CN105188358A - 表达嵌合的主要组织相容性复合物(mhc)i类分子的转基因小鼠 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因修饰的非人动物，其表达嵌合人/非人MHC？I多肽以及人或人源化β2微球蛋白多肽，以及包括上述相同多肽的胚胎、细胞以及组织。还涉及用于制备所述基因修饰动物的构建体和制备方法。还涉及使用所述基因修饰动物用以研究人类免疫系统多个方面的方法。

Description

表达嵌合的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的转基因小鼠

交叉引用相关申请

本申请要求2013年3月11日提交的美国申请号13/793,812的权益，其内容在此全部并入本申请。

发明领域

本发明涉及一种基因修饰的非人动物，如啮齿动物(如小鼠或大鼠)，其表达一种人或人源化的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子。本发明还涉及一种基因修饰的非人动物，如小鼠或大鼠，其表达一种人或人源化的MHCI蛋白(如MHCIα链)和/或人或人源化β2微球蛋白；以及表达其的胚胎、组织和细胞。本发明还提供了制备表达人或人源化MHCI类蛋白(如MHCIα链)和/或β2微球蛋白的基因修饰非人动物的方法。本发明还提供了在体外人源化细胞免疫系统或在基因修饰非人动物中的背景下鉴定和评估肽的方法，以及修饰非人类动物如小鼠或大鼠的MHCI和/或β2微球蛋白基因座，以表达人或人源化MHCI和/或β2微球蛋白。

技术背景

在适应性免疫应答中，外来抗原被B淋巴细胞和T淋巴细胞上的受体分子(如免疫球蛋白和T细胞受体或TCR)识别。这些外来抗原作为肽片段由专门蛋白在细胞表面呈递，统称为主要组织相容性复合物(MHC)分子。MHC分子由多个基因座编码，这些基因座作为基因的连接簇跨度约4Mb。在小鼠中，MHC基因在17号染色体上，由于历史原因被称为组织相容性2(H-2)基因。在人类中，该基因在6号染色体上，并且被称为人类白细胞抗原(HLA)基因。小鼠和人类的基因座为多基因的；它们包括三个MHC基因高度多态类别(I类、II类和III类)，在人类和小鼠基因组中表现出类似结构(分别参见图2和图3)。

MHC基因座在基因组中表现出最高的多态性；一些基因由>300个等位基因表示(如人HLA-DRβ和人HLA-B)。所有I类和II类MHC基因可以呈递肽片段，但每个基因表达具有不同结合特性的蛋白质，反映了多态性和等位基因变体。任何给定的个体具有可以在免疫应答过程中被B和T细胞呈递在细胞表面上的肽片段的独特范围。

人类和小鼠均具有I类MHC基因(见图2和图3)。在人类中，经典I类基因被称为HLA-A、HLA-B和HLA-C，而在小鼠中它们是H-2K、H-2D和H-2L。I类分子由两条链组成：一条多态α链(有时被称为重链)和一条较小的链称为β2微球蛋白(也称为轻链)，其通常非多态(图1)。这两条链在细胞表面上形成非共价异源二聚体。该α链包括三个结构域(α1、α2和α3)。所述α链基因外显子1编码先导序列，外显子2和3编码的α1和α2结构域，外显子4编码α3结构域，外显子5编码跨膜域，以及外显子6和7编码胞浆尾。所述α链形成包括α1和α2结构域(类似Ig样结构域)及其后的α3结构域(其类似于β2微球蛋白)的肽结合裂隙。

β2微球蛋白是一种12kDa的非糖基化蛋白；其功能之一是稳定MHCI类α链。不同于α链，β2微球蛋白不跨膜。人类β2微球蛋白基因座位于15号染色体上，而小鼠基因座位于2号染色体上。β2微球蛋白基因由4个外显子和3个内含子组成。β2微球蛋白的循环形式存在于血清、尿液和其他体液中；因而，该非共价MHCI相关的β2微球蛋白可以与生理条件下的循环β2微球蛋白进行交换。

I类MHC分子在所有有核细胞中表达，包括肿瘤细胞。它们在T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞，以及其他细胞中特异性表达，并将肽片段(长度通常为8-10个氨基酸)展示在CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表面。CTL专门杀死通过自身膜结合TCR识别的MHC-I结合肽的任意细胞。当一个细胞展示来源于细胞蛋白中通常不呈递的肽(如病毒、肿瘤或其他非自体来源)时(CTL识别这类肽)，CTL被激活并杀死展示所述肽的细胞。

通常情况下，由于耐受机制，在MHCI类分子的背景下呈递正常(即自体)蛋白不引发CTL的激活。然而，在一些疾病(如癌症、自身免疫性疾病)中来源于自体蛋白的肽成为免疫系统细胞成分的靶标，这导致呈递这类肽的细胞受到破坏。虽然在识别某些引发细胞免疫反应的自体来源的抗原(如各种癌症相关的抗原)方面有一些进展，但为了提高对由人类CTL通过MHCI类分子识别肽的鉴别，依然需要从体内和体外系统模拟人体细胞免疫系统各方面。模拟人体细胞免疫系统的系统可以用于鉴别疾病相关抗原以开发人类治疗，如疫苗和其它生物制剂。用于在人免疫系统背景下评估抗原识别的系统可以协助鉴别治疗上有用的CTL群体(如在研究和对抗人类疾病中有用)。这类系统也可协助增强人类CTL群体活性以更有效地对抗传染病和携带外来抗原的实体。因此，需要生物系统(如基因工程动物)，这类系统可以生成一种展示模拟人体免疫系统功能的元件的免疫系统。

发明概述

本申请提供了一种生物系统，用于生成或鉴定与人类MHCI类蛋白及其嵌合物相关，以及与CD8+T细胞结合的肽。本申请提供了非人类动物，包括非人类细胞，其表达在细胞免疫反应中起作用的人类或人源化分子。本申请还提供了人源化啮齿动物基因座，其编码人类或人源化的MHCI和β2微球蛋白。本申请还提供了人源化啮齿动物细胞，其表达人或人源化的MHC和β2微球蛋白分子。本申请提供了包括人源化啮齿类动物细胞的体内和体外系统，其中，所述啮齿动物细胞表达一种或多种人或人源化免疫系统分子。

本发明提供了非人动物，如啮齿动物(如小鼠或大鼠)，在其基因组中包括编码嵌合人/非人(如人/啮齿动物，如人/小鼠或人/大鼠)MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人部分包括人MHCI多肽的胞外域。具体地，本申请提供了非人动物，其包括在内源性MHCI基因座上编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括人MHCI多肽的胞外域，并且其中所述动物表达嵌合的人/非人MHCI多肽。一方面，所述动物不表达来自内源非人类MHCI基因座的内源非人MHCI多肽的胞外域(如功能性胞外域)。在本发明的一个方面，所述非人动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)包括MHCI基因座的两个拷贝，该基因座包括编码嵌合人/非人(如人/啮齿动物，如人/小鼠或人/大鼠)MHCI多肽的核苷酸序列。在本发明的另一个方面，所述动物包括MHCI基因座的一个拷贝，所述基因座包括编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列。因此，所述动物可为纯合或杂合的MHCI基因座，该基因座包括编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列。在各种不同的实施例中，所述编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列包括于所述非人动物(如啮齿动物，如大鼠或小鼠)的种系中。在一个实施方式中，所述嵌合MHCI基因座包括于非人类动物的种系中。

在一个方面，所述编码嵌合人/非人MHCI的核苷酸序列与内源性非人调控元件，如启动子、增强子、沉默子等，可操作地连接。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人类部分包括人先导序列。在另一个实施方式中，所述嵌合多肽包括非人先导序列，如内源性非人先导序列。在另外的实施方式中，所述嵌合多肽的人类部分包括人类MHCI多肽的α1，α2和α3结构域。所述人MHCI多肽可以选自由HLA-A、HLA-B以及HLA-C组成的组。在一个实施方式中，所述人MHCI多肽是HLA-A多肽，如HLA-A2多肽，如HLA-A2.1多肽。在另一个实施方式中，所述人MHCI多肽是HLA-B多肽，如HLA-B27的多肽。

一方面，所述基因工程非人类动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物是小鼠。因此，在一个实施方式中，所述内源性非人类基因座是小鼠基因座，如，小鼠H-2K，H-2D或H-2L基因座。在一个实施方式中，所述嵌合人/非人MHCI多肽的非人类部分包括所述内源性非人MHCI多肽的跨膜域和胞浆域。因此，在一个实施方式中，其中所述非人类动物是小鼠，所述内源性非人MHCI基因座可以是H-2K基因座(如H-2Kb基因座)并且所述内源性非人MHCI多肽可以是H-2K多肽；因此，所述嵌合人/非人MHCI多肽可以包括H-2K多肽的跨膜域和胞浆域。在另一个实施方式中，其中所述非人类动物是小鼠，所述内源性非人MHCI基因座可以是H-2D基因座并且所述内源性非人MHCI多肽可以是H-2D多肽；因此，所述嵌合人/非人MHCI多肽可以包括H-2D多肽的跨膜域和胞浆域。类似地，在另一个实施方式中，所述内源性非人MHCI基因座可以是小鼠H-2L基因座并且所述内源性非人MHCI多肽可以是H-2L多肽；因此，所述嵌合的人/非人MHCI多肽可以包括H-2L多肽的跨膜域和胞浆域。

本文还提供了一种小鼠，其在内源性H-2K基因座包括编码嵌合人类/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括人HLA-A多肽的胞外域(如HLA-A2)和小鼠部分包括小鼠H-2K多肽的跨膜域和胞浆域，并且其中所述小鼠表达嵌合人/小鼠MHCI多肽。在一些实施方式中，所述小鼠不表达来自内源性H-2K基因座的小鼠H-2K多肽的胞外域(如不表达功能性胞外域)。在一个方面，编码嵌合人类/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列与内源性小鼠调控元件可操作地连接。所述嵌合多肽的人类部分可以包括人先导序列。其也可以包括人类MHCI多肽的α1、α2和α3域。所述人MHCI多肽可以是HLA-A多肽，如HLA-A2.1多肽。在一个方面，所述小鼠H-2K基因座是H-2Kb基因座。

本文还提供了一种小鼠，其在内源性H-2D基因座包括编码嵌合人类/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括人HLA-B(如HLA-B27)多肽的胞外域，并且小鼠部分包括小鼠H-2D(如H-2D1)多肽的跨膜域和胞浆域，并且其中所述小鼠表达嵌合人/小鼠MHCI多肽。在一些实施方式中，所述小鼠不从内源性H-2D基因座表达小鼠H-2D多肽的胞外域(如功能性胞外域)。在一方面，所述编码嵌合人类/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列与内源性小鼠调控元件可操作地连接。所述嵌合多肽的人类部分可以包括人先导序列。所述嵌合多肽还可包括小鼠先导序列。所述嵌合多肽的人类部分还可以包括人类MHCI多肽的α1，α2和α3域。所述人MHCI多肽可以是HLA-B多肽，如HLA-B27多肽。一方面，所述小鼠H-2D基因座是H-2D1基因座。

在另一个实施方式中，本文提供了一种小鼠，其在内源性小鼠MHCI基因座包括编码嵌合人类/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括选自HLA-A2、HLA-A3、HLA-B27和HLA-B7的人MHCI的胞外域。在另一个实施方式中，本文提供了一种小鼠，其在内源性MHCI基因座包括一个或多个，如一个、两个、三个、四个、五个或六个，编码嵌合人类/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括人MHCI多肽的胞外域，其中所述嵌合人/小鼠MHCI多肽的小鼠部分包括小鼠MHCI多肽的跨膜域和胞浆域，并且其中所述小鼠表达一个或多个，例如一个、两个、三个、四个、五个或六个，嵌合人类/小鼠MHCI多肽。因此，所述小鼠MHCI多肽可以选自H-2D，H-2K，和H-2L。在一个实施方式中，所述嵌合人类/小鼠MHCI多肽可以选自HLA-A2/H-2K、HLA-A3/H-2K、HLA-B27/H-2D、HLA-B7/H-2D及它们的组合。在一个实施方式中，一个、两个或三个嵌合人/小鼠MHCI多肽可以在每个17号姊妹染色体上编码；因此，小鼠MHCI基因座可以包括一个或多个，例如一个、两个、三个、四个、五个或六个，编码嵌合人类/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠包括两个编码嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述两个核苷酸序列编码HLA-A2/H-2K和HLA-B27/H-2D多肽，并且其中所述小鼠表达嵌合HLA-A2/H-2K和HLA-B27/H-2D多肽。在一个实施方式中，本文所述的小鼠不从内源性小鼠MHCI基因座表达任何功能性内源性小鼠MHCI多肽。因此，在一方面，所述小鼠只表达人源化的，如嵌合人类/小鼠MHCI多肽，且保留的不包括嵌合人/小鼠MHCI序列的MHCI基因座(如不包括用编码嵌合人/小鼠多肽的核苷酸序列替换内源性小鼠MHCI核苷酸序列的MHCI基因座)通过缺失被去除。在另一个实施方式中，所述小鼠保留编码功能性内源性小鼠MHCI多肽(如H-2L多肽)的核苷酸序列。

本发明的另一方面涉及一种非人动物，例如，啮齿动物(如小鼠或大鼠)，在其基因组中包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。因此，本文包括一种非人类动物，其在内源性非人β2微球蛋白基因座包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，其中所述动物表达人或人源化β2微球蛋白多肽。在一方面，所述动物不从内源非人β2微球蛋白基因座表达功能性内源性非人β2微球蛋白多肽。在一方面，所述动物包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的β2微球蛋白基因座的两个拷贝；在另一个实施方式中，所述动物包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的β2微球蛋白基因座的一个拷贝。因此，所述动物可以是编码人或人源化β2微球蛋白多肽的β2微球蛋白基因座的纯合子或杂合子。在各种不同的实施方式中，编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括在所述非人类动物(如啮齿动物，如大鼠或小鼠)的种系中。在一个实施方式中，编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括编码包括人β2微球蛋白氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，该多肽能结合到MHCI蛋白。

在一些实施方式中，编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列与内源性非人β2微球蛋白调控元件可操作地连接。在一方面，所述编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括如人β2微球蛋白基因外显子2至外显子4的核苷酸序列。在另一方面，所述编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括如人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4的核苷酸序列。在进一步的方面，所述核苷酸序列还包括如非人β2微球蛋白基因的外显子1所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述非人类动物是啮齿动物(如小鼠或大鼠)；因此，所述非人β2微球蛋白基因座是啮齿动物(如小鼠或大鼠)β2微球蛋白基因座。

本申请还提供了一种小鼠，其在内源性β2微球蛋白基因座包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，其中所述小鼠表达人或人源化β2微球蛋白多肽。在一些实施方式中，所述小鼠不从内源性β2微球蛋白基因座表达功能性内源性小鼠β2微球蛋白。所述核苷酸序列可以连接到内源性小鼠调控元件上。在一方面，所述核苷酸序列包括如人β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4的核苷酸序列。可替代地，编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列可包括如人β2微球蛋白基因外显子2、3和4所示的核苷酸序列。编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列可进一步包括小鼠β2微球蛋白基因外显子1的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括编码包括人β2微球蛋白多肽的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述多肽能够结合到MHCI蛋白。

本发明进一步提供了一种非人动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，在其基因组中包括编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列和编码人或人源β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，本发明提供非人类动物，在其基因组中包括编码嵌合人/非人MHCI多肽的第一核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括人MHCI多肽的胞外域；和编码人或人源化β2微球蛋白多肽第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列位于内源性非人MHCI基因座，所述第二核苷酸序列位于内源性非人β2微球蛋白基因座，且其中所述动物表达嵌合人/非人MHCI多肽和人或人源化β2微球蛋白多肽。在一方面，所述动物是小鼠。因此，所述内源性MHCI基因座可以选自由H-2K，H-2D和H-2L基因座组成的组。在一个实施方式中，所述内源性小鼠基因座是H-2K基因座(如H-2Kb基因座)。在另一个实施方式中，所述内源性小鼠基因座是H-2D基因座。在一个实施方式中，所述人MHCI多肽选自由HLA-A，HLA-B和HLA-C多肽组成的组。在一方面，所述人MHCI多肽是HLA-A，如HLA-A2(如HLA-A2.1)。在另一个实施方式中，所述人MHCI多肽是HLA-B，如，HLA-B27。在各种实施例中，所述第一和第二核苷酸序列包括在非人类动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)的种系中。

因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种小鼠，其在基因组中包括编码嵌合人/小鼠MHCI多肽的第一核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括人HLA-A的胞外域(如HLA-A2)和小鼠部分包括小鼠H-2K的跨膜域和胞浆域；和编码人源化或β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列位于内源性H-2K基因座，和所述第二核苷酸序列位于内源性小鼠β2微球蛋白基因座，且其中所述小鼠表达的嵌合人/小鼠MHCI多肽和人或人源化β2微球蛋白多肽。在另一个实施方式中，本发明提供一种小鼠，其在基因组中包括编码嵌合人/小鼠MHCI多肽的第一核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括人HLA-B(如HLA-B27)的胞外域，和小鼠部分包括小鼠H-2D的跨膜域和胞浆域；以及编码人或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列位于内源性H-2D基因座，第二核苷酸序列位于内源性小鼠β2微球蛋白基因座，并且其中所述小鼠表达嵌合人/小鼠MHCI多肽和人或人源化β2微球蛋白多肽。在一个实施方式中，所述非人类动物(如小鼠)，其包括嵌合MHCI多肽和人或人源化β2微球蛋白多肽，其不从它们各自的内源性基因座表达内源性非人MHCI多肽(如小鼠H-2K或H-2D多肽)的胞外域(如功能性胞外域)和/或功能性内源性非人(如小鼠)β2微球蛋白多肽。在一方面，所述动物(如小鼠)包括所述第一和第二核苷酸序列的每个的两个拷贝。在另一方面，所述动物(如小鼠)包括所述第一核苷酸序列的一个拷贝和第二核苷酸序列的一个拷贝。因此，所述动物可为第一和第二核苷酸序列的纯合子或杂合子。

在一方面，所述第一核苷酸序列与内源非人(如小鼠)MHCI调控元件可操作地连接，且所述第二核苷酸序列与内源非人(如小鼠)β2微球蛋白元件可操作地连接。所述嵌合多肽的人类部分可以包括人MHCI多肽的α1、α2和α3域。所述第二核苷酸序列可以包括如人微球蛋白β2基因的外显子2至外显子4所示的核苷酸序列。或者，所述第二核苷酸序列可包括如人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4所示的核苷酸序列。在一方面，包括嵌合MHCI多肽和人或人源化β2微球蛋白多肽的所述小鼠，与没有人或人源化β微球蛋白多肽的表达情况下的嵌合人/小鼠MHCI多肽的表达相比，可以是人或人源化β2微球蛋白的表达增加了嵌合人/小鼠MHCI多肽的表达的小鼠。

此外，本发明提供了一种小鼠，在其基因组中，如，在其内源性MHCI基因座上，包括一个或多个，例如一个、两个、三个、四个、五个或六个编码嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，并且在其内源性β2微球蛋白基因座上还包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述嵌合MHCI多肽的人类部分包括人MHCI多肽的胞外域，和小鼠部分包括小鼠MHCI多肽的跨膜域和胞浆域。因此，所述小鼠可以表达一种或多种，例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个嵌合人类/小鼠MHCI多肽和人或人源化β2微球蛋白多肽。

还提供了制备如本文所述的基因工程改造的非人类动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)的方法。因此，在一个实施方式中，本申请提供了一种修饰非人类动物，如，啮齿动物(如小鼠或大鼠)的MHCI基因座来表达嵌合人/非人，如，人/啮齿动物(如人/小鼠或人/大鼠)MHCI多肽的方法，其中所述方法包括在所述内源性MHCI基因座用编码人类MHCI多肽的胞外域的核苷酸序列替换编码非人胞外域的核苷酸(如，啮齿类MHCI多肽)序列。在另一个实施方式中，本发明提供了修饰非人类动物(如，啮齿类动物(如小鼠或大鼠))的β2微球蛋白基因座以表达人或人源化β2微球蛋白多肽的方法，其中所述方法包括在所述内源性非人，如，啮齿动物(如小鼠或大鼠)β2微球蛋白基因座用编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列替换编码非人，如，啮齿动物(如小鼠或大鼠)β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在这些方法中，所述替换可在单个ES细胞中进行，并且可以将所述单个ES细胞引入非人类动物，如，啮齿动物(如小鼠或大鼠)，以制备胚胎。可交配所得非人类动物，如啮齿动物(如小鼠或大鼠)以制备双重人源化动物。

因此，本发明还提供了制备双重人源化动物(如啮齿类动物(如小鼠或大鼠))的方法。在一个实施方式中，本发明提供了制备基因修饰小鼠的方法，所述小鼠包括(a)修饰第一小鼠的MHCI基因座以表达嵌合人/小鼠MHCI多肽，其包括在内源性小鼠MHCI基因座中用编码人MHCI多肽的胞外域的核苷酸序列替换编码小鼠MHCI多肽的胞外域的核苷酸序列；(b)修饰第二小鼠的β2微球蛋白基因座以表达人或人源化β2微球蛋白多肽，其包括在内源性小鼠β2微球蛋白基因座中用编码人或人源化的β2微球蛋白多肽的核苷酸序列替换编码小鼠β2微球蛋白多肽的核苷酸序列；并且(c)将所述第一和第二小鼠交配以制备基因修饰小鼠，所述基因修饰小鼠在其基因组中包括编码嵌合人/小鼠MHCI多肽的第一核苷酸序列和编码人或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列，其中所述基因修饰小鼠表达所述嵌合人/小鼠MHCI多肽和所述人或人源化β2微球蛋白多肽。在一些实施方式中，所述MHCI基因座选自H-2K、H-2D和H-2L；在一些实施方式中，所述人MHCI多肽选自HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一个实施方式中，所述MHCI基因座是H-2K基因座，所述人MHCI多肽是HLA-A(如HLA-A2)，并且所述小鼠表达嵌合HLA-A/H-2K多肽(如HLA-A2/H-2K多肽)。在一方面，所述嵌合HLA-A2/H-2K多肽包括HLA-A2多肽的胞外域和H-2K多肽的胞浆域和跨膜域。在另一个实施方式中，所述MHCI基因座是H-2D基因座，所述人MHCI多肽是HLA-B(如HLA-B27)，所述小鼠表达嵌合HLA-B2/H-2D多肽(如HLA-B27/H-2D多肽)。在一方面，所述嵌合HLA-B27/H-2D多肽包括HLA-B27多肽的胞外域和H-2D多肽的胞浆域和跨膜域。在一个方面，所述第二核苷酸序列包括如人β2微球蛋白基因外显子2、3和4(如外显子2至外显子4)中所示的核苷酸序列，以及如小鼠β2微球蛋白基因外显子1所示的核苷酸序列。

本文还提供一种编码嵌合人/非人MHCI多肽的非人类嵌合MHCI基因座，其包括编码人MHCI胞外域的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与编码非人MHCI跨膜域和胞浆域的第二核苷酸序列可操作地连接。在一方面，所述嵌合MHCI基因座在非人类动物基因组中的内源性MHCI位置上。在一方面，所述嵌合MHCI基因座表达嵌合人/非人(如人/啮齿动物，如人/小鼠或人/大鼠)的MHCI多肽。在一个实施方式中，所述人MHCI选自HLA-A，HLA-B和HLA-C(如HLA-B27或HLA-A2)。在一个实施方式中，所述非人类MHCI是选自H-2D、H-2K和H-2L(如H-2D或H-2K)的小鼠MHCI。在一个实施方式中，所述嵌合MHCI基因座表达一种或多种嵌合人/非人MHCI多肽。

本文还提供基因修饰β2微球蛋白基因座，其包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在一方面，所述基因座包括包括如所述人β2微球蛋白基因外显子2、3和4(如外显子2-4)序列所示的第一核苷酸序列，和包括如非人(如啮齿动物，如大鼠或小鼠)β2微球蛋白基因外显子1序列所示的第二核苷酸序列。在一个实施方式中，所述第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列可操作地连接。在一方面，所述基因修饰β2微球蛋白基因座是在非人类动物基因组中的内源性β2微球蛋白位置上。在一方面，所述基因修饰β2微球蛋白基因座表达人或人源化β2微球蛋白多肽。

在一方面，所述非人嵌合MHCI基因座通过如本申请所述任何用于制备基因修饰的非人动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)的方法获得。在一方面，所述基因修饰β2微球蛋白基因座通过如本文所述任何用于制备基因修饰非人类动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)的方法获得。

本文还提供细胞，如，分离的抗原呈递细胞，所述细胞来源于如本文所述的非人类动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)。还提供来源于如本文所述的非人类动物的组织和胚胎。

在另一个实施方式中，本发明提供用于鉴定引发免疫应答的抗原或抗原表位的方法，用于评估候选疫苗的方法，用于鉴定对人类病原体或癌症抗原高亲和力T细胞的方法。

除非另有明示或者从上下文中是显而易见的，本申请所述的任意实施方式和方面均可以用于彼此之间组合。通过对随后详细描述的回顾，其他实施方式对本领域技术人员将是显而易见的。下述的详细描述包括对本发明不同实施方式的示例性表述，其对所主张本发明不具有限制作用。附图构成本说明书的一部分，其与该描述一起，仅用于说明实施方式，并非用于限制本发明。

附图说明

图1是I类MHC分子的四个结构域的示意图：包括α1、α2和α3结构域的α链以及非共价结合的第四结构域，β2微球蛋白(β2m)。灰色的圆圈代表结合在肽结合裂隙的肽。

图2是人HLA的相对基因组结构的示意图(未按比例)，表示I类、II和III类基因。

图3是小鼠MHC的相对基因组结构的示意图(未按比例)，表示I类、II和III类基因。

图4表示病毒载体构建体，其包括编码带有IRES-GFP报告子的嵌合HLA-A/H-2K多肽的cDNA(A)；以及比较在转染了HLA-A2(虚线)、HLA-A2/H-2K(点线)或没有转染(实线)的MG87细胞中人类HLA-A2表达直方图(B)(单独(左)或者与人源化β2微球蛋白(右)共转染)。在(B)中呈现的水平门控数据表示为表达如(C)图表中的构建体的细胞的百分比。

图5是用于制备表达人HLA-A2蛋白胞外区的嵌合H-2K基因座的靶向策略示意图(未按比例)。小鼠序列用黑色表示，人序列用白色表示。L＝先导，UTR＝非翻译区，TM＝跨膜域，CYT＝胞浆域，HYG＝潮霉素。

图6A表明HLA-A2(左)和H-2K(右)在从野生型(WT)小鼠或携带嵌合HLA-A2/H-2K基因座(HLA-A/H-2KHET)的杂合小鼠分离的细胞中的表达(％总细胞)。

图6B为嵌合HLA-A2/H-2K蛋白在携带嵌合HLA-A2/H-2K基因座杂合小鼠的体内表达的点阵图。

图7示出了在小鼠β2微球蛋白基因座的人源化β2微球蛋白基因的靶标策略(未按比例)。小鼠序列为黑色，人序列为白色。NEO＝新霉素。

图8示出了HLAI类和人类β2微球蛋白在从野生型(WT)小鼠、嵌合HLA-A2/H-2K杂合小鼠以及嵌合HLA-A2/H-2K和人源化β微球蛋白杂合小鼠(双杂合；I类/β2mHET)的血液中分离的细胞上的表达的代表性点阵图。

图9示出了人HLAI类在从野生型(WT)，嵌合HLA-A2/H-2K杂合(I类HET)和嵌合HLA-A2/H2K/人源化β2微球蛋白双重杂合子(I类/β2mHET)小鼠的血液中分离的细胞上的表达(X轴)的代表性直方图。

图10示出了在flu(左)或EBV(右)肽的存在下，暴露于来自野生型小鼠(WTAPC)或对嵌合HLA-A2/H-2K和人源化β2微球蛋白(双HETAPC)都是杂合子的小鼠的抗原呈递细胞(APC)的人T细胞的IFNγElispot测定结果。使用单因素方差分析(onewayANOVA)与Tukey多重比较后测试进行统计分析。

图11是用于制备表达人类HLA-B27基因的胞外域(在描述的特定实施方式中，为人的α1、α2和α3结构域)，和内源性小鼠H-2D的先导、跨膜域和胞浆域的嵌合HLA-B27/H-2D1基因座的靶向策略的示意图(未按比例)。也包括了用于基因分型(见表2)的探针的位置。hEX1＝人类外显子1；mEX1＝小鼠外显子1；h2、h3、h4＝人外显子2、3和4；m5、m6、m7、m8＝小鼠外显子5、6、7和8；mTM＝m5中小鼠跨膜域。如果没有另外说明，小鼠序列表示为黑色，人序列表示为白色。

图12，顶部两个图，显示了人HLAI类在从野生型(WT；右上图)或嵌合HLA-B27/H-2D杂合/人源化β2微球蛋白杂合(B27/hB2MHet/Het；左上图)小鼠的血液中分离的细胞上的表达的代表性直方图；底部两个图描绘了人β2微球蛋白在从WT或B27/hB2MHet/Het小鼠的血液中分离的细胞上表达的代表性直方图。MFI＝平均荧光强度；单独sec＝只进行二级抗体染色。

发明详述

定义

本发明提供了表达人或人源化的MHCI和/或β2微球蛋白多肽的基因修饰的非人动物(例如小鼠、大鼠、家兔等)；包含其的胚胎、细胞和组织；制备其的方法；以及使用其的方法。除非另有定义，本申请中使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在现有技术中已有的含义，除非存在相反的明确指示或从该术语或短语使用的上下文中是显而易见的。

术语“保守的”当用于描述保守的氨基酸取代时，包括氨基酸残基被带有具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基团的其他氨基酸残基取代。可以通过修饰核苷酸序列实现保守的氨基酸取代，以引入编码保守的取代的核苷酸改变。在通常情况下，保守的氨基酸取代将基本上不改变目的蛋白的功能性性质，例如MHCI分子递呈目的肽的能力。带有具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的示例包括脂肪族侧链如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族-羟基侧链如丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的侧链如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香侧链如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫侧链如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守的氨基酸取代基团包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方式中，保守的氨基酸取代可以是使用丙氨酸取代蛋白中的任意天然残基，如用在例如丙氨酸扫描诱变中。在一些实施方式中，Gonnet等((1992)ExhaustiveMatchingoftheEntireProteinSequenceDatabase,Science256:1443-45)披露保守的氨基酸取代使得在PAM250log-似然性矩阵中具有正值，其通过引用并入本申请。在一些实施方式中，所述取代是适度保守的取代，其中所述取代在PAM250log-似然性矩阵中具有非负值。

因此，本发明也包括转基因非人类动物，其基因组包括编码人或人源化MHCI多肽和/或β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括在本申请中所描述的氨基酸序列中的保守氨基酸取代。

本领域技术人员将理解，除了在本申请中所述的编码人或人源化MHCI多肽和/或β2微球蛋白的核酸残基，由于遗传密码的简并性，其它核酸可以编码本发明的多肽。因此，除了转基因的非人类动物外(其基因组中包括用保守的氨基酸取代基编码MHCI多肽和/或β2微球蛋白的核苷酸序列)，本申请也提供了一种非人类动物，由于遗传密码的简并性，其基因组包括不同于本申请中所描述的核苷酸序列。

术语“同一性”当与序列结合使用时包括根据本领域公知的能够用于测定核苷酸和/或氨基酸序列同一性的多种不同算法确定的同一性。在本申请所述的一些实施方式中，使用开放缺口罚分为10.0，延伸缺口罚分为0.1的ClustalWv.1.83(slow)比对和使用Gonnet相似性矩阵(MacVector^TM10.0.2,MacVectorInc.,2008)确定同一性。针对序列的同一性比较序列的长度将取决于特定的序列。在不同实施方式中，通过从其N-末端至其C-末端比较成熟蛋白的序列确定其同一性。在不同实施方式中，当将嵌合的人/非人序列与人序列进行比较时，将所述嵌合的人/非人序列的人部分(而不是非人部分)用于进行针对确定人序列与嵌合的人/非人序列的人部分之间的同一性水平目的的比较(例如将嵌合人/小鼠蛋白的人胞外域与人蛋白的人胞外域进行比较)。

术语“同源性”或“同源的”涉及序列例如核苷酸或氨基酸序列时指两条序列根据最佳比对和比较，例如至少约75％的核苷酸或氨基酸、例如至少约80％的核苷酸或氨基酸、例如至少约90-95％的核苷酸或氨基酸、例如超过97％的核苷酸或氨基酸是一致的。本领域技术人员将理解对于最佳基因靶向所述靶向构建体应含有与内源性DNA序列具有同源性的臂(“即同源臂”)；因此，同源重组可以发生在靶向构建体与被靶向的内源性序列之间。

术语“可操作地连接”指并列的，其中这样描述的所述组分与允许其以其意向的方式发挥功能相关。正因如此，编码蛋白的核酸序列可以与调控序列(例如，启动子、增强子、沉默子序列等)可操作地连接以保持正确的转录调控。此外，本发明嵌合或人源化蛋白的不同部分可以可操作地连接以保持合适的折叠、加工、靶向、表达，以及所述蛋白在细胞中的其他功能性性质。除非另有说明，本发明嵌合或人源化蛋白的不同结构域彼此之间可操作地连接。

术语“MHCI复合物”或类似的，如本文所述，包括MHCIα链多肽和β2微球蛋白多肽之间的复合物。术语“MHCI多肽”或类似的，如本文所述，包括单独的MHCIα链多肽。典型地，术语“人MHC”和“HLA”可以互换使用。

在基因替换中术语“取代”意指将外源遗传物质放入内源性遗传基因座，由此替换具有直系同源或同源核酸序的内源基因的全部或一部分。如以下实施例所述，小鼠MHCI和β2微球蛋白多肽的内源性基因座编码部分的核酸序列分别由编码人MHCI的部分和β2微球蛋白多肽部分的核苷酸序列所取代。

关于功能性多肽，如本申请所用的“功能性”是指一种多肽，其保留通常与天然蛋白相关联的至少一种生物活性。例如，在本发明的一些实施方式中，在内源基因座(例如，在内源性非人MHCI和/或β2微球蛋白基因座的取代)的取代导致不能表达功能性内源多肽的基因座。同样，在本申请中所用的关于蛋白的功能性胞外域的术语“功能性”，是指保留其功能的胞外域，例如，在MHCI的情况下，能够结合抗原，结合T细胞共同受体的能力等。在本发明的一些实施方式中，在内源性MHC基因座的取代导致基因座不能表达内源性MHC的胞外域(例如，功能性胞外域)，而表达人MHC的胞外域(例如，功能性的胞外域)。

下文描述了基因修饰MHCI非人类动物的几个方面，如，动物种类；动物品系；细胞类型；筛选、检测和其他方法；使用方法等等，将适用于基因工程改造的β2微球蛋白和MHCI/β2微球蛋白动物。

基因修饰MHCI动物

在各种实施例中，本发明通常提供了基因修饰非人动物，所述非人动物在其基因组中包括编码人或人源化MHCI多肽的核苷酸序列；因此，所述动物表达人或人源化MHCI多肽。

MHC基因分为三类：I类、II类和III类，所有这些都由人类6号染色体或小鼠17号染色体编码。所述人和小鼠MHC类别的相对结构示意图分别如图2和3所示。MHC基因是小鼠和人类基因组中最具多态性的基因。MHC多态性被假定为在提供进化优势中十分重要；序列变化可导致肽结合的差异性，其允许更好地向细胞毒性T细胞呈递病原体。

MHCI类蛋白包括胞外域(其包括三个结构域：α₁、α₂和α₃)，跨膜域和胞浆尾。该α₁和α₂结构域构成所述肽的结合裂隙，而α₃与β2微球蛋白相互作用。

除了其与β2微球蛋白相互作用，所述α₃结构域与TCR共受体CD8相互作用，促进抗原特异性活化。虽然MHCI类与CD8的结合比TCR与MHCI类的结合弱约100倍，但CD8的结合增强了TCR结合的亲和力Wooldridgeetal.(2010)MHCClassIMoleculeswithSuperenhancedCD8BindingPropertiesBypasstheRequirementforCognateTCRRecognitionandNonspecificallyActivateCTLs,J.Immunol.184:3357-3366。有趣的是，增加MHCI类与CD8的结合消除了CTL活化中的抗原特异性。同上。

CD8结合MHCI类分子是物种特异性的；CD8的小鼠同源物，LYT-2，显示出与H-2D^d分子在α3结构域结合，但它并没有结合HLA-A分子。Connollyetal.(1988)TheLyt-2MoleculeRecognizesResiduesintheClassIα3DomaininAllogeneicCytotoxicTCellResponses,J.Exp.Med.168:325-341。差异性结合可能是由于CD8上的CDR样决定基(CDR1-和CDR2样)造成的，所述CD8在人类和小鼠之间不保守。Sandersetal.(1991)MutationsinCD8thatAffectInteractionswithHLAClassIandMonoclonalAnti-CD8Antibodies,J.Exp.Med.174:371-379；Vitielloetal.(1991)AnalysisoftheHLA-restrictedInfluenza-specificCytotoxicTLymphocyteResponseinTransgenicMiceCarryingaChimericHuman-MouseClassIMajorHistocompatibilityComplex,J.Exp.Med.173:1007-1015；and,Gaoetal.(1997)CrystalstructureofthecomplexbetweenhumanCD8andHLA-A2,Nature387:630-634。据报道，CD8在α3结构域的保守区域(在位置223-229)结合HLA-A2。在HLA-A中的单个取代(V245A)减少CD8结合HLA-A，伴随大量T细胞介导的裂解减少Salteretal.(1989),Polymorphismintheα3domainofHLA-AmoleculesaffectsbindingtoCD8,Nature338:345348。一般情况下，HLA-A分子的α3结构域多态性也影响其与CD8的结合。同上。在小鼠中，在H-2D^d的残基227的氨基酸取代影响小鼠Lyt-2与H-2D^d的结合，并且转染了突变H-2D^d的细胞不被CD8+T细胞裂解。Potteretal.(1989)Substitutionatresidue227ofH-2classImoleculesabrogatesrecognitionbyCD8-dependent,butnotCD8-independent,cytotoxicTlymphocytes,Nature337:73-75。

因此，由于MHCI类α3结构域和CD8的相互作用的种属特异性，包括用人HLA-A2α3结构域替换H-2Kα3结构域的MHCI复合物在没有人CD8时，在小鼠中(即体内)无功能。在HLA-A2转基因的动物中，用人α3结构域取代小鼠α3结构域导致T细胞应答的恢复。Irwinetal.(1989)Species-restrictedinteractionsbetweenCD8andtheα3domainofclassIinfluencethemagnitudeofthexenogeneicresponse,J.Exp.Med.170:1091-1101；Vitielloetal.(1991),同上。

小鼠MHCI类蛋白的跨膜域和胞浆尾还具有重要的功能。MHCI跨膜域的一个功能是促进由HLA-A2调节的同型细胞粘附的(增强或抑制附着)，可能是由于表面的MHC分子的交联(或连接)的结果。Wagneretal.(1994)LigationofMHCClassIandClassIIMoleculesCanLeadtoHeterologousDesensitizationofSignalTransductionPathwaysThatRegulateHomotypicAdhesioninHumanLymphocytes,J.Immunol.152:5275-5287。细胞粘附可受结合在HLA-A2分子的不同表位的mAb影响，这表明HLA-A2上有多个位点涉及调节同型细胞粘附；取决于结合表位，该影响可以是增强或抑制HLA-A2依赖的附着力。同上。

胞浆尾，由MHCI基因外显子6和7编码，据报道在细胞表面正确表达和用于LIR1介导的NK细胞细胞毒性的抑制是必需的。Grudaetal.(2007)IntracellularCysteineResiduesintheTailofMHCClassIProteinsAreCrucialforExtracellularRecognitionbyLeukocyteIg-LikeReceptor1,J.Immunol.179:3655-3661。胞浆尾是至少一些MHCI分子通过在其半胱氨酸残基形成二硫键进行多聚化所必需的，并且因此在集群和NK细胞识别中发挥作用。Lynchetal.(2009)NovelMHCClassIStructuresonExosomes,J.Immunol.183:1884-1891。

HLA-A2的胞浆域包括一个组成型磷酸化的丝氨酸残基和磷酸化酪氨酸，虽然在Jurkat细胞中缺乏胞浆域的突变HLA-A2分子表现出正常的表达、细胞骨架关联、聚集和细胞内吞内化。Guretal.(1997)StructuralAnalysisofClassIMHCMolecules:TheCytoplasmicDomainIsNotRequiredforCytoskeletalAssociation,Aggregation,andInternalization,Mol.Immunol.34(2):125-132。缺乏胞浆域的截短HLA-A2分子显然表达正常且与β2微球蛋白相结合。同上。

然而，一些研究已经表明，胞浆尾在细胞内转运，树突状细胞(DC)介导的抗原呈递和CTL启动中是关键。由外显子6编码的酪氨酸残基被证明是通过内体隔间的MHCI运输、外源抗原呈递和CTL启动所必需的；而缺失外显子7引起抗病毒CTL应答增强。Lizeeetal.(2003)ControlofDendriticCross-PresentationbytheMajorHistocompatibilityComplexClassICytoplasmicDomain,NatureImmunol.4:1065-73；Bashaetal.(2008)MHCClassIEndosomalandLysosomalTraffickingCoincideswithExogenousAntigenLoadinginDendriticCells,PLoSONE3:e3247；andRodriguez-Cruzetal.(2011)NaturalSpliceVariantofMHCClassICytoplasmicTailEnhancesDendriticCell-InducedCD8+T-CellResponsesandBoostsAnti-TumorImmunity,PLoSONE6:e22939。

在各种实施方式中，本发明提供了一种基因修饰非人动物(如小鼠、大鼠、兔等)，在其基因组中包括编码人或人源化MHCI类多肽的核苷酸序列。所述非人类动物可以在其基因组中包括编码部分人和部分非人的MHCI多肽的核苷酸序列，如非人动物表达的嵌合人/非人MHCI多肽。在一方面，所述非人动物只表达人或人源化MHCI多肽，如嵌合人/非人MHCI多肽，并且不从内源性MHCI基因座表达内源非人MHCI蛋白(如功能性内源性非人MHCI蛋白)。

在一个实施方式中，本申请提供了一种非人动物，如啮齿动物，如大鼠或小鼠，在其基因组中，如，在内源性非人MHCI基因座包括，编码人类MHCI多肽的核苷酸序列。在另一个实施方式中，本申请提供了一种非人动物，如啮齿动物，如大鼠或小鼠，在其基因组中，如，在内源性MHCI基因座中包括，编码嵌合人/非人类MHCI多肽的核苷酸序列。

在一个实施方式中，所述嵌合人/非人MHCI多肽在其人类部分包括结合人MHCI多肽的肽结合结构域。在一方面，所述嵌合多肽的人类部分包括人MHCI的胞外域。在本实施方式中，所述嵌合多肽的人类部分包括人MHCIα链的胞外域。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人类部分包括人MHCI的α1和α2结构域。在另一个实施方式中，所述嵌合多肽的人类部分包括人MHCI的α1、α2和α3结构域。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人部分(如所述嵌合多肽的胞外域)包括人先导序列。在另一个实施方式中，所述嵌合多肽(如所述嵌合多肽的胞外域)包括非人的先导序列(如内源性非人先导序列)。

人或人源化MHCI多肽可以来源于由HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-E，HLA-F或HLA-G基因座的任意一个编码的功能性人HLA分子。常用的HLA抗原列表在Shankarkumar等.((2004)TheHumanLeukocyteAntigen(HLA)System,Int.J.Hum.Genet.4(2):91-103)(通过引用并入本文)中进行说明。Shankarkumar等还对本领域中使用的HLA命名进行了简要说明。关于HLA命名法和各种HLA等位基因的其他信息可以在Holdsworth等，(2009)TheHLAdictionary2008:asummaryofHLA-A,-B,-C,-DRB1/3/4/5,andDQB1allelesandtheirassociationwithserologicallydefinedHLA-A,-B,-C,-DR,and–DQantigens,TissueAntigens73:95-170中找到,并且最近被Marsh等，(2010)NomenclatureforfactorsoftheHLAsystem,2010,TissueAntigens75:291-455更新，二者均通过引用并入本文。因此，所述人或人源化MHCI多肽可来源于本文所述的任意功能性人HLAI类分子。

在一个具体的方面中，所述人或人源化MHCI多肽来源于人HLA-A。在一个具体的实施方式中，所述HLA-A多肽是HLA-A2多肽(如，和HLA-A2.1多肽)。在一个实施方式中，所述HLA-A多肽是由HLA-A*0201等位基因，如HLA-A*02：01：01：01等位基因，编码的多肽。所述HLA-A*0201等位基因常用于北美人群。虽然本申请实施例描述了该特定HLA序列，本文中涵盖任何合适的HLA-A序列，如，在人类群体中显示的HLA-A2多态变体，具有一个或多个保守或非保守氨基酸修饰的序列，由于遗传密码简并性与本文所述序列不同的核酸序列等。

在一方面，本申请提供了表达人HLA-A2序列的非人类动物，其中所述人HLA-A2序列包括一个或多个保守或非保守修饰。

在一方面，本申请提供了表达人HLA-A2序列的非人类动物，其中所述人HLA-A2序列与人HLA-A2序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一个具体实施方式中，所述人HLA-A2序列与实施例中所述的人HLA-A2序列具有至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一个实施方式中，所述人HLA-A2序列包括一个或多个保守取代。在一个实施方式中，所述人HLA-A2序列包括一个或多个非保守取代。

在另一具体方面，所述人或人源化MHCI多肽来源于选自HLA-B和HLA-C的人MHCI。在一方面，所述人或人源化MHCI来源于HLA-B，如，HLA-B27。在其他实施方式中，所述人或人源化MHCI来源于HLA-A3、HLA-B7、HLA-B27、HLA-Cw6等。

因此，在一个方面，所述人或人源化MHCI来源于HLA-B。在一个具体实施方式中，所述HLA-B多肽是HLA-B27。在一个实施方式中，所述HLA-B27多肽是由HLA-B27等位基因亚型B*2701-2759编码的多肽。所述HLA-B27的使用通常与人类群体中强直性脊柱炎相关。虽然本申请实施例描述了该特定HLA序列，但本文涵盖任何合适的HLA-B27序列，如，人类群体中显示的HLA-B27多态变体，具有一个或多个保守或非保守氨基酸修饰的序列，由于遗传密码简并性与本文所述序列不同的核酸序列等。

在一个方面，本申请提供表达人HLA-B27序列的非人动物，其中所述人HLA-B27序列包括一个或多个保守或非保守修饰。

在一个方面，本申请提供了表达人HLA-B27序列的非人动物，其中所述人HLA-B27序列与人HLA-B27序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一个具体的实施方式中，所述人HLA-B27序列与实施例中所述的人HLA-B27序列具有至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一个实施方式中，所述人HLA-B27序列包括一个或多个保守取代。在一个实施方式中，所述人HLA-B27序列包括一个或多个非保守取代。

在一个方面，所述嵌合人/非人MHCI多肽的非人部分包括所述非人MHCI多肽的跨膜域和/或胞浆域。在一个实施方式中，所述非人类动物是小鼠，并且所述非人MHCI多肽选自H-2K、H-2D和H-2L。在一个实施方式中，所述非人MHCI多肽是H-2K，如，H-2Kb。在另一个实施方式中，所述非人MHCI多肽是H-2D，如，H-2D1。虽然在实施例中已描述了具体的H-2K和H-2D序列，但本申请包括任何合适的H-2K或H-2D序列，如，多态变体，保守/非保守氨基酸取代等。

本文所述的非人类动物可以在其基因组中包括编码人或人源化MHCI多肽的核苷酸序列，如，嵌合人/非人MHCI多肽，其中编码所述多肽的核苷酸序列位于内源性非人MHCI基因座(如，H-2K或H-2D基因座)。在一个方面，这导致用编码人或人源化MHCI多肽的核苷酸序列替换内源性MHCI基因或其一部分，如，得到编码本文所述的嵌合人/非人MHCI多肽的嵌合基因。在一个实施方式中，所述替换包括用编码相同多肽的人核苷酸序列(如，HLA-A2或HLA-B27的核苷酸序列)替换编码非人MHCI肽结合结构域或非人MHCI胞外域的内源性核苷酸序列。在此实施方式中，所述替换不包括对编码非人MHCI多肽(如，H-2K或H-2D多肽)的跨膜域和/或胞浆域的MHCI序列的替换。因此，所述非人类动物在内源性非人MHCI基因座包括嵌合人/非人核苷酸序列，以及从内源性非人MHCI基因座表达嵌合人/非人MHC多肽。

嵌合人/非人多肽可以是这样的，它包括人或非人先导(信号)序列。在一个实施方式中，所述嵌合多肽包括人MHCI蛋白，如，HLA-A2蛋白(例如，HLA-A2.1先导序列)的先导序列。因此，所述编码嵌合MHCI多肽的核苷酸序列可以与编码人MHCI先导序列的核苷酸序列可操作地连接。

在另一个实施方式中，所述嵌合多肽包括MHCI蛋白的非人先导序列，如，内源性MHCI蛋白的非人先导序列。在一个实施方式中，所述嵌合多肽包括非人MHCI蛋白的先导序列，如，小鼠H-2D蛋白(如小鼠H-2D1先导序列)。因此，所述编码嵌合MHCI多肽的核苷酸序列可以与编码非人MHCI先导序列的核苷酸序列可操作地连接。

嵌合人/非人MHCI多肽可以在其人类部分包括完全或基本上全部的人MHCI多肽的胞外域。因此，所述人类部分可包括至少80％、优选至少85％、更优选至少90％，如，95％或更多的编码人MHCI多肽胞外域的氨基酸(如，HLA-A2多肽，HLA-B27多肽)。在一个实施方式中，所述人MHCI多肽的基本上全部胞外域缺乏人MHCI先导序列。在另一个实施方式中，所述嵌合人/非人MHCI多肽包括人MHCI先导序列。

此外，所述嵌合MHCI多肽可以在内源性非人类的调控元件，例如，啮齿动物MHCI调节性动物的控制下表达。这样的安排有助于所述嵌合MHCI多肽在非人类动物中的适当表达，如，在非人类动物的免疫反应期间。

所述基因修饰的非人类动物可以选自以下组：小鼠、大鼠、兔、猪、牛(如牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(如狨猴，恒河猴)。对于非人类动物，其中合适的可基因修饰的ES细胞不容易获得，可用其它方法来制备包括基因修饰非人类动物。这样的方法包括，如，修饰非ES细胞基因组(如成纤维细胞或诱导的多能细胞)以及使用核转移以将修饰的基因组核转移到合适的细胞，如，卵母细胞，以及在合适的条件下在非人类动物中妊娠所述修饰细胞(如所述修饰的卵母细胞)以形成胚胎。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠。在另一个实施方式中，所述小鼠是选自由以下品系构成的组的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等(1999)Revisednomenclatureforstrain129mice，MammalianGenome10:836，亦参见Auerbach等(2000)EstablishmentandChimeraAnalysisof129/SvEv-andC57BL/6-DerivedMouseEmbryonicStemCellLines)。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合。在另一个特定实施方式中，所述小鼠是前述129品系的混合或前述BL/6品系的混合。在一个特定实施方式中，所述混合的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在又另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系和另一个前述品系的混合。

在一个实施方式中，所述非人动物是大鼠。在一个实施方式中，所述大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、SpragueDawley品系、Fischer品系、F344、F6和黑刺鼠。在一个实施方式中，所述大鼠品系是两种或多种选自下组的品系的混合：Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6和黑刺鼠。

因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种基因修饰的小鼠，在其基因组中包括编码嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括肽结合结构域或人MHCI(如人HLA-A或HLA-B，如人HLA-A2或HLA-B27(如人HLA-A2.1))的胞外域(如功能性肽结合结构域或胞外域)。在一些实施方式中，所述小鼠不表达肽结合结构域或从其内源性小鼠基因座表达的内源性小鼠多肽的胞外域。所述人类MHCI的肽结合结构域可以包括α1和α2结构域。可替代地，所述人MHCI的肽结合结构域可以包括α1、α2、和α3结构域。在一个方面，所述人MHCI的胞外域包括人MHCIα链的胞外域。在一个实施方式中，所述内源性小鼠基因座是H-2K或H-2D基因座(如H-2Kb的或H-2D1)，以及所述嵌合多肽的小鼠部分分别包括小鼠H-2K或H-2D多肽的跨膜域和胞浆域(如H-2Kb或H-2D1)。

因此，在一个实施方式中，本申请提供了基因修饰的小鼠，其中所述小鼠在内源性H-2K(如H-2Kb)基因座包括编码嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括人HLA-A2(如HLA-A2.1)多肽的胞外域和小鼠部分包括小鼠H-2K(例如，H-2Kb的)多肽的跨膜域和胞浆域。在一方面，所述小鼠不从内源性MHCI基因座表达小鼠H-2K(如H-2Kb)多肽胞外域，如，功能性胞外域。在一个实施方式中，所述小鼠表达来自内源性H-2K(如H-2Kb)基因座的嵌合HLA-A2/H-2K(如嵌合HLA-A2.1/H-2Kb)多肽。在各种实施例中，所述嵌合基因的表达在内源性小鼠MHCI类调控元件控制下。在一些方面，所述小鼠包括包括编码嵌合HLA-A2/H-2K多肽的核苷酸序列的嵌合MHCI基因座的两个拷贝；而在其它方面，所述小鼠包括包括编码嵌合HLA-A2/H-2K多肽的核苷酸序列的嵌合MHCI基因座的一个拷贝。因此，所述小鼠可以是编码嵌合HLA-A2/H-2K多肽的核苷酸序列的纯合子或杂合子。

在本文所述的一些实施方式中，提供了小鼠，所述小鼠在内源性小鼠H-2K基因座包括嵌合MHCI基因座。所述嵌合基因座包括编码人HLA-A2蛋白(如，人HLA-A2基因α1，α2和α3结构域)的胞外域的核苷酸序列。所述嵌合基因座缺乏编码小鼠H-2K蛋白的胞外域(例如，小鼠H-2K的α1，α2和α3结构域)的核苷酸序列。在一个方面，所述嵌合基因座缺乏编码小鼠H-2K的先导肽、α1，α2和α3结构域的核苷酸序列；并且包括人HLA-A2的先导肽、α1，α2和α3结构域，以及小鼠H-2K跨膜和胞浆域。所述嵌合基因座的各种结构域可操作地彼此连接，使得所述嵌合基因座表达的功能性嵌合人/小鼠MHCI蛋白。

在另一个实施方式中，本发明提供了基因修饰的小鼠，其中所述小鼠在内源性H-2D(如H-2D1)基因座包括编码嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括人HLA-B(如HLA-B27)多肽的胞外域，和小鼠部分包括小鼠H-2D(如H-2D1)多肽的跨膜域和胞浆域。在一个方面，所述小鼠不从内源性MHCI基因座表达小鼠H-2D多肽的胞外域，如，功能性胞外域。在一个实施方式中，小鼠从内源性H-2D基因座表达嵌合HLA-B27/H-2D多肽。在各种实施方式中，所述嵌合基因的表达受内源性小鼠MHCI类调控元件控制。在一些方面，所述小鼠包括包含编码嵌合HLA-B27/H-2D多肽的核苷酸序列的嵌合MHCI基因座的两个拷贝；而在其它方面，所述小鼠包括包括编码嵌合HLA-B27/H-2D多肽的核苷酸序列的嵌合MHCI基因座的一个拷贝。因此，所述小鼠可以是纯编码嵌合HLA-B27/H-2D多肽的核苷酸序列纯合子或杂合子。

本文所述的一些实施方式中，提供了小鼠，所述小鼠在内源性小鼠H-2D基因座包括嵌合MHCI基因座。所述嵌合基因座包括编码人HLA-B27蛋白的胞外域的核苷酸序列，如，人HLA-B27基因的α1、α2和α3结构域。所述嵌合基因座缺乏编码小鼠H-2D蛋白的胞外域的核苷酸序列(如小鼠H-2D的α1、α2和α3结构域)。在一个方面，所述嵌合基因座缺乏编码小鼠H-2D的α1、α2和α3结构域的核苷酸序列；并且包括人HLA-B27的α1、α2和α3结构域，和小鼠H-2D先导序列以及跨膜域和胞浆域。所述嵌合基因座的各种结构域可操作地彼此连接，使得所述嵌合基因座表达功能性嵌合人/小鼠MHCI蛋白。

在各种实施方式中，从如本申请所述的嵌合MHCI基因座表达功能性嵌合MHCI蛋白的非人动物，如，啮齿动物(如小鼠或大鼠)，在细胞表面展示嵌合蛋白。在一个实施方式中，所述非人动物在细胞表面以与在人类中观察到的一样的分布表达嵌合MHCI蛋白。在一个方面，所述细胞展示与嵌合MHCI蛋白的胞外部分(如人HLA-A2或HLA-B27的胞外部分)结合的肽片段(抗原片段)。在一个实施方式中，这样的嵌合蛋白质的胞外部分与所述细胞表面上的其它蛋白质相互作用，如，β2微球蛋白。

在各种实施方式中，展示嵌合MHCI蛋白(如，HLA-A2/H-2K蛋白或HL-B27/H-2D蛋白质)的细胞是一种有核细胞。在各个方面，所述细胞是抗原呈递细胞(APC)。虽然大多数的细胞在体内能在MHCI的条件下呈递抗原，但抗原呈递细胞的一些非限制性实例包括巨噬细胞、树突细胞和B细胞。其他抗原呈递细胞，包括专业的和非专业的APC，是本领域已知的，并且包括在本文中。在一些实施方式中，展示所述嵌合MHCI蛋白的细胞是肿瘤细胞，并且通过所述嵌合蛋白质呈现的肽片段来源于肿瘤。在其他实施方式中，由所述嵌合MHCI蛋白呈递的肽片段来源于病原体，如，细菌或病毒。

本文所述的嵌合MHCI蛋白可以与相同细胞或第二细胞表面上的其它蛋白质发生相互作用。在一些实施方式中，所述嵌合MHCI蛋白与所述细胞表面上的内源性非人蛋白相互作用。所述嵌合MHCI蛋白也可以与相同细胞或第二细胞表面的人或人源化蛋白相互作用。

在相同的细胞上，HLAI类分子可以功能性地与非人(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)和人β2微球蛋白相互作用。因此，在一个实施方式中，所述嵌合MHCI蛋白，如，HLA-A2/H-2K或HLA-B27/H-2D蛋白，与小鼠β2微球蛋白相互作用。虽然一些人HLAI类分子与小鼠β2微球蛋白之间的相互作用是可能的，但与人HLAI类和人β2微球蛋白之间的相互作用相比其可能会大大减少。因此，在没有人类β2微球蛋白时，细胞表面上的人MHCI的表达可能会降低。Perarnau等，(1988)Humanβ2-microglobulinSpecificallyEnhancesCell-SurfaceExpressionofHLAClassIMoleculesinTransfectedMurineCells,J.Immunol.141:1383-89。其他HLA分子，如HLA-B27，不与小鼠β2微球蛋白进行相互作用；参见，如，Tishon等，(2000)TransgenicMiceExpressingHumanHLAandCD8MoleculesGenerateHLA-RestrictedMeaslesVirusCytotoxicTLymphocytesoftheSameSpecificityasHumanswithNaturalMeaslesVirusInfection,Virology275:286-293，其报导了在基因修饰小鼠中HLA-B27功能需要人类β2微球蛋白和人CD8。因此，在另一个实施方式中，所述嵌合MHCI蛋白与人或人源化β2微球蛋白相互作用。在一些这样的实施方式中，如下文所述，所述非人类动物，如，啮齿动物(如小鼠或大鼠)，在其基因组包括人或人源化β2微球蛋白基因，并且所述动物表达功能性人或人源化β2微球蛋白多肽；因此，所述嵌合MHCI蛋白与人或人源化β2微球蛋白多肽相互作用。

在各个方面，所述嵌合蛋白(如HLA-A2/H-2K或HLA-B27/H-2D蛋白)也与第二细胞表面上的蛋白相互作用(通过其胞外部分)。所述第二细胞可以是非人细胞，如，小鼠或人来源。所述第二细胞可以来源于与表达所述嵌合MHCI多肽的细胞相同的非人类动物或相同的非人类动物物种。与嵌合蛋白的胞外部分(如，HLA-A2/H-2K或HLA-B27/H-2D)可以相互作用的非限制性的蛋白的实例包括T细胞受体(TCR)和其共受体CD8。因此，第二细胞可以是T细胞。此外，所述嵌合MHCI蛋白的胞外部分可以结合天然杀伤(NK)细胞表面的蛋白，如NK细胞表面的杀伤免疫球蛋白受体(KIR)。

T细胞或NK细胞可以结合嵌合MHCI多肽及其展示的肽片段之间形成的复合物。这种结合可分别导致T细胞活化或NK介导的细胞杀伤的抑制。一个假设是，NK细胞已经发展到杀死那些通过下调其MHCI复合物逃避T细胞介导的细胞毒作用的感染细胞或肿瘤细胞。然而，当MHCI复合物在细胞表面表达时，NK细胞受体识别它，并且抑制了NK介导的细胞杀伤。因此，在一些方面，当NK细胞结合嵌合MHCI多肽(如HLA-A2/H-2K或HLA-B27/H-2D多肽)和感染细胞或肿瘤细胞表面上所展示的肽片段之间形成的复合物，则所述NK细胞介导的细胞杀伤被抑制。

在一个实施方式中，本文所述的嵌合MHCI多肽，如，嵌合HLA-A2/H-2K或HLA-B27/H-2D多肽，与第二细胞表面的CD8蛋白相互作用。在一个实施方式中，所述嵌合MHCI多肽，如，HLA-A2/H-2K或HLA-B27/H-2D多肽与第二细胞表面的内源性啮齿动物(如小鼠或大鼠)的CD8蛋白相互作用。在一个实施方式中，所述第二细胞是T细胞。在另一个实施方式中，将所述第二细胞进行改造以表达CD8。在某些方面，所述嵌合MHCI多肽，如，HLA-A2/H-2K或HLA-B27/H-2D多肽，与所述第二细胞表面(如人细胞或啮齿动物细胞)上的人CD8相互作用。在一些这样的实施方式中，所述非人类动物，如，小鼠或大鼠，包括人CD8转基因，并且所述小鼠或大鼠表达功能性人CD8蛋白。

本文所述的嵌合MHCI多肽也可以与第二细胞上的非人(如小鼠或大鼠)的TCR、人TCR或人源化TCR相互作用。所述嵌合MHCI多肽可以与第二细胞表面上的内源性TCR(如小鼠或大鼠TCR)相互作用。所述嵌合MHCI多肽还可以与第二细胞表面上的人或人源化TCR相互作用，其中所述细胞来源于与表达所述嵌合MHCI多肽的细胞相同的动物或动物物种(如小鼠或大鼠)。所述嵌合MHCI多肽可以与人细胞表面表达的人TCR相互作用。

除了基因工程改造的非人类动物，本申请还提供了非人胚胎(如啮齿动物胚胎，如小鼠或大鼠胚胎)，其中所述胚胎包括来源于如本文所述的非人类动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)的供体ES细胞。在一个方面，所述胚胎包括包含嵌合MHCI基因的ES供体细胞和宿主胚胎细胞。

本申请还提供了一种组织，其中所述组织来源于如本文所述非人类动物(如小鼠或大鼠)，并表达嵌合MHCI多肽(如HLA-A2/H-2K多肽或HLA-B27/H-2D多肽)。

此外，本申请提供了从如本文所述的非人类动物中分离的非人类细胞。在一个实施方式中，所述细胞是ES细胞。在一个实施方式中，所述细胞是抗原呈递细胞，如树突细胞、巨噬细胞、B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是免疫细胞。在一个实施方式中，所述免疫细胞是淋巴细胞。

本申请还提供了一种非人细胞，其包括如本文所述的非人动物的染色体或其片段。在一个实施方式中，所述非人细胞包括如本文所述的非人动物的细胞核。在一个实施方式中，所述非人细胞包括核转移得到的染色体或其片段。

在一个方面，本申请提供了非人类的诱导多能细胞，其包括编码如本文所述的嵌合MHCI多肽(如HLA-A2/H-2K或HLA-B27/H-2D多肽)的基因。在一个实施方式中，所述诱导多能细胞来源于如本文所述非人类动物。

在一个方面，本申请提供了杂交瘤或四价体瘤，其来源于如本文所述非人类动物的细胞。在一个实施方式中，所述非人类动物是小鼠或大鼠。

本申请还提供了用于制备本文所述的基因工程改造的非人类动物(如基因工程啮齿动物，如小鼠或大鼠)的方法。通过所述制备基因工程改造的非人类动物方法获得了其基因组包括编码嵌合MHCI多肽的核苷酸序列的动物。在一个实施方式中，通过所述方法获得了基因工程改造的小鼠，其基因组在内源性MHCI基因座上，如，H-2K或H-2D基因座，包括编码嵌合人类/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合MHCI多肽的人类部分包括人HLA-A2或人HLA-B27的胞外域，和小鼠部分分别包括小鼠H-2K或小鼠H-2D的跨膜域和胞浆域。在一些实施方式中，如实施例中所述，该方法使用经技术制备的靶向构建体，将该构建体引入ES细胞中，并使用技术将经靶向的ES细胞克隆引入到小鼠胚胎。在一个实施方式中，所述ES细胞是129和C57BL/6小鼠品系的混合；在另一个实施方式中，所述ES细胞是BALB/c和129小鼠品系的混合。

因此，本申请还提供了用于制备本文所述的基因工程改造的非人类动物的核苷酸构建体。在一个方面，所述核苷酸构建体包括：5'和3'非人类同源臂、包括人HLA-A或HLA-B基因序列的人DNA片段以及在重组位点之间的选择盒。在一个实施方式中，所述人DNA片段是包括人HLA-A或HLA-B基因的内含子和外显子的基因组片段。在一个实施方式中，所述非人同源臂与非人MHCI类基因座(如小鼠H-2K或H-2D基因座)同源。

在一个实施方式中，所述基因组片段包括人HLA-A(如HLA-A2)的先导序列，α1结构域、α2结构域和α3域编码序列。在一个实施方式中，所述人DNA片段从5'到3'包括：HLA-A先导序列、HLA-A先导序列/α1内含子、HLA-Aα1外显子、HLA-Aα1-α2内含子、HLA-Aα2外显子、HLA-Aα2-α3内含子以及HLA-Aα3外显子。

在另一个实施方式中，所述基因组片段包括人HLA-B(如HLA-B27)α1结构域、α2结构域和α3结构域编码序列。因此，用于制备基因工程改造的动物的核苷酸序列还可包括非人类(如，小鼠，如，小鼠H-2D)的先导序列。在一个实施方式中，所述人DNA片段从5'至3'包括：人HLA-B27α1外显子、HLA-B27α1-α2内含子、HLA-B27α2外显子、HLA-B27α2-α3内含子以及HLA-B27α3外显子。

选择盒是插入靶向构建体以便于选择具有整合的目的构建体的细胞(如ES细胞)的核苷酸序列。很多合适的选择盒是现有技术所知的。通常，选择盒使得在特定的抗生素的存在下(如Neo、Hyg、Pur、CM、Spec等)进行阳性选择。此外，选择盒可位于重组位点之间，其允许在经重组酶处理后缺失该选择盒。常用的重组位点是loxP和Frt，分别由Cre和Flp酶识别，但是其它重组位点也是本领域已知的。

在一个实施方式中，所述选择盒位于人DNA片段的5'端。在另一个实施方式中，所述选择盒位于人DNA片段的3'端。在另一个实施方式中，所述选择盒位于人DNA片段内。在另一个实施方式中，所述选择盒位于人DNA片段的内含子中。在另一个实施方式中，所述选择盒位于α2-α3内含子中。在又一个实施方式中，所述选择盒可以位于非人序列中，所述非人序列是被插入到所述非人类动物的基因组中的序列的一部分。

在一个实施方式中，所述5'和3'非人同源臂分别包括内源性非人(如鼠科)MHCI类基因座5'和3'的位置(如第一先导序列的5’和非人MHCI基因的α3外显子的3')的基因组序列。在另一个实施方式中，所述5'非人类同源臂可以包括所述非人MHCI基因的α1外显子上游的基因组序列，如，包括所述非人先导序列外显子的基因组序列；在本实施方式中，所述嵌合人/非人MHCI蛋白保留所述非人先导序列。在一个实施方式中，所述内源性MHCI类基因座选自小鼠H-2K、H-2D和H-2L。

在一个具体实施方式中，所述内源性MHCI类基因座是鼠H-2K。因此，在一个方面，本申请提供了核苷酸构建体，其从5'到3'包括：包括内源性小鼠H-2K基因座的小鼠基因组序列5'的5'同源臂、包括HLA-A基因第一基因组序列的第一人DNA片段、5'重组序列位点(如loxP)、选择盒、3'重组序列位点(如loxP)、包括HLA-基因第二基因组序列的第二人DNA片段以及包括内源性H-2Kα3外显子的小鼠基因组序列3'的3’同源臂。在一个实施方式中，所述核苷酸构建体从5'到3'包括：包括内源性小鼠H-2K基因座的小鼠基因组序列5'的5'同源臂、包括HLA-A先导序列的人基因组序列、HLA-A先导序列/α1内含子序列、HLA-Aα1外显子、HLA-Aα1-α2内含子、HLA-Aα2外显子、α2-α3内含子的第一5'部分、位于重组位点之间的选择盒、α2-α3内含子的第二3'部分、HLA-Aα3外显子以及包含内源性小鼠H-2Kα3外显子的非小鼠基因组序列3’的3’同源臂。在一个实施方式中，5'同源臂序列如SEQIDNO：1所示，3'同源臂序列如SEQIDNO：2所示。

在另一个具体实施方式中，所述内源性MHCI类基因座是小鼠H-2D基因座。因此，在一个方面，本申请提供了核苷酸构建体，其从5'到3'包括：包括内源性小鼠H-2D1基因的小鼠基因组序列5'的5'同源臂、包括HLA-B27基因的基因组序列的人DNA片段以及包括内源性H-D基因的小鼠基因组序列3'的3’同源臂。在一个实施方式中，所述核苷酸构建体从5'到3'包括：包括内源性小鼠H-2D基因的小鼠基因组序列5'的5'同源臂，其包括先导序列外显子和H-2D1先导-α1内含子、HLA-B27α1外显子、HLA-B27α1-α2内含子、HLA-B27α2外显子、带有5'loxP位点插入的HLA-B27α2-α3内含子、HLA-B27α3外显子、小鼠H-2Dα-3跨膜域内含子、小鼠跨膜域和胞浆域基因组序列和polyA尾、5'FRT位点、潮霉素盒、3'FRT位点、3'loxP位点和包括小鼠H-2D基因下游的基因组序列的3'同源臂。在一个实施方式中，5'同源臂序列跨越内源性小鼠H-2D基因上游49.8kb的小鼠基因组序列，并包括H-2D先导序列，且3'同源臂跨越内源性小鼠H-2D基因下游155.6kb的小鼠基因组序列。

一旦完成基因打靶，将ES细胞或基因修饰的非人类动物进行筛选以证实目的外源性核苷酸序列成功掺入或外源性多肽成功表达。许多技术是本领域技术人员已知的，包括(但不限于)Southern印迹，长片段PCR，定量PCT(如使用实时PCR)，荧光原位杂交，Northern印迹，流式细胞术，Western分析，免疫细胞化学，免疫组织化学等。在一个实施例中，带有目的基因修饰的非人类动物(如小鼠)可以通过使用改进的等位基因检测筛选小鼠等位基因丢失和/或人等位基因获得，详述于Valenzuela等，(2003)High-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis,NatureBiotech.21(6):652-659。其他在基因修饰动物中识别特定核苷酸或氨基酸序列的测定法为本领域技术人员所熟知。

本公开内容还提供了修饰非人类动物MHCI基因座来表达本文所述的嵌合人/非人MHCI多肽的方法。在一个实施方式中，本发明提供修饰小鼠MHCI基因座来表达嵌合人/小鼠MHCI多肽的方法，其中所述方法包括在内源性MHCI基因座用编码人MHCI多肽的肽结合结构域的核苷酸序列替换编码小鼠MHC多肽的肽结合结构域的核苷酸序列。在一些方面，小鼠MHCI胞外域的核苷酸序列被替换为人MHCI胞外域的核苷酸序列。所述小鼠可能无法从内源性MHCI基因座表达小鼠MHCI肽结合结构域或胞外域。在一个实施方式中，小鼠H-2K胞外域的核苷酸序列被替换为人HLA-A2胞外域的核苷酸序列，使得所述修饰小鼠MHCI基因座表达嵌合HLA-A2/H-2K多肽。在一个实施方式中，小鼠H-2D胞外域的核苷酸序列被替换为人HLA-B27胞外域的核苷酸序列，使得所述修饰小鼠MHCI基因座表达嵌合HLA-B27/H-2D多肽。

在一个方面，本发明提供了用于制备嵌合人HLAI类/非人MHCI类分子的方法，包括在单个细胞从核苷酸构建体表达嵌合HLA-A/H-2K或HLA-B/H-2D蛋白的方法，其中所述核苷酸构建体包括cDNA序列，其分别编码HLA-A或HLA-B蛋白的α1、α2和α3结构域以及非人H-2K或H-2D蛋白(如，小鼠H-2K或H-2D蛋白)的跨膜域和胞浆域。在一个实施方式中，所述核苷酸构建体是病毒载体；在一个具体实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一个实施方式中，所述细胞选自CHO、COS、293、HeLa以及表达病毒核酸序列(如PERC.6^TM细胞)的视网膜细胞。

在一个方面，本申请提供了表达嵌合人HLAI类/非人MHCI蛋白(如HLA-A/H-2K或HLA-B/H-2D蛋白)的细胞。在一个实施方式中，所述细胞包括包括嵌合MHCI类基因的表达载体，其中所述嵌合MHCI类基因包括人HLA-A或HLA-B基因序列与非人H-2K或H-2D基因序列(如，小鼠H-2K或H-2D基因)分别可操作地融合连接。在一个实施方式中，所述人HLA-A或HLA-B基因序列包括编码HLA-A或HLA-B蛋白的α1、α2和α3结构域的外显子。在一个实施方式中，所述非人H-2K或H-2D基因序列包括分别编码H-2K或H-2D蛋白跨膜域和胞浆域的外显子。在一个实施方式中，所述细胞选自CHO、COS、293、HeLa以及表达病毒核酸序列(如PERC.6^TM细胞)的视网膜细胞。

本申请还提供了通过如本文所述的非人动物制备的嵌合MHCI类分子，其中所述嵌合MHCI类分子包括来自人HLA-A或HLA-B蛋白的α1、α2和α3结构域，和来自非人，如，小鼠，的H-2K或H-2D蛋白的跨膜域和胞浆域。本文描述的嵌合HLA-A/H-2K多肽可以通过抗HLA-A抗体检测。因此，展示嵌合人/非人HLA-A/H-2K多肽的细胞可以使用抗HLA-A抗体检测和/或选择。在一些情况下，本文所述嵌合HLA-A2/H-2K多肽可以使用抗HLA-A2抗体来检测。在另一个实施方式中，本文所述的嵌合HLA-B/H-2D多肽可以使用抗HLA-B抗体来检测；例如，所述嵌合HLA-B27/H-2D多肽可以使用抗HLA-B27抗体来检测。

尽管以下实施例描述了基因工程改造的动物，其基因组分别在内源性小鼠H-2K基因座或内源性H-2D基因座的人HLA-B27包括用编码人HLA-A2胞外域的序列替换编码小鼠H-2K或H-2D多肽胞外域的核苷酸序列，本领域的技术人员将理解，类似的策略可以用于将其他小鼠MHCI基因座(如H-2L)替换成其相应的人HLA基因座(如HLA-C)。因此，本申请还提供了非人类动物，其在其基因组包括编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列，其中该多肽的人类部分来源于另一个HLAI类蛋白。

本申请也提供了在多个MHCI基因座的替换。因此，本申请还提供了一种非人类动物，如，啮齿动物，如，小鼠，其在内源性MHCI基因座包括一个或多个，如一个、两个、三个、四个、五个或六个编码人或人源化MHCI多肽的核苷酸序列，如，嵌合人/非人(如人/啮齿动物，如人/小鼠)MHCI多肽。在一种情况下，两条包括MHCI基因座的小鼠17号姐妹染色体中每条都包括H-2K、H-2L和H-2D基因；因此，在一个方面，每个姊妹染色体在它们的内源性基因组位置可编码高达三个嵌合人/小鼠多肽。因此，在一个实施方式中，基因修饰非人类动物，如，小鼠，在内源性MHC基因座可包括六个不同的编码多达六个人或人源化MHCI多肽的核苷酸序列，如，多达六个嵌合人/非人，如，人/小鼠MHCI多肽。在另一种情况下，两条包括MHCI基因座的小鼠17号姐妹染色体中每条都包括H-2K和H-2D基因；因此，在一个方面，每个姐妹染色体在它们的内源性基因组位置可编码多达两个嵌合人/小鼠多肽；并且所述基因修饰的非人类动物，如，小鼠，可包括多达四种不同的编码多达四个人或人源化MHCI多肽的核苷酸序列。

在一个实施方式中，本申请提供了小鼠，所述小鼠在内源性MHCI基因座包括一个或多个(如一个、两个、三个、四个、五个或六个)编码人或人源化MHCI多肽的核苷酸序列；如嵌合人/小鼠MHCI多肽，其中所述嵌合多肽的人类部分包括人MHCI多肽的胞外域，并且其中所述嵌合多肽的小鼠部分包括小鼠MHCI多肽跨膜域和胞浆域，并且其中所述小鼠表达一个或多个(如一个、两个、三个、四个、五个或六个)嵌合人/小鼠MHCI多肽。在一个实施方式中，所述小鼠MHCI选自H-2D、H-2K和H-2L。在一个实施方式中，所述人MHC选自HLA-A、HLA-B和HLA-C。

因此，本申请提供了小鼠，所述小鼠在内源性MHCI基因座包括编码嵌合人类/小鼠MHCI多肽的两个核苷酸序列，其中所述两个核苷酸序列编码嵌合HLA-A2/H-2K和HLA-B27/H-2D多肽，并且其中所述小鼠表达嵌合HLA-A2/H-2K和HLA-B27/H-2D多肽。在一个实施方式中，编码HLA-A2/H-2K和HLA-B27/H-2D的核苷酸序列分别位于内源性H-2K和H-2D基因座。在一方面，所述小鼠不表达任何功能性内源性小鼠MHCI多肽。在另一个方面中，所述小鼠保留编码内源性小鼠MHCI多肽，如，表达功能性小鼠MHC多肽(如H-2L多肽)的核苷酸序列。

此外，本发明提供了用于制备非人类动物(如，小鼠)的方法，其包括在多个内源性MHC基因座(如，非人类，如，小鼠)的替换，包括一个或多个(如一个、两个、三个、四个、五个或六个)编码嵌合人/非人(如，人/小鼠)MHCI多肽的核苷酸序列。由于各种MHCI基因座在小鼠17号染色体的密切连接，在一些实施方式中，该方法包括在所述基因座的连续替换。在一个实施方式中，该方法包括在ES细胞中将编码第一小鼠MHCI多肽的核苷酸序列替换为编码第一嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，制备表达第一嵌合MHCI多肽的小鼠，从所述小鼠制备ES细胞，在所述ES细胞中将编码第二小鼠MHCI多肽的核苷酸序列替换为编码第二嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，并制备表达两种嵌合人/小鼠MHCI多肽的小鼠。可以用类似方法制备小鼠，其包括编码第三嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，通过在包括两种嵌合MHCI基因的ES细胞中将编码第三小鼠MHCI多肽的核苷酸序列替换为编码第三嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列。或者，该方法可以包括在ES细胞中将编码第一小鼠MHCI多肽的核苷酸序列替换为编码第一嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，然后在相同的ES细胞中将编码第二小鼠MHCI多肽的核苷酸序列替换为编码第二嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，并制备表达两种嵌合人/小鼠MHCI多肽的小鼠；可以在相同的ES细胞中制备包括三个嵌合人/小鼠MHCI多肽的小鼠。通过连续替换制备的包括一个、两个或三个嵌合MHCI多肽的小鼠可以是嵌合MHCI序列杂合子或纯合子。包括四、五和六个嵌合MHCI多肽的小鼠可以通过将均包括编码嵌合MHCI多肽的核苷酸序列的两种动物交配以获得，在一个实施方式中，对每个嵌合MHCI序列都是杂合子的动物。本领域技术人员将理解，包括两个、三个或四个嵌合MHCI多肽的小鼠还可以通过交配而不是连续替换制备；这种动物可以对所有嵌合MHCI序列是杂合的(如包括在每个姐妹染色体上的不同嵌合基因的小鼠对两个MHC基因是杂合子等)。

基因修饰的β2微球蛋白动物

本发明通常提供基因修饰非人类动物，在其基因组中包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列；因此，所述动物表达人或人源化β2微球蛋白多肽。

β2微球蛋白或MHCI类复合物的轻链(也简称为“β2M”)是一种非糖基化小蛋白(12kDa)，其功能主要是稳定MHCIα链。所述人β2微球蛋白基因编码119个氨基酸的蛋白质，其有20个N末端氨基酸编码先导序列。所述成熟蛋白质包括99个氨基酸。该基因包括4个外显子，包括5'非翻译区的第一外显子，整个先导序列以及成熟多肽的前两个氨基酸；编码所述成熟蛋白质主要部分的第二外显子；编码所述成熟蛋白质的最后四个氨基酸和终止密码子的第三外显子；以及包括3'非翻译区的第四外显子。Gussow等。Gussow等，(1987)Theβ2-MicroglobulinGene.PrimaryStructureandDefinitionoftheTranscriptionalUnit,J.Immunol.139:3131-38。β2微球蛋白与MHCI非共价结合。未结合的β2微球蛋白存在于体液中，如血浆，其被运送到肾脏排泄。肾功能不全引起的β2微球蛋白积累，可以是病原性(如透析相关淀粉样变性)；累积的蛋白质在关节和结缔组织中形成丝状纤丝组成的淀粉样蛋白斑。

除了透析相关淀粉样变性，β2微球蛋白还涉及多种其它病症。在淋巴细胞恶性肿瘤中，如非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤中检测到β2微球蛋白水平的升高。见，如，Shi等，(2009)β2Microglobulin:EmergingasaPromisingCancerTherapeuticTarget,DrugDiscoveryToday14:25-30。一些其他伴随升高的β2微球蛋白水平的恶性肿瘤包括乳腺癌，前列腺癌，肺癌，肾癌，胃肠道及鼻咽癌。β2微球蛋白过表达被认为有促进肿瘤生长作用。同上。最近还表明，β2微球蛋白驱动上皮至间质转变，促进乳腺癌，前列腺癌，肺癌和肾癌的癌症骨和软组织转移。Josson等，(2011)β2microglobulinInducesEpitelialtoMesenchymalTransitionandConfersCancerLethalityandBoneMetastasisinHumanCancerCells.CancerRes.71(7):1-11。β2微球蛋白与一种非经典MHCI成员，血色素沉着病(HFE)蛋白相互作用，并与转铁蛋白受体相互作用，调节铁稳态。同上。本领域中对β2微球蛋白参与恶性肿瘤的其他标志(自我更新，血管发生增强，治疗抵抗)有广泛记载。

β2微球蛋白缺陷小鼠已有报道。见，Koller等，(1990)Normaldevelopmentofmicedeficientinβ2m,MHCclassIproteins,andCD8+Tcells,Science248:1227-1230。据Koller等人报道，这些小鼠表现健康，但是没有检测到MHCI类表达。此外，大多数T细胞群在一些组织中表现正常，同时观察到其他组织中CD8+T细胞显著减少。这一所谓的缺乏MHCI表达与之前在Allen等，((1986)β2microglobulinIsNotRequiredforCellSurfaceExpressionoftheMurineClassIHistocompatibilityAntigenH-2D^borofaTruncatedH-2D^b,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:7447-7451)中得到的结果不一致。Allen等人报道β2微球蛋白对所有MHCI复合物的细胞表面表达不是必需的，因为缺乏β2微球蛋白的细胞能够表达H-2D^b。然而，据推测在这些细胞中H-2D^b的功能受到损害，并且H-2D^b的构象与天然蛋白质不同，这解释了Koller和其同事无法使用抗天然H-2D^b抗体对该蛋白进行检测的原因。然而，据报道缺乏β2微球蛋白的细胞可以呈递抗原到内源性CD8+T细胞(包括正常小鼠的外源性CD8+T细胞)，并且据报道β2微球蛋白不是在小鼠中应答抗原刺激形成高水平的H-2^dMHCI类限制性CD8+CTL所必须的，虽然需要其以维持有效的免疫反应。Quinn等，(1997)Virus-Specific,CD8+MajorHistocompatibilityComplexClassI-RestrictedCytotoxicTLymphocytesinLymphocyticChoriomeningitisVirus-Infectedβ2-Microglobulin-DeficientMice,J.Virol.71:8392-8396。值得注意的是，据报道，在没有β2微球蛋白时产生高水平的T细胞的能力局限于H-2^dMHCI类限制性反应。β2微球蛋白缺陷小鼠已经被报道具有许多显著的特点，如，对一些寄生虫病易感性增加，肝炎感染易感性增加，铁代谢缺陷以及繁殖表型受损。Cooper等，(2007)AnimpairedbreedingphenotypeinmicewithageneticdeletionofBeta-2microglobulinanddiminishedMHCclassIexpression:Roleinreproductivefitness,Biol.Reprod.77:274-279。

已报道在随机插入的转基因上表达人β2微球蛋白以及人HLAI类分子(即HLA-B7)的小鼠。Chamberlain等，(1988)Tissue-specificandcellsurfaceexpressionofhumanmajorhistocompatibilitycomplexclassIheavy(HLA-B7)andlight(β2-microglobulin)chaingenesintransgenicmice,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:7690-7694。与内源性I类一致，人HLAI类的表达在肝脏中显著降低。同上。人类β2微球蛋白的表达也与内源性β2微球蛋白一致，而人HLA-I类分子的表达在双转基因小鼠中增加10到17倍。同上。但是，作者没有尝试将小鼠内源性β2微球蛋白基因座替换为人类β2微球蛋白基因座。

因此，本文公开了一种基因工程改造的非人类动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其基因组包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在一个方面，所述动物不在内源性非人β2微球蛋白基因座表达内源性非人β2微球蛋白。在一些实施方式中，所述核苷酸序列编码部分是人类，部分是非人类的β2微球蛋白多肽，如，其包括一些对应于人β2微球蛋白的氨基酸和一些对应于非人β2微球蛋白的氨基酸。在一个方面，所述非人类动物不在内源性非人基因座表达内源性非人β2微球蛋白多肽，仅表达人或人源化β2微球蛋白多肽。在一个实施方式中，所述非人类动物不在内源性β2微球蛋白基因座表达完整的内源性非人β2微球蛋白多肽，只能表达非人内源性β2微球蛋白多肽的一部分。因此，在各种实施方式中，所述动物不在内源性非人β2微球蛋白基因座表达功能性非人β2微球蛋白多肽。在一个具体方面，编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列位于内源性非人β2微球蛋白基因座。在一个方面，所述动物包括β2微球蛋白基因座的两个拷贝，所述基因座包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在另一个方面，所述动物包括β2微球蛋白基因座的一个拷贝，所述基因座包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。因此，所述动物可为β2微球蛋白基因座纯合子或杂合子，所述基因座包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。所述人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列可以来源于在人类群体中天然存在的β2微球蛋白序列的集合。在各种实施方式中，本发明的基因工程改造的非人类动物在其种系中包括编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括编码包括人β2微球蛋白氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，该多肽能结合MHCI蛋白。

编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列可以包括对应于整个人β2微球蛋白基因的核酸残基。或者，所述核苷酸序列可包括编码如人β2微球蛋白蛋白21-119氨基酸序列(即对应于成熟人β2微球蛋白的氨基酸残基)所示的核苷酸残基。在一个替代实施方式中，所述核苷酸序列可包括编码如人β2微球蛋白氨基酸23-115的氨基酸序列所示的核苷酸残基，例如，如人β2微球蛋白氨基酸23-119所示的氨基酸序列。所述人β2微球蛋白的核酸与氨基酸序列见上文Gussow等人所述，其通过引用并入本申请。

因此，所述人或人源化β2微球蛋白多肽可以包括如人β2微球蛋白多肽氨基酸23-115所示的氨基酸序列，如，人β2微球蛋白多肽氨基酸23-119所示的氨基酸序列，如，人β2微球蛋白多肽氨基酸21-119所示的氨基酸序列。或者，所述人β2微球蛋白可包括人β2微球蛋白多肽的1-119的氨基酸。

在一些实施方式中，编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列包括如人β2微球蛋白基因外显子2至外显子4所示的核苷酸序列。或者，所述核苷酸序列包括如人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4的核苷酸序列。在本实施方式中，将如外显子2、3和4的核苷酸序列可操作地连接，以允许进行该基因的正常转录和翻译。因此，在一个实施方式中，所述人序列包括对应于人β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4的核苷酸序列。在一个具体的实施方式中，所述人序列包括对应于人β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4后约267bp的核苷酸序列。在一个具体的实施方式中，所述人序列包括约2.8kb的人β2微球蛋白基因。

因此，所述人或人源化β2微球蛋白多肽可以通过包括如人β2微球蛋白的外显子2至外显子4的核苷酸序列所示的核苷酸序列编码，如，对应于人β2微球蛋白基因外显子2至外显子4的核苷酸序列。备选地，所述多肽可以通过人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4所示的核苷酸序列的核苷酸序列编码。在一个具体的实施方式中，所述人或人源化β2微球蛋白多肽由对应人β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4后约267bp的核苷酸序列编码。在另一具体实施方式中，所述人或人源化多肽由包括约2.8kb的人β2微球蛋白基因的核苷酸序列编码。由于所述β2微球蛋白基因的外显子4中包括5'非翻译区，因此所述人或人源化多肽可以通过包括β2微球蛋白基因的外显子2和3的核苷酸序列进行编码。

本领域普通技术人员将理解，尽管本申请在实施例中描述了使用特定核酸和氨基酸序列以制备基因工程改造的动物，但是也提供了一个或多个保守或非保守氨基酸取代的序列，或由于遗传密码的简并性与本文所述不同的序列。

因此，本申请提供了表达人类β2微球蛋白序列的非人类动物，其中所述β2微球蛋白序列与人β2微球蛋白序列至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％具有同一性。在一个具体的实施方式中，所述β2微球蛋白序列与本申请实施例中所述的人β2微球蛋白序列至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％具有同一性。在一个实施方式中，所述人β2微球蛋白序列包括一个或多个保守取代。在一个实施方式中，所述人β2微球蛋白序列包括一个或多个非保守取代。

此外，本申请提供了非人类动物，其中所述编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列也包括如非人β2微球蛋白基因的外显子1所示的核苷酸序列。因此，在一个具体实施方式中，所述非人类动物在其基因组包括编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括非人β2微球蛋白的外显子1和人β2微球蛋白基因外显子2、3和4的核苷酸序列。因此，所述人或人源化β2微球蛋白多肽通过非人β2微球蛋白基因的外显子1和人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4编码(如人β2微球蛋白基因的外显子2和3)。

与包括编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列的非人类动物类似，包括编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列的所述非人类动物可以选自由以下组成的组：小鼠、大鼠、兔、猪、牛(如奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(如狨猴，恒河猴)。在本发明的一些实施方式中，所述非人类动物为哺乳动物。在一个具体的实施方式中，所述非人类动物是鼠科，如，啮齿动物(如小鼠或大鼠)。在一个实施方式中，所述动物是小鼠。

因此，在一些方面，本发明提供了一种基因工程改造的小鼠，其中，所述小鼠包括如本文所述的编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。本发明提供了一种基因工程改造的小鼠，其中，所述小鼠在其内源性β2微球蛋白基因座包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列(如人或基本上为人β2微球蛋白的多肽)。在一些实施方式中，所述小鼠不从内源性β2微球蛋白基因座表达内源性β2微球蛋白多肽(如功能性内源性β2微球蛋白多肽)。在一些实施方式中，所述基因工程化小鼠包括小鼠β2微球蛋白基因的外显子1和人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述小鼠表达人或人源化β2微球蛋白多肽。

在一个方面，本申请提供了一种修饰的非人β2微球蛋白基因座，其包括异源β2微球蛋白序列。在一个实施方式中，所述异源β2微球蛋白序列是人或人源化序列。

在一个实施方式中，所述修饰基因座是啮齿动物基因座。在一个具体的实施方式中，所述啮齿动物基因座选自小鼠或大鼠基因座。在一个实施方式中，所述非人类基因座使用至少一个人类β2微球蛋白编码序列进行修饰。

在一个实施方式中，所述异源β2微球蛋白序列与内源性调节元件可操作地连接，如，内源性启动子和/或表达调控序列。在一各具体的实施方式中，所述异源β2微球蛋白序列是人序列并且所述人序列与内源性启动子和/或表达调控序列可操作地连接。

在一个方面，本申请提供了经修饰的非人β2微球蛋白基因座，其包括与内源启动子和/或表达控制序列可操作地连接的人序列。

在各个方面，所述由基因修饰的非人类动物，或来源于非人类动物的细胞、胚胎或组织表达的人或人源化β2微球蛋白保留了内源性和/或人β2微球蛋白的所有功能方面。例如，优选的，所述人或人源化β2微球蛋白可以结合MHCIα链(如内源性非人或人MHCI多肽)。所述人或人源化β2微球蛋白多肽可以结合，募集或以其他方式与任何其他分子相关联，如与内源性非人和/或人β2微球蛋白(如HFE，等)相关联的受体，锚蛋白或信号分子。

除基因修饰动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，本申请还提供了一种组织或细胞，其中所述组织或细胞来自如本文所述的非人类动物，并且包括异源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列，即核苷酸和/或氨基酸序列。在一个实施方式中，所述异源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列是人或人源化β2微球蛋白基因或人或人源化β2微球蛋白序列。优选地，所述细胞为有核细胞。所述细胞可以为任何已知表达MHCI复合物的细胞，如抗原呈递细胞。通过所述细胞表达的人或人源化β2微球蛋白多肽可以与内源性非人MHCI(如啮齿动物MHCI)相互作用，以形成功能性MHCI复合物。所得MHCI复合物可以与T细胞，如，细胞毒性T细胞相互作用。因此，本申请还提供来自如本文所述的非人类动物的细胞的体外复合物细胞和T细胞。

本申请还提供了非人类细胞，其包括人或人源化β2微球蛋白基因或序列以及额外的人或人源化序列，如目前公开的嵌合MHCI多肽。在这样的情况下，所述人或人源化β2微球蛋白多肽可以与，如，嵌合人/非人MHCI多肽相互作用，并且可以形成功能性MHCI复合物。在一些方面，这样的复合物能与T细胞(如，人或非人T细胞)上的TCR相互作用。因此，本申请还提供了如本文所述非人类动物的细胞的体外复合物和人或非人T细胞。

本公开内容的另一个方面是一种啮齿动物胚胎(如小鼠或大鼠胚胎)，其包括如本文所述的异源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列。在一个实施方式中，所述胚胎包括ES供体细胞(其包括异源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列)和宿主胚胎细胞。所述异源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列是人或人源化β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列。

本发明还包括非人细胞，其包括如本文所述的非人类动物的染色体或其片段(如其中该染色体或其片段包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列)。所述非人细胞可包括如本文所述的非人类动物细胞核。在一个实施方式中，作为核转移的结果，所述非人细胞包括所述染色体或其片段。

在一个方面，本申请提供了非人诱导的多能细胞，其包括异源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列。在一个实施方式中，所述诱导的多能细胞来源于本文所述非人类动物。在一个实施方式中，所述异源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列是人或人源化基因或序列。

本申请还提供了一种杂交瘤或四价体瘤，其来源于如本文所述非人类动物细胞。在一个实施方式中，所述非人类动物是小鼠或大鼠。

本申请还提供了制备本文所述的基因工程改造的非人类动物(如基因工程改造的啮齿动物，如小鼠或大鼠)的方法。该方法得到一种动物，其基因组包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在一个方面，该方法得到基因工程改造的小鼠，其基因组在内源性β2微球蛋白基因座包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在一些情况下，所述小鼠不在内源性小鼠β2微球蛋白基因座表达功能性小鼠β2微球蛋白。在一些方面，该方法利用使用VELOCIGENE制备的靶向构建体，将所述构建体引入ES细胞中，并使用技术将靶向的ES细胞克隆引入小鼠胚胎，如在实施例中所述。在一个实施方式中，所述ES细胞是129和C57BL/6小鼠品系的混合；在另一个实施方式中，所述ES细胞是BALB/c和129小鼠品系的混合。

本申请还提供了用于制备基因工程改造的非人类动物的核苷酸构建体。所述核苷酸构建体可包括：5'和3'非人同源臂、包括人β2微球蛋白序列的人DNA片段以及在重组位点之间的选择盒。在一个实施方式中，所述人DNA片段是基因组片段，其包括人β2微球蛋白基因的内含子和外显子。在一个实施方式中，所述非人同源臂与非人β2微球蛋白基因座同源。所述基因组片段可以包括人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4。在一种情况下，所述基因组片段从5'到3'包括：所有的人类β2微球蛋白序列的外显子2、内含子、外显子3、内含子和外显子4。所述选择盒可位于构建体的β2微球蛋白编码区外的任何地方，如，其可以位于人β2微球蛋白的外显子4的3'。所述5'和3'非人同源臂可分别包括内源性非人β2微球蛋白基因的基因组序列5'和3'。在另一个实施方式中，所述5'和3'非人同源臂分别包括内源性非人基因外显子2的基因组序列5'和外显子4的3'。

本发明的另一个方面涉及修饰非人类动物β2微球蛋白基因座(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，以表达如本申请所述人或人源化β2微球蛋白多肽的方法。修饰小鼠β2微球蛋白基因座以表达人或人源化β2微球蛋白多肽的方法包括在内源性β2微球蛋白基因座将编码小鼠β2微球蛋白的核苷酸序列替换为编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在此方法的一个实施方式中，所述小鼠不从内源性小鼠β2微球蛋白基因座表达功能性β2微球蛋白多肽。在一些具体的实施方式中，所述编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括如人β2微球蛋白基因的外显子2至4所示的核苷酸序列。在其他实施方式中，编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括如人β2微球蛋白基因外显子2、3和4所示的核苷酸序列。

基因修饰的MHCI/β2微球蛋白动物

在各种实施方式中，本发明一般提供了基因修饰的非人动物，在其基因组中包括编码人或人源化MHCI和β2微球蛋白多肽的核苷酸序列；因此，所述动物表达人或人源化MHCI和β2微球蛋白多肽。

在使用混合的人/非人系统成分中出现了功能差异。HLAI类比小鼠I类与β2微球蛋白结合更紧密。Bernabeu(1984)β2-microgobulinfromserumassociateswithMHCclassIantigensonthesurfaceofculturedcells,Nature308:642-645。对消除功能差异的尝试反映在特定的人源化MHC小鼠构建体上。已经开发出来表达随机整合的人HLA-A2.1/HLA-DR1嵌合转基因的H-2I类和2类敲除小鼠(小鼠β2微球蛋白敲除的背景下)具有人HLA-A2.1的α1和α2结构域以及小鼠H-2D^b的α3结构域，在其N末端通过接头与人β2微球蛋白的C末端连接。参见，如Pajot等(2004)Amousemodelofhumanadaptiveimmunefunctions:HLA-A2.1-/HLA-DR1-transgenicH-2classI-/classII-knockoutmice,Eur.J.Immunol.34:3060-3069。据报道这些小鼠生成抗原特异性抗体和针对B型肝炎病毒的CTL应答，而仅仅为HLA-A2.1转基因小鼠或H-2I类/II型敲除小鼠则没有。仅仅为转基因的小鼠的缺陷可能源于此类小鼠采用内源性I类和/或II类基因以规避任何转基因的能力，而MHC基因敲除小鼠则没有该选择。然而，所述小鼠可以表达至少H-2D^b，可能是由于将其与β2微球蛋白敲除小鼠背景的小鼠交配的原因(参见，Pajot等，同上；其显然包括完整的内源性I类和II类基因座)。

据报道与人β2微球蛋白嵌合融合的细胞表面的表达比内源性MHC表达低，但没有报道NK杀伤的存活/率，也未报道NK自我杀伤率。Pajot等，同上。观察到与MHCI类缺陷β2微球蛋白敲除小鼠相比，CD8+T细胞数目有所改善(总脾细胞的2-3％，vs.而在β2KO小鼠中的0.6-1％)。然而，T细胞可变区的使用情况表现出针对BV5.1、BV5.2和BV11基因片段的不同特性。据报道CD8+和CD4+T细胞应答仅限于用于免疫小鼠的合适的B型肝炎抗原，虽然至少两只小鼠杀死了带有任一抗原的细胞(其中所述小鼠仅用一种抗原免疫)，这可能是由于缺乏NK细胞抑制或缺乏NK细胞选择性。

如上所述，针对人MHCI和人β2微球蛋白的转基因小鼠包括编码嵌合MHCI/β2微球蛋白的核苷酸序列，其中所述MHCI和β2微球蛋白部分包括在单个多肽链内，导致MHCIα链和β2微球蛋白彼此共价连接，从而滞留在细胞表面。本申请提供了在基因组包括两个独立核苷酸序列的小鼠，一个编码人或人源化MHCI多肽，另一个编码人或人源化β2微球蛋白多肽。本文所述小鼠表达一种MHCI复合物，该MHCI复合物更像存在于自然界的MHCI复合物，其中MHCIα链和β2微球蛋白在两个分离的多肽链上，且β2微球蛋白与MHCIα链非共价结合。

因此，本发明公开提供了一种非人动物，在其基因组中包括：编码人或人源化MHCI多肽的第一核苷酸序列和编码人或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列。在一个方面，本申请提供了一种非人动物，在其基因组中包括：(a)编码嵌合人/非人MHCI多肽的第一核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人类部分包括肽结合结构域或人MHCI(如HLA-A、HLA-B或HLA-C；如HLA-A2或HLA-B27)的胞外域，以及(b)编码人或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列。

所述第一核苷酸序列可位于内源性非人MHCI基因座，使得该动物在其基因组包括在MHCI基因座将所有或部分内源性MHCI基因(如编码肽结合结构域或胞外域的部分)替换为相应的人MHCI序列。因此，该动物在内源性MHCI基因座可包括编码人MHCI(如HLA-A、HLA-B或HLA-C；如HLA-A2或HLA-B27)的胞外域的核苷酸序列和内源性非人MHCI的跨膜域和胞浆域(如H-2K、H-2D、H-2L，如H-2K或H-2D)。在一个方面，所述动物是小鼠，并且所述第一核苷酸序列包括编码人HLA-A2(如HLA-A2.1)的胞外域和小鼠H-2K(如H-2Kb)跨膜域与胞浆域的核苷酸序列。在另一个方面，所述动物是小鼠，并且第一核苷酸序列包括编码人HLA-B27胞外域和小鼠H-2D(如H-2D1)跨膜域与胞浆域的核苷酸序列。

所述第二核苷酸序列可位于内源性非人β2微球蛋白基因座，使得该动物在其基因组在β2微球蛋白基因座包括将所有或部分内源性β2微球蛋白基因替换为相应的人β2微球蛋白序列。所述第二核苷酸序列可以包括如人β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4所示的核苷酸序列。或者，所述第二核苷酸序列可包括如人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4所示的核苷酸序列。在本实施方式中，核苷酸序列之间可操作地彼此连接。所述第二核苷酸序列可进一步包括非人β2微球蛋白基因的外显子1的序列。

在一个方面，所述动物不从内源性非人MHCI基因座表达功能性MHCI(如即不表达功能性肽结合结构域，也不表达内源性MHCI的功能性胞外域)；在一个方面，所述动物不从内源性非人β2微球蛋白基因座表达功能性β2微球蛋白多肽。在一些方面，所述动物对MHCI基因座和β2微球蛋白基因座纯合的，所述MHCI基因座包括编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列，所述β2微球蛋白基因座包括编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列。在其它方面，所述动物对MHCI基因座和β2微球蛋白基因座杂合的，所述MHCI基因座包括编码嵌合人/非人MHCI多肽的核苷酸序列，所述β2微球蛋白基因座包括编码人或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列。

优选地，所述第一和第二核苷酸序列与内源表达调控元件可操作地连接(如启动子、增强子、沉默子等)。

本文所包括的第一和第二核苷酸序列(以及它们编码的多肽)的各种其他实施方式可通过说明书全文描述的实施方式容易地理解，如，在与基因工程改造的MHCI的动物和经过基因工程改造的β2微球蛋白的动物相关的章节中描述的那些。

在一个方面，本公开提供了一种小鼠，在其基因组包括(a)编码嵌合人/小鼠MHCI多肽的第一核苷酸序列(具体地，HLA-A2/H-2K或HLA-B27/H-2D多肽)，其中所述嵌合多肽的人类部分包括人HLA-A2或HLA-B27的胞外域和小鼠部分的分别包括小鼠H-2K或小鼠H-2D的跨膜域和胞浆域，以及(b)编码人或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列(如，其中所述核苷酸序列包括如人β2微球蛋白基因外显子2至外显子4所示的核苷酸序列以及如人β2微球蛋白基因外显子2、3和4的核苷酸序列)，其中所述第一核苷酸序列位于内源性H-2K或H-2D基因座，并且第二序列位于内源性β2微球蛋白基因座。在一个实施方式中，所述小鼠不从它们各自的内源性基因座表达功能性H-2K或H-2D和小鼠β2微球蛋白多肽。在一个实施方式中，所述小鼠表达嵌合人/小鼠MHCI多肽和人或人源化β2微球蛋白多肽。

如以下实施例所示，基因工程改造以共表达人或人源化MHCI和β2微球蛋白的动物与单独MHCI人源化的动物相比，显示出在细胞表面上的嵌合MHCI类的表达增加。在一些实施方式中，共表达人或人源化MHCI和β2微球蛋白使人或人源化MHCI的细胞表面表达与人或人源化β2微球蛋白不存在时，人或人源化MHCI的表达相比增加了超过约10％、如大于约20％、如约50％或以上，如约70％。

本公开还提供制备基因工程改造的非人类动物(如啮齿动物，如大鼠或小鼠)的方法，其基因组包括如本文所述的第一和第二核苷酸序列。该方法一般包括：制备第一基因工程改造的非人类动物，其基因组包括本文所述的第一核苷酸序列(即人或人源化MHCI序列)，制备第二基因工程非人类动物，其基因组包括本文所述的第二核苷酸序列(即人或人源化β2微球蛋白序列)，并将所述第一和第二动物交配以获得子代，其基因组包括两种核苷酸序列。在一个实施方式中，所述第一和第二动物分别针对第一和第二核苷酸序列是杂合的。在一个实施方式中，所述第一和第二动物分别针对第一和第二核苷酸序列是纯合的。在一个实施方式中，所述第一和第二动物分别通过将内源性非人基因座替换为所述第一和第二核苷酸序列而制备。在一方面，所述第一和第二动物通过利用经由技术制备的构建体制备，并将带有这种构建体的靶向的ES细胞克隆通过方法引入胚胎(如啮齿动物胚胎，如小鼠或大鼠胚胎)。

在另一个方面，本发明提供了一种基因修饰非人动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，在其基因组上包括编码一种或多种(如一个、两个、三个、四个、五个、六个)嵌合人/非人(如嵌合人/小鼠)MHCI多肽的核苷酸序列和编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。嵌合人/非人MHCI多肽和人或人源化β2微球蛋白的各个方面在本说明书中公开并且对本领域技术人员是清楚的。本文还提供了用于制备非人类动物的方法，所述动物包括编码一种或多种(如一个、两个、三个、四个、五个、六个)嵌合人/非人(如，嵌合人/小鼠)MHCI多肽的核苷酸序列和编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。

基因修饰动物的用途

在各种实施方式中，本文所述的基因修饰非人类动物使用细胞表面的人或人源化MHCI和/或β2微球蛋白生产APC，并且作为结果，以类似人的方式呈递胞质蛋白来源的肽作为针对CTL的表位，因为基本上所有复合物的组分都是人或人源化的。本发明所述的基因修饰非人类动物可用于在人源化动物中研究人免疫系统的功能；用于鉴定抗原和引发免疫应答的抗原表位(如T细胞表位，如独特的人类癌症表位)，如用于疫苗开发；用于鉴定对人类病原体或癌症抗原高亲和力的T细胞(即在人类MHCI复合物的情况下以高亲合力结合抗原的T细胞)，如在适应性T细胞疗法中使用；用于候选疫苗和其他疫苗策略的评价；用于研究人类自身免疫性疾病；用于研究人类感染性疾病；以及其他基于人类MHC表达制定更好的治疗策略。

MHCI复合物结合肽，并将其呈递在细胞表面。一旦在该复合物存在下在表面呈递，则T细胞可识别该肽。例如，当肽来源于病原体或其它目的抗原(如肿瘤抗原)，T细胞识别可导致T细胞活化，巨噬细胞杀伤具有所呈递肽序列的细胞，和与所述呈递的序列结合的抗体的B细胞活化。

T细胞与表达MHCI复合物的细胞通过肽结合的MHCI的胞外域以及T细胞的CD8的胞外域发生相互作用。接触具有与MHCI类分子结合的合适的抗原的APC的CD8+T细胞会变成细胞毒性T细胞。因此，在MHCI类与T细胞受体以高亲合力结合的情况下的抗原，对人类疾病治疗药物的开发具有潜在重要作用。然而，在小鼠MHCI的背景下的抗原呈递仅与人类疾病略微相关，因为人和小鼠MHC复合物识别的抗原不同，如小鼠MHCI与人MHCI相比可能无法识别相同抗原或可以呈递不同表位。因此，与人类疾病最相关的数据是通过研究人MHCI抗原表位的呈递获得的。

因此，在各种实施方式中，本发明的基因工程改造的动物是有用的，除其他事项外，其可用于评估抗原在人体中引起免疫应答的能力，以及用于制备多种不同抗原以及鉴别可用于人类疫苗开发的特定抗原。

在一个方面，本发明提供了用于确定在人体中的肽序列的抗原性的方法，包括将如本文所述的基因修饰的非人类动物暴露于包括所述肽序列的分子，允许所述非人类动物产生免疫应答，并在非人类动物中检测与如本文所述的嵌合人/非人MHCI或人源化MHCI复合物(包括嵌合人/非人MHCI和人或人源化β2微球蛋白)呈递的肽的序列结合的细胞。

在一个方面，本申请提供了用于确定一种肽是否会在人体中引起细胞免疫应答的方法，其包括将如本文所述的基因修饰非人类动物暴露于肽，允许所述非人类动物产生免疫应答，并在非人类动物中检测与通过如本文所述的嵌合人/非人MHCI类分子呈递的肽序列结合的细胞。在一个实施方式中，暴露后的所述非人类动物包括与所述肽结合的MHCI类限制性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在一个实施方式中，所述CTL杀死携带所述肽的细胞。

在一个方面，本发明提供了用于鉴别人CTL表位的方法，包括将如本申请所述的非人类动物暴露于包括推定的CTL表位的抗原，允许所述非人类动物产生免疫反应，从所述非人类动物分离结合表位的MHCI类限制性CD8+CTL，并鉴别与MHCI类限制性CD8+CTL结合的表位。

在一个方面，本发明提供了一种用于鉴别HLAI类限制性肽的方法，其通过人细胞的呈递和通过人淋巴细胞的结合(如人类T细胞)将导致携带该肽的细胞的细胞毒作用，所述方法包括将如本文所述的非人类动物(或其MHCI类表达细胞)与包括目的肽的分子接触，分离该非人类动物表达嵌合人/非人I类分子的细胞，所述分子结合目的肽，将所述细胞暴露于能够传导HLAI类限制性细胞毒性人淋巴细胞，并测定肽诱导的细胞毒性。

在一个方面，本申请提供了一种用于鉴别在人类中产生细胞毒性T细胞应答的抗原的方法，包括将推定的抗原暴露于如本文所述的小鼠，允许小鼠产生免疫反应，并鉴别由HLAI类限制性分子结合的所述抗原。

在一个实施方式中，所述抗原包括细菌或病毒表面或包膜蛋白。在一个实施方式中，所述抗原包括人肿瘤细胞表面上的抗原。在一个实施方式中，所述抗原包括在人体中使用的推定的疫苗。在一个实施方式中，所述抗原包括在人体中产生抗体的人的表位。在另一个实施方式中，所述抗原包括产生靶向所述表位/MHCI复合物的高亲和性CTL的人表位。

在一个方面，本申请提供了一种用于确定在暴露于人免疫系统后一个推定的抗原是否包括会产生HLAI类限制性免疫反应(如HLA-A限制性免疫应答(如HLA-A2限制性应答)或HLA-B-限制性应答(如HLA-B27限制性应答))的表位的方法，包括将如本文所述的小鼠暴露于所述推定抗原，并在小鼠中测量抗原特异性的HLAI类限制性，如HLA-A-或HLA-B-限制性(如HLA-A2限制性或HLA-B27限制性)免疫应答。

在一个实施方式中，所述推定的抗原选自生物药物或其片段、非自体蛋白、非自体细胞的表面抗原、肿瘤细胞的表面抗原、细菌或酵母或真菌细胞表面抗原、病毒的表面抗原或包膜蛋白。

此外，本文所述的基因工程改造的非人动物可以用于鉴别识别目的抗原(如肿瘤或其他疾病抗原)的T细胞受体(如高亲和力T细胞受体)。该方法可以包括：将本文所述的非人动物暴露于抗原，允许非人类动物产生针对所述抗原的免疫应答，从所述非人动物中分离T细胞(所述T细胞包括结合由人或人源化MHCI呈递的抗原的T细胞受体)，以及确定所述T细胞受体的序列。

在一个方面，本发明提供了一种用于鉴别对于人肿瘤抗原具有高亲和力的T细胞受体可变结构域的方法，包括将包含人源化MHCIα1、α2和α3结构域(如HLA-A2或HLA-B27α1、α2和α3结构域)的小鼠暴露于人肿瘤抗原；允许小鼠产生免疫反应；并且，从小鼠中分离编码T细胞受体可变结构域的核酸序列，其中该T细胞受体可变结构域以不超过约1纳摩尔的K_D与所述人肿瘤抗原结合。

在一个实施方式中，所述小鼠进一步包括在内源性小鼠T细胞受体可变区基因基因座用多个未重排的人T细胞受体的可变区基因片段替换，其中所述未重排的人T细胞受体可变区基因片段重组以编码嵌合人-小鼠T细胞受体基因，所述基因包括人可变区和小鼠恒定区。在一个实施方式中，所述小鼠包括人CD8转基因，并且所述小鼠表达功能性人CD8蛋白。

对肿瘤抗原具有高亲合力的T细胞受体在基于细胞的治疗中是有用的。对人肿瘤抗原具有高亲合力的T细胞群体已通过将人T细胞暴露于HLA-A2进行准备(所述HLA-A2已被突变以将CD8与α3亚基的结合减少到最小化)以仅选择对肿瘤抗原具有极高亲合力的T细胞(即尽管CD8不能结合α3，但T细胞克隆仍识别所述抗原)。见，Pittet等，(2003)α3DomainMutantsofPeptide/MHCClassIMultimersAllowtheSelectiveIsolationofHighAvidityTumor-ReactiveCD8TCells,J.Immunol.171:1844-1849。所述非人动物和所述非人动物的细胞，可用于鉴定与人HLAI类形成复合物的肽，所述人HLAI类与T细胞受体以高亲合力结合，或活化携带T细胞受体的淋巴细胞。

结合到T细胞的抗原/HLAI类，或者T细胞活化，可通过本领域中已知的任何合适的方法测定。肽特异性APC-T细胞结合与活化是可测量的。例如，据报道表达HLA-A2的抗原呈递细胞的T细胞的参与引起免疫突触的积累，而交联的MHCI类分子未积累。见，Fooksman等，(2009)CuttingEdge:Phosphatidylinositol4,5-BisphosphateConcentrationattheAPCSideoftheImmunologicalSynapseIsRequiredforEffectorTCellFunction,J.Immunol.182:5179-5182。

携带TCR的淋巴细胞与表达I类的APC的相互作用的功能性后果也可测量，并且包括淋巴细胞的细胞杀伤。例如，据报道通过CD8+CTL接触HLA-A2α2亚基的点生成Fas-非依赖杀伤的信号。当(通过抗体)接触已知接触CD8的HLA-A2分子表位(来自晶体学研究)而不对胞浆域有任何明显的依赖时，表达HLA-A2的Jurkat细胞发生凋亡。见，Pettersen等，(1998)TheTCR-BindingRegionoftheHLAClassIα2DomainSignalsRapidFas-IndependentCellDeath:ADirectPathwayforTCell-MediatedKillingofTargetCells？J.Immunol.160:4343-4352。据推测，通过HLA-A2α2接触CD8+CTL的CD8诱导的快速杀伤可能主要是由于该Fas非依赖的HLA-A2-介导的途径(同上)，其与TCR非依赖α3结构域介导的杀伤所区分(其本身可以诱导细胞凋亡)(参见，Woodle等，(1997)Anti-humanclassIMHCantibodiesinduceapoptosisbyapathwaythatisdistinctfromtheFasantigen-mediatedpathway,J.Immunol.158:2156-2164)。

T细胞和在MHCI中展示肽的APC的相互作用也可以通过T细胞增殖测定来测量。可替代地，其可通过测量通常与活化的免疫反应相关的细胞因子的释放来确定。在一个实施方式中，IFNγELISPOT可用于监测和量化CD8+T细胞的活化。

如本文所述，CD8+T细胞的激活可在本文所述基因修饰非人类动物中受到阻碍，这是由于CD8与MHCI的物种特异性的结合造成的。对于需要一个物种特异性CD8相互作用的实施方式而言，如本文所述基因修饰动物(如啮齿动物，如小鼠或大鼠)的细胞被暴露(如在体外)于人细胞(如携带人CD8的细胞，如人T细胞)。在一个实施方式中，将如本文所述的小鼠中表达MHCI类的细胞在体外暴露于包括人CD8和T细胞受体的T细胞。在一个具体的实施方式中，所述T细胞是人T细胞。在一个实施方式中，所述小鼠的表达MHCI类的细胞包括结合于嵌合人/小鼠MHCI或人源化MHCI复合物(包括人类β2微球蛋白)的肽，所述T细胞是人T细胞，确定所述T细胞与展示肽的小鼠细胞的结合能力。在一个实施方式中，通过展示肽的小鼠细胞确定人类T细胞的活化。在一个实施方式中，本申请提供了通过展示肽的细胞测量人类T细胞的活化的体外方法，包括将如本文所述的小鼠或小鼠细胞暴露于目的抗原，将来源于所述小鼠的细胞或所述小鼠细胞(可能携带来源于与人或人源化MHCI形成复合物的抗原的肽)暴露于人T细胞，并测定所述人T细胞的激活。在一个实施方式中，该方法用于鉴别人病原体或人肿瘤的T细胞表位。在一个实施方式中，该方法用于鉴别疫苗的表位。

在一个实施方式中，本申请提供了一种用于通过推定人类治疗确定T细胞激活的方法，包括将如本文所述的基因修饰动物暴露于推定人类治疗(或如，将这类动物的人或人源化MHCI表达细胞暴露于推定治疗的肽序列)，将展示人或人源化MHCI/肽复合物的基因修饰动物的细胞暴露于包括人T细胞受体和能够结合所述基因修饰动物的细胞的CD8的T细胞，并且测量通过所述基因修饰动物展示肽的细胞诱导的人T细胞的激活。

在各种实施方式中，来源于本申请所述动物的表达人或人源化MHCI类的细胞形成的复合物含有T细胞，其包括人CD8序列，如人T细胞，或包括编码人CD8的转基因的非人类动物的T细胞。人CD8的转基因小鼠是现有技术公知的。Tishon等，(2000)TrangenicMiceExpressingHumanHLAandCD8MoleculesGenerateHLA-RestrictedMeaslesVirusCytotoxicTLymphocytesoftheSameSpecificityasHumanswithNaturalMeaslesVirusInfection,Virology275(2):286-293；还有LaFace等，(1995)HumanCD8TransgeneRegulationofHLARecognitionbyMurineTCells,J.Exp.Med.182:1315-1325。

除了在人类病原体或肿瘤中鉴别抗原和抗原表位的能力，本发明的基因修饰动物可用于鉴别人类自身免疫性疾病相关的自身抗原，如I型糖尿病、多发性硬化症等，如Takaki等((2006)HLA-A*0201-RestrictedTCellsfromHumanizedNODMiceRecognizeAutoantigensofPotentialClinicalRelevancetoType1Diabetes,J.Immunol.176:3257-65)描述了使用携带HLA/β2微球蛋白单链的NOD小鼠确定I型糖尿病自身抗原。此外，可以使用本发明的基因修饰动物研究人类自身免疫性疾病的各个方面。由于人MHCI的一些多态性等位基因与已知的某些疾病(如自身免疫性疾病)的发展相关(如格雷夫斯病、重症肌无力、牛皮癣等；见Bakker等，(2006)Ahigh-resolutionHLAandSNPhaplotypemapfordiseaseassociationstudiesintheextendedhumanMHC,NatureGenetics38:1166-72及其补充信息和InternationalMHCandAutoimmunityGeneticsNetwork(2009)MappingofmultiplesusceptibilityvariantswithintheMHCregionfor7immune-mediateddiseases,Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:18680-85，二者通过引用并入本申请)，本发明的基因修饰动物包括人源化MHCI基因座，所述基因座包括可能对自身免疫性疾病模型有用的等位基因。在一个实施方式中，所述疾病等位基因是HLA-B27，并且所述疾病是强直性脊柱炎或反应性关节炎；因此，在一个实施方式中，用于研究这些疾病的动物包括人或人源化HLA-B27。其他人类疾病的等位基因是已知的，如与HIV病毒、埃博拉病毒感染等相关的HLAI类等位基因，并且这些等位基因或等位基因组合可以用在本文所述基因修饰动物形成的疾病模型中。

此外，本发明的基因修饰动物与其表达的人或人源化HLA分子可用于检验抗体，所述抗体通过与人类疾病进展相关的人类HLA分子阻断抗原呈递。因此，本发明提供了确定抗体是否能够阻断与人类疾病(例如，如本申请上述人类疾病)相关的HLA分子呈递的抗原的方法，包括将如本申请所述表达人或人源化HLA的细胞域待测抗体接触并确定所述抗体是否能够阻断由人或人源化HLA将所述抗原呈递给免疫细胞(如T细胞)，如通过测定其阻断人或人源化HLA限制性免疫应答的能力。在一个实施方式中，该方法在表达所述人或人源化HLA的动物中进行，如表达与人或人源化HLA的动物相关的疾病的动物，其可作为所述疾病的疾病模型。

涉及MHCI复合物的细胞免疫的其它方面是本领域已知的；因此，本文所述的基因工程改造的非人类动物可用于研究免疫生物学的这些方面。例如，TCR与MHCI类的结合在体内由其他因素调节。白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员B(LILRB1，或LIR-1)在MHCI类限制性CTL上表达并且通过与在APC上的MHCI类分子α3亚基上的决定子特异性结合以下调T细胞的刺激。结构研究表明，针对LIR-1和CD8的结合位点重叠，这表明抑制性LIR-1与刺激性CD8竞争性地与MHCI类分子结合。Willcox等，(2003)CrystalstructureofHLA-A2boundtoLIR-1,ahostandviralmajorhistocompatibilitycomplexreceptor,NatureImmunology4(9):913-919；还有Shirioshi等，(2003)HumaninhibitoryreceptorsIg-liketranscript2(ILT2)andILT4competewithCD8forMHCclassIbindingandbindpreferentiallytoHLA-G,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(15):8856-8861。LIR-1通过其(细胞内)免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)转导抑制性信号。在NK细胞中，研究已经表明缺乏ITIM(通常不能抑制)的KIR(抑制性杀伤细胞Ig样受体)可以在LIR-1与MHCI类分子α3结构域结合的情况下能够产生抑制(假设通过LIR-1ITIM)(参见，Kirwin等，(2005)KillerCellIg-LikeReceptor-DependentSignalingbyIg-LikeTranscript2(ILT2/CD85j/LILRB1/LIR-1)J.Immunol.175:5006-5015)，这表明了与MHCI类结合的LIR-1和KIR间的协作以及结合HLAα3结构域在调节NK细胞抑制中的作用。

如上所述，MHC分子与不表达TCR的细胞相互作用。这些细胞中有些是NK细胞。NK细胞是细胞毒性淋巴细胞(与CTL或细胞毒性T淋巴细胞相区别)，其在细胞免疫应答中发挥核心作用，尤其是在先天性免疫中。NK细胞是抵御入侵的微生物、病毒和其他非自体(如肿瘤)实体的第一道防线。通过表面受体激活或抑制NK细胞，且它们表达CD8但不表达TCR。NK细胞可与表达MHCI类的细胞相互作用，但相互作用是通过与CD8结合的α3结构域而不是通过结合TCR、携带肽的α1和α2结构域。NK细胞的主要功能是摧毁缺乏足够的MHCI类表面蛋白的细胞。

人天然杀伤(NK)细胞表面的交联的MHCI类分子导致胞内酪氨酸磷酸化，MHCI类分子从免疫突触迁移以及下调肿瘤细胞杀伤。和下调的肿瘤细胞杀伤。Rubio等，(2004)Cross-linkingofMHCclassImoleculesonhumanNKcellsinhibitsNKcellfunction,segregatesMHCIfromtheNKcellsynapse,andinducesintracellularphosphotyrosines,J.LeukocyteBiol.76:116-124。

NK细胞中的MHCI类的另一个功能显然是防止自体杀伤。NK细胞携带两种激活受体，2B4和2B4的配体CD48；MHCI类似乎与2B4结合并防止其被CD48激活。Betser-Cohen(2010)TheAssociationofMHCClassIProteinswiththe2B4ReceptorInhibitsSelf-KillingofHumanNKCells,J.Immunol.184:2761-2768。

因此，本文所述的基因工程改造的非人类动物可用于研究这些非TCR或非CTL介导的过程，并为它们的调控设计方法。

实施例

将通过下述非限制性实施例对本发明进行进一步解释。列出这些实施例用于帮助理解本发明，其不以任何方式构成对其保护范围的限制。所述实施例不包括对本领域普通技术人员熟知的常规方法(分子克隆技术等)的详细描述。除非另有明示，以重量份表示重量，分子量是平均分子量，以摄氏度表示温度和压力为处于或接近大气压。

实施例1.基因修饰HLA-A2小鼠的构建和表征

实施例1.1：MG87细胞中的HLA-A2/H-2K的表达。

一种病毒构建体包括嵌合HLA-A2/H-2K基因序列(图4A)，其通过使用本领域技术人员公认的的标准分子克隆技术制备以分析在转染的细胞中嵌合人/小鼠MHCI的表达。

简言之，嵌合人HLA-A/小鼠H-2K病毒构建体通过使用编码所述α链的α1、α2和α3结构域的外显子序列制备，并且将其克隆进编码来源于H-2K基因的跨膜域和胞浆域的序列的小鼠的编码框(图4A，pMIG-HLA-A2/H2K)。如图4所示，所述构建体包括IRES-GFP报告子序列，其用来确定所述构建体能否在转染后的细胞中表达。

在人胚胎肾293(293T)细胞中制备并增殖包括上述嵌合构建体的病毒。将293T细胞在10cm培养皿中铺板并使其生长至95％汇合度。用25μgpMIG-HLA-A2/H2K、pMIG-人HLA-A2或pMIG-人源化β2微球蛋白，和5μgpMDG(包膜质粒)、15μgPCL-Eco(无包装信号Ψ的包装构建体)、1mL的Opti-MEM(Invitrogen)制备DNA转染混合物。将在1mL的Opti-MEM中的80μL(Invitrogen)Lipofectamine-2000(其经预先混合并在室温下孵育5分钟)加入到这1mLDNA混合物中。在室温下使所述Lipofectamine/DNA混合物孵育另外20分钟，然后加入到10cm培养皿中，并将板在37℃孵育。将24小时后的细胞培养液收集，然后将新鲜的10mLR10(RPMI1640+10％FBS)培养基添加到所述细胞中。重复更换两次培养基。在共四天后，将收集的培养基合并，离心并通过无菌过滤器除去细胞碎片。

上述生产的增殖的病毒被用于转导入MG87(小鼠成纤维)细胞。用PBS将来自一个T-75烧瓶中的MG87细胞洗涤一次。将3mL0.25％胰蛋白酶+EDTA加到所述细胞中并使其在室温下孵育三分钟。将7mLD10(高葡萄糖DMEM；10％胎牛血清)加入到所述细胞/胰蛋白酶混合物中，并转移到15mL管中，在1300rpm下离心五分钟。离心细胞后，将培养液吸出并将细胞重新悬浮在5mLD10中。对细胞进行计数并将细胞铺在6孔板中，每个孔～3.0×10⁵个细胞。将单独pMIG-人HLA-A2或pMIG-HLA-A2/H-2K或与pMIG-人源化β2微球蛋白病毒一起加入到所述孔中，非转导的细胞作为对照。细胞在37℃、5％CO₂下孵育2天。准备细胞用于FACS分析(使用抗HLA-A2抗体，克隆BB7.2)以检测在有或没有β2微球蛋白时HLA-A2的表达。

图(图4B)和表格总结了从图(图4C)中得到的数据，表明了与人源化β2微球蛋白共转导增加了人HLA-A2或嵌合人/非人HLA-A2/H-2K的表达，其表现在曲线的右移。

实施例1.2.对嵌合HLA-A2/H-2K基因座的工程化改造。

使用技术通过来自人类和小鼠的细菌人工染色体(BAC)DNA构建独特的靶向载体的单一步骤对小鼠H-2K基因进行人源化(见，如，美国专利号6,586,251和Valenzuela等，(2003)High-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis.Nat.Biotech.21(6):652-659)。将来自小鼠BAC的克隆RP23-173k21(Invitrogen)的DNA通过同源重组进行修饰以将编码小鼠H-2K基因α1、α2和α3结构域的基因组DNA替换为编码人HLA-A基因的α1、α2和α3亚基的人类基因组DNA(图5)。

简言之，在单一靶向事件中使用靶向载体将编码小鼠H-2K基因的α1、α2和α3亚基的基因组序列替换为编码人HLA-A*0201基因的α1、α2和α3结构域的人类基因组DNA，所述靶向载体包括位于loxP位点之间的潮霉素选择盒，和包括小鼠H-2K基因座(包括5’非翻译区(UTR))5’的序列的5’小鼠同源臂(如SEQIDNO：1所示的5'同源臂)，和包括小鼠H-2Kα3编码序列的3'基因组序列的3’的小鼠同源臂(如SEQIDNO：2所示的3'同源臂)。

靶向内源性H-2K基因基因座的最终构建体从5'到3'包括：(1)包括包含5’UTR的内源性H-2K基因的小鼠基因组序列5'～200bp的5'同源臂，(2)～1339bp的人类基因组序列，包括HLA-A*0201先导序列、HLA-A*0201先导序列/α1内含子、HLA-A*0201α1外显子、HLA-A*0201α1-α2内含子、HLA-A*0201α2外显子、～316bp的α2-α3内含子5’端，(3)5'loxP位点，(4)潮霉素选择盒，(5)3'loxP位点，(6)～580bp的人类基因组序列，包括～304bp的α2-α3内含子的3'末端、HLA-A*0201α3外显子，以及(7)包括～200bp的小鼠基因组序列的3'同源臂，所述小鼠基因组序列包括在小鼠H-2Kα3和跨膜编码序列之间的内含子(见图5的H-2K靶向载体的示意图)。在靶向载体的5'的小鼠/人序列连接处的149个核苷酸的序列如SEQIDNO：3所示，在靶向载体的3'的小鼠/人序列连接处的159个核苷酸的序列如SEQIDNO：4。与此靶向载体的同源重组产生了修饰的小鼠H-2K基因座，其包括编码HLA-A*0201基因的α1、α2和α3结构域的人类基因组DNA，所述基因座与内源性小鼠H-2K跨膜域和胞浆域的编码序列可操作地连接，在翻译后，产生了嵌合人/小鼠MHCI类蛋白。

经靶向的BACDNA用于对小鼠F1H4ES细胞进行电穿孔以产生修饰的ES细胞用于制备在有核细胞表面表达嵌合MHCI类蛋白的小鼠(如，T和B淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞)。包括人HLA序列插入的ES细胞通过定量TAQMAN^TM检测鉴定。设计特异性引物组和探针用于检测人类HLA序列和相关的选择盒的插入(等位基因获得，GOA)以及内源性小鼠序列的丢失(等位基因丢失，LOA)。表1列出了每个定量PCR测定中使用的探针的名称和位置。

表1：用于确定嵌合HLA-A1/H-2K基因的探针

所述选择盒可以通过本领域技术人员已知的方法来去除。例如，携带嵌合人/小鼠MHCI类基因座的ES细胞可以用表达Cre的构建体转染以去除由含有人HLA-A*0201基因序列的靶向构建体的插入引入的位于loxP位点之间的潮霉素选择盒(参见图5)。潮霉素选择盒可以任选地通过与表达重组酶Cre的小鼠交配而去除。任选地，所述潮霉素选择盒保留在小鼠中。

如上所述的经靶向的ES细胞用作供体ES细胞并通过方法引入到8细胞期的小鼠胚胎中(见，如，美国专利号7,294,754和Poueymirou等，(2007)F0generationmicethatareessentiallyfullyderivedfromthedonorgene-targetedEScellsallowingimmediatephenotypicanalysesNatureBiotech.25(1):91-99)。独立地携带嵌合MHCI类基因的(完全来源于供体ES细胞的F0代小鼠)通过使用改进的等位基因测定法(Valenzuela等人，同上)的基因分型鉴定，所述等位基因测定法检测所述独特的人类HLA-A*0201基因序列的存在。

实施例1.3基因修饰小鼠体内表达嵌合HLA-A/H-2K。

对如实施例1.2中所述的携带基因修饰的H-2K基因座的杂合小鼠针对在所述动物的细胞中嵌合HLA-A/H-2K蛋白的表达进行分析。

从野生型和HLA-A/H-2K嵌合杂合体(A2/H2K)小鼠中分别获得血液。用藻红蛋白偶联(PE)的抗HLA-A抗体对细胞进行染色以检测人HLA-A2，并在4℃与别藻蓝蛋白偶联抗H-2K^b抗体接触一小时。使用HLA-A和H-2K^b特异性抗体通过流式细胞术对细胞表达进行分析。图6A示出野生型和嵌合杂合体中H-2K^b和HLA-A2的表达，嵌合杂合体表达两种蛋白。图6B示出在所述杂合小鼠中H-2K^b和嵌合HLA-A2/H2K的表达。

实施例2.基因修饰β2微球蛋白小鼠的构建和表征

实施例2.1：工程改造人源化β2微球蛋白基因座

使用技术将所述小鼠β2微球蛋白(β2m)基因在单一步骤中通过构建独特的靶向载体进行人源化，所述靶向载体来自人类和小鼠的细菌人工染色体(BAC)DNA(见，如美国专利号6,586,251和Valenzuela等，同上)。

简言之，靶向载体通过细菌同源重组包制备，所述细菌同源重组包括来自RPCI-23文库(Invitrogen)中BAC克隆89C24的小鼠β2m上游和下游同源臂。将所述小鼠同源臂工程化改造以将从外显子2至非编码外显子4下游约267个核苷酸延伸出的2.8kb的人β2mDNA片段包括在侧翼之间(图7)。将在重组酶识别位点(如loxP位点)之间的药物选择盒(新霉素)工程化改造进入所述靶向载体，以允许随后的选择。将最终的靶向载体线性化，并通过电穿孔引入F1H4小鼠ES细胞株(Valenzuela等，同上)。

通过方法将去除药物选择盒(通过Cre重组酶引入)的靶向的ES细胞克隆引入8细胞期小鼠胚胎(见，如美国专利7,294,754号和Poueymirou等人，同上)。携带人源化β2m基因的(完全来源于供体ES细胞的F0代小鼠)通过使用改进的等位基因测定法筛选小鼠等位基因的丢失和人等位基因的获得儿鉴定(Valenzuela等，同上)。

实施例2.2：人源化β2微球蛋白小鼠的表征

使用流式细胞术对人源化β2微球蛋白(β2m)基因杂合的小鼠进行表达评价(图8和9)。

简言之，使用本领域已知技术从野生型组(每组n＝4)、人源化β2m、人源化MHC(即，人HLA)I类和双人源化β2m和MHCI类小鼠中分离血液。来源于各组各小鼠的血液用ACK裂解缓冲液(Lonza,Walkersville,MD,USA)处理，以去除红细胞。使用荧光标记的抗CD3(17A2)、抗CD19(1D3)、抗CD11b(M1/70)、抗-人HLA类I和抗-人β2微球蛋白(2M2)抗体对剩余细胞进行染色。使用(BDBiosciences)进行流式细胞术。

从来源于单一人源化和双人源化动物的细胞中检测到人HLAI类的表达，而来源于双人源化小鼠的细胞仅检测到β2微球蛋白的表达(图8)。人类β2m和人HLAI类的共表达导致人HLAI类在细胞表面的可检测的量相对于在不存在人类β2m时表达的人HLAI类的量增加(图9；平均荧光强度2370对1387)。

实施例3.来自表达HLA-A2/H-2K和人源化β2微球蛋白的基因修饰小鼠APC呈递的爱泼斯坦-巴尔病毒流感(EBV)肽的免疫应答。

对来源于几个人类供体的PBMC针对HLA-A2的表达及其产生针对流感和EBV肽的响应能力进行筛选。选择单个供体进行后续实验。

使用负选择从选择的供体PBMC中分离人T细胞。从嵌合HLA-A2/H-2K杂合小鼠、人源化β2微球蛋白基因杂合小鼠以及野生型小鼠中分离脾脏非T细胞。将小鼠中约50,000个脾脏非T细胞加入到由抗人IFNγ抗体包被的Elispot板上。加入流感肽(10微摩尔)或EBV肽集合(各5微摩尔)。以25微克/孔加入聚合IC，在37℃、5％CO₂下孵育所述孔三小时。将人T细胞(50,000)和抗人CD28加入到脾脏非T细胞和肽中，在37℃、5％CO₂下孵育所述孔40个小时，之后进行IFNγElispot测定。

如图10所示，当流感和EBV肽被在表面表达嵌合HLA-A2/H-2K和人源化β2微球蛋白的小鼠APC呈递时，人T细胞能够产生对其的应答。

实施例4.基因修饰HLA-B27小鼠的构建和表征

实施例4.1：工程化改造嵌合HLA-B27/H-2D1基因座

使用技术将小鼠H-2D1(组织相容性2，D区基因座1)基因在单一步骤中通过独特的靶向载体进行人源化，所述靶向载体来源于人类和小鼠的细菌人工染色体(BAC)DNA(见，如，美国专利号6,586,251和Valenzuela等人(2003)，同上)。将来自小鼠BAC克隆bMQ300c10(Invitrogen)的DNA通过同源重组进行修饰以将编码小鼠H-2D1基因α1、α2和α3结构域的基因组DNA替换为编码人HLA-B27基因α1、α2和α3亚基的人基因组DNA(图11)。

简言之，在单一靶向事件中使用靶向载体将编码小鼠H-2D1基因α1、α2和α3亚基的基因组序列替换为编码人HLA-B27基因(亚型B*2701-2759)α1、α2和α3的人基因组序列DNA，所述靶向载体包括5’小鼠同源臂，其包括在小鼠H-2D1基因座(包括先导序列外显子)5’的序列，以及3’小鼠同源臂，其包括小鼠H-2D1polyA序列3’的基因组序列。

靶向内源性H-2D1基因基因座的最终构建体从5'到3'包括：(1)包括包含先导序列外显子和内含子的内源性H-2D1基因5'的49.8kb小鼠基因组序列的5'同源臂，(2)包括HLA-B27α1外显子、HLA-Bα1-α2内含子、HLA-Bα2外显子、具有5'loxP位点插入的HLA-Bα2-α3内含子、HLA-Bα3外显子的1.67kb的人基因组序列，(3)1.8kb的小鼠H-2D1α3内含子、H-2D1跨膜和胞浆编码外显子和polyA序列，(4)5'FRT位点，(5)潮霉素选择盒，(6)3'FRT位点，(7)3'loxP位点以及(8)包括小鼠H-2D1基因下游的155.6kb小鼠基因组序列的3'同源臂(参见图11，H-2D1靶向载体的示意图)。在靶向载体的5'的所述小鼠/人序列连接处的199个核苷酸序列示于SEQIDNO：9，包括靶向载体内插入的loxP序列及其周围的人序列的134个核苷酸序列示于SEQIDNO：10，靶向载体3’的所述人/小鼠序列连接处的200个核苷酸序列示于SEQIDNO：11，位于小鼠序列和FRT-HYG-FRT选择盒的连接处5’的序列示于SEQIDNO：12，以及位于FRT-HYG-FRT选择盒和小鼠序列3’连接处的序列示于SEQIDNO：13。所述靶向载体的同源重组产生了包括编码HLA-B27基因的α1、α2和α3结构域的人类基因组DNA的修饰的小鼠H-2D1基因座，其可操作地连接到内源性小鼠H-2D1跨膜域和胞浆域的编码序列，经翻译后，产生嵌合人/小鼠MHCI类蛋白。

靶向的BACDNA用于小鼠F1H4ES细胞电穿孔以产生修饰的ES细胞，以用于制备在有核细胞(如，T和B淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞)表面表达嵌合MHCI类蛋白的小鼠。包括人HLA序列的插入的ES细胞通过定量TAQMAN^TM检测鉴定。设计特异性引物组和探针用于检测人类HLA序列和相关选择盒的插入(获得等位基因，GOA)和内源性小鼠序列的丢失(等位基因丢失，LOA)。表2列出每个在定量PCR测定中使用的探针名称和检测的位置；这些探针被示意性地描绘在图11中。

表2：用于确认嵌合HLA-B27/H-2D基因的探针

HLA-B27/H2-D1等位基因可以通过与Cre去除小鼠品系杂交被诱导条件性缺失。例如，携带嵌合人/小鼠MHCI类基因座的小鼠可以与在特定细胞系表达Cre重组酶的转基因小鼠杂交，以去除在靶向构建体中在lox位点之间的人HLA-B27α3和在5'和3'loxP位点之间的小鼠H2-D1跨膜和胞浆区(参见图11)。

选择盒可以通过本领域的技术人员已知的方法来去除。例如携带嵌合人/小鼠MHCI类基因座的ES细胞可以用表达FlpO的构建体转染以去除在FRT位点之间的潮霉素选择盒(其由包括人HLA-B27基因序列的靶向构建体插入)(参见图11)。所述潮霉素选择盒可以任选地选择通过与表达FlpO重组酶的小鼠交配来去除。任选地，所述潮霉素盒保留在小鼠中。

上述靶向的ES细胞作为供体ES细胞并且使用的方法导入8细胞期的小鼠胚胎中(见，如，美国专利号7,294,754和Poueymirou等人(2007)，同上)。(完全来源于供体ES细胞的F0代小鼠)独立地携带嵌合MHCI类基因，其使用改进的等位基因检测通过基因分型鉴定(Valenzuela等人，同上)，所述方法检测独特的人类HLA-B27基因序列的存在。

实施例4.2：基因修饰小鼠中嵌合HLA-B27/H-2D1的表达

从对人源化B2M和嵌合HLA-B27/H-2D1都为杂合的小鼠和它们的野生型同窝中使用含EDTA(BD)的微量试管收集血液。使用1mg/ml的初级抗体(W6/32-PE，泛HLA-类抗体，Abcam；或抗人b2m抗体)在4℃下对血液进行染色25分钟，随后用FACS缓冲液洗涤，并按1：300稀释APC标记抗人IgG二级抗体(JacksonImmunoresearch)，在4℃孵育20分钟。用一步固定/裂解溶液(eBiosciences)裂解血红细胞并且对细胞固定，并重悬在1×BD稳定固定剂中。使用FACSCanto机器获得细胞，使用FlowJo软件分析数据。

如图12所显示的，嵌合HLA-B27/H-2D1蛋白和人源化B2M表达于基因工程改造动物的血细胞中(通过针对人HLA-B27和人B-2M的抗体检测证明)，而在野生型动物中检测不到它们的表达。

等同方式

本领域技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验来确定本文中所描述的本发明的具体实施方式的许多等同方式。这样的等同方式亦由本发明的权利要求所涵盖。

引用在本申请的所有非专利文献、专利申请和专利的全部内容通过引用整体并入申请。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种小鼠，其在内源性H-2D基因座包括编码嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，

其中所述嵌合多肽包括人HLA-B27多肽的α1、α2和α3结构域、小鼠H-2D多肽的跨膜域和小鼠H-2D多肽的胞浆域；并且

其中所述小鼠表达所述嵌合多肽。

2.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述小鼠不表达来自内源性H-2D基因座的小鼠H-2D多肽的功能性胞外域。

3.权利要求1所述的小鼠，其中所述内源性H-2D基因座缺乏编码小鼠H-2D多肽的α1、α2和α3结构域的内源性核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述核苷酸序列包括内源性小鼠H-2D先导核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述核苷酸序列可操作地与内源性小鼠调控元件连接。

6.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述核苷酸序列包括人HLA-B27的α1外显子、人HLA-B27的α1-α2内含子、人HLA-B27的α2外显子、人HLA-B27的α2-α3内含子以及人HLA-B27的α3外显子。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的小鼠，其进一步在内源性β2微球蛋白基因座包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，其中所述小鼠表达所述人或人源化β2微球蛋白多肽。

8.根据权利要求7所述的小鼠，其中所述小鼠不表达来自内源性β2微球蛋白基因座的功能性内源性β2微球蛋白。

9.根据权利要求8所述的小鼠，其中所述编码所述人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列可操作地与内源性小鼠β2微球蛋白调控元件连接。

10.根据权利要求7所述的小鼠，其中所述编码所述人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括人β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4所示的核苷酸序列。

11.根据权利要求7所述的小鼠，其中所述编码所述人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括人β2微球蛋白基因的外显子2、外显子3和外显子4所示的核苷酸序列。

12.一种非人类动物，其在内源性MHCI基因座包括编码两种或更多种嵌合人/非人MHCI多肽的两个或更多个核苷酸序列，

其中所述嵌合多肽包括人MHCI多肽的α1、α2和α3结构域、非人MHCI多肽的跨膜域和非人MHCI多肽的胞浆域；并且

其中所述动物表达所述两种或更多种嵌合人/非人MHCI多肽。

13.根据权利要求12所述的动物，其中所述动物是啮齿动物。

14.根据权利要求13所述的动物，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

15.根据权利要求14所述的动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且其中所述非人MHCI多肽是小鼠H-2D多肽、小鼠H-2K多肽或小鼠H-2L多肽。

16.根据权利要求12所述的非人类动物，其中所述动物不表达功能性的内源性MHCI多肽。

17.一种小鼠，其在内源性MHCI基因座包括编码嵌合HLA-A2/H-2K多肽的核苷酸序列和编码嵌合HLA-B27/H-2D多肽的核苷酸序列，

其中所述小鼠表达所述嵌合HLA-A2/H-2K和HLA-B27/H-2D多肽。

18.根据权利要求17所述的小鼠，其中所述小鼠不表达功能性的内源性MHCI多肽。

19.根据权利要求17所述的小鼠，其中所述编码所述嵌合HLA-A2/H-2K多肽的核苷酸序列位于内源性H-2K基因座，并且编码所述嵌合HLA-B27/H-2D多肽的核苷酸序列位于内源性H-2D基因座。

20.编码嵌合人/非人MHCI多肽的嵌合MHCI基因座，包括：

编码人MHCI多肽的α1、α2和α3结构域的第一核苷酸序列，其可操作地与编码非人MHCI多肽的跨膜域和胞浆域的第二核苷酸序列连接，

其中所述基因座表达嵌合的人/非人MHCI多肽。

21.根据权利要求20所述的基因座，其中所述MHCI基因座位于非人类动物基因组中的内源性MHCI位置。

22.根据权利要求21所述的基因座，其中所述人MHCI多肽为HLA-A2或HLA-B27。

23.根据权利要求20所述的基因座，其中所述非人MHCI多肽是小鼠H-2K多肽或小鼠H-2D多肽。

24.一种修饰小鼠的内源性H-2D基因座以表达嵌合人/小鼠MHCI多肽的方法，其中所述方法包括将位于所述内源性H-2D基因座的编码小鼠H-2D多肽α1、α2和α3结构域的核苷酸序列替换为编码人HLA-B27多肽α1、α2和α3结构域的核苷酸序列。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述小鼠不表达来自内源性H-2D基因座的小鼠H-2D多肽的胞外域。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述小鼠表达人HLA-B27多肽的α1、α2和α3结构域。

27.根据权利要求24所述的方法，其中所述小鼠表达小鼠H-2D多肽的跨膜域和所述小鼠H-2D多肽的胞浆域。

28.根据权利要求24所述的方法，其中所述替换是在单个ES细胞中进行的，并将所述单个ES细胞引入小鼠胚胎以制备小鼠。

29.一种制备基因修饰的小鼠的方法，包括：

修饰第一小鼠的H-2D基因座以表达嵌合人/小鼠MHCI多肽，包括将内源性小鼠H-2D基因座中编码小鼠H-2D多肽的α1、α2和α3结构域的核苷酸序列替换为编码人HLA-B27多肽的α1、α2和α3结构域的核苷酸序列；

修饰第二小鼠的β2微球蛋白基因座以表达人或人源化β2微球蛋白多肽，包括将内源性小鼠β2微球蛋白基因座中编码小鼠β2微球蛋白多肽的核苷酸序列替换为编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列；并且

将所述第一和第二小鼠交配以制备基因修饰小鼠，所述基因修饰小鼠的基因组包括编码嵌合HLA-B27/H-2D多肽的第一核苷酸序列和编码人或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列，其中所述基因修饰小鼠表达所述嵌合HLA-B27/H-2D多肽和所述人或人源化β2微球蛋白多肽。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第二核苷酸序列包括人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4所示的核苷酸序列，以及小鼠β2微球蛋白基因的外显子1所示的核苷酸序列。

Claims (31)

1.一种小鼠，其在内源性H-2D基因座包括编码嵌合人/小鼠MHCI多肽的核苷酸序列，

其中所述嵌合多肽包括人HLA-B27多肽的胞外域、小鼠H-2D多肽的跨膜域和小鼠H-2D多肽的胞浆域；并且

其中所述小鼠表达所述嵌合多肽。

2.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述小鼠不表达来自内源性H-2D基因座的小鼠H-2D多肽的功能性胞外域。

3.权利要求1所述的小鼠，其中所述内源性H-2D基因座缺乏编码小鼠H-2D多肽的α1、α2和α3结构域的内源性核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述核苷酸序列包括内源性小鼠H-2D先导核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述核苷酸序列可操作地与内源性小鼠调控元件连接。

6.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述嵌合多肽包括人HLA-B27多肽的α1、α2和α3结构域。

7.根据权利要求1所述的小鼠，其中所述核苷酸序列包括人HLA-B27的α1外显子、人HLA-B27的α1-α2内含子、人HLA-B27的α2外显子、人HLA-B27的α2-α3内含子以及人HLA-B27的α3外显子。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的小鼠，其进一步在内源性β2微球蛋白基因座包括编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，其中所述小鼠表达所述人或人源化β2微球蛋白多肽。

9.根据权利要求8所述的小鼠，其中所述小鼠不表达来自内源性β2微球蛋白基因座的功能性内源性β2微球蛋白。

10.根据权利要求9所述的小鼠，其中所述编码所述人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列可操作地与内源性小鼠β2微球蛋白调控元件连接。

11.根据权利要求8所述的小鼠，其中所述编码所述人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括人β2微球蛋白基因的外显子2至外显子4所示的核苷酸序列。

12.根据权利要求8所述的小鼠，其中所述编码所述人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包括人β2微球蛋白基因的外显子2、外显子3和外显子4所示的核苷酸序列。

13.一种非人类动物，其在内源性MHCI基因座包括编码两种或更多种嵌合人/非人MHCI多肽的两个或更多个核苷酸序列，

其中所述嵌合多肽包括人MHCI多肽的胞外域、非人MHCI多肽的跨膜域和非人MHCI多肽的胞浆域；并且

其中所述动物表达所述两种或更多种嵌合人/非人MHCI多肽。

14.根据权利要求13所述的动物，其中所述动物是啮齿动物。

15.根据权利要求14所述的动物，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。

16.根据权利要求15所述的动物，其中所述啮齿动物是小鼠，并且其中所述非人MHCI多肽是小鼠H-2D多肽、小鼠H-2K多肽或小鼠H-2L多肽。

17.根据权利要求13所述的非人类动物，其中所述动物不表达功能性的内源性MHCI多肽。

18.一种小鼠，其在内源性MHCI基因座包括编码嵌合HLA-A2/H-2K多肽的核苷酸序列和编码嵌合HLA-B27/H-2D多肽的核苷酸序列，

其中所述小鼠表达所述嵌合HLA-A2/H-2K和HLA-B27/H-2D多肽。

19.根据权利要求18所述的小鼠，其中所述小鼠不表达功能性的内源性MHCI多肽。

20.根据权利要求18所述的小鼠，其中所述编码所述嵌合HLA-A2/H-2K多肽的核苷酸序列位于内源性H-2K基因座，并且编码所述嵌合HLA-B27/H-2D多肽的核苷酸序列位于内源性H-2D基因座。

21.编码嵌合人/非人MHCI多肽的嵌合MHCI基因座，包括：

编码人MHCI多肽的胞外域的第一核苷酸序列，其可操作地与编码非人MHCI多肽的跨膜域和胞浆域的第二核苷酸序列连接，

其中所述基因座表达嵌合的人/非人MHCI多肽。

22.根据权利要求21所述的基因座，其中所述MHCI基因座位于非人类动物基因组中的内源性MHCI位置。

23.根据权利要求22所述的基因座，其中所述人MHCI多肽为HLA-A2或HLA-B27。

24.根据权利要求21所述的基因座，其中所述非人MHCI多肽是小鼠H-2K多肽或小鼠H-2D多肽。

25.一种修饰小鼠的内源性H-2D基因座以表达嵌合人/小鼠MHCI多肽的方法，其中所述方法包括将位于所述内源性H-2D基因座的编码小鼠H-2D多肽胞外域的核苷酸序列替换为编码人HLA-B27多肽胞外域的核苷酸序列。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述小鼠不表达来自内源性H-2D基因座的小鼠H-2D多肽的胞外域。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述小鼠表达人HLA-B27多肽的α1、α2和α3结构域。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述小鼠表达小鼠H-2D多肽的跨膜域和所述小鼠H-2D多肽的胞浆域。

29.根据权利要求25所述的方法，其中所述替换是在单个ES细胞中进行的，并将所述单个ES细胞引入小鼠胚胎以制备小鼠。

30.一种制备基因修饰小鼠的方法，包括：

修饰第一小鼠的H-2D基因座以表达嵌合人/小鼠MHCI多肽，包括将内源性小鼠H-2D基因座中编码小鼠H-2D多肽的胞外域的核苷酸序列替换为编码人HLA-B27多肽的胞外域的核苷酸序列；

修饰第二小鼠的β2微球蛋白基因座以表达人或人源化β2微球蛋白多肽，包括将内源性小鼠β2微球蛋白基因座中编码小鼠β2微球蛋白多肽的核苷酸序列替换为编码人或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列；并且

将所述第一和第二小鼠交配以制备基因修饰小鼠，所述基因修饰小鼠的基因组包括编码嵌合HLA-B27/H-2D多肽的第一核苷酸序列和编码人或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列，其中所述基因修饰小鼠表达所述嵌合HLA-B27/H-2D多肽和所述人或人源化β2微球蛋白多肽。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二核苷酸序列包括人β2微球蛋白基因的外显子2、3和4所示的核苷酸序列，以及小鼠β2微球蛋白基因的外显子1所示的核苷酸序列。