ES2822228T3 - Composiciones y métodos para inducir la fagocitosis de células positivas de clase I de CMH y contrarrestar la resistencia a anti-CD47/SIRPA - Google Patents

Abstract

Un método para inducir la fagocitosis de una célula diana, comprendiendo el método: poner en contacto una célula diana con un macrófago en presencia de una composición para aumentar la fagocitosis de una célula diana, la composición comprende: (a) un agente de miembro 1 de subfamilia B de receptor tipo inmunoglobulina anti-CMH Clase I/leucocitos (LILRB1) que reduce la unión entre CMH Clase I en la célula diana y LILRB1 en una célula fagocítica, donde dicho agente anti-CMH Clase I/LILRB es: (i) un anticuerpo anti-CMH Clase I, (ii) un péptido LILRB1 que comprende uno o más de los dominios de inmunoglobulina extracelular de LILRB1, (iii) un anticuerpo anti-LILRB1, o (iv) un complejo de CMH Clase I soluble que se une a LILRB1; y (b) un agente anti-CD47/SIRPA que reduce la unión de CD47 en la célula diana a SIRPα en una célula fagocítica, donde dicho agente anti-CD47/SIRPA es: (i) un anticuerpo anti-CD47, (ii) un polipéptido SIRPα de alta afinidad que comprende un dominio d1 de SIRPα humano, con al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d1, en donde el cambio de aminoácido aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPα a CD47 al disminuir la tasa de desviación en al menos 10 veces, (iii) un reactivo SIRPA que comprende al menos el dominio d1 de SIRPA, (iv) un anticuerpo anti-SIRPa, o (v) un polipéptido CD47 soluble, para un período de tiempo suficiente para inducir la fagocitosis de la célula diana por el macrófago, en donde el contacto es in vitro o ex vivo.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para inducir la fagocitosis de células positivas de clase I de CMH y contrarrestar la resistencia a anti-CD47/SIRPA

INTRODUCCIÓN

[0001] La muerte celular programada (PCD) y la eliminación de las células fagocíticas son formas comunes en las que responde un organismo para eliminar células dañadas, precancerosas, o infectadas. Las células que sobreviven a esta respuesta del organismo (por ejemplo, células cancerosas, células infectadas crónicamente, etc.) han ideado formas de evadir la PCD y la eliminación de células fagocíticas. Por ejemplo, los tumores en crecimiento y las células que albergan una infección están bajo la presión constante del sistema inmunológico del huésped, y la evasión de la vigilancia inmunológica es fundamental para la progresión del cáncer y la infección crónica en los pacientes. Agentes terapéuticos que interrumpen este escape, ya sea estimulando directamente el sistema inmunológico para que ataque las células tumorales y/o células infectadas, o por el bloqueo de señales inmunosupresoras expresadas por células tumorales y/o células infectadas, comprende una nueva categoría prometedora de fármacos.

[0002] Si se activan adecuadamente, las células efectoras de los sistemas inmunes tanto innatos como adaptativos poseen la capacidad de ataque de células cancerosas y/o células infectadas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se unen a tumores pueden inducir este ataque, y la eficacia depende en parte de la capacidad del anticuerpo para estimular la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) por parte de los macrófagos. Sin embargo, CD47, una señal de "no me comas", está constitutivamente regulada al alza en una amplia variedad de células enfermas, células cancerosas y células infectadas, lo que permite que estas células eviten la fagocitosis. Aunque la unión de un anticuerpo antitumoral a las células tumorales es suficiente para activar los receptores Fc de los macrófagos y estimular así algún grado de fagocitosis de las células tumorales, la potencia de esta respuesta está fuertemente limitada por la expresión del tumor de CD47.

[0003] Los agentes anti-CD47/SIRPA que bloquean la interacción entre CD47 en una célula (por ejemplo, una célula de cáncer, una célula infectada, etc.) y SIRPA sobre otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica) contrarrestan el aumento de la expresión de CD47 y facilitan la fagocitosis de la célula cancerosa y/o la célula infectada. Por ejemplo, los anticuerpos bloqueadores de CD47 interrumpen simultáneamente la interacción CD47/SIRPA y opsonizan las células tumorales a las que se unen, promoviendo poderosamente la fagocitosis de macrófagos (Fig. 1A). Los agentes anti-CD47/SIRPA pueden usarse para tratar y/o proteger contra una amplia variedad de afecciones/trastornos.

[0004] Sin embargo, algunas células cancerosas y/o células infectadas son resistentes al tratamiento con agentes anti-CD47/SIRPA. La presente divulgación proporciona composiciones y métodos para predecir si un cáncer (por ejemplo, predecir si un individuo que tiene cáncer) responderá al tratamiento anti-CD47. Esta divulgación proporciona además composiciones y métodos para tratar un cáncer y/o una infección que es resistente al tratamiento con agentes anti-CD47/SIRPA. Por ejemplo, esta divulgación proporciona composiciones y métodos para reducir la resistencia al tratamiento (con un agente anti-CD47/SIRPA) de una célula cancerosa y/o una célula infectada.

Publicaciones

[0005] . Borges et al, 1997, Journal of Immunology 159, 5192-5196; Fanger y col., 1998, European Journal of Immunology 28, 3423-3434; Willcox y col., 2003,. Nature immunology 4, 913-919; Cheng, H. et al., 2011, The Journal of Biological Chemistry 286, 18013-18025, doi: 10,1074/jbc.M111,221028. Monsivais-Urenda et al., 2007, Journal of Autoinmunity 29 (2-3), 97-105, describe el análisis de la expresión y función del receptor inhibidor ILT2 (CD85j/LILRB1/LIR-1) en células mononucleares de sangre periférica de pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES). Saverino et al., 2000, The Journal of Immunology 165 (7), 3742-3755, informa que el receptor inhibidor de CD85/LIR-1/ILT2 es expresado por todos los linfocitos T humanos y regula negativamente sus funciones. Moysey et al., 2011, Protein & Cell, 1 (12), 1118-1127, describen un receptor de ILT2 soluble de alta afinidad. Steevels et al., 2011, European Journal of Immunology 41 (3), 575-587 describe receptores inhibidores inmunes. Tseng et al., 2013, PNAS 110 (27), 11103-11108 informa que la fagocitosis del cáncer mediada por anticuerpos antiCD47 por macrófagos prepara una respuesta eficaz de células T antitumorales. El documento Wo 2009/091601 describe métodos para manipular la fagocitosis mediada por CD47. Barkal et al., 2017, Nature Immunology 19 (1), 76-84 informa que la participación del CMH Clase I por el receptor inhibidor LILRB1 suprime los macrófagos y es una diana de la inmunoterapia contra el cáncer. Davidson et al., 2013, International Immunology 26 (1), 21-33 informa que el factor de transcripción AP-1 JunD activa el promotor distal del receptoR1 de tipo inmunoglobulina leucocitaria. Liu et al., 2014, Oncology Reports 33, 95-102 describe la inhibición específica del crecimiento de células de cáncer de mama humano que expresan ErbB2 por células NK-92 modificadas genéticamente.

SUMARIO

[0006] La invención proporciona un método para inducir la fagocitosis de una célula diana, comprendiendo el método: poner en contacto una célula diana con un macrófago en presencia de una composición para aumentar la fagocitosis de una célula diana, comprendiendo la composición:

(a) un agente de miembro 1 de subfamilia B de receptor inmunoglobulina-like anti-CMH Clase I/leucocitos (LILRBi) que reduce la unión entre CMH Clase I en la célula diana y LILRB1 en una célula fagocítica, en donde dicho agente anti-CMH Clase I/LILRB es:

(i) un anticuerpo anti-CMH Clase I,

(ii) un péptido LILRB1 que comprende uno o más de los dominios de inmunoglobulina extracelular de LILRB1,

(iii) un anticuerpo anti-LILRB1, o

(iv) un complejo de CMH Clase I soluble que se une a LILRB1; y

(b) un agente anti-CD47/SIRPA que reduce la unión de CD47 en la célula diana a SIRPa en una célula fagocítica, donde el agente anti-CD47/SIRPA es:

(i) un anticuerpo anti-CD47,

(ii) un polipéptido SIRPa de alta afinidad que comprende un dominio d i de SIRPa humano, con al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d i, en donde el cambio de aminoácido aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPa a CD47 al disminuir la tasa de desviación en al menos 10 veces,

(iii) un reactivo SIRPA que comprende al menos el dominio d i de SIRPA,

(iv) un anticuerpo anti-SIRPa, o

(v) un polipéptido CD47 soluble,

durante un período de tiempo suficiente para inducir la fagocitosis de la célula diana por el macrófago, en donde el contacto es in vitro o ex vivo.

[0007] La invención proporciona además un miembro 1 de subfamilia B de receptor inmunoglobulina-like anti-CMH Clase I/leucocitos (LILRBi) para uso en un método de tratamiento de cáncer o una infección de patógeno intracelular en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo:

(a) el agente anti-CMH Clase I/LILRB1, en donde el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 reduce la unión entre CMH Clase I en una célula diana y LILRBi en una célula fagocítica, y donde el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 es:

(i) un anticuerpo anti-CMH Clase I,

(ii) un péptido LILRBi que comprende uno o más de los dominios de inmunoglobulina extracelulares de LILRBi,

(iii) un anticuerpo anti-LILRBi, o

(iv) un complejo soluble de CMH Clase I que se une a LILRBi; y

(b) un agente anti-CD47/SIRPA que reduce la unión de CD47 en una célula diana a SIRPa en una célula fagocítica, en donde el agente anti-CD47/SIRPA es:

(i) un anticuerpo anti-CD47,

(ii) un polipéptido SIRPa de alta afinidad que comprende un dominio d i de SIRPa humano, con al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d i, en donde el cambio de aminoácido aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPa a CD47 al disminuir la tasa de desviación en al menos i0 veces,

(iii) un reactivo SIRPA que comprende al menos el dominio d i de SIRPA,

(iv) un anticuerpo anti-SIRPa, o

(v) un polipéptido CD47 soluble,

en cantidades eficaces para reducir el número de células cancerosas y/o células que albergan el patógeno intracelular en el individuo.

[0008] La invención proporciona además un agente anti-CD47/SIRPA para uso en un método de tratamiento de cáncer o una infección intracelular por patógenos en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo:

(a) un agente anti-CMH Clase I/LILRBi que reduce la unión entre CMH Clase I en una célula diana y LILRBi en una célula fagocítica, en donde el agente anti-CMH Clase I/LILRBi es: (i)

(i) un anticuerpo anti-CMH Clase I,

(ii) un péptido LILRBi que comprende uno o más de los dominios de inmunoglobulina extracelular de LILRBi,

(iii) un anticuerpo anti-LILRBi, o

(iv) un complejo de CMH Clase I soluble que se une a LILRBi; y

(b) el agente anti-CD47/SIRPA, donde el agente anti-CD47/SIRPA reduce la unión de CD47 en una célula diana a SIRPa en una célula fagocítica, y donde el agente anti-CD47/SIRPA es:

(i) un anticuerpo anti-CD47,

(ii) un polipéptido SIRPa de alta afinidad que comprende un dominio d i de SIRPa humano, con al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d i, donde el aminoácido el cambio aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPa a CD47 al disminuir la tasa de desviación en al menos 10 veces,

(iii) un reactivo SIRPA que comprende al menos el dominio d i de SIRPA,

(iv) un anticuerpo anti-SIRPa, o

(v) un polipéptido CD47 soluble,

en cantidades eficaces para reducir el número de células cancerosas y/o células que albergan el patógeno intracelular en el individuo.

[0009] La invención proporciona además un método para predecir si un individuo es resistente o susceptible al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA que reduce la unión de CD47 en una célula diana a SIRPa en una célula fagocítica, comprendiendo el método:

(a) medir el nivel de expresión de CMH Clase I en una muestra biológica del individuo, en donde la muestra biológica comprende una célula cancerosa o una célula que alberga un patógeno intracelular, para producir un valor de prueba medido;

(b) comparar el valor de prueba medido con un valor de control; y

(c) proporcionar una predicción, basada en dicha comparación, sobre si el individuo es resistente o susceptible al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA, en donde dicho agente anti-CD47/SIRPA que reduce la unión de CD47 en una diana célula a SIRPa en una célula fagocítica es:

(i) un anticuerpo anti-CD47,

(ii) un polipéptido SIRPa de alta afinidad que comprende un dominio d i de SIRPa humano, con al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d i, en donde el cambio de aminoácido aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPa a CD47 al disminuir la tasa de desviación en al menos i0 veces,

(iii) un reactivo SIRPA que comprende al menos el dominio d i de SIRPA,

(iv) un anticuerpo anti-SIRPa, o

(v) un polipéptido CD47 soluble.

[0010] Los métodos y composiciones se proporcionan para inducir la fagocitosis de una célula diana, tratar un individuo con cáncer, tratar un individuo que tiene una infección de patógeno intracelular (por ejemplo, una infección crónica), y/o reducir el número de células infligidas (por ejemplo, células cancerosas, células infectadas con un patógeno intracelular, etc.) en un individuo. También se proporcionan métodos y composiciones para predecir si un individuo es resistente (o susceptible) al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA. En algunos casos, los métodos y composiciones de referencia incluyen un agente anti-CMH Clase I/LILRBi. En algunos casos, los métodos y composiciones en cuestión incluyen un agente anti-CMH Clase I/LILRBi y un agente antiCD47/SIRPA (por ejemplo, coadministración de un agente anti-CMH Clase I/LILRBi y un agente anti-CD47/SIRPA). También se proporcionan kits para practicar los métodos de la divulgación.

[0011] En algunas realizaciones, una composición de la materia (por ejemplo, para aumentar la fagocitosis de una célula diana) incluye: (a) un agente anti-CMH Clase I/LILRBi (por ejemplo, un agente de unión tal como un anti-CMH Clase I CMH I o un péptido LILRBi; un agente de unión a LILRBi tal como un anticuerpo anti-LILRBi o un complejo soluble de CMH Clase I que se une a LILRBi; y similares); y (b) al menos uno de: (i) un agente que opsoniza la célula diana, y (ii) un agente anti-CD47/SIRPA. En algunos casos, el agente anti-CMH Clase I/LILRBi se une específicamente al complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) Clase I. En algunos casos, el agente anti-CMH Clase I/LILRBi es un anticuerpo que se une específicamente al CMH Clase I clásico, donde el CMH clase I clásico carece de HLA-G y comprende al menos uno de HLA-A, HLA-B y HLA-C. En algunos casos, el agente anti-CMH Clase I/LILRBi es un péptido miembro i de la subfamilia B del receptor de tipo inmunoglobulina leucocitaria soluble (LILRBi). En algunos casos, el agente anti-CMH Clase I/LILRBi se une específicamente al miembro i de la subfamilia B del receptor de tipo inmunoglobulina leucocitaria (LILRBi) y no activa la señalización a través de LILRBi al unirse. En algunos casos, el agente anti-CMH Clase I/LILRBi es un anticuerpo anti-LILRBi. En algunos casos, la composición también incluye un agente anti-CD47/SIRPA. En algunos casos, el agente que opsoniza la célula diana es un anticuerpo que no es un anticuerpo anti-CD47. En algunos casos, la composición incluye un agente anti-CD47/SIRPA y un agente que opsoniza la célula diana.

[0012] En algunas realizaciones, un kit de sujeto (por ejemplo, para aumentar la fagocitosis de una célula diana) incluye: (a) un anticuerpo anti-CMH agente Clase I/LILRBi (por ejemplo, un agente de unión tal como un anti-CMH Clase I CMH I o un péptido LILRBi; un agente de unión a LILRBi tal como un anticuerpo anti-LILRBi o un complejo soluble de CMH Clase I que se une a LILRB1; y similares); y (b) un agente anti-CD47/SIRPA y/o un agente que opsoniza la célula diana (por ejemplo, donde (a) y (b) están en contenedores separados). En algunos casos, al menos uno de (a) y (b) está presente como formulación terapéutica.

[0013] En algunas realizaciones, un método sujeto es un método para inducir la fagocitosis de una célula diana, y el método incluye: poner en contacto una célula diana con un macrófago en presencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 (por ejemplo, una molécula de agente de unión de CMH Clase I, como un anticuerpo anti-CMH Clase I o un péptido LILRB1; un agente de unión de LILRB1, como un anticuerpo anti-LILRB1 o un complejo soluble de CMH Clase I que se une a LILRB1; y similares) y al menos uno de: un agente anti-CD47/SIRPA y un agente que opsoniza la célula diana, durante un período de tiempo suficiente para inducir la fagocitosis de la célula diana por el macrófago. En algunos casos, la célula diana es una célula cancerosa. En algunos casos, la célula diana es una célula infectada con un patógeno intracelular. En algunos casos, la célula diana es una célula cancerosa de un individuo que tiene cáncer. En algunos casos, el contacto es in vitro o ex vivo. En algunos casos, el contacto es in vivo. En algunos casos, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 se une específicamente al complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) Clase I. En algunos casos, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 se une específicamente al CMH Clase I clásico, en donde dicho CMH Clase I clásico carece de HLA-G y comprende al menos uno de HLA-A, HLA-B y HLA-C. En algunos casos, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 es un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo. En algunos casos, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 es un polipéptido del miembro 1 de la subfamilia B del receptor de tipo inmunoglobulina leucocitaria soluble (LILRB1). En algunos casos, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 se une específicamente al miembro 1 de la subfamilia B del receptor de tipo inmunoglobulina leucocitaria (LILRB1) y no activa la señalización a través de LILRB1 al unirse. En algunos casos, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 es un anticuerpo anti-LILRB1 o un fragmento de unión del mismo. En algunos casos, el contacto se realiza en presencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente antiCD47/SIRPA.

[0014] En algunas realizaciones, un método de la materia es un método de tratamiento de un individuo que tiene cáncer (y/o que tiene una infección por patógeno intracelular), donde el método incluye administrar al individuo: (a) un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 (por ejemplo, un agente de unión a CMH Clase I tal como un anticuerpo anti-CMH Clase I o un péptido LILRB1, un agente de unión a LILRB1 tal como un anticuerpo anti-LILRB1 o un complejo de CMH Clase I soluble que se une a LILRB1 y similares); y (b) al menos uno de: (i) un agente anti-CD47/SIRPA, y (ii) un agente que opsoniza una célula diana del individuo, donde la célula diana es una célula cancerosa (y/o una célula que alberga un patógeno intracelular), en cantidades eficaces para reducir el número de células cancerosas (y/o células que albergan el patógeno intracelular) en el individuo. En algunos casos, (a) y (b) se administran simultáneamente. En algunos casos, (a) y (b) no se administran simultáneamente. En algunos casos, el método incluye, antes del paso de administración: medir el nivel de expresión del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) Clase I en una muestra biológica del individuo, donde la muestra biológica incluye una célula cancerosa (y/o una célula que alberga un patógeno intracelular); y proporcionar una predicción, basada en el resultado del paso de medición, de que el individuo es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA.

[0015] En algunas realizaciones, un método sujeto es un método para predecir si un individuo es resistente o susceptible al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA, donde el método incluye: (a) medir el nivel de expresión del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) Clase I en una muestra biológica del individuo, donde la muestra biológica incluye una célula cancerosa (y/o una célula que alberga un patógeno intracelular), para producir un valor de prueba medido; (b) comparar el valor de prueba medido con un valor de control; y (c) proporcionar una predicción, basada en la etapa de comparación, en cuanto a si el individuo es resistente o susceptible al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA. En algunos casos, el paso de medición incluye un método basado en anticuerpos. En algunos casos, el método basado en anticuerpos incluye citometría de flujo. En algunos casos, el CMH Clase I es el CMH Clase I clásico que carece de HLA-G y comprende HLA-A, HLA-B y/o HLAC. En algunos casos, el valor de control es el nivel de expresión de CMH Clase I de una célula o población de células que se sabe que exhiben un fenotipo de resistencia al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA. En algunos casos, el valor de control es el valor de fondo del paso de medición. En algunos casos, el método incluye un paso para determinar que la célula cancerosa (y/o la célula que alberga un patógeno intracelular) es positiva para CMH Clase I y proporciona una predicción de que el individuo es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA. En algunos casos, el método incluye: (a) proporcionar una predicción de que el individuo es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA, y (b) administrar al individuo un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA (p. ej., un agente de unión al CMH Clase I tal como un anticuerpo anti-CMH Clase I o un péptido LILRB1; un agente de unión a LILRB1 tal como un anticuerpo anti-LILRB1 o un complejo soluble de CMH Clase I que se une a LILRB1; y similares). En algunos casos, el paso de proporcionar una predicción incluye generar un informe que incluye al menos uno de: (i) el nivel de expresión medido de CMH Clase I, (ii) el nivel de expresión medido normalizado de CMH Clase I, (iii) una predicción de resistencia o susceptibilidad a un agente anti-CD47/SIRPA, y (iv) una terapia recomendada basada en el valor de prueba medido. En algunos casos, el informe se muestra en un dispositivo de salida en una ubicación remota a la computadora. En algunos casos, un método sujeto incluye identificar/seleccionar la necesidad de un paciente de coadministración de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA.

[0016] Los aspectos de la divulgación incluyen agentes anti-CMH Clase I/LILRB1. En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto es un anticuerpo anti-LLRB1 (por ejemplo, humanizado, por ejemplo, anticuerpo humanizado de isotipo IgG4). En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto es un anticuerpo antiCMH Clase I (por ejemplo, humanizado, por ejemplo, anticuerpo humanizado de isotipo IgG4). En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto es un polipéptido que incluye las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena ligera establecidas en SEQ ID NO: 8-10 y las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada establecidas en SEQ ID NO: 12-14. En algunos casos, el agente incluye la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera establecida en SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada establecida en SEQ ID NO: 11. En algunos casos, el agente es un anticuerpo humanizado o un fragmento Fab. En algunos casos, el agente está presente en una composición farmacéutica. Los aspectos de la divulgación también incluyen la preparación de un medicamento (por ejemplo, un medicamento que incluye un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, un medicamento que incluye un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto y un agente anti-CD47/SIRPA, un medicamento que incluye un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto y un anticuerpo contra un antígeno canceroso, un medicamento que incluye un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto y un agente anti-CD47/SIRPA y un anticuerpo contra un antígeno canceroso, y similares). En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 (p. ej., en cualquiera de los métodos o composiciones de la divulgación) es un anticuerpo (p. ej., anticuerpo anti-LLRB1, anticuerpo anti-CMH Clase I) y puede ser un anticuerpo humanizado., por ejemplo, puede ser un anticuerpo humanizado de isotipo IgG4.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0017]

Fig. 1A-1C. La resistencia a la fagocitosis de macrófagos se correlaciona con la expresión de CMH Clase I. (Fig. 1A) Esquema de dibujos animados de la señalización entre macrófagos y células cancerosas diana en condiciones no tratadas (izquierda) y tratamiento con terapia anti-CD47 (derecha). (Fig,1 B) Medición de fagocitosis basada en FACS por macrófagos humanos derivados de donantes contra un panel de 18 líneas celulares cancerosas, que incluyen carcinoma de colon (CC), cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), carcinoma de mama (BC), tumor neuroendocrino pancreático (PNET), melanoma (Mel) y osteosarcoma (OS) tras el tratamiento con PBS o un anticuerpo anti-CD47 humanizado, Hu5F9-G4. Todos los valores se normalizaron a DLD1 como control de índice. Las barras de error representan la desviación estándar de los ensayos con cuatro donantes independientes para todas las líneas, con la excepción de H128, H1688 y SkBr3, para los que representan tres donantes independientes. 12 de 18 líneas muestran un aumento significativo (p<0,05; prueba t de dos caras de Student sin corrección de comparaciones múltiples) en la fagocitosis tras el tratamiento con Hu5F9-G4. (Fig. 1C) Diagrama de dispersión transformado logarítmicamente de la eficacia fagocítica normalizada tras el tratamiento con el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4 (eje Y) representado frente a la expresión de superficie de HLA-A, B, C medida por análisis FACS con el pan-HLA unión del anticuerpo W6/32 (eje X). Los valores Y son promedios transformados logarítmicamente de los valores representados en la Fig. 1A. Existe una relación inversa significativa entre la expresión de HLA-A, B, C y la sensibilidad a la fagocitosis tras el tratamiento con Hu5F9-G4 (R2=0,411, p=0,002).

Fig. 2A-2G. El CMH Clase I protege directamente a las células del ataque de los macrófagos. (Fig. 2A) Tabla de resumen de expresión (izquierda) y diagrama de dispersión FACS (derecha) de los niveles de expresión de CD47 y HLA-A, B, C (ejes Y y X, respectivamente) para cuatro sublíneas de KWNO1 modificadas genéticamente. (Fig. 2B) Tabla de resumen de expresión (izquierda) y diagrama de dispersión FACS (derecha) de niveles de expresión de CD47 y HLA-A, B, C (ejes Y y X, respectivamente) para cuatro sublíneas de DLD1 diseñadas genéticamente. (Fig. 2C) Medición de la fagocitosis por los macrófagos humanos co­ cultivadas basados en FACS con kW n O1 parental (rojo) y una sub-línea eliminada B2M, KWNO1-AB2M (negro), tras el tratamiento con PBS o el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4. Los valores se normalizan al nivel máximo de fagocitosis en cada experimento replicado independiente. Las barras de error representan la desviación estándar de experimentos con ocho donantes de macrófagos independientes. ** p<0,01, ***p<0,001, ANOVA de 2 vías con corrección de comparaciones múltiples. (Fig. 2D) Medición basada en FACS de fagocitosis por macrófagos humanos cocultivados con DLD1 parental (negro) y una sublínea transgénica reconstituida con CMH, DLD1-Tg (B2M) (rojo), tras el tratamiento con PBS o el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4. Los valores se normalizan al nivel máximo de fagocitosis en cada experimento replicado independiente. Las barras de error representan la desviación estándar de experimentos con ocho donantes de macrófagos independientes. ns, no significativo. ***p<0,001, ANOVA de 2 vías con corrección de comparaciones múltiples. (Fig. 2E) Medición basada en FACS de la fagocitosis por macrófagos humanos cocultivados con variantes genéticas de KWNO1. Los valores se normalizan al nivel máximo de fagocitosis en cada experimento replicado independiente. El anticuerpo anti-EpCam es el clon 1B7. Las barras de error representan la desviación estándar de los experimentos de ocho donantes de macrófagos independientes. ns, no significativo.*p <0.05, ** p<0,01, ***p<0,001, ANOVA de 2 vías con corrección de comparaciones múltiples. (Fig. 2F) Medición basada en FACS de la fagocitosis por macrófagos humanos cocultivados con variantes genéticas de DLD1. Los valores se normalizan al nivel máximo de fagocitosis en cada experimento replicado independiente. Anti-EGFR es el anticuerpo clínico cetuximab. Las barras de error representan la desviación estándar de los experimentos de ocho donantes de macrófagos independientes. ns, no significativo.*p <0,05, ** p<0,01, ***p<0,001, ANOVA de 2 vías con corrección de comparaciones múltiples. (Fig. 2G) Medición de fagocitosis basada en FACS por macrófagos derivados de donantes de la línea CMH-DLD1 (panel izquierdo, negro) y las líneas CMH+ U2OS, SAOS2, SKMeI3, NCI-H196, HCT116 y KWNO1 (panel derecho, gris) tras el tratamiento con PBS; un fragmento de unión a antígeno (Fab) generado mediante escisión proteolítica del anticuerpo pan-HLA W6/32; el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4; o una combinación de W6/32 Fab y Hu5F9-G4. Los valores se normalizan al nivel máximo de fagocitosis en cada experimento replicado independiente. Las barras de error representan la desviación estándar de experimentos con cuatro donantes de macrófagos independientes. ns, no significativo.*p <0,05, prueba t de Student sin corrección de comparaciones múltiples.

Fig. 3A-3C. El receptor LILRB1 media la detección de macrófagos de CMH Clase I. (Fig,3A) Gráficos del histograma representativo del análisis FACS de la expresión de LILRB1 y LILRB2 en monocitos de sangre periférica CD14+ humanos primarios (izquierda), y macrófagos cultivados ex vivo del día 7 derivados del mismo donante (derecha). El control de IgG se indica en rojo. La tinción específica se indica en azul. (Fig,3B) Niveles de expresión de LILRB1 y LILRB2, medidos por la intensidad de fluorescencia media (IFM, panel izquierdo) o el porcentaje de células positivas (panel derecho), en 4 pares de monocitos primarios (círculo azul) y macrófagos cultivados ex vivo de los mismos donantes (triángulo rojo). ns, no significativo. ***p<0,001, ANOVA de 2 vías con corrección de comparaciones múltiples. (Fig. 3C) Medición basada en FACs de la fagocitosis por macrófagos derivados del donante de KWNO1 parental (rojo) y la sublínea CMH negativa KWNO1-AB2M (negro) tras el tratamiento con PBS, el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4, un fragmento de unión a antígeno (Fab) generado por escisión proteolítica del anticuerpo pan-HLA W6/32, el anticuerpo de bloqueo anti-LILRBI GHI/75 o el anticuerpo de bloqueo anti-LILRB227D6. Los valores se normalizan al nivel más alto de fagocitosis observado en una réplica experimental dada. Las barras de error representan la desviación estándar de los ensayos realizados con ocho donantes de macrófagos independientes. ns, no significativo. ***p<0,001, ANOVA de 2 vías con corrección de comparaciones múltiples.

Fig. 4A-4C. B2M confiere protección específica de especie contra la fagocitosis de macrófagos. (Fig. 4A) La estructura cristalina del complejo LILRB1: B2M: HLA-A2, que ilustra las diferencias entre secuencias humanas y de ratón. LILRB1 (magenta) hace un contacto extenso con residuos de B2M (azul) pero solo un contacto limitado con HLA-A2 (gris). Recuadro: los residuos que difieren entre B2M humano y de ratón, y que se encuentran dentro de los 5 angstroms de LILRB1, están resaltados en naranja. Estos residuos se mutaron, como se indica, para formar un B2m quimérico humano-ratón (hmcB2M). Las imágenes se generaron usando MacPyMol a partir de datos de estructura publicados IP7Q (Fanger y col., European Journal of Immunology 28, 3423-3434 (1998)). (Fig. 4B) Medición basada en FAc S de la expresión de CMH Clase I de superficie, medida mediante tinción con el anticuerpo de unión pan-HLA-A, B, C W6/32. Las células DLD1 parentales (panel izquierdo, negro) son negativas para CMH Clase I de superficie, pero reconstitución transgénica con B2M humano (DLD1-Tg (B2M), rojo), o un B2M quimérico de ratón-humano (DLD1-Tg (hmcB2M), violeta), ambos inducen una expresión de superficie eficaz de CMH Clase I. Los KWNO1 parentales (panel derecho, rojo) son positivos para la expresión de CMH Clase I, que puede eliminarse mediante la deleción de B2M mediada por CRISpR (KWNO1-AB2M, negro); la expresión transgénica de hmcB2M restaura la expresión superficial de CMH (KWNO1-Tg (hmcB2M)-AB2M, violeta). (Fig. 4C) Medición de fagocitosis basada en FACS por macrófagos primarios derivados de donantes humanos (eje Y) o macrófagos NSG derivados de ratón (eje X) cocultivados con DLD1 parental (negro); KWNO1 eliminado por B2M (KWNO1-AB2M, negro); una sublínea DLD1 con expresión transgénica de B2M completamente humano (rojo); KWNO1 parental (rojo); una sublínea DLD1 con expresión transgénica de un B2M quimérico humano-ratón (violeta); o una sublínea KWNO1 con B2M eliminado y expresión transgénica de hmcB2M (KWNO1-Tg (hmcB2M)-AB2M, púrpura). Las barras de error verticales representan la desviación estándar de experimentos con ocho donantes biológicos independientes, mientras que las barras de error horizontales representan la desviación estándar de ocho réplicas experimentales en dos experimentos con macrófagos de ratón NSG (NOD-SCID Il2ry-/-) derivados independientemente.

Fig. 5A-5E. La expresión de CMH Clase I protege a las células tumorales de los macrófagos in vivo. (Fig. 5A) Esquema del sistema de xenoinjerto de macrófagos humanos in vivo. Las células tumorales y los macrófagos humanos se mezclaron en hielo en una proporción de 1:2, y los anticuerpos se agregaron como se indica antes de la inyección subcutánea en el flanco de los ratones NSG. Imágenes de bioluminiscencia tumoral de ratones NSG (NOD-SCID Il2ry-/-) post-. (Fig,5B) Imágenes de bioluminiscencia tumoral de ratones NSG (NOD-SCID Il2ry-/-) después del injerto con macrófagos humanos diferenciados primarios ex vivo y células tumorales CMH+ (KWNO1, panel izquierdo) o células tumorales CMH- (KWNOl-AB2M, panel derecho), tratado con PBS, el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4, el anticuerpo anti-LILRBI recombinante GHI75-G4, o una combinación de los dos anticuerpos. Se evaluaron cinco animales por grupo de tratamiento. Las imágenes de bioluminiscencia son del día 7 (panel izquierdo) o del día 14 (panel derecho). (Fig. 5C) Microscopía de fluorescencia de secciones tomadas de tumores mixtos CMH+ y CMH- KWNO1 inyectados subcutáneamente en los flancos de ratones NSG. Las células quiméricas c Mh están marcadas por la expresión de GFP, mientras que las células CMH- están marcadas por la expresión de RFP. Los macrófagos de ratón se visualizan mediante tinción F4/80. Es evidente un alto grado de infiltración de macrófagos en el tumor y se pueden observar macrófagos en el acto de fagocitosis (punta de flecha blanca). La barra de escala representa 200 pM. (Fig. 5D) Esquema del experimento in vivo para evaluar la sensibilidad de las células CMH- y CMH+ quiméricas a los agentes anti-CD47. Se inyectaron cantidades equivalentes de células en los flancos de los ratones NSG y se dejó que se injertaran durante 14 días. A partir de los 14 días posteriores a la inyección, los ratones recibieron inyecciones una vez a la semana de PBS o de anticuerpo anti-CD47. (Fig,5E) Bioluminiscencia tumoral (flujo total, fotones/segundo) de células CMH- (KWNO1-AB2M) y CMH+ quiméricas (KWNO1-Tg (hmcB2M)-AB2M) injertadas subcutáneamente en los flancos de ratones NSG, y comenzando el día 14 después del injerto, tratado una vez por semana con PBS o con 10 mg/kg del anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4. Las líneas representan el cambio de veces en el flujo bioluminiscente, normalizado al valor inicial medido en el día 7. Las barras de error representan el error estándar de la media de 15 ratones por grupo. Gray es CMH- (KWNO1-AB2M) tratado con PBS; el rosa es CMH+ quimérico (KWNO1-Tg (hmcB2M)-AB2M) tratado con PBS; el negro es CMH-(KWNO1-AB2M) tratado con Hu5F9-G4; el púrpura es CMH+ quimérico (KWNO1-Tg (hmcB2M)-AB2M) tratado con Hu5F9-G4.*indica p<0,05 frente a grupos de tratamiento con vehículo, *** indica p<1e-4 frente a grupos de tratamiento con vehículo, ANOVA de 2 vías con corrección de comparaciones múltiples de Tukey; consulte la Tabla complementaria 1 para obtener comparaciones estadísticas completas. Las mediciones de luminiscencia se interrumpieron cuando los ratones tuvieron que ser sacrificados debido al crecimiento del tumor.

Fig. 6. Estrategia de apertura del ensayo de fagocitosis in vitro basado en FACS. Nuestro ensayo de fagocitosis in vitro se basa en etiquetado diferencial de las células cancerosas diana (GFP+ CD45 -) y macrófagos humanos (GFP- CD45+) con el fin de identificar los macrófagos que tienen células diana etiquetadas que han sido fagocitadas con éxito. La coincubación con células diana marcadas en condiciones de tratamiento con PBS (paneles superiores) conduce a una emergencia mínima de una población de GFP+ CD45+, que se mide como porcentaje del total de macrófagos. Por el contrario, el tratamiento con un anticuerpo opsonizante de tumores, especialmente en condiciones de bloqueo de CD47, da como resultado una clara aparición de una población de GFP+ CD45+ distinta. Anteriormente validamos este ensayo mediante clasificación posterior al ensayo y microscopía de las poblaciones, lo que confirmó que la estrategia de activación de puerta identificaba con éxito macrófagos que habían fagocitado una o más células cancerosas (Weiskopf et al, Science 341, 88-91 (2013)).

Fig. 7. La expresión de CD47 no se correlaciona con la sensibilidad a la fagocitosis inducida por Hu5F9-G4. Gráfica de dispersión transformada logarítmicamente de la eficacia fagocítica normalizada tras el tratamiento con el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4 (eje Y) representada frente a la expresión de superficie de CD47, medida por análisis FACS con el anticuerpo monoclonal anti-ratón humano B6H12 (eje X). No existe una relación significativa entre estos dos parámetros, R2=0,094, p=0,217.

Fig. 8. La expresión de la proteína CMH es alta en líneas celulares resistentes a la fagocitosis. Gráficos de histograma de expresión de HLA-A, B, C (arriba) y B2M (abajo) para dos líneas celulares de cáncer de colon: DLD1 (rojo) y HCT116 (magenta); dos líneas de cáncer de pulmón de células pequeñas, NCI-H82 (azul) y NCI-H196 (violeta); y un tumor neuroendocrino pancreático KWNO1 (verde), medido por el sistema de matriz de anticuerpos basado en BioLegend LegendScreen FACS. La tinción de control de isotipo se indica en azul, mientras que la tinción específica se indica en rojo.

Fig. 9. Expresión de HLA-A, B, C de líneas celulares resistentes a la fagocitosis. Diagrama de dispersión a escala logarítmica de la eficiencia fagocítica en un panel de líneas celulares tras el tratamiento con el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4 (eje Y), representado frente a la expresión de superficie de HLA-A, B, C medida por análisis FACS con un anticuerpo de unión a HLA-A, B, C (eje X). Los datos son un subconjunto de los que se muestran en la Fig. 1B, con el fin de resaltar las líneas celulares utilizadas para el experimento que se muestra en la Fig. 2G.

Fig. 10. El anticuerpo LILRB1 sensibiliza a las células CMH+ DLD1 a la fagocitosis. Medición basada en FACS de fagocitosis por macrófagos derivados de donantes de DLD1 parental (negro) y la sublínea transgénica DLD1-Tg (B2M) reconstituida con CMH humano (rojo) tras el tratamiento con PBS; el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4; un fragmento de unión a antígeno (Fab) generado por escisión proteolítica del anticuerpo pan-HLA W6/32; el anticuerpo anti-LILRB1 GHI/75; o el anticuerpo anti-LILRB227D6. Los valores se normalizan al nivel más alto de fagocitosis observado en una réplica experimental dada. Las barras de error representan la desviación estándar de los ensayos realizados con ocho donantes de macrófagos independientes. Si bien DLD1-Tg (B2M) es significativamente más resistente a la fagocitosis inducida por Hu5F9-G4 que DLD1 parental (p<0,01, ANOVA de 2 vías con corrección de comparaciones múltiples), esta diferencia significativa se borra por completo tras la interrupción de la señalización de CMH/LILRB1 eje por W6/32 fab o GHI/75. ns, no significativo. ** p<0,01, ***p<0,001, ANOVA de 2 vías con corrección de comparaciones múltiples.

Fig. 11. Los macrófagos de ratón expresan el homólogo PirB de la familia LILRB. Histograma FACS de macrófagos NSG diferenciados ex vivo teñidos con control de IgG marcado con PE (rojo) o anticuerpo anti-PirA/B 6C1.

Fig. 12. El B2m de ratón no forma de forma eficaz complejos CMH estables con cadenas alfa de HLA humanas. Histograma FACS de células DLD1 parentales (negro), células DLD1 reconstituidas con un transgén B2M humano (rojo) o con un transgén B2m de ratón (azul). Mientras que la expresión de B2M completamente humana facilita la expresión de CMH de superficie robusta, tal como lo detecta el anticuerpo pan-HLA W6/32, la expresión de B2m de ratón facilita solo niveles bajos de CMH de superficie.

Fig. 13 Los macrófagos humanos continúan fagocitando las células cancerosas días después del injerto en ratones NSG. Se mezclaron células KWNO1 con macrófagos humanos y PBS, el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4, el anticuerpo anti-LILRB1 recombinante GHI75-G4 o una combinación de los dos anticuerpos. Estas mezclas se co-injertaron luego por vía subcutánea en ratones NSG y se evaluó la luminiscencia del tumor a las 12 horas, 4 días y 7 días después del injerto. A las 12 horas después del injerto, los tumores tratados con una combinación de Hu5F9-G4 y GHI75-G4 mostraron una rápida disminución de la luminiscencia en comparación con otros grupos. La luminiscencia de estos tumores continuó disminuyendo entre 12 horas y 4 días después del injerto, lo que sugiere una continuación de la fagocitosis de macrófagos de las células cancerosas. Las barras de error representan la desviación estándar de cinco ratones por grupo. Fig. 14. La expresión de CMH no afecta la cinética de crecimiento in vitro de la línea celular DLD1. Curva de crecimiento de DLD1 parental (rosa) y una sublínea de DLD1 que expresa el B2M quimérico humano-ratón (DLD1 -Tg (hmcB2M), azul), medido por recuento de células a 1,2 y 4 días. Las barras de error representan la desviación estándar de tres réplicas independientes. No hay diferencias significativas entre estas líneas en ningún momento.

Fig. 15. La expresión de CMH no influye en la cinética de crecimiento in vitro de la línea celular KWNO1 en un cocultivo mixto. Análisis FACS de la expresión de CMH en un cocultivo in vitro 50-50 de células quiméricas CMH+ y CMH- KWNO1, medido por el anticuerpo de unión a pan-HLA. Después de 21 días, no hubo cambios significativos en la proporción de células CMH+ y CMH- desde el día 0. Las barras de error representan la desviación estándar de tres co-cultivos independientes.

Fig. 16. Una tabla que proporciona una comparación estadística entre puntos de tiempo y grupos.

Fig,17 Resultados de experimentos que miden la fagocitosis de dos líneas celulares de cáncer de mama humano diferentes (MDAMB-468 y m DA-MB-231) por macrófagos humanos con y sin anticuerpo anti-LILRB1 (y en presencia o ausencia de otros anticuerpos, por ejemplo, Hu5F9-G4 que es un anticuerpo anti-CD47). Las barras de izquierda a derecha son: IgG4, Hu5F9-G4, Cetuximab, Trastuzumab, Panitumumab, Cetuximab Hu5F9-G4, Trastuzumab Hu5F9-G4 y Panitumumab Hu5F9-G4.

Fig. 18. Datos que muestran que los ejes de señalización de CD47 y CMH Clase I son señales antifagocíticas independientes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0018] Los métodos y composiciones se proporcionan para inducir la fagocitosis de una célula diana, el tratamiento de un individuo que tiene cáncer, el tratamiento de un individuo que tiene una infección de patógeno intracelular (por ejemplo, una infección crónica), y/o reducir el número de células infligidas (por ejemplo, células cancerosas, células infectadas con un patógeno intracelular, etc.) en un individuo. También se proporcionan métodos y composiciones para predecir si un individuo es resistente (o susceptible) al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA. En algunos casos, los métodos y composiciones de la materia incluyen un agente anti-CMH Clase I/LILRB1. En algunos casos, los métodos y composiciones de la materia incluyen un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente que opsoniza una célula diana (p. ej., coadministración de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente que opsoniza una diana célula). En algunos casos, los métodos y composiciones en cuestión incluyen un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA (por ejemplo, coadministración de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA). También se proporcionan kits para practicar los métodos de la divulgación.

[0019] Antes de describir los presentes procedimientos y composiciones, es de entenderse que esta invención no se limita a un método o una composición particular descrita, como tal, puede, por supuesto, varíar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

[0020] Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima de la unidad del límite inferior a menos que el contexto claramente dicte otra cosa, entre los límites superior e inferior de ese intervalo es también específicamente divulgado. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido está incluido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el intervalo, y cada intervalo en donde ninguno o ambos límites están incluidos en los intervalos más pequeños también está incluido dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos.

[0021] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entendido por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen algunos métodos y materiales potenciales y preferidos.

[0022] Cualquier método reivindicado se puede llevar a cabo en el orden de eventos recitadas o en cualquier otro orden que es lógicamente posible.

[0023] Hay que señalar que, como se usa aquí y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ella” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto claramente dicte otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células y la referencia al "péptido" incluye la referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos, por ejemplo, polipéptidos, conocidos por los expertos en la técnica, etc.

[0024] Las publicaciones descritas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas de forma independiente.

Definiciones

[0025] En la descripción que sigue, se utiliza una serie de términos que se utilizan convencionalmente en el campo. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y coherente de la especificación y las reivindicaciones, y el alcance que debe darse a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

[0026] Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímero de aminoácidos de origen no natural.

[0027] El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y aminoácidos sintéticos, así como análogos de aminoácidos y aminoácidos miméticos que funcionan de una manera similar a la de aminoácidos naturales. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono alfa que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metilo sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido natural.

[0028] Los términos "receptor", "individual", "sujeto", "host", y "paciente", se utilizan indistintamente en este documento y se refieren a cualquier sujeto mamífero para quien se desea el diagnóstico, tratamiento o terapia, particularmente seres humanos. "Mamífero" para fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos los seres humanos, los animales domésticos y de granja, y los animales de zoológico, deportivos o de compañía, como perros, caballos, gatos, vacas, ovejas, cabras, cerdos, etc. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano.

[0029] El término "muestra" con respecto a un paciente engloba sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejidos sólidos, tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células de los mismos y la progenie derivada de los mismos. La definición también incluye muestras que hayan sido manipuladas de alguna forma después de su obtención, como por ejemplo mediante tratamiento con reactivos; lavado; o enriquecimiento para determinadas poblaciones celulares, como las células cancerosas. La definición también incluye muestras que han sido enriquecidas para tipos particulares de moléculas, por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, etc.

[0030] El término "muestra biológica" abarca una muestra clínica, y también incluye tejido obtenido por resección quirúrgica, el tejido obtenido por biopsia, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, muestras de tejido, órganos, médula ósea, sangre, plasma, suero, aspirado y similares. Una "muestra biológica" incluye una muestra que comprende células diana y/o células de control normales, o se sospecha que comprende dichas células. La definición incluye fluidos biológicos derivados de ellos (p. ej., célula cancerosa, célula infectada, etc.), p. ej., una muestra que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos que se obtiene a partir de dichas células (p. ej., un lisado celular u otro extracto celular que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos). Una muestra biológica que comprende una célula infligida (por ejemplo, una célula cancerosa, una célula infectada, etc.) de un paciente también puede incluir células no infligidas.

[0031] El término "diagnóstico" se utiliza aquí para referirse a la identificación de un estado, enfermedad molecular o patológico o condición, tales como la identificación de un subtipo molecular de cáncer, la determinación de que un individuo es resistente o susceptible al tratamiento con un reactivo anti-CD47 y similares.

[0032] El término "pronóstico" se utiliza aquí para referirse a la predicción de la probabilidad de progresión de la enfermedad (por ejemplo, muerte atribuible a cáncer o progresión, la progresión de una infección, etc.), incluyendo la recurrencia, propagación metastásica de cáncer, y resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA).

[0033] El término "predicción" se utiliza aquí para referirse al acto de predecir o estimar, basado en la observación, la experiencia, o razonamiento científico. En un ejemplo, un médico puede predecir la probabilidad de que un paciente sobreviva, después de la extirpación quirúrgica de un tumor primario y/o quimioterapia durante un cierto período de tiempo sin recurrencia del cáncer. Como otro ejemplo, se puede predecir la probabilidad de que un individuo sea resistente (o susceptible) al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA (por ejemplo, determinar si es probable que un individuo sea resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA, o, en cambio, es probable que responda al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA, es decir, es probable que sea susceptible al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA). Como otro ejemplo más, se puede predecir la probabilidad de que un individuo sea susceptible al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA (por ejemplo, determinar si es probable que un individuo sea susceptible al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA).

[0034] Los términos "unión específica", "se une específicamente", y similares, se refieren a la unión preferente no covalente o covalente a una molécula relativa a otras moléculas o restos en una mezcla de solución o de reacción (por ejemplo, un anticuerpo específicamente se une a un polipéptido o epítopo particular en relación con otros polipéptidos/epítopos disponibles). En algunas realizaciones, la afinidad de una molécula por otra molécula a la que se une específicamente se caracteriza por una K^d (constante de disociación) de 10-5 M o menos (por ejemplo, 10-6 M o menos, 10-7 M o menos, 10-8 M o menos, 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, 10­ 11 M o menos, 10-14 M o menos, 10-15 M o menos, o 10-16 M o menos). "Afinidad" se refiere a la fuerza de la unión, el aumento de la afinidad de unión está correlacionado con una K^d inferior.

[0035] El término, como se usa en el presente documento "miembro de unión específica" se refiere a un miembro de un par de unión específica (es decir, dos moléculas, por lo general dos moléculas diferentes, donde una de las moléculas, por ejemplo, un primer miembro de unión específico, a través de medios no covalentes se une específicamente a la otra molécula, por ejemplo, un segundo miembro de unión específico). Los ejemplos de miembros de unión específicos incluyen, pero no se limitan a: agentes que se unen específicamente al CMH Clase I (p. ej., CMH Clase I clásico), LILRB1, Cd 47 y/o SIRPA (es decir, agentes anti-CMH Clase I/LILRB1, agentes anti-CD47/SIRPA), o que de otro modo bloqueen la interacción entre CMH Clase I y LILRB1; y/o la interacción entre CD47 y SIRPA.

[0036] El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos Fab), siempre ya que exhiben la actividad biológica deseada. Los "anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos de este último tipo se producen, por ejemplo, en niveles bajos por el sistema linfático y en niveles elevados por los mielomas.

[0037] Los "anticuerpos e inmunoglobulinas nativos" son normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V^h) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (ILO) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que determinados residuos de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186: 651 (1985); Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 82: 4592 (1985)).

[0038] El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se denominan marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de hoja b, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja b. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Maryland (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.

[0039] La digestión de anticuerpos (p. ej., con enzimas como papaína, Ficina y similares) produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y aún es capaz de reticular el antígeno.

[0040] "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento del antígeno y el sitio de unión. En una especie Fv de dos cadenas, esta región consta de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y ligera en asociación estrecha, no covalente. En una especie Fv monocatenaria (scFv), un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera pueden unirse covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible de modo que las cadenas ligeras y pesadas puedan asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la de especies Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-ILO. En conjunto, las seis CDR confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).

[0041] El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en donde el o los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

[0042] Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4, IgA-i, IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, g y m, respectivamente. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Las variantes diseñadas de subclases de inmunoglobulinas, incluidas aquellas que aumentan o disminuyen las funciones efectoras inmunitarias, la vida media o la estabilidad del suero, también están incluidas en esta terminología.

[0043] El "fragmento de anticuerpo" y todas las variantes gramaticales del mismo, como se usa en el presente documento, se definen como una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto, donde la porción está libre de los dominios de cadena pesada constante. (es decir, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que sea un polipéptido que tenga una estructura primaria que consista en una secuencia ininterrumpida de residuos de aminoácidos contiguos (denominados en el presente documento como un "fragmento de anticuerpo monocatenario" o "polipéptido monocatenario"), incluidos, entre otros, (1) moléculas monocatenarias de cadena Fv (scFv) (2) polipéptidos monocatenarios que contienen sólo un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento del mismo que contiene las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin un resto de cadena pesada asociado (3) polipéptidos monocatenarios que contienen sólo una región variable de cadena pesada, o un fragmento de la misma que contiene las tres CDR de la región variable de cadena pesada, sin un resto de cadena ligera asociado y (4) nanocuerpos que comprenden dominios de Ig individuales de especies no humanas u otros módulos de unión de dominio único específicos; y estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpos. En un fragmento de anticuerpo que comprende una o más cadenas pesadas, la cadena o cadenas pesadas pueden contener cualquier secuencia de dominio constante (p. ej., CH1 en el isotipo IgG) que se encuentra en una región que no es Fc de un anticuerpo intacto, y/o puede contener cualquier secuencia de la región bisagra encontrada en un anticuerpo intacto, y/o puede contener una secuencia de cremallera de leucina fusionada o situada en la secuencia de la región bisagra o la secuencia del dominio constante de la(s) cadena(s) pesada(s).

[0044] Salvo que se indique específicamente lo contrario, el término "conjugado", como se describe y reivindica en el presente documento se define como una molécula heterogénea formada por la unión covalente de uno o más fragmento(s) de anticuerpo a una o más molécula(s) de polímero, donde la molécula heterogénea es soluble en agua, es decir, soluble en fluidos fisiológicos tales como sangre, y donde la molécula heterogénea está libre de cualquier agregado estructurado. Un conjugado de interés es PEG. En el contexto de la definición anterior, el término "agregado estructurado" se refiere a (1) cualquier agregado de moléculas en solución acuosa que tiene una estructura de esferoide o cáscara de esferoide, de manera que la molécula heterogénea no está en una micela u otra estructura de emulsión, y no está anclado a una bicapa lipídica, vesícula o liposoma; y (2) cualquier agregado de moléculas en forma sólida o insolubilizada, tal como una matriz de perlas de cromatografía, que no libera la molécula heterogénea en solución al entrar en contacto con una fase acuosa. Por consiguiente, el término "conjugado" como se define en el presente documento abarca la molécula heterogénea antes mencionada en un precipitado, sedimento, matriz bioerosionable u otro sólido capaz de liberar la molécula heterogénea en una solución acuosa tras la hidratación del sólido.

[0045] Tal como se utiliza en esta descripción, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico en un antígeno al cual se une el paratopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos normalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

[0046] La palabra "marcador" cuando se usa aquí se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente, por ejemplo, a un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o agente anti-CD47/SIRPA. El propio marcador puede ser detectable por sí mismo (marcador directamente detectable) (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o el marcador puede ser detectable indirectamente, por ejemplo, en el caso de un marcador enzimático, la enzima puede catalizar una alteración química de un compuesto o composición de sustrato y el producto de la reacción es detectable.

[0047] Los términos "células fagocíticas" y "fagocitos" se usan indistintamente en este documento para referirse a una célula que es capaz de la fagocitosis. Hay cuatro categorías principales de fagocitos: macrófagos, células mononucleares (histiocitos y monocitos); leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos) y células dendríticas.

[0048] Como se usa en este documento, el término "correlatos", o "se correlaciona con", y términos similares, se refiere a una asociación estadística entre instancias de dos eventos, donde los eventos incluyen números, conjuntos de datos, y similares. Por ejemplo, cuando los eventos implican números, una correlación positiva (también denominada en el presente documento "correlación directa") significa que a medida que uno aumenta, el otro también aumenta. Una correlación negativa (también denominada en el presente documento "correlación inversa") significa que a medida que una aumenta, la otra disminuye.

Composiciones

[0049] La presente descripción proporciona composiciones para inducir la fagocitosis de una célula diana, el tratamiento de un individuo que tiene cáncer, el tratamiento de un individuo que tiene una infección de patógeno intracelular (por ejemplo, una infección crónica), reduciendo el número de células infligidas (por ejemplo, células de cáncer, células infectadas con un patógeno intracelular, etc.) en un individuo, y/o predecir si un individuo es resistente (o susceptible) al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA. En algunos casos, las composiciones de la materia incluyen un agente anti-CMH Clase I/LILRB1. En algunos casos, las composiciones de la materia incluyen un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA.

[0050] Agente anti-CMH Clase I/LILRB1. Un complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I está compuesto por cadenas alfa de antígeno leucocitario humano (h La ) y una proteína beta-2-macroglobulina (B2M) que se ensamblan para formar un complejo. Las cadenas alfa de HLA en humanos incluyen las cadenas alfa HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K y HLA-L. Las cadenas alfa HLA-A, HLA-B y HLA-C se denominan aquí cadenas alfa HLA clásicas. Las cadenas alfa de HLA de clase I de CMH no clásicas incluyen HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K y HLA-L. Por lo tanto, el término "CMH Clase I clásico" se refiere a los complejos CMH Clase I que incluyen HLA-A, HLA-B y/o HLA-C (y no incluyen HLA-E, HLA-F, HLAG, HLA-K o HLA-L;. y el término "CMH Clase I" se refiere a cualquier complejo CMH Clase I.

[0051] Un complejo CMH Clase I en una primera célula (por ejemplo, una célula de cáncer, una célula infectada) puede unirse a (y activar) LILRB1 en una segunda célula (por ejemplo, una célula fagocítica, por ejemplo, un macrófago) y así inhibir la fagocitosis de la primera célula por la segunda célula. "Receptor de tipo inmunoglobulina de leucocitos, subfamilia B (con dominios TM e ITIM), miembro 1" (LILRB1) es un miembro de la clase de subfamilia B de receptores de receptores de tipo inmunoglobulina leucocitaria (LIR), y contiene un ectodominio (que tiene dominios de inmunoglobulina extracelulares), un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico (que tiene motivos inhibidores basados en inmunorreceptor de tirosina (ITIMs)). LILRB1 se expresa en las células inmunes donde se une a las moléculas del CMH Clase I. Cuando se "activa", el receptor transduce una señal negativa que inhibe la estimulación de una respuesta inmune en las células en las que se expresa.

[0052] LILRB1 también se conoce como ILT2, ILT2, CD85, CD85j, LIR1, LIR1, y MIR7. La proteína LILRB1 humana existe como al menos 6 isoformas diferentes (indicadas como SEQ ID NO: 1-6):

LILRB1 (isoforma 1)

MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQAGHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYRE

KKTAPWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHTGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAYIKPTL

SAQPSPVVNSGGNVTLQCDSQVAFDGFILCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVS

PSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSD

AGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSA

PSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLR

STYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTT

GPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTST

QRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHD

EDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTY

AQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 1)

LILRB1 (isoforma 2)

MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQAGHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYRE KKTAPWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHTGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAYIKPTL SAQPSPVVNSGGNVTLQCDSQVAFDGFILCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVS PSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSD AGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSA PSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLR STYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTT GPTSTSAGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTS TQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRQSP HDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDV TYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 2)

LILRB1 (isoforma 3)

MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQAGHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYRE KKTAPWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHTGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAYIKPTL SAQPSPVVNSGGNVTLQCDSQVAFDGFILCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVS PSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSD AGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSA PSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLR STYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTT GPTSTSAGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTS

TQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPH

DEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVT YAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 3)

LILRB1 (isoforma 4) MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQAGHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYRE KKTAPWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHTGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAYIKPTL SAQPSPVVNSGGNVTLQCDSQVAFDGFILCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVS PSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSD AGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSA PSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLR STYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTT GPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTST QRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRQSPH DEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVT YAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 4)

LILRB1 (isoforma 5)

MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQAGHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYRE

KKTAPWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHTGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAYIKPTL

SAQPSPVVNSGGNVTLQCDSQVAFDGFILCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVS

PSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSD

AGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSA

PSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLR

STYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSAGPEDQPLTPT

GSDPQSGLGRHLGVVIGILVAVILLLLLLLLLFLILRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPE

PTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPR

REMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPS

QEGPSPAVPSIYATLAIH (SEQ ID NO: 5)

LILRB1 (isoforma 6)

MTPILTVLICLGLSLGPRTHVQAGHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYRE

KKTAPWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHTGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAYIKPTL

SAQPSPVVNSGGNVTLQCDSQVAFDGFILCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVS

PSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSD

AGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSA

PSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLR

STYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTT

GPTSTSAGPEDQPLTPTGSDPQSGE (SEQ ID NO: 6)

[0053] Tal como se utiliza aquí, el término "agente anti-CMH Clase I/LILRB1" se refiere a cualquier agente que reduce la unión de CMH Clase I (por ejemplo, en una célula diana) para LILRB1 (por ejemplo, en una célula fagocítica). En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 se une a (específicamente se une) CMH Clase I (por ejemplo, CMH Clase I clásico) (por ejemplo, se une al complejo completamente ensamblado). En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 se une (se une específicamente) a uno o más componentes del CMH Clase I (por ejemplo, una o más cadenas alfa del CMH Clase I, una o más cadenas alfa del CMH Clase I clásico, y/o B2M), reduciendo así la formación de CMH Clase I, lo que da como resultado una unión reducida de CMH Clase I a LILRB1. En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble de CMH Clase I) se une a (se une específicamente) a LILRB1.

[0054] Por lo tanto, en algunas realizaciones, un agente adecuado anti-CMH Clase I/LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1, etc.) se une específicamente CMH Clase I y reduce la unión de CMH Clase I a LILRB1. En algunas realizaciones, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1, etc.) se une específicamente al CMH Clase I clásico (complejos CMH Clase I que no incluyen una cadena alfa de HLA) y reduce la unión del CMH Clase I clásico a LILRB1. En algunas realizaciones, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble de CMH Clase I) se une específicamente a LILRB1.

[0055] En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 (por ejemplo, en cualquiera de los métodos o composiciones de la divulgación) es un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo anti-LLRB1, anticuerpos anti-CMH Clase I) y en algunos casos es un anticuerpo humanizado (p. ej., puede ser un anticuerpo humanizado de isotipo IgG4, p. ej., un anticuerpo de isotipo IgG4 que tiene una mutación en la región bisagra como la mutación S241P que reduce la heterogeneidad que a veces se encuentra en anticuerpos IgG4 quiméricos de ratón/humanos) (p. ej., véase Angal et al., Mol Immunol. 1993 enero; 30 (1): 105-8).

[0056] Los ejemplos de agentes anti-CMH Clase I/LILRB1 adecuados (agentes aglutinantes CMH Clase I, por ejemplo, agentes aglutinantes CMH Clase I clásicos, así como agentes aglutinantes LILRB1) incluyen, pero no se limitan a: (i) anticuerpos anti-CMH Clase I (por ejemplo, anticuerpos que se unen al CMH Clase I, anticuerpos que se unen al CMH Clase I clásico, que incluyen una cadena alfa HLA-A, HlA-B y/o HLA-C); y (ii) péptidos LILRB1, que incluyen, sin limitación, polipéptidos LILRB1 solubles que se unen a CMH Clase I, por ejemplo, un polipéptido que comprende una porción extracelular (ectodominio) de LILRB1, un polipéptido LILRB1 de alta afinidad, etc.; (iii) anticuerpos anti-LILRB1; y (iv) complejos de CMH clase I solubles que se unen a LILRB1. Los compuestos de molécula pequeña que inhiben la unión del CMH Clase I (por ejemplo, el CMH Clase I clásico) con LILRB1 también se consideran agentes anti-CMH Clase I/LILRB1.

[0057] (i) y (ii) anteriores son ejemplos de agentes de unión a CMH Clase I (por ejemplo, agentes de unión a CMH Clase I clásico); mientras que (iii) y (iv) anteriores son ejemplos de agentes de unión a LILRB1.

[0058] Agentes anti-CMH Clase I/LILRB1 (por ejemplo, agentes de unión LILRB1) no activan/estimulan LILRB1 (por ejemplo, en la célula fagocítica que expresa LILRB1). En algunos casos, los agentes anti-CMH Clase I/LILRB1 (p. ej., agentes de unión a LILRB1) no activan/estimulan LILRB1 en una cantidad en donde la señalización a través de LILRB1 se estimula en las células fagocíticas, inhibiendo así la fagocitosis por las células fagocíticas. En otras palabras, en algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 adecuado que se une a LILRB1 puede estimular algún nivel de señalización a través de LILRB1 en las células fagocíticas (es decir, se puede tolerar algún nivel de señalización), siempre que el nivel de la señalización no es suficiente para inhibir la fagocitosis.

(i) Anticuerpos anti-CMH Clase I. En algunas realizaciones, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto es un anticuerpo (un anticuerpo anti-CMH Clase I) que se une específicamente al CMH Clase I (por ejemplo, cadenas alfa de MCH de clase I HLA-A, HLA-B y/o HLA-C) y reduce la interacción entre CMH Clase I en una célula (por ejemplo, una célula infectada) y LILRB1 en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). El término "anticuerpo anti-CMH Clase I" como se usa en este documento abarca moléculas que incluyen la región de unión de un anticuerpo anti-CMH Clase I, por ejemplo, una molécula que incluye las CDR de un anticuerpo anti-CMH Clase I como un fragmento Fab (ver definición del término "anticuerpo" anterior). Los anticuerpos anti-CMH Clase I adecuados incluyen versiones completamente humanas, humanizadas o quiméricas de tales anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos humanizados son útiles para aplicaciones in vivo en humanos debido a su baja antigenicidad. De manera similar, los anticuerpos caninizados, felinizados, etc. son útiles para aplicaciones en perros, gatos y otras especies, respectivamente. Los anticuerpos de interés incluyen anticuerpos humanizados o anticuerpos caninizados, felinizados, equinizados, bovinizados, porcinizados, etc., y variantes de los mismos. En algunos casos, un anticuerpo anti-CMH Clase I puede ser un anticuerpo anti-CMH Clase I que no activa el CMH Clase I al unirse. También se prevén anticuerpos monocatenarios derivados de camélidos, anticuerpos monocatenarios derivados de tiburón, proteínas modificadas genéticamente que contienen dominio de fibronectina, péptidos knottin y DARPins; y versiones conjugadas con fluoróforo de cada uno de estos reactivos.

Los ejemplos de anticuerpos monoclonales anti-CMH Clase I pueden incluir, entre otros, los clones: W6/32, EP1395Y, OX18, ERMP42, MEM-E/02, 2G5, F21-2, 41,17, OX-27 y 3D12HLA-MI. En algunas realizaciones, por lo tanto, la divulgación proporciona versiones humanizadas de los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente (por ejemplo, aquellos anticuerpos que reconocen el CMH Clase I humano, por ejemplo, el CMH Clase I clásico humano). Para cualquiera de los anticuerpos anti-CMH Clase I descritos, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado, un fragmento de unión del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab) o cualquier permutación que tenga el dominio de unión al antígeno (o, por ejemplo, las CDR del antígeno dominio de unión). (Consulte la definición de "anticuerpo" más arriba). En general, los anticuerpos humanizados se preparan sustituyendo aminoácidos en las regiones marco de un anticuerpo no humano parental para producir un anticuerpo modificado que es menos inmunogénico en un ser humano que el anticuerpo no humano parental. Los anticuerpos se pueden humanizar usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, injerto de CDR (EP 239,400; publicación PCT WO 91/09967; Patentes de Estados Unidos N° 5,225,539; 5,530,101; y 5,585.089), revestimiento o rejuvenecimiento (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7 (6): 805-814 (1994); Roguska. Et al., PNAS 91: 969 -973 (1994)), y barajado de cadenas (Patente de Estados Unidos N° 5,565,332). En determinadas realizaciones, las sustituciones de la estructura se identifican mediante el modelado de las interacciones de la CDR y los residuos de la estructura para identificar los residuos de la estructura importantes para la unión de antígenos y la comparación de secuencias para identificar los residuos de la estructura inusuales en posiciones particulares (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n° 5,585.089; Riechmann y col., Nature 332: 323 (1988)). Los métodos adicionales para humanizar anticuerpos contemplados en este documento se describen en la patente de EE.UU. N° 5,750,078; 5,502,167; 5,705,154; 5,770,403; 5,698,417; 5,693,493; 5,558,864; 4,935,496; y 4,816,567, y las publicaciones PCT WO 98/45331 y WO 98/45332.

(ii) Péptido LILRB1 soluble. Un péptido soluble LILRB1 comprende la porción de LILRB1 que es suficiente para unirse al CMH Clase I con una afinidad reconocible (p. ej., en una célula diana, como una célula cancerosa), que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento del mismo que retiene la actividad de unión. Un péptido de LILRB1 soluble sujeto no incluye el dominio transmembrana de LILRB1. Un péptido de LILRB1 soluble puede comprender uno o más de los dominios de inmunoglobulina extracelular de LILRB1 (por ejemplo, un péptido de LILRB1 soluble puede incluir la totalidad o una parte de la porción soluble del ectodominio de LILRB1). Un péptido soluble LILRB1 reduce (por ejemplo, bloquea, previene, etc.) la interacción entre LILRB1 y CMH Clase I.

Los péptidos solubles de LILRB1 adecuados incluyen cualquier péptido que comprenda secuencias de LILRB1 variantes o existentes de forma natural (por ejemplo, secuencias de dominio extracelular o variantes de dominio extracelular) que puede unirse específicamente a LILRB1 e inhibir la interacción entre CMH Clase I (por ejemplo, CMH Clase I clásico) y LILRB1 sin estimular suficiente actividad LILRB1 para inhibir la fagocitosis. En algunas realizaciones, un péptido de LILRB1 soluble sujeto comprende el dominio extracelular de LILRB1, que incluye un péptido señal (por ejemplo, el péptido señal de LILRB1). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del péptido señal puede sustituirse por una secuencia de aminoácidos del péptido señal que se deriva de otro polipéptido (por ejemplo, una inmunoglobulina o CTLA4). Por ejemplo, a diferencia de LILRB1 de longitud completa, que es un polipéptido de la superficie celular que atraviesa la membrana celular externa, se secretan péptidos de LILRB1 solubles; por consiguiente, un péptido de LILRB1 soluble puede incluir un péptido señal heterólogo que normalmente está asociado con un polipéptido que se secreta a partir de una célula. Como se describe en este documento, los péptidos señal no se exponen en la superficie celular de una proteína secretada o transmembrana porque el péptido señal se escinde durante la translocación de la proteína o el péptido señal permanece anclado en la membrana celular externa (dicho péptido también se denomina ancla de señal). Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que la secuencia del péptido señal de LILRB1 se escinde del polipéptido precursor de LILRB1 in vivo. En algunas realizaciones, un péptido de LILRB1 sujeto comprende todo o una parte del dominio extracelular de LILRB1, pero no incluye un péptido señal.

Los péptidos de LILRB1 solubles adecuados incluyen péptidos de LILRB1 que tienen mutaciones (variantes) de dominio extracelular con respecto a una secuencia de LILRB1 de tipo salvaje. En algunos casos, un péptido de LILRB1 soluble sujeto incluye una secuencia de aminoácidos que tiene 65% o más (por ejemplo, 70% o más, 75% o más, 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más). más, 97% o más, 98% o más, 99% o más, 99,5% o más, 99,8% o más, o 100%) identidad de secuencia de aminoácidos con la porción extracelular de una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-6, cuyas variantes retienen la capacidad de unirse a LILRB1 sin estimular la señalización de LILRB1 lo suficiente como para inhibir la fagocitosis por una célula fagocítica que expresa LILRB1. Los ensayos para medir si un péptido dado cumple los criterios anteriores están fácilmente disponibles para un experto en la técnica y se puede usar cualquier ensayo conveniente. En algunas realizaciones, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto es un "péptido LILRB1 de alta afinidad", que incluye polipéptidos derivados de LILRB1 y análogos de los mismos. Los péptidos LILRB1 de alta afinidad son variantes de un péptido LILRB1 descrito anteriormente que comprenden al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de LILRB1 de tipo salvaje, donde el cambio de aminoácido aumenta la afinidad del péptido LILRB1 para unirse a CMH Clase I (p. ej., CMH Clase I clásico) (por ejemplo, disminuyendo la tasa de desviación en al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces o más).

En algunas realizaciones, un péptido LILRB1 (por ejemplo, un péptido LILRB1 de alta afinidad) es una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada en marco con un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión, por ejemplo, de modo que la proteína de fusión no se elimine rápidamente de la circulación. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina. La región Fc puede ayudar en la fagocitosis al proporcionar una señal de "cómeme", que mejora el bloqueo de la señal de "no me comas" proporcionada por el péptido LILRB1. En otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc, por ejemplo, que proporcione un mayor tamaño, dominios de multimerización y/o unión o interacción adicional con moléculas de Ig.

(iii) Anticuerpos anti-LILRBI. En algunas realizaciones, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto es un anticuerpo que se une específicamente a LILRB1 (es decir, un anticuerpo anti-LILRB1) y reduce la interacción entre c Mh Clase I en una célula (p. ej., una célula infectada) y LILRB1. en otra célula (p. ej., una célula fagocítica). Los anticuerpos anti-LILRB1 adecuados pueden unirse a LILRB1 sin activar/estimular la señalización a través de LILRB1 lo suficiente como para inhibir la fagocitosis. Por tanto, un anticuerpo anti-LILRB1 adecuado se une específicamente a LILRB1 (sin activar/estimular suficientemente una respuesta de señalización para inhibir la fagocitosis) y bloquea una interacción entre LILRB1 y CMH Clase I (por ejemplo, CMH Clase I clásico). Los anticuerpos anti-LILRB1 adecuados incluyen versiones completamente humanas, humanizadas o quiméricas de tales anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos humanizados son útiles para aplicaciones in vivo en humanos debido a su baja antigenicidad. De manera similar, los anticuerpos caninizados, felinizados, etc. son útiles para aplicaciones en perros, gatos y otras especies, respectivamente. Los anticuerpos de interés incluyen anticuerpos humanizados o anticuerpos caninizados, felinizados, equinizados, bovinizados, porcinizados, etc., y variantes de los mismos.

[0059] Los ejemplos de anticuerpos monoclonales anti-LILRB1 pueden incluir, pero no se limitan a clones: GHI/75, HP-F1, 3D3-1D12 y VMP55. En algunas realizaciones, por lo tanto, la divulgación proporciona versiones humanizadas de los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente (por ejemplo, aquellos anticuerpos que reconocen LILRB1 humana). También se prevén anticuerpos monocatenarios derivados de camélidos, anticuerpos monocatenarios derivados de tiburón, proteínas modificadas genéticamente que contienen dominio de fibronectina, péptidos knottin y DARPins; y versiones conjugadas con fluoróforo de cada uno de estos reactivos.

[0060] En general, los anticuerpos humanizados se hacen mediante la sustitución de aminoácidos de las regiones marco de un anticuerpo no humano parental para producir un anticuerpo modificado que es menos inmunogénico en un ser humano que el anticuerpo no humano parental. Los anticuerpos se pueden humanizar usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, injerto de CDR (EP 239,400; publicación PCT WO 91/09967; Patentes de Estados Unidos N° 5,225,539; 5,530,101; y 5,585,089), revestimiento o rejuvenecimiento (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7 (6): 805-814 (1994); Roguska. Et al., PNAS 91: 969 -973 (1994)), y barajado de cadenas (Patente de Estados Unidos N° 5,565,332). En determinadas realizaciones, las sustituciones de la estructura se identifican mediante el modelado de las interacciones de la CDR y los residuos de la estructura para identificar los residuos de la estructura importantes para la unión de antígenos y la comparación de secuencias para identificar los residuos de la estructura inusuales en posiciones particulares (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n° 5,585,089; Riechmann y col., Nature 332: 323 (1988)). Los métodos adicionales para humanizar anticuerpos contemplados en este documento se describen en la patente de EE.UU. N° 5,750,078; 5,502,167; 5,705,154; 5,770,403; 5,698,417; 5,693,493; 5,558,864; 4,935,496; y 4,816,567, y las publicaciones PCT WO 98/45331 y WO 98/45332.

[0061] Los inventores han secuenciado el anticuerpo GHI/75 y han identificado el sitio/dominio de unión a antígeno (las secuencias de cadena ligera y pesada):

Cadena ligera (región VJ) del clon GHI/75 (anticuerpo anti-LILRB1) (las CDR según IMGT están subrayadas):

DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKSPQLLIYAATNLADGVPSRFS

GSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSTPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO; 7)

CDR-L1: QTIGTW (SEQ ID NO: 8)

CDR-L2: AAT (SEQ ID NO: 9)

CDR-L3: CQQLYSTPFT (SEQ ID NO: 10)

Cadena pesada (región VDJ) de clon GHI/75 (anticuerpo anti-LILRB1) (las CDR según IMGT están subrayadas):

EVILVESGGALVRPGGSLKLSCAASGFTFSSNAMSWVRQTPEKRLEWVATISNGGTFTYYPD

SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCARHGDGNYGDPLDYWGQGTTLTVSS

(SEQ ID NO; 11)

CDR-H1: FTFSSNA (SEQ ID NO: 12)

CDR-H2: ISNGGTFT (SEQ ID NO: 13)

CDR-H3: CARHGDGNYGDPL (SEQ ID NO: 14).

[0062] Para cualquiera de los anticuerpos anti-LILRB1 descritos, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado, un fragmento de unión del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab), o cualquier permutación que tiene el dominio de unión al antígeno (o, por ejemplo, las CDR del dominio de unión a antígeno). (Consulte la definición de "anticuerpo" más arriba).

[0063] Un anticuerpo anti-LILRB1 sujeto puede incluir: (i) una o más (por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, o 5 o más) secuencias de CDR (por ejemplo, las indicadas en SEQ ID NOs: 8-10 y 12-14); (ii) una región variable completa (por ejemplo, las expuestas en las SEQ ID NO: 7 y 11); y/o (iii) fragmentos variables de cadena sencilla (p. ej., que incluyen cualquiera o todas las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 7-14). Como se conoce en la técnica, una secuencia de región variable puede fusionarse con cualquier secuencia de región constante apropiada.

[0064] En algunas realizaciones, un anticuerpo sujeto anti-LILRB1 incluye una o más CDR (por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, o 6 CDRs) que incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8-10 y 12­ 14. Un anticuerpo anti-LILRB1 sujeto puede incluir una secuencia CDR que difiere en hasta 6 aminoácidos (p. ej., hasta 5 aminoácidos, hasta 4 aminoácidos, hasta 3 aminoácidos, hasta 2 aminoácidos o hasta 1 aminoácido) en comparación con una secuencia de aminoácidos de CDR expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 8-10 y 12-14.

[0065] En algunos casos, un anticuerpo sujeto anti-LILRB1 incluye una o más CDR (por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, o 6) que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en hasta 6 aminoácidos (p. ej., hasta 5 aminoácidos, hasta 4 aminoácidos, hasta 3 aminoácidos, hasta 2 aminoácidos o hasta 1 aminoácido) en comparación con una secuencia de aminoácidos CDR establecida en cualquiera de SEQ ID NO: 8-10 y 12-14. En algunos casos, un anticuerpo anti-LILRB1 sujeto incluye dos o más CDR (p. ej., 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o 6 o más) que tienen una secuencia de aminoácidos que difiere en hasta 6 aminoácidos (p. ej., hasta 5 aminoácidos, hasta 4 aminoácidos, hasta 3 aminoácidos, hasta 2 aminoácidos o hasta 1 aminoácido) en comparación con una secuencia de aminoácidos de CDR establecida en cualquiera de las SEQ ID NO: 8-10 y 12-14.

[0066] En algunas realizaciones, un anticuerpo sujeto anti-LILRB1 incluye una secuencia de aminoácidos que es 80% o más (por ejemplo, 85% o más, 90% o más, 92% o más, 95% o más, 97% o más, 98% o más, 99% o más, 99,5% o más, o 100%) idéntica a una secuencia de aminoácidos de CDR expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 8-10 y 12-14. En algunos casos, un anticuerpo anti-LILRBI sujeto incluye una cadena pesada que tiene una o más (por ejemplo, dos o más, tres o más, o 3) de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 12-14. En algunos casos, un anticuerpo anti-LILRB1 sujeto incluye una cadena pesada que tiene las 3 secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 12-14. En algunos casos, un anticuerpo anti-LILRB1 sujeto incluye una cadena ligera que tiene una o más (por ejemplo, dos o más, tres o más, o 3) de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 8-10. En algunos casos, un anticuerpo anti-LILRB1 sujeto incluye una cadena ligera que tiene las 3 secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 8-10.

[0067] En algunos casos, un anticuerpo sujeto anti-LILRB1 incluye una cadena ligera que tiene todas las 3 secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 8-10, y una cadena pesada que tiene todas las 3 secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 12-14.

[0068] En algunos casos, un anticuerpo sujeto anti-LILRB1 incluye una cadena pesada que tiene tres CDR, en las que CDR-H1 tiene la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 12, CDR-H2 tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 13 y CDR-H3 tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14. En algunos casos, un anticuerpo anti-LILRB1 sujeto incluye una cadena ligera que tiene tres CDR, donde CDR-L1 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 8, CDRL2 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9, y CDR-L3 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 10. En algunos casos, el anticuerpo sujeto anti-LILRB1 incluye: (i) una cadena pesada que tiene tres CDR, donde CDRH1 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID No : 12, CDR-H2 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 13, y CDR-H3 tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14; y (ii) una cadena ligera que tiene tres CDR, donde CDR-L1 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 8, CDR-L2 tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 9 y CDR-L3 tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10.

[0069] En algunos casos, un anticuerpo sujeto anti-LILRB1 incluye una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 11. en algunos casos, un anticuerpo anti-LILRB1 sujeto incluye una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 7. En algunos casos, un anticuerpo anti-LILRB1 sujeto incluye una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 11; y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 7.

[0070] (iv) Complejo de CMH Clase I soluble. En algunas realizaciones, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto es un complejo soluble CMH Clase I (o cualquier componente del mismo) que se une específicamente a LILRB1 y reduce la interacción entre CMH Clase I en una célula (por ejemplo, una célula infectada) y LILRB1 en otra célula (p. ej., una célula fagocítica). Un complejo de CMH Clase I soluble adecuado puede unirse a LILRB1 sin activar o estimular la señalización a través de LILRB1 porque la activación de LILRB1 inhibiría la fagocitosis. Un polipéptido de CMH Clase I soluble adecuado se une específicamente a LILRB1 sin activar/estimular una respuesta de señalización suficiente para inhibir la fagocitosis.

[0071] La eficacia de un anticuerpo agente anti-CMH Clase I/LILRB1. La eficacia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 adecuado puede evaluarse ensayando el agente. Como ejemplo no limitante de tal ensayo, las células diana se incuban en presencia o ausencia del agente candidato y se mide la fagocitosis de las células diana (por ejemplo, fagocitosis por macrófagos). Un agente para usar en los métodos objeto (un agente anti-CMH Clase I/LILRB1) regulará positivamente la fagocitosis en al menos un 10% (p. ej., al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 120%, al menos 140%, al menos 160%, al menos 180%, al menos 200%, o al menos 300%) en comparación con la fagocitosis en ausencia del agente candidato. Puede usarse cualquier ensayo de fagocitosis conveniente. Como ejemplo no limitante de un ensayo de fagocitosis, véanse los ejemplos a continuación.

[0072] En algunos casos, el ensayo puede llevarse a cabo en presencia de un agente inductor de fagocitosis conocido (por ejemplo, un agente anti-CD47/SIRPA). En algunos casos, en presencia de un agente inductor de fagocitosis conocido (p. ej., un agente antiCD47/SIRPA), un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 aumentará la regulación de la fagocitosis en al menos un 10% (p. ej., al menos un 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 120%, al menos 140%, al menos 160%, al menos 180%, al menos 200% o al menos 300%) en comparación con la fagocitosis en ausencia del agente inductor de la fagocitosis. En algunos casos, en presencia de un agente inductor de fagocitosis conocido (p. ej., un agente anti-CD47/SIRPA), un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 regulará positivamente la fagocitosis en al menos un 10% (p. ej., al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 120%, al menos 140%, al menos 160%, al menos 180%, al menos 200% o al menos 300%) en comparación con la fagocitosis en ausencia del agente candidato.

[0073] Del mismo modo, un ensayo in vitro que mide la fosforilación de la tirosina de LILRB1 se puede utilizar (por ejemplo, como una alternativa o además de un ensayo de fagocitosis). En algunos casos, un agente candidato adecuado mostrará una disminución en la fosforilación de al menos un 5% (por ejemplo, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o 100%) en comparación con la fosforilación observada en ausencia del agente candidato. En algunos casos, en presencia de un agente inductor de fagocitosis conocido (p. ej., un agente anti-CD47/SIRPA), un agente candidato anti-CMH Clase I/LILRB1 adecuado mostrará una disminución en la fosforilación de al menos un 5% (p. ej., al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, o 100%) en comparación con la fosforilación en ausencia del agente inductor de fagocitosis. En algunos casos, en presencia de un agente inductor de fagocitosis conocido (p. ej., un agente anti-CD47/SIRPA), un agente candidato anti-CMH Clase I/LILRB1 adecuado mostrará una disminución en la fosforilación de al menos un 5% (p. ej., al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o 100%) en comparación con la fosforilación en ausencia del agente candidato.

[0074] Agente anti-CD47/SIRPA. Como se usa en este documento, el término "agente anti-CD47/SIRPA" se refiere a cualquier agente que reduce la unión de CD47, por ejemplo, en una célula diana, a SIRPA (también conocido como SIRPa), por ejemplo, en una célula fagocítica. Los ejemplos no limitantes de agentes anti-CD47/SIRPA adecuados incluyen reactivos SIRPA, que incluyen, sin limitación, polipéptidos SIRPA de alta afinidad; anticuerpos anti-SIRPA; polipéptidos CD47 solubles; y anticuerpos anti-CD47 o fragmentos de anticuerpos. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47/SIRPA adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD47, un reactivo SIRPA, etc.) se une específicamente a CD47 para reducir la unión de CD47 a SIRPA. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47/SIRPA adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-SIRPA, un polipéptido CD47 soluble, etc.) se une específicamente a SIRPA para reducir la unión de CD47 a SIRPA. Un agente anti-CD47/SIRPA adecuado que se une a SIRPA no activa SIRPA (por ejemplo, en la célula fagocítica que expresa SIRPA). La eficacia de un agente anti-CD47/SIRPA adecuado puede evaluarse ensayando el agente (más adelante se describe). Como ejemplo no limitante de tal ensayo, las células diana se incuban en presencia o ausencia del agente candidato y se mide la fagocitosis de las células diana (por ejemplo, fagocitosis por macrófagos). Un agente para su uso en los métodos objeto (un agente anti-CD47/SIRPA) regulará positivamente la fagocitosis en al menos un 10% (por ejemplo, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 120%, al menos 140%, al menos 160%, al menos 180%, al menos 200%, o al menos 300%) en comparación con la fagocitosis en ausencia del agente candidato. Puede usarse cualquier ensayo de fagocitosis conveniente. Como ejemplo no limitante de un ensayo de fagocitosis, véanse los ejemplos a continuación. De manera similar, se puede usar un ensayo in vitro que mide la fosforilación de tirosina de SIRPA (por ejemplo, como una alternativa o además de un ensayo de fagocitosis). Un agente candidato adecuado mostrará una disminución en la fosforilación de al menos un 5% (por ejemplo, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o 100%) en comparación con la fosforilación observada en ausencia del agente candidato.

[0075] En algunas realizaciones, el agente anti-CD47/SIRPA no activa CD47 tras la unión. Cuando se activa CD47, puede ocurrir un proceso similar a la apoptosis (es decir, muerte celular programada) (Manna y Frazier, Cancer Research, 64, 1026-1036, 1 de febrero de 2004). Por tanto, en algunas realizaciones, el agente anti-CD47/SIRPA no induce directamente la muerte celular de una célula que expresa CD47.

[0076] Algunos agentes patógenos (por ejemplo, virus de la viruela, virus del mixoma, virus deerpox, virus de la viruela porcina, virus de variola caprina, virus de variola ovina, etc.) expresan un análogo de CD47 (es decir, un imitador de CD47) (por ejemplo, la proteína M128L) que actúa como factor de virulencia para permitir la infección (Cameron et al., Virology. 20 de junio de 2005; 337 (1): 55-67), y algunos patógenos inducen la expresión de CD47 endógeno en la célula huésped. Por tanto, las células infectadas con un patógeno que expresa un análogo de CD47 pueden expresar el análogo de CD47 proporcionado por el patógeno de forma exclusiva o en combinación con CD47 endógeno. Este mecanismo permite que el patógeno aumente la expresión de CD47 (mediante la expresión del análogo de CD47) en la célula infectada con o sin aumentar el nivel de CD47 endógeno. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47/SIRPA (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD47, un reactivo SIRPA, un anticuerpo SIRPA, un polipéptido CD47 soluble, etc.) puede reducir la unión de un análogo de CD47 (es decir, un imitador de CD47) a SIRPA. En algunos casos, un agente anti-CD47/SIRPA adecuado (por ejemplo, un reactivo SIRPA, un anticuerpo anti-CD47, etc.) puede unirse a un análogo de CD47 (es decir, un imitador de CD47) para reducir la unión del análogo de CD47 a SIRPa . En algunos casos, un agente anti-CD47/SIRPA adecuado (por ejemplo, un anticuerpo anti-SIRPA, un polipéptido CD47 soluble, etc.) puede unirse a SIRPA. Un agente anti-CD47/SIRPA adecuado que se une a SIRPA no activa SIRPA (por ejemplo, en la célula fagocítica que expresa SIRPA). Se puede usar un agente anti-CD47/SIRPA en cualquiera de los métodos proporcionados en este documento cuando el patógeno es un patógeno que proporciona un análogo de CD47. En otras palabras, el término "CD47", como se usa en este documento, abarca tanto CD47 como análogos de CD47 (es decir, imitadores de CD47).

[0077] Reactivo SIRPA. Un reactivo SIRPA comprende la parte de SIRPA que es suficiente para unirse a CD47 con una afinidad reconocible, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento del mismo que retiene la actividad de unión. Un reactivo SIRPA adecuado reduce (por ejemplo, bloquea, previene, etc.) la interacción entre las proteínas nativas SIRPA y CD47. El reactivo SIRPA comprenderá normalmente al menos el dominio d1 de SIRPA. En algunas realizaciones, un reactivo SIRPA es una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada en marco con un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión, por ejemplo, de modo que la proteína de fusión no se elimine rápidamente de la circulación. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina. La región Fc ayuda en la fagocitosis al proporcionar una señal de "cómeme", que mejora el bloqueo de la señal de "no me comas" proporcionada por el reactivo SIRPA de alta afinidad. En otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc, por ejemplo, que proporcione un mayor tamaño, dominios de multimerización y/o unión o interacción adicional con moléculas de Ig.

[0078] En algunas realizaciones, un agente anti-CD47/SIRPA sujeto es un "reactivo SIRPA de alta afinidad", que incluye SIRPA derivada de polipéptidos y análogos de los mismos. Los reactivos SIRPA de alta afinidad se describen en la publicación de patente internacional WO 2013/109752. Los reactivos SIRPA de alta afinidad son variantes de la proteína SIRPA nativa. En algunas realizaciones, un reactivo SIRPA de alta afinidad es soluble, donde el polipéptido carece del dominio transmembrana SIRPA y comprende al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia SIRPA de tipo salvaje, y donde el cambio de aminoácido aumenta la afinidad de la unión de polipéptido SIRPA a CD47, por ejemplo, disminuyendo la tasa de desviación en al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces o más.

[0079] Un reactivo de alta afinidad SIRPA comprende la porción de SIRPA que es suficiente para unir CD47 en una afinidad reconocible, por ejemplo, alta afinidad, que normalmente se encuentra entre la secuencia señal y el dominio transmembrana, o un fragmento del mismo que retiene la actividad de unión. El reactivo SIRPA de alta afinidad comprende al menos el dominio d1 de SIRPA con residuos de aminoácidos modificados para aumentar la afinidad. En algunas realizaciones, una variante de SIRPA de la presente invención es una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada en marco con un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión, por ejemplo, de modo que la proteína de fusión no se elimine rápidamente de la circulación. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es parte o la totalidad de una región Fc de inmunoglobulina. La región Fc ayuda en la fagocitosis al proporcionar una señal de "cómeme", que mejora el bloqueo de la señal de "no me comas" proporcionada por el reactivo SIRPA de alta afinidad. En otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar a Fc, por ejemplo, que proporcione un mayor tamaño, dominios de multimerización y/o unión o interacción adicional con moléculas de Ig. Los cambios de aminoácidos que proporcionan una mayor afinidad se localizan en el dominio d1 y, por tanto, los reactivos SIRPA de alta afinidad comprenden un dominio d1 de SIRPA humano, con al menos un cambio de aminoácido en relación con la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d1. Dicho reactivo SIRPA de alta afinidad comprende opcionalmente secuencias de aminoácidos adicionales, por ejemplo secuencias Fc de anticuerpos; porciones de la proteína SIRPA humana de tipo salvaje distintas del dominio d1, que incluyen, sin limitación, los residuos 150 a 374 de la proteína nativa o fragmentos de la misma, habitualmente fragmentos contiguos al dominio d1; y similares. Los reactivos SIRPA de alta afinidad pueden ser monoméricos o multiméricos, es decir, dímero, trímero, tetrámero, etc. Un ejemplo de un reactivo SIRPA de alta afinidad se conoce como CV1 (un monómero de proteína modificado por ingeniería genética).

[0080] Anticuerpos anti-CD47. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47/SIRPA sujeto es un anticuerpo que se une específicamente a CD47 (es decir, un anticuerpo anti-CD47) y reduce la interacción entre CD47 en una célula (p. ej., una célula infectada) y SIRPA en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD47 adecuado no activa CD47 al unirse. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos adecuados incluyen los clones B6H12, 5F9, 8B6 y C3 (por ejemplo, como se describe en la publicación de patente internacional WO 2011/143624). Los anticuerpos anti-CD47 adecuados incluyen versiones completamente humanas, humanizadas o quiméricas de tales anticuerpos. Los anticuerpos humanizados (por ejemplo, hu5F9-G4) son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en seres humanos debido a su baja antigenicidad. De manera similar, los anticuerpos caninizados, felinizados, etc. son especialmente útiles para aplicaciones en perros, gatos y otras especies, respectivamente. Los anticuerpos de interés incluyen anticuerpos humanizados o anticuerpos caninizados, felinizados, equinizados, bovinizados, porcinizados, etc., y variantes de los mismos.

[0081] Anticuerpos anti-SIRPA. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47/SIRPA sujeto es un anticuerpo que se une específicamente a SIRPA (es decir, un anticuerpo anti-SIRPA) y reduce la interacción entre CD47 en una célula (p. ej., una célula infectada) y SIRPA en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). Los anticuerpos anti-SIRPA adecuados pueden unirse a SIRPA sin activar o estimular la señalización a través de SIRPA porque la activación de SIRPA inhibiría la fagocitosis. En cambio, los anticuerpos anti-SIRPA adecuados facilitan la fagocitosis preferencial de las células infligidas sobre las células normales. Aquellas células que expresan niveles más altos de CD47 (por ejemplo, células infectadas) en relación con otras células (células no infectadas) se fagocitarán preferentemente. Por tanto, un anticuerpo anti-SIRPA adecuado se une específicamente a SIRPA (sin activar/estimular lo suficiente una respuesta de señalización para inhibir la fagocitosis) y bloquea una interacción entre SIRPA y CD47. Los anticuerpos anti-SIRPA adecuados incluyen versiones completamente humanas, humanizadas o quiméricas de tales anticuerpos. Los anticuerpos humanizados son especialmente útiles para aplicaciones in vivo en seres humanos debido a su baja antigenicidad. De manera similar, los anticuerpos caninizados, felinizados, etc. son especialmente útiles para aplicaciones en perros, gatos y otras especies, respectivamente. Los anticuerpos de interés incluyen anticuerpos humanizados o anticuerpos caninizados, felinizados, equinizados, bovinizados, porcinizados, etc., y variantes de los mismos.

[0082] Polipéptidos solubles de CD47. En algunas realizaciones, un agente anti-CD47/SIRPA sujeto es un polipéptido CD47 soluble que se une específicamente a SIRPA y reduce la interacción entre CD47 en una célula (por ejemplo, una célula infectada) y SIRPA en otra célula (por ejemplo, una célula fagocítica). Un polipéptido CD47 soluble adecuado puede unirse a SIRPA sin activar o estimular la señalización a través de SIRPA porque la activación de SIRPA inhibiría la fagocitosis. En cambio, los polipéptidos de CD47 solubles adecuados facilitan la fagocitosis preferencial de las células infectadas sobre las no infectadas. Aquellas células que expresan niveles más altos de CD47 (por ejemplo, células infectadas) en relación con las células normales no diana (células normales) se fagocitarán preferentemente. Por tanto, un polipéptido CD47 soluble adecuado se une específicamente a SIRPA sin activar/estimular una respuesta de señalización suficiente para inhibir la fagocitosis.

[0083] En algunos casos, un polipéptido CD47 soluble adecuado puede ser una proteína de fusión (por ejemplo como se describe estructuralmente en la publicación de patente de EE.UU. US20100239579). Sin embargo, solo las proteínas de fusión que no activan/estimulan SIRPA son adecuadas para los métodos proporcionados en este documento. Los polipéptidos de CD47 solubles adecuados también incluyen cualquier péptido o fragmento de péptido que comprenda secuencias de CD47 variantes o existentes de forma natural (p. ej., secuencias de dominio extracelular o variantes de dominio extracelular) que puedan unirse específicamente a SIRPA e inhibir la interacción entre CD47 y SIRPA sin estimular suficiente actividad de SIRPA para inhibir la fagocitosis.

[0084] En ciertas realizaciones, el polipéptido CD47 soluble comprende el dominio extracelular de CD47, incluyendo el péptido señal. Los polipéptidos CD47 solubles también incluyen variantes del dominio extracelular CD47 que comprenden una secuencia de aminoácidos al menos 65%-75%, 75%-80%, 80-85%, 85%-90% o 95%-99% (o cualquier identidad porcentual no enumerada específicamente entre 65% y 100%), cuyas variantes retienen la capacidad de unirse a SIRPA sin estimular la señalización de SIRPA.

[0085] En ciertas realizaciones, el péptido señal de secuencia de aminoácidos puede estar sustituido con una secuencia de aminoácidos de péptido señal que se deriva de otro polipéptido (por ejemplo, una inmunoglobulina o CTLA4). Por ejemplo, a diferencia del CD47 de longitud completa, que es un polipéptido de la superficie celular que atraviesa la membrana celular externa, los polipéptidos CD47 solubles se secretan; por consiguiente, un polinucleótido que codifica un polipéptido CD47 soluble puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal que está asociado con un polipéptido que normalmente se secreta de una célula.

[0086] En otras realizaciones, el polipéptido CD47 soluble comprende un dominio extracelular de CD47 que carece del péptido señal. Como se describe en este documento, los péptidos señal no se exponen en la superficie celular de una proteína secretada o transmembrana porque el péptido señal se escinde durante la translocación de la proteína o el péptido señal permanece anclado en la membrana celular externa (dicho péptido también se denomina ancla de señal). Se cree que la secuencia del péptido señal de CD47 se escinde del polipéptido precursor de CD47 in vivo.

[0087] En otras realizaciones, un polipéptido CD47 soluble comprende una variante de dominio extracelular CD47. Dicho polipéptido CD47 soluble conserva la capacidad de unirse a SIRPA sin estimular la señalización de SIRPA. La variante del dominio extracelular CD47 puede tener una secuencia de aminoácidos que sea al menos 65%-75%, 75%-80%, 80-85%, 85%-90% o 95%-99% idéntica (que incluye cualquier porcentaje de identidad entre cualquiera de los intervalos descritos) con el dominio extracelular de CD47 de tipo salvaje.

[0088] Los agentes descritos anteriormente se pueden preparar en una variedad de maneras. Por ejemplo, se puede preparar un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA (juntos o por separado): como una unidad de dosificación, con un excipiente farmacéuticamente aceptable, con sales y ésteres farmacéuticamente aceptables, etc. Las composiciones se pueden proporcionar como composiciones farmacéuticas.

[0089] Composiciones farmacéuticas. Se pueden proporcionar agentes anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o agentes anti-CD47/SIRPA adecuados en composiciones farmacéuticas adecuadas para uso terapéutico, por ejemplo, para tratamiento en humanos. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen una o más entidades terapéuticas de la presente divulgación (por ejemplo, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA) e incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable, una sal farmacéuticamente aceptable, un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o ésteres o solvatos del mismo. En algunas realizaciones, el uso de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA incluye el uso en combinación con otro agente terapéutico (por ejemplo, otro agente antiinfeccioso u otro agente anti-cancerígeno). Las formulaciones terapéuticas que comprenden un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA se pueden preparar mezclando el agente o agentes que tienen el grado de pureza deseado con un vehículo fisiológicamente aceptable, una sal farmacéuticamente aceptable, un excipiente y/o estabilizador (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)) (por ejemplo, en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas). Una composición que tiene un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA se puede formular, dosificar y administrar de una manera consistente con las buenas prácticas médicas. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el horario de administración y otros factores conocidos por los médicos.

[0090] "Excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente que es útil para preparar una composición farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica y deseable, e incluye excipientes que son aceptables para uso veterinario así como para uso farmacéutico en humanos. Dichos excipientes pueden ser sólidos, líquidos, semisólidos o, en el caso de una composición en aerosol, gaseosos.

[0091] "Sales y ésteres farmacéuticamente aceptables" significan medios y ésteres que son farmacéuticamente aceptables y tienen las propiedades farmacológicas deseadas. Tales sales incluyen sales que se pueden formar donde los protones ácidos presentes en los compuestos son capaces de reaccionar con bases orgánicas o inorgánicas. Las sales inorgánicas adecuadas incluyen las formadas con los metales alcalinos, por ejemplo, sodio y potasio, magnesio, calcio y aluminio. Las sales orgánicas adecuadas incluyen aquellas formadas con bases orgánicas tales como las bases amínicas, por ejemplo, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y similares. Dichas sales también incluyen sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácidos clorhídrico y bromhídrico) y ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido maleico y los ácidos alcano y arenosulfónico tales como ácido metanosulfónico y ácido bencenosulfónico). Los ésteres farmacéuticamente aceptables incluyen ésteres formados a partir de grupos carboxi, sulfoniloxi y fosfonoxi presentes en los compuestos, por ejemplo, ésteres de C1-6 alquilo. Cuando hay dos grupos ácidos presentes, una sal o éster farmacéuticamente aceptable puede ser un monoácido mono-sal o éster o una di-sal o éster; y de manera similar, cuando hay más de dos grupos ácidos presentes, algunos o todos estos grupos pueden salificarse o esterificarse. Los compuestos nombrados en esta descripción pueden estar presentes en forma no salificada o no esterificada, o en forma salificada y/o esterificada, y la denominación de tales compuestos pretende incluir tanto el compuesto original (no salificado y no esterificado) como sus sales y ésteres farmacéuticamente aceptables. Además, ciertos compuestos nombrados en esta descripción pueden estar presentes en más de una forma estereoisomérica, y la denominación de dichos compuestos pretende incluir todos los estereoisómeros individuales y todas las mezclas (racémicas o no) de dichos estereoisómeros.

[0092] Los términos "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable" y variaciones gramaticales de los mismos, como se refieren a composiciones, vehículos, diluyentes y reactivos, se usan indistintamente y representan que los materiales son capaces de administración a/o sobre un ser humano sin la producción de efectos fisiológicos indeseables en un grado que prohibiría la administración de la composición.

[0093] "Unidad de dosificación" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el individuo particular a tratar. Cada unidad puede contener una cantidad predeterminada de compuesto(s) activo(s) calculada para producir los efectos terapéuticos deseados en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas de dosificación unitaria puede ser dictada por (a) las características únicas del (de los) compuesto(s) activo(s) y el (los) efecto(s) terapéutico(s) particular(es) que se desea lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de combinar dicho(s) compuesto(s) activo(s).

Métodos

[0094] Se describen métodos para inducir la fagocitosis de una célula diana, tratando un individuo que tiene cáncer, tratando un individuo que tiene una infección de patógeno intracelular (por ejemplo, una infección crónica), reduciendo el número de células infligidas (por ejemplo, células cancerosas, células infectadas con un patógeno intracelular, etc.) en un individuo, y/o predecir si un individuo es resistente (o susceptible) a tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA. En algunos casos, los métodos objeto incluyen el uso de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente que opsoniza una célula diana (p. ej., coadministración de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente que opsoniza un célula diana). En algunos casos, los métodos objeto incluyen el uso de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA (por ejemplo, la coadministración de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA). En algunos casos, los métodos objeto incluyen el uso de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1, un agente anti-CD47/SIRPA y un agente que opsoniza una célula diana (p. ej., coadministración de un anti-CMH Clase I/LILRB1, un agente anti-CD47/SIRPA y un agente que opsoniza una célula diana). En algunos casos, un agente anti-CD47/SIRPA es un agente que opsoniza una célula diana (por ejemplo, cuando el agente anti-CD47/SIRPA es un anticuerpo anti-CD47 que tiene una región Fc).

[0095] Las composiciones descritas anteriormente pueden encontrar uso en los métodos descritos en este documento.

[0096] En algunos casos, un método sujeto es un método para inducir la fagocitosis de una célula diana. El término "célula diana", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula (por ejemplo, células infligidas como células cancerosas, células infectadas, etc.) que está dirigida para la fagocitosis por una célula fagocítica. En algunos casos, una célula diana es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA. Por ejemplo, algunas células infligidas (por ejemplo, células cancerosas) no expresan CMH Clase I y tales células son susceptibles a un agente anti-CD47/SIRPA. Cuando una célula diana que es susceptible a un agente anti-CD47/SIRPA se pone en contacto con una célula fagocítica en presencia de un agente anti-CD47/SIRPA, la célula diana puede ser engullida (por ejemplo, fagocitada) por la célula fagocítica.

[0097] Sin embargo, algunas células infligidas (por ejemplo, células cancerosas) no expresan CMH Clase I y tales células pueden ser resistentes a un agente anti-CD47/SIRPA. Cuando una célula diana que es resistente a un agente anti-CD47/SIRPA entra en contacto con una célula fagocítica (p. ej., un macrófago) en presencia de un agente anti-CD47/SIRPA, es menos probable que la célula diana se engulle (p. ej., es fagocitada) por la célula fagocítica (ver los ejemplos de trabajo a continuación). En algunas realizaciones, una célula diana (por ejemplo, una célula diana que es resistente a un agente anti-CD47/SIRPA) se pone en contacto con una célula fagocítica (por ejemplo, un macrófago) en presencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA. Cuando una célula diana que es resistente a un agente anti-CD47/SIRPA (p. ej., la célula diana resistente expresa CMH Clase I) se pone en contacto con una célula fagocítica (p. ej., un macrófago) en presencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA, la célula fagocítica puede engullir (p. ej., fagocitar) la célula diana. Poner en contacto una célula diana con una célula fagocítica (por ejemplo, un macrófago) en presencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA abarca escenarios en los que la célula diana entra en contacto con el anti-CMH Clase I/LILRB1 y el agente anti-CD47/SIRPA al mismo tiempo (es decir, ambos agentes están presentes al mismo tiempo), y escenarios en los que la célula diana entra en contacto con uno de los agentes antes que el otro agente (en cualquier orden) (p. ej., uno de los agentes está presente primero y el otro agente se añade más tarde, en presencia o ausencia del primer agente).

[0098] El contacto de una célula diana con una célula fagocítica (por ejemplo, un macrófago) en presencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA puede ocurrir in vitro o in vivo. Por ejemplo, en algunos casos, se cultiva una célula diana (p. ej., una célula cancerosa de un individuo, una célula cancerosa de una línea celular inmortalizada, una célula infectada de un individuo, una célula infectada de una línea celular, y similares) in vitro con una célula fagocítica, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente antiCD47/SIRPA.

[0099] En algunos casos, después de que la célula fagocítica envuelva a la célula diana, la célula fagocítica se introduce en un individuo (por ejemplo, el individuo del que se tomó la célula diana). En algunos casos, la célula fagocítica es una célula de un individuo (por ejemplo, el mismo individuo de quien se tomó la célula diana) y la célula fagocítica se reintroduce en el individuo después de que la célula fagocítica engulle a la célula diana. Cuando la célula diana y/o la célula fagocítica son de un individuo que está siendo tratado, el método puede denominarse método ex vivo. En algunos casos, un método para inducir la fagocitosis de una célula diana, donde el método incluye poner en contacto la célula diana con una célula fagocítica (por ejemplo, un macrófago) en presencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA, puede ocurrir in vivo. En tales casos, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y el agente anti-CD47/SIRPA pueden administrarse a un individuo (por ejemplo, un individuo que tiene cáncer, una infección crónica, etc.) y el contacto de la célula diana con la célula fagocítica ocurrirá in vivo, sin más aportaciones de la persona que realiza el método. Como tal, en algunos casos, un método para inducir la fagocitosis de una célula diana puede abarcar un método que incluye administrar a un individuo un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA.

[0100] Una célula diana puede ser una célula que está "infligida", donde el término "infligido" se utiliza aquí para referirse a un sujeto con síntomas, una enfermedad o una afección que puede tratarse con un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA. Un sujeto "infligido" puede tener cáncer, puede albergar una infección (por ejemplo, una infección crónica) y otras afecciones hiperproliferativas, por ejemplo, esclerosis, fibrosis y similares, etc. Las "células infligidas" pueden ser aquellas células que causan los síntomas, enfermedad o dolencia. Como ejemplos no limitantes, las células infligidas de un paciente infligido pueden ser células cancerosas, células infectadas y similares. Una indicación de que una enfermedad o dolencia puede tratarse con un agente anti-CD47/SIRPA es que las células involucradas (es decir, las células infligidas, por ejemplo, las células cancerosas, las células infectadas, etc.) expresan un nivel aumentado de CD47 en comparación con a células normales del mismo tipo de célula. Una indicación de que una enfermedad o dolencia puede tratarse con un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 es que las células involucradas (es decir, las células infligidas, por ejemplo, las células cancerosas, las células infectadas, etc.) expresan CMH Clase I (por ejemplo, CMH Clase I clásico). En algunos casos, una indicación de que una enfermedad o enfermedad puede tratarse con un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA es que las células involucradas (es decir, las células infligidas, por ejemplo, las células cancerosas, las células infectadas, etc.) expresan un nivel aumentado de CD47 en comparación con las células normales del mismo tipo de célula, y expresan CMH Clase I (por ejemplo, CMH Clase I clásico).

[0101] En algunos casos, un método sujeto es un método de tratamiento de un individuo que tiene cáncer y/o que tiene una infección intracelular por patógenos (por ejemplo, una infección crónica). Un tratamiento eficaz reducirá el número de células infligidas (por ejemplo, células cancerosas, células infectadas con un patógeno intracelular, etc.) en un individuo (por ejemplo, mediante el aumento de la fagocitosis de las células diana). Como tal, en algunos casos, un método sujeto es un método para reducir el número de células infligidas (por ejemplo, células cancerosas, células infectadas con un patógeno intracelular, etc.) en un individuo.

[0102] Los términos "tratamiento", "tratar', "tratado" y similares se usan en este documento para referirse generalmente a la obtención de un efecto deseado farmacológico y/o fisiológico. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma(s) de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de estabilización o cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. El término "tratamiento" abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un ser humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad y/o síntoma(s) ocurran en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero aún no se le ha diagnosticado que lo tenga; (b) inhibir la enfermedad y/o síntoma(s), es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar los síntomas de la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad y/o los síntomas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos ya infligidos (por ejemplo, aquellos con cáncer, aquellos con una infección, aquellos con un trastorno inmunológico, etc.) así como aquellos en los que se desea prevención (por ejemplo, aquellos con mayor susceptibilidad al cáncer, aquellos con mayor probabilidad de infección, los sospechosos de tener cáncer, los sospechosos de albergar una infección, etc.).

[0103] Un tratamiento terapéutico es uno en donde el sujeto es infligido antes de la administración y un tratamiento profiláctico es uno en donde el sujeto no se inflige antes de la administración. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mayor probabilidad de sufrir o se sospecha que se le inflige antes del tratamiento. En algunas formas de realización, se sospecha que el sujeto tiene una mayor probabilidad de sufrir una enfermedad.

[0104] Los ejemplos de síntomas, enfermedades y/o afecciones que pueden tratarse con un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 (por ejemplo, en combinación con un agente anti-CD47/SIRPA) incluyen, pero no se limitan a, cáncer (cualquier forma de cáncer, que incluye pero no se limita a: carcinomas, tumores de tejidos blandos, sarcomas, teratomas, melanomas, leucemias, linfomas, cánceres de cerebro, tumores sólidos, mesotelioma (MSTO), etc.); infección de un patógeno intracelular (por ejemplo, infección crónica); y enfermedades o trastornos inmunológicos (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria) (por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis y similares) (por ejemplo, para terapia inmunosupresora).

[0105] Como se usa en el presente documento "cáncer" incluye cualquier forma de cáncer, incluyendo pero no limitado a los cánceres de tumores sólidos (por ejemplo, pulmón, próstata, mama, vejiga, colon, ovario, páncreas, riñón, hígado, glioblastoma, meduloblastoma, leiomiosarcoma, carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello, melanomas, neuroendocrinos, etc.) y cánceres líquidos (por ejemplo, cánceres hematológicos); carcinomas; tumores de tejidos blandos; sarcomas; teratomas; melanomas; leucemias; linfomas; y cánceres de cerebro, incluida la enfermedad residual mínima, y que incluye tumores tanto primarios como metastásicos. Cualquier cáncer es un cáncer adecuado para ser tratado mediante los métodos y composiciones de la materia.

[0106] Los carcinomas son neoplasias que se originan en los tejidos epiteliales. Las células epiteliales cubren la superficie externa del cuerpo, recubren las cavidades internas y forman el revestimiento de los tejidos glandulares. Los ejemplos de carcinomas incluyen, pero no se limitan a: adenocarcinoma (cáncer que comienza en las células glandulares (secretoras)), por ejemplo, los cánceres de mama, páncreas, pulmón, próstata y colon pueden ser adenocarcinomas; carcinoma adrenocortical; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células renales; carcinoma de ovario; carcinoma in situ; carcinoma ductal; carcinoma de mama; carcinoma de células basales; carcinoma de células escamosas; carcinoma de células de transición; carcinoma de colon; el carcinoma nasofaríngeo; carcinoma de células renales quísticas multiloculares; carcinoma de células de avena; carcinoma de pulmón de células grandes; carcinoma de pulmón de células pequeñas; carcinoma de pulmón de células no pequeñas; y similares. Los carcinomas se pueden encontrar en la próstata, páncreas, colon, cerebro (por lo general como metástasis secundarias), pulmón, mama, piel, etc.

[0107] Los tumores de tejidos blandos son un grupo muy diverso de tumores raros que se derivan de tejido conectivo. Los ejemplos de tumores de tejidos blandos incluyen, pero no se limitan a: sarcoma alveolar de partes blandas; histiocitoma fibroso angiomatoide; fibroma condromioxido; condrosarcoma esquelético; condrosarcoma mixoide extraesquelético; sarcoma de células claras; tumor desmoplásico de células redondas pequeñas; dermatofibrosarcoma protuberans; tumor del estroma endometrial; Sarcoma de Ewing; fibromatosis (Desmoid); fibrosarcoma infantil; tumor del estroma gastrointestinal; tumor óseo de células gigantes; tumor tenosinovial de células gigantes; tumor miofibroblástico inflamatorio; leiomioma uterino; leiomiosarcoma; lipoblastoma; lipoma típico; lipoma de células fusiformes o pleomórfico; lipoma atípico; lipoma condroide; liposarcoma bien diferenciado; liposarcoma mixoide/células redondas; liposarcoma pleomórfico; histiocitoma fibroso maligno mixoide; histiocitoma fibroso maligno de alto grado; mixofibrosarcoma; tumor maligno de la vaina del nervio periférico; mesotelioma; neuroblastoma; osteocondroma; osteosarcoma; tumor neuroectodérmico primitivo; rabdomiosarcoma alveolar; rabdomiosarcoma embrionario; schwannoma benigno o maligno; sarcoma sinovial; Tumor de Evan; fascitis nodular; fibromatosis de tipo desmoide; tumor fibroso solitario; dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP); angiosarcoma; hemangioendotelioma epitelioide; tumor tenosinovial de células gigantes (TGCT); sinovitis villonodular pigmentada (PVNS); displasia fibrosa; mixofibrosarcoma; fibrosarcoma; sarcoma sinovial; tumor maligno de la vaina del nervio periférico; neurofibroma; y adenoma pleomórfico de tejido blando; y neoplasias derivadas de fibroblastos, miofibroblastos, histiocitos, células vasculares/células endoteliales y células de la vaina nerviosa.

[0108] Un sarcoma es un tipo raro de cáncer que surge en células de origen mesenquimatoso, por ejemplo, en huesos o en los tejidos blandos del cuerpo, incluyendo cartílago, grasa, músculo, vasos sanguíneos, tejido fibroso u otro tejido conjuntivo o tejido de apoyo. Los diferentes tipos de sarcoma se basan en el lugar donde se forma el cáncer. Por ejemplo, el osteosarcoma se forma en los huesos, el liposarcoma se forma en la grasa y el rabdomiosarcoma en el músculo. Los ejemplos de sarcomas incluyen, pero no se limitan a: tumor de Askin; botrioides del sarcoma; condrosarcoma; sarcoma de Ewing; hemangioendotelioma maligno; schwannoma maligno; osteosarcoma; y sarcomas de tejidos blandos (p. ej., sarcoma alveolar de partes blandas; angiosarcoma; cistosarcoma filodesdermatofibrosarcoma protuberante (DFSP); tumor desmoide; tumor desmoplásico de células redondas pequeñas; sarcoma epitelioide; condrosarcoma extraesquelético; osteosarcoma extraesquelético; fibrosarcoma; tumor estromal gastointestinal (GIST); hemangiopericitoma hemangiosarcoma (más comúnmente denominado "angiosarcoma"); sarcoma de Kaposi; leiomiosarcoma; liposarcoma; linfangiosarcoma; tumor maligno de la vaina del nervio periférico (MPNST); neurofibrosarcoma; sarcoma sinovial; sarcoma pleomórfico indiferenciado y similares).

[0109] Un teratoma es un tipo de tumor de células germinales que puede contener varios tipos diferentes de tejido (por ejemplo, puede incluir tejidos derivados de cualquier y/o todas las tres capas germinales: endodermo, mesodermo y ectodermo), incluyendo por ejemplo, cabello, músculos y huesos. Los teratomas ocurren con mayor frecuencia en los ovarios en las mujeres, los testículos en los hombres y el coxis en los niños.

[0110] El melanoma es una forma de cáncer que comienza en los melanocitos (células que producen el pigmento melanina). Puede comenzar en un lunar (melanoma cutáneo), pero también puede comenzar en otros tejidos pigmentados, como en el ojo o en los intestinos.

[0111] Las leucemias son cánceres que comienzan en el tejido formador de sangre, como la médula ósea, y provocan la producción de un gran número de células sanguíneas anormales que ingresan al torrente sanguíneo. Por ejemplo, las leucemias pueden originarse en células derivadas de la médula ósea que normalmente maduran en el torrente sanguíneo. Las leucemias se denominan por la rapidez con la que se desarrolla y progresa la enfermedad (p. ej., aguda frente a crónica) y por el tipo de glóbulo blanco afectado (p. ej., mieloide frente a linfoide). Las leucemias mieloides también se denominan leucemias mielógenas o mieloblásticas. Las leucemias linfoides también se denominan leucemia linfoblástica o linfocítica. Las células de leucemia linfoide pueden acumularse en los ganglios linfáticos, que pueden hincharse. Los ejemplos de leucemias incluyen, entre otros: leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC) y leucemia linfocítica crónica (LLC).

[0112] Los linfomas son cánceres que comienzan en células del sistema inmunológico. Por ejemplo, los linfomas pueden originarse en células derivadas de la médula ósea que normalmente maduran en el sistema linfático. Hay dos categorías básicas de linfomas. Un tipo es el linfoma de Hodgkin (LH), que se caracteriza por la presencia de un tipo de célula llamada célula de Reed-Sternberg. Actualmente hay 6 tipos reconocidos de LH. Los ejemplos de linfomas de Hodgkin incluyen: esclerosis nodular linfoma de Hodgkin clásico (LHC), LHC de celularidad mixta, LHC con depleción de linfocitos, LHC rico en linfocitos y LH con predominio de linfocitos nodulares.

[0113] La otra categoría de linfoma es linfomas no Hodgkin (LNH), que incluye un grupo grande y diverso de cánceres de las células del sistema inmune. Los linfomas no Hodgkin se pueden dividir en cánceres que tienen un curso indolente (de crecimiento lento) y aquellos que tienen un curso agresivo (de crecimiento rápido). Actualmente existen 61 tipos reconocidos de LNH. Los ejemplos de linfomas no Hodgkin incluyen, entre otros: linfomas relacionados con el SIDA, linfoma anaplásico de células grandes, linfoma angioinmunoblástico, linfoma blástico de células NK, linfoma de Burkitt, linfoma similar a Burkitt (linfoma de células pequeñas no escindidas), leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño, linfoma cutáneo de células T, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de células T de tipo enteropatía, linfoma folicular, linfomas de células T gamma-delta hepatoesplénico, leucemias de células T, linfoma linfoblástico, linfoma de células del manto, linfoma de zona marginal, linfoma nasal de células T, linfoma pediátrico, linfomas periféricos de células T, linfoma primario del sistema nervioso central, linfomas transformados, linfomas de células T relacionados con el tratamiento y macroglobulinemia de Waldenstrom.

[0114] Los cánceres de cerebro incluyen cualquier cáncer de los tejidos del cerebro. Los ejemplos de cánceres cerebrales incluyen, pero no se limitan a: gliomas (por ejemplo, glioblastomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, ependimomas, y similares), meningiomas, adenomas pituitarios, schwannomas vestibulares, tumores neuroectodérmicos primitivos (meduloblastomas), etc.

[0115] La "patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, crecimiento celular anormal o incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anormales, supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, premalignidad, malignidad, invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, tales como ganglios linfáticos, etc.

[0116] Como se usa en el presente documento, los términos "recurrencia del cáncer" y "recurrencia del tumor," y variantes gramaticales de los mismos, se refieren a un mayor crecimiento de células neoplásicas o cancerosas después del diagnóstico de cáncer. En particular, la recurrencia puede ocurrir cuando se produce un mayor crecimiento de células cancerosas en el tejido canceroso. La "diseminación del tumor", de manera similar, ocurre cuando las células de un tumor se diseminan hacia tejidos y órganos locales o distantes; por lo tanto, la diseminación del tumor incluye la metástasis del tumor. La "invasión tumoral" ocurre cuando el crecimiento del tumor se disemina localmente para comprometer la función de los tejidos involucrados por compresión, destrucción o prevención de la función normal del órgano.

[0117] Como se usa en este documento, el término "metástasis" se refiere al crecimiento de un tumor canceroso en una parte de órganos o cuerpo, que no está conectada directamente al órgano del tumor canceroso original. La metástasis se entenderá para incluir micrometástasis, que es la presencia de una cantidad indetectable de células cancerosas en un órgano o parte del cuerpo que no es directamente conectado con el órgano del tumor canceroso original. La metástasis también se puede definir como varios pasos de un proceso, como la salida de las células cancerosas del sitio del tumor original y la migración y/o invasión de las células cancerosas a otras partes del cuerpo.

[0118] Tal como se utiliza aquí, el término "infección" se refiere a cualquier estado en que al menos una célula de un organismo (es decir, un sujeto) está infectada por un agente infeccioso (por ejemplo, un sujeto tiene una infección de patógeno intracelular, por ejemplo, una infección crónica por patógenos intracelulares). Como se usa en este documento, el término "agente infeccioso" se refiere a una entidad biológica extraña (es decir, un patógeno) (por ejemplo, una que induce un aumento de la expresión de CD47 en al menos una célula del organismo infectado). Por ejemplo, los agentes infecciosos incluyen, pero no se limitan a, bacterias, virus, protozoos y hongos. Los patógenos intracelulares también son de interés. Las enfermedades infecciosas son trastornos causados por agentes infecciosos. Algunos agentes infecciosos no causan síntomas o enfermedades reconocibles bajo ciertas condiciones, pero tienen el potencial de causar síntomas o enfermedades bajo condiciones cambiantes. Los sujetos métodos se pueden utilizar en el tratamiento de infecciones por patógenos crónicas, por ejemplo incluyendo, pero no limitados a infecciones virales, por ejemplo, retrovirus, lentivirus, virus hepadna, herpes virus, virus de la viruela, virus del papiloma humano, etc.; infecciones bacterianas intracelulares, por ejemplo, Mycobacterium, Chlamydophila, Ehrlichia, Rickettsia, Brucella, Legionella, Francisella, Listeria, Coxiella, Neisseria, Salmonella, Yersinia sp, Helicobacter pylori, etc.; y protozoos patógenos intracelulares, por ejemplo, Plasmodium sp, Trypanosoma sp., Giardia sp., Toxoplasma sp., Leishmania sp., etc.

[0119] Las enfermedades infecciosas que pueden tratarse usando un agente de sujetos anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o el agente anti-CD47/SIRPA incluye pero no se limita a: VIH, influenza, herpes, giardia, malaria, leishmania, la infección patógena por el virus Hepatitis (A, B y C), virus del herpes (p. ej., VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II y CMV, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la influenza, flavivirus, echovirus, rinovirus, virus coxsackie, cornovirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral, infección patógena por las bacterias clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos y conococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, E. coli, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis, bacterias de la enfermedad de Lyme, infección patógena por hongos candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), criptococo neoformans, aspergillus (fumigatus, niger, etc.), género mucorales (mucor, absidia, rhizopus), sporothrix schenkii, blastomyces dermatitidis, paracoisidioiens, coccidioides immitis e histoplasma capsulatum, e infección patógena por los parásitos entamoeba histolytica, balantidium coli, naegleriafowleri, acanthamoeba sp., giardia lambia, criptosporidios sp., pneumocystis carinii, plasmodium vivax, babesia microti, trypanosoma brucei, trypanosoma cruzi, leishmania donovani, toxoplasma gondi, y/o nippostrongylus brasiliensis.

[0120] En algunas realizaciones, la inflexión es una infección crónica, es decir, una infección que no es eliminada por el sistema inmunológico del huésped en un período de hasta 1 semana, 2 semanas, etc. En algunos casos, las infecciones crónicas implican la integración de elementos patógenos genéticos en el genoma del huésped, por ejemplo, retrovirus, lentivirus, virus de la hepatitis B, etc. En otros casos, las infecciones crónicas, por ejemplo, ciertas bacterias intracelulares o patógenos protozoarios, son el resultado de una célula patógena que reside dentro de una célula huésped. Además, en algunas realizaciones, la infección se encuentra en una etapa latente, como con los virus del herpes o los virus del papiloma humano.

[0121] Una infección tratada con los métodos de la descripción implica generalmente un patógeno con al menos una parte de su ciclo de vida dentro de una célula huésped, es decir, una fase intracelular. Los métodos de la divulgación proporcionan una eliminación más eficaz de las células infectadas por las células fagocíticas del organismo huésped, en relación con la fagocitosis en ausencia de tratamiento, y por tanto están dirigidos a la fase intracelular del ciclo de vida del patógeno.

[0122] Los términos "co-administración", "coadministrar", y "en combinación con" incluyen la administración de dos o más agentes terapéuticos (por ejemplo, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA) ya sea de forma simultánea, concurrente o secuencial sin límites de tiempo específicos. En una realización, los agentes están presentes en la célula o en el cuerpo del sujeto al mismo tiempo o ejercen su efecto biológico o terapéutico al mismo tiempo. En una realización, los agentes terapéuticos están en la misma composición o forma de dosificación unitaria. En otras realizaciones, los agentes terapéuticos se encuentran en composiciones separadas o formas de dosificación unitaria. En ciertas realizaciones, se puede administrar un primer agente antes de (por ejemplo, minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), concomitantemente con o después (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas después) de la administración de un segundo agente terapéutico.

[0123] En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto y/o un agente anti-CD47/SIRPA (p. ej., formulado como una composición farmacéutica) se coadministra con un fármaco terapéutico contra el cáncer, fármaco terapéutico para tratar una infección o un anticuerpo dirigido contra un tumor. Tal administración puede implicar la administración concurrente (es decir, al mismo tiempo), anterior o posterior del fármaco/anticuerpo con respecto a la administración de un agente o agentes de la divulgación. Una persona con experiencia normal en la técnica no tendría dificultad para determinar el momento, la secuencia y las dosis de administración apropiadas para fármacos y composiciones particulares de la presente divulgación.

[0124] En algunas realizaciones, el tratamiento se lleva a cabo mediante la administración de una combinación (co­ administración) de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto (por ejemplo, con o sin un agente anti-CD47/SIRPA) con otro agente (por ejemplo, un estimulante inmune, un agente para tratar la infección crónica, un agente citotóxico, un agente anti-cáncer, etc.). Una clase de ejemplo de agentes citotóxicos que pueden usarse son los agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aldesleucina, altretamina, amifostina, asparaginasa, bleomicina, capecitabina, carboplatino, carmustina, cladribina, cisaprida, cisplatino, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, docetaxel, doxorubicina, dronabinol, duocarmicina, etopósido, filgrastim, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, granisetrón, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, interferón alfa, irinotecán, lansoprazol, levamisol, leucovorina, megestrol, mesna, metotrexato, metoclopramida, mitoprazolitaxel (Taxol™), pilocarpina, procloroperazina, rituximab, saproína, tamoxifeno, taxol, hidrocloruro de topotecán, trastuzumab, vinblastina, vincristina y tartrato de vinorelbina.

[0125] No es necesario que un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA se formulen, opcionalmente, con uno o más agentes que potencien la actividad, o que de otro modo aumenten el efecto terapéutico. Estos se usan generalmente en las mismas dosis y con las vías de administración que se usan en este documento o del 1 al 99% de las dosis empleadas hasta ahora. En algunas realizaciones, el tratamiento se logra mediante la administración de una combinación (coadministración) de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto y un agente que opsoniza una célula diana. En algunas realizaciones, el tratamiento se logra administrando una combinación (coadministración) de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, un agente que opsoniza una célula diana y un agente anti-CD47/SIRPA. En algunas realizaciones, el tratamiento se logra mediante la administración de una combinación (coadministración) de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto y un agente anti-CD47/SIRPA. Por tanto, también se contemplan en la presente composiciones (y métodos que usan las composiciones) que incluyen: (a) un agente anti-CMH Clase I/LILRB1; y (b) al menos uno de: (i) un agente que opsoniza la célula diana, y (ii) un agente anti-CD47/SIRPA. En algunos casos, el agente que opsoniza la célula diana es el rituximab. En algunos casos, el agente que opsoniza la célula diana es Cetuximab.

[0126] Un "agente que opsoniza una célula diana" (un "agente opsonizante") es cualquier agente que puede unirse a una célula diana (por ejemplo, una célula de cáncer, una célula que alberga un patógeno intracelular, etc.) y opsonizar la célula diana. Por ejemplo, cualquier anticuerpo que pueda unirse a una célula diana (como se define en el presente documento), donde el anticuerpo tiene una región f C, se considera un agente que opsoniza una célula diana. En algunos casos, el agente que opsoniza una célula diana es un anticuerpo, que no es un anticuerpo anti-CD47, que se une a una célula diana (p. ej., un anticuerpo anti-tumor, un anticuerpo anti-cáncer, un anticuerpo anti-infección, y similares).

[0127] Por ejemplo, anticuerpos selectivos para marcadores de células tumorales, radiación, cirugía y/o privación hormonal, véase Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU., 96: 15074-9, 1999. Los inhibidores de la angiogénesis también pueden combinarse con los métodos de la divulgación. Actualmente, varios anticuerpos están en uso clínico para el tratamiento del cáncer y otros se encuentran en distintas etapas de desarrollo clínico. Por ejemplo, hay varios antígenos y los correspondientes anticuerpos monoclonales para el tratamiento de las neoplasias malignas de las células B. Un antígeno diana es CD20. El rituximab es un anticuerpo monoclonal quimérico no conjugado dirigido al antígeno CD20. CD20 tiene un papel funcional importante en la activación, proliferación y diferenciación de las células B. El antígeno CD52 está dirigido por el anticuerpo monoclonal alemtuzumab, que está indicado para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica. El CD22 es el objetivo de varios anticuerpos y recientemente ha demostrado su eficacia combinada con la toxina en la leucemia de células pilosas resistente a la quimioterapia. Se han presentado a la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) dos nuevos anticuerpos monoclonales dirigidos a CD20, tositumomab e ibritumomab. Estos anticuerpos se conjugan con radioisótopos. Alemtuzumab (Campath) se usa en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica; El gemtuzumab (Mylotarg) se utiliza en el tratamiento de la leucemia mielógena aguda; Ibritumomab (Zevalin) encuentra uso en el tratamiento del linfoma no Hodgkin; Panitumumab (Vectibix) encuentra uso en el tratamiento del cáncer de colon.

[0128] Los anticuerpos monoclonales útiles en los métodos de la invención que se han utilizado en los tumores sólidos se incluyen, sin limitación, edrecolomab y trastuzumab (Herceptin). Edrecolomab se dirige al antígeno 17-1A que se observa en el cáncer de colon y recto y ha sido aprobado para su uso en Europa para estas indicaciones. Trastuzumab se dirige al antígeno HER-2/neu. Este antígeno se ve en el 25% al 35% de los cánceres de mama. Cetuximab (Erbitux) también es de interés para su uso en los métodos de la invención. El anticuerpo se une al receptor de EGF (EGFR) y se ha utilizado en el tratamiento de tumores sólidos, incluido el cáncer de colon y el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN).

[0129] Un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto se puede combinar (con o sin un agente anti-CD47/SIRPA) cualquier de los anteriores anticuerpos mencionados (agentes que opsonizan una célula diana). Por lo tanto, en algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, por ejemplo, un agente que se une específicamente al CMH Clase I clásico (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1) y/o un agente que específicamente se une a LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble de CMH Clase I), se usa en una terapia de combinación (se coadministra) con uno o más anticuerpos específicos de células selectivos para marcadores de células tumorales. En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, por ejemplo, un agente que se une específicamente al CMH Clase I clásico (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1) y/o un agente que se une específicamente a LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRBI, un complejo soluble de CMH Clase I), se usa en una terapia de combinación (se coadministra) con un agente anti-CD47/SIRPA y uno o más anticuerpos específicos de células selectivos para marcadores de células tumorales.

[0130] En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, por ejemplo, un agente que se une específicamente CMH Clase I clásico (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1) y/o un agente que se une específicamente LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble de CMH Clase I), se utiliza en una terapia de combinación (es co-administrado) con uno o más de: cetuximab (se une EGFR), panitumumab (se une a EGFR), rituximab (se une a CD20), trastuzumab (se une a HER2), pertuzumab (se une a HER2), alemtuzumab (se une a CD52), brentuximab (se une a CD30), tositumomab, ibritumomab, gemtuzumab, ibritumomab y edrecolomab (se une a 17-1A).

[0131] En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, por ejemplo, un agente que se une específicamente CMH Clase I clásico (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1) y/o un agente que se une específicamente a LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble de CMH Clase I), se usa en una terapia de combinación (se coadministra) con un agente anti-CD47/SIRPA y uno o más de: cetuximab (se une a EGFR), panitumumab (se une a EGFR), rituximab (se une a CD20), trastuzumab (se une a HER2), pertuzumab (se une a HER2), alemtuzumab (se une a CD52), brentuximab (se une a CD30), tositumomab, ibritumomab, gemtuzumab, e ibritumomab (se une a 17-1A).

[0132] En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, por ejemplo, un agente que se une específicamente CMH Clase I clásico (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1) y/o un agente que se une específicamente a LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble de CMH Clase I), se usa en una terapia de combinación (se coadministra) con uno o más agentes que se unen específicamente a uno o más de: CD19, CD20, CD22, CD24, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44, CD52, CD56, CD70, CD96, CD97, CD99, CD123, CD279 (PD-1), CD274 (PD-L1), EGFR, 17-1A, HER2, CD117, CMet, PTHR2 y HAVCR2 (TIM3).

[0133] En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, por ejemplo, un agente que se une específicamente CMH Clase I clásico (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1) y/o un agente que se une específicamente a LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble de CMH Clase I), se usa en una terapia de combinación (se coadministra) con un agente anti-CD47/SIRPA y uno o más agentes que se unen específicamente a uno o más de: CD19, CD20, CD22, CD24, CD25, CD30, CD33, CD38, CD44, CD52, CD56, CD70, CD96, CD97, CD99, CD123, CD279 (PD-1), CD274 (PD-L1), EGFR, 17-1A, HER2, CD117, C-Met, PTHR2 y HAVCR2 (TIM3).

[0134] En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, por ejemplo, un agente que se une específicamente CMH Clase I clásico (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1) y/o un agente que se une específicamente a LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble CMH Clase I), se usa en una terapia de combinación (se coadministra) con cualquier agente inmunomodulador conveniente (por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA4, un anti-PD- 1, un anticuerpo anti-PD-L1, un agonista de CD40, un modulador 4-1BB (por ejemplo, un agonista 41BB) y similares).

[0135] En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, por ejemplo, un agente que se une específicamente al CMH Clase I clásico (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1) y/o un agente que específicamente se une a LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble de CMH Clase I), se usa en una terapia de combinación (se coadministra) con un agente anti-CD47/SIRPA y cualquier agente inmunomodulador conveniente (por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1, un agonista de CD40, un modulador 4-1BB (por ejemplo, un agonista 41BB) y similares).

[0136] En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, por ejemplo, un agente que se une específicamente CMH Clase I clásico (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1) y/o un agente que se une específicamente a LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble de CMH Clase I), se usa en una terapia de combinación (se coadministra) con un inhibidor de BTLA y/o Cd 160.

[0137] En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, por ejemplo, un agente que se une específicamente al CMH Clase I clásico (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1) y/o un agente que específicamente se une a LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble de CMH Clase I), se usa en una terapia de combinación (se coadministra) con un agente anti-CD47/SIRPA y un inhibidor de BTLA y/o CD160.

[0138] En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, por ejemplo, un agente que se une específicamente CMH Clase I clásico (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1) y/o un agente que se une específicamente a LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble de CMH Clase I), se usa en una terapia de combinación (se coadministra) con un inhibidor de TIM3 y/o CEACAM1.

[0139] En algunos casos, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, por ejemplo, un agente que se une específicamente al CMH Clase I clásico (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH Clase I, un péptido LILRB1) y/o un agente que específicamente se une a LILRB1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LILRB1, un complejo soluble de CMH Clase I), se usa en una terapia de combinación (se coadministra) con un agente anti-CD47/SIRPA y un inhibidor de TIM3 y/o CEACAM1.

[0140] El tratamiento también se puede combinar con otros agentes activos, tales como antibióticos, citocinas, agentes antivirales, etc. Las clases de antibióticos incluyen penicilinas, por ejemplo, penicilina G, penicilina V, meticilina, oxacilina, carbenicilina, nafcilina, ampicilina, etc.; penicilinas en combinación con beta inhibidores de betalactamasa, cefalosporinas, por ejemplo cefaclor, cefazolina, cefuroxima, moxalactam, etc.; carbapenémicos; monobactamas; aminoglucósidos; tetraciclinas; macrólidos; lincomicinas; polimixinas; sulfonamidas; quinolonas; cloranfénico; metronidazol; espectinomicina; trimetoprima; vancomicina; etc. citoquinas pueden también ser incluidos, por ejemplo, el interferón y, el factor de necrosis tumoral a, interleuquina 12, etc. Los agentes antivirales, por ejemplo aciclovir, ganciclovir, etc., también pueden usarse en el tratamiento.

[0141] Una "dosis terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéutica" es una cantidad suficiente para efectuar resultados clínicos deseados (es decir, conseguir la eficacia terapéutica). Puede administrarse una dosis terapéuticamente eficaz en una o más administraciones. Para los propósitos de esta divulgación, una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente antiCD47/SIRPA es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, ralentizar o retrasar la progresión del estado de enfermedad (por ejemplo, cáncer o infección crónica) aumentando la fagocitosis de una célula diana (por ejemplo, una célula diana). Por tanto, una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA reduce la unión de (i) CMH en una célula diana, a LILRB1 en una célula fagocítica; y/o (ii) CD47 en una célula diana, a SIRPA en una célula fagocítica; a una dosis eficaz para aumentar la fagocitosis de la célula diana.

[0142] En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz conduce a los niveles séricos sostenidos de un anti-CMH de clase agente I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH y/o un anticuerpo anti-CD47) de 40 pg/ml o más (por ejemplo, 50 ug/ml o más, 60 ug/ml o más, 75 ug/ml o más, 100 ug/ml o más, 125 ug/ml o más, o 150 ug/ml o más) para cada agente. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz conduce a niveles séricos sostenidos de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH y/o un anticuerpo anti-CD47) que van de 40 pg/ml a 300 ug/ml (por ejemplo, de 40 ug/ml a 250 ug/ml, de 40 ug/ml a 200 ug/ml, de 40 ug/ml a 150 ug/ml, de 40 ug/ml a 100 ug/ml, de 50 ug/ml a 300 ug/ml, de 50 ug/ml a 250 ug/ml, de 50 ug/ml a 200 ug/ml, de 50 ug/ml a 150 ug/ml, de 75 ug/ml a 300 ug/ml, de 75 ug/ml a 250 ug/ml, de 75 ug/ml a 200 ug/ml, de 75 ug/ml a 150 ug/ml, de 100 ug/ml a 300 ug/ml, de 100 ug/ml a 250 ug/ml, o de 100 ug/ml a 200 ug/ml) para cada agente. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz para tratar tumores sólidos conduce a niveles séricos sostenidos de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH y/o un anticuerpo anti-CD47) de 100 pg/ml o más (por ejemplo, niveles séricos sostenidos que oscilan entre 100 ug/ml y 200 ug/ml) para cada agente. En algunas realizaciones, una dosis terapéuticamente eficaz para tratar tumores no sólidos (por ejemplo, leucemia mieloide aguda (LMA)) conduce a niveles séricos sostenidos de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente antiCD47/SIRPA (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMH y/o un anticuerpo anti-CD47) de 50 pg/ml o más (p. ej., niveles séricos sostenidos de 75 pg/ml o más; o niveles séricos sostenidos que oscilan entre 50 ug/ml a 150 ug/ml) para cada agente.

[0143] Por consiguiente, una única dosis terapéuticamente eficaz o una serie de dosis terapéuticamente eficaces podrían alcanzar y mantener un nivel sérico de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA. Una dosis terapéuticamente eficaz de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA puede depender del agente específico utilizado, pero normalmente es de 8 mg/kg de peso corporal o más (p. ej., 8 mg/kg o más, 10 mg/kg o más, 15 mg/kg o más, 20 mg/kg o más, 25 mg/kg o más, 30 mg/kg o más, 35 mg/kg o más, o 40 mg/kg o más) para cada agente, o de 10 mg/kg a 40 mg/kg (por ejemplo, de 10 mg/kg a 35 mg/kg, o de 10 mg/kg a 30 mg/kg) para cada agente. La dosis requerida para alcanzar y/o mantener un nivel en suero particular es proporcional a la cantidad de tiempo entre dosis e inversamente proporcional al número de dosis administradas. Por tanto, a medida que aumenta la frecuencia de dosificación, disminuye la dosis requerida. La optimización de las estrategias de dosificación será fácilmente comprendida y practicada por un experto en la técnica. Para todas las dosis terapéuticamente eficaces enumeradas anteriormente, cuando se utilizan tanto un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 como un agente anti-CD47/SIRPA, la dosis para cada agente puede ser independiente del otro agente. Como ejemplo ilustrativo (para ilustrar la independencia de las dosis), una dosis terapéutica del agente anti-CMH Clase I/LILRB1 puede ser de 75 ug/ml a 250 ug/ml mientras que una dosis terapéutica del agente anti-CD47/SIRPA puede ser de 40 ug/ml a 100 ug/ml.

[0144] La dosis y la frecuencia pueden variar dependiendo de la vida media del agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o agente antiCD47/SIRPA en el paciente. Un experto en la técnica entenderá que dichas pautas se ajustarán al peso molecular del agente activo, por ejemplo, en el uso de fragmentos de anticuerpos, en el uso de conjugados de anticuerpos, en el uso de agentes anti-CMH Clase I/LILRB1, en el uso de agentes anti-CD47/SIRPA, etc. La dosis también puede variarse para la administración localizada, por ejemplo, intranasal, inhalación, etc., o para la administración sistémica, por ejemplo, i.m., i.p., i.v. y similares.

[0145] Una dosis sub-terapéutica es una dosis (es decir, una cantidad) que no es suficiente para efectuar los resultados clínicos deseados cuando se usa en un contexto particular. Por ejemplo, una dosis subterapéutica de un agente anti-CD47/SIRPA es una cantidad que no es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, ralentizar o retrasar la progresión del estado patológico (p. ej., cáncer, infección, inflamación, etc.). Sin embargo, en algunos casos, cuando se usa una dosis subterapéutica de un agente anti-CD47/SIRPA en combinación con (coadministrado con) un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, la dosis puede convertirse en una dosis terapéutica. En otras palabras, en algunos casos, una dosis dada de un agente anti-CD47/SIRPA puede ser subterapéutica cuando se usa en ausencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, pero terapéutica cuando se usa en presencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1. Agente anti-CMH Clase I/LILRB1. Por lo tanto, en algunos casos, un agente anti-CD47/SIRPA puede coadministrarse con un agente anti-CMH Clase I/LILRB1, donde la dosis del agente anti-CD47/SIRPA sería subterapéutica (p. ej. la dosis del agente anti-CD47/SIRPA sería subterapéutica cuando se usa en ausencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1. En algunos casos, es deseable usar una dosis subterapéutica de un agente anti-CD47/SIRPA en combinación con un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto. En algunos casos, una dosis subterapéutica de un agente anti-CD47/SIRPA (subterapéutico cuando se usa en ausencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1) es una dosis terapéutica cuando el agente se usa en combinación (co-administrado) con un agente anti-CMH Clase I/LILRB1.

[0146] Mientras que el uso de una dosis sub-terapéutica de un agente anti-CD47/SIRPA en combinación con un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 logra un resultado deseado (por ejemplo, la combinación es terapéutica), la dosis no se considera una "dosis terapéutica" porque la dosis subterapéutica no aumenta eficazmente la fagocitosis de una célula diana y no es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, ralentizar o retrasar la progresión del estado de la enfermedad, a menos que se use en combinación con un agente anti-CMH Clase I/LILRB1. Una dosis subterapéutica de un agente anti-CD47/SIRPA puede depender del agente específico utilizado, pero en algunos casos es inferior a 10 mg/kg.

[0147] En algunos casos, es deseable una dosis subterapéutica de un agente anti-CD47/SIRPA porque algunos agentes anti-CD47/SIRPA, cuando se usan en una dosis suficientemente alta, pueden causar una reducción de los glóbulos rojos en un individuo en tratamiento. Por lo tanto, en algunos casos, la coadministración con un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 permite que el agente anti-CD47/SIRPA se use en una dosis que reduce la pérdida potencial de glóbulos rojos, pero que de otra manera se consideraría una dosis subterapéutica. Como tal, una coadministración puede evitar la reducción de células sanguíneas.

[0148] Un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA se pueden administrar por cualesquiera vías adecuadas, incluyendo la tópica, oral, parenteral, intrapulmonar e intranasal. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa (bolo o goteo lento), intraarterial, intraperitoneal, intratecal o subcutánea. Se puede administrar un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA de cualquier manera que sea médicamente aceptable. Esto puede incluir inyecciones, por vías parenterales tales como intravenosa, intravascular, intraarterial, subcutánea, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural u otras, así como oral, nasal, oftálmica, rectal o tópica. La administración de liberación sostenida también se incluye específicamente en la divulgación, por medios tales como inyecciones de depósito o implantes erosionables. Se contempla particularmente la administración localizada, por medios tales como la administración a través de un catéter a una o más arterias, como la arteria renal o un vaso que irriga un tumor localizado. Como se señaló anteriormente, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA se pueden formular con un vehículo farmacéuticamente aceptable (uno o más ingredientes orgánicos o inorgánicos, naturales o sintéticos, con los que se encuentra un agente sujeto combinados para facilitar su aplicación). Un vehículo adecuado incluye solución salina estéril, aunque los expertos en la técnica conocen otras soluciones y suspensiones estériles isotónicas acuosas y no acuosas que se sabe que son farmacéuticamente aceptables. Una "cantidad eficaz" se refiere a aquella cantidad que es capaz de mejorar o retrasar la progresión de la afección enferma, degenerativa o dañada. Se puede determinar una cantidad eficaz de forma individual y se basará, en parte, en la consideración de los síntomas a tratar y los resultados buscados. Una cantidad eficaz puede ser determinada por un experto en la técnica empleando tales factores y utilizando únicamente experimentación rutinaria.

[0149] Un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA se administra a menudo como una composición farmacéutica que comprende un agente terapéutico activo y otro excipiente farmacéuticamente aceptable. La forma preferida depende del modo de administración y aplicación terapéutica previstos. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, vehículos o diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos comúnmente usados para formular composiciones farmacéuticas para administración animal o humana. El diluyente se selecciona de manera que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros vehículos, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.

[0150] En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden también incluir macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos tales como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (tales como sefarosa funcionalizada con látex™, agarosa, celulosa, y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados lipídicos (como gotas de aceite o liposomas).

[0151] Un portador puede portar los agentes de diversas formas, que incluyen enlaces covalentes directamente o mediante un grupo enlazador y asociaciones no covalentes. Los vehículos de enlace covalente adecuados incluyen proteínas tales como albúminas, péptidos y polisacáridos tales como aminodextrano, cada uno de los cuales tiene múltiples sitios para la unión de restos. Un vehículo también puede portar un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA por asociaciones no covalentes, tales como enlaces no covalentes o por encapsulación. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble para los fines de la invención. Los expertos en la técnica conocerán otros vehículos adecuados para unir agentes anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o agentes anti-CD47/SIRPA, o podrán determinarlos usando experimentación rutinaria.

[0152] Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecidimetilbencilo amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilo parabenos tales como metilo o propilo parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de proteína Zn); y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones que se utilizarán para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

[0153] Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).

[0154] Los portadores y enlazadores específicos para agentes radionúclidos incluyen moléculas pequeñas radiohalogenadas y compuestos quelantes. Puede formarse un quelato de radionúclido a partir de compuestos quelantes que incluyen los que contienen átomos de nitrógeno y azufre como átomos donantes para unir el radionúclido de metal, u óxido de metal.

[0155] Los restos radiográficos para usar como restos de formación de imágenes incluyen compuestos y quelatos con átomos relativamente grandes, tales como oro, iridio, tecnecio, bario, talio, yodo y sus isótopos. Se prefiere que se utilicen restos de formación de imágenes radiográficas menos tóxicos, tales como yodo o isótopos de yodo. Dichos restos se pueden conjugar con el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA a través de un engarce químico o vehículo de quelación aceptable. Los restos emisores de positrones incluyen 18F, que pueden conjugarse fácilmente mediante una reacción de fluoración con el agente anti-CMH Clase I/LILRBl y/o un agente anti-CD47/SIRPA.

[0156] Las composiciones se pueden preparar como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas o micropartículas tales como polilactida, poliglicólido o copolímero para mejorar el efecto adyuvante, como se discutió anteriormente. Langer, Science 249: 1527, 1990 y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Los agentes de esta invención pueden administrarse en forma de inyección de depósito o preparación de implante que se puede formular de tal manera que para permitir una liberación sostenida o pulsátil del ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas se formulan generalmente como estériles, sustancialmente isotónicas y en total conformidad con todas las regulaciones de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos.

[0157] La toxicidad de los agentes anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o agentes anti-CD47/SIRPA puede determinarse por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la LD50 (la dosis letal para 50% de la población) o la LD100 (la dosis letal para el 100% de la población). La relación de dosis entre el efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para optimizar y/o definir aún más un intervalo de dosificación terapéutica y/o un intervalo de dosificación subterapéutico (por ejemplo, para uso en humanos). El médico individual puede elegir la formulación, la vía de administración y la dosificación exactas en función del estado del paciente.

[0158] En algunos casos, un método para inducir la fagocitosis de una célula diana, tratando un individuo que tiene cáncer, tratando un individuo que tiene una infección de patógeno intracelular (por ejemplo, una infección crónica), y/o reduciendo el número de células infligidas (por ejemplo, células cancerosas, células infectadas con un patógeno intracelular, etc.) en un individuo, incluye, como se describe a continuación, predecir si un individuo es resistente o susceptible al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA.

Métodos de predicción

[0159] Como se discutió anteriormente, en algunos casos, una célula diana (incluso una que expresó CD47) es relativamente resistente a un agente anti-CD47/SIRPA, lo que significa que la célula diana es menos susceptible a la fagocitosis por una célula fagocítica (por ejemplo, un macrófago), incluso cuando la célula diana se pone en contacto con una célula fagocítica en presencia de un agente anti-CD47/SIRPA. Como tal, en algunos casos, un individuo (por ejemplo, un individuo que tiene células infligidas, por ejemplo, células cancerosas y/o células infectadas) puede ser relativamente resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA. También como se describe anteriormente, y como se describe a continuación en los ejemplos de trabajo, los inventores han descubierto que el nivel de expresión de CMH Clase I (p. ej., CMH Clase I clásico) por una célula infligida (p. ej., en la superficie celular) puede utilizarse para predecir si una célula diana (y por lo tanto si un individuo) es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA. En este contexto, la resistencia al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA se refiere al tratamiento en ausencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 sujeto, porque los inventores han descubierto que ponerse en contacto con una célula diana (por ejemplo, una célula diana que es resistente al tratamiento con un agente antiCD47/SIRPA) con un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 puede vencer la resistencia.

[0160] Los términos "resistencia" y "resistentes" (usados en el presente documento cuando se refiere a la resistencia a un agente anti-CD47/SIRPA) se utiliza aquí para referirse a células diana que exhiben una disminución en la susceptibilidad a la fagocitosis (en el presente de un agente anti-CD47/SIRPA) en comparación con otras células. Por ejemplo, aunque muchas células cancerosas son negativas (o expresan niveles bajos) de CMH Clase I (p. ej., CMH Clase I clásico), algunas células cancerosas son positivas para c Mh Clase I (p. ej., CMH Clase I clásico). Las células diana (p. ej., células cancerosas) pueden expresar CMH Clase I (p. ej., CMH Clase I clásico) en un intervalo de niveles. Por ejemplo, algunas células diana expresan más CMH Clase I (p. ej., CMH Clase I clásico) que otras, pero aún expresan menos células que las normales. Algunas células diana expresan niveles normales de CMH Clase I. Los inventores han descubierto que el nivel de CMH Clase I expresado por una célula diana se correlaciona con su susceptibilidad a la fagocitosis por una célula fagocítica (por ejemplo, un macrófago). Por lo tanto, cuando se usa el término "resistencia" o "resistente", no significa necesariamente que las células no se puedan fagocitar, pero sí significa que las células no se fagocitan tan eficientemente como otras células (por ejemplo, una proporción menor de células de una población de células puede fagocitarse, por ejemplo, durante un período de tiempo dado, en comparación con otras células).

[0161] En algunas realizaciones, una célula diana que es resistente a tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA exhibe una eficiencia fagocitosis que es 95% o menos (por ejemplo, 90% o menos, 85% o menos, 80% o menos, 75% o menos, 70% o menos, 65% o menos, 60% o menos, 55% o menos, 50% o menos, 45% o menos, 50% o menos, 45% o menos, 40% o menos, 35% o menos, 30% o menos, 25% o menos, 20% o menos, 15% o menos, o 10% o menos) de la eficiencia de fagocitosis exhibida por una célula de control (por ejemplo, una población de células de control). En este contexto, una célula de control puede ser cualquier célula diana que exprese CD47 y se fagocita cuando se pone en contacto con: (i) una célula fagocítica (por ejemplo, un macrófago) y (ii) un agente anti-CD47/SIRPA. Por ejemplo, en algunos casos, una célula de control en este contexto es una línea de células cancerosas que se sabe que es susceptible a un agente anti-CD47/SIRPA. Los expertos en la técnica conocerán los ensayos para determinar la eficacia de la fagocitosis y se puede utilizar cualquier ensayo conveniente. Por ejemplo, vea los ejemplos de trabajo a continuación (por ejemplo, vea la Fig. 1B). Como tal, se puede predecir que un individuo será resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA cuando una célula diana exhibe un nivel de expresión de CMH Clase I que está por encima de un umbral particular (que se puede determinar comparando el nivel de expresión medido con un nivel medido de una célula de control que es susceptible de tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA.

[0162] En algunas realizaciones, una célula diana (o un individuo) se prevé que sea susceptible a un agente anti-CD47/SIRPA cuando la célula diana expresa 95% o menos (por ejemplo, 90% o menos, 85% o menos, 80% o menos, 75% o menos, 70% o menos, 65% o menos, 60% o menos, 55% o menos, 50% o menos, 45% o menos, 50% o menos, 45% o menos, 40% o menos, 35% o menos, 30% o menos, 25% o menos, 20% o menos, 15% o menos, o 10% o menos) CMH Clase I expresado por una célula de control (por ejemplo, una célula normal). En algunos casos, se predice que una célula diana (o un individuo) será resistente a un agente anti-CD47/SIRPA cuando la célula diana expresa 1,1 veces o más (por ejemplo, 1,2 veces o más, 1,3 veces o más, 1,4 veces o más, 1,5 veces o más, 1,6 veces o más, 1,7 veces o más, 1,8 veces o más, 1,9 veces o más, 2 veces o más, 2,1 veces o más, 2,5 veces veces o más, 3 veces o más, 4 veces o más, 5 veces o más, etc.) CMH Clase I en comparación con una célula de control (p. ej., una célula CMH Clase I negativa, una célula que expresa niveles bajos de CMH Clase I, pero se sabe que es susceptible y similares) o se compara con un valor de fondo.

[0163] Los métodos para predecir si las células diana son (o un individuo) resistentes o susceptibles al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA incluyen el paso de medir el nivel de expresión del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) Clase I en una muestra biológica del individuo (por ejemplo, cuando la muestra biológica comprende una célula infligida tal como una célula cancerosa o una célula que alberga un patógeno intracelular), para producir un valor de prueba medido. El valor de prueba medido se puede comparar con un valor de control. En algunos casos, el valor se mide para células individuales (p. ej., usando citometría de flujo).

[0164] En algunos casos, cuando el valor de la prueba medida es mayor que o igual que el valor de control, se hace una predicción de la resistencia (y cuando el valor de la prueba medida es menor que el valor de control, se hace una predicción de susceptible). El valor de control puede ser un valor predeterminado o puede ser un valor que se mide aproximadamente al mismo tiempo que se mide el valor de prueba. En algunos casos, el valor de control es un valor de expresión que se sabe que está asociado con un fenotipo de resistencia a un agente anti-CD47/SIRPA. Como tal, cuando el valor de prueba medido es igual o mayor que este valor, se puede hacer una predicción de la resistencia. Tal valor de control (uno que se sabe que está asociado con un fenotipo de resistencia a un agente anti-CD47/SIRPA) puede ser un valor medido a partir de una célula infligida que se sabe que exhibe un fenotipo de resistencia.

[0165] En algunos casos, cuando el valor de la prueba medida es mayor que el valor de control, se hace una predicción de la resistencia (y cuando el valor de la prueba medida es menor o igual que el valor de control, se hace una predicción de susceptible). El valor de control puede ser un valor predeterminado o puede ser un valor que se mide en o aproximadamente al mismo tiempo que se mide el valor de prueba. En algunos casos, el valor de control es un valor que representa el valor de fondo del paso de medición (por ejemplo, el experimento en donde se realizó la medición). Por ejemplo, en algunos casos, para que una célula muestre un fenotipo de resistencia, la célula solo necesita ser positiva para CMH Clase I (por ejemplo, CMH Clase I clásico).

[0166] Por lo tanto, en algunos casos, un método de predecir si una célula diana (o un individuo) es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA incluye medir el nivel de expresión de Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) de clase I (por ejemplo, en una muestra biológica del individuo que contiene una célula infligida), determinando que la célula diana (o una célula infligida del individuo) es positiva para CMH Clase I (p. ej., CMH Clase I clásico) y prediciendo que la célula diana (o individuo) es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA. En algunos casos, un método para predecir si una célula diana (o un individuo) es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA incluye medir el nivel de expresión del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) Clase I (p. ej., en una muestra biológica del individuo que contiene una célula infligida), determinando que la célula diana (o una célula infligida del individuo) expresa un mayor nivel de CMH Clase I (p. ej., CMH Clase I clásico) en comparación con un valor de control, y prediciendo que la célula diana (o el individuo) es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA.

[0167] En algunos casos, el nivel de expresión de CMH Clase I es predictivo de cuán resistente es una célula (o un individuo) a un agente anti-CD47/SIRPA. Por lo tanto, en algunos casos, el método es un método para predecir el nivel de resistencia de una célula diana (o un individuo) al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA, y el método puede incluir: medir el nivel de expresión de Complejo de Histocompatibilidad Mayor (CMH) Clase I (p. ej., en una muestra biológica del individuo que contiene una célula infligida), comparar el nivel medido de CMH Clase I con un valor de control y predecir ese nivel de resistencia de la célula diana (o individuo) al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA.

[0168] En algunos casos, un método para predecir si una célula diana (o un individuo) es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA incluye medir el nivel de expresión del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) Clase I (por ejemplo, en una muestra biológica del individuo que contiene una célula infligida), determinando que la célula diana (o una célula infligida del individuo) es negativa para CMH Clase I (p. ej., CMH Clase I clásico), y prediciendo que la célula diana (o individuo) no es resistente (es decir, es susceptible a) tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA. En algunos casos, un método para predecir si una célula diana (o un individuo) es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA incluye medir el nivel de expresión del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) Clase I (p. ej., en una muestra biológica del individuo que contiene una célula infligida), determinando que la célula diana (o una célula infligida del individuo) expresa un nivel reducido de CMH Clase I (p. ej., CMH Clase I clásico) en comparación con un valor de control, y prediciendo que la célula diana (o el individuo) no es resistente (es decir, es susceptible) al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA.

[0169] En algunos casos, cuando se hace una predicción de la resistencia, el método incluye además el tratamiento de la persona (es decir, poner en contacto la(s) célula(s) diana(s)) con un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA (por ejemplo, coadministración al individuo, contacto de la célula diana con una célula fagocítica in vitro en presencia de un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y un agente anti-CD47/SIRPA, etc.).

[0170] Los términos "determinación", "medición", "evaluación", "valorización", "ensayar", y "analizar' se utilizan indistintamente en este documento para referirse a cualquier forma de medición, y incluir la determinación de si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas. La medición puede ser relativa o absoluta. Por ejemplo, "medir" puede ser determinar si el nivel de expresión es menor o "mayor o igual que" un umbral particular (el umbral puede predeterminarse o puede determinarse analizando una muestra de control). Por otro lado, "medir para determinar el nivel de expresión" puede significar determinar un valor cuantitativo (usando cualquier métrica conveniente) que represente el nivel de expresión (es decir, el nivel de expresión, p. ej., la cantidad de proteína y/o ARN, p. ej., ARNm) de un biomarcador particular. El nivel de expresión puede expresarse en unidades arbitrarias asociadas con un ensayo en particular (por ejemplo, unidades de fluorescencia, por ejemplo, intensidad de fluorescencia media (IFM)), o puede expresarse como un valor absoluto con unidades definidas (por ejemplo, número de transcripciones de ARNm, número de moléculas de proteína, concentración de proteína, etc.). Además, el nivel de expresión de un biomarcador se puede comparar con el nivel de expresión de uno o más genes adicionales (por ejemplo, ácidos nucleicos y/o sus proteínas codificadas) para derivar un valor normalizado que representa un nivel de expresión normalizado. La métrica (o unidades) específicas elegidas no es crucial siempre que se utilicen las mismas unidades (o se realice la conversión a las mismas unidades) al evaluar múltiples muestras biológicas del mismo individuo (por ejemplo, muestras biológicas tomadas en diferentes puntos en el tiempo de el mismo individuo). Esto se debe a que las unidades se cancelan cuando se calcula un cambio de veces en el nivel de expresión de una muestra biológica a la siguiente (por ejemplo, muestras biológicas tomadas en diferentes momentos del mismo individuo).

[0171] El término "medición" se usa en este documento para incluir los pasos físicos de manipular una muestra biológica para generar datos relacionados con la muestra. Como comprenderá fácilmente un experto en la técnica, se debe "obtener" una muestra biológica antes de analizar la muestra. Por tanto, el término "medir" implica que se ha obtenido la muestra. Los términos "obtenido" u "obteniendo" como se usan en este documento abarcan el acto de recibir una muestra biológica extraída o aislada. Por ejemplo, una instalación de análisis puede "obtener" una muestra biológica por correo (o mediante entrega, etc.) antes de analizar la muestra. En algunos de estos casos, la muestra biológica fue "extraída" o "aislada" de un individuo por otra parte antes de enviarla por correo (es decir, entrega, transferencia, etc.), y luego "obtenida" por el centro de pruebas al llegar la muestra. Por lo tanto, una instalación de prueba puede obtener la muestra y luego analizarla, produciendo así datos relacionados con la muestra. En algunos casos, el nivel de expresión medido de CMH Clase I se normaliza (por ejemplo, a un control experimental interno).

[0172] Los términos "obtenidos" o "obtención" como se usa en el presente documento también pueden incluir la extracción física o aislamiento de una muestra biológica de un sujeto. Por consiguiente, una muestra biológica puede ser aislada de un sujeto (y por tanto "obtenida") por la misma persona o misma entidad que posteriormente analiza la muestra. Cuando una muestra biológica es "extraída" o "aislada" de una primera parte o entidad y luego transferida (por ejemplo, entregada, enviada por correo, etc.) a una segunda parte, la muestra fue "obtenida" por la primera parte (y también "aislada" por la primera parte), y luego posteriormente "obtenida" (pero no "aislada") por la segunda parte. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el paso de obtener no comprende el paso de aislar una muestra biológica.

[0173] En algunas realizaciones, la etapa de obtención comprende la etapa de aislar una muestra biológica (por ejemplo, una muestra biológica de pretratamiento, una muestra biológica después del tratamiento, etc.). Los métodos y protocolos para aislar varias muestras biológicas (por ejemplo, una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de plasma, una muestra de biopsia, un aspirado, etc.) serán conocidos por un experto en la técnica y cualquier método conveniente puede ser conocido utilizado para aislar una muestra biológica.

[0174] En los métodos de sujetos, se mide el nivel de expresión de un producto génico (por ejemplo, un biomarcador) en una muestra biológica (es decir, "se determina"). Por "nivel de expresión" se entiende el nivel de producto génico (por ejemplo, el valor absoluto y/o normalizado determinado para el nivel de expresión de la proteína y/o el nivel de expresión de ARN de un biomarcador). El término "producto génico" o "producto de expresión" se utiliza en este documento para referirse a los productos proteicos o productos de transcripción de ARN (transcripciones de ARN, por ejemplo, ARNm, un ARN sin empalmar, un ARNm variante de empalme y/o un ARN fragmentado) de un gen, incluido el ARNm y los productos de traducción de polipéptidos de tales transcripciones de ARN. Un producto génico puede ser, por ejemplo, una proteína, un polipéptido postraduccionalmente modificado, un polipéptido variante de corte y empalme, un ARN sin empalmar, un ARNm, un ARNm variante de corte y empalme, un microARN, un ARN fragmentado, etc.

[0175] El biomarcador utilizado aquí es CMH Clase I (por ejemplo, CMH Clase I clásico). Por lo tanto, "medir el nivel de expresión" generalmente implica medir el nivel de expresión de CMH Clase I (por ejemplo, CMH Clase I clásico) sobre o en una célula. En algunos casos, los métodos incluyen medir el nivel de expresión de CMH Clase I (por ejemplo, CMH Clase I clásico) en la superficie de una célula (por ejemplo, mediante citometría de flujo). En algunos casos, los métodos incluyen medir el nivel de expresión de CMH Clase I (por ejemplo, CMH Clase I clásico) en una célula (por ejemplo, mediante transferencia Western, ensayo ELISA, espectrometría de masas, etc.).

[0176] Para la medición de los niveles de proteína, se determina la cantidad o el nivel de un polipéptido en la muestra biológica, por ejemplo, la proteína/polipéptido codificado por el gen de biomarcadores. En algunos casos, se mide el nivel de proteína de superficie. En algunos casos, las células se extraen de la muestra biológica (p. ej., mediante centrifugación, mediante células adheridas a un plato o plástico, etc.) antes de medir el nivel de expresión. En algunos casos, se mide el nivel de proteína intracelular (por ejemplo, lisando las células de la muestra biológica para medir el nivel de proteína en el contenido celular). En algunos casos, las células de la muestra biológica se identifican como células diana (p. ej., células infligidas) (p. ej., mediante clasificación celular, mediante evaluación microscópica, mediante análisis de marcadores, etc.) antes de medir el nivel de expresión de CMH Clase I. En algunos casos, las células de la muestra biológica se identifican como células diana simultáneamente con la medición del nivel de expresión del CMH Clase I (por ejemplo, mediante citometría de flujo). En algunos casos, los niveles de superficie de CMH Clase I se pueden medir extrayendo o enriqueciendo o purificando proteínas de superficie antes de la medición.

[0177] En algunos casos, puede también ser medido el nivel de expresión de una o más proteínas, y el nivel de expresión de biomarcador comparado con el nivel de una o más proteínas adicionales para proporcionar un valor normalizado para el nivel de expresión de biomarcadores. Puede emplearse cualquier protocolo conveniente para evaluar los niveles de proteínas en donde se determina el nivel de una o más proteínas en la muestra ensayada.

[0178] Mientras que una variedad de diferentes maneras de ensayo para determinar los niveles de proteína son conocidas para un experto normal en la técnica y cualquier método conveniente se puede utilizar, los métodos representativos incluyen pero no se limitan a los métodos basados en anticuerpos (por ejemplo, citometría de flujo, ELISA, transferencia Western, matrices proteómicas, tecnología de microesferas xMAPTM (por ejemplo, tecnología Luminex), inmunohistoquímica, citometría de flujo y similares); así como métodos no basados en anticuerpos (por ejemplo, espectrometría de masas).

[0179] Cuando se hace una predicción en los métodos objeto, los métodos incluyen una etapa de proporcionar la predicción. El término "proporcionar una predicción" no es simplemente un paso mental, sino que incluye el paso activo de informar la predicción generando o informando, o proporcionando oralmente la predicción. En algunos casos, la predicción se proporciona como un informe. Por lo tanto, en algunos casos, los métodos en cuestión pueden incluir además un paso de generar o enviar un informe que proporcione los resultados de la evaluación de la muestra, cuyo informe se puede proporcionar en forma de un medio electrónico no transitorio (por ejemplo, una pantalla electrónica en un monitor de computadora, almacenado en la memoria, etc.), o en forma de un medio tangible (por ejemplo, un informe impreso en papel u otro medio tangible). Puede proporcionarse cualquier forma de informe, por ejemplo, como se conoce en la técnica o como se describe con mayor detalle a continuación.

[0180] En algunas realizaciones, se genera un informe. Un "informe", como se describe en este documento, es un documento electrónico o tangible que incluye elementos del informe que proporcionan información de interés relacionada con la evaluación de un tema y sus resultados. En algunas realizaciones, un informe de un sujeto incluye el valor de prueba medido que representa el nivel de expresión medido de CMH Clase I (por ejemplo, el nivel de expresión medido normalizado). En algunas realizaciones, un informe de un sujeto incluye la evaluación de un artesano, por ejemplo, una predicción de resistencia o susceptibilidad, una recomendación de tratamiento, una prescripción, etc. Un informe de un sujeto puede generarse completa o parcialmente de forma electrónica. Un informe de un sujeto puede incluir además uno o más de: 1) información sobre la instalación de prueba; 2) información del proveedor de servicios; 3) datos del paciente; 4) datos de muestra; 5) un informe de evaluación, que puede incluir diversa información que incluye: a) valores de referencia empleados, y b) datos de prueba, donde los datos de prueba pueden incluir, por ejemplo, una determinación del nivel de proteína; 6) otras características.

[0181] En algunas realizaciones, se proporciona una predicción generando un informe escrito. Por lo tanto, los métodos en cuestión pueden incluir un paso de generación o salida de un informe, que puede proporcionarse en forma de un medio electrónico (por ejemplo, una pantalla electrónica en un monitor de computadora), o en forma de un medio tangible (por ejemplo, un informe impreso en papel u otro medio tangible). Se puede proporcionar cualquier forma de informe.

[0182] El informe puede incluir una sección de datos de ejemplo, que puede proporcionar información sobre la muestra biológica analizada en la evaluación de seguimiento, tales como la fuente de muestra biológica obtenida del paciente (por ejemplo, tumor, sangre, saliva, o el tipo de tejido, etc.), cómo se manipuló la muestra (por ejemplo, temperatura de almacenamiento, protocolos preparatorios) y la fecha y hora de recogida. Los campos del informe con esta información generalmente se pueden completar con los datos ingresados por el usuario, algunos de los cuales pueden proporcionarse como selecciones predefinidas (por ejemplo, usando un menú desplegable). El informe puede incluir una sección de resultados. Por ejemplo, el informe puede incluir una sección que informa los resultados de un ensayo de determinación del nivel de expresión del marcador, o una predicción de resistencia o susceptibilidad.

Kits

[0183] También se proporcionan kits para su uso en los métodos. Los kits objeto pueden incluir un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA. En algunas realizaciones, un kit comprende dos o más agentes anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o dos o más agentes anti-CD47/SIRPA. En algunas realizaciones, un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente antiCD47/SIRPA se proporciona en una forma de dosificación (por ejemplo, una forma terapéuticamente eficaz de dosificación, una forma de dosificación sub-terapéutica, por ejemplo, en el caso de un agente anti-CD47/SIRPA). En el contexto de un kit, se puede proporcionar un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y/o un agente anti-CD47/SIRPA en forma líquida o vendida en cualquier empaque conveniente (por ejemplo, paquete de barra, paquete de dosis, etc.). Los agentes de un kit pueden estar presentes en el mismo recipiente o en recipientes separados. Por ejemplo, un kit puede tener un agente anti-CMH Clase I/LILRB1 en un recipiente y un agente anti-CD47/SIRPA en otro recipiente. Los agentes también pueden estar presentes en el mismo recipiente.

[0184] Además de los componentes anteriores, los kits en cuestión pueden incluir además (en ciertas realizaciones) instrucciones para la práctica de los presentes métodos. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits objeto en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en donde estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una hoja o hojas de papel en las que está impresa la información, en el empaque del kit, en un prospecto, y similares.

Otra forma más de estas instrucciones es un medio legible por ordenador, por ejemplo, disquete, disco compacto (CD), unidad flash y similares, en donde se ha grabado la información. Otra forma más de estas instrucciones que puede estar presente es la dirección de un sitio web que se puede utilizar a través de Internet para acceder a la información en un sitio eliminado.

EXPERIMENTAL

[0185] Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a los expertos ordinarios en la técnica una exposición completa y descripción de cómo hacer y usar la presente invención, y no están destinados a limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni tienen la intención de representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio ponderado, la temperatura está en grados centígrados y la presión es igual o cercana a la atmosférica.

[0186] La presente invención ha sido descrita en términos de realizaciones particulares encontradas o propuestas por el presente inventor para comprender los modos preferidos para la práctica de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que, a la luz de la presente descripción, se pueden realizar numerosas modificaciones y cambios en las realizaciones particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance pretendido de la invención. Por ejemplo, debido a la redundancia de codones, se pueden realizar cambios en la secuencia de ADN subyacente sin afectar la secuencia de la proteína. Además, debido a consideraciones de equivalencia funcional biológica, se pueden realizar cambios en la estructura de la proteína sin afectar la acción biológica en especie o cantidad. Todas estas modificaciones están destinadas a incluirse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1

[0187] Los experimentos aquí muestran que CMH Clase I, que está entre los complejos reguladores más intensamente estudiados en inmunología debido a su función en la señalización de células T y NK, juega un papel previamente no apreciado en la protección de las células contra el ataque de los macrófagos. Los resultados demuestran que la expresión del c Mh Clase I inhibe la fagocitosis de células mediada por macrófagos, tanto in vitro como in vivo. Se muestra que el reconocimiento de macrófagos de CMH Clase I está mediado específicamente por el receptor de superficie LILRB1. Los agentes biológicos anti-LILRB1, dirigidos al CMH Clase I o al LILRB1, son suficientes para interrumpir esta protección, definiendo así el eje de señalización CMH/LILRB1 como un mediador importante de la regulación inmune innata y una diana para la terapia (p. ej., inmunoterapia anti-cáncer).

Materiales y Métodos

Cultivo celular

[0188] Las células DLD-1, NCI-H69, NCI-H82, NCI-H1688, NCI-H196, NCI-H524, Bon, y KWNO1 se hicieron crecer en RPMI GlutaMax (Life Technologies) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Hyclone) y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina (Life Technologies). Se cultivó NCI-H128 en RPMI GlutaMax (Life Technologies) suplementado con suero bovino fetal al 20% (Hyclone) y penicilina y estreptomicina 100U/ml (Life Technologies). HT-29, SkBr3 y SkMel3 se cultivaron en McCoy 5A GlutaMax (Life Technologies) complementado con suero bovino fetal al 10% (Hyclone) y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina (Life Technologies). LS-174T, MCF7 y SkMel28 se cultivaron en los medios esenciales mínimos de Eagle (ATCC) complementados con GlutaMax (Life Technologies) suero bovino fetal al 10% (Hyclone) y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina (Life Technologies). Cuando fue necesario, las células se separaron de las placas y se desagregaron utilizando TrypLE Express (Life Technologies) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Todas las líneas celulares se obtuvieron de ATCC con la excepción de KWNO1, que fue un generoso obsequio de Geoff Krampitz de la Universidad de Stanford. A menos que se indique lo contrario, las líneas celulares se propagaron y subcultivaron de acuerdo con las directrices de la ATCC.

Generación de partículas lentivirales

[0189] Las partículas lentivirales incompetentes de replicación basadas en VIH se generaron en células 293 Lenti-X (Clontech) por cotransfección de vector pMDG,2 (Addgene), psPAX2 (Addgene), y un tercer vector específico para la aplicación lentiviral, utilizando el reactivo de transfección Xtremegene HD (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los vectores se transfectaron en una relación de masas de 4:2:1, vector lenti específico: psPAX2: pMDG,2. Después de la transfección, se recogió el sobrenadante del medio de cultivo celular a las 36 y 60 horas. Las partículas lentivirales se concentraron mediante ultracentrifugación durante 2,5 horas a 50.000 g, o con PEG-it (Systems Biosciences) según las indicaciones del fabricante. Se siguieron técnicas adecuadas de bioseguridad y eliminación siempre que se usaron reactivos lentivirales, de acuerdo con las pautas de la Universidad de Stanford.

Transducción de GFP-luciferasa

[0190] Con el fin de facilitar tanto el ensayo de fagocitosis basado en FACS e imágenes in vivo, sublíneas de DLD1, HT-29, LS-174T, SKBR3, Bon, KWNO1, SkMeI28, y SkMel3 se generaron que fueron diseñados para expresar de forma estable una proteína de fusión GFP-luciferasa (Systems Biosciences, número de catálogo BLIV100PA/VA-1). U2OS y SAOS2 se diseñaron para expresar de manera estable una proteína de fusión RFP-luciferasa (Systems Biosciences, número de catálogo BLIV101 PA/VA-1). Las células parentales no modificadas se recogieron en suspensión unicelular y se mezclaron con medio de crecimiento precalentado, lentivirus concentrado y polibreno (Sigma) 10 |jg/ml. A continuación, las células se centrifugaron a 800 rpm, temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se generaron poblaciones uniformes de GFP+ o RFP+ mediante rondas secuenciales de clasificación de células en un clasificador de células FACSAria II (BD Biosciences).

Generación de macrófagos

[0191] Cámaras de sistema de reducción de leucocitos (SRL) de donantes anónimos se obtuvieron de la sangre de Stanford Center. Los monocitos se purificaron a partir de estas muestras en un autoMACS Pro Separator (Miltenyi) utilizando microperlas anti-CD14 optimizadas para la separación de sangre total (Miltenyi) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. A continuación, los monocitos se diferenciaron en macrófagos mediante 7-10 días de cultivo en IMDM GlutaMax (Life Technologies) suplementado con suero humano AB al 10% (Life Technologies) y penicilina y estreptomicina 100 U/ml (Life Technologies). Los macrófagos NSG se generaron como se describió anteriormente. Brevemente, se recolectaron células de médula ósea de las extremidades inferiores de ratones NSG de 6-8 semanas de edad y se cultivaron durante 7 días en IMDM GlutaMax 13 (Life Technologies) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Hyclone), 100 U/ml de penicilina y estreptomicina y 10 ng/ml de M-CSF murino (Peprotech).

Ensayo de fagocitosis basado en FACS

[0192] Cada reacción de fagocitosis informada en este trabajo fue realizada por co-cultivo de 100.000 células diana y 50.000 macrófagos durante dos horas en placas de 96 pocillos de fondo en U de fijación ultra-bajo (Corning) en IMDM GlutaMax (Life Technologies) sin antibióticos ni suero añadido. Los macrófagos se generaron como se describió anteriormente y se recolectaron de placas usando TrypLE Express (Life Technologies). Las células diana se diseñaron para expresar de manera estable la proteína fluorescente GFP o RFP, como se describió anteriormente, o se tiñeron con Calcein AM (Life Technologies) de acuerdo con las indicaciones del fabricante antes del cocultivo. Los anticuerpos de tratamiento, incluido el clon anti-CD47 Hu5F9-G4, cetuximab (BristollMyers Squibb), el clon GHI/75 anti-LILRB1 (BioLegend) y el clon 27D2 anti-LILRB2 (Biolegend) se añadieron a las reacciones a una concentración de 10 ug/ml. Después del cocultivo, las reacciones se tiñeron con el clon HI30 anti-CD45 marcado con APC (BioLegend) para identificar macrófagos humanos, y con el clon BM8 anti-F4/80 marcado con PE-Cy7 (BioLegend) para identificar macrófagos de ratón NSG. Se usó tinción DAPI para excluir las células muertas del análisis (Sigma). Las reacciones se llevaron a cabo en un analizador LSRFortessa equipado con un muestreador automático de alto rendimiento (BD Biosciences). La fagocitosis se evaluó como el porcentaje de macrófagos GFP+ usando FlowJo v,9,4,10 (Tree Star) y se normalizó como se indica en las leyendas de las figuras.

Matriz de anticuerpos

[0193] El sistema de matriz de anticuerpos LegendScreen (BioLegend) se utilizó para evaluar el fenotipo de superficie de la NCIH69, NCI-H82, NCI-H524, y líneas de células NCI-H196. Las células se recolectaron y desagregaron con TrypLE (Life Technologies), y NCI-H82 y NCI-H69 se tiñeron usando Calcein AM (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células NCI-H82 (teñidas con calceína) y NCI-H524 (sin teñir) se procesaron juntas de una manera multiplexada, al igual que NCI-H69 (teñidas con calceína) y NCI-H196 (sin teñir). Las células se distribuyeron entre los pocillos que contenían anticuerpos, se tiñeron y lavaron de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Posteriormente, las muestras se ejecutaron en un LSRFortessa Analizador equipado con un muestreador automático de alto rendimiento (BD Biosciences). Los niveles de fluorescencia se evaluaron utilizando FlowJo v,9,4,10 (Tree Star). La señal de tinción de calceína se utilizó para deconvolucionar muestras multiplexadas.

Tinción de anticuerpos

[0194] El análisis FACS se llevó a cabo ya sea en un clasificador de células FACSAria II (BD Biosciences) o en un LSRFortessa Analyzer (BD Biosciences). Se evaluaron los niveles de CD47 de superficie mediante tinción de anticuerpos con el clon B6H12 (BioLegend) a una dilución de 1:100. Se evaluó HLA-A/B/C mediante tinción de anticuerpos con el clon W6/32 (BioLegend) a una dilución de 1:50. Se evaluó LILRB1 mediante tinción de anticuerpos con el clon GHI/75 (BioLegend) a una dilución de 1:25. LILRB2 se evaluó mediante tinción de anticuerpos con el clon 27D2 (BioLegend) a una dilución de 1:25. Todas las tinciones se realizaron en hielo durante 30 minutos, luego se lavaron y se resuspendieron de acuerdo con la práctica estándar.

Modificaciones genéticas DLD1

[0195] Las células no modificadas DLD1 (ATCC) fueron transducidas con lentivirus para inducir la expresión estable de proteína de fusión GFP-luciferasa (Systems Biosciences, número de catálogo BLIV100PA/VA-1), como se describe arriba y ordenados para pureza usando un clasificador de células FACSAria II (BD Biosciences). Se introdujeron cambios genéticos secuenciales en esta línea parental GFP-luciferasa+. Se clonaron B2M humano de tipo salvaje (NC_000015.10), B2m de ratón de tipo salvaje (NC_000068.7) o B2M quimérico de ratón humano (hmcB2M; ver la secuencia a continuación) en los sitios Nhel y Notl del pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro vector (Systems Biosciences), y estos vectores se usaron para producir lentivirus, como se describió anteriormente. Las células DLD1 se transdujeron con estas partículas virales para producir DLD1-Tg (B2M), DLD1-Tg (mB2m) y DLD1-Tg (hmcB2M), respectivamente. DLD1-A (CD47) se generó mediante cotransfección transitoria de vectores TALEN dirigidos a CD47, que se describen a continuación, utilizando Xtremegene HD (Roche) de acuerdo con el protocolo indicado por el fabricante, teñido para la expresión de CD47 utilizando el clon de anticuerpo B6H12 (BioLegend), y clasificado para la pureza utilizando un clasificador de células FACSAria II (BD Biosciences). Se generó DLD1-Tg (B2M)-A (CD47) por transducción de lentivirus codificantes de B2M humano en la sublínea DLD1-A (CD47).

Diseño y construcción de TALEN

[0196] Los TALEN se diseñaron y ensamblaron como se describe29. El locus genómico de CD47 humano (NC_000003.12) se escaneó en busca de supuestos pares de unión a TALEN. El exón 2 se seleccionó finalmente para el direccionamiento y los pares de TALEN TGTCGTCATTCCATGCTTTG (SEQ ID NO: 15) y TATACTTCAGTAGTGTTTTG (SEQ iD NO: 16) se clonaron respectivamente en la estructura pTALEN.

B2M quimérico humano-ratón

[0197] B2M quimérico fue diseñado para incorporar diferencias de aminoácidos C-terminales de ratón B2m en una secuencia de B2M principalmente humana. La secuencia se sintetizó químicamente como sigue (IDT), y se clonó en los sitios Nhel y Notl de pCDH-CMV-MCS-EFI-Puro. La secuencia de origen del ratón está en minúsculas.

>hmcB2M_geneblock

TTT AAGCT AGC AT GT CT CGCT CCGT GGCCTT AGCT GT GCT CGCGCT ACT CT CT CTTT CT G

GCCT GG AGGCT AT CC AGCGT ACT CC AA AG ATT C AGGTTT ACT C ACGT C AT CC AGC AG AG

A AT GG A AAGT C AA ATTT CCT G AATT GCT AT GT GT CTGGGTTT C ATCC AT CCG AC ATT G AAG

TT G ACTT ACTG A AG AAT GG AG AG AG AATT G AAAAAGT GG AGCATT C AG ACTT GT CTTT C A

GC AAGG ACTGGT CTTT CT AT CT CTT GT ACT AC ACT G A ATT CACCCCC ACT G AA AA AG AT G

AGTATGCCtgcagagttaagcatgccagtatggccgagcccaagaccgtctactgggatcgagacatgtgaGCGGCCG

CAATTT(SEQ ID NO: 17)

Generación de fragmentos Fab W6/32

[0198] El anticuerpo W6/32 (BioXcell) se desaló en una solución de citrato de sodio 20 mM pH 6,0, cisteína 25 mM, EDTA 5 mM, y se diluyó a una concentración de 4 mg/mL. La digestión con proteasa se logró mezclando con 250 ul de resina de ficina inmovilizada (Thermo Scientific) por mL de anticuerpo. La mezcla se incubó con rotación a 37°C durante 5 horas. Después de la incubación, la reacción de digestión resultante se pasó por una columna monoQ y el flujo continuo se recogió y filtró a través de una columna Superdex-200. Los fragmentos Fab se cuantificaron mediante Nanodrop y se comprobó su pureza mediante tinción de Coomassie.

Imágenes de estructura cristalina

[0199] Se generaron imágenes de estructura cristalina con MacPyMol v. 1.7.0.3 a partir de la estructura publicada IP7Q.

Ratones

[0200] Ratones Nod.Cg-PRKDCSCID IL2RGtm1W¡l/SZJ (NSG) se utilizaron para todos los experimentos in vivo. Los ratones se injertaron con tumores aproximadamente a las 6-10 semanas de edad, y se realizaron experimentos con una cohorte de 15 ratones de la misma edad y sexo. Los ratones se mantuvieron en una instalación de barrera bajo el cuidado del Centro de Servicios Veterinarios de Stanford y se manipularon de acuerdo con los protocolos aprobados por el Panel Administrativo de la Universidad de Stanford sobre Cuidado de Animales de Laboratorio.

Competencia in vivo de sublíneas DLD1

[0201] Las células DLD1 y células DLD1-Tg (hmcB2M) se generaron como se detalló anteriormente. Las células se recogieron del cultivo, se contaron, se mezclaron en cantidades iguales y se analizaron FACS en un clasificador de células FACSAria II (BD Biosciences) para confirmar una representación aproximadamente igual. Las células se mezclan a continuación con una solución de matrigel 25% baja en proteínas (BD Biosciences) y 75% de RPMI sin suplementar (Life Technologies) a una concentración de 1x106 células/ml. Los ratones se inyectaron por vía subcutánea en su flanco derecho con 100 pL de suspensión celular (100.000 células) y se asignaron aleatoriamente a un punto de tiempo de análisis utilizando las herramientas de aleatorización de la lista en www.random.org. A los 7 días, 14 días y 28 días, se sacrificaron 5 ratones por punto de tiempo de acuerdo con las pautas del Panel Administrativo de Stanford sobre cuidados de laboratorio. Los tumores se disecaron del tejido de ratón circundante con la ayuda de un microscopio de disección fluorescente Leica M165 (Leica) y se disociaron como se describió anteriormente. Las suspensiones de células individuales se lavaron, se tiñeron con anticuerpo W6/32 como se describió anteriormente, y se analizaron usando un clasificador de células FACSAria II o un analizador LSRFortessa (BD Biosciences).

Resultados

[0202] Cuando los macrófagos humanos derivadas del donante se co-cultivaron con células de cáncer, el tratamiento con el anticuerpo humanizado anti-CD47 (Hu5F9-G4) indujo un aumento significativo en la fagocitosis de los macrófagos para una mayoría (12 de 18) de las líneas celulares que abarca una amplia variedad de tipos de tumores. Sin embargo, algunas líneas no respondieron significativamente a la terapia anti-CD47 (6 de 18) y, además, entre aquellas con respuestas significativas, la magnitud de la fagocitosis inducida difirió ampliamente. Estas diferencias no se correlacionaron con las diferencias en los niveles de CD47 de superficie, que fueron altos en todas las líneas celulares probadas.

[0203] En base a esta observación, se planteó la hipótesis de que las líneas celulares resistentes expresaban una o más señales dominantes de "no me comas" además de CD47. Para identificar estas señales, se utilizó un sistema de matriz de anticuerpos para caracterizar el inmunofenotipo de superficie de cuatro líneas de cáncer de pulmón de células pequeñas (NCI-H69, NCI-H524, NCI-H82 y NCI-H196) que abarcan un amplio espectro de respuesta al tratamiento Hu5F9-G4, desde muy sensible hasta casi completamente resistente. La línea celular más resistente de este panel, NCI-H196, expresó altos niveles de moléculas de superficie HLA-A/B/C y B2M.

[0204] Las cadenas alfa de HLA y la proteína B2M se ensamblan para formar el complejo clásico de CMH Clase I, que tiene funciones críticas en la regulación de las células T y NK. El análisis de la expresión de HLA-A/B/C en un panel extendido de 18 líneas celulares reveló una correlación inversa sorprendente y muy significativa entre los niveles de superficie de CMH Clase I y la sensibilidad a la fagocitosis mediada por macrófagos en el tratamiento con Hu5F9-G4 (R2=0,411, p=0,002).

[0205] Con el fin de investigar si la expresión de CMH Clase I confiere directamente una resistencia funcional a la fagocitosis mediada por macrofagos, una serie de experimentos genéticos fueron diseñados y ejecutados que utilizan la línea de cáncer de colon DLD1. Esta línea celular expresa CD47 pero es completamente negativa para la expresión de CMH Clase I de superficie debido a la inactivación genética bialélica del locus B2M. La expresión de superficie de CMH Clase I se puede restaurar experimentalmente mediante la expresión lentiviral de B2M de tipo salvaje, mientras que la expresión de CD47 se puede eliminar mediante la mutación inducida por TALEN del locus CD47. Por tanto, mediante modificaciones genéticas secuenciales, se generaron sublíneas de DLD1 con las cuatro posibles permutaciones de expresión de CMH clase I y CD47 positiva o negativa.

[0206] Una comparación de DLD1 y B2M parentales reconstituyeron células DLD1-Tg (B2M) reveló que la restauración de la superficie de CMH Clase I era suficiente para proteger las células significativamente de la fagocitosis de macrófagos inducida por Hu5F9-G4 (p<2x10‘5). El análisis de la serie alélica completa de DLD1 demostró que las células doble negativas que carecen de expresión de CD47 y CMH eran las más vulnerables a la fagocitosis tras el tratamiento con el anticuerpo anti-EGFR cetuximab, mientras que la expresión de CMH Clase I fue significativamente protectora (p<0,001). La expresión de CD47 inhibió el ataque de macrófagos en un grado aún mayor (p<0,001). Estos resultados demuestran que el CMH Clase I es un inhibidor importante de la fagocitosis de macrófagos, particularmente en condiciones de señalización de CD47 comprometida.

[0207] Estos datos sugieren que en las líneas celulares que expresan altos niveles de CMH, la interrupción de este eje de señalización puede potenciar la fagocitosis. Para ello, se generó un fragmento de unión a antígeno (Fab) del anticuerpo monoclonal pan-HLA-A/B/C W6/32 19. A diferencia del anticuerpo intacto, el W6/32 Fab se une al CMH Clase I sin introducir opsonización en forma de Fc, lo que permite examinar las consecuencias de su función de bloqueo de forma aislada. El anti-HLA-A/B/C Fab no aumentó significativamente la fagocitosis por sí solo para ninguna línea celular probada, ni aumentó la fagocitosis inducida por Hu5F9-G4 de la línea celular CMH negativa DLD1. No obstante, en un panel de líneas celulares que expresan altos niveles de cotratamiento de CMH con el fab W6/32 de unión a HLA, aumentó significativamente la eficacia del anticuerpo anti-CD47 para la mayoría de las líneas. Estos resultados demuestran que los agentes bloqueadores del CMH pueden potenciar el ataque mediado por macrófagos de cánceres que de otro modo serían resistentes.

[0208] Con el fin de entender mejor el mecanismo por el cual los macrófagos pueden detectar el estado de la expresión de CMH de las células diana, se buscaron la identidad del receptor o receptores implicados en este proceso. Se ha informado que los linajes de monocitos expresan varias proteínas de unión a CMH, en particular miembros de la familia LILRA y LILRB. Los estudios estructurales sugieren que entre esta familia, solo dos genes, LILRB1 y LILRB2, poseen tanto la capacidad de unión al CMH como los motivos ITIM involucrados en la transducción intracelular de la señalización represiva que serían necesarios para explicar nuestros resultados experimentales.

[0209] El análisis FACS de monocitos de sangre periférica humana CD14+ recién aislados de cuatro donantes independientes reveló que estas células expresan tanto LILRB1 como LILRB2 hasta cierto punto. Sin embargo, después de 7 días de diferenciación ex vivo en macrófagos maduros, estas mismas poblaciones de células aumentaron significativamente su expresión de LILRB1 pero perdieron la expresión de LILRB2 (p<0,001). Esta observación implica a LILRB1, pero no a LILRB2, como un mediador candidato de la señalización represiva del CMH en macrófagos.

[0210] Por lo tanto, si la prueba de un anticuerpo de bloqueo LILRB1 podría inducir los macrófagos para fagocitar células que expresan CMH. De hecho, aunque la reconstitución de DLD1 con B2M de tipo salvaje protegió significativamente a estas células del ataque de macrófagos dirigido por Hu5F9-G4, interrumpiendo LILRB1 (usando el anticuerpo de bloqueo GHI/75) o HLA-A/B/C (usando el bloqueo de W6/32 fab) fue suficiente para facilitar la fagocitosis y eliminar completamente el efecto protector de la expresión del CMH. Por el contrario, el tratamiento con un anticuerpo bloqueante de LILRB2, 27D2, no tuvo un efecto significativo sobre la fagocitosis dirigida por Hu5F9-G4.

[0211] Todos los ensayos de fagocitosis reportados en este estudio utilizaron los macrófagos derivados de múltiples donantes biológicos independientes, sin análisis o selección basada en haplotipo HLA anterior; a pesar de esto, no se descubrió ninguna evidencia de una respuesta variable basada en polimorfismo a la protección mediada por CMH. Esto sugiere que los macrófagos emplean un paradigma de detección de CMH diferente al utilizado por las células T y las células NK. De acuerdo con esta observación, el análisis de la estructura cristalina de LILRB1 unido al complejo de CMH Clase I humano reveló que la mayoría de los contactos de aminoácidos entre LILRB1 y CMH están dentro de la subunidad invariante B2M, en lugar de la cadena alfa altamente polimórfica de HLA.

[0212] Por el contrario a las cadenas alfa de HLA, B2M humana es mínimamente polimórfica entre individuos, pero el alineamiento de las secuencias de proteínas B2M de ratones y humanos revela ~30% desajuste, incluyendo un número de residuos en la interfaz predicha entre B2M y LILRB1. Dada esta diferencia, se probó si la expresión de B2M de ratón podría proporcionar protección contra el ataque de macrófagos humanos. La sobreexpresión de B2M de ratón en células DLD1 humanas no pudo disuadir la fagocitosis por macrófagos humanos, pero este resultado fue confundido por la baja eficiencia con la que B2M de ratón devolvió complejos CMH estables a la superficie celular. Para eludir esta limitación técnica, se generó un B2M quimérico humano-ratón (hmcB2M) que es principalmente humano pero está mutado para incluir ocho aminoácidos C-terminales de secuencia de ratón en la región que se predice que interactúa con LILRB1. La expresión de hmcB2M induce una expresión superficial robusta de HLA-A/B/C comparable a la B2M completamente humana, pero a diferencia de la B2M humana, no tiene efecto protector contra el ataque de macrófagos humanos. Este resultado demuestra genéticamente que la interfaz B2M/LILRB1 es fundamental para la detección de macrófagos de CMH. Por el contrario, cuando las sublíneas DLD1 se cocultivaron con macrófagos de ratón, hmcB2M fue la única versión probada de B2M que protegió significativamente de la fagocitosis.

[0213] Para probar las consecuencias in vivo de señalización CMH sobre la fagocitosis de los macrófagos y, en particular, para determinar si expresión de CMH por las células cancerosas podría conferir una ventaja competitiva sobre las células cancerosas negativas por CMH in vivo, se utilizaron ratones NSG (NOD-SCID II2ry-/-), que producen macrófagos funcionales pero carecen de células T, B y NK funcionales. Se inyectaron subcutáneamente ratones NSG con una población mixta de células que comprendía 50% de DLD1 parental (CMH-) y 50% de DLD1 reconstituida con hmcB2M (CMH+). Aunque los tumores injertados inicialmente contenían porcentajes aproximadamente iguales de células CMH+ y CMH-(antes de la inyección y día 7), después de varias semanas de crecimiento, los tumores eran casi uniformemente positivos para c Mh (día 28). Esto implica que las células que expresan CMH están sujetas a un grado significativamente reducido de inmunvigilancia de macrófagos in vivo. Es poco probable que esto sea una ventaja autónoma de células, ya que la sublínea DLD1 reconstituida con hmcB2M no muestra ninguna diferencia significativa en la cinética de crecimiento in vitro en comparación con las células DLD1 parentales. Además, la administración de Hu5F9-G4 (anticuerpo anti-CD47) ralentizó el crecimiento de células DLD1 in vivo (que son CMH-debido a la falta de expresión de B2M), pero no tuvo un efecto significativo en las células DLD1-Tg (hmcB2M), que expresan B2M y son CMH+.

Ejemplo 2

[0214] Los resultados presentados aquí demuestran que la expresión de CMH Clase I por las células cancerosas directamente inhibe la fagocitosis mediada por macrófagos, y además muestran que la detección de macrófagos de CMH Clase I está mediada por el inhibidor LILRB1 receptor de la superficie. Los agentes biológicos dirigidos al CMH Clase I o al LILRB1 fueron suficientes para interrumpir esta protección y potenciar el ataque de macrófagos in vitro e in vivo, definiendo así el eje de señalización CMH:LILRB1 no solo como un importante regulador de la función efectora de los macrófagos, sino también como un biomarcador para la respuesta terapéutica a los agentes anti-CD47 y una diana para la inmunoterapia contra el cáncer. Algunos de los resultados presentados en el ejemplo 2 también se presentan en el ejemplo 1 anterior.

Resultados

Expresión de CMH Clase I se correlaciona con la resistencia a la fagocitosis de macrófagos.

[0215] Los fármacos contra la vía CD47:SIRPA tienen una amplia eficacia para inducir la fagocitosis de células cancerosas, en gran medida independientemente del subtipo de enfermedad o tejido de origen. En consecuencia, cuando se cocultivaron macrófagos humanos derivados de donantes con una variedad de líneas celulares sólidas derivadas de tumores, el anticuerpo anti-CD47 humanizado Hu5F9-G4 induce un aumento significativo en la fagocitosis de macrófagos para la mayoría de las células (Fig. 1B, 12 de 18 líneas, p<0,05), según lo evaluado por un ensayo de fagocitosis basado en citometría de flujo completamente validado (Fig. 6) (ver Liu et al, PLoS One. 21 de septiembre de 2015; 10 (9): e0137345, que contiene enseñanzas relacionadas con anticuerpos anti-CD47). Sin embargo, algunas líneas no responden significativamente a la terapia anti-CD47 (6 de 18), y entre los respondedores, la magnitud de la fagocitosis inducida varía ampliamente (Fig. 1B). Estas diferencias no se correlacionaron con el subtipo de cáncer, ni se correlacionaron con los niveles de CD47 en la superficie, que fueron altos en todas las líneas celulares probadas (Fig. 7). Debido a que Hu5F9-G4 bloquea simultáneamente la señalización de CD47:SIRPA y opsoniza las células, especulamos que las líneas resistentes a Hu5F9-G4 deben expresar una o más señales de "no me comas" además de CD47.

[0216] Con el fin de identificar estas señales, se utilizó un sistema de matriz de anticuerpos para caracterizar el inmunofenotipo superficial de cinco líneas de células: las líneas de cáncer de colon DLD1 y HCT116; las líneas de cáncer de pulmón de células pequeñas NCI-H82 y NCIH196; y la línea de tumor neuroendocrino pancreático KWNO1. Estas líneas abarcan un amplio espectro de tipos de tumores, así como un amplio intervalo de sensibilidad a la fagocitosis tras el tratamiento con Hu5F9-G4 (Fig. 1B). Al analizar los datos de estas matrices, se observó una relación intrigante entre la expresión de proteínas CMH Clase I y la resistencia a la fagocitosis de macrófagos inducida por Hu5F9-G4 (Fig. 8).

[0217] Las cadenas alfa de HLA y la proteína B2M se ensamblan para formar el complejo CMH Clase I, que tiene funciones esenciales en la regulación de células T y células NK, pero no tiene una función descrita clásicamente en la regulación de macrófagos. No obstante, el análisis de la expresión de HLA en el panel de 18 líneas celulares reveló una correlación muy significativa entre los niveles de superficie de CMH Clase I y la resistencia a la fagocitosis mediada por macrófagos tras el tratamiento con Hu5F9-G4 (Fig,1 C, R2=0,411, p=0,002).

CMH Clase I protege directamente a las células del ataque de los macrófagos.

[0218] Para investigar esta correlación, se realizaron una serie de experimentos genéticos utilizando las líneas KWNO1 y DLD1. Ambas líneas fueron positivas para la expresión de CD47 (Fig. 2A, Fig. 2B), pero mientras que KWNO1 expresó altos niveles de CMH Clase I, DLD1 fue negativo para CMH de superficie debido a la inactivación bialélica del locus B2M. A través de la modificación genética irreversible y rondas secuenciales de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), se generaron sublíneas policlonales de KWNO1 y DLD1 con las cuatro permutaciones de expresión positiva o negativa de CMH y CD47 (Fig. 2A y Fig. 2B).

[0219] El cocultivo de estas líneas con macrófagos humanos derivados de donantes reveló que la deleción del CMH de superficie era suficiente para aumentar modesta pero significativamente la fagocitosis espontánea en algunos casos (Fig. 2C, p<0,01). Además, en una confirmación crítica de la hipótesis, las células CMH- eran significativamente más sensibles a la fagocitosis inducida por anti-CD47 que sus contrapartes CMH+ (Fig. 2C, d p<0,001). El análisis de los paneles alélicos extendidos de estas líneas confirmó que tras el tratamiento con anticuerpo opsonizante, las células que carecían de expresión de CD47 y CMH eran significativamente más sensibles a la fagocitosis que las células que expresaban CMH Clase I solo (Fig. 2E y Fig. 2F, azul frente a verde; p<0,05 y p<0,001, respectivamente) o células que expresan CD47 solo (Fig. 2E y Fig. 2F, azul versus negro, p<0,001), y en la línea celular KWNO1, la expresión simultánea de CMH y CD47 fue significativamente mayor protectora que cualquier señal sola (Fig. 2E, rojo, p<0,001). Por tanto, el CMH Clase I y el CD47 son señales anti-fagocíticas independientes que pueden trabajar de manera cooperativa para proteger a las células del ataque de los macrófagos.

[0220] En base a este resultado, se especuló que el bloqueo de la señalización del CMH podría ser una herramienta general para sensibilizar a las células a la fagocitosis. Por lo tanto, se generó un fragmento Fab derivado del anticuerpo monoclonal pan-HLA-A, B, C, W6/32, lo que permitió el examen de los efectos de bloqueo del CMH de este anticuerpo en aislamiento de cualquier efecto mediado por Fc. El Fab de unión a HLA no influyó en la fagocitosis de una línea celular negativa para c Mh , DLD1 (Fig. 2G, panel izquierdo). Sin embargo, cuando se aplicó a un panel de células con alto contenido de CMH (Fig. 9), el Fab de unión a HLA aumentó significativamente la fagocitosis inducida por anti-CD47 para 4 de las 6 líneas probadas (Fig. 2G), incluyendo KWNO1, confirmando así de forma independiente los resultados de los experimentos genéticos (Fig. 2C y Fig. 2D).

LILRB1 es el receptor primario para la señalización inhibidora de CMH a macrófagos.

[0221] Con el fin de investigar más a fondo el fenómeno de la señalización de CMH a macrófagos, el siguiente objetivo era identificar el receptor o receptores implicados en su detección. El análisis FACS de monocitos de sangre periférica humana CD14+ recién aislados de cuatro donantes independientes reveló que la mayoría de estas células expresan tanto LILRB1 como LILRB2 (Fig. 3A, Fig. 3B). Sin embargo, después de 7 días de diferenciación ex vivo en macrófagos maduros, la expresión de LILRB1 aumentó significativamente (Fig. 3A, b p<0,001), mientras que el porcentaje de células que expresan LILRB2 disminuyó significativamente (Fig. 3A, b, p<0,001). Esta observación implicó fuertemente a LILRB1, pero excluyó en gran medida a LILRB2, como mediador de la señalización represiva del CMH en macrófagos humanos maduros.

[0222] Con el fin de confirmar funcionalmente esta hipótesis, se puso a prueba si el bloqueo LILRB1 podría aumentar la fagocitosis de células CMH+. De hecho, GHI/75, un anticuerpo monoclonal bloqueante contra LILRB1, aumentó significativamente la fagocitosis inducida por Hu5F9-G4 específicamente de células CMH+ (Fig. 3C, p<0,01), eliminando el diferencial entre las sublíneas CMH+ y CMH- para ambas KWNO1 (Fig. 3C) y DlD1 (Fig. 10). Por el contrario, el tratamiento con un anticuerpo bloqueante de LILRB2 no tuvo un efecto significativo sobre la fagocitosis para ninguna población celular (Fig. 3B y Fig. 10). Tomados en conjunto, estos resultados apoyan fuertemente a LILRB1 como el principal efector de la detección de CMH durante la regulación de la fagocitosis.

Proteína B2M confiere la detección de CMH específica de especie por macrófagos.

[0223] Todos los ensayos informados en este estudio utilizaron macrófagos derivados de múltiples donantes biológicos independientes, sin análisis o selección previa basada en el haplotipo HLA; a pesar de esto, se observó una protección muy consistente por la expresión de CMH, lo que sugiere un paradigma de detección diferente al de los mecanismos específicos de alelo empleados por las células T y las células NK. De acuerdo con este resultado, el análisis de la estructura cristalina previamente resuelta de LILRB1 unido al complejo de CMH clase I humano reveló que la mayoría de los residuos de contacto entre LILRB1 y CMH están dentro de la subunidad invariante B2M en lugar de la cadena alfa altamente polimórfica de HLA (Fig. 4A).

[0224] Existen diferencias sustanciales en los genes familiares de LILRB entre seres humanos y ratones, pero el trabajo anterior sugiere que el receptor de ratón PirB puede subsumir la mayor parte de las funciones descritas, tanto para LILRB1 como LILRB2 humanas, incluyendo señalización represiva tras la unión CMH. Por consiguiente, se encontró que PirB se expresaba en gran medida en la superficie de macrófagos de ratón diferenciados in vitro (Fig. 11). Sin embargo, a diferencia de los macrófagos humanos, los macrófagos de ratón no discriminaron fuertemente entre células CMH+ y CMH- humanas.

[0225] La alineación de las secuencias de proteína B2M humana y de ratón reveló un desajuste de identidad de aproximadamente el 30%, que incluye varios aminoácidos en la región de contacto predicho entre B2M humana y LILRB1 (Fig. 4A). Las diferencias en estos residuos podrían explicar la falta de señalización del CMH humano a los macrófagos de ratón, y luego se buscó determinar si B2m de ratón y B2M humano podrían dotar a las células de una protección específica de especie contra la fagocitosis.

[0226] Un intento de expresar B2m de ratón en células humanas reveló que esta proteína extraña era incapaz de formar complejos CMH estables superficiales con cadenas alfa de HLA humano (Fig. 12). Para eludir esta limitación técnica, se generó un B2M quimérico humano-ratón (hmcB2M) en donde la proteína humana se mutó para incluir aminoácidos de la secuencia de ratón dentro de la región de interacción predicha con LILRB1 (Fig. 4A, región insertada). La expresión de hmcB2M en células DLD1 parentales negativas para B2M, o en KWNO1 suprimido por B2M, permitió una expresión de superficie robusta de HLA comparable a la lograda con la proteína B2M completamente humana (Fig. 4B, púrpura versus rojo).

[0227] Usando estas líneas, se confirmó que aunque B2M humano protegía fuertemente las células diana contra macrófagos humanos (Fig. 4C, eje y, negro versus rojo), era ineficiente en la protección contra macrófagos murinos (Fig. 4C, eje x, negro versus rojo); por el contrario, la expresión de hmcB2M confirió precisamente la protección inversa (Fig. 4C, negro frente a violeta). Este resultado demuestra genéticamente que los residuos de aminoácidos en la región de B2M que interactúa con LILRB son críticos para la detección específica de especies de CMH por macrófagos humanos y de ratón.

CMH protege a las células cancerosas del ataque de macrófagos in vivo

[0228] El siguiente objetivo fue estudiar las consecuencias in vivo de la señalización de CMH a macrófagos y, en particular, para determinar si la expresión de CMH por las células cancerosas las protege de la vigilancia inmune de macrófagos in vivo. Basado en la naturaleza específica de especie de esta interacción (Fig. 4C), fue un objetivo primero establecer un sistema de xenoinjerto mediante el cual pudiéramos evaluar la interacción de macrófagos humanos con células cancerosas humanas in vivo. Los ratones NSG (NOD-SCID Il2 iy /-) producen células funcionales del linaje mieloide, pero carecen de células T, B y NK y, por lo tanto, pueden aceptar trasplantes de especies cruzadas. Estos ratones se utilizaron como huéspedes en los que se co-injertaron macrófagos humanos ex vivo junto con células cancerosas humanas KWNO1 (esquema en la Fig. 5A).

[0229] Las células CMH+ KWNO1 fácilmente injertadas en huéspedes GSN, a pesar de la presencia de macrófagos humanos (Fig. 5B, panel izquierdo), y consistente con ensayos in vitro, fueron sólo modestamente afectados por el tratamiento con el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4 de bloqueo (Fig. 5B, panel izquierdo). En contraste, el tratamiento de la sub-línea de CMH-KWNO1 con Hu5F9-G4 dio como resultado el aclaramiento completo de las células tumorales, sin bioluminiscencia detectable a los 14 días después de la inyección (Fig. 5B, panel derecho), una demostración sorprendente de la potencia de la regulación de macrófagos mediada por CMH. En una demostración simétrica de este principio, el tratamiento combinado con anticuerpos bloqueantes anti-CD47 y anti-LILRB1 fue suficiente para reducir drásticamente la formación de tumores por células CMH+ KWNO1 (Fig. 5B, panel izquierdo), lo que llevó a una reducción >80 veces mayor de la carga de tumor general el día 7 en comparación con los ratones tratados con PBS, y una reducción de aproximadamente 50 veces en comparación con los tumores tratados con Hu5F9-G4 solo (Fig. 5B y Fig. 13).

[0230] La fagocitosis en este sistema de xenoinjerto había disminuido gradualmente el día 7, de acuerdo con la dispersión de los macrófagos humanos coinjertados o de los tratamientos con anticuerpos específicos humanos después de la inyección inicial (Fig. 13). Por tanto, con el fin de estudiar los efectos a largo plazo de la señalización de CMH de tumor a macrófago in vivo, se utilizaron sublíneas de KWNO1 que expresaban la B2M quimérica de ratón humano (Fig. 4). Un análisis histológico inicial de tumores derivados de una población mixta de células CMH- y células CMH+ quiméricas reveló una infiltración sustancial por macrófagos de ratón (Fig. 5C, azul), así como casos claros de fagocitosis de células tumorales (Fig. 5C, punta de flecha blanca), demostrando así que los macrófagos NSG están realmente presentes en el tumor y son capaces de montar una respuesta antitumoral contra estas células in vivo.

[0231] Con el fin de comparar cuantitativamente la sensibilidad in vivo de CMH frente a células CMH+ quiméricas a agentes anti-CD47, células CMH KWNO1 o células CMH+ KWNO1 quiméricos fueron injertados en los flancos de ratones NSG, e imágenes bioluminiscentes se utilizaron para el seguimiento del crecimiento tumoral en condiciones de tratamiento con PBS o administración de Hu5F9-G4 una vez a la semana (esquema en la Fig. 5D). En los primeros momentos, no hubo diferencia significativa en la luminiscencia entre los tumores de ningún grupo de tratamiento, o entre los tumores quiméricos CMH+ y CMH-(Fig. 5E). Para el día 42, el tratamiento anti-CD47 una vez a la semana había ralentizado significativamente el crecimiento de tumores CMH- y CMH+ quiméricos (Fig. 5E, p<1e-4 y p<0,05, respectivamente). Sin embargo, hubo un beneficio terapéutico significativamente menor para anti-CD47 para los tumores CMH+ KWNO1, que crecieron a una tasa significativamente más rápida que los tumores CMH- (Fig. 5E, p<0,05; ver Fig. 16 para una comparación estadística completa entre todos los puntos de tiempo y grupos). Dado que estas sublíneas de cáncer difieren solo en su estado de expresión de B2M, que no tuvo un efecto medible sobre su tasa de crecimiento in vitro (Fig. 14 y Fig. 15), estos resultados demuestran un efecto mediado por CMH en la vigilancia inmune de macrófagos de células tumorales in vivo.

Discusión

[0232] Los datos presentados aquí demuestran que el CMH Clase I es una señal reguladora clave para las funciones efectoras de los macrófagos, ampliando así nuestra comprensión de uno de los complejos de señalización más importantes y mejor estudiados de la inmunología, y destacando el papel central de c Mh en la coordinación de la actividad de las ramas tanto adaptativa como innata del sistema inmunológico. La señalización de CMH:LILRB1 se ha estudiado previamente en un subconjunto de células NK y en el linaje mieloide por su papel en la activación de monocitos. Sin embargo, como se describe aquí, mientras que los monocitos recién aislados tienen expresión detectable de LILRB1, los niveles de superficie de este gen aumentan aproximadamente 10 veces durante la diferenciación en macrófagos maduros (Fig. 3B). Este aumento, cuando se toma junto con los datos funcionales descritos aquí, sugiere que la regulación de la fagocitosis de macrófagos es un papel clave de la señalización de LILRB1.

[0233] Los resultados en el presente documento tienen implicaciones importantes para varios aspectos de la biología de los macrófagos. Los virus pueden evitar la presentación de péptidos extraños a las células T mediante la regulación a la baja del CMH Clase I de superficie, que en consecuencia puede activar el ataque de las células NK debido a la falta de unión del CMH por los receptores de tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR). Es probable que el eje de señalización CMH:LILRB1 desempeñe una función análoga para la vigilancia inmunitaria de células infectadas mediadas por macrófagos. Además, la familia del citomegalovirus humano (CMV) ha evolucionado para codificar una proteína, UL-18, que imita al HLA pero evita la unión de las células T. Se une a LILRB1 con una afinidad >1000 veces mayor en comparación con los complejos de CMH nativos y, según informes anteriores, inhibe el subconjunto de células NK que expresan LILRB1. Dada la alta expresión de LILRB1 en macrófagos maduros, es probable que UL-18 module la fagocitosis mediada por macrófagos de células infectadas por CMV y, por tanto, esto puede influir en la patología de la infección por CMV.

[0234] La señalización de CMH:LILRB1 también es importante en la dinámica de la eliminación celular programada. A medida que los eritrocitos envejecen, su señalización efectiva de CD47 disminuye gradualmente, cayendo finalmente por debajo de un umbral crítico y permitiendo así la fagocitosis por macrófagos. Mientras que la mayoría de los tejidos humanos normales expresan CMH Clase I, incluidos los precursores de eritrocitos, los eritrocitos maduros carecen de CMH de superficie. A la luz de los resultados en este documento, esta falta de expresión puede ser un factor en la preparación de los eritrocitos para una eventual fagocitosis, y puede servir para explicar en parte la anemia inducida por anticuerpos anti-CD47 o proteínas de fusión Fc de unión a CD47 cuando se implementan como terapias contra el cáncer.

[0235] Como se demuestra por los resultados en el presente documento, tanto in vitro y in vivo, la falta de células de cáncer de expresión de CMH dota con sensibilidad a la fagocitosis. Muchos cánceres se presentan clínicamente con expresión comprometida o negativa del CMH de superficie. Debido a la presentación deficiente de los neoantígenos del cáncer mutados, estos pacientes son muy malos candidatos para terapias centradas en células T, pero los resultados presentados aquí sugieren que son candidatos ideales para inmunoterapias mediadas por macrófagos. Por lo tanto, el estado de expresión del c Mh puede usarse como biomarcador predictivo no solo para la eficacia de las terapias de células T como los agentes anti-PD-1 o PD-L1, sino también para la eficacia de los fármacos anti-CD47 o anti-SIRPA en una variedad de las indicaciones de la enfermedad.

[0236] Más allá de su uso como biomarcador, el trabajo aquí sugiere que en pacientes con tumores que expresan niveles normales o altos de CMH, los agentes terapéuticos que interrumpen la interacción CMH:LILRB1 pueden aumentar de forma independiente la eficacia de los anticuerpos monoclonales de unión al tumor, y cooperarán con agentes contra CD47:S iRpA.

[0237] Agentes contra el eje de señalización CMH:LILRB1 pueden ser un componente importante de cualquier régimen terapéutico que tiene como objetivo involucrar macrófagos en la lucha contra el cáncer

Procedimientos experimentales

Cultivo celular

[0238] Las células DLD-1, NCI-H69, NCI-H82, NCI-H1688, NCI-H196, NCI-H524, Bon y KWNO1 se cultivaron en RPMI+GlutaMax (Life Technologies) complementado con suero bovino fetal al 10% (Hyclone) y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina (Life Technologies). Se cultivó NCI-H128 en RPMI GlutaMax (Life Technologies) suplementado con suero bovino fetal al 20% (Hyclone) y penicilina y estreptomicina 100U/ml (Life Technologies). HT-29, SkBr3 y SkMel3 se cultivaron en McCoy 5A GlutaMax (Life Technologies) complementado con suero bovino fetal al 10% (Hyclone) y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina (Life Technologies). LS-174T, MCF7 y SkMei28 se cultivaron en los medios esenciales mínimos de Eagle (ATCC) complementados con GlutaMax (Life Technologies), suero bovino fetal al 10% (Hyclone) y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina (Life Technologies). Cuando fue necesario, las células se separaron de las placas y se desagregaron utilizando TrypLE Express (Life Technologies) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Todas las líneas celulares se obtuvieron de ATCC con la excepción de KWNO1, que fue un generoso obsequio de Geoff Krampitz de la Universidad de Stanford. A menos que se indique lo contrario, las líneas celulares se propagaron y subcultivaron de acuerdo con las directrices de la ATCC.

Generación de partículas lentivirales

[0239] Las partículas lentivirales de replicación incompetente basadas en VIH se generaron en células 293 Lenti-X (Clontech) por cotransfección de vector pMDG,2 (Addgene), psPAX2 (Addgene), y un tercer vector específico de la aplicación lentiviral, utilizando el reactivo de transfección Xtremegene HD (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los vectores se transfectaron en una relación de masas de 4:2:1, vector lenti específico: psPAX2: pMDG,2. Después de la transfección, se recogió el sobrenadante del medio de cultivo celular a las 36 y 60 horas. Las partículas lentivirales se concentraron mediante ultracentrifugación durante 2,5 horas a 50.000 g, o con PEG-it (Systems Biosciences) según las indicaciones del fabricante. Se siguieron técnicas adecuadas de bioseguridad y eliminación siempre que se usaron reactivos lentivirales, de acuerdo con las pautas de la Universidad de Stanford.

Generación de sub-líneas DLD1 y KWNO1

[0240] Con el fin de generar sub-líneas de DLD1 y KWNO1, se recogieron las células parentales, no modificadas en una sola célula de suspensión y se mezcla con medio de crecimiento pre-calentado, lentivirus concentrado, y 10 pg/mL polibreno (Sigma). A continuación, las células se centrifugaron a 1800 rpm, temperatura ambiente durante 45 minutos. Los grupos lentivirales incluyeron al menos tres especies virales distintas: una que codifica la nucleasa Cas9 y otras dos que codifican diferentes ARN de guía pequeña de CRISPR (ARNsg) dirigidos al primer exón de CD47 o B2M, según corresponda. Los ARNsg de CRISPR se diseñaron utilizando las herramientas de genome-engineering.org y tenían las siguientes secuencias: sgCD47-1: GCTACTGAAGTATACGTAAAG (SEQ ID NO: 18), sgCD47-2: GCTTGTTTAGAGCTCCATCAA (SEQ IDNO: 19), sgB2M-1: GAGTAGCGCGAGCACAGCTA (SEQ ID NO: 20), sgB2M-2: GGCCGAGATGTCTCGCTCCG (SEQ iD NO: 21). 7 días después de la infección, se evaluó el estado de expresión de las células mediante citometría de flujo. Se evaluó CD47 mediante tinción con B6H12 conjugado con APC (Biolegend) y se evaluó HLA-A, B, C mediante tinción con W6/32 conjugado con PE-Cy7 (Biolegend). Las células se clasificaron en un clasificador de células FACSAria II (BD Biosciences). Normalmente, cada línea celular se clasificó tres veces, separadas por varios días de recuperación y expansión entre rondas. Se clonaron B2M humano de tipo salvaje (NC_000015.10), B2m de ratón de tipo salvaje (NC_000068.7) o B2M quimérico de ratón humano (hmcB2M; véase la secuencia a continuación) en los sitios Nhel y Notl del pCDHCMV-MCS-EF1-Puro vector (Systems Biosciences), y estos vectores se utilizaron para producir lentivirus e introducir transgenes, según fuera apropiado. Se generó DLD1-A (CD47) mediante cotransfección transitoria de vectores TALEN dirigidos a CD47, descritos a continuación, usando Xtremegene HD (Roche) de acuerdo con el protocolo indicado por el fabricante. Todas las demás modificaciones genéticas se indujeron mediante la administración lentiviral de transgenes o la administración lentiviral de Cas9 y los ARNsg correspondientes, como se describió anteriormente.

Diseño y construcción de TALEN

[0241] Los TALEN fueron diseñados y ensamblados como se describe. El locus genómico de CD47 humano (NC_000003.12) se escaneó en busca de supuestos pares de unión a TALEN. El exón 2 se seleccionó finalmente para el direccionamiento y los pares de TALEN TGTCGTCATTCCATGCTTTG (SEQ ID NO: 22) y TATACTTCAGTAGTGTTTTG (SEQ iD NO: 23) se clonaron respectivamente en el esqueleto pTALEN.

Transducción de GFP-luciferasa

[0242] Con el fin de facilitar tanto el ensayo de fagocitosis basado en FACS como la obtención de imágenes in vivo, generamos sublíneas de DLD1, HT-29, LS-174T, SkBr3, Bon, KWNO1, SkMeI28 y SkMel3 diseñadas para expresar de forma estable una proteína de fusión GFP-luciferasa (Systems Biosciences, número de catálogo BLIV100PA/VA-1). U2OS y SAOS2 se diseñaron para expresar de forma estable una proteína de fusión RFP-luciferasa (Systems Biosciences, número de catálogo BLIV101PA/VA-1). Las células parentales no modificadas se recolectaron en suspensión unicelular y se mezclaron con medio de crecimiento precalentado, lentivirus concentrado y polibreno (Sigma) de 10 pg/ml. A continuación, las células se centrifugaron a 1800 rpm, temperatura ambiente durante 45 minutos. A continuación, se generaron poblaciones uniformes de GFP+ o RFP+ mediante rondas secuenciales de clasificación de células en un clasificador de células FACSAria II (BD Biosciences).

Generación de macrófagos

[0243] Cámaras de sistema de reducción de leucocitos (SRL) de donantes anónimos se obtuvieron de la sangre de Stanford Center. Los monocitos se purificaron a partir de estas muestras en un separador autoMACS Pro (Miltenyi) utilizando microperlas anti-CD14 optimizadas para la separación de sangre total (Miltenyi) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. A continuación, los monocitos se diferenciaron en macrófagos mediante 7-10 días de cultivo en IMDM GlutaMax (Life Technologies) suplementado con suero humano AB al 10% (Life Technologies) y penicilina y estreptomicina 100 U/ml (Life Technologies). Los macrófagos NSG se generaron como se describió anteriormente. Brevemente, se recolectaron células de médula ósea de las extremidades inferiores de ratones NSG de 6-8 semanas de edad y se cultivaron durante 7 días en IMDM GlutaMax 13 (Life Technologies) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Hyclone), 100 U/ml de penicilina y estreptomicina y 10 ng/ml de M-CSF murino (Peprotech).

Ensayo de fagocitosis basado en FACS

[0244] Cada reacción de fagocitosis informada en este trabajo fue realizada por co-cultivo de 100.000 células diana y 50.000 macrófagos durante dos horas en placas de 96 pocillos de fondo en U de fijación ultra-bajo (Corning) en IMDM+GlutaMax (Life Technologies) sin antibióticos ni suero añadido. Los macrófagos se generaron como se describió anteriormente y se recolectaron de placas usando TrypLE Express (Life Technologies). Las células diana se diseñaron para expresar de manera estable la proteína fluorescente GFP o RFP, como se describió anteriormente, o se tiñeron con Calceína AM (Life Technologies) de acuerdo con las indicaciones del fabricante antes del cocultivo. Los anticuerpos de tratamiento, incluido el clon anti-CD47 Hu5F9-G4, cetuximab (BristollMyers Squibb), el clon GHI/75 anti-LILRB1 (BioLegend) y el clon 27D2 anti-LILRB2 (Biolegend) se agregaron a las reacciones a una concentración de 10 pg/mL. Después del cocultivo, las reacciones se tiñeron con el clon HI30 anti-CD45 marcado con APC (BioLegend) para identificar macrófagos humanos, y con el clon BM8 anti-F4/80 marcado con PE-Cy7 (BioLegend) para identificar macrófagos de ratón NSG. Se usó tinción DAPI para excluir las células muertas del análisis (Sigma). Las reacciones se llevaron a cabo en un analizador LSRFortessa equipado con un muestreador automático de alto rendimiento (BD Biosciences). La fagocitosis se evaluó como una suma de los macrófagos GFP+ (tanto las puertas "Media" como "Alta" se incluyeron en este número, como se describe en la Fig. 6), expresada como un porcentaje del total de macrófagos, como se analizó usando FlowJo v,9,4,10 (Tree Star) y se normalizó como se indica en las leyendas de las figuras. A menos que se indique lo contrario, cada réplica representa una réplica biológica verdadera (es decir, un donante de macrófagos humanos independiente) y, a menos que se indique lo contrario, las réplicas se dividieron entre un mínimo de dos instancias experimentales independientes (p. ej., cuatro donantes independientes evaluados el día 1, con cuatro donantes independientes evaluados el día 2). El tamaño de la muestra se eligió para asegurar una probabilidad superior al 95% de identificar, mediante la prueba t de dos colas, un efecto de >20%, asumiendo una variación técnica del 15%.

Matriz de anticuerpos

[0245] Se utilizó el sistema de matriz de anticuerpos LegendScreen (BioLegend) para evaluar el fenotipo de la superficie de las líneas de células NCIH69, NCI-H82, NCI-H524, y NCI-H196. Las células se recolectaron y desagregaron con TrypLE (Life Technologies), y NCI-H82 y NCI-H69 se tiñeron usando Calcein AM (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células NCI-H82 (teñidas con calceína) y NCI-H524 (sin teñir) se procesaron juntas de una forma multiplexada, al igual que NCI-H69 (teñidas con calceína) y NCI-H196 (sin teñir). Las células se distribuyeron entre los pocillos que contenían anticuerpos, se tiñeron y lavaron de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Posteriormente, las muestras se procesaron en un analizador LSRFortessa equipado con un muestreador automático de alto rendimiento (BD Biosciences). Los niveles de fluorescencia se evaluaron utilizando FlowJo v,9,4,10 (Tree Star). La señal de tinción de calceína se utilizó para deconvolucionar muestras multiplexadas.

Tinción de anticuerpos

[0246] El análisis FACS se llevó a cabo ya sea en un clasificador de células FACSAria II (BD Biosciences) o en una LSRFortessa Analyzer (BD Biosciences). Los niveles de CD47 en la superficie se evaluaron mediante tinción de anticuerpos con el clon B6H12 (BioLegend) a una dilución de 1:100. Se evaluó HLA-A/B/C mediante tinción de anticuerpos con el clon W6/32 (BioLegend) a una dilución de 1:50. Se evaluó LILRB1 mediante tinción de anticuerpos con el clon GHI/75 (BioLegend) a una dilución de 1:25. LILRB2 se evaluó mediante tinción de anticuerpos con el clon 27D2 (BioLegend) a una dilución de 1:25. Todas las tinciones se realizaron en hielo durante 30 minutos, luego se lavaron y se resuspendieron de acuerdo con la práctica estándar.

B2M quimérico humano-ratón

[0247] B2M quimérico fue diseñado para incorporar diferencias de aminoácidos C-terminales de ratón B2m en una secuencia de B2M principalmente humana. La secuencia (indicada a continuación) se sintetizó químicamente (IDT) y se clonó en los sitios Nhel y NotI de pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro. La secuencia de origen del ratón está en minúsculas. >hmcB2M_geneblock

TTT AAGCT AGC AT GT CT CGCT CCGT GGCCTT AGCT GT GCT CGCGCT ACT CT CT CTTT CT G

GCCTGG AGGCT AT CC AGCGT ACT CCAA AG ATT CAGGTTT ACT CACGT CAT CCAGCAG AG

AAT GG AAAGT CAAATTT CCTG AATTGCT AT GT GTCTGGGTTT C ATCCAT CCG ACATT G AAG

TT G ACTT ACT G AAG AATGG AG AG AG AATT G AAAAAGTGG AGCATT C AG ACTT GT CTTT CA

GC A AGG ACT GGT CTTTCT AT CT CTT GT ACT AC ACTG AATT CACCCCC ACT G AAAA AG AT G

AGTATGCCtgcagagttaagcatgccagtatggccgagcccaagaccgtctactgggatcgagacatgtgaGCGGCCG

CAATTT (SEQ ID NO: 24).

Generación de fragmentos W6/32 Fab

[0248] El anticuerpo W6/32 (BioXcell) se desaló en una solución de citrato de sodio 20 mM pH 6,0, cisteína 25 mM, EDTA 5 mM, y se diluyó a una concentración de 4 mg/mL. La digestión con proteasa se logró mezclando con 250 ml de resina de ficina inmovilizada (Thermo Scientific) por ml de anticuerpo. La mezcla se incubó con rotación a 37°C durante 5 horas. Después de la incubación, los fragmentos Fab se purificaron del anticuerpo no digerido y los fragmentos Fc mediante cromatografía de intercambio iónico con una columna monoQ, seguida de cromatografía de exclusión por tamaño con una columna Superdex-200. Los fragmentos Fab se cuantificaron mediante Nanodrop y se comprobó su pureza mediante tinción de Coomassie.

Imágenes de estructura cristalina

[0249] Se generaron imágenes de estructura cristalina con MacPyMol v. 1,7.0,3 a partir de la estructura publicada IP7Q.

Ratones

[0250] Los ratones Nod.Cg-PRKDCSCID IL2RGtm1W¡l/SZJ (NSG) se utilizaron para todos los experimentos in vivo. Los ratones se injertaron con tumores aproximadamente a las 6-10 semanas de edad, y se realizaron experimentos con cohortes emparejadas por edad y sexo. Los ratones se mantuvieron en una instalación de barrera bajo el cuidado del Centro de Servicios Veterinarios de Stanford y se manipularon de acuerdo con los protocolos aprobados por el Panel Administrativo de la Universidad de Stanford sobre Cuidado de Animales de Laboratorio.

Modelo humanizado de ratón NSG

[0251] Los macrófagos humanos cultivados ex vivo y células etiquetadas de GFP-luciferasa KWNO1 o KWNO1-A (B2M) y se genera y se cosecha como se describe anteriormente. Se resuspendieron 200.000 macrófagos humanos, 100.000 células diana y 1 pl de PBS, 1 pl de solución madre Hu5F9-G4 1 mg/ml o 1 pl GHI/75 1 mg/ml en 50 pl de RPMI y se inyectaron por vía subcutánea el flanco derecho de un ratón NSG. Se utilizaron 5 ratones para cada grupo de tratamiento. La bioluminiscencia del tumor se evaluó usando un generador de imágenes IVIS Spectrum (Perkin Elmer) 12 horas después de la inyección, 4 días después de la inyección, 7 días después de la inyección y 14 días después de la inyección, como se indica. Los experimentos se realizaron de forma no ciega.

Experimentos de crecimiento In vivo

[0252] Los ratones NSG se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho, ya sea con 100.000 marcado con células etiquetadas con GFP-luciferasa KWNO1-A (B2M) (30 ratones) o KWNO1-Tg (hmcB2M)-A (B2M) (30 ratones) y aleatorizadas en cohortes de tratamiento utilizando las herramientas de aleatorización de lista en random.org. El tamaño de la muestra se eligió para asegurar una probabilidad superior al 95% de identificar, mediante la prueba t de dos colas, un efecto de >50%, asumiendo una variación técnica del 50%. A partir del día 14, los ratones se trataron una vez por semana mediante inyección intraperitoneal de 100 jL de PBS o 250 |jg Hu5F9-G4 a una concentración de 2,5 mg/mL. La luminiscencia del tumor se midió una vez por semana usando un generador de imágenes IVIS Spectrum (Perkin Elmer). Las mediciones se interrumpieron cuando los tumores en un grupo de medición comenzaron a exceder el flujo total de 5x1010, que es, en nuestra experiencia, un umbral por encima del cual las señales bioluminiscentes son menos precisas. A través de experimentos adicionales, incluidos experimentos piloto, se injertaron ratones adicionales por vía subcutánea con estas líneas celulares y se trataron con PBS, pero no se incluyeron como parte de este conjunto de datos. Se injertó una jaula adicional de 4 ratones con cada KWNO1-A (B2M) y KWNO1-Tg (hmcB2M)-A (B2M) y recibieron tratamiento con Hu5F9-G4 una vez a la semana, pero finalmente no se incluyeron en el análisis final del experimento. Los experimentos con ratones se realizaron de forma no ciega.

Histología

Se fijaron tumores KWNO1 en paraformaldehído al 2% durante la noche a cuatro grados. El tejido se incrustó y se congeló en el compuesto OCT (Sakura) a temperatura de corte óptima o se incrustó en parafina. Las secciones congeladas se cortaron a 4-7 jM y se guardaron para inmunofluorescencia.

Inmunofluorescencia

[0254] Se llevaron a cabo estudios de inmunofluorescencia en secciones congeladas. Las secciones congeladas se descongelaron a temperatura ambiente durante diez minutos y se lavaron en PBS dos veces. Los portaobjetos se bloquearon en suero al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las secciones se tiñeron con anticuerpos primarios contra F4:80 (1:100, monoclonal de rata, Abcam) durante la noche a 4°C y se lavaron tres veces en PBS. Los portaobjetos se tiñeron y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con AlexaFluor 647 durante una a dos horas a temperatura ambiente. Las manchas se lavaron una vez con PBST y tres veces con PBS antes de la tinción nuclear con Hoechst 33342 (Life Technologies), durante dos minutos y se montaron con Fluoromount G (Southern Biotech). El procesamiento de fotografías básico, incluida la coloración falsa del canal de fluorescencia, la combinación de canales y el ajuste de brillo y contraste, se realizó utilizando Adobe Photoshop (Adobe).

Ejemplo 3

[0255] Fig. 17. Resultados de los experimentos que miden la fagocitosis de dos líneas celulares de cáncer de mama humano diferentes (MDA-MB-468 y MDA-MB-231) por los macrófagos humanos con y sin anticuerpo anti-LILRB1 (y en la presencia o ausencia de otros anticuerpos, por ejemplo, Hu5F9-G4 que es un anticuerpo anti-CD47). Las barras de izquierda a derecha son: IgG4, Hu5F9-G4, Cetuximab, Trastuzumab, Panitumumab, Cetuximab+Hu5F9-G4, Trastuzumab+Hu5F9-G4 y Panitumumab+Hu5F9-G4.

[0256] Fig. 18 presenta datos que muestran que los ejes de señalización de CD47 y CMH Clase I son señales antifagocíticas independientes. Medición basada en FACS de la fagocitosis por macrófagos humanos cocultivados con células KWNO1 parentales (gris) y células KWNO1 eliminadas por B2M (rosa), tras el tratamiento con PBS, el anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4 (que bloquea la interacción CD47/SIRPA), o el anticuerpo anti-CD47 2D3 (que se une a CD47 pero no bloquea su interacción con SIRPA y, por lo tanto, representa cualquier anticuerpo que se une a una célula diana y opsoniza esa célula). Los valores se normalizan a la fagocitosis máxima observada para un conjunto dado de replicaciones. La deleción de B2M y la consiguiente eliminación de la expresión superficial del CMH Clase I aumenta significativamente la fagocitosis de las células KWNO1 en relación con las células KWNO1 parentales tras la opsonización con el anticuerpo anti-CD47 2D3 no bloqueante (***p<1x10‘4, ANOVA), demostrando así que la interrupción de CMH clase l/LILRB1 aumenta la fagocitosis incluso en condiciones de señalización intacta de CD47/SIRPA. La co-disrupción de la señalización de CMH clase I/LILRB1 y la señalización de CD47/SIRPA mediante el tratamiento de células KWNO1 eliminadas por B2M con Hu5F9-G4, que bloquea CD47/SIRPA y opsoniza las células diana, conduce a un aumento significativo y sinérgico de la fagocitosis en relación con la disrupción de cualquier vía de señalización sola (***p<1x10‘4, ANOVA).

[0257] Los datos presentados aquí demuestran que CMH Clase I es una señal reguladora crítica para las funciones efectoras de los macrófagos. Estos hallazgos identifican el eje de señalización CMH/LILRB1 como un objetivo para el tratamiento (p. ej., inmunoterapia contra el cáncer). Al interrumpir esta vía, p. ej., junto con agentes y anticuerpos monoclonales específicos de tumores (p. ej., contra el eje CD47/LILRB1), los agentes terapéuticos contra CMH/LILRB1 pueden permitir la estimulación de respuestas potentes de agentes anti-cáncer mediados por macrófagos (y/o infección anti-crónica).

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para inducir la fagocitosis de una célula diana, comprendiendo el método: poner en contacto una célula diana con un macrófago en presencia de una composición para aumentar la fagocitosis de una célula diana, la composición comprende:

   (a) un agente de miembro 1 de subfamilia B de receptor tipo inmunoglobulina anti-CMH Clase I/leucocitos (LILRB1) que reduce la unión entre CMH Clase I en la célula diana y LILRB1 en una célula fagocítica, donde dicho agente anti-CMH Clase I/LILRB es:

   (i) un anticuerpo anti-CMH Clase I,

   (ii) un péptido LILRB1 que comprende uno o más de los dominios de inmunoglobulina extracelular de LILRB1,

   (iii) un anticuerpo anti-LILRB1, o

   (iv) un complejo de CMH Clase I soluble que se une a LILRB1; y

   (b) un agente anti-CD47/SIRPA que reduce la unión de CD47 en la célula diana a SIRPa en una célula fagocítica, donde dicho agente anti-CD47/SIRPA es:

   (i) un anticuerpo anti-CD47,

   (ii) un polipéptido SIRPa de alta afinidad que comprende un dominio d i de SIRPa humano, con al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d i, en donde el cambio de aminoácido aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPa a CD47 al disminuir la tasa de desviación en al menos 10 veces,

   (iii) un reactivo SIRPA que comprende al menos el dominio d i de SIRPA,

   (iv) un anticuerpo anti-SIRPa, o

   (v) un polipéptido CD47 soluble,

   para un período de tiempo suficiente para inducir la fagocitosis de la célula diana por el macrófago, en donde el contacto es in vitro o ex vivo.

   2. El método de la reivindicación 1, en donde la célula diana es una célula cancerosa o una célula infectada con un patógeno intracelular.

   3. Un agente miembro 1 de subfamilia B del receptor de tipo inmunoglobulina anti-CMH Clase I/leucocitario (LILRB1) para su uso en un método de tratamiento del cáncer o una infección intracelular por patógenos en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo:

   (a) el agente anti-CMH Clase I/LILRB1, en donde el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 reduce la unión entre CMH Clase I en una célula diana y LILRB1 en una célula fagocítica, y donde el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 es:

   (i) un anticuerpo anti-CMH Clase I,

   (ii) un péptido LILRB1 que comprende uno o más de los dominios de inmunoglobulina extracelular de LILRB1,

   (iii) un anticuerpo anti-LILRB1, o

   (iv) un complejo soluble de CMH Clase I que se une a LILRB1; y

   (b) un agente anti-CD47/SIRPA que reduce la unión de CD47 en una célula diana a SIRPa en una célula fagocítica, en donde el agente anti-CD47/SIRPA es:

   (i) un anticuerpo anti-CD47,

   (ii) un polipéptido SIRPa de alta afinidad que comprende un dominio d1 de SIRPa humano, con al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d1, en donde el cambio de aminoácido aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPa a CD47 al disminuir la tasa de desviación en al menos 10 veces,

   (iii) un reactivo SIRPA que comprende al menos el dominio d1 de SIRPA,

   (iv) un anticuerpo anti-SIRPa, o

   (v) un polipéptido CD47 soluble,

   en cantidades eficaces para reducir el número de células cancerosas y/o células que albergan el patógeno intracelular en el individuo.

   4. Un agente anti-CD47/SIRPA para uso en un método de tratamiento del cáncer o una infección intracelular por patógenos en un individuo, comprendiendo el método administrar al individuo:

   (a) un agente de miembro 1 de subfamilia B de receptor de tipo inmunoglobulina de anti-CMH Clase I/leucocitos (LILRB1) que reduce la unión entre CMH Clase I en una célula diana y LILRB1 en una célula fagocítica, en donde el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 es:

   (i) un anticuerpo anti-CMH Clase I,

   (ii) un péptido LILRB1 que comprende uno o más de los dominios de inmunoglobulina extracelular de LILRB1,

   (iii) un anticuerpo anti-LILRB1, o

   (iv) un complejo de CMH Clase I soluble que se une a LILRB1; y

   (b) el agente anti-CD47/SIRPA, donde el agente anti-CD47/SIRPA reduce la unión de CD47 en una célula diana a SIRPa en una célula fagocítica, y donde el agente anti-CD47/SIRPA es:

   (i) un anticuerpo anti-CD47,

   (ii) un polipéptido SIRPa de alta afinidad que comprende un dominio d i de SIRPa humano, con al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d i, donde el aminoácido el cambio aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPa a CD47 al disminuir la tasa de desviación en al menos 10 veces,

   (iii) un reactivo SIRPA que comprende al menos el dominio d i de SIRPA,

   (iv) un anticuerpo anti-SIRPa, o

   (v) un polipéptido CD47 soluble,

   en cantidades eficaces para reducir el número de células cancerosas y/o células que albergan el patógeno intracelular en el individuo.

   5. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 para uso de la reivindicación 3, o el agente anti-CD47/SIRPA para uso de la reivindicación 4, donde el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 se une específicamente a LILRB1 y no activa la señalización a través de LILRB1 tras la unión, opcionalmente en donde el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 es un anticuerpo anti-LILRBI.

   6. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 para uso de la reivindicación 3, o el agente anti-CD47/SIRPA para uso de la reivindicación 4, en donde el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 se une específicamente al CMH Clase I, opcionalmente en donde:

   (a) el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 se une específicamente al CMH Clase I clásico, en donde dicho CMH Clase I clásico carece de HLA-G y comprende al menos uno de HLA-A, HLA- B, y HLA-C, opcionalmente además donde dicho agente anti-CMH Clase I/LILRB1 es un anticuerpo, o

   (b) el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 es un péptido LILRB1 soluble que comprende uno o más dominios de inmunoglobulina extracelular de LILRB1.

   7. El agente anti-CMH Clase I/LILRB1 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 3, 5 y 6, o el agente anti-CD47/SIRPA para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde:

   (i) el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y el agente anti-CD47/SIRPA se administran simultáneamente, o (ii) el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 y el agente anti-CD47/SIRPA no se administran simultáneamente, o (iii) el método comprende, antes de la etapa de administración:

   medir el nivel de expresión de CMH Clase I en una muestra biológica del individuo, donde la muestra biológica comprende una célula cancerosa o una célula que alberga un patógeno intracelular; y proporcionar una predicción, basada en el resultado de dicha medición, de que el individuo es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA.

   8. Un método para predecir si un individuo es resistente o susceptible al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA que reduce la unión de CD47 en una célula diana a SIRPa en una célula fagocítica, comprendiendo el método:

   (a) medir el nivel de expresión de CMH Clase I en una muestra biológica del individuo, en donde la muestra biológica comprende una célula cancerosa o una célula que alberga un patógeno intracelular, para producir un valor de prueba medido;

   (b) comparar el valor de prueba medido con un valor de control; y

   (c) proporcionar una predicción, basada en dicha comparación, sobre si el individuo es resistente o susceptible al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA, en donde dicho agente anti-CD47/SIRPA reduce la unión de CD47 en una célula diana a SIRPa en una célula fagocítica es:

   (i) un anticuerpo anti-CD47,

   (ii) un polipéptido SIRPa de alta afinidad que comprende un dominio d1 de SIRPa humano, con al menos un cambio de aminoácido en relación con la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d1, en donde el cambio de aminoácido aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPa a CD47 al disminuir la tasa de desviación en al menos 10 veces,

   (iii) un reactivo SIRPA que comprende al menos el dominio d1 de SIRPA,

   (iv) un anticuerpo anti-SIRPa, o

   (v) un polipéptido CD47 soluble.

   9. Método según la reivindicación 8, en donde:

   (a) dicha medición comprende un método basado en anticuerpos, y/o

   (b) el método basado en anticuerpos comprende citometría de flujo, y/o

   (c) dicho CMH Clase I es CMH Clase I clásico que carece de HLA-G y comprende HLA-A, HLA-B y/o HLA-C, y/o

   (d) el valor de control es el nivel de expresión de CMH Clase I de una célula o población de células se sabe que exhibe un fenotipo de resistencia al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA que reduce la unión de CD47 en una célula diana a SIRPa en una célula fagocítica, y/o

   (e) el valor de control es el valor de fondo del paso de medición, y/o

   (f) comprende una etapa de determinar que la célula de cáncer o la célula que alberga un patógeno intracelular es positiva para CMH clase I, y proporcionar una predicción de que el individuo es resistente al tratamiento con un agente anti-CD47/SIRPA que reduce la unión de CD47 en una célula diana a SIRPa en una célula fagocítica, y/o

   (g) proporcionar una predicción comprende generat un informe que incluye al menos uno de: (i) el nivel de expresión medido de CMH Clase I, (ii) el nivel de expresión medido normalizado de CMH Clase I, (iii) una predicción de resistencia o susceptibilidad a un agente anti-CD47/SIRPA y (iv) una terapia recomendada basada en el valor de prueba medido, en donde opcionalmente el informe se muestra en un dispositivo de salida en una ubicación remota al ordenador;

   y en donde dicho agente anti-CD47/SIRPA en (d), (f) y (g) es:

   (i) un anticuerpo anti-CD47,

   (ii) un polipéptido SIRPa de alta afinidad que comprende un dominio d i de SIRPa humano, con al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo salvaje dentro del dominio d i, en donde el cambio de aminoácido aumenta la afinidad de la unión del polipéptido SIRPa a CD47 al disminuir la tasa de desviación en al menos 10 veces, (iii) un reactivo SIRPA que comprende al menos el dominio d i de SIRPA,

   (iv) un anticuerpo anti-SIRPa, o

   (v) un polipéptido CD47 soluble;

   y en donde dicho agente anti-CMH Clase I/LILRB1 en (g) es:

   (i) un anticuerpo anti-CMH Clase I,

   (ii) un péptido LILRB1 que comprende uno o más de los dominios de inmunoglobulina extracelular de LILRB1,

   (iii) un anticuerpo anti-LILRBI, o

   (iv) un complejo soluble de CMH Clase I que se une a LILRB1.

   10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 5, 6, 8 y 9, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5-7, o el agente anti-CD47/SIRPA para uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde el patógeno intracelular es un virus,

   una bacteria, un protozoo o un hongo.

   11. El método, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 para su uso, o el agente anti-CD47/SIRPA para su uso de la reivindicación 10, en donde el patógeno intracelular es:

   (a) retrovirus (por ejemplo, VIH), lentivirus, virus hepadna, virus del herpes (por ejemplo, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, CMV o virus de Epstein Barr), virus de la viruela, virus del papiloma humano, adenovirus, virus de la influenza, flavivirus, echovirus, rinovirus, virus coxsackie, cornovirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC o virus de la encefalitis arboviral,

   (b) Micobacteria, Chlamydophila, Ehrlichia, Rickettsia, Brucella, Legionella, Francisella, Listeria, Coxiella, Neisseria, Salmonela, Yersinia sp, Helicobacter pylori, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococo, conococo, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, E. coli, legionella, difteria, salmonela, bacilos o bacterias de la enfermedad de Lyme,

   (c) Plasmodium sp., Trypanosoma sp., Giardia sp., Toxoplasma sp., Leishmania sp., Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondy, orlus Nilipposistrongii, o

   (d) Candida (por ejemplo, C. albicans, C. krusei, C. glabrata o C. tropicalis), Cryptococcus neoforman Aspergillus (por ejemplo, A. fumigatus o A. niger), género Mucorales (por ejemplo, M. mucor, M. absidia o M. rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis o Histoplasma capsulatu

   12. El agente anti-CMH Clase I/LILRB1 para su uso o el agente anti-CD47/SIRPA para su uso de la reivindicación 10, en donde la infección por patógenos intracelulares es la bacteria clamidia, difteria, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste o leptospirosis.

   13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 5, 6, 8 y 9, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5-7, o el agente anti-CD47/SIRPA para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde el cáncer se selecciona entre cánceres de tumores sólidos (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de hígado, glioblastoma, meduloblastoma, leiomiosarcoma, carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello, melanomas, cáncer neuroendocrino); cánceres líquidos (por ejemplo, cánceres hematológicos); carcinomas; tumores de tejidos blandos; sarcomas; teratomas; melanomas; leucemias; linfomas; y cánceres de cerebro.

   14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 5, 6, 8 y 9, el agente anti-CMH Clase I/LILRB1 para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5-7, o el agente anti-CD47/SIRPA para uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde el cáncer es cáncer de mama, carcinoma de colon, cáncer de pulmón de células pequeñas, melanoma u osteosarcoma.