엑토도메인을 통해 MHC I 복합체 발현 세포와 상호작용한다. MHC 제I 부류 분자에 결합된 적합한 항원을 갖는 APC와 접한 CD8+ T 세포는 세포독성 T 세포가 될 것이다. 따라서, MHC 제I 부류의 상황에서 T 세포 수용체에 고 친화성으로 결합하는 항원은 사람 병원체에 대한 치료제를 개발하는데 있어 잠재적으로 중요하다. 그러나, 사람 및 마우스 MHC 복합체는 항원을 서로 상이하게 인식하기 때문에, 예를 들면, 마우스 MHC I은 동일한 항원을 인식할 수 없거나 사람 MHC I과 다른 에피토프를 제시할 수 있기 때문에, 마우스 MHC I의 상황에서의 항원의 제시는 사람 질환과 단지 약간만 관련된다. 따라서, 사람 병원체에 대한 가장 관련 있는 데이터는 사람 MHC I에 의한 항원 에피토프의 제시를 연구함으로써 수득된다.
따라서, 다양한 실시형태에서, 본 발명의 유전적으로 조작된 동물은 특히, 사람에서 면역 반응을 개시하는 항원의 능력을 평가하고, 다양한 항원을 생성하고 사람 백신 개발에 사용될 수 있는 특정 항원을 동정하는데 유용하다.
하나의 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 펩타이드 서열을 포함하는 분자에 노출시켜 비-사람 동물이 면역 반응을 일으키도록 하고, 본원에서 기술되는 바와 같은 키메라 사람/비-사람 MHC I 또는 (키메라 사람/비-사람 MHC I 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린을 포함하는) 사람화된 MHC I 복합체에 의해 제시된 펩타이드의 서열에 결합하는 세포를 상기 비-사람 동물에서 검출하는 것을 포함하는, 상기 펩타이드 서열의 사람에서의 항원성을 측정하는 방법이 제공된다.
하나의 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 펩타이드에 노출시켜 비-사람 동물이 면역 반응을 일으키도록 하고, 본원에서 기술되는 바와 같은 키메라 사람/비-사람 MHC 제I 부류 분자에 의해 펩타이드의 서열에 결합하는 세포를 상기 비-사람 동물에서 검출하는 것을 포함하여, 상기 펩타이드가 세포성 면역 반응을 일으키는지의 여부를 측정하는 방법이 제공된다. 하나의 실시형태에서, 노출 후의 비-사람 동물은 펩타이드에 결합하는 MHC 제I 부류-제한된 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)를 포함한다. 하나의 실시형태에서, CTL은 펩타이드를 보유한 세포를 사멸시킨다.
하나의 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물을 추정상 CTL 에피토프를 포함하는 항원에 노출시켜 비-사람 동물이 면역 반응을 일으키도록 하고, 상기 비-사람 동물로부터 상기 에피토프에 결합하는 MHC 제I 부류-제한된 CD8+ CTL을 단리하고, MHC 제I 부류-제한된 CD8+ CTL에 의해 결합된 에피토프를 동정하는 것을 포함하는, 사람 CTL 에피토프의 동정 방법이 제공된다.
하나의 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 비-사람 동물(또는 이의 MHC 제I 부류-발현 세포)을 관심대상의 폴리펩타이드를 포함하는 분자에 노출시키고, 관심대상의 펩타이드에 결합하는 키메라 사람/비-사람 제I 부류 분자를 발현하는 비-사람 동물의 세포를 단리하고, 상기 세포를 HLA 제I 부류-제한된 세포독성을 수행할 수 있는 사람 림프구에 노출시키고, 펩타이드-유도된 세포독성을 측정하는 것을 포함하는, 사람 세포에 의한 제시 및 사람 림프구(예: 사람 T 세포)에 의한 결합이 펩타이드-함유 세포에 대한 세포독성을 초래하는 HLA 제I 부류-제한된 펩타이드의 동정 방법 제공된다.
하나의 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스에 추정상 항원을 노출시켜 마우스가 면역 반응을 일으키도록 하고, HLA-A-제한된 분자에 의해 결합되는 항원을 동정하는 것을 포함하여, 사람에서 세포독성 T 세포 반응을 생성하는 항원을 동정하는 방법이 제공된다.
하나의 양상에서, 항원은 세균 또는 바이러스 표면 또는 외피 단백질을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원은 사람 종양 세포 표면 상의 항원을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원은 사람에서 사용하기 위한 추정상 백신을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항원은 사람에서 항체를 생성하는 사람 에피토프를 포함한다. 다른 실시형태에서, 항원은 에피토프/MHC I 복합체를 표적화하는 고 친화성 CTL을 생성하는 사람 에피토프를 포함한다.
하나의 양상에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스를 추정상 항원에 노출시키고, 상기 마우스에서 항원-특이적 HLA 제1 부류-제한된, 예를 들면, HLA-A-제한된 또는 HLA-B-제한된(예를 들면, HLA-A2-제한된 또는 HLA-B27-제한된) 면역 반응을 측정하는 것을 포함하는, 추정상 항원이 사람 면역계에 노출시 HLA 제1부류-제한된 면역 반응을 생성하는 에피토프를 함유하는지의 여부를 측정하는 방법이 제공된다.
하나의 실시형태에서, 추정상 항원은 생물약제 또는 이의 단편, 비-자가 단백질, 비-자가 세포의 표면 항원, 종양 세포의 표면 항원, 세균 또는 효모 또는 진균 세포의 표면 항원, 바이러스의 표면 항원 또는 외피 단백질로부터 선택된다.
또한, 본원에서 기술되는 유전적으로 조작된 비-사람 동물은 관심대상의 항원, 예를 들면, 종양 또는 또 다른 질병 항원을 인식하는 T 세포 수용체, 예를 들면 고 친화성 T 세포 수용체를 동정하는데 유용할 수 있다. 상기 방법은 본원에서 기술되는 비-사람 동물을 항원에 노출시켜 비-사람 동물이 항원에 대한 면역 반응을 일으키도록 하고, 비-사람 동물로부터 사람 또는 사람화된 MHC I에 의해 제시되는 항원에 결합하는 T 세포 수용체를 포함하는 T 세포를 분리하고, T 세포 수용체의 서열을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
하나의 양상에서, 사람화된 MHC I α1, α2, 및 α3 도메인(예: HLA-A2 또는 HLA-B27 α1, α2, 및 α3 도메인)을 포함하는 마우스를 사람 종양 항원에 노출시켜 마우스가 면역 반응을 일으키도록 하고, 상기 마우스로부터 약 1nM 이하의 KD로 사람 종양 항원에 결합하는 T 세포 수용체 가변 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 단리하는 것을 포함하는, 사람 종양 항원에 대한 고 친화성을 갖는 T 세포 수용체 가변 도메인을 동정하는 방법이 제공된다.
하나의 실시형태에서, 마우스는 내인성 마우스 T 세포 수용체 가변 영역 유전자 유전자좌에서 다수의 비재배열된 사람 T 세포 수용체 가변 영역 유전자 절편으로의 대체를 추가로 포함하며, 상기 비재배열된 사람 T 세포 수용체 가변 영역 유전자 절편은 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 키메라 사람-마우스 T 세포 수용체 유전자를 암호화하도록 재조합된다. 하나의 실시형태에서, 마우스는 사람 CD8 전이유전자를 포함하고, 마우스는 기능성 사람 CD8 단백질을 발현한다.
종양 항원에 대해 고 친화성을 갖는 T 세포 수용체는 세포-기반 요법에 유용하다. 종양 항원에 대해 매우 높은 친화성을 갖는 T 세포(CD8이 α3에 결합하지 못함에도 불구하고 항원을 인식하는 T 세포 클론)만을 선별하기 위해, 사람 종양 항원에 대해 고 친화성을 갖는 T 세포 집단을 사람 T 세포를 α3 서브유니트에 대한 CD8 결합을 최소화하도록 돌연변이된 HLA-A2에 노출시킴으로써 생성시켰다[참조: Pittet et al. (2003) α3 Domain Mutants of Peptide/MHC Class I Multimers Allow the Selective Isolation of High Avidity Tumor-Reactive CD8 T Cells, J. Immunol. 171:1844-1849]. 비-사람 동물 및 비-사람 동물의 세포는 T 세포 수용체에 고 친화성으로 결합하거나 T 세포 수용체를 보유한 림프구를 활성화시키는 사람 HLA 제I 부류와의 복합체를 형성할 펩타이드를 동정하는데 유용하다.
T 세포에 대한 항원/HLA 제I 부류 결합 또는 T 세포의 활성화는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 측정될 수 있다. 펩타이드-특이적 APC-T 세포 결합 및 활성화는 측정가능하다. 예를 들면, 보고에 따르면, HLA-A2를 발현하는 항원-제시 세포의 T 세포 진입기전(engagement)은 PIP2가 면역시냅스에 축적되도록 하는 반면, 가교결합 MHC 제I 부류 분자는 그렇지 않다[참조: Fooksman et al. (2009) Cutting Edge: Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Concentration at the APC Side of the Immunological Synapse Is Required for Effector T Cell Function, J. Immunol. 182:5179-5182].
TCR을 보유한 림프구와 제I 부류-발현 APC의 상호작용의 기능성 결과도 또한 측정가능하며, 림프구에 의한 세포 사멸을 포함한다. 예를 들면, 보고에 따르면 CD8+ CTL에 의한 HLA-A2의 α2 서브유니트 상의 접촉점이 Fas-독립적 사멸에 대한 신호를 발생시킨다. HLA-A2-발현 Jurkat 세포는 세포질 도메인에 대한 어떠한 명백한 의존 없이도, (결정학 연구로부터) CD8에 접촉하는 것으로 공지된 HLA-A2 분자 상의 에피토프에서 (항체에 의해) 접촉되는 경우, 세포자멸한다[참조: Pettersen et al. (1998) The TCR-Binding Region of the HLA Class I α2 Domain Signals Rapid Fas-Independent Cell Death: A Direct Pathway for T Cell-Mediated Killing of Target Cells? J. Immunol. 160:4343-4352]. CD8+ CTL의 CD8과의 HLA-A2 α2 접촉에 의해 유도되는 신속한 사멸은, 홀로 아폽토시스(apoptosis)를 유도할 수 있는 TCR-독립적 α3 도메인-매개성 사멸과 구별하여 [참조: Woodle et al. (1997) Anti-human class I MHC antibodies induce apoptosis by a pathway that is distinct from the Fas antigen-mediated pathway, J. Immunol. 158:2156-2164], 주로 Fas-독립적 HLA-A2-매개성 경로 때문일 수 있다고 가정되었다[상기 참조].
MHC I의 상황에서 펩타이드를 나타내는 APC와 T 세포 간의 상호작용 결과는 또한 T 세포 증식 검정으로 측정될 수 있다. 대안적으로, 이는 통상적으로 면역 반응 활성화와 연관된 사이토킨 방출을 측정함으로써 결정될 수 있다. 하나의 실시형태에서, IFNγ ELISPOT이 CD8+ T 세포 활성화를 모니터링하고 정량하는데 사용될 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같이, CD8+ T 세포 활성화는 CD8의 MHC I에 대한 종-특이적 결합 때문에 본원에서 기술되는 유전적으로 변형된 비-사람 동물에서 방해될 수 있다. 종-특이적 CD8 상호작용이 요망되는 실시형태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 유전적으로 변형된 동물(예: 설치류, 예를 들면, 마우스 또는 래트)의 세포는 사람 세포, 예를 들면, 사람 CD8-함유 세포, 예를 들면, 사람 T 세포에(예를 들면, 시험관내에서) 노출된다. 하나의 실시형태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스의 MHC 제I 부류-발현 세포는 사람 CD8 및 T 세포 수용체를 포함하는 T 세포에 시험관내에서 노출된다. 구체적 실시형태에서, T 세포는 사람 T 세포이다. 하나의 실시형태에서, 마우스의 MHC 제I 부류-발현 세포는 키메라 사람/마우스 MHC I 또는 (사람 β2 마이크로글로불린을 포함하는) 사람화된 MHC I 복합체에 결합된 펩타이드를 포함하고, T 세포는 사람 T 세포이며, 펩타이드-디스플레이 마우스 세포에 결합하는 T 세포의 능력이 측정된다. 하나의 실시형태에서, 펩타이드-디스플레이 마우스 세포에 의한 사람 T 세포의 활성화가 측정된다. 하나의 실시형태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 마우스 또는 마우스 세포를 관심대상의 항원에 노출시키고, (아마도 사람 또는 사람화된 MHC I와의 복합체에서 항원으로부터 유래된 펩타이드를 보유하는) 마우스 또는 마우스 세포로부터의 세포를 사람 T 세포에 노출시키고, 사람 T 세포의 활성화를 측정하는 것을 포함하는, 펩타이드-디스플레이 세포에 의한 사람 T 세포의 활성화를 측정하는 시험관내 방법이 제공된다. 하나의 실시형태에서, 상기 방법은 사람 병원체 또는 신생물의 T 세포 에피토프를 동정하는데 사용된다. 하나의 실시형태에서, 상기 방법은 백신을 위한 에피토프를 동정하는데 사용된다.
하나의 실시형태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 유전적으로 변형된 동물을 추정상 사람 치료제에 노출시키고(또는, 예를 들면, 이러한 동물의 사람 또는 사람화된 MHC I-발현 세포를 추정상 치료제의 펩타이드 서열에 노출시키고), 사람 또는 사람화된 MHC I/펩타이드 복합체를 디스플레이하는 유전적으로 변형된 동물의 세포를 유전적으로 변형된 동물의 세포를 결합할 수 있는 사람 T 세포 수용체 및 CD8을 포함하는 T 세포에 노출시키고, 유전적으로 변형된 동물의 펩타이드-디스플레이 세포에 의해 유도되는 사람 T 세포의 활성화를 측정하는 것을 포함하는, 추정상 사람 치료제에 의한 T 세포 활성화를 측정하는 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 본원에서 기술되는 바와 같은 동물로부터의 사람 또는 사람화된 MHC 제I 부류-발현 세포 간에 형성된 복합체는 사람 CD8 서열을 포함하는 T 세포, 예를 들면, 사람 T 세포 또는 사람 CD8을 암호화하는 전이유전자를 포함하는 비-사람 동물의 T 세포로 생성된다. 사람 CD8에 대해 유전자전이된 마우스는 당업계에 공지되어 있다[참조: Tishon et al. (2000) Trangenic Mice Expressing Human HLA 및 CD8 Molecules Generate HLA-Restricted Measles Virus Cytotoxic T Lymphocytes of the Same Specificity as Humans with Natural Measles Virus Infection, Virology 275(2):286-293; also, LaFace et al. (1995) Human CD8 Transgene Regulation of HLA Recognition by Murine T Cells, J. Exp. Med. 182:1315-1325].
사람 병원체 또는 신생물로부터의 항원 및 항원 에피토프를 동정하는 능력 이외에도, 본 발명의 유전적으로 변형된 동물은 사람 자가면역 질환, 예를 들면, 제I형 당뇨병, 다발성 경화증과 관련된 자가항원을 동정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Takaki et al. (2006) HLA-A*0201-Restricted T Cells from Humanized NOD Mice Recognize Autoantigens of Potential Clinical Relevance to Type 1 Diabetes, J. Immunol. 176:3257-65]은 제1형 당뇨병 자가항원을 동정하는데 있어 HLA/β2 마이크로글로불린 단쇄를 보유한 NOD 마우스의 사용을 기술한다. 또한, 본 발명의 유전적으로 변형된 동물은 사람 자가면역 질환의 다양한 양상을 연구하는데 사용될 수 있다. 사람 MHC I의 일부 다형적 대립유전자가 특정 질환, 예를 들면, 자가면역 질환(예: 그레이브 질환, 중증 근무력증, 건선 등[참조: Bakker et al. (2006) A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC, Nature Genetics 38:1166-72 and Supplementary Information and International MHC and Autoimmunity Genetics Network (2009) Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:18680-85, 둘 다 본원에서 참조로 인용됨])의 발병과 연관되는 것으로 공지되어 있기 때문에, 이러한 대립유전자를 포함하는 사람화된 MHC I 유전자좌를 포함하는 본 발명의 유전적으로 변형된 동물은 자가면역 질환 모델로서 유용할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 질환 대립유전자는 HLA-B27이고, 질환은 강직척추염 또는 반응성 관절염이고, 따라서 하나의 실시형태에서, 이러한 질환을 연구하는데 사용되는 동물은 사람 또는 사람화된 HLA-B27을 포함한다. 다른 사람 질환 대립유전자는 공지되어 있으며, 예를 들면 HIV, 에볼라 감염 등과 연관된 HLA 제1부류 대립유전자가 있으며, 이들 대립유전자 또는 대립유전자들의 조합은 본원에 기술된 유전적으로 변형된 동물에서 질환 모델 생성을 위해 유용할 수 있다.
또한, 본 발명의 유전적으로 변형된 동물 및 이에 의해 발현되는 사람 또는 사람화된 HLA 분자는 사람 질환 진행과 연관된 사람 HLA 분자에 의한 항원 제시를 차단하는 항원을 시험하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 사람 또는 사람화된 HLA를 발현하는 세포를 시험 항체에 노출시키고, 예를 들면, 사람 또는 사람화된 HLA-제한된 면역 반응을 차단하는 항체의 능력을 측정함으로써 상기 시험 항체가 사람 또는 사람화된 HLA에 의한 면역 세포(예: T 세포)에의 항원 제시를 차단할 수 있는지의 여부를 결정하는 것을 포함하는, 항체가 사람 질환, 예를 들면, 상술한 질환과 연관된 HLA 분자에 의한 항원 제시를 차단할 수 있는지의 여부를 결정하는 방법이 본원에 제공된다. 하나의 실시형태에서, 상기 방법은 사람 또는 사람화된 HLA를 발현하는 동물, 예를 들면, 질환에 대한 질환 모델로서 작용하는 질환-관련된 사람 또는 사람화된 HLA를 발현하는 동물에서 실시된다.
MHC I 복합체를 수반하는 세포성 면역의 다른 양은 당업계에 공지되어 있고, 따라서 본원에 기술된 유전적으로 조작된 비-사람 동물은 이러한 면역 생물학의 양상을 연구하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, MHC 제I 부류에 대한 TCR의 결합은 생체내에서 추가의 인자에 의해 조절된다. 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 하위계열 B 구성원(LILRB1 또는 LIR-1)이 MHC 제I 부류-제한된 CTL 상에서 발현되고 APC 상의 MHC 제I 부류 분자의 α3 서브유니트 상의 특정 결정인자에 결합함으로써 T 세포 자극을 하향-조절한다. 구조 연구는 LIR-1 및 CD8에 대한 결합 부위가 중첩됨을 보이며, 이는 억제성 LIR-1이 MHC 제I 부류 분자와의 결합에 대해 자극성 CD8과 경쟁한다는 것을 제시한다[참조: Willcox et al. (2003) Crystal structure of HLA-A2 bound to LIR-1, a host and viral major histocompatibility complex receptor, Nature Immunology 4(9):913-919; 또한, Shirioshi et al. (2003) Human inhibitory receptors Ig-like transcript 2 (ILT2) and ILT4 compete with CD8 for MHC class I binding and bind preferentially to HLA-G, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(15):8856-8861]. LIR-1은 이의 (세포내) 면역 수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)를 통해 억제 신호를 전달한다. NK 세포에서, 연구는 (정상적으로는 억제할 수 없는) ITIM이 결여된 KIR(억제성 살해 세포 Ig-유사 수용체)이 (아마도 LIR-1 ITIM을 통해) MHC 제I 부류 분자의 α3 도메인에 결합된 LIR-1의 존재 하에 억제할 수 있다는 것을 보여주었으며[참조: Kirwin et al. (2005) Killer Cell Ig-Like Receptor-Dependent Signaling by Ig-Like Transcript 2 (ILT2/CD85j/LILRB1/LIR-1) J. Immunol. 175:5006-5015], 이는 MHC 제I 부류에 결합된 LIR-1과 KIR 간의 협동 및 이에 따른 NK 세포 억제를 조절하는데 있어서 HLA α3 도메인 결합의 역할을 제시한다.
상술된 바와 같이, MHC 분자는 TCR을 발현하지 않는 세포와 상호작용한다. 이러한 세포 중에 NK 세포가 있다. NK 세포는 세포성 면역 반응 및 특히, 선천성 면역에서 중요한 역할을 하는 (CTL 또는 세포독성 T 림프구와 구별되는) 세포독성 림프구이다. NK 세포는 침입하는 미생물, 바이러스 및 기타 비-자가(예: 종양) 실체에 대한 제1선의 방어책이다. NK 세포는 표면 수용체를 통해 활성화되거나 억제되며, 이들은 CD8은 발현하나 TCR을 발현하지 않는다. NK 세포는 MHC 제I 부류를 발현하는 세포와 상호작용할 수 있으나, 상호작용은 TCR-결합, 펩타이드-보유 α1 및 α2 도메인 보다는 CD8-결합 α3 도메인을 통해 이루어진다. NK 세포의 주요 기능은 충분한 MHC 제I 부류 표면 단백질이 결여된 세포를 파괴하는 것이다.
사람 천연 살해(NK) 세포 표면 상에서의 MHC 제I 부류 분자의 가교-결합은 세포내 티로신 포스포릴화, 면역시냅스로부터 MHC 제I 부류 분자의 이동 및 종양 세포 사멸의 하향-조절을 초래한다[참조: Rubio et al. (2004) Cross-linking of MHC class I molecules on human NK cells inhibits NK cell function, segregates MHC I from the NK cell synapse, and induces intracellular phosphotyrosines, J. Leukocyte Biol. 76:116-124].
NK 세포에서의 MHC 제I 부류의 다른 기능은 명백히 자가-사멸을 방지하는 것이다. NK 세포는 활성화 수용체 2B4 및 2B4 리간드 CD48 둘다를 보유하고, MHC 제I 부류는 2B4에 결합하여 CD48에 의한 이의 활성화를 방지하는 것으로 보인다[참조: Betser-Cohen (2010) The Association of MHC Class I Proteins with the 2B4 Receptor Inhibits Self-Killing of Human NK Cells, J. Immunol. 184:2761-2768].
따라서, 본원에 기술된 유전적으로 조작된 비-사람 동물은 이들 비-TCR 또는 비-CTL 매개 과정을 연구하고 이들의 조절을 위한 접근법을 디자인하는데 사용될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다. 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕고자 제시되는 것이지 어떠한 방식으로도 이의 범위를 제한하려는 것이 아니며 그러한 것으로 해석되지 않아야 한다. 실시예는 당업자에게 널리 공지된 통상의 방법(분자 클로닝 기술 등)의 상세한 설명을 포함하지 않는다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이며, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨를 나타내고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.
실시예 1: 유전적으로 변형된 HLA-A2 마우스의 작제 및 특성확인
실시예 1.1: MG87 세포에서 HLA-A2/H-2K의 발현
키메라 사람/마우스 MHC I 발현을 형질감염된 세포에서 분석하기 위해 키메라 HLA-A2/H-2K 유전자 서열을 함유하는 바이러스 작제물(도 4A)을 당업자에게 공지된 표준 분자 클로닝 기술을 이용하여 생성하였다.
간략히 언급하면, α쇄의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 엑손 서열을 사용하고 이들을 H-2K 유전자로부터의 막관통 도메인 및 세포질 도메인에 대한 마우스 암호화 서열과 함께 프레임 내에 클로닝하여 키메라 사람 HLA-A/마우스 H-2K 바이러스 작제물을 생성시켰다(도 4A, pMIG-HLA-A2/H2K). 도 4에 예시된 바와 같이, 상기 작제물은 형질감염시 작제물이 세포에서 발현될 수 있는지를 측정할 수 있도록 하는 IRES-GFP 리포터 서열을 함유하였다.
상술된 키메라 작제물을 함유하는 바이러스를 생성시키고 사람 배아 신장 293 (293T) 세포에서 증식시켰다. 293T 세포를 10cm 접시에 놓고, 95% 컨플루언시(confluency)로 성장시켰다. DNA 형질감염 혼합물을 25㎍의 pMIG-HLA-A2/H2K, pMIG-사람 HLA-A2 또는 pMIG-사람화된 β2 마이크로글로불린 및 5㎍의 pMDG(외피 플라스미드), 15㎍의 pCL-Eco(패키징 시그널 ψ 부재 하의 패키징 작제물), 1mL의 Opti-MEM(Invitrogen)을 사용하여 생성하였다. 이러한 1mL DNA 혼합물에 미리 함께 혼합된 1mL의 Opti-MEM 중의 80μL의 리포펙타민-2000(Invitrogen)을 첨가하고 5분 동안 실온에서 항온배양하였다. 리포펙타민/DNA 혼합물을 실온에서 추가로 20분 동안 항온배양한 후, 10cm 접시에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 항온배양하였다. 24시간 후 세포로부터 배지를 모으고, 신선한 10mL의 R10(RPMI 1640 + 10% FBS) 배지를 세포에 첨가하였다. 이러한 배지 교환을 2회 반복하였다. 총 4일 후, 모은 배지를 푸울링하고, 원심분리한 후, 멸균 필터를 통해 여과시켜 세포 파편물을 제거하였다.
상기 생성된 증식된 바이러스를 MG87(마우스 섬유아세포) 세포의 형질도입에 사용하였다. 단일 T-75 플라스크로부터의 MG87 세포를 PBS로 1회 세척하고, 3mL의 0.25% 트립신 + EDTA를 세포에 가한 후, 3분 동안 실온에서 항온배양하였다. 7mL의 D10(고 글루코스 DMEM; 10% 소 태아 혈청)을 세포/트립신 혼합물에 첨가하고, 15ml 튜브에 옮긴 후 5분 동안 1300rpm에서 원심분리하였다. 세포를 원심분리시킨 후, 배지를 흡인하고, 세포를 5ml D10에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 웰당 약 3.0×105개의 세포를 6-웰 플레이트에 첨가하였다. pMIG-사람 HLA-A2 또는 pMIG-HLA-A2/H-2K를 단독으로 또는 pMIG-사람화된 β2 마이크로글로불린 바이러스와 함께 웰에 첨가하고, 대조군으로 비-형질도입된 세포를 사용하였다. 세포를 2일 동안 5% CO2와 함께 37℃에서 항온배양하였다. β2 마이크로글로불린의 존재 또는 부재 하에서의 HLA-A2 발현에 대한 (항-HLA-A2 항체, 클론 BB7.2를 사용하여) FACS 분석을 위해 세포를 준비하였다.
그래프(도 4B) 뿐만 아니라 그래프로부터 수득된 데이터를 요약한 표(도 4C)는, 곡선의 우측으로의 이동으로 입증되는 바와 같이, 사람화된 β2 마이크로글로불린와의 공동형질감염이 사람 HLA-A2 또는 키메라 사람/비-사람 HLAA2/H-2K의 발현을 증가시킨다는 것을 입증한다.
실시예 1.2: 키메라 HLA-A2/H-2K 유전자좌의 조작
마우스 H-2K 유전자를 VELOCIGENE® 기술을 이용하여 사람 및 마우스 세균성 인공 염색체(BAC)로부터 특유의 표적화 벡터를 작제함으로써 1단계로 사람화하였다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659]. 마우스 BAC 클론 RP23-173k21(Invitrogen)로부터의 DNA를 상동성 재조합으로 변형시켜, 마우스 H-2K 유전자의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 게놈 DNA를 사람 HLA-A 유전자의 α1, α2 및 α3 서브유니트를 암호화하는 사람 게놈 DNA로 대체시켰다(도 5).
간략히 언급하면, H-2K 유전자의 α1, α2 및 α3 서브유니트를 암호화하는 게놈 서열을, 5' 비해독 영역(UTR)을 포함하는 마우스 H-2K 유전자좌의 5'의 서열을 함유하는 5' 마우스 상동성 암(서열번호 1에 제시되어 있음) 및 마우스 H-2K α3 암호화 서열의 3'의 게놈 서열을 함유하는 3' 마우스 상동성 암(서열번호 2에 제시되어 있음)과 함께 loxP 부위가 플랭킹된 하이그로마이신 카세트를 포함하는 표적화 벡터를 사용하여 단일 표적화 이벤트로 사람 HLA-A*0201 유전자의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 사람 게놈 DNA로 대체시킨다.
내인성 H-2K 유전자 유전자좌를 표적화하기 위한 최종 작제물은 5'로부터 3'로 (1) 5'UTR을 포함하는 내인성 H-2K 유전자의 5'의 약 200 bp의 마우스 게놈 서열을 함유하는 5' 상동성 암, (2) HLA-A*0201 리더 서열, HLA-A*0201 리더/α1 인트론, HLA-A*0201 α1 엑손, HLA-A*0201 α1-α2 인트론, HLA-A*0201 α2 엑손, α2-α3 인트론의 약 316 bp의 5' 말단을 포함하는 약 1339 bp의 사람 게놈 서열, (3) 5' loxP 부위, (4) 하이그로마이신 카세트, (5) 3' loxP 부위, (6) α2-α3 인트론의 약 304 bp의 3' 말단, HLA-A*0201 α3 엑손을 포함하는 약 580 bp의 사람 게놈 서열 및 (7) 마우스 H-2K α3와 막관통 암호화 서열 사이에 인트론을 함유하는 약 200 bp의 마우스 게놈 서열을 함유하는 3' 상동성 암을 포함하였다(H-2K 표적화 벡터의 도식 표현은 도 5를 참조). 표적화 벡터의 5'에 있는 마우스/사람 서열의 접합점의 149개 뉴클레오타이드의 서열은 서열번호 3에 제시되어 있고, 표적화 벡터의 3'에 있는 사람/마우스 서열의 접합점의 159개 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4에 제시되어 있다. 이러한 표적화 벡터를 사용한 상동성 재조합으로, 내인성 마우스 H-2K 막관통 도메인 및 세포질 도메인 암호화 서열에 작동적으로 연결된 HLA-A*0201 유전자의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 사람 게놈 DNA를 함유하고 해독시 키메라 사람/마우스 MHC 제I 부류 단백질을 형성하는 변형된 마우스 H-2K 유전자좌가 생성되었다.
표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 F1H4 ES 세포를 전기천공함으로써 유핵 세포(예: T 및 B 림프구, 대식구, 호중구)의 표면에 키메라 MHC 제I 부류 단백질을 발현하는 마우스를 생성하기 위한 변형된 ES 세포를 생성시켰다. 사람 HLA 서열의 삽입물을 함유하는 ES 세포는 정량적 TAQMANTM 검정으로 동정하였다. 사람 HLA 서열 및 관련된 선별 카세트의 삽입(대립유전자의 획득, GOA) 및 내인성 마우스 서열의 손실(대립유전자의 손실, LOA)을 검출하기 위한 특정 프라이머 세트 및 프로브를 디자인하였다. 표 1은 정량적 PCR 검정에 사용된 각각의 프로브에 대한 명칭 및 검출 위치를 나타낸다.
선별 카세트는 당업자에게 공지된 방법으로 제거될 수 있다. 예를 들면, 키메라 사람/마우스 MHC 제I 부류 유전자좌를 포함하는 ES 세포는 사람 HLA-A*0201 유전자 서열을 포함하는 표적화 작제물(도 5 참조)의 삽입에 의해 도입된 "loxed" 하이그로마이신 카세트를 제거하기 위해 Cre를 발현하는 작제물로 형질감염될 수 있다. 하이그로마이신 카세트는 임의로 Cre 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종함으로써 제거할 수 있다. 임의로, 하이그로마이신 카세트는 마우스에 유지된다.
상술한 표적화된 ES 세포를 공여자 ES 세포로 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아 내로 도입시켰다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99]. 독립적으로 키메라 MHC 제I 부류 유전자를 포함하는 VELOCIMICE®(전적으로 공여자 ES 세포로부터 유래된 FO 마우스)는 특유의 사람 HLA-A*0201 유전자 서열의 존재를 검출하는 변형된 대립유전자 검정법[참조: Valenzuela et al., 상기 참조]을 이용하는 유전형 결정에 의해 동정되었다.
실시예 1.3: 유전적으로 변형된 마우스에서 키메라 HLA-A/H-2K의 생체내 발현
실시예 1.2에서 기술되는 바와 같은 유전적으로 변형된 H-2K 유전자좌를 지니는 이형접합 마우스를 동물 세포에서의 키메라 HLA-A/H-2K 단백질 발현에 대해 분석하였다.
혈액을 야생형 및 HLA-A/H-2K 키메라 이형접합(α2/H2K) 마우스로부터 개별적으로 수득하였다. 세포를 피코에리트린-접합된(PE) 항-HLA-A 항체를 사용하여 사람 HLA-A2에 대해 염색하고, 4℃에서 1시간 동안 알로피코시아닌-접합된 항-H-2Kb 항체에 노출시켰다. 세포를 HLA-A 및 H-2Kb에 특이적인 항체를 사용하여 유동 세포분석에 의해 발현에 대해 분석하였다. 도 6a는 야생형 및 키메라 이형접합체에서의 H-2Kb 및 HLA-A2 발현을 도시하며, 키메라 이형접합체는 두 단백질 모두를 발현하였다. 도 6b는 이형접합 마우스에서의 H-2Kb 및 키메라 HLA-A2/H2K 둘 다의 발현을 나타낸다.
실시예 2: 유전적으로 변형된 β2 마이크로글로불린 마우스의 작제 및 특성확인
실시예 2.1: 사람화된 β2 마이크로글로불린 유전자좌의 조작
마우스 β2 마이크로글로불린(β2m) 유전자를 VELOCIGENE® 기술을 이용하여 사람 및 마우스 세균성 인공 염색체(BAC) DNA로부터 특유의 표적화 벡터를 작제함으로써 1단계로 사람화시켰다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela et al., 상기 참조].
간략히 언급하면, 표적화 벡터를 RPCI-23 라이브러리(Invitrogen)로부터의 BAC 클론 89C24으로부터 마우스 β2m 상류 및 하류 상동성 암을 포함하는 세균성 상동 재조합에 의해 생성하였다. 마우스 상동성 암을 엑손 2부터 비-암호화 엑손 4 하류의 약 267개 뉴클레오타이드까지 연장된 2.8 kb 사람 β2m DNA 단편을 플랭킹하도록조작하였다(도 7). 재조합효소 인식 부위(예: loxP 부위)가 플랭킹된 약물 선별 카세트(네오마이신)를 후속 선별이 가능하도록 하기 위해 표적화 벡터에 삽입하였다. 최종 표적화 벡터를 선형화하고 F1H4 마우스 ES 세포주로 전기천공시켰다[참조: Valenzuela et al., 상기 참조].
(Cre 재조합효소의 도입에 의해) 제거되는 약물 카세트를 갖는 표적화된 ES 세포 클론을 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아 내로 도입시켰다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou et al., 상기 참조]. 사람화된 β2m 유전자를 보유한 VELOCIMICE®(전적으로 공여자 ES 세포로부터 유래된 FO 마우스)를 변형된 대립유전자 검정법[참조: Valenzuela et al., 상기 참조]을 이용하여 마우스 대립유전자의 손실 및 사람 대립유전자의 획득을 스크리닝함으로써 확인하였다.
실시예 2.2: 사람화된 β2 [0197] 마이크로글로불린 마우스의 특성확인
사람화된 β2 마이크로글로불린(β2m) 유전자에 대해 이형접합성인 마우스를 유세포분석법을 사용하여 발현에 대해 평가하였다(도 8 및 도 9).
간략히 언급하면, 혈액을 당업계에 공지된 기술을 이용하여 야생형, 사람화된 β2m, 사람화된 MHC(즉, 사람 HLA) 제I 부류 및 이중으로 사람화된 β2m 및 MHC 제I 부류 마우스의 그룹(n=4/그룹)으로부터 단리시켰다. 각 그룹의 마우스 각각으로부터의 혈액을 ACK 용해 완충액(Lonza Walkersville)으로 처리하여 적혈구를 제거하였다. 남은 세포를 형광색소 접합된 항-CD3(17α2), 항-CD19(1D3), 항-CD11b(M1/70), 항-사람 HLA 제I 부류 및 항-사람 β2 마이크로글로불린(2M2) 항체를 사용하여 염색하였다. BD-FACSCANTOTM(BD Biosciences)을 사용하여 유세포분석을 수행하였다.
사람 HLA 제I 부류의 발현은 단일하게 사람화된 동물 및 이중으로 사람화된 동물로부터의 세포 상에서 검출되었고, β2 마이크로글로불린의 발현은 이중으로 사람화된 마우스로부터의 세포상에서만 검출되었다(도 8). 사람 β2m 및 사람 HLA 제I 부류의 공동발현은, 사람 β2m 부재 하의 사람 HLA 제I 부류 발현과 비교하여, 세포 표면 상의 사람 HLA 제I 부류의 검출가능한 양을 증가시켰다(도 9: 평균 형광 강도 2370 대 1387).
실시예 3: HLA-A2/H-2K 및 사람화된 β2 마이크로글로불린을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스로부터의 APC에 의해 제시되는 플루 및 엡스타인-바 바이러스(EBV) 펩타이드에 대한 면역 반응
여러 명의 사람 공여자로부터의 PBMC를 HLA-A2의 발현과 플루 및 EBV 펩타이드에 대한 반응을 일으키는 능력 둘 다에 대해 스크리닝하였다. 후속 실험을 위해 1명의 공여자를 선별하였다.
사람 T 세포를 선택된 공여자의 PBMC로부터 네가티브 선별을 이용하여 단리시켰다. 비장의 비-T 세포를 키메라 HLA-A2/H-2K에 대해 이형접합이고 사람화된 β2-마이크로글로불린 유전자에 대해 이형접합성인 마우스 및 야생형 마우스로부터 단리시켰다. 마우스로부터의 약 50,000개의 비장 비-T 세포를 항-사람 IFNγ 항체로 코팅된 ELISPOT 플레이트에 첨가하였다. 플루 펩타이드(10μM) 또는 EBV 펩타이드의 풀(pool)(각각 5μM)을 첨가하였다. 폴리 IC를 25㎍/웰로 첨가하고, 웰을 3시간 동안 37℃에서 5% CO2에서 항온배양하였다. 사람 T 세포(50,000) 및 항-사람 CD28을 비장 비-T 세포 및 펩타이드에 첨가하고, IFNγ ELISPOT 검정을 수행한 후, 웰을 40시간 동안 37℃에서 5% CO2에서 항온배양하였다.
도 10에 도시된 바와 같이, 사람 T 세포는, 표면 상에 키메라 HLA-A2/H-2K 및 사람화된 β2 마이크로글로불린을 발현하는 마우스 APC에 의해 제시되는 경우에 플루 및 EBV 펩타이드에 대한 반응을 일으킬 수 있었다.
실시예 4: 유전적으로 변형된 HLA-B27 마우스의 작제 및 특성확인
실시예 4.1: 키메라 HLA-B27/H-2D1 유전자좌의 조작
마우스 H-2D1 유전자를 VELOCIGENE® 기술을 이용하여 사람 및 마우스 세균성 인공 염색체(BAC)로부터 특유의 표적화 벡터를 작제함으로써 1단계로 사람화하였다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela et al. (2003) 상기 참조]. 마우스 BAC 클론 bMQ300c10(Invitrogen)로부터의 DNA를 상동성 재조합으로 변형시켜, 마우스 H-2D1 유전자의 α1, α2 및 α3 서브유니트를 암호화하는 게놈 DNA를 사람 HLA-A 유전자의 α1, α2 및 α3 서브유니트를 암호화하는 사람 게놈 DNA로 대체시켰다(도 11).
간략히 언급하면, 마우스 H-2D1 유전자의 α1, α2 및 α3 서브유니트를 암호화하는 게놈 서열을, 리더 서열 엑손을 포함하는 마우스 H-2D1 유전자좌의 5'의 서열을 함유하는 5' 마우스 상동성 암 및 마우스 H-2D1 폴리A 서열의 3'의 게놈 서열을 함유하는 3' 마우스 상동성 암을 포함하는 표적화 벡터를 사용하여 단일 표적화 이벤트로 사람 HLA-B27(아형 B*2701-2759) 유전자의 α1, α2 및 α3을 암호화하는 사람 게놈 DNA로 대체시킨다.
내인성 H-2D1 유전자 유전자좌를 표적화하기 위한 최종 작제물은 5'로부터 3'로 (1) 리더 서열 엑손 및 인트론을 포함하는 내인성 H-2D1 유전자의 5'의 마우스 게놈 서열의 49.8 kb를 함유하는 5' 상동성 암, (2) HLA-B27 α1 엑손, HLA-Bα1-α2 인트론, HLA-B α2 엑손, 5' loxP 부위를 갖는 HLA-B α2-α3 인트론, HLA-B α3 엑손을 포함하는 1.67kb의 사람 게놈 서열, (3) 1.8kb의 마우스 H-2D1 α3 인트론, H-2D1 막관통 및 세포질 암호화 엑손 및 폴리A 서열, (4) 5' FRT 부위, (5) 하이그로마이신 카세트, (6) 3' FRT 부위, (7) 3' loxP 부위 및 (8) 마우스 H-2D1 유전자의 하류의 155.6kb의 마우스 게놈 서열을 함유하는 3' 상동성 암을 포함하였다(H-2D1 표적화 벡터의 도식 표현은 도 11을 참조). 표적화 벡터의 5'에 있는 마우스/사람 서열의 접합점의 199개 뉴클레오타이드의 서열은 서열번호 9에 제시되어 있고, 표적화 벡터 내의 loxP 삽입물과 함께 이의 주변의 사람 서열을 포함하는 134개 뉴클레오타이드의 서열은 서열번호 10에 제시되어 있고, 표적화 벡터의 3'에 있는 사람/마우스 서열의 접합점의 200개 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11에 제시되어 있고, 마우스 서열 및 FRT-HYG-FRT 선별 카세트의 5' 접합점의 서열은 서열번호 12에 제시되어 있고, FRT-HYG-FRT 카세트 및 마우스 서열의 3' 접합점의 서열은 서열번호 13에 제시되어 있다. 이러한 표적화 벡터를 사용한 상동성 재조합으로, 내인성 마우스 H-2D1 막관통 도메인 및 세포질 도메인 암호화 서열에 작동적으로 연결된 HLA-B27 유전자의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 사람 게놈 DNA를 함유하고 해독시 키메라 사람/마우스 MHC 제I 부류 단백질을 형성하는 변형된 마우스 H-2D1 유전자좌가 생성되었다.
표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 F1H4 ES 세포를 전기천공함으로써 유핵 세포(예: T 및 B 림프구, 대식구, 호중구)의 표면에 키메라 MHC 제I 부류 단백질을 발현하는 마우스를 생성하기 위한 변형된 ES 세포를 생성시켰다. 사람 HLA 서열의 삽입물을 함유하는 ES 세포는 정량적 TAQMANTM 검정으로 동정하였다. 사람 HLA 서열 및 관련된 선별 카세트의 삽입(대립유전자의 획득, GOA) 및 내인성 마우스 서열의 손실(대립유전자의 손실, LOA)을 검출하기 위한 특정 프라이머 세트 및 프로브를 디자인하였다. 표 2는 정량적 PCR 검정에 사용된 각각의 프로브에 대한 명칭 및 검출 위치를 나타낸다.
HLA-B27/H2-D1 대립유전자는 Cre 결실 마우스 스트레인에 교배시킴으로써 조건부로 검출되도록 유도할 수 있다. 예를 들면, 표적화 작제물에서 "Loxed" 사람 HLA-B27α3, 및 5' 및 3' loxP 부위가 플랭킹된 마우스 H2-D1 막관통 및 세포질 영역을 제거하기 위해, 키메라 사람/마우스 MHC 제1부류 유전자좌를 보유한 마우스를 특정 세포 계통에서 Cre 재조합효소를 발현하는 유전자전이 마우스에 교배시킬 수 있다(도 11 참조).
선별 카세트는 당업자에게 공지된 방법으로 제거될 수 있다. 예를 들면, 키메라 사람/마우스 MHC 제I 부류 유전자좌를 포함하는 ES 세포는 사람 HLA-B27 유전자 서열을 함유하는 표적화 작제물의 삽입에 의해 도입된 "FRTed" 하이그로마이신 카세트를 제거하기 위해 FlpO를 발현하는 작제물로 형질감염될 수 있다(도 11 참조). 하이그로마이신 카세트는 임의로 FlpO 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종함으로써 제거할 수 있다. 임의로, 하이그로마이신 카세트는 마우스에서 유지된다.
상술한 표적화된 ES 세포를 공여자 ES 세포로 사용하여 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아 내로 도입시켰다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou et al. (2007), 상기 참조]. 독립적으로 키메라 MHC 제I 부류 유전자를 보유하는 VELOCIMICE®(전적으로 공여자 ES 세포로부터 유래된 FO 마우스)는 특유의 사람 HLA-B27 유전자 서열의 존재를 검출하는 변형된 대립유전자 검정법[참조: Valenzuela et al., 상기 참조]을 이용하는 유전형 결정에 의해 동정되었다.
실시예 4.2: 유전적으로 변형된 마우스에서 키메라 HLA-B27/H-2D1의 발현
사람화된 B2M 및 키메라 HLA-B27/H-2D1에 대해 이형접합성인 마우스 및 이의 야생형 동복자로부터의 혈액을 EDTA(BD)를 함유한 마이크로테이너 튜브에 모았다. 혈액을 4℃에서 25분 동안 1mg/ml의 1차 항체(W6/32-PE, pan HLA-제1 부류 항체, Abcam; 또는 항-사람 b2m 항체)로 염색한 다음, FACS 완충액으로 세척하고 APC-표지된 항-사람 IgG 2차 항체(Jackson Immunoresearch)의 1:300 희석액과 함께 4℃에서 25분 동안 항온배양하였다. 적혈구를 1단계 고정/용해 용액(eBiosciences)으로 용해시키고, 세포를 1× BD 안정화 고정액 중에서 고정 및 재현탁시켰다. 세포를 FACS Canto 기기에서 수득하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이타를 분석하였다.
도 12에 도시된 바와 같이, 키메라 HLA-B27/H-2D1 단백질 및 사람화된 B2M은 (사람 HLA-B27 및 사람 B-2M에 대해 생성된 항체에 의한 검출로 입증되는 바와 같이) 유전적으로 조작된 동물의 혈액 세포에서 발현되었지만, 이의 발현은 야생형 동물에서는 검출되지 않았다.
등가범위
당업자는 단지 통상적 실험만을 이용하여 본원에 기술된 발명의 특정 실시형태들에 대한 많은 등가범위를 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가범위를 하기 청구범위에 포함시키고자 한다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 비특허 문헌, 특허원 및 특허의 전체 내용이 모두 본원에서 참조로 인용된다.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> TRANSGENIC MICE EXPRESSING CHIMERIC MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) CLASS I MOLECULES
<130> 0825B
<150> US 13/793,812
<151> 2011-03-11
<160> 17
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 5' homology arm of MHC I targeting construct
<400> 1
ggattcccca tctccacagt ttcacttctg cacctaacct gggtcaggtc cttctgtccg 60
gacactgttg acgcgcagtc agctcttacc cccattgggt ggcgcgatca cccaagaacc 120
aatcagtgtc gccgcggacg ctggatataa agtccacgca gcccgcagaa ctcagaagtc 180
gcgaatcgcc gacaggtgcg 200
<210> 2
<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 3' homology arm of MHC I targeting construct
<400> 2
gtaaggagag tgtgggtgca gagctggggt cagggaaagc tggagctttc tgcagaccct 60
gagctgctca gggctgagag ctggggtcat gaccctcacc ttcatttctt gtacctgtcc 120
ttcccagagc ctcctccatc cactgtctcc aacatggcga ccgttgctgt tctggttgtc 180
cttggagctg caatagtcac 200
<210> 3
<211> 149
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sequence of the chimeric human/mouse MHC I locus at the 5'
junction of mouse/human sequences
<400> 3
agtgtcgccg cggacgctgg atataaagtc cacgcagccc gcagaactca gaagtcgcga 60
atcgccgaca ggtgcgatgg ccgtcatggc gccccgaacc ctcgtcctgc tactctcggg 120
ggctctggcc ctgacccaga cctgggcgg 149
<210> 4
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sequence of the chimeric human/mouse MHC I locus at the 3'
junction of human/mouse sequences
<400> 4
ggtggtgcct tctggacagg agcagagata cacctgccat gtgcagcatg agggtttgcc 60
caagcccctc accctgagat ggggtaagga gagtgtgggt gcagagctgg ggtcagggaa 120
agctggagct ttctgcagac cctgagctgc tcagggctg 159
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Probe for detection of hygromycin cassette
<400> 5
acgagcgggt tcggcccatt c 21
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Probe for detection of human HLA-A2 alpha2-alpha3 intron
<400> 6
agtccttcag cctccactca ggtcagg 27
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Probe for detection of Human HLA-A2 alpha2 exon
<400> 7
taccaccagt acgcctacga cggca 25
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Probe for detection of human HLA-A2 alpha2-alpha3 intron
<400> 8
cactctctgg tacaggat 18
<210> 9
<211> 199
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sequence of the chimeric human/mouse MHC I locus at the 5'
junction of mouse/human sequences
<400> 9
cccttctcca cctgagcccc gcgcccagat cccctcccgg cctgcgcagc cgcccggggt 60
ttggtgagga ggtcggggtc tcaccgcgcg ccgtccccag gctcccactc catgaggtat 120
ttccacacct ccgtgtcccg gcccggccgc ggggagcccc gcttcatcac cgtgggctac 180
gtggacgaca cgctgttcg 199
<210> 10
<211> 134
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sequence of chimeric human/mouse MHC I locus surrounding 5' loxP
site
<400> 10
tccctgttcc ccgctcagag actcgaactt tccaatgaat aggagattat cataacttcg 60
tataatgtat gctatacgaa gttatccagg tgcctgcgtc caggctggtg tctgggttct 120
gtgccccttc ccca 134
<210> 11
<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sequence of chimeric human/mouse MHC I locus at the 3' junction
of human/mouse sequences
<400> 11
agaagtgggc agctgtggtg gtgccttctg gagaagagca gagatacaca tgccatgtac 60
agcatgaggg gctgccgaag cccctcaccc tgagatgggg tgtgggtgca gagctggggt 120
cagggaaagc tggagccttc tgcagaccct gagctggtca gggatgagag ctggggtcat 180
aaccctcacc ttcatttcct 200
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sequence at the 5' junction of of FRT-HYG-FRT insertion
<400> 12
agactcaact agggatcctt taatgtgctg ggtgtacaag acaattcacc catttcctct 60
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tggtgggttg ctggaa 16
Claims (41)
- 내인성 H-2D 유전자좌에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 마우스로서,
상기 키메라 폴리펩타이드가 사람 HLA-B27 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인, 및 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고,
상기 마우스가 상기 키메라 폴리펩타이드를 발현하는, 마우스. - 제1항에 있어서, 상기 마우스가 내인성 H-2D 유전자좌로부터 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 기능성 세포외 도메인을 발현하지 않는, 마우스.
- 제1항에 있어서, 상기 내인성 H-2D 유전자좌가, 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열이 결여되어 있는, 마우스.
- 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열이,
(a) 내인성 마우스 H-2D 리더 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나;
(b) 내인성 마우스 조절 요소에 작동적으로 연결되고/되거나;
(c) 사람 HLA-B27 α1 엑손, 사람 HLA-B27 α1-α2 인트론, 사람 HLA-B27 α2 엑손, 사람 HLA-B27 α2-α3 인트론 및 사람 HLA-B27 α3 엑손을 포함하는, 마우스. - 내인성 H-2D 유전자좌에 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 마우스 게놈을 변형시키는 것을 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법으로서,
상기 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드가 사람 HLA-B27 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인, 및 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고,
상기 마우스가 상기 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 발현하는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법. - 제5항에 있어서, 상기 마우스의 변형이 상기 내인성 H-2D 유전자좌에서 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 HLA-B27 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키는 것을 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 대체가 단일 ES 세포에서 이루어지고, 상기 단일 ES 세포가 마우스 배아 내로 도입되어 마우스를 생성하는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 마우스가 내인성 H-2D 유전자좌로부터 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 기능성 세포외 도메인을 발현하지 않는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 내인성 H-2D 유전자좌가, 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열이 결여되어 있는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열이,
(a) 내인성 마우스 H-2D 리더 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
(b) 내인성 마우스 조절 요소에 작동적으로 연결되고/되거나;
(c) 사람 HLA-B27 α1 엑손, 사람 HLA-B27 α1-α2 인트론, 사람 HLA-B27 α2 엑손, 사람 HLA-B27 α2-α3 인트론 및 사람 HLA-B27 α3 엑손을 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법. - 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마우스가 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 상기 마우스가 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 마우스가 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능성 내인성 β2 마이크로글로불린을 발현하지 않고, 임의로, 상기 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 마우스 β2 마이크로글로불린 조절 요소에 작동적으로 연결되는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이,
(a) 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나;
(b) 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 엑손 3 및 엑손 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법. - 제13항에 있어서,
제1 마우스의 내인성 마우스 H-2D 유전자좌에서 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 HLA-B27 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키고;
제2 마우스의 내인성 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서, 마우스 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키고;
상기 제1 마우스 및 제2 마우스를 육종하여, 게놈 내에 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스를 생성시키고, 여기서, 상기 유전적으로 변형된 마우스는 상기 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드 및 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법. - 제14항에 있어서, 상기 제2 뉴클레오타이드 서열이 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열 및 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스의 생성 방법.
- 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 사람 HLA-B27 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열
을 포함하는, 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산. - 내인성 MHC I 유전자좌에 2종 이상의 키메라 사람/설치류 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 2종 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 설치류로서,
상기 키메라 폴리펩타이드 각각이 사람 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인, 및 설치류 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고,
상기 설치류가 상기 2종 이상의 키메라 사람/설치류 MHC I 폴리펩타이드를 발현하고,
상기 설치류가 마우스 또는 래트인, 설치류. - 제17항에 있어서, 상기 설치류가 마우스이고, 상기 설치류 MHC I 폴리펩타이드가 마우스 H-2D 폴리펩타이드, 마우스 H-2K 폴리펩타이드 또는 마우스 H-2L 폴리펩타이드인, 설치류.
- 제18항에 있어서, 내인성 MHC I 유전자좌에 키메라 HLA-A2/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
상기 설치류가 상기 키메라 HLA-A2/H-2K 및 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 발현하고, 임의로,
상기 키메라 HLA-A2/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 H-2K 유전자좌에 위치하고, 상기 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 H-2D 유전자좌에 위치하는, 설치류. - 제19항에 있어서, 상기 설치류가 세포 표면 상의 상기 내인성 MHC I 유전자좌로부터 기능성 내인성 MHC I 폴리펩타이드를 발현하지 않는, 설치류.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 마우스 또는 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 설치류에 있어서, 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 마우스 또는 설치류로서, 상기 마우스 또는 설치류가 상기 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는, 마우스 또는 설치류.
- 제21항에 있어서, 상기 마우스 또는 설치류가 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능성 내인성 β2 마이크로글로불린을 발현하지 않고, 임의로, 상기 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 마우스 또는 설치류 β2 마이크로글로불린 조절 요소에 작동적으로 연결되어 있는, 마우스 또는 설치류.
- 제21항에 있어서, 상기 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이,
(a) 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나;
(b) 사람 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 엑손 3 및 엑손 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 마우스 또는 설치류. - 내인성 MHC I 유전자좌에 2종 이상의 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 2종 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 비-사람 동물 게놈을 변형시키는 것을 포함하는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 생성 방법으로서,
상기 2종 이상의 키메라 사람/비-사람 폴리펩타이드 각각이 사람 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인, 및 비-사람 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고,
상기 동물이 2종 이상의 키메라 사람/비-사람 MHC I 폴리펩타이드를 발현하는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 생성 방법. - 제24항에 있어서, 상기 동물이 설치류인, 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 생성 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 설치류가 마우스 또는 래트인, 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 생성 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 설치류가 마우스이고, 상기 비-사람 MHC I 폴리펩타이드가 마우스 H-2D 폴리펩타이드, 마우스 H-2K 폴리펩타이드 또는 마우스 H-2L 폴리펩타이드인, 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 생성 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 동물이 내인성 비-사람 MHC I 유전자좌로부터 내인성 비-사람 MHC I 폴리펩타이드의 기능성 세포외 도메인을 발현하지 않는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 생성 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 설치류가 마우스이고,
상기 방법이 내인성 MHC I 유전자좌에 키메라 HLA-A2/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 마우스 게놈을 변형시키는 것을 포함하고,
상기 마우스가 상기 키메라 HLA-A2/H-2K 및 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 발현하는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 생성 방법. - 제29항에 있어서, 상기 마우스는 내인성 마우스 MHC I 유전자좌로부터 내인성 마우스 MHC I 폴리펩타이드의 기능성 세포외 도메인을 발현하지 않는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 생성 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 키메라 HLA-A2/H-2K 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 H-2K 유전자좌에 위치하고, 상기 키메라 HLA-B27/H-2D 폴리펩타이드를 암호화는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 H-2D 유전자좌에 위치하는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 생성 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 마우스 게놈의 변형이 내인성 H-2D 유전자좌에서 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사람 HLA-B27 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 대체시키는 것을 포함하는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 생성 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 마우스가 내인성 H-2D 유전자좌로부터 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 발현하지 않는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 생성 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 대체가 단일 ES 세포에서 이루어지고, 여기서, 상기 단일 ES 세포가 마우스 배아 내로 도입되어 마우스를 생성하는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 생성 방법.
- 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드로서, 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인에 작동적으로 연결된 사람 HLA-B27 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함하는, 키메라 사람/마우스 MHC I 폴리펩타이드.
- 제35항에 있어서, 상기 MHC I 폴리펩타이드가 사람 또는 사람화된 β2 마이크로글로불린에 비-공유적으로 결합되어 있는, 키메라 사람/마우스 동물 MHC I 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 마우스 또는 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 설치류를 추정상 CTL 에피토프를 포함하는 항원에 노출시키고,
상기 마우스 또는 설치류가 면역 반응을 일으키도록 하고,
상기 마우스 또는 설치류로부터 상기 에피토프에 결합하는 MHC 제I 부류-제한된 CD8+ CTL을 단리하고,
상기 MHC 제I 부류-제한된 CD8+ CTL에 의해 결합된 에피토프를 동정하는 것을 포함하는, 사람 CTL 에피토프의 동정 방법. - 사람 세포에 의한 제시 및 사람 림프구에 의한 결합이 펩타이드-함유 세포의 세포독성을 초래하는 HLA 제I 부류-제한된 펩타이드의 동정 방법으로서,
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 마우스 또는 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 설치류를 관심대상의 펩타이드를 포함하는 분자에 노출시키고,
상기 관심대상의 펩타이드에 결합하는 키메라 사람/설치류 제I 부류 분자를 발현하는 마우스 또는 설치류의 세포를 단리하고,
상기 세포를 시험관내에서 HLA 제I 부류-제한된 세포독성을 수행할 수 있는 사람 림프구에 노출시키고,
펩타이드-유도된 세포독성을 측정하는 것을 포함하는, HLA 제I 부류-제한된 펩타이드의 동정 방법. - 키메라 사람/설치류 MHC I 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 세포로서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 사람 부분이 사람 HLA-B27 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함하고, 상기 키메라 폴리펩타이드의 설치류 부분이 마우스 H-2D 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는, 단리된 세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 마우스 또는 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 설치류로부터 유래된 조직.
- 삭제
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| EP3209769B1 (en) * | 2014-10-24 | 2020-08-05 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Compositions and methods for inducing phagocytosis of mhc class i positive cells and countering anti-cd47/sirpa resistance |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003006639A1 (fr) | 2001-07-13 | 2003-01-23 | Genoway | Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations |
| WO2005004592A2 (en) | 2003-07-30 | 2005-01-20 | Institut Pasteur | Transgenic mice having a human major histocompatibility complex (mhc) phenotype, experimental uses and applications |
| US20050050580A1 (en) | 2000-12-13 | 2005-03-03 | Masashi Gotoh | Transgenic animal expressing hla-a24 and utilization thereof |
| WO2008010100A2 (en) | 2006-07-13 | 2008-01-24 | Institut Pasteur | Immunodeficient mice transgenic for hla class i and hla class ii molecules and their uses |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5489742A (en) * | 1990-10-23 | 1996-02-06 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Transgenic rats and animal models of inflammatory disease |
| US20020151690A1 (en) * | 1997-08-12 | 2002-10-17 | Luxemburg Alain T | Purification of antigen-specific t cells |
| EP1173573A1 (en) * | 1999-04-23 | 2002-01-23 | Pharmexa A/S | Method for down-regulating il5 activity |
| US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| JP2005527490A (ja) * | 2002-01-18 | 2005-09-15 | イノヴィオ アーエス | 筋肉内投与のための二重特異性抗体ｄｎａ構築物 |
| SE0301109D0 (sv) * | 2003-04-14 | 2003-04-14 | Mallen Huang | Nucleotide vaccine composition |
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-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050050580A1 (en) | 2000-12-13 | 2005-03-03 | Masashi Gotoh | Transgenic animal expressing hla-a24 and utilization thereof |
| WO2003006639A1 (fr) | 2001-07-13 | 2003-01-23 | Genoway | Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations |
| WO2005004592A2 (en) | 2003-07-30 | 2005-01-20 | Institut Pasteur | Transgenic mice having a human major histocompatibility complex (mhc) phenotype, experimental uses and applications |
| WO2008010100A2 (en) | 2006-07-13 | 2008-01-24 | Institut Pasteur | Immunodeficient mice transgenic for hla class i and hla class ii molecules and their uses |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Eur. J. Immunol., vol.19(12), pp.2349-2354(1989). |
| J. Exp. Med., vol.170(4), pp.1091-1101(1989). |
| J. Exp. Med., vol.173(4), pp.1007-1015(1991). |
| J. Immunol., vol.149(1), pp.136-142(1992). |
| Nature, vol. 348(6302), pp.642-644(1990.12.13). |
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