ES2378097T3 - Proteínas de unión al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) - Google Patents

Abstract

Una proteína de unión aislada que se une al factor de crecimiento de hepatocitos humano (HGF) que comprende (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 18, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 19 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 20; y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 15, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 16 ó SEC ID Nº : 203 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 17.

Description

Proteínas de unión al factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)

SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de las Solicitudes Provisionales de Estados Unidos Nº 60/810.714, presentada el 2 de junio de 2006 y 60/860.461, presentada el 21 de noviembre de 2006.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de la invención es la biología molecular, inmunología y oncología. Más particularmente, el campo es proteínas de unión basadas en anticuerpos que se unen a factor de crecimiento de hepatocitos humano (HGF).

ANTECEDENTES

El Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF), también conocido como Factor de Difusión (SF), es una proteína heterodimérica multifuncional producida predominantemente por células mesenquimales y es un efector de células que expresan la tirosina quinasa receptora Met (Bottaro et al (1991) SCIENCE 251: 802-804, Rubin et al (1993) BIOCHIM. BlOPHYS. Acta 1155: 357-371). El receptor Met humano también se conoce como “c-Met”. El HGF maduro contiene dos cadenas polipeptídicas, la cadena α y la cadena β. Estudios publicados sugieren que es la cadena α la que contiene el dominio de unión a receptor c-Met del HGF.

Cuando se une con su receptor afín, HGF media varias actividades celulares. La ruta de señalización de HGF-Met desempeña un papel en la regeneración de hígado, curación de heridas, regeneración neural, angiogénesis y tumores malignos. Véase, por ejemplo, Cao et al. (2001) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 98: 7443-7448, Burgess et al. (2006) CANCER RES. 66: 1721-1729, y Patentes de Estados Unidos Nº 5.997.868 y 5.707.624. Los investigadores han estado desarrollando varios moduladores de HGF, incluyendo anticuerpos, para tratar diversos trastornos que implican actividad de HGF, por ejemplo, ciertos cánceres sensibles a HGF. Véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud Internacional Nº WO 2005/017107.

La estructura básica común de todos los anticuerpos se muestra de forma esquemática en la Figura 1. Los anticuerpos son proteínas multiméricas que contienen cuatro cadenas polipeptídicas. Dos de las cadenas polipeptídicas se denominan cadenas pesadas o H y dos de las cadenas polipeptídicas se denominan cadenas ligeras o L. Las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina están conectadas por un enlace disulfuro intercatenario. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina están conectadas por varios enlaces disulfuro intercatenarios. Una cadena ligera está compuesta de una región variable (VL en la Figura 1) y una región constante (CL en la Figura 1), mientras que la cadena pesada está compuesta de una región variable (VH en la Figura 1) y al menos tres regiones constantes (CH1, CH2 y CH3 en la Figura 1). Las regiones variables determinan la especificidad del anticuerpo y las regiones constantes tienen otras funciones.

La información estructural y de aminoácidos indica que cada región variable comprende tres regiones hipervariables (también conocidas como regiones determinantes de complementariedad o CDR) flanqueadas por cuatro regiones flanqueantes o FR relativamente conservadas. Las tres CDR, denominadas CDR1, CDR2 y CDR3, son responsables de la especificidad de unión de anticuerpos individuales. Cuando los anticuerpos van a usarse como agentes terapéuticos y de diagnóstico, típicamente es deseable crear anticuerpos que tengan la mayor especificidad de unión y afinidad con la molécula diana. Se cree que diferencias en las regiones variables pueden tener efectos profundos en la especificidad y afinidad del anticuerpo.

En el documento WO 2005/017107 A, se describen anticuerpos para la proteína HGF humana. La patente de Estados Unidos Nº 5.707.624 describe el uso de anticuerpos anti-HGF en el tratamiento de sarcoma de Kaposi. De forma similar, la Patente de Estados Unidos Nº 5.997.868 describe el tratamiento de un tumor por administración de un anticuerpo anti-HGF al paciente a tratar para bloquear la capacidad de HGF endógeno para promover angiogénesis en el tumor. Más recientemente, los investigadores proponen que los anticuerpos que se unen a la cadena β de HGF pueden tener potencial como agentes terapéuticos en pacientes con tumores dependientes de HGF (Burgess (2006) mencionado anteriormente).

No obstante, existe aún una necesidad de moduladores de HGF adicionales que puedan usarse como agentes terapéuticos y de diagnóstico.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de una familia de proteínas de unión que se unen específicamente a HGF, en particular HGF humano. Las proteínas de unión están basadas en anticuerpos en la medida en que contienen sitios de unión a antígeno (es decir, HGF) basados en las CDR de una familia de anticuerpos que se unen específicamente a HGF. Las CDR confieren la especificidad de unión de las proteínas de unión para HGF. Las proteínas de unión pueden usarse como agentes de diagnóstico y terapéuticos. Cuando se usan como un agente terapéutico, las proteínas de unión se modifican por ingeniería genética (por ejemplo, se humanizan) para reducir o eliminar el riesgo de inducir una respuesta inmune contra la proteína de unión cuando se administra al receptor (por ejemplo, un ser humano).

Las proteínas de unión neutralizan la actividad de HGF y, por lo tanto, pueden usarse como un agente terapéutico. En ciertas realizaciones, las proteínas de unión evitan que HGF se una a su receptor afín, c-Met, neutralizando de este modo la actividad de HGF. Debido a que se ha implicado HGF en el crecimiento y proliferación de células cancerosas, las proteínas de unión pueden usarse para inhibir la proliferación de células cancerosas. Además, cuando se administran a un mamífero, las proteínas de unión pueden inhibir o reducir el crecimiento tumoral en el mamífero.

La invención proporciona una proteína de unión aislada que se une al factor de crecimiento de hepatocitos humano (HGF) que comprende.

(i)

una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 18, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 19 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 20; y

(ii)

una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 15, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 16 o SEC ID Nº: 203 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 17.

La invención proporciona adicionalmente una proteína de unión aislada que se une al factor de crecimiento de hepatocitos humano (HGF) que comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionadas del grupo que consiste en:

(a)

una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 14, y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 20-137 de SEC ID Nº: 12;

(b)

una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 173 y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 165;

(c)

una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 173 y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 169,

(d)

una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 179 y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 165; y

(e)

una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 179 y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 169.

La invención también proporciona una proteína de unión aislada que se une al factor de crecimiento de hepatocitos humano (HGF) que comprende una cadena ligera de inmunoglobulina y una cadena pesada de inmunoglobulina seleccionadas del grupo que consiste en:

(a)

una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 177 y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 167;

(b)

una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 177 y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 171;

(c)

una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 177 y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 210;

(d)

una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 181 y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 167;

(e)

una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 181 y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 171; y

(f)

una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 181 y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 210.

También se proporciona la proteína de unión de la invención para su uso en terapia. En ciertas realizaciones la proteína de unión de la invención es para su uso en la inhibición o reducción de la proliferación de una célula tumoral o para su uso en la inhibición o reducción del crecimiento tumoral en un mamífero.

La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia SEC ID Nº: 18, una CDRL2 que comprende una secuencia SEC ID Nº: 19 y una CDRL3 que comprende la secuencia SEC ID Nº: 20 y una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia SEC ID Nº: 15, una CDRH2 que comprende la secuencia SEC ID Nº: 16 o SEC ID Nº: 203 y una CDRH3 que comprende la secuencia SEC ID Nº: 17.

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico tal y una célula hospedadora que comprende dicho vector de expresión.

La invención también proporciona una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia SEC ID Nº: 18, una CDRL2 que comprende la secuencia SEC ID Nº: 19 y una CDRL3 que comprende la secuencia SEC ID Nº: 20 y un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia SEC ID Nº: 15, una CDRH2 que comprende la secuencia SEC ID Nº: 16 o SEC ID Nº: 203 y una CDRH3 que comprende la secuencia SEC ID Nº: 17.

En otro aspecto la invención proporciona un método para producir una proteína de unión de la invención, comprendiendo el método:

(i)

cultivar la célula hospedadora de la invención en condiciones tales que la célula hospedadora exprese la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina; y

(ii)

recoger la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina.

Estos y otros aspectos y ventajas de la invención resultarán evidentes tras la consideración de las siguientes figuras, descripción detallada y reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La invención puede entenderse más completamente con referencia a los siguientes dibujos.

La Figura 1 es una representación esquemática de un anticuerpo típico.

La Figura 2 es un diagrama esquemático que muestra la secuencia de aminoácidos que define la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina completa de los anticuerpos indicados como 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 y 3D11. Las secuencias de aminoácidos para cada anticuerpo se alinean entre sí y las regiones que definen el péptido señal, CDR1, CDR2 y CDR3 se identifican en cajas. Las secuencias fuera de las cajas representan las secuencias FR.

La Figura 3 es un diagrama esquemático que muestra las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 para cada una de las secuencias de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina presentadas en la Figura 2.

La Figura 4 es un diagrama esquemático que muestra la secuencia de aminoácidos que define la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina completa de los anticuerpos 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 y 3D11. Las secuencias de aminoácidos para cada anticuerpo se alinean entre sí y las regiones que definen el péptido señal, CDR1, CDR2 y CDR3 se identifican en cajas. Las secuencias fuera de las cajas representan las secuencias FR.

La Figura 5 es un diagrama esquemático que muestra las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 para cada una de las secuencias de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina presentadas en la Figura 4.

La Figura 6 es un gráfico que resume los resultados de un experimento para medir la actividad inhibidora de tumores de anticuerpos anti-HGF 1D3, 1F3, 1A3 y 2B8 en un modelo de xenotrasplante U87MG. Los rombos corresponden a PBS; los triángulos corresponden a anticuerpo anti-HGF 1A3; X corresponde a anticuerpo anti-HGF 1D3; los cuadrados corresponden a anticuerpo anti-HGF 1F3 y los círculos corresponden a anticuerpo anti-HGF 2B8.

La Figura 7 es un gráfico que resume los resultados de un experimento para medir la actividad inhibidora de tumor de los anticuerpos anti-HGF 1D3, 1F3, 1A3 y 2B8 en un modelo de xenotrasplante U118. Los rombos corresponden a IgG; los cuadrados corresponden a anticuerpo anti-HGF 1F3, los triángulos a anticuerpo anti-HGF 1D3; X corresponde a anticuerpo anti-HGF 1A3 y los círculos corresponden a anticuerpo anti-HGF 2B8.

La Figura 8 es una tabla que resume los datos de resonancia de plasmón superficial en la afinidad de unión a antígeno y cinética de interacción entre HGF humano y anticuerpos 2B8 quiméricos, quiméricos/humanizados o humanizados. La tabla enumera los pares de cadena ligera Kappa y cadena pesada de IgG1 ensayados. Los anticuerpos con desviaciones típicas (DEVTIP) enumerados se analizaron en tres experimentos independientes.

La Figura 9 es un gráfico de barras que resume los datos experimentales que indican que Hu2B8 se une a un epítopo mutuamente exclusivo para anticuerpo monoclonal murino 2B8. 2B8 humanizado o quimérico se capturó en una microplaca de Fc antihumano. HGF se unión después al 2B8 humanizado o quimérico. Se midió la capacidad de 2B8 de ratón o el anticuerpo de control (anticuerpo policlonal de cabra anti-HGF) para unirse al HGF capturado. Tanto los anticuerpos 2B8 humanizados como 2B8 quiméricos evitan que 2B8 murino se una a HGF. Las barras blancas corresponden al anticuerpo 2B8 quimérico; las barras grises corresponden al anticuerpo Hu2B8 humanizado (región variable kappa Kv1-39.1 y región variable de cadena pesada Hv5-51.1); las barras negras corresponden al anticuerpo Hu2B8 humanizado (región variable kappa Kv3-15.1 y región variable de cadena pesada Hv5-51.1).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de una familia de proteínas de unión que se unen específicamente y neutralizan la actividad de HGF, en particular, HGF humano. Las proteínas de unión pueden usarse en una diversidad de aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. Las proteínas de unión se basan en los sitios de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal que se ha seleccionado por su capacidad para unirse a, y neutralizar la actividad de, HGF. En particular, las proteínas de unión contienen secuencias CDR de región variable de inmunoglobulina que definen juntas un sitio de unión para HGF.

A la vista de la actividad neutralizadora de estos anticuerpos, son particularmente útiles en la modulación del crecimiento y/o proliferación de células sensibles a HGF, por ejemplo, células cancerosas. Cuando se usan como un agente terapéutico, las proteínas de unión pueden modificarse por ingeniería genética para minimizar o eliminar el riesgo de inducir una respuesta inmune contra las proteínas de unión, cuando se administran al receptor. Además, dependiendo de la aplicación particular, se contempla que las proteínas de unión puedan conjugarse con otros restos, por ejemplo, marcadores detectables, por ejemplo, radiomarcadores, y moléculas efectoras, por ejemplo otros agentes terapéuticos basados en moléculas pequeñas y proteínas. Cada una de estas características y aspectos de la invención se realizan en más detalle posteriormente.

I – Proteínas de Unión que se Unen a HGF

En un aspecto, la invención proporciona una proteína de unión aislada que se une a HGF humano. La proteína de unión comprende (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRL1-CDRL2CDRL3 y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR), en la que la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina juntas definen un sitio de unión sencillo para unirse a HGF humano. Como se describe en la presente memoria CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos X1 X2 Ser X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15, en la que el aminoácido X1 es Arg, Lys, o Ser, X2 es Ala o Thr, X4 es Glu, Gin, o Ser, X5 es Asn, Asp, o Ser, X6 es He o Val, X7 es Asp, Lys, Ser, Val, o Tyr, X8 es un enlace peptídico o Tyr, X9 es un enlace peptídico o Asp, X10 es un enlace peptídico o Gly, X11 es un enlace peptídico o Asn, X12 es un enlace peptídico, Ile o Ser, X13 es Asn o Tyr, X14 es He, Leu, Met, o Val, X15 es Ala, Asn, His, o Ser. CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22, en la que el aminoácido X16 es Ala, Asp, Arg, Gly, o Val, X17 es Ala, Thr, o Val, X18 es Asn, Ser, o Thr, X19 es Arg, Asn, Lys, o His, X20 es Leu o Arg, X21 es Ala, Asn, Glu, Val, o Pro, X22 es Asp, Ser, o Thr. CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, en la que el aminoácido X23 es Leu, Gly, o Gin, X24 es Hes

o Gin, X25 es Phe, Ser, Tip, o Tyr, X26 es Asp, He, Ser, Trp, o Tyr, X27 es Gly, Glu, Asn, o Ser, X28 es Asp, Asn, Phe, Thr,

o Tyr, X30 es Leu, Phe, Pro, o Tyr.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión aislada que se une a HGF humano que comprende (i) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la estructura CDRH1-CDRH2-CDRH3 y (ii) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR), en la que la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina definen juntas un sitio de unión sencillo para unirse a HGF humano. Como se describe en la presente memoria CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos X1 Tyr X3 X4 X5, en la que el aminoácido X1 es Asp, Asn, Ser,

o Thr, X3 es Phe, Ser, Trp, o Tyr, X4 es He, Leu, o Met, X5 es Asn, Hes, o Ser. CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos X6 lle X8 X9 X10 X11 Gly X13 X14 X15 Tyr X17 X18 X19 X20 X21 X22, en la que el aminoácido X6 es Lys, Gin, Glu, Val, o Tyr, X8 es Asn, Gly, Ser, Tip, o Tyr, X9 es Ala, Pro o Ser, X10 es Gly o Thr, X11 es un enlace peptídico, Asp, Asn, Gly, o Ser, X13 es Asp, Asn, His, o Ser, X14 es Ser o Thr, X15 es Asn o Tyr, X17 es Asn o Pro, X18 es Ala, Asp, Gly, Gin, Glu, Pro, o Ser, X19 es Asn, Lys, Met, o Ser, X20 es Leu, Phe o Val, X21 es Lys, Met, o Gin, X22 es Asp, Gly o Ser. CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 Tyr, en la que el aminoácido X23 es Arg, Asn, Gin, o Glu, X24 es Gly, Leu, Arg, o Tyr, X25 es un enlace peptídico, Asp, o Gly, X26 es un enlace peptídico o Gly, X27 es un enlace peptídico o Tyr, X28 es un enlace peptídico, Leu, o Tyr, X29 es un enlace peptídico, Gly, Leu, Arg, o Val, X30 es un enlace peptídico, Asp, Gly, o Glu, X31 es un enlace peptídico, Asn, Arg, Ser, o Tyr, X32 es un enlace peptídico, Ala, Gly, He, o Tyr, X33 es Met o Phe, X34 es Ala o Asp.

Se entiende que la proteína de unión puede comprender las secuencias tanto de cadena ligera de inmunoglobulina como de cadena pesada de inmunoglobulina o los fragmentos de las mismas, indicados anteriormente. Además, se entiende que la proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un sitio de anticuerpo biosintético.

En ciertas realizaciones, las secuencias de CDR de la cadena ligera de inmunoglobulina y la cadena pesada de inmunoglobulina se interponen con regiones flanqueantes (FR).

En ciertas otras realizaciones, las secuencias de CDR de la cadena ligera de inmunoglobulina y la cadena pesada de inmunoglobulina se interponen entre regiones flanqueantes humanas o humanizadas.

En una realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de SEC ID Nº 18 (2B8), una CDRL2 que comprende la secuencia de SEC ID Nº 19 (2B8) y una CDRL3 que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 20 (2B8).

En cada una de las realizaciones anteriores, las secuencias CDRL1, CDRL2 y CDRL3 preferentemente se interponen entre FR de inmunoglobulina humanas o humanizadas. Se entiende que la proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto, un fragmento de unión a antígeno del mismo o un sitio de anticuerpo biosintético.

En otra realización, la proteína de unión comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende: una CDRH1 que comprende la secuencia de SEC ID Nº 15 (2B8), una CDRH2 que comprende la secuencia de SEC ID Nº 16 (2B8) o SEC ID Nº: 203 (Hu2B8 Hv5a.1 o Hu2B8 Hv5-5.1) y una CDRH3 que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 17 (2B8).

En cada una de las realizaciones anteriores, las secuencias CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se interponen preferentemente entre FR de inmunoglobulina humanas o humanizadas. Se entiende que la proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto, un fragmento de unión a antígeno del mismo o un sitio de anticuerpo biosintético.

La invención proporciona una proteína de unión que se une HGF humano que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 20-137 de SEC ID Nº: 12 (2B8) y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 21-127 de SEC ID Nº: 14 (2B8).

En cada una de las realizaciones anteriores, la proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto, un fragmento de unión a antígeno del mismo o un sitio de anticuerpo biosintético.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión aislada que se une a HGF humano que comprende (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 173 (región variable de cadena ligera Hu2B8 Kv1-39.1) y SEC ID Nº 179 (región variable de cadena ligera Hu2B8 Kv3-15.1) y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 165 (región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5a.1) y SEC ID Nº: 169 (región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv551.1). La proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto, un fragmento de unión a antígeno del mismo o un sitio de anticuerpo biosintético.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión aislada que se une a HGF humano que comprende (i) una cadena ligera de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº 177 (Hu2B8 Kv1-39.1 + constante kappa (alotipo Km (3) (alelo 2))) y SEC ID Nº 181 (Hu2B8 Kv3-15.1 + constante kappa (alotipo Km (3) (alelo 2))) y (ii) una cadena pesada de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 167 (Hu2B8 Hv5a.1 + constante IgG1 (alotipo G1m (17,1))), SEC ID Nº: 171 (Hu2B8 Hv5-51.1 + constante IgG1 (alotipo G1m (17,1))) y SEC ID Nº: 210 (Hu2B8 Hv5-51.1 + constante IgG1 (alotipo G1m (3) (alelo 2))). La proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto, un fragmento de unión a antígeno del mismo o un sitio de anticuerpo biosintético.

También se describe una proteína de unión aislada que se une a HGF humano reducido. La proteína de unión comprende (i) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende tres CDR y (ii) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende tres CDR. Las CDR típicamente se interponen entre las FR. Las CDR de la cadena ligera de inmunoglobulina y la cadena pesada de inmunoglobulina definen juntas un sitio de unión que se une a HGF humano reducido, por ejemplo, la cadena α de HGF reducido. HGF reducido se refiere a HGF tratado con una cantidad de agente reductor, por ejemplo, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol o glutatión suficiente para reducir el enlace disulfuro entre la cadena α y la cadena β. Las concentraciones ejemplares incluyen, por ejemplo, DTT 100 mM y 2-mercaptoetanol 5 %.

También se describe en la presente memoria una proteína de unión que comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende al menos una CDR seleccionada del grupo que consiste en CDRL1, CDRL2 y CDRL3. Opcionalmente, la proteína de unión comprende dos CDR, por ejemplo, CDRL1 y CDRL2 o CDRL1 y CDRL3, o CDRL1 y CDRL3. Opcionalmente, la proteína de unión comprende las tres CDR, es decir, CDRL1, CDRL2 y CDRL3. CDRL1 descrita en la presente memoria comprende la secuencia de aminoácidos X1 X2 Ser X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15, en la que el aminoácido X1 es Arg o Lys, X2 es Ala o Thr, X4 es Glu o Gln, X5 es Asn, Ser o Asp, X6 es Ile o Val, X7 es Tyr, Asp o Lys, X8 es un enlace peptídico o Tyr, X9 es un enlace peptídico o Asp, X10 es un enlace peptídico o Gly, X11 es un enlace peptídico o Asn, X12 es un enlace peptídico o Ser, X13 es Asn o Tyr, X14 es Ile o Leu, X15 es Ala, Asn, o Ser. CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22, en la que el aminoácido X16 es Ala, Asp, Val o Arg, X17 es Ala, o Val, X18 es Asn, Ser, o Thr, X19 es Arg, Asn, o His, X21 es Ala, Glu, Val, o Pro, X22 es Asp o Ser. CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, en la que el aminoácido X23 es Leu, o Gln, X24 es His o Gln, X25 es Phe, Ser, o Tyr, X26 es Asp, Ile, o Trp, X27 es Gly o Glu, X28 es Asp, Phe o Thr, X30 es Phe, Pro, o Tyr.

También se describe en la presente memoria una proteína de unión que comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos una CDR seleccionada del grupo que consiste en CDRH1, CDRH2 y CDRH3. Opcionalmente, la proteína de unión comprende dos CDR, por ejemplo, CDRH1 y CDRH2, o CDRH1 y CDRH3, o CDRH1 y CDRH3. Opcionalmente, la proteína de unión comprende las tres CDR, es decir, CDRH1, CDRH2 y CDRH3. CDRH1 descrita en la presente memoria comprende la secuencia de aminoácidos X1 Tyr X3 X4 X5, en la que el aminoácido X1 es Asp, Asn, Ser, o Thr, X3 es Phe, Trp, o Tyr, X4 es Ile, Leu, o Met, X5 es Asn, His, o Ser. CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos X6 lle X8 X9 Gly X11 Gly X13 X14 X15 Tyr X17 X18 X19 X20 Lys X22, en la que el aminoácido X6 es Lys, Gln, o Tyr, X8 es Gly, Ser, o Tyr, X9 es Pro o Ser, X11 es Asp, Gly, o Ser, X13 es Asp o Ser, X14 es Ser o Thr, X15 es Asn o Tyr, X17 es Asn o Pro, X18 es Ala, Asp, Gly o Glu, X19 es Asn, Met o Ser, X20 es Phe o Val, X22 es Asp o Gly. CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 Tyr, en la que el aminoácido X23 es Argo Gln, X24 es Gly o Leu, X25 es Asp, Gly o un enlace peptídico, X26 es Gly o un enlace peptídico, X27 es un enlace peptídico o Tyr, X28 es Leu, un enlace peptídico o Tyr, X29 es una Gly, Arg o Leu, X30 es Asp, Gly, o Glu, X31 es Tyr, Arg o Asn, X32 es Ala, Gly, o Tyr, X33 es Met o Phe.

Se entiende que la proteína de unión puede comprender las secuencias tanto de cadena pesada de inmunoglobulina como de cadena ligera de inmunoglobulina o los fragmentos de las mismas, indicadas anteriormente. Además, se entiende que la proteína de unión puede ser un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un sitio de anticuerpo biosintético.

Se entiende que cada una de las proteínas de unión analizadas anteriormente puede ser un anticuerpo intacto, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal. Como alternativa, la proteína de unión puede ser un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo o puede ser un sitio de unión de anticuerpo biosintético. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab’, (Fab’)2 o Fv. Los expertos en la materia conocen técnicas para preparar tales fragmentos de anticuerpo. Se conocen en la técnica varios sitios de unión a anticuerpo biosintético e incluyen, por ejemplo, moléculas de Fv sencillas o sFv, descritas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.476.786. Otros sitios de unión de anticuerpo biosintético incluyen proteínas de unión biespecíficas o bifuncionales, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos

o bifuncionales, que son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen al menos a dos antígenos diferentes. Por ejemplo, las proteínas de unión biespecíficas pueden unirse a HGF, por ejemplo, HGF humano, y otro antígeno de interés. Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos biespecíficos e incluyen, por ejemplo, fusionando hibridomas o ligando fragmentos Fab’. Véase, por ejemplo, Songsivilai et al (1990) CLIN. EXP. IMMUNOL. 79: 315-325; Kostelny et al. (1992) J. IMMUNOL. 148: 1547-1553.

Las proteínas de unión de la invención pueden unirse a hHGF que contiene una sustitución de cisteína a arginina en la posición 561 o una sustitución de glicina a glutamato en la posición 555.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión aislada que se une a HGF humano con una kd de 4,0 x 10-5 s-1 o inferior, 3,0 x 10-5 s-1 o inferior o 2,0 x 10-5 s-1 o inferior. Las proteínas de unión aisladas pueden unirse a HGF humano con una kd de 5,0 x 10-5 s-1 a 0,5 x 10-5 s-1, de 4,0 x 10-5 s-1 a 1,0 x 10-5 s-1 o de 3,0 x 10-5 s-1 a 1,5 x 10"5 s-1. En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión aislada que se une a HGF humano con una KD de 100 pM

o inferior, 20 pM o inferior, 10 pM o inferior o 5 pM o inferior. Las proteínas de unión asiladas pueden unirse a HGF humano con una KD de 100 pM a 5 pM, de 20 pM a 5 pM, de 15 pM a 10 pM, de 20 pM a 10 pM, o de 15 pM a 5 pM. A no ser que se especifique de otro modo, los valores de KD se determinan por los métodos y en las condiciones descritas en el Ejemplo 6.

En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión aislada que se une a HGF humano, uniéndose el anticuerpo a HGF humano con KD inferior a 37 ºC que a 25 ºC. La proteína de unión que se une opcionalmente a HGF humano con una KD menor de 5 pM a 37 ºC.

En otros aspectos y realizaciones, las proteínas de unión pueden inhibir que hHGF se una a c-Met. Por ejemplo, las proteínas de unión pueden tener una CI50 (concentración a 50 % de la inhibición máxima) de al menos aproximadamente 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 y 7,0 nM cuando se ensayó usando el protocolo descrito en el Ejemplo 7(a). En ciertas otras realizaciones, las proteínas de unión pueden neutralizar la incorporación de BrdU de HGF en células 4 MBr-5 (ATCC, Nº de Catálogo CCL208) usando el método descrito en el Ejemplo 7(b).

Las proteínas de unión tienen una CI50 de 50 nM o menor, preferentemente 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 1, 0,5 nM o inferior, cuando se ensayan usando el protocolo descrito en el Ejemplo 7(b). En ciertas otras realizaciones, las proteínas de unión pueden usarse para inhibir fosforilación de c-Met estimulada por HGF en células PC-3 (ATCC, Manassus, VA Nº de Catálogo CRL-1435) usando el ensayo descrito en el Ejemplo 9. Las proteínas de unión inhiben fosforilación de c-Met estimulada por HGF (1,25 nM) en células PC-3 con una CI50 de 2 nM o menos (Tabla 8), usando un ensayo descrito en el Ejemplo 9.

II – Producción de Proteínas de Unión

Las proteínas de unión de la invención pueden producirse de diversas maneras usando enfoques conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden sintetizarse químicamente moléculas de ADN que codifican regiones variables de cadena ligera y regiones variables de cadena pesada, usando un sintetizador comercial e información de secuencia proporcionada en la presente memoria. Tales moléculas de ADN sintético pueden ligarse con otras secuencias de nucleótidos apropiadas, incluyendo, por ejemplo, secuencias codificantes de región constante y secuencias de control de la expresión, para producir construcciones de expresión génica convencionales que codifican las proteínas de unión deseadas. La producción de construcciones génicas definidas está dentro de la experiencia habitual en la técnica. Como alternativa, las secuencias proporcionadas en la presente memoria pueden clonarse de hibridomas por técnicas de hibridación convencionales o técnicas de PCR, usando sondas de ácido nucleico sintéticas cuyas secuencias se basan en información de secuencia proporcionada en la presente memoria o información de secuencia de la técnica anterior con respecto a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos en células de hibridoma. La producción y uso de tales sondas está dentro de la experiencia habitual en la técnica.

Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión deseadas pueden introducirse (ligarse) en vectores de expresión, que pueden introducirse en una célula hospedadora mediante técnicas de transfección o transformación convencionales conocidas en la materia. Las células hospedadoras ejemplares incluyen, por ejemplo, células de E. coli, células de ovario de hámster Chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y células de mieloma que no producen de otro modo proteína de inmunoglobulina. Las células hospedadoras transfectadas pueden cultivarse en condiciones que permitan que las células hospedadoras expresen los genes de interés, por ejemplo, los genes que codifican las regiones variables de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina. Los productos de expresión resultantes pueden recogerse usando técnicas conocidas en la materia.

Las condiciones de expresión y purificación particulares variarán dependiendo del sistema de expresión que se emplee. Por ejemplo, si el gen va a expresarse en E. coli, se clona primero en un vector de expresión. Esto se consigue posicionando el gen obtenido por ingeniería genética cadena abajo de un promotor bacteriano adecuado, por ejemplo, Trp o Tac, y una secuencia señal, por ejemplo, una secuencia que codifica el fragmento B de proteína A (FB). La proteína de fusión expresada resultante típicamente se acumula en cuerpos de inclusión o restringentes en el citoplasma de las células y puede recogerse después de la rotura de las células por prensa francesa o sonicación. Los cuerpos restringentes se solubilizan después y las proteínas expresadas se vuelven a plegar y se escinden por los métodos ya establecidos para muchas otras proteínas recombinantes.

Si el gen obtenido por ingeniería genética debe expresarse en células hospedadoras eucariotas, por ejemplo, células de mieloma o células CHO, se inserta primero en un vector de expresión que contenga un promotor eucariota adecuado, una señal de secreción, potenciadores de inmunoglobulina y diversos intrones. Este vector de expresión opcionalmente puede contener secuencias que codifican toda o parte de una región constante, lo que permite que se exprese una cadena pesada o ligera completa, o una parte de la misma. La construcción génica puede transfectarse en células de mieloma o células CHO usando protocolos de transfección establecidos. Tales células transfectadas pueden expresar fragmentos VL o VH, heterodímeros VL-VH, polipéptidos de cadena sencilla VH-VL o VL-VH, cadenas de inmunoglobulina pesadas o ligeras completas, o partes de las mismas, cada una de las cuales puede unirse a un dominio proteico que tenga otra función (por ejemplo, citotoxicidad).

III – Modificaciones de las Proteínas de Unión

Se entiende que las proteínas de unión pueden modificarse para optimizar el rendimiento dependiendo del uso pretendido de las proteínas de unión. Por ejemplo, cuando la proteína de unión se usa como un agente terapéutico, la proteína de unión puede modificarse para reducir su inmunogenicidad en el receptor pretendido. Como alternativa o además, la proteína de unión puede fusionarse o acoplarse con otra proteína o péptido, por ejemplo, un factor de crecimiento, citocina o citotoxina. Tales modificaciones pueden conseguirse usando técnicas de manipulación genética rutinarias conocidas en la materia.

Se conocen diversas técnicas para reducir la antigenicidad de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en la materia. Estas técnicas pueden usarse para reducir o eliminar la antigenicidad de las proteínas de unión de la invención. Por ejemplo, cuando las proteínas de unión van a administrarse a un ser humano, las proteínas de unión se modifican por ingeniería genética preferentemente para reducir su antigenicidad en seres humanos. Este procedimiento con frecuencia se denomina humanización. Preferentemente, las proteínas de unión humanizadas tienen la misma o sustancialmente la misma afinidad por el antígeno que la proteína de unión no humanizada original de la que derivó.

En un enfoque de humanización bien conocido, se crean proteínas quiméricas en las que se reemplazan regiones constantes de inmunoglobulina de anticuerpos de una especie, por ejemplo, ratón con regiones constantes de inmunoglobulina de una segunda especie diferente, por ejemplo, un ser humano. En este ejemplo, el anticuerpo resultante es una quimera ratón-humano, en la que las secuencias de región constante humanas, en principio, son menos inmunogénicas que las secuencias murinas homólogas. Este tipo de ingeniería de anticuerpo se describe, por ejemplo, en Morrison, et al. (1984) PROC. NAT. ACAD. SCI. 81: 6851-6855, Neuberger et al (1984) NATURE 312: 604608; Patentes de Estados Unidos Nº 6.893.625 (Robinson); 5.500.362 (Robinson); y 4.816.567 (Cabilly).

En otro enfoque, conocido como injerto de CDR, las CDR de las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo de interés se injertan en regiones flanqueantes (FR) de otra especie. Por ejemplo, pueden injertarse CDR murinas en secuencias FR humanas. En algunas realizaciones, las CDR de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo anti-HGF se injertan en FR humanas o FR humanas consenso. Para crear FR humanas consenso, se alinean FR de varias secuencias de aminoácidos de cadena pesada o cadena ligera humanas para identificar una secuencia de aminoácidos consenso. El injerto de CDR se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 7.022.500 (Queen); 6.982.321 (Winter); 6.180.370 (Queen); 6.054.297 (Carter); 5.693.762 (Queen);

5.859.205 (Adair); 5.693.761 (Queen); 5.565.332 (Hoogenboom); 5.585.089 (Queen); 5.530.101 (Queen); Jones et al. (1986) NATURE 321: 522-525; Riechmanr et al. (1988) NATURE 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) SCIENCE 39: 1534-1536; y Winter (1998) FEBS LETT 430: 92-94.

En un enfoque llamado “superhumanization”, se crean anticuerpos en los que la inmunogenicidad humana se reduce o elimina por una forma alternativa de injerto. En la superhumanization, las secuencias FR humanas se seleccionan de un conjunto de genes de línea germinal humanos basándose en la similitud estructural de las CDR humanas con las del anticuerpo de ratón a humanizar. Este enfoque se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.881.557 (Foote) y en Tan et al. (2002) J. IMMUNOL 169:1119-1125.

Otros enfoques para reducir la inmunogenicidad incluyen técnicas conocidas como “remodelación”, “hiperquimerización”

o “revestimiento/renovación de la superficie” para producir anticuerpos humanizados. Véase, por ejemplo, Vaswami et al. (1998) ANNALS OF ALLERGY, ASTHMA, & IMMUNOL. 81: 105; Roguska et al (1996) PROT. ENGINEER 9: 895904; y Patente de Estados Unidos Nº 6.072.035 (Hardman). En el enfoque de revestimiento/renovación de la superficie, los restos aminoacídicos accesibles en superficie en el anticuerpo murino se reemplazan por restos aminoacídicos más frecuentemente hallados en las mismas posiciones en un anticuerpo humano. Este tipo de renovación de la superficie del anticuerpo se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.639.641 (Pedersen).

Un enfoque ejemplar para convertir un anticuerpo de ratón en una forma adecuada para su uso médico en seres humanos se conoce como tecnología ACTIVMAB™ (Vaccinex, Inc., Rochester, NY), que implica un vector basado en virus vaccinia para expresar anticuerpos en células de mamífero. Se dice que se producen altos niveles de diversidad combinatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº

6.706.477 (Zauderer); 6.800.442 (Zauderer); y 6.872.518 (Zauderer).

Otro enfoque ejemplar para convertir un anticuerpo de ratón en una forma adecuada para su uso en seres humanos es tecnología practicada comercialmente por KaloBios Pharmaceuticals, Inc. (Palo Alto, CA). Esta tecnología implica el uso de una biblioteca de “aceptores” humanos patentada para producir una biblioteca “centrada en epítopos” para selección de anticuerpos.

Otro enfoque ejemplar para modificar un anticuerpo de ratón en una forma adecuada para su uso médico en seres humanos es tecnología HUMAN ENGINEERING™ (HE™), que se practica comercialmente por XOMA (US) LLC. Véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud Internacional Nº WO 93/11794 y Patentes de Estados Unidos Nº 5.766.886; 5.770.196; 5.821.123; y 5.869.619.

Cualquier enfoque adecuado, incluyendo cualquiera de los enfoques anteriores, puede usarse para reducir o eliminar la inmunogenicidad humana de una proteína de unión de interés.

Además, es posible crear anticuerpos completamente humanos en ratones. En este enfoque, los anticuerpos humanos se preparan usando un ratón transgénico en el que los genes productores de anticuerpo del ratón se han reemplazado por una parte sustancial de los genes productores de anticuerpo humanos. Tales ratones producen inmunoglobulina humana en lugar de moléculas de inmunoglobulina murina. Véase, por ejemplo, documento WO 98/24893 (Jacobovitz et al.) y Mendez et al. (1997) NATURE GENETICS 15: 146-156. Pueden producirse anticuerpos monoclonales anti-HGF completamente humanos usando el siguiente enfoque. Se inmunizan ratones transgénicos que contienen genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés, por ejemplo, HGF. Después se obtienen células linfáticas de los ratones, que se fusionan después con una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales. Las líneas celulares de hibridoma se exploran y se seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para HGF.

Las proteínas de unión de la invención pueden conjugarse con otras moléculas, dependiendo de su uso pretendido. Por ejemplo, si la proteína de unión va a usarse como un agente terapéutico, entonces la proteína de unión puede conjugarse con otro agente, por ejemplo, una molécula efectora que modula o promueve de otro modo la terapia. Hasta el punto de que el efector es un agente no basado en proteína, por ejemplo, un fármaco de molécula pequeña, un radiomarcador o toxina, entonces, el agente puede acoplarse químicamente con la proteína de unión usando químicas de acoplamiento in vitro convencionales. Si, por otro lado, la molécula aceptora es una proteína o péptido, por ejemplo, una enzima, receptor, toxina, factor de crecimiento, citocina u otro inmunomodulador, entonces la proteína de unión puede acoplarse químicamente al efector usando químicas de acoplamiento in vitro o pueden acoplarse al efector como una proteína de fusión. Las proteínas de fusión pueden construirse y expresarse usando las técnicas similares a las analizadas en la sección II.

IV – Uso de Proteínas de Unión

Las proteínas de unión descritas en la presente memoria pueden usarse como un agente de diagnóstico o un agente terapéutico.

(1) Aplicaciones Terapéuticas

Debido a que las proteínas de unión de la invención neutralizan la actividad de HGF, pueden usarse en diversas aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, ciertas proteínas de unión de la invención son útiles en la prevención o tratamiento de enfermedades o trastornos hiperproliferativos, por ejemplo, diversas formas de cáncer.

Las propiedades de unión pueden usarse para inhibir o reducir la proliferación de células tumorales. En un enfoque tal, las células tumorales se exponen a una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de unión de modo que inhiben o reducen la proliferación de la célula tumoral. En ciertas realizaciones, las proteínas de unión inhiben la proliferación de células tumorales en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 %.

En ciertas realizaciones, la proteína de unión se usa para inhibir o reducir la proliferación de una célula tumoral en la que la proteína de unión reduce la capacidad de hHGF para unirse a c-Met. La proteína de unión puede usarse para inhibir o reducir la proliferación de una célula tumoral incluso cuando la proteína de unió se une a hHGF pero no inhibe sustancialmente la unión de hHGF con c-Met, como se muestra por el anticuerpo 3B6 en las Tablas 5 y 6.

Además, la proteína de unión puede usarse para inhibir o ralentizar el crecimiento o desarrollo tumoral en un mamífero. En un método tal, se administra una cantidad eficaz de la proteína de unión al mamífero para inhibir o ralentizar el crecimiento tumoral en el mamífero. En consecuencia, las proteínas de unión pueden usarse para tratar tumores, por ejemplo, en un mamífero. El método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de unión. La proteína de unión puede administrarse sola o en combinación con otra molécula farmacéuticamente activa, para tratar el tumor.

Se contempla que las proteínas de unión de la invención pueden usarse en el tratamiento de una diversidad de trastornos sensibles a HGF, incluyendo, por ejemplo, células tumorales sensibles a HGF en cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, mieloma múltiple, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de riñón, cáncer nasofaríngeo, cáncer pancreático, mesotelioma, melanoma y glioblastoma.

Como se usa en la presente memoria, “tratar”, “tratando” y “tratamiento” se refieren al tratamiento de una patología en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluyen: (a) evitar que la patología aparezca en un mamífero, en particular, cuando dicho mamífero está predispuesto a la patología pero aún no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la patología, es decir, detener su desarrollo; y/o (c) aliviar la patología, es decir, provocar regresión de la patología.

Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz del componente activo estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, opcionalmente de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, opcionalmente de aproximadamente 1 mg/kg a 10 mg/kg. La cantidad administrada dependerá de variables tales como el tipo y alcance de la enfermedad o indicación a tratar, el estado de salud general del paciente particular, la eficacia biológica relativa de la proteína de unión suministrada, la formulación de la proteína de unión, la presencia y tipos de excipientes en la formulación y la vía de administración. La dosificación inicial administrada puede aumentarse más allá del nivel superior para alcanzar rápidamente el nivel en sangre o nivel en tejidos deseado, o la dosificación inicial puede ser menor que la óptima y la dosificación diaria puede aumentarse progresivamente durante el transcurso del tratamiento dependiendo de la situación particular. La dosificación humana puede optimizarse, por ejemplo, en un estudio de aumento de la dosis de Fase I convencional diseñado para pasar de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. La frecuencia de dosificación puede variar, dependiendo de factores tales como la vía de administración, cantidad de dosificación y la enfermedad que se trata. Son frecuencias de dosificación ejemplares una vez por día, una vez por semana y una vez cada dos semanas. Una vía preferida de administración es parenteral, por ejemplo, infusión intravenosa. La formulación de fármacos basados en anticuerpos monoclonales está dentro de la experiencia habitual de la técnica. En algunas realizaciones de la invención, la proteína de unión, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal, se liofiliza y se reconstituye en solución salina tamponada en el momento de la administración.

Las proteínas de unión pueden administrarse solas o en combinación con otros principios farmacéuticamente activos. Los otros principios activos, por ejemplo, inmunomoduladores, pueden administrarse junto con la proteína de unión o pueden administrarse antes o después de la proteína de unión.

Las formulaciones que contienen las proteínas de unión para su uso terapéutico, típicamente incluyen las proteínas de unión combinadas con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente memoria, “vehículo farmacéuticamente aceptable” significa tampones, vehículos y excipientes, que son, dentro del alcance del criterio médico razonable, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, adecuado con una relación de beneficio/riesgo razonable. El vehículo o vehículos deberían ser “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de las formulaciones y no deletéreos para el receptor. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, a este respecto, pretenden incluir todos y cada uno de los tampones, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica.

Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en una forma unitaria de dosificación y pueden prepararse por cualquier método adecuado, incluyendo cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Una composición farmacéutica de la invención debería formularse para ser compatible con su vía pretendida de administración. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral o administración no parenteral, por ejemplo, administración intravenosa, intradérmica, por inhalación, transdérmica, (tópica), transmucosa y rectal. Pueden prepararse soluciones útiles para administración oral o parenteral por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica, descritos, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. (Mack Publishing Company, 1990).

Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden estar en forma de: unidades discretas tales como inyectables, cápsulas, cápsulas de gelatina, sobres, comprimidos, trociscos o grageas, conteniendo cada una una cantidad predeterminada de la proteína de unión; una composición de polvo o granular; una solución o una suspensión en un líquido acuoso o líquido no acuoso, o una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen, por ejemplo, los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiamintetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o frascos de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.

En general, las composiciones adecuadas para su uso inyectable incluyen soluciones acuosas (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Debería ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debería conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.

Las formulaciones farmacéuticas preferentemente son estériles. La esterilización puede conseguirse, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición está liofilizada, la esterilización usando este método puede realizarse antes o después de liofilización y reconstitución. Una vez que la composición farmacéutica se ha formulado, puede almacenarse, por ejemplo, en frascos como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o como un polvo deshidratado o liofilizado.

(2) Aplicaciones de Diagnóstico

Siempre que las proteínas de unión se usen para fines de diagnóstico, in vitro o in vivo, las proteínas de unión típicamente se marcan directa o indirectamente con un resto detectable. El resto detectable puede ser cualquier resto que sea capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3Hidrógeno (3H), 14Carbono (14C), 32Fósforo (32P), 35Azufre (35S), o 125Yodo (125I); un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; una enzima, tal como una fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano rusticano; una sonda de espín tal como un marcador de espín; o una partícula coloreada, por ejemplo, una partícula de látex o de oro. Se entiende que la proteína de unión puede conjugarse con el resto detectable usando varios enfoques conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Hunter et al. (1962) NATURE 144: 945; David et al (1974) BIOCHEMISTRY 13: 1014; Pain et al. (1981) J. IMMUNOL. METH. 40: 219; y Nygren (1982) J. HISTOCHEM. AND CYTOCHEM. 30: 407. Los marcadores pueden detectarse, por ejemplo, visualmente o con la ayuda de un espectrofotómetro u otro detector.

Las proteínas de unión pueden emplearse en una amplia serie de técnicas de inmunoensayo disponibles en la materia. Los inmunoensayos ejemplares incluyen, por ejemplo, inmunoensayos de tipo sándwich, inmunoensayos competitivos, procedimientos inmunohistoquímicos.

En un inmunoensayo de tipo sándwich, se usan dos anticuerpos que se unen a un analito o antígeno de interés, por ejemplo, uno inmovilizado en un soporte sólido y uno libre en solución y marcado con un resto detectable. Cuando una muestra que contiene el antígeno se introduce en este sistema, el antígeno se une tanto al anticuerpo movilizado como al anticuerpo marcado, para formar un complejo inmune de tipo “sándwich” en la superficie del soporte. La proteína en complejo se detecta retirando por lavado componentes de muestra no unidos y anticuerpo marcado en exceso y se mide la cantidad de anticuerpo marcado en complejo con la proteína en la superficie del soporte. Como alternativa, el anticuerpo libre en solución puede detectarse por un tercer anticuerpo marcado con un resto detectable que se une al anticuerpo libre. Puede encontrarse una revisión detallada de diseño, teoría y protocolos de ensayo inmunológico en numerosos textos, incluyendo Butt, ed., (1984) PRACTICAL IMMUNOLOGY Marcel Dekker, New York; Harlow et al. eds. (1988) ANTIBODIES A LABORATORY APPROACH, Cold Spring Harbor Laboratory; y Diamandis et al., eds. (1996) IMMUNOASSAY, Academic Press, Boston.

Se contempla que las proteínas de unión marcadas son útiles como agentes de formación de imágenes in vivo, de manera que las proteínas de unión pueden dirigir los agentes de formación de imágenes a tejidos particulares de interés en el receptor. Un resto remotamente detectable preferido para formación de imágenes in vivo incluye el átomo radiactivo Tecnecio-99m (99mTc), un emisor gamma con una semivida de aproximadamente seis horas. Los restos no radiactivos también útiles en la formación de imágenes in vivo incluyen marcadores de espín de nitróxido así como iones metálicos de transición y lantánidos todos los cuales inducen relajación protónica in situ. Además de formación de imágenes inmunológica, los restos radiactivos en complejo pueden usarse en protocolos de radioinmunoterapia convencionales para destruir la célula diana. Los nucleótidos preferidos para radioinmunoterapia de dosis alta incluyen los átomos radioactivos 90Itrio (90Yt), 131Yodo (131I) y 111Indio (111In). La proteína de unión puede marcarse con l31I, 111In y 99mTC usando técnicas de acoplamiento conocidas en la materia de formación de imágenes. De forma similar, los procedimientos para preparar y administrar el agente de formación de imágenes así como capturar y procesar las imágenes se conocen bien en la técnica de formación de imágenes y por lo tanto no se analizan en detalle en la presente memoria. De forma similar, se conocen bien en la técnica métodos para realizar inmunoterapias basadas en anticuerpo. Véase, por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 5.534.254.

A lo largo de la descripción, cuando se describe que las composiciones tienen, incluyen o comprenden componentes específicos, se contempla que las composiciones también consisten esencialmente en, o consisten en, los componentes enumerados. De forma similar, cuando se describe que los procedimientos tienen, incluyen o comprenden etapas de procedimiento específicas, los procedimientos también consisten esencialmente en, o consisten en, las etapas de procesamiento enumeradas. Excepto cuando se indique de otro modo, el orden de las etapas u orden para realizar ciertas acciones son irrelevantes siempre que la invención permanezca operativa. Además, a no ser que se indique de otro modo, dos o más etapas o acciones pueden realizarse simultáneamente.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos analizan la producción y caracterización de varios anticuerpos monoclonales anti-hHGF. Se incluyen secuencias que no están dentro del alcance de las reivindicaciones para referencia.

Ejemplo 1 – Producción de Anticuerpos Monoclonales Anti-hHGF

Este ejemplo describe la producción de varios anticuerpos monoclonales anti-hHGF.

Se realizaron inmunizaciones, fusiones y exploraciones primarias en MBS Inc. (Portland, ME), siguiendo el protocolo de Múltiples Sitios de Inmunización Repetitivos (RIMMS). Se inmunizaron cinco ratones AJ y cinco ratones Balb/c con HGF humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN; Nº de Catálogo 294-HGN-025). Se seleccionaron dos ratones con sueros que presentaban la mayor actividad anti-HGF por Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzima (ELISA) para fusión posterior. Se recogieron bazos y ganglios linfáticos de los ratones apropiados. Se recogieron después linfocitos B y se fusionaron con una línea de melanoma. Los productos de fusión se diluyeron en serie en una o más placas hasta casi la clonalidad. Se exploraron sobrenadantes de las fusiones resultantes con respecto a su unión con hHGF por ELISA. Los sobrenadantes que se había identificado que contenían anticuerpos para HGF se caracterizaron adicionalmente por ensayos funcionales in vitro como se analiza en los siguientes ejemplos. Se seleccionó un panel de hibridomas y los hibridomas se subclonaron y expandieron. Los anticuerpos monoclonales se purificaron después por cromatografía de afinidad en resina de proteína A/G en condiciones convencionales.

Ejemplo 2 – Análisis de Secuencia de Anticuerpos Monoclonales anti-hHGF

Este ejemplo describe análisis de isotipo y secuencia de los anticuerpos monoclonales anti-hHGF producidos en el Ejemplo 1.

a. Determinación de Isotipos de Anticuerpos Monoclonales Murinos de HGF

El tipo de cadena ligera e isotipo de cadena pesada de cada anticuerpo monoclonal se determinó usando el Kit de Isotipación de Anticuerpo Monoclonal de Ratón IsoStrip de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Applied Science).

Se determinó que todos los anticuerpos contenían una cadena ligera de inmunoglobulina Kappa y una cadena pesada de inmunoglobulina IgG1.

b. Determinación de Secuencias de Nucleótidos que Codifican Regiones Variables de Cadena Pesada y Ligera de Inmunoglobulina

Se extrajo ARN total de cada línea celular de hibridoma monoclonal usando el kit de Miniprep RNeasy de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen Venlo, Países Bajos). Se generó ADNc de primera cadena de longitud completa usando el Kit de amplificación de ADNc BD SMART™ RACE de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Clontech) usando los cebadores oligonucleotídicos BD SMART IIA (5’ aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg 3’) (SEC ID Nº: 85) y cebador 5’-RACE CDS (5’ tttttttttttttttttttttttttvn 3’, en la que v = a, g, o c y n = a, g, c, o t) (SEC ID Nº: 86) para el fin de RACE 5’ (Amplificación Rápida de Extremos de ADNc).

Las regiones variables de las cadenas de inmunoglobulina Kappa y Pesada (IgG1) se amplificaron por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) usando el Sistema de PCR de Alta Fidelidad Expand (Roche Applied Science) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se amplificaron regiones variables de cadena pesada con la mezcla de cebadores oligonucleotídicos 5’ mezcla de Cebadores Universal A (mezcla de 5’ ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt 3’ (SEC ID Nº: 87) y 5’ ctaatacgactcactatagggc 3’ (SEC ID Nº: 88)) y un cebador específico de Región Constante IgG1 3’, 5’ tatgcaaggcttacaaccaca 3’ (SEC ID Nº: 89) o 5’ gccagtggatagacagatgggggtgteg 3’ (SEC ID Nº: 90). Se amplificaron regiones variables de cadena Kappa con la mezcla de cebadores oligonucleotídicos 5’ mezcla de Cebadores Universal A y un cebador específico de Región constante Kappa 3’, 5’ ctcattcctgttgaagctcttgacaat 3’ (SEC ID Nº: 91) o 5’ cgactgaggcacctccagatgtt 3’ (SEC ID Nº: 92).

Se fraccionaron productos de PCR individuales por electroforesis en gel de agarosa y se purificaron usando el kit de Purificación en Gel Qiaquick de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). Los productos de PCR se clonaron posteriormente en el plásmido pCR2.1 TOPO usando el kit de clonación basado en topoisomerasa Kit TOPO TA Cloning® (con vector pCR®2.1-TOPO®) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformaron en bacterias DH5 usando técnicas de transformación convencionales. Se secuenció ADN plasmídico aislado de clones bacterianos transformados usando T7 (5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’) (SEC ID Nº: 93), Cebadores directo M13 (5’ GTAAAACGACGGCCAGT 3’) (SEC ID Nº: 94) e inverso M13 (5’ CAGGAAACAGCTATGACC 3’) (SEC ID Nº: 95) por Agencourt Bioscience usando métodos de secuenciación de ADN dideoxi convencionales para identificar la secuencia de las secuencias de regiones variables. Las secuencias se analizaron usando software Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el servido web IMGT/V-Quest
(http://imgLcines.fr/textes/vquest) para identificar y confirmar las secuencias de regiones variables.

c. Determinación de Secuencias de Nucleótidos que Codifican Secuencias de Región Constante de Cadena Pesada y Ligera de Inmunoglobulina para Cadenas Kappa e IgG1 de 1A3, 1D3, 1F3 y 2B8

Se amplificaron por PCR ADNc de longitud completa para las cadenas IgG1 de 1A3, 1D3 y 1F3 a partir del ADNc creado anteriormente usando el cebador directo 5’ ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgaactttgggctcagattgattttcc 3’ (codón de inicio subrayado) (SEC ID Nº: 96) y el cebador inverso 5’ ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagagg 3’ (codón de parada subrayado) (SEC ID Nº: 97). Se amplificó ADNc de longitud completa para la cadena IgG1 de 2B8 a partir del ADNc creado anteriormente usando el cebador directo 5’ ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgggatggagctatatcatcctcttt 3’ (codón de inicio subrayado) (SEC ID Nº: 98) y cebador inverso 5’ ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagag 3’ (codón de parada subrayado) (SEC ID Nº: 99).

Se amplificó ADNc de longitud completa para la cadena Kappa de 2B8 usando el cebador directo 5’ ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatggaatcacagactctggtcttcata 3’ (codón de inicio subrayado) (SEC ID Nº: 100) y el cebador inverso 5’ ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaacactcattcctgttgaagctc 3’ (codón de parada subrayado) (SEC ID Nº: 101). Se subclonaron fragmentos de PCR en pDONR221 (Invitrogen, Carlsbad, CA) por reacción de recombinación Gateway BP (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se secuenciaron por Agencourt Bioscience usando métodos de secuenciación de ADN dideoxi convencionales para identificar la secuencia de la región constante y confirmar adicionalmente secuencias de regiones variables.

d. Análisis de Secuencia

Se identificaron Regiones Variables (texto normal) usando software del servidor web IMGT/V-QUEST
(http://imgt.cines.fr/textes/vquest/) . Las secuencias de péptido señal se predijeron basándose en identificación del codón de inicio en fase (ATG) que estaba cadena arriba de la región variable identificada. Las secuencias del péptido señal se identificaron y se subrayan posteriormente.

El último nucleótido de cada región variable es la primera base del siguiente codón generado por el punto de unión de región variable/constante. Este nucleótido se incluye en la región variable porque es parte de ese exón. Las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes enumeradas posteriormente incluyen la traducción de este codón de punto de unión.

Para crear las secuencias de anticuerpo de cadena pesada o kappa completas, las secuencias de región variable indicadas posteriormente se combinan con sus secuencias de región constante respectivas (las secuencias señal están subrayadas).

(1) Región Variable de Cadena Pesada de 1A3 (SEC ID Nº: 1)

(2)

Región Variable de Cadena Ligera Kappa de 1A3 (SEC ID Nº: 3)

(3)

Región Variable de Cadena Pesada de 2B8 (SEC ID Nº: 11)

(4) Región Variable de Cadena Ligera Kappa de 2B8 (SEC ID Nº: 13)

(5)

Región Variable de Cadena Pesada de 2F8 (SEC ID Nº: 21)

(6)

Región Variable de Cadena Ligera Kappa de 2F8 (SEC ID Nº: 23)

(7) Región Variable de Cadena Pesada de 3B6 (SEC ID Nº: 31)

(8)

Región Variable de Cadena Ligera Kappa 3B6 (2 posibles codones de inicio ATG (mayúsculas)) (SEC ID Nº: 33)

(9)

Región Variable de Cadena Pesada 3D11 (SEC ID Nº 41)

(10)

Región Variable de Cadena Ligera Kappa de 3D11 (SEC ID Nº: 43)

(11) Región Variable de Cadena Pesada de 1D3 (SEC ID Nº: 51)

(12)

Región Variable de Cadena Ligera Kappa de 1D3 (SEC ID Nº: 53)

(13)

Región Variable de Cadena Pesada de 1F3 (SEC ID Nº: 61)

(14) Región Variable de Cadena Ligera Kappa de 1F3 (SEC ID Nº: 63)

(15)

Región Variable de Cadena Pesada de 3A12 (SEC ID Nº: 71)

(16)

Región Variable de Cadena Ligera Kappa de 3A12 (SEC ID Nº 73)

(17) Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 de Ratón de Referencia (J00453) (SEQ ID NO 81)

(18)

Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 de Ratón Determinada para 1A3, 1D3, 1F3 y 2B8 (derivada de ratones de cepa AJ) (SEC ID Nº: 82)

(19)

Región Constante de Cadena Ligera Kappa de Ratón de Referencia (V00807) y Región Constante de Cadena Ligera Kappa de Ratón Determinada para 1D3, 1F3 y 2B8 (derivada de ratones de cepa AJ) (SEC ID Nº: 83)

(20)

Región Constante de Cadena Ligera Kappa de Ratón Determinada para 1A3 que contiene un nucleótido alterado en comparación con 1D3, 1F3 y 2B8 (subrayado) (SEC ID Nº: 84)

Cada una de las secuencias de aminoácidos que definen las regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina para los anticuerpos producidos en el Ejemplo 1 se exponen en la Figura 2. Todas las secuencias se alinean entre sí y

10 las secuencias que definen el péptido señal, CDR1, CDR2 y CDR3 se identifican por cajas. La Figura 3 muestra un alineamiento de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 separadas para cada uno de los anticuerpos.

Cada una de las secuencias de aminoácidos que definen las regiones variables de cadena ligera de inmunoglobulina para cada uno de los anticuerpos producidos en el Ejemplo 1 se exponen en la Figura 4. Todas las secuencias se alinean entre sí y las secuencias que definen el péptido señal, CDR1, CDR2 y CDR3 se identifican por cajas. La Figura 5

15 muestra un alineamiento de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 separadas para cada uno de los anticuerpos.

Por conveniencia, la Tabla 1 proporciona un cuadro de concordancia que muestra la correspondencia entre las secuencias de anticuerpos analizadas en este Ejemplo y las presentadas en la Lista de Secuencias.

TABLA 1

SEC ID Nº

Proteína o �?cido Nucleico

Región Variable de Cadena Pesada de 1A3 — ácido nucleico

Región Variable de Cadena Pesada de 1A3 — proteína

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 1A3 — ácido nucleico

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 1A3 — proteína

CDR1 de Cadena Pesada de 1A3

CDR2 de Cadena Pesada de 1A3

CDR3 de Cadena Pesada de 1A3

CDR1 de Cadena Ligera (kappa) de 1A3

CDR2 de Cadena Ligera (kappa) de 1A3

CDR3 de Cadena Ligera (kappa) de 1A3

Región Variable de Cadena Pesada de 2B8 -ácido nucleico

Región Variable de Cadena Pesada de 2B8 -proteína

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 2B8 -ácido nucleico

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 2B8 — proteína

CDR1 de Cadena Pesada de 2B8

CDR2 de Cadena Pesada de 2B8

CDR3 de Cadena Pesada de 2B8

CDR1 de Cadena Ligera (kappa) de 2B8

CDR2 de Cadena Ligera (kappa) de 2B8

CDR3 de Cadena Ligera (kappa) de 2B8

Región Variable de Cadena Pesada de 2F8 — ácido nucleico

Región Variable de Cadena Pesada de 2F8 — proteína

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 2F8 -ácido nucleico

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 2F8 — proteína

CDR1 de Cadena Pesada de 2F8

CDR2 de Cadena Pesada de 2F8

CDR3 de Cadena Pesada de 2F8

CDR1 de Cadena Ligera (kappa) de 2F8

CDR2 de Cadena Ligera (kappa) de 2F8

CDR3 de Cadena Ligera (kappa) de 2F8

Región Variable de Cadena Pesada de 3B6 — ácido nucleico

Región Variable de Cadena Pesada de 3B6 — proteína

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 3B6 -ácido nucleico

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 3B6 — proteína

CDR1 de Cadena Pesada de 3B6

CDR2 de Cadena Pesada de 3B6

CDR3 de Cadena Pesada de 3B6

CDR1 de Cadena Ligera (kappa) de 3B6

CDR2 de Cadena Ligera (kappa) de 3B6

CDR3 de Cadena Ligera (kappa) de 3B6

Región Variable de Cadena Pesada de 3D11 — ácido nucleico

Región Variable de Cadena Pesada de 3D11 — proteína

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 3D11 -ácido nucleico

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 3D11 — proteína

CDR1 de Cadena Pesada de 3D11

CDR2 de Cadena Pesada de 3D11

CDR3 de Cadena Pesada de 3D11

CDR1 de Cadena Ligera (kappa) de 3D11

CDR2 de Cadena Ligera (kappa) de 3D11

CDR3 de Cadena Ligera (kappa) de 3D11

SEC ID Nº

Proteína o �?cido Nucleico

51

Región Variable de Cadena Pesada de 1D3 — ácido nucleico

52

Región Variable de Cadena Pesada de 1D3 — proteína

53

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 1D3 -ácido nucleico

54

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 1D3 — proteína

55

CDR1 de Cadena Pesada de 1D3

56

CDR2 de Cadena Pesada de 1D3

57

CDR3 de Cadena Pesada de 1D3

58

CDR1 de Cadena Ligera (kappa) de 1D3

59

CDR2 de Cadena Ligera (kappa) de 1D3

60

CDR3 de Cadena Ligera (kappa) de 1D3

61

Región Variable de Cadena Pesada de 1F3 — ácido nucleico

62

Región Variable de Cadena Pesada de 1F3 — proteína

63

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 1F3 -ácido nucleico

64

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 1F3 — proteína

65

CDR1 de Cadena Pesada de 1F3

66

CDR2 de Cadena Pesada de 1F3

67

CDR3 de Cadena Pesada de 1F3

68

CDR1 de Cadena Ligera (kappa) de 1F3

69

CDR2 de Cadena Ligera (kappa) de 1F3

70

CDR3 de Cadena Ligera (kappa) de 1F3

71

Región Variable de Cadena Pesada de 3A12 — ácido nucleico

72

Región Variable de Cadena Pesada de 3A12 — proteína

73

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 3A12 -ácido nucleico

74

Región Variable de Cadena Ligera (kappa) de 3A12 — proteína

75

CDR1 de Cadena Pesada de 3A12

76

CDR2 de Cadena Pesada de 3A12

77

CDR3 de Cadena Pesada de 3A12

78

CDR1 de Cadena Ligera (kappa) de 3A12

79

CDR2 de Cadena Ligera (kappa) de 3A12

80

CDR3 de Cadena Ligera (kappa) de 3A12

También, por conveniencia, las siguientes secuencias representan la secuencia de cadena ligera y cadena pesada completas reales o consideradas (es decir, que contengan las secuencias de regiones tanto variables como constantes) para cada uno de los anticuerpos descritos en este ejemplo. Se observa que las regiones constantes de los anticuerpos

5 murinos 2F8, 3A12, 3B6 y 3D11 no se secuenciaron pero se presupone que tienen las mismas secuencias de región constante que los anticuerpos 1D3, 1F3 y 2B8, que se secuenciaron, puesto que todos derivaron de ratones de la cepa AJ. Se aprecia, sin embargo, que las secuencias de región variable descritas en la presente memoria pueden ligarse a cada una de varias secuencias de región constante distintas que se conoce por los expertos en la materia que producen cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina de longitud completa.

(1)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Pesada de 1A3 de Longitud Completa (Región Variable de Cadena Pesada y Región Constante IgG1 de 1A3) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 122)

(2)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Pesada de 1A3 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 1A3) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 123)

(3)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Ligera de 1A3 de Longitud Completa (Región constante y Región Variable Kappa de 1A3) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 124)

10 (4) Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Ligera de 1A3 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 1A3) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 125)

(5)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Pesada de 2B8 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 2B8) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 126)

(6)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Pesada de 2B8 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 2B8) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 127)

(7)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Ligera de 2B8 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 2B8) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 128)

(8)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Ligera de 2B8 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 2B8) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 129)

(9)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Pesada de 2F8 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 2F8) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 130)

(10)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Pesada de 2F8 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 2F8) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 131)

(11)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Ligera de 2F8 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 2F8) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 132)

10 (12) Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Ligera de 2F8 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 2F8) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 133)

(13)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Pesada de 3B6 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 3B6) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 134)

(14)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Pesada de 3B6 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 3B6) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 135)

(15)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Ligera de 3B6 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 3B6) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 136)

10 (16) Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Ligera de 3B6 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 3B6) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 137)

(17)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Pesada de 3D11 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 3D11) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 138)

(18)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Pesada de 3D11 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 3D11) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 139)

(19)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Ligera de 3D11 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 3D11) (secuencia señal subrayada) SEC ID Nº: 140)

(20)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Ligera de 3D11 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 3D11) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 141)

(21)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Pesada de 1D3 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 1D3) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 142)

(22)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Pesada 1D3 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 1D3) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 143)

(23)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Ligera de 1D3 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 1D3) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 144)

(24)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Ligera de 1D3 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 1D3) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 145)

(25)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Pesada de 1F3 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 1F3) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 146)

(26)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Pesada de 1F3 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 1F3) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 147)

(27)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Ligera de 1F3 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 1F3) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 148)

(28)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Ligera de 1F3 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 1F3) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 149)

(29)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Pesada de 3A12 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 3A12) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 150)

(30)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Pesada de 3A12 de Longitud Completa (Región Constante IgG1 y Región Variable de Cadena Pesada de 3A12) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 151)

(31)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Secuencia de Cadena Ligera de 3A12 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 3A12) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 152)

(32)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia de Cadena Ligera de 3A12 de Longitud Completa (Región Constante y Región Variable Kappa de 3A12) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 153)

Por conveniencia, la Tabla 2 proporciona un cuadro de concordancias que muestra la correspondencia entre las 15 secuencias de longitud completa de los anticuerpos analizados en este Ejemplo con las presentadas en la Lista de Secuencias.

TABLA 2

SEC ID Nº:

Proteína o �?cido Nucleico

122

Constante IgG1 + Variable Pesada de 1A3 -ácido nucleico

123

Constante IgG1 + Variable Pesada de 1A3 -proteína

124

Constante + Variable Ligera de 1A3 -ácido nucleico

125

Constante + Variable Ligera de 1A3 -proteína

126

Constante de IgG1 + Variable Pesada de 2B8 -ácido nucleico

127

Constante de IgG1 + Variable Pesada de 2B8 -proteína

128

Constante + Variable Ligera de 2B8 -ácido nucleico

129

Constante + Variable Ligera de 2B8 -proteína

130

Constante IgG1 + Variable Pesada de 2F8 -ácido nucleico

131

Constante IgG1 + Variable Pesada de 2F8 -proteína

132

Constante + Variable Ligera de 2F8 -ácido nucleico

133

Constante + Variable Ligera de 2F8 -proteína

134

Constante IgG1 + Variable Pesada de 3B6 -ácido nucleico

135

Constante IgG1 + Variable Pesada de 3B6 -proteína

136

Constante + Variable Ligera de 3B6 -ácido nucleico

137

Constante + Variable Ligera de 3B6 -proteína

138

Constante IgG1 + Variable Pesada de 3D11 -ácido nucleico

139

Constante IgG1 + Variable Pesada de 3D11 -proteína

140

Constante + Variable Ligera de 3D11 -ácido nucleico

141

Constante + Variable Ligera de 3D11 -proteína

142

Constante IgG1 + Variable Pesada de 1D3 -ácido nucleico

143

Constante IgG1 + Variable Pesada de 1D3 -proteína

144

Constante + Variable Ligera de 1D3 -ácido nucleico

145

Constante + Variable Ligera de 1D3 -proteína

146

Constante IgG1 + Variable Pesada de 1F3 -ácido nucleico

147

Constante IgG1 + Variable Pesada de 1F3 -proteína

148

Constante + Variable Ligera de 1F3 -ácido nucleico

149

Constante + Variable Ligera de 1F3 -proteína

150

Constante IgG1 + Variable Pesada de 3A12 -ácido nucleico

151

Constante IgG1 + Variable Pesada de 3A12 -proteína

152

Constante + Variable Ligera de 3A12 -ácido nucleico

153

Constante + Variable Ligera de 3A12 -proteína

Ejemplo 3 -Producción de Diversas Proteínas hHGF Recombinantes

Este Ejemplo describe la clonación y expresión de varias proteínas recombinantes usadas para caracterizar los

5 anticuerpos creados en el Ejemplo 1 y en el Ejemplo 14. En particular, este Ejemplo describe la clonación y expresión de proteína hHGF recombinante, una proteína hHGF recombinante que contiene una sustitución de glicina a glutamato en la posición 555 (G555E), una proteína hHGF recombinante que contiene una sustitución de cisteína a arginina en la posición 561 (C561R), una proteína HGF quimérica de ratón-humano-ratón (mhm) recombinante que contiene la secuencia de HGF V495-L585 humana dispuesta dentro de la secuencia HGF de ratón, una proteína HGF quimérica

10 mhm recombinante que contiene la secuencia de HGF I499-R566 humana dispuesta dentro de la secuencia de HGF de ratón y una proteína HGF quimérica mhm recombinante que contiene la secuencia HGF W507-L585 humana dispuesta dentro de la secuencia HGF de ratón.

Las siguientes construcciones de expresión se generaron usando técnicas moleculares convencionales y la secuencias de ADNc resultantes se confirmaron por secuenciación de ADN:

15 a. hHGF-Fc

En un primer ciclo de PCR, se generaron dos fragmentos de PCR solapantes introduciendo un sitio Not I y codificando un marcador 6xHis entre hHGF e hIgFc. Los fragmentos de PCR solapantes actuaron como molde en un segundo ciclo para amplificar hHGF-his-IgFc. El fragmento resultante se digirió con NheI y BamHI y se clonó en pcDNA5/FRT (Invitrogen, nº 35-3014). Después, se amplificó hHFG del clon de Invitrogen ID: IOH29794 (ADNc de HFG humano). Se 20 descubrió que la secuencia correspondía a la secuencia depositada en el NCBI con el número de acceso NM_000601.4.

(1)

Cebador NheI de hHFG 5’ ACTGGCTAGCATGTGGGTGACCAAACTCCT (SEC ID Nº: 102)

(2)

Cebador de Marcador His de NotI de hHGF 3’ GTGATGGTGATGGTGATGGCGGCCGCATGACTGTGGTACCTTATATG (SEC ID Nº: 103)

(3)

Cebador de HisIgFc 5’ ACTGGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC (SEC ID Nº: 104)

(4)

Cebador BamHI de IgFc 3’ ACTGGGATCCTCACTATTTACCCGGGGACAG (SEC ID Nº: 105)

b.

hHGF-Fc G555E y hHGF-Fc C561R

Se generaron mutantes de hHGF-Fc G555E y C561R por mutagénesis dirigida usando el kit de mutagénesis dirigida QuikChange II XL (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

(1)

Cebador Sentido de hHGF-Fc (G555E) CATGATGTCCACGAAAGAGGAGATGAG (SEC ID Nº: 106)

(2)

Cebador Antisentido de hHGF-Fc (G555E) CTCATCTCCTCTTTCGTGGACATCATG (SEC ID Nº: 107)

(3)

Cebador Sentido de hHGF-Fc (C561R) GGAAGAGGAGATGAGAAACGCAAACAGGTTCTCAATG (SEC ID Nº: 108)

(4)

Cebador Antisentido de hHGF-Fc (C561R) CATTGAGAACCTGTTTGCGTTTCTCATCTCCTCTTCC (SEC ID Nº: 109)

c.

Fc de quimera ratón-humano-ratón

La construcción de IgFc de quimera de ratón-humano-ratón contiene cadena alfa de mHGF-hHGF, los aminoácidos de cadena β Val 495-Leu 585 de HFG humano y cadena beta C terminal de mHGF seguido de marcador 6xHis e IgG-Fc.

Se amplificó ADNc de HFG humano que codificaba los aminoácidos V495-L585 del clon de Invitrogen ID: IOH297794 (ADNc de HFG humano). La secuencia corresponde a la secuencia depositada en el NCBI con el número de acceso NM_000601.4. Se amplificaron secuencias de HFG de ratón por RT-PCR de ARN total de hígado de ratón (Clontech, nº 636603) usando el kit de RT-PCR Super Script One Step de Invitrogen (nº 10928-034) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia de ADNc de mHFG corresponde a la secuencia depositada en el NCBI con el número de acceso D10213.1.

Se generaron tres fragmentos, denominados fragmentos 1, 2 y 3 usando cebadores de PCR solapantes y se hibridaron en ciclos consecutivos de amplificación por PCR. El producto final se escindió con NheI y NotI y se clonó en pcDNA5/FRT IgGFc.

(1)

Cebadores del Fragmento 1 para cadena alfa de mHGF 5’ NheI 5’ ATCGGCTAGCATGATGTGGGGGACCAAAC (SEC ID Nº: 110) 3’ GAATCCCATTTACAACCCGCAGTTGTTTTGTTTTGG (SEC ID Nº: 111)

(2)

Cebadores del Fragmento 2 para cadena beta de hHGF aa V495-L585 5’ CCAAAACAAAACAACTGCGGGTTGTAAATGGGATTC (SEC ID Nº: 112) 3’ CAGGATTGCAGGTCGAGCAAGCTTCATTAAAACCAGATCT (SEC ID Nº: 113)

(3)

Cebador del Fragmento 3 para extremo C terminal de cadena beta de mHGF 3’NotI 5’ AGATCTGGTTTTAATGAAGCTTGCTCGACCTGCAATCCTG (SEC ID Nº: 114) 3’ GTAATTTTGACATACAAGTTGTGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC (SEC ID Nº: 115)

d.

Construcción de hHGF y quimera mhm

Los vectores que codifican hHGF y quimera mhm (V495-L585), pcDNA5/FRT hHGF y pcDNA5/FRT-quimera mhm (V495-L585), sin marcador Fc se generaron por mutagénesis dirigida. Se introdujo un codón de parada 3’ del marcador 6xHis usando el kit de mutagénesis dirigida QuikChange II XL (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cebador de mutagénesis incluía el Cebador 1:

CATCACCATCACCATCACTAAGCGGGTCTGGTGCCACG (SEC ID Nº: 116), y Cebador 2: CGTGGCACCAGACCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATG (SEC ID Nº: 117).

Además, se crearon dos quimeras mhm adicionales de la construcción pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585) por mutagénesis dirigida usando el kit de mutagénesis dirigida QuikChange II XL (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una construcción de mhm contenía la región de I499-R556 de hHGF dispuesta entre secuencias murinas. La otra construcción de mhm contenía la región de W507-L585 de hHGF dispuesta entre secuencias murinas.

Para la quimera mhm (I499-R556), se realizaron las siguientes mutaciones puntuales en orden en la construcción molde pcDNA5/FRT-quimera mhm (V495-L585): D558E, C561R, V564I, V567I y M583L, usando las secuencias oligonucleotídicas apropiadas. Para la quimera mhm (W507-L585), se introdujeron las siguientes mutaciones puntuales en una etapa en la construcción molde pcDNA5/FRT-quimera mhm (V495-L585): Q502R, N504T e I505V, usando las secuencias oligonucleotídicas apropiadas.

La secuencia de nucleótidos resultante de la proteína hHGF-Fc se expone como SEC ID Nº: 118, incluyendo secuencia señal (nucleótidos 1-93) y prodominio (nucleótidos 94-162). La secuencia de aminoácidos de la proteína hHGF-Fc se expone como SEC ID Nº: 119.

La secuencia de nucleótidos resultante que codifica la proteína quimérica mhm (V495-L585)-Fc se expone en SEC ID Nº: 120, incluyendo secuencia señal (nucleótidos 1-96) y prodominio (nucleótidos 97-165). La secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica mhm (V495-L585)-Fc se expone en SEC ID Nº: 121.

La secuencia de nucleótidos resultante que codifica, y la secuencia proteica que define, la construcción mhm (V495L585) se exponen en SEC ID Nº: 211 y 212, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico expuesta en SEC ID Nº: 211 incluye la secuencia señal (nucleótidos 1-96) y el prodomonio (nucleótidos 97-165) y la secuencia proteica expuesta en SEC ID Nº: 212 incluye la secuencia proteica activa (sin la secuencia señal o el prodominio). La secuencia de nucleótidos resultante que codifica, y la secuencia proteica que define, la construcción mhm (I499-R556) se exponen en SEC ID Nº: 213 y 214, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico expuesta en SEC ID Nº: 213 incluye la secuencia señal (nucleótidos 1-96) y el prodominio (nucleótidos 97-165) y la secuencia proteica expuesta en SEC ID Nº: 214 incluye la secuencia proteica activa (sin la secuencia señal o el prodominio). La secuencia de nucleótidos resultante que codifica, y la secuencia proteica que define, la mhm (W507-L585) se exponen en SEC ID Nº: 215 y 216, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico expuesta en SEC ID Nº: 215 incluye la secuencia señal (nucleótidos 196) y el prodominio (nucleótidos 97-165) y la secuencia proteica expuesta en SEC ID Nº: 216 incluye la secuencia proteica activa (sin la secuencia señal o el prodominio).

e. Expresión Proteica

(1)

Cultivo celular

Se cultivaron células CHO FlpIn (Invitrogen, nº de catálogo R758-07)) en medio F12K (ATCC, nº de catálogo 30-2004), FCS 10 % (Invitrogen, nº de catálogo 10438026), Penicilina 1 % (10.000 unidades/ml) /Estreptomicina (10.000 µg/ml) (Invitrogen, nº de catálogo 15140-122) a 37 °C, CO2 5 %, Zeocina 100 µg/ml (Invitrogen, nº de catálogo R250-01).

(2)

Generación de Líneas Celulares de CHO FlpIn Estables

Se transfectaron células hospedadoras CHO FlpIn con una relación 9:1 de ADN de plásmido de expresión pOG44:pcDNA5/FRT usando lipofectamine 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, nº de catálogo 11668-027). Como controles, las células se transfectaron con plásmido pcDNA5/vector FRT/pOG44 vacío y pOG44 (Invitrogen, nº de catálogo 35-3018) solamente. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se dividieron y después de cuarenta y ocho horas se añadió Higromicina B 0,5 mg/ml (Sigma, nº de catálogo H0654-SPEC) a las células. Se realizó una selección policlonal de células estables en F12K, FCS 10 %, Penicilina/Estreptomicina 1 %, Higromicina B 0,5 mg/ml.

(3)

Expresión proteica en líneas celulares CHO FlpIn estables.

Se sembraron aproximadamente 2x106 células en placas de 15 cm y se cultivaron en F12K (ATCC, nº de catálogo 302004)/DMEM de alta glucosa (Invitrogen, nº de catálogo 11995065) 1:1, IgG FCS 5 % ultra bajo (Invitrogen, nº 1625078) a 37 °C, CO2 5 % durante 5-6 días. Se recogieron los sobrenadantes y las proteínas resultantes se analizaron por ELISA y por resonancia de plasmón superficial.

Ejemplo 4 -Características de Unión de Anticuerpos Monoclonales Anti-hHGF

Los anticuerpos monoclonales producidos en el Ejemplo 1 se caracterizaron por su capacidad para unirse a hHGF y ciertas de las proteínas HGF recombinantes producidas en el Ejemplo 3.

Los anticuerpos se analizaron por resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIAcore T100 para evaluar su capacidad para unirse a HGF y ciertas de las proteínas de fusión analizadas en el Ejemplo 3. Cada anticuerpo se inmovilizó en una microplaca sensora CM5 de dextrano carboximetilado (BIAcore, nº de catálogo BR-1006-68) por acoplamiento de amina (BIAcore, nº de catálogo BR-1000-50) usando un protocolo de acoplamiento convencional de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se realizaron análisis a 25 ºC usando PBS (GIBCO, nº de catálogo 14040-133) que contenía tensioactivo P20 0,05 % (BIAcore, nº de catálogo R-1000-54), BSA 2 mg/ml (EMD, nº de catálogo 2930) y sal de dextrano sódico CM 10 mg/ml (Fluka, nº de catálogo 86524) como tampón de ejecución. Se inyectó sobrenadante que contenía diferentes proteínas de fusión HGF o sobrenadante de células transfectadas con vector vacío sobre cada anticuerpo a un caudal de 30 µl/minuto durante 3 minutos. La unión resultante se determinó como unidades de resonancia (UR) frente a línea basal 30 segundos después del final de la inyección. La unión se compare con HGF humano (R&D Systems, nº de catálogo 294-HGN-025) diluido en tampón de ejecución. Se controló la unión no específica comparando la unión con una superficie de control en la que se inmovilizó IgG de ratón (Rockland, nº de catálogo 010-0102) usando el mismo procedimiento de acoplamiento de amina.

Los resultados se resumen en la Tabla 3.

Anticuerpo

rhHGF (R&D Systems) rmHGF (R&D Systems) quimera mhm (V495-L585) HGF humano G555E C561R

1A3

Sí No No Sí Sí Sí

1D3

Sí No Sí Sí Sí Sí

1F3

Sí Sí Sí Sí Sí Sí

2B8

Sí No Sí Sí Sí Sí

2F8

Sí Sí No Sí Sí Sí

3A12

Sí No No Sí Sí Sí

3B6

Sí No No Sí Sí Sí

3D11

Sí No No Sí Sí Sí

Los resultados de la Tabla 3 demuestran que cada uno de los anticuerpos se une a rHGF y HGF humano purificado. Además, todos los anticuerpos se unen a hHGF que contiene mutaciones puntuales G555E y C561R. En general, ninguno de los anticuerpo excepto 1F3 y 2F8 se unió a HGF murino lo que demuestra que los anticuerpos 1A3, 1D3, 2B8, 3A12, 3B6 y 3D11 específicamente se unen a HGF humano. Los anticuerpos 1D3, 1F3 y 2B8 se unen a la quimera ratón-humano-ratón mientras que el resto de los anticuerpos no. Los resultados sugieren que los anticuerpos 1D3 y 2B8 al menos en parte se unen a los restos 495-585 de HGF humano. Los anticuerpos 1A3, 3A12, 3B6 y 3D11 parecen unirse a partes de hHGF humano distintas de los restos 495-585. En la actualidad, no está determinado porqué 2F8 no se une a la quimera mhm puesto que parece unirse tanto a hHGF como a mHGF.

Ejemplo 5 -Capacidad de Anticuerpos Monoclonales Anti-hHGF para unirse a HGF reducido y no reducido

En este Ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-hHGF producidos en el Ejemplo 1 se analizaron con respecto a su capacidad para unirse a HGF reducido y no reducido.

La reactividad de los sueros anti-HGF con el hHGF recombinante se evaluó por inmunotransferencia. Se fraccionaron ocho µg de proteína hHGF recombinante en tampón de ejecución NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen) con o sin tampón reductor de muestra NuPAGE (Invitrogen) en un gel de pocillos 1,0 mmX2D de Bis-Tris 4-12 % (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las proteínas fraccionadas se transfirieron después a una membrana de nitrocelulosa usando procedimientos convencionales. Las membranas de nitrocelulosa se bloquearon con solución en polvo de leche desgrasada 5 % en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 0,1 % (TBST) y después se montaron en una aparato de Multiexploración Mini Protean II (BioRad) para bloqueo adicional.

Las membranas resultantes se examinaron con los anticuerpos purificados en un aparato de Multiexploración. Los anticuerpos purificados se diluyeron a 5 µg/ml en tampón de bloqueo. La membrana de nitrocelulosa se retiró después del aparato y se incubó con anticuerpos de IgG anti-ratón marcados con peroxidasa de rábano rusticano. Los resultados se resumen en la Tabla 4, en la que los números reflejan el alcance de unión representando -la menor unión (unión baja o sin unión) y representando 3+ la mayor unión.

TABLA 4

Anticuerpo

Reducido (exposición: 3,5 minutos) No reducido (exposición 20 segundos)

1A3

2+ 2+

1D3

2+ 2+

1F3

2+ 2+

2B8

- 1+

2F8

2+ 2+

3A12

- 2+

3B6

3+ 2+

3D11

- 3+

Los datos de la Tabla 4 demuestran que todos los anticuerpos se unen a rhHGF no reducido. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales 1A3, 1D3, 1F3, 2F8, 3B6 se unieron a rhHGF reducido pero los anticuerpos 2B8, 3A12 y 5 3D11 no se unieron a rhHGF reducido.

Ejemplo 6 -Afinidades de Unión

Las afinidades de unión y cinética de interacción de cada uno de los anticuerpos producidos en el Ejemplo 1 frente a hHGF se midieron por resonancia de plasmón superficial.

Se inmovilizaron inmunoglobulinas anti-ratón de conejo (BIAcore, nº de catálogo BR-1005-14) en microplacas sensoras

10 CM5 de dextrano carboximetilado (BIAcore, nº de catálogo BR-1006-68) por acoplamiento de amina (BIAcore, nº de catálogo BR-1000-50) usando un protocolo de acoplamiento convencional de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los análisis se realizaron a 25 ºC usando PBS (GIBCO, nº de catálogo 14040-133) que contenía tensioactivo P20 0,05 % (BIAcore, nº de catálogo BR-1000-54), BSA 2 mg/ml (EMD, nº de catálogo 2930) y sal de Dextrano sódico CM 10 mg/ml (Fluka, nº de catálogo 86524) como tampón de ejecución.

15 Los anticuerpos se capturaron en una celda de flujo individual a un caudal de 10 µl/minuto. El tiempo de inyección fue variable para que cada anticuerpo produjera aproximadamente 20 UR de anticuerpo capturado para cada ciclo. Se inyectó tampón o HGF (R&D Systems, nº de catálogo 294-HGN-025) diluido en tampón de ejecución secuencialmente sobre una superficie de referencia (sin anticuerpo capturado) y la superficie activa (anticuerpo a ensayar) durante 2 minutos a 60 µl/minuto. La fase de disociación se controló durante 15 ó 90 minutos, dependiendo de la concentración.

20 La superficie se regeneró después con Glicina-HCl 10 mM, pH 1,7 (BIAcore, nº de catálogo BR-1003-54) inyectada durante 3 minutos a un caudal de 60 µl/minuto antes de que se iniciara otro ciclo. Las concentraciones de HGF ensayadas fueron de 0,46 nM a 7,5 nM.

Los parámetros cinéticos se determinaron usando la función cinética del software BIAevalutation con resta de referencia. Los parámetros cinéticos para cada anticuerpo Ka (constante de tasa de asociación), kd (constante de tasa

25 de disociación) y KD (constante de disociación en equilibrio) se resumen en la Tabla 5.

TABLA 5

Anticuerpo

ka (1/Ms) ET (ka) kd (1/2) ET (kd) KD (pM) DT

1A3

1,7x106 7,3x104 5,2x10-5 8,4x10-7 30,1 5,6

1D3

1,7x106 3,1x104 8,2x10-5 1,7X10-6 54,2 27,4

1F3

1,5x106 5,0x104 2,6x10-5 6,6x10-7 18,1 8,2

2B8

1,6x106 2,9x104 2,1x10-5 1,4x10-7 13,5 4,4

3A12

1,6x106 3,7x104 1,6x10-4 1,6x10-6 103,0 10,4

3B6

2,0x106 6,5x104 3,9x10-5 3,2x10-7 17,0 3.4

Los datos de la Tabla 5 demuestran que los anticuerpos se unen a hHGF con una KD de aproximadamente 100 pM o menos, aproximadamente 50 pM o menos o 20 pM o menos.

Ejemplo 7 -Actividad de Neutralización de Anticuerpos Anti-hHGF

En este Ejemplo, los anticuerpos producidos en el Ejemplo 1 se caracterizaron por su capacidad para (a) inhibir la unión de hHGF con c-Met y (b) inhibir la incorporación de BrdU estimulada por HGF en células 4MBr-5.

a. Ensayo de Inhibición de Unión de HGF-Met (Ensayo de Neutralización)

Los anticuerpos se ensayaron por ELISA con respecto a su capacidad para inhibir la unión de hHGF con c-Met.

Específicamente, se recubrieron placas de ensayo DELFIA de 96 pocillos Wallac (Wallac Inc., nº de catálogo AAAND0001) con 100 µl de HGF 6,25 µg/ml (R&D Systems, nº de catálogo 294-HGN-025) en tampón de recubrimiento de carbonato (Na2CO3 15 mM y NaHCO3 34 mM, pH 9,0) durante 16 horas a 4 °C. Las placas se bloquearon después con 200 µl de leche en polvo desgrasada 5 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos se prepararon en una placa separada añadiendo concentraciones crecientes de los anticuerpos que se investigan (0,033667 nM, dilución en serie 3 veces) a c-Met 2nM (R&D Systems, nº de catálogo 358-MT/CF) en leche en polvo desgrasada 5 % en PBS. Se transfirieron 100 µl de muestra por pocillo a la placa de ensayo y se incubó durante una noche a 4 °C. Las placas de ensayo se lavaron después 3 veces con PBS-Tween 20 0,1 % y se incubaron 2 horas a temperatura ambiente con 100 µl/pocillo de anticuerpo anti-c-Met humano biotinilado 2 µg/ml (R&D Systems, nº de catálogo BAF358) preparado en leche en polvo desgrasada 5 % en PBS.

Las placas resultantes se lavaron después tres veces con PBS-Tween 20 0,1 % y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con Estreptavidina marcada con Eu (Wallac, nº de catálogo 1244-360) diluida 1:1000 en tampón de ensayo DELFIA (Wallac, nº de catálogo 4002-0010). Las placas resultantes se lavaron 3 veces con solución de lavado DELFIA (Wallac, nº de catálogo 4010-0010) y se incubaron con solución potenciadora DELFIA 100 µl/pocillo (Wallac nº 4001-0010) durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación.

Las placas se leyeron en instrumento Victor3V (Perkin Elmer) usando el método de Europio. Los valores de CI50 se calcularon y se resumen en la Tabla 6.

TABLA 6

Anticuerpo

CI50 (nM) DT

1A3

5,65 0,91

1D3

4,43 2,27

1F3

6,57 0,28

2B8

5,57 1,19

2F8

5,36 0,88

3A12

5,26 2,11

3B6

- -

3D11

5,66 2,75

Los resultados demuestran que todos los anticuerpos (es decir, 1D3, 1A3, 2B8, 3A12, 1F3, 3D11 y 2F8) distintos de 3B6 neutralizan eficazmente la unión de HGF con c-Met.

b. Neutralización de la Incorporación de BrdU Estimulada por HGF en células 4MBr-5

Se distribuyeron 10 µl de hHGF 12,5 nM en pocillos individuales de una placa de microtitulación de cultivo tisular de 96 pocillos (Costar nº de catálogo 3903). Se añadieron 10 µl de anticuerpos diluidos en serie a concentraciones de 6667, 2222, 740, 247, 82, 27, 9,1, 3,0, 1,0, 0,33 nM a cada pocillo. La mezcla de anticuerpos de HGF se incubó después a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se disociaron células epiteliales bronquiales de mono 4MBr-5 (ATCC, CCL208) cultivadas en F-12K (ATCC, 30-2004), FBS 15 % (Gibco 10438-026), EGF 30 ng/ml (Sigma E9644), penicilina/estreptomicina 1 % (PS, Gibco nº de catálogo 15140-122) con tripsina (Gibco nº de catálogo 25200-056), se resuspendieron en medio de ensayo (F-12K, FBS 2,5 %, PS 1 %) a 75.000 células/ml y se distribuyeron 80 µl de la suspensión celular en la mezcla de anticuerpos de HGF.

Las células resultantes se incubaron a 37 °C, CO2 5 %. Cuarenta y ocho horas después, se añadieron 10 µl de BrdU 100 µM (Roche nº de catálogo 1669915). Setenta y dos horas después, los medios se retiraron, las placas se secaron con un secador de pelo y se procesaron con el ELISA de BrdU de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche nº de catálogo. 1669915).

La señal luminiscente se cuantificó por un lector de placa Synergy HT (Bio-Tek). Los datos se ajustaron a una respuesta a dosis sigmoidea con pendiente variable con la ecuación y = inferior + (superior-inferior)/(1+10^(log(CE50-x)*pendiente

de colina)) en GraphPad Prism (GraphPad Software). Cada experimento se repitió al menos 3 veces por duplicado y se presentan los valores medios de CE50 en la Tabla 7.

TABLA 7

Anticuerpo

CI50 (nM)

1A3

4,69

1D3

4,99

1F3

1,94

2B8

1,41

2F8

19,24

3A12

30,30

3B6

36,08

3D11

5,12

Los resultados de la Tabla 7 demuestran que todos los anticuerpos, 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 y 3D11 inhiben la proliferación inducida por HGF en células 4MBr-5.

Ejemplo 8 -Actividad Anti dispersión de Anticuerpos Anti-hHGF

Este Ejemplo describe una caracterización de los anticuerpos producidos en el Ejemplo 1 por su capacidad para inhibir actividad de dispersión inducida por HGF. HGF induce “dispersión” (motilidad) de grupos en células MDCK (ATCC, Manassas, VA, nº de catálogo. CCL-34).

Se sembraron células MDCK en placas de cultivo tisular Costar de 96 pocillos (Coming Incorporated, Coming, NY, nº de catálogo 3595) a una densidad de 4x103 células por pocillo en 80 µl de MEM (ATCC, Manassas, VA, nº de catálogo 302003) que contenía Suero Bovino fetal 10 % (Invitrogen nº de catálogo 10438026) y penicilina-estreptomicina 1 % (Invitrogen nº de catálogo 15140122). Cada uno de los anticuerpos a investigar se diluyó a 6,667 nM en MEM que contenía Suero Bovino Fetal 10 % y penicilina-estreptomicina 1 %. Cada una de las diluciones de anticuerpos diferentes, así como MEM que contenía Suero Bovino Fetal 10 % y penicilina-estreptomicina 1 % sin anticuerpo, se combinó después de forma separada con un volumen igual de MEM que contenía Suero Bovino Fetal 10 % y penicilina-estreptomicina 1 % y HFG 100 ng/ml (R&D Systems nº de catálogo 294-HGN-025). Las diluciones de anticuerpo/HGF se incubaron durante 30 minutos a 25 ºC. Se añadieron 20 µl de cada dilución de anticuerpo/HGF de forma separada a pocillos individuales, produciendo una concentración de anticuerpo final de 666,7 nM y una concentración de HGF final de 10 ng/ml. Las células MDCK se incubaron después durante 24 horas a 37 °C con CO2 5 %.

Después de 24 horas de incubación, las células MDCK se lavaron cuidadosamente una vez con 100 µl por pocillo de PBS helado (Invitrogen nº de catálogo 14190144) y se fijaron con 100 µl por pocillo de metanol helado agitando a la vez durante 10 minutos a 25 ºC. Las placas se lavaron después cuidadosamente una vez con agua destilada. Se añadió un volumen de 100 µl de solución de violeta cristal, que consistía en violeta cristal 0,5 % (Sigma, St. Louis, MO, nº de catálogo C3886) y etanol 50 % en agua destilada, a cada pocillo y las células se incubaron durante 20 minutos a 25 ºC en agitación.

Después de la tinción con solución de violeta cristal, las células se lavaron cuidadosamente tres veces con agua destilada. Después, se añadió PBS a cada pocillo para evitar el secado de las muestras. Se tomaron imágenes de las células usando el microscopio Leica DMIRB (Leica Microsystems GmbH, Wetzler, Alemana), cámara DC500 (Leica Microsystems GmbH, Wetzler, Alemania) y software MagnaFire 2.1C (Optronics, Goleta, CA), y las muestras se valoraron por su nivel de dispersión. Los resultados se resumen en la Tabla 8.

TABLA 8

Inhibición de dispersión de células MDCK inducida por HGF

Anticuerpo

Ensayo 1 Ensayo 2

1A3

++ +

1D3

++ ++

1F3

+ +

2B8

+++ +++

2F8

+ +

3A12

- -/+

3B6

++ ++

3D11

- -

-

Sin Inhibición

+++ Inhibición muy fuerte, casi completa

++ Inhibición fuerte

+ Inhibición detectable

Los resultados en la Tabla 8 demuestran que el anticuerpo 2B8 inhibió la dispersión inducida por HGF más que los otros anticuerpos. Los anticuerpos 1D3 y 3B6 presentaron un nivel intermedio de inhibición; el anticuerpo 1A3 presentó un nivel de inhibición de bajo a intermedio; los anticuerpos 1F3 y 2F8 presentaron un nivel bajo de inhibición; y los anticuerpos 3A12 y 3D11 proporcionaron poca o ninguna inhibición detectable.

Ejemplo 9 -Inhibición de Fosforilación de c-Met estimulada por HGF

Este Ejemplo describe una caracterización de los anticuerpos producidos en el Ejemplo 1 por su capacidad para inhibir la fosforilación de c-Met estimulada por HGF en células PC-3. HGF induce la fosforilación de Met en células PC-3 (ATCC Nº CRL-1435).

Se sembraron células PC-3 en pocillos individuales de placas de cultivo tisular Costar de 96 pocillos (Corning nº de catálogo 3595) a una densidad de 4,5x104 células por pocillo en 100 µl de F-12K (ATCC, Manassas, VA, nº de catálogo 30-2004) que contenía Suero Bovino Fetal 10 % (Invitrogen nº de catálogo 10438026) y penicilina-estreptomicina 1 % (Invitrogen nº de catálogo 15140122). Después de 24 horas a 37 °C con CO2 5 %, el medio se retiró y las células se aclararon una vez con F-12K sin suero que contenía penicilina-estreptomicina 1 %. Las células se incubaron después durante 24 horas en 100 µl de F-12K sin suero que contenía penicilina-estreptomicina 1 %.

Las siguientes 10 diluciones diferentes de cada uno de los anticuerpos que se investigan se prepararon en F-12K sin suero que contenía penicilina-estreptomicina 1 %: 6667 nM, 2222 nM, 741 nM, 247 nM, 82,3 nM, 27,4 nM, 9,1 nM, 3,0 nM, 1,0 nM y 0,3 nM. Cada dilución de anticuerpo y F-12K sin suero que contenía penicilina-estreptomicina 1 % sin anticuerpos, se combinaron de forma separada con un volumen igual de F-12K sin suero que contenía penicilina-estreptomicina 1 % y HGF 500 ng/ml (R&D Systems nº de catálogo 294-HGN-025). Estas diluciones de anticuerpos/HGF se incubaron durante 30 minutos a 25 ºC. Esto dio como resultado una concentración final de HGF 1,25 nM.

Las células PC-3 se aclararon después una vez con F-12K sin suero que contenía penicilina-estreptomicina 1 %. A continuación, se añadieron 70 µl de F-12K sin suero que contenía penicilina-estreptomicina 1 % a las células, seguido de 10 µl de Na3VO4 10 mM (Sigma nº de catálogo S6508) en F-12K sin suero que contenía penicilina-estreptomicina 1 %. Las células se incubaron después durante 60 minutos a 37 °C con CO2 5 %. Después de esta incubación, se añadieron 20 µl de cada dilución de anticuerpo/HGF por separado a pocillos separados, produciendo una concentración de HGF final de 50 ng/ml y las siguientes concentraciones finales de cada anticuerpo: 666,7 nM, 222,2 nM, 74,1 nM, 24,7 nM, 8,23 nM, 2,74 nM, 0,91 nM, 0,30 nM, 0,10 nM, 0,03 nM. Las células se incubaron después durante 10 minutos a 37 ºC con CO2 5 %, después de lo cual se eliminó la mezcla de medio/anticuerpo/HGF, las placas se colocaron en hielo. Las células se aclararon después con 100 µl por pocillo de PBS helado (Invitrogen nº de catálogo 14190144) que contenía Na3VO4 1 mM. Las células se incubaron después durante 30 minutos a 4 °C en 100 µl por pocillo de tampón de lisis helado que consistía en OmniPur Triton X-100 1 % (MERCK KGaA, Darmstadt, Alemania, nº de catálogo 9410), Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, Na3VO4 0,3 mM, cóctel de inhibidor de proteasa 1x (Sigma nº de catálogo P8340), y cóctel de inhibidor de fosfatasa 2 1x (Sigma nº de catálogo 5726).

Se diluyó anticuerpo anti-HGF-R humano (c-met) biotinilado (R&D Systems nº de catálogo BAF358) a una concentración de 2 µg/ml en Tampón de Ensayo DELFIA (PerkinElmer, Turku, Finlandia, nº de catálogo 4002-0010) que contenía

albúmina de suero bovino 1 % (Sigma nº de catálogo A2153) y se añadieron 50 µl de esta dilución por pocillo de placas de microtitulación de estreptavidina amarillas (PerkinElmer nº de catálogo AAAND-0005). Las placas se incubaron después con anticuerpo durante 30 minutos a 25 ºC sin agitación. Después de la incubación, las placas se lavaron con solución de lavado DELFIA (PerkinElmer nº de catálogo 4010-0010) y se añadieron 80 µl de cada uno de los lisados celulares de PC-3 diferentes por separado a pocillos individuales de las placas de microtitulación de estrptavidina lavadas.

Las placas de microtitulación de estreptavidina que contenían lisados celulares de PC-3 se incubaron durante 60 minutos a 25 °C con agitación y después se lavaron con solución de lavado DELFIA. Se añadieron 100 µl de anticuerpo Eu-N1 P-Tyr-100 DELFIA 600 ng/ml (PerkinElmer nº de catálogo AD0159) diluido en Tampón de Ensayo DELFIA que contenía albúmina de suero bovino 1 % a cada pocillo de las placas de microtitulación de estreptavidina lavadas previamente incubadas con lisados celulares de PC-3. Las placas se incubaron durante 60 minutos a 25 °C, con agitación. Las placas se lavaron una última vez con solución de lavado DELFIA. Después se añadieron 200 µl de Solución potenciadora DELFIA (PerkinElmer nº de catálogo 4001-0010) a cada pocillo de las placas de microtitulación de estreptavidina y las placas se incubaron en oscuridad durante 5 minutos a 25 °C, con agitación.

La señal se midió después usando el protocolo de Europio en el lector Victor3V (PerkinElmer). Los valores de CE50 se calcularon usando Prism 4 para Windows (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) y la ecuación de respuesta a dosis sigmoidea.

Los resultados resumidos como CE50 en nM se exponen en la Tabla 9

TABLA 9

Anticuerpo

Media de Dos Ensayos Desviación Típica

1A3

0,684 0,242

1D3

0,984 0,129

1F3

1,19 1,01

2B8

0,287 0,104

2F8

1,39 2,12

3A12

2,00 0,553

3B6

1,01 1,11

3D11

2,28 N/D

Los datos de la Tabla 9 demuestran que los ocho anticuerpos son potentes inhibidores de fosforilación de c-Met inducida por HGF en células PC-3.

Ejemplo 10 -Inhibición de tumores en modelo de Xenotrasplante U87MG

La capacidad de anticuerpos monoclonales murinos de la invención para inhibir el crecimiento tumoral se ensayó en un modelo de xenotrasplante U87MG. Se expandieron células U87MG (ATCC) en cultivo a 37 ºC en una atmósfera que contenía CO2 5 % y aire 95 %, usando un medio que comprende medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal 10 %, penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 µg/ml. Las células se subcultivaron y se mantuvieron separando las células de la pared de la placa de cultivo usando tripsina-EDTA.

Se recogieron células casi confluyentes por tripsinización y después se inyectaron 5x106 células en Matrigel 50 % (BD Biosciences; nº de catálogo 356237) por vía subcutánea en el área dorsal superior entre los omóplatos de ratones ICR SCID hembra de 7 semanas de edad (Taconic Labs). Los diámetros largo (L) y corto (W) (mm) de los tumores se midieron con un calibrador. El volumen tumoral (vol.) se calculó como: volumen (mm3) = L x W2 / 2. Cuando los tumores crecieron hasta aproximadamente 200 mm3, los ratones que portaban tumores se separaron aleatoriamente en 5 grupos de 10 ratones cada uno. Un grupo recibió PBS. Cada uno de los otros 4 grupos recibió uno del anticuerpo 1A3, 1D3, 1F3 o 2B8. Todos los anticuerpos se dosificaron a 1 mg/kg de peso corporal, dos veces por semana, por inyecciones intraperitoneales de 5 dosis. Los volúmenes tumorales y pesos corporales del ratón se registraron dos veces por semana. La inhibición del crecimiento tumoral se analizó usando ensayo de t de Student. Los resultados se resumen en la Figura 6 y Tabla 10.

Tabla 10

Porcentaje de Inhibición

2B8 vs PBS

93 % p=0,001

1A3 vs PBS

73 % p=0,0075

1D3 vs PBS

51 % p=0,075

1F3 vs PBS

60 % p=0,027

Se consiguió regresión parcial en el grupo tratado con 2B8 (Figura 6). Se observó inhibición del crecimiento estadísticamente significativa en los grupos tratados con 1A3 y tratados con 1F3 (Tabla 10). Hubo una inhibición del crecimiento tumoral del 51 % para 1D3 con un p valor de 0,075. No se observó pérdida de peso corporal significativa.

Ejemplo 11 -Inhibición Tumoral en Modelo de Xenotrasplante U118

La capacidad de los anticuerpos 1A3, 1D3, 1F3 y 2B8 para inhibir el crecimiento tumoral se ensayó en un modelo de xenotrasplante U118. Se expandieron células U118 (ACC) como se ha descrito en el Ejemplo 10 (anteriormente) con respecto a las células U87MG.

Se establecieron tumores subcutáneos como se ha descrito en el Ejemplo 10 anteriormente, excepto que los ratones usados fueron ratones desnudos NCr hembras de 7 semanas de edad (Taconic) y el tratamiento se comenzó cuando los tumores crecieron hasta aproximadamente 80 mm3. Como en el modelo U87MG, todos los anticuerpos se dosificaron a 1 mg/kg de peso corporal dos veces por semana por inyecciones intraperitoneales durante 4 dosis. Los volúmenes tumorales y pesos corporales de los ratones se registraron dos veces por semana. La inhibición del crecimiento tumoral se analizó usando ensayo de t de Student. Los resultados se resumen en la Figura 7 y Tabla 11.

Tabla 11

Porcentaje de Inhibición

2B8 vs IgG

75 % p=0,007

1A3 vs IgG

57 % p=0,01

1D3 vs IgG

47 % p=0,12

1F3 vs IgG

30 % p=0,39

Se observó inhibición del crecimiento tumoral estadísticamente significativa en los grupos tratados con 2B8 y 1A3 (Figura 7). Hubo una inhibición del crecimiento tumoral modesta en los grupos de 1F3 y 1D3 con p valores menores de 0,05, que se definió como la significación estadística en este estudio (Tabla 11). No se observó pérdida de peso corporal significativa.

Ejemplo 12 -Humanización de Anticuerpos Monoclonales Murinos

Este Ejemplo describe la humanización del anticuerpo 2B8 murino, junto con una caracterización de los anticuerpos humanizados resultantes. Las Regiones Variables Pesada y Ligera de 2B8 se “humanizaron” por dos métodos.

A. Procedimiento de Humanización 1

En el primer método, se diseñaron tres regiones variables de cadena pesada humanizadas y dos regiones variables de cadena ligera kappa humanizadas basándose en el método de “superhumanization” descrito en Hwang et al. (2005) Methods 36:35-42; Tan et al. (2002) J. Immunol. 169:1119-1125; Patente de Estados Unidos Nº 6.881.557.

La clase de estructura canónica de Chothia se determinó para cada CDR de 2B8 de ratón basándose en la composición de aminoácidos y longitud de la CDR. Se identificaron regiones variables de línea germinal humana que consistían en regiones variables ligeras y pesadas de la misma clase estructural canónica Chothia basándose en alelos de referencia de región variable de línea germinal humana conocidos descritos en el sitio web del Sistema de Información de Inmunogenética Internacional (IMGT) (disponible en la web en imgt.cines.fr y biochem.unizh.ch/ anticuerpo/ Sequences/ index.html). Estas regiones variables de línea germinal humana de la misma clase estructural se compararon con regiones variables de 2B8 murinas calculando el porcentaje de identidad o similitud entre los restos aminoacídicos de CDR. Las regiones variables de línea germinal humana con la mayor identidad y/o similitud con los restos de CDR de 2B8 de ratón se seleccionaron para injerto de CDR. Los restos flanqueantes de las regiones variables de línea germinal humana se conservaron mientras que los restos de CDR de 2B8 se usaron para reemplazar los restos de región variable de línea germinal humana que fueron diferentes entre CDR de 2B8 de ratón y CDR de línea germinal humana. La región J humana que era más similar a la región J de ratón de 2B8 se añadió después al extremo carboxilo terminal de la región variable “superhumanized”. Se añadió después una secuencia señal al extremo amino terminal de las regiones variables “superhumanized” y estas secuencias de aminoácidos se convirtieron en secuencias de ácido nucleico.

La secuencia de ácido nucleico de región variable completa se construyó usando métodos de PCR de síntesis génica (Young et al. (2004) NUCL. ACIDS Res. 32:e59) y se clonó en un vector de expresión de mamíferos (basado en 5 pcDNA3.2 DEST (Invitrogen)) que contenía regiones IgG1 (alotipo G1m(17,1)) o Kappa (alotipo Km(3)(alelo 2)) constantes humanas (cadena abajo de las regiones variables) usando técnicas de biología molecular convencionales. Los cuatro anticuerpos IgG1 de cadena pesada (2B8 quimérico) y 3 cadenas pesadas humanizadas (Hu2B8 Hv1-f.1, Hu2B8 Hv5-a.1, Hu2B8 Hv5-51.1) se expresaron en las posibles combinaciones con los 3 anticuerpos de cadena kappa (2B8 quimérico) y 2 cadenas ligeras humanizadas (Hu2B8 Kv1-39.1 y Hu2B8 Kv3-15.1) creando 12 proteínas de

10 anticuerpo diferentes. La unión de los anticuerpos quiméricos, quiméricos/humanizados y humanizados con HGF humano se midió después como se describe posteriormente y los resultados se resumen en la Figura 8. Cada una de las posibles combinaciones de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina y cadena ligera de inmunoglobulina se expone a continuación en la Tabla 12A.

Tabla 12A

Región Variable de Cadena Pesada

Región Variable de Cadena Ligera

2B8 Quimérico (SEC ID Nº: 12)

2B8 Quimérico (SEC ID Nº: 14)

2B8 Quimérico (SEC ID Nº: 12)

Hu2B8 Kv1-39.1 (SEC ID Nº: 173)

2B8 Quimérico (SEC ID Nº: 12)

Hu2B8 Kv3-15.1 (SEC ID Nº: 179)

Hu2B8 Hv1-f.1 (SEC ID Nº: 159)

2B8 Quimérico (SEC ID Nº: 14)

Hu2B8 Hv1-f.1 (SEC ID Nº: 159)

Hu2B8 Kv1-39.1 (SEC ID Nº: 173)

Hu2B8 Hv1-f.1 (SEC ID Nº: 159)

Hu2B8 Kv3-15.1 (SEC ID Nº: 179)

Hu2B8 Hv5-a.1 (SEC ID Nº: 165)

2B8 Quimérico (SEC ID Nº: 14)

Hu2B8 Hv5-a.1 (SEC ID Nº: 165)

Hu2B8 Kv1-39.1 (SEC ID Nº: 173)

Hu2B8 Hv5-a.1 (SEC ID Nº: 165)

Hu2B8 Kv3-15.1 (SEC ID Nº: 179)

Hu2B8 Hv5-51.1 (SEC ID Nº: 169)

2B8 Quimérico (SEC ID Nº: 14)

Hu2B8 Hv5-51.1 (SEC ID Nº: 169)

Hu2B8 Kv1-39.1 (SEC ID Nº: 173)

Hu2B8 Hv5-51.1 (SEC ID Nº: 169)

Hu2B8 Kv3-15.1 (SEC ID Nº: 179)

Cada una de las posibles combinaciones de cadenas pesadas de inmunoglobulina y cadenas ligeras de inmunoglobulina se exponen a continuación en la Tabla 12B.

Tabla 12B

Cadena Pesada de Inmunoglobulina

Cadena Ligera de Inmunoglobulina

IgG1 de 2B8 Quimérico (SEC ID Nº: 155)

Kappa de 2B8 Quimérico (Km(3)) (SEC ID Nº: 157)

IgG1 de 2B8 Quimérico (SEC ID Nº: 155)

Hu2B8 Kv1-39.1 + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 2) (SEC ID Nº: 177)

IgG1 de 2B8 Quimérico (SEC ID Nº: 155)

Hu2B8 Kv3-15.1 + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 2) (SEC ID Nº: 181)

Hu2B8 Hv1-f1 + Constante IgG1 alotipo (G1M(17,1)) (SEC ID Nº: 163)

Kappa de 2B8 Quimérico (Km(3)) (SEC ID Nº: 157)

Hu2B8 Hv1-f1 + Constante IgG1 alotipo (G1M(17,1)) (SEC ID Nº: 163)

Hu2B8 Kv1-39.1 + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 2) (SEC ID Nº: 177)

Hu2B8 Hv1-f1 + Constante IgG1 alotipo (G1M(17,1)) (SEC ID Nº: 163)

Hu2B8 Kv3-15.1 + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 2) (SEC ID Nº: 181)

Hu2B8 Hv5-a.1+ Constante IgG1 alotipo (G1M(17,1)) (SEC ID Nº: 167)

Kappa de 2B8 Quimérico (Km(3)) (SEC ID Nº: 157)

Hu2B8 Hv5-a.1+ Constante IgG1 alotipo (G1M(17,1)) (SEC ID Nº: 167)

Hu2B8 Kv1-39.1 + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 2) (SEC ID Nº: 177)

Hu2B8 Hv5-a.1+ Constante IgG1 alotipo (G1M(17,1)) (SEC ID Nº: 167)

Hu2B8 Kv3-15.1 + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 2) (SEC ID Nº: 181)

Hu2B8 Hv5-51.1 + Constante IgG1 alotipo (G1M(17,1)) (SEC ID Nº: 171)

Kappa de 2B8 Quimérico (Km(3)) (SEC ID Nº: 157)

Cadena Pesada de Inmunoglobulina

Cadena Ligera de Inmunoglobulina

Hu2B8 Hv5-51.1 + Constante IgG1 alotipo (G1M(17,1)) (SEC ID Nº: 171)

Hu2B8 Kv1-39.1 + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 2) (SEC ID Nº: 177)

Hu2B8 Hv5-51.1 + Constante IgG1 alotipo (G1M(17,1)) (SEC ID Nº: 171)

Hu2B8 Kv3-15.1 + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 2) (SEC ID Nº: 181)

Dos de las posibles construcciones de anticuerpo que contienen las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de longitud completa que contienen regiones variables humanizadas se designan a continuación:

sh2B8-9 (G1m(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ región constante IgG1 (alotipo G1m(17,1))) (SEC ID Nº: 171) más hu2B8 Kv 5 1-39.1 (+ región constante Kappa (alotipo Km(3) (alelo 2))) (SEC ID Nº: 177)

sh2B8-12 (G1m(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ región constante IgG1 (alotipo G1m(17,1))) (SEC ID Nº: 171) más hu2B8 Kv 3-15.1 (+ región constante Kappa (alotipo Km(3) (alelo 2))) (SEC ID Nº: 181).

Las secuencias de ácido nucleico que codifican y las secuencias proteicas que definen cada uno de los anticuerpos humanizados se resumen a continuación. En esta sección, el ultimo nucleótido de cada región variable es la primera

10 base del siguiente codón generado por el punto de unión de región variable/constante. Este nucleótido se incluye en la región variable porque es parte de ese exón. Las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes enumeradas a continuación incluyen la traducción de este codón de punto de unión.

(1) Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Cadena Pesada de 2B8 quimérica de Longitud Completa (Región

Variable de Ratón y Región Constante IgG1 Humana) (alotipo G1m(17.1)) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 15 154)

(2)

Secuencia Proteica que Define la Cadena Pesada de 2B8 Quimérica de Longitud Completa (IgG1 de 2B8 Quimérica (alotipo G1m(17,1)) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 155)

(3)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Cadena Ligera de 2B8 Quimérica de Longitud Completa (Región Variable de Ratón y Región Constante Humana) (Kappa de 2B8 Quimérica (Km(3))) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 156)

(4)

Secuencia Proteica que Define la Cadena Ligera de 2B8 Quimérica de Longitud Completa (Kappa de 2B8 Quimérica (Km(3))) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 157)

(5) Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv1-f.1 Humanizada 10 (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 158)

(6) Secuencia Proteica que Define la Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv1-f.1 Humanizada (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 159)

15 (7) Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(17,1)) (SEC ID Nº: 160)

(8)

Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(17,1)) (SEC ID Nº: 161). El primer aminoácido deriva de la traducción del último nucleótido de región variable y los primeros dos nucleótidos de la secuencia de Cadena Pesada de IgG1.

(9)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Variable Hu2B8 Hv1f.1 Humanizada de Cadena Pesada de Longitud Completa y Región constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(17,1)) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 162)

(10)

Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(17,1)) y Región Variable Hu2B8 Hv1f.1 Humanizada de Cadena Pesada de Longitud Completa (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 163)

(11)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv5a.1 Humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 164)

(12)

Secuencia Proteica que Define la Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv5a.1 Humanizada (sin secuencia 10 señal) (SEC ID Nº: 165)

(13)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(17,1)) y Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv5a.1 Humanizada de Longitud Completa (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 166)

(14)

Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(17,1)) y Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv5a.1 Humanizada de Longitud Completa (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 167)

(15)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica Región Variable de Cadena Pesada de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizada 10 (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 168)

(16)

Secuencia Proteica que Define la Secuencia Variable de Cadena Pesada Hu2B8 HvS-51.1 Humanizada (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 169)

(17)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(17,1)) y Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 HvS-51.1 Humanizada de Longitud Completa (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 170)

5 (18) Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(17,1)) y Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizada de Longitud Completa (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 171)

10 (19) Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Variable de Cadena Kappa Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 172). Se muestran dos posibles ATG de inicio en mayúsculas.

(20)

Secuencia Proteica que Define la Región Variable de Cadena Kappa Hu2B8 Kv1-39.1 (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 173)

(21)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) (SEC ID Nº: 174)

(22)

Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) (SEC ID Nº: 175). El primer aminoácido deriva de la traducción del último nucleótido de región variable y los primeros dos nucleótidos de la secuencia de Cadena Ligera Kappa.

(23)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2)

y Región Variable de Cadena Ligera Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizada de Longitud Completa (secuencia señal subrayada) 10 (SEC ID Nº: 176)

(24) Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) y Región Variable de Cadena Ligera Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizada de Longitud Completa (SEC ID Nº: 177)

15 (25) Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Variable de Cadena Ligera Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 178)

(26)

Secuencia Proteica que Define la Región Variable de Cadena Ligera Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizada (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 179)

(27)

�?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) y Región Variable de Cadena Ligera Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizada de Longitud Completa (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 180)

(28)

Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) y Región Variable de Cadena Ligera Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizada (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 181)

Por conveniencia, la Tabla 13 proporciona un cuadro de concordancias que muestra la correspondencia entre las secuencias de longitud completa y de los anticuerpos analizados en esta sección con los presentados en la Lista de Secuencias.

TABLA 13

SEC ID Nº:

Proteína o �?cido Nucleico

154

IgG1 (G1m(17,1)) de 2B8 Quimérica -ácido nucleico

155

IgG1 (G1m(17,1)) de 2B8 Quimérica -proteína

156

Kappa (Km(3)) de 2B8 Quimérica -ácido nucleico

157

Kappa (Km(3)) de 2B8 Quimérica -proteína

158

Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv1f.1 -ácido nucleico

159

Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv1f.1 -proteína

160

Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana alotipo (G1m(17,1)) -ácido nucleico

161

Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana alotipo (G1m(17,1)) -proteína

162

Hu2B8 Hv1f.1 + Constante IgG1 (alotipo G1m(17,1)) -ácido nucleico

163

Hu2B8 Hv1f.1 + Constante IgG1 (alotipo G1m(17,1)) -proteína

164

Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv5a.1 -ácido nucleico

165

Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv5a.1 -proteína

166

Hu2B8 Hv5a.1 + Constante IgG1 (alotipo G1m(17,1)) -ácido nucleico

167

Hu2B8 Hv5a.1 + Constante IgG1 (alotipo G1m(17,1)) -proteína

168

Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv5-51.1 -ácido nucleico

169

Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv5-51.1 -proteína

170

Hu2B8 Hv5-51.1 + Constante IgG1 (alotipo G1m(17,1)) -ácido nucleico

171

Hu2B8 Hv5-51.1 + Constante IgG1 (alotipo G1m(17,1)) -proteína

172

Región Variable de Cadena Kappa Hu2B8 Kv1-39.1 -ácido nucleico

173

Región Variable de Cadena Kappa Hu2B8 Kv1-39.1 -proteína

174

Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) -ácido nucleico

175

Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 2) -proteína

176

Hu2B8 Kv1-39.1 + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 2) -ácido nucleico

177

Hu2B8 Kv1-39.1 + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 2) -proteína

178

Región Variable de Cadena Kappa Hu2B8 Kv3-15.1 -ácido nucleico

179

Región Variable de Cadena Kappa Hu2B8 Kv3-15.1 -proteína

180

Hu2B8 Kv3-15.1 + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 2) -ácido nucleico

181

Hu2B8 Kv3-15.1 + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 2) -proteína

B. Procedimiento de Humanización 2

El segundo procedimiento de humanización empleado para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo de ratón 2B8 se basa en el método descrito en Studnicka et al. (1994) PROTEIN ENG. 7:805-814. Se identificaron las regiones variables 5 de línea germinal humana pesada y kappa más idénticas (en el nivel de aminoácidos) a las de 2B8 de ratón. Los restos que diferían entre ratón y ser humano se convirtieron a la secuencia humana dependiendo del riesgo probable de que un cambio tal afectara a la unión o inmunogenicidad. Los restos de bajo riesgo (es decir, restos que cuando se cambian probablemente no afecten a la unión a antígeno y reducirían también la inmunogenicidad potencial) se cambiaron al aminoácido humano en la región variable pesada (creando LR2B8HC) y la región variable kappa (creando LR2B8LC). 10 Adicionalmente, los de bajo riesgo y medio riesgo (es decir, restos que cuando se cambian tienen cierta probabilidad de tener un efecto en los restos de unión a antígeno y también reducirían la inmunogenicidad potencial) se cambiaron al aminoácido humano en la región variable pesada (creando LRMR2B8HC) y la región variable kappa (creando LRMR2B8LC). La región constante de cadena pesada de IgG1 humana (alotipo G1m(3) (alelo 1)) se añadió al extremo carboxilo terminal de las dos regiones variables pesadas human engineered y la región constante Kappa humana 15 (alotipo Km(3) (alelo 1)) se añadió al extremo carboxilo terminal de dos regiones variables ligeras human engineered, creando de este modo cuatro cadenas de anticuerpo human engineered. Se sintetizaron en primera lugar secuencias de ácido nucleico de región variable por métodos de síntesis génica y se añadieron después a secuencias de región constante humanas. Estos anticuerpos human engineered se clonaron en vectores de expresión proteica de mamífero y la proteína se expresó en las cuatro posibles combinaciones de cadena pesada más cadena ligera. La unión de los

20 anticuerpos quiméricos, quiméricos/humanizados o humanizados con HGF humano se midió usando técnicas convencionales, como se describe posteriormente.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican y las secuencias proteicas que definen cada uno de los anticuerpos humanizados se resumen posteriormente. En esta sección, el último nucleótido de cada región variable es la primera base del siguiente codón generado por el punto de unión de región variable/constante. Este nucleótido se incluye en la

25 región variable porque es parte de ese exón. Las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes enumeradas a continuación incluyen la traducción de este codón de punto de unión.

(1) Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Variable de Cadena Pesada LR2B8HC Humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 182)

30 (2) Secuencia Proteica que Define la Región Variable de Cadena Pesada LR2B8HC Humanizada (sin secuencia seña) (SEC ID Nº: 183)

(3)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(3)) (alelo1) (SEC ID Nº: 184)

(4)

Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(3)) (alelo 1 ó 2) (SEC ID Nº: 185). El primer aminoácido deriva de la traducción del último nucleótido de la región variable y los dos primeros nucleótidos de la secuencia de Cadena Pesada de IgG1.

(5)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(3)) (alelo 1) y Región Variable de Cadena Pesada LR2B8HC Humanizada de Cadena Pesada de Longitud Completa (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 186)

(6)

Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(3)) (alelo 1) y Región Variable de Cadena Pesada LR2B8HC Humanizada de Cadena Pesada de Longitud Completa (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 187)

(7) Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Variable de Cadena Pesada LRMR2B8HC Humanizada 10 (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 188)

(8)

Secuencia Proteica que Define la Región Variable de Cadena Pesada LRMR2B8HC Humanizada (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 189)

(9)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(3)) (alelo 1) y Región Variable de Cadena Pesada LRMR2B8HC Humanizada de Cadena Pesada de Longitud Completa (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 190)

(10)

Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(3)) (alelo 1)

y Región Variable de Cadena Pesada LRMR2B8HC Humanizada de Cadena Pesada de Longitud Completa (sin 10 secuencia señal) (SEC ID Nº: 191)

(11)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Variable de Cadena Ligera LR2B8LC Humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 192)

(12)

Secuencia Proteica que Define la Región Variable de Cadena Ligera LR2B8LC Humanizada (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 193)

(13)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) (SEC ID Nº: 194)

(14)

Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) (SEC ID Nº: 195). El primer aminoácido derivó de la traducción del último nucleótido de la región variable y los primeros dos nucleótidos de la secuencia de Cadena Ligera Kappa.

(15)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) y Región Variable de Cadena Ligera LR2B8LC Humanizada de Longitud Completa (SEC ID Nº: 196)

(16) Secuencia Proteica que Codifica la Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) y Región 15 Variable de Cadena Ligera LR2B8LC Humanizada de Longitud Completa (SEC ID Nº: 197)

(17)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Variable de Cadena Ligera LRMR2B8LC Humanizada (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 198)

(18)

Secuencia Proteica que Define la Región Variable de Cadena Ligera LRMR2B8LC Humanizada (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 199)

(19)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) y Región Variable de Cadena Ligera LRMR2B8LC Humanizada de Longitud Completa (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 200)

(20)

Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) y Región Variable de Cadena Ligera LRMR2B8LC Humanizada de Longitud Completa (SEC ID Nº: 201)

Por conveniencia, la Tabla 14 proporciona un cuadro de concordancias que muestra la correspondencia entre las 15 secuencias de longitud completa y de los anticuerpos analizados en esta sección con las presentadas en la Lista de Secuencias.

TABLA 14

SEC ID Nº:

Proteína o �?cido Nucleico

182

Región Variable de Cadena Pesada LR2B8HC -ácido nucleico

183

Región Variable de Cadena Pesada LR2B8HC -proteína

184

Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(3)) (alelo 1) -ácido nucleico

185

Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(3)) (alelo 1) -proteína

186

LR2B8HC + Constante IgG1 (alotipo G1m(3)) (alelo 1) -ácido nucleico

187

LR2B8HC + Constante IgG1 (alotipo G1m(3)) (alelo 1) -proteína

188

Región Variable de Cadena Pesada LRMR2B8HC -ácido nucleico

189

Región Variable de Cadena Pesada LRMR2B8HC -proteína

190

LRMR2B8HC + Constante IgG1 (alotipo G1m(3)) (alelo 1) -ácido nucleico

191

LRMR2B8HC + Constante IgG1 (alotipo G1m(3)) (alelo 1) -proteína

192

Región Variable de Cadena ligera LR2B8LC -ácido nucleico

193

Región Variable de Cadena ligera LR2B8LC -proteína

194

Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) -ácido nucleico

195

Región Constante de Cadena Kappa Humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) -proteína

196

LR2B8LC + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 1) -ácido nucleico

197

LR2B8LC + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 1) -proteína

198

Región Variable de Cadena Ligera LRMR2B8LC -ácido nucleico

199

Región Variable de Cadena Ligera LRMR2B8LC -proteína

200

LRMR2B8LC + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 1) -ácido nucleico

201

LRMR2B8LC + Constante Kappa (alotipo Km(3)) (alelo 1) -proteína

La Tabla 15 resume las secuencias de CDR de cadena pesada (Definición de Kabat) de los anticuerpos 2B8 humanizados preparados por procedimiento de humanización 1 y por procedimiento de humanización 2 descritos en la presente memoria anteriormente en este Ejemplo.

TABLA 15

Anticuerpo

CDR1 CDR2 CDR3 Región Variable de Cadena Pesada de Longitud Completa

Pesada de 2B8 Murina

TYWMH (SEC ID Nº: 15) EINPTN GHTNYNEKF KS (SEC ID Nº: 16) NYVGSIFDY (SEC ID Nº: 17) SEC ID Nº: 12

Hu2B8 Hv1f.1

TYWMH (SEC ID Nº: 15) EINPTNGHTNYNEKFQG (SEC ID Nº: 202) NYVGSIFDY (SEC ID Nº: 17) SEC ID Nº: 159

Hu2B8 Hv5a.1

TYWMH (SEC ID Nº: 15) EINPTNGHTNYNPSFQG (SEC ID Nº: 203) NYVGSIFDY (SEC ID Nº: 17) SEC ID Nº: 165

Hu2B8 Hv5-51.1

TYWMH (SEC ID Nº: 15) EINPTNGHTNYNPSFQG (SEC ID Nº: 203) NYVGSIFDY (SEC ID Nº: 17) SEC ID Nº: 169

LR2B8HC

TYWMH (SEC ID Nº: 15) EINPTNGHTNYNEKFKG (SEC ID Nº: 204) NYVGSIFDY (SEC ID Nº: 17) SEC ID Nº: 183

LRMR2B8HC

TYWMH (SEC ID Nº: 15) EINPTNGHTNYNQKFQG (SEC ID Nº: 205) NYVGSIFDY (SEC ID Nº: 17) SEC ID Nº: 189

La Tabla 16 resume las secuencias de CDR de cadena ligera (Definición de Kabat) de los anticuerpos 2B8 humanizados preparados por procedimiento de humanización 1 y por procedimiento de humanización 2 descritos anteriormente en la 10 presente memoria en este Ejemplo.

TABLA 16

Anticuerpo

CDR1 CDR2 CDR3 Región Variable de Cadena Ligera de Longitud Completa

Ligera de 2B8 Murina

KASENWSYVS (SEC ID Nº: 18) GASNRNT (SEC ID Nº: 19) GQSYNYPYT (SEC ID Nº: 20) SEC ID Nº: 14

Hu2B8 Kv1-39.1

KASENWSYVS (SEC ID Nº: 18) GASNRNT (SEC ID Nº: 19) GQSYNYPYT (SEC ID Nº: 20) SEC ID Nº: 173

Hu2B8 Kv3-15.1

KASENWSYVS (SEC ID Nº: 18) GASNRNT (SEC ID Nº: 19) GQSYNYPYT (SEC ID Nº: 20) SEC ID Nº: 179

LR2B8LC

KASENWSYVS (SEC ID Nº: 18) GASNRNT (SEC ID Nº: 19) GQSYNYPYT (SEC ID Nº: 20) SEC ID Nº: 193

LRMR2B8LC

KASENWSYVS (SEC ID Nº: 18) GASNRES (SEC ID Nº: 206) GQSYNYPYT (SEC ID Nº: 20) SEC ID Nº: 199

C. Afinidad de Unión de Anticuerpos 2B8 Humanizados

La afinidad de unión a antígeno y cinética de interacción se evaluaron por tecnología de resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIAcore T100. Se inmovilizaron inmunoglobulinas anti-humano de ratón (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) en microplacas sensoras CM4 de dextrano carboximetilado (BIAcore, nº de catálogo BR-1005-34) por acoplamiento de amina (BIAcore, nº de catálogo BR-1000-50) usando un protocolo de acoplamiento convencional de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los análisis se realizaron a 25 ºC usando PBS (GIBCO, nº de catálogo 14040-133) que contenía tensioactivo P20 0,05 % (BIAcore, nº de catálogo BR1000-54), BSA 2 mg/ml (EMD, nº de catálogo 2930) y sal de Dextrano sódico-CM 10 mg/ml (Fluka, nº de catálogo 86524) como tampón de ejecución.

Los anticuerpos se capturaron en celda de flujo individual a un caudal de 10 µl/minuto. El tiempo de inyección fue variable para cada anticuerpo para producir aproximadamente 20 UR de anticuerpo capturado para cada ciclo. Se inyectó tampón o HGF (R&D Systems, nº de catálogo 294-HGN-025) diluido en tampón de ejecución secuencialmente sobre una superficie de referencia (sin anticuerpo capturado) y la superficie activa (anticuerpo a ensayar) durante 2 minutos a 60 µl/minuto. La fase de disociación se controló durante 15 ó 90 minutos, dependiendo de la concentración. La superficie se regeneró después con Glicina-HCl 10 mM, pH 2,0 (BIAcore, nº de catálogo BR-1003-55) inyectado durante 3 minutos a un caudal de 60 µl/minuto antes de que se iniciara otro ciclo. Las concentraciones de HGF ensayadas fueron de 1,88, 3,75 y 7,5 nM. La determinación de los parámetros cinéticos se consiguió usando la función cinética del software BIAevalutation con resta de la referencia. Los parámetros cinéticos para cada anticuerpo, ka (constante de tasa de asociación), kd (constante de tasa de disociación) y KD (constante de disociación en equilibrio) se resumen en la Figura 8.

Los resultados resumidos en la Figura 8 muestran que ciertas combinaciones de cadenas pesadas superhumanized (Hu2B8 Hv5a.1, Hu2B8 Hv5-51.1 o Hu2B8 Hv1-f.1) y cadenas ligeras (Hu2B8 Kv1-39.1 o Hu2B8 Kv3-15.1) conservan afinidades de unión (KD) por HGF similares a 2B8 quimérico (regiones variables de ratón con regiones constantes humanas) y 2B8 (Tabla 5).

D. Ensayo de Unión Mutuamente Exclusivo

La unión mutuamente exclusiva a HGF se evaluó por tecnología de resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIAcore T100. Se inmovilizaron inmunoglobulinas anti-humano de ratón (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) en microplacas sensoras CM5 de dextrano carboximetilado (BIAcore, nº de catálogo BR-1006-68) por acoplamiento de amina (BIAcore, nº de catálogo BR-1000-50) usando un protocolo de acoplamiento convencional de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los análisis se realizaron a 25 ºC usando PBS (GIBCO, nº de catálogo 14040-133) que contenía tensioactivo P20 0,05 % (BIAcore, nº BR-1000-54), BSA 2 mg/ml (EMD, nº de catálogo 2930) y sal de Dextrano Sódico-CM 10 mg/ml (Fluka, nº de catálogo 86524) como tampón de ejecución.

Los anticuerpos humanizados se capturaron en una celda de flujo individual a un caudal de 30 µl/minuto. El tiempo de inyección fue variable para cada anticuerpo para producir aproximadamente 150 UR de anticuerpo capturado para cada ciclo. Se inyecto HGF (R&D Systems, nº de catálogo 294-HGN-025) diluido en tampón de ejecución a una concentración final de 7,5 µg/ml durante 90 segundos a 30 µl/minuto sobre los anticuerpos humanizados capturados. La unión de HGF se controló antes de inyección posterior de anticuerpo 2B8 de ratón o anticuerpo anti-HGF de cabra policlonal (R&D Systems, AF294) durante 3 minutos a 30 µl/minuto. La superficie se regeneró después con Glicina-HCl 10 mM, pH 2,0 (BIAcore, nº de catálogo BR-1003-55) inyectado durante 3 minutos a un caudal de 60 µl/minuto antes de que se ensayara otro anticuerpo. Los resultados se resumen en la Figura 9.

Los resultados resumidos en la Figura 9 muestran que tanto los anticuerpos 2B8 humanizados como los anticuerpos 2B8 quiméricos evitan que 2B8 murino se una a HGF. Estos resultados demuestran que los anticuerpos humanizados aún se unen al mismo epítopo de HGF que el anticuerpo 2B8 original.

Ejemplo 13 -Producción de Variantes de 2B8 Humanizadas

a. Anticuerpos HUMAN ENGINEERED

Se clonaron cadenas ligeras (LR2B8LC y LRMR2B8LC, respectivamente) y cadenas pesadas (LR2B8HC y LRMR2B8HC, respectivamente) de Human Engineered de riesgo bajo y riesgo bajo más moderado con codones y expresión optimizados en fase en vectores de expresión de anticuerpos transitoria de XOMA, que contienen módulos de regiones constantes Kappa y gamma-1 humanas. Las cuatro variantes de 2B8 Human Engineered se produjeron por transfección transitoria en células HEK293E. Se produjeron los siguientes cuatro anticuerpos:

HE2B8-1 = LR2B8HC (+ región constante IgG1 (alotipo G1m(3) (alelo 1)) (SEC ID Nº: 187) más LR2B8LC (+ región constante Kappa (alotipo Km(3) (alelo 1))) (SEC ID Nº: 197)

HE2B8-2 = LR2B8HC (+ región constante IgG1 (alotipo G1m(3) (alelo 1)) (SEC ID Nº: 187) más LRMR2B8LC (+ región constante Kappa (alotipo Km(3) (alelo 1))) (SEC ID Nº: 201)

HE2B8-3 = LRMR2B8HC (+ región constante IgG1 (alotipo G1m(3) (alelo 1)) (SEC ID Nº: 191) más LR2B8LC (+ región constante Kappa (alotipo Km(3) (alelo 1))) (SEC ID Nº: 197)

HE2B8-4 = LRMR2B8HC (+ región constante IgG1 (alotipo G1m(3) (alelo 1)) (SEC ID Nº: 191) más LRMR2B8LC (+ región constante Kappa (alotipo Km(3) (alelo 1))) (SEC ID Nº: 201)

Las cadenas ligeras y pesadas se co-transfectaron en células HEK293E adaptadas a suspensión de XOMA cultivadas en medio IS293 (Irvine Scientific, Irvine, CA) usando matraces de agitación de 2 litros. Después de 24 horas en los matraces de agitación, se centrifugaron 200 ml de células transfectadas, se resuspendieron en 40 ml de medio fresco y se transfirieron a matraces Integra (Wilson Wolf Manufacturing Inc., MN) para producción. Después de incubación durante siete días, las suspensiones celulares se eliminaron de los matraces Integra, se centrifugaron y se retuvieron los sobrenadantes de cultivo. Los anticuerpos en los sobrenadantes de cultivo se purificaron en columnas spin de proteína A (Pro-Chem), se dializaron frente a PBS, se concentraron y se esterilizaron por filtración.

b. Anticuerpos SUPERHUMANIZED

Se clonó ADNc de dominio constante IgG1 humano (alotipo G1m(3)) + Hu2B8_Hv5-51.1 de longitud completa en pEE6.4 (Lonza Biologies, Berkshire, Reino Unido) usando sitios de restricción HindIII y EcoRI. Se clonaron ADNc de dominio constante kappa humano + región variable Hu2B8_Kv1-39.1 de longitud completa y ADNc de dominio constante kappa humano + región variable Hu2B8_Kv3-15.1 de longitud completa cada uno en pEE14.4 (Lonza Biologies) usando sitios de restricción HindIII y EcoRI. El fragmento de promotor hCMV-MIE + Hu2B8_Hv5-51.1 de longitud completa + ADNc de dominio constante IgG1 humano (alotipo G1m(3)) + poli A de SV40 (en pEE6.4) se eliminó por digestión con NotI/SalI y se insertó en uno de los vectores pEE14.4 de cadena kappa a través de sitios NotI/SalI, creando de este modo 2 vectores de expresión diferentes que expresan simultáneamente cada uno cadena pesada y ligera para preparar los siguientes anticuerpos:

sh2B8-9 (G1m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ región constante IgG1 (alotipo G1m(3)) (alelo 2)) (SEC ID Nº: 210) más hu2B8 Kv 1-39.1 (+ región constante Kappa (alotipo Km(3) (alelo 2))) (SEC ID Nº: 177)

sh2B8-12 (G1m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ región constante IgG1 (alotipo G1m(3)) (alelo 2)) (SEC ID Nº: 210) más hu2B8 Kv 3-15.1 (+ región constante Kappa (alotipo Km(3) (alelo 2))) (SEC ID Nº: 181)

La secuencias de ácido nucleico que codifican y las secuencias proteicas que definen la Región Constante Pesada de IgG1 humana alotipo G1m(3) (alelo 2) y cada una de las secuencias de cadena pesada de longitud completa se exponen a continuación. Las secuencias de cadena ligera fueron las mismas que se han descrito en el Ejemplo 12.

(1)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(3)) (alelo 2) (SEC ID Nº: 207)

(2)

Secuencia Proteica que Define la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana (alotipo G1m(3)) (alelo 1 ó 2) (SEC ID Nº: 208). El primer aminoácido se deriva de la traducción del último nucleótido de la región variable y los primeros dos nucleótidos de la secuencia de cadena pesada de IgG1.

(3)

Secuencia de �?cido Nucleico que Codifica la Cadena de Longitud Completa que Contiene la Región Variable de Cadena Pesada Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizada y la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana alotipo G1m(3) (alelo 2) (secuencia señal subrayada) (SEC ID Nº: 209)

(4)

Secuencia Proteica que Define la Cadena Pesada de Longitud Completa que Contiene Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizada y la Región Constante de Cadena Pesada de IgG1 Humana alotipo G1m(3) (alelo 2) (sin secuencia señal) (SEC ID Nº: 210)

Cada vector de expresión dual se transfectó en células 293T para expresión transitoria usando DMEM con suero bovino fetal 10 %. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lavaron y después se reemplazaron con medio sin suero, IS GRO (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contenía L-Glutamina 4 mM. Se recogió el sobrenadante diariamente y se remplazó con medio fresco durante 10 días. Los sobrenadantes de cultivo se

10 centrifugaron, se filtraron (0,45 µm) y se concentraron 10-100 veces. Los anticuerpos se purificaron en resina ProSep vA (Millipore), se dializaron frente a PBS, se concentraron y se esterilizaron por filtración.

Ejemplo 14 -Características de Unión de Variantes de 2B8 Humanizadas

Los anticuerpos humanizados producidos en el Ejemplo 13 se caracterizaron por su capacidad para unirse a hHGF y las proteínas HGF recombinantes producidas en el Ejemplo 3.

15 Los anticuerpos se analizaron por resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIAcore T100 para evaluar su capacidad para unirse a hHGF y las proteínas se fusión analizadas en el Ejemplo 3. Cada anticuerpo se inmovilizó en una microplaca sensora CM5 de dextrano carboximetilado (BIAcore, nº de catálogo BR-1006-68) por acoplamiento de amina (BIAcore, nº de catálogo BR-1000-50) usando un protocolo de acoplamiento convencional de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

20 Se realizaron análisis a 25 ºC usando PBS (GIBCO, nº de catálogo 14040-133) que contenía tensioactivo P20 0,05 % (BIAcore, nº de catálogo R-1000-54), BSA 2 mg/ml (EMD, nº de catálogo 2930) y sal de Dextrano Sódico-CM 10 mg/ml (Fluka, nº de catálogo 86524) como tampón de ejecución. Se inyectó sobrenadante que contenía diferentes proteínas de fusión HGF o sobrenadante de células transfectadas con vector vacío sobre cada anticuerpo a un caudal de 30 µl/minuto durante 3 minutos. La unión resultante se determinó como unidades de resonancia (UR) sobre la línea basal

25 30 segundos después del final de la inyección. La unión se comparó con HGF humano (R&D Systems, nº de catálogo 294-HGN-025) diluido en tampón de ejecución. La unión no específica se controló comparando la unión con una superficie de control. Los resultados se resumen en la Tabla 17.

TABLA 17

Anticuerpo

rhHGF (R&D Systems) rmHGF (R&D Systems) quimera MHM (495-585) quimera MHM (507-585) quimera MHM (499-556)

2B8

Sí No Sí Sí Sí

HE2B8-1

Sí No Sí Sí Sí

HE2B8-2

Sí No Sí Sí Sí

HE2B8-3

Sí No Sí Sí Sí

HE2B8-4

Sí No Sí Sí Sí

sh2B8-9 (G1 m(3))

Sí No Sí Sí Sí

sh2B8-12 (G1m(3))

Sí No Sí Sí Sí

Los resultados en la Tabla 17 demuestran que cada uno de los anticuerpos basados en 2B8 humanizado se unen a rhHGF y las tres quimeras de ratón-humano-ratón.

Ejemplo 15 -Afinidades de Unión de Variantes de 2B8 Humanizado

Las afinidades de unión y cinética de interacción de los anticuerpos enumerados en la Tabla 15 se midió por resonancia de plasmón superficial.

Se inmovilizaron inmunoglobulinas anti-humano de ratón (Jackson Labs, nº de catálogo 209-005) en microplacas sensoras CM4 de dextrano carboximetilado (BIAcore, nº de catálogo BR-1006-68) por acoplamiento de amina (BIAcore, nº de catálogo BR-1000-50) usando un protocolo de acoplamiento convencional de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los análisis se realizaron a 25 ºC usando PBS (GIBCO, nº de catálogo 14040-133) que contenía tensioactivo P20 0,05 % (BIAcore, nº de catálogo BR-1000-54) y BSA 2 mg/ml (EMD, nº de catálogo 2930).

os anticuerpos se capturaron en una celda de flujo individual a un caudal de 10 µl/minuto. El tiempo de inyección fue variable para cada anticuerpo para producir aproximadamente 20 UR de anticuerpo capturado para cada ciclo. Se inyectó tampón o HGF (R&D Systems, nº de catálogo 294-HGN-025) diluido en tampón de ejecución secuencialmente sobre una superficie de referencia (sin anticuerpo capturado) y la superficie activa (anticuerpo a ensayar) durante 2 minutos a 60 µl/minuto. La fase de disociación se controló durante 15 ó 90 minutos, dependiendo de la concentración. La superficie se regeneró después con Glicina-HCl 10 mM, pH 2,2 (BIAcore, nº de catálogo BR-1003-54) inyectado durante 3 minutos a un caudal de 60 µl/minuto antes de que se iniciara otro ciclo. Las concentraciones de HGF ensayadas fueron de 0,46 nM a 7,5 nM.

Los parámetros cinéticos se determinaron usando la función cinética del software BIAevalutation con resta de la referencia. Los parámetros cinéticos para cada anticuerpo, ka (constante de tasa de asociación), kd (constante de tasa de disociación) y KD (constante de disociación en equilibrio) se resumen en la Tabla 18.

TABLA 18

Anticuerpo

Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (pM) DT

2B8

1,4x106 1,0x10-5 7,3 -

HE2B8-1

2,2x106 1,4x10-5 7,1 5,2

HE2B8-2

1,8x106 9,6X10-6 5,2 2,7

HE2B8-3

2,0x106 4,1x10-6 2,0 1,1

HE2B8-4

1,7x106 1,1x10-5 6,5 1,3

sh2B8-9(G1m(17,1)

2,0x106 1,7x10-5 8,1 5,3

sh2B8-12 (G1m(17,1)

1,9x106 2,3x10-5 12 0,4

Estos datos muestran que los anticuerpos humanizados tienen tasas de asociación (ka) rápidas, tasas de disociación (kd) muy lentas y afinidades (KD) muy altas. En particular, los anticuerpos tienen afinidades que varían de 2,0 a 12 pM.

Ejemplo 166 -Comparación de Afinidades de Unión a 25 ºC y 37 ºC

Las afinidades de unión y cinética de interacción de anticuerpo HE2B8-4, sh2B8-9, sh2B8-12, y 2B8 murino se midieron por resonancia de plasmón superficial en condiciones diferentes.

Se inmovilizaron inmunoglobulinas de ratón anti-humano (Jackson Labs, nº de catálogo 209-005) o inmunoglobulinas de conejo anti-ratón (BIAcore, nº de catálogo BR-1005-14) en microplacas sensoras CM4 de dextrano carboximetilado (BIAcore, nº de catálogo BR-1006-68) por acoplamiento de amina (BIAcore, nº de catálogo BR-1000-50) usando un protocolo de acoplamiento convencional de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el caso de mediciones a 25 ºC para sh2b8-9 y sh2B8-12 se usó una microplaca sensora CM5 (BIAcore, nº de catálogo BR-1006-68). Los análisis se

realizaron a 25 ºC y 37 ºC usando PBS (GIBCO, nº de catálogo 14040-133) que contenía tensioactivo P20 0,05 % (BIAcore, nº de catálogo BR-1000-54) y BSA 2 mg/ml (EMD, nº de catálogo 2930) como tampón de ejecución.

Los anticuerpos se capturaron en una celda de flujo individual a un caudal de 10 µl/minuto. El tiempo de inyección fue variable para cada anticuerpo para producir aproximadamente 20 UR de anticuerpo capturado para cada ciclo. Se inyectó tampón o HGF (R&D Systems, nº de catálogo 294-HGN-025) diluido en tampón de ejecución secuencialmente sobre una superficie de referencia (sin anticuerpo capturado) y la superficie activa (el anticuerpo a ensayar) durante 2 minutos a 60 µl/ml. La fase de disociación se controló durante 15 ó 90 minutos, dependiendo de la concentración. La superficie de microplacas sensoras de inmunoglobulinas de ratón anti-humano se regeneró después con Glicina-HCl 10 mM, pH 2,2 (BIAcore, nº de catálogo BR-1003-54) inyectada durante 3 minutos a un caudal de 60 µl/minuto antes de que se iniciara otro ciclo. La superficie de microplacas sensoras de inmunoglobulinas de conejo anti-ratón se regeneró con Glicina-HCl 10 mM, pH 1,7 (BIAcore, nº de catálogo BR-1003-54) inyectada durante 3 minutos a un caudal de 60 µl/minuto antes de que se iniciara otro ciclo. Las concentraciones de HGF ensayadas fueron de 0,46 nM a 7,5 nM.

Los parámetros cinéticos se determinaron usando la función cinética del software BIAevaluation con resta de la referencia. Los parámetros cinéticos para cada anticuerpo, ka (constante de tasa de asociación), kd (constante de tasa de disociación) y KD (constante de disociación en equilibrio) se resumen a continuación en la Tabla 19.

TABLA 19

Anticuerpo

Temp (ºC) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM)

2B8

25 1,6x106 2,1x10-5 13,5

2B8

37 2,8x106 1,3x10-5 4,5

HE2B8-4

25 2,0x106 1,2x10-5 5,6

HE2B8-4

37 3,1x106 1,0x10-5 3,3

sh2B8-9 (G1m(17,1))

25 2,0x106 1,7x10-5 8,1

sh2B8-9 (G1m(3))

37 2,5x106 1,4x10-5 5,8

sh2B8-12 (G1m(17,1))

25 1,9x106 2,3x10-5 12,0

sh2B8-12 (G1m(3))

37 2,4x106 1,1x10-5 4,8

Como se esperaba, las constantes de tasa de asociación aumentaron con un aumento de la temperatura. Sorprendentemente, las constantes de disociación no cambiaron significativamente con un aumento correspondiente de la temperatura. En consecuencia, las constantes de disociación en equilibrio globales (KD) fueron aproximadamente de 1,4 a 3 veces más pequeñas (mayor afinidad) a temperatura fisiológica (37° C).

Ejemplo 17 -Actividad de Neutralización de Variantes de 2B8 Humanizado

Los anticuerpos descritos en el Ejemplo 14 se caracterizaron por su capacidad para (a) inhibir la unión de hHGF con c-Met y (b) inhibir la incorporación de BrdU estimulada por HGF en células 4MBr-5.

Se realizó ensayo de inhibición de la unión de HGF-Met (Ensayo de Neutralización) como se describe a continuación. Los anticuerpos se ensayaron por ELISA con respecto a su capacidad para inhibir la unión de hHGF con c-Met. Específicamente, se revistieron placas de ensayo DELFIA de 96 pocillos de Wallac (Wallac Inc., nº de catálogo AAAND0001) con 100 µl de HGF 6,25 µg/ml (R&D Systems, nº de catálogo 294-HGN-025) en tampón de recubrimiento de carbonato (Na2CO3 15 mM y NaHCO3 34 mM, pH 9,0) durante 16 horas a 4 ºC. Las placas se bloquearon después con 200 µl de leche en polvo desgrasada 5 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos se prepararon en una placa separada añadiendo concentraciones crecientes de los anticuerpos en investigación (0,033250 nM, dilución seriada 2 veces) a c-Met biotinilado 2 nM en leche en polvo desgrasada 5 % en PBS. C-Met (R&D Systems, nº de catálogo 358-MT/CF) se biotiniló de acuerdo con las instrucciones del fabricante a una relación de biotina con c-Met 10:1 (Pierce, nº de catálogo 21335). Se transfirieron 100 µl de muestra por pocillo a la placa de ensayo y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas resultantes se lavaron tres veces con PBS-Tween 20 0,1 % y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con Estreptavidina marcada con Eu (Wallac, nº de catálogo 1244-360) diluida 1:1000 en tampón de ensayo DELFIA (Wallac, nº de catálogo 4002-0010). Las placas resultantes se lavaron 3 veces con solución de lavado DELFIA (Wallac, nº de catálogo 4010-0010) y se incubaron con solución potenciadora DELFIA 100 µl/pocillo (Wallac nº 4001-0010) durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación. Las placas se leyeron en un instrumento Victor3V (Perkin Elmer) usando el procedimiento del Europio. Los valores de CI50 se calcularon usando Prism.

Los valores de CI50 obtenidos se muestran en la Tabla 20.

TABLA 20

Anticuerpo

CI50 (nM) DT

2B8

9,2 1,2

HE2B8-1

6,0 1,2

HE2B8-2

5,7 1,1

HE2B8-3

5,9 1,1

HE2B8-4

6,5 1,2

sh2B8-9 (G1m(3))

4,2 -

sh2B8-12 (G1m(3)

6,8 -

Estos resultados de la Tabla 20 demuestran que los anticuerpos humanizados ensayados neutralizan eficazmente la unión de HGF con c-Met.

Los anticuerpos de la Tabla 17 también se ensayaron en el ensayo de proliferación celular descrito en el Ejemplo 7(b). Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 21.

TABLA 21

Anticuerpo

CI50 (nM) DT

2B8

0,86 0,35

HE2B8-1

0,47 0,15

HE2B8-2

0,66 0,13

HE2B8-3

0,55 0,28

HE2B8-4

0,58 0,26

sh2B8-9 (G1m(3))

0,52 0.11

sh2B8-12 (G1m(3)

0,81 0,22

Los resultados de la Tabla 21 demuestran que todos los anticuerpos humanizados ensayados inhiben la proliferación 10 inducida por HGF de células 4MBr-5.

Ejemplo 18 -Actividad Anti Dispersión de Variantes de 2B8 Humanizado

Los anticuerpos de la Tabla 17 se ensayaron en el ensayo anti dispersión descrito en el Ejemplo 8. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 22.

TABLA 22

Inhibición de Dispersión de Células MDCK inducida por HGF

Anticuerpo

Ensayo 1 Ensayo 2

2B8

++ ++

HE2B8-1

++ ++

HE2B8-2

++ ++

HE2B8-3

++ ++

HE2B8-4

++ ++

sh2B8-9 (G1m(3))

++ ++

sh2B8-12 (G1m(3))

++ ++

15 -Sin Inhibición +++ Inhibición muy fuerte, casi completa ++ Inhibición fuerte

+ Inhibición detectable

20 Los resultados de la Tabla 22 demuestran que todos los anticuerpos humanizados ensayados inhibían la dispersión inducida por HGF en el mismo grado que el anticuerpo monoclonal murino 2B8.

Ejemplo 19 -Inhibición de Fosforilación de c-Met estimulada por HGF

Los anticuerpos de la Tabla 17 se ensayaron en el ensayo de fosforilación de c-Met descrito en el Ejemplo 9. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 23.

TABLA 23

Anticuerpo

Media de dos Ensayos Desviación Típica

2B8

0,91 0,02

he2B8-1

0,80 0,04

he2B8-2

0,88 0,15

he2B8-3

0,79 0,05

he2B8-4

0,75 0,14

sh2B8-9 (G1m(3))

0,93 0.03

sh2B8-12 (G1m(3)

0,81 0,07

Los resultados de la Tabla 23 demuestran que todos los anticuerpos humanizados ensayados eran inhibidores potentes de fosforilación de c-Met inducida por HGF en células PC-3.

5 Ejemplo 20 -Inhibición Tumoral en Modelo de Xenotrasplante U87MG

La capacidad de los anticuerpos monoclonales humanizados de la invención para inhibir el crecimiento tumoral se ensayó en un modelo de xenotrasplante U87MG. Se expandieron células U87MG (ATCC) en cultivo a 37 ºC en una atmósfera que contenía CO2 5 % y aire 95 %, usando un medio que comprende medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10 %, penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 µg/ml. Las células se

10 subcultivaron y se mantuvieron separando las células de la pared de la placa de cultivo usando tripsina-EDTA.

Se recogieron células casi confluyentes por tripsinización y después se inyectaron 5x106 células en Matrigel 50 % (BD Biosciences; nº de catálogo 356237) por vía subcutánea en el área dorsal superior entre los omóplatos de ratones ICR SCID hembra de 7 semanas de edad (Taconic Labs). Los diámetros largo (L) y corto (W) (mm) de los tumores se midieron con un calibrador. El volumen tumoral (vol.) se calculó como. volumen (mm3) = L x W2 / 2. Cuando los tumores 15 crecieron a aproximadamente 200 mm3, los ratones que portaban tumores se separaron aleatoriamente en 5 grupos de 10 ratones cada uno. Un grupo recibió PBS y un grupo recibió control de IgG humana. Cada uno de los otros 4 grupos recibieron uno de los anticuerpos humanizados (HE2B8-1, HE2B8-2, HE2B8-3 y HE2B8-4). Todos los anticuerpos se dosificaron a 0,25 mg/kg de peso corporal, dos veces por semana, por inyecciones intraperitoneales de 5 dosis. Los volúmenes tumorales y pesos corporales del ratón se registraron dos veces por semana. La inhibición del crecimiento

20 tumoral se analizó usando ensayo de t de Student.

Los anticuerpos humanizados ensayados estaban activos in vivo. Hubo 57 % de inhibición del crecimiento tumoral para HE2B8-1 con un p valor de 0,02, 61 % de inhibición del crecimiento tumoral para HE2B8-2 con un p valor de 0,02, 85 % de inhibición de crecimiento tumoral para HE2B8-3, con un p valor de 0,0004 y 74 % de inhibición de crecimiento tumoral para HE2B8-4 con un p valor de 0,001. No se observó pérdida de peso corporal significativa.

25 Se realizó un estudio posterior como se ha descrito anteriormente en ratones desnudos NCR hembra (Taconic Labs) que portaban tumores U87MG subcutáneos inoculados en el flanco. Cada grupo (10 ratones cada uno) recibió uno de los siguientes tratamientos a 0,5 mg/kg: control de vehículo PBS, control de huIgG, HE2B8-4 o sh2B8-9. Se proporcionó tratamiento intraperitoneal dos veces por semana durante un mínimo de 5 semanas. Cada grupo de tratamiento demostró regresión tumoral similar con inhibición del crecimiento tumoral de 113 % para sh2B8-9 y 115 % para HE2B8

30 4 y un retardo del crecimiento tumoral mínimo de 30 días. Ambos tratamientos se toleraron bien sin pérdida de peso corporal significativa.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Han, May Wright, Kirk S. Winston, William M.

5 Breault, Lyne Lin, Jie Etemad-Gilbertson, Bijan Knuehl, Christine Gyuria, Jeno

10 <120> Proteínas de Unión a Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF)

<130> AVO-001A

<150> 60/810.714

<151>

<150> 60/860.461 15 <151>

<160> 216

<170> Patentln versión 3.3

<210> 1

<211> 424 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 1A3

<400> 1

<210> 2

<211> 141

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 30 <220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 1A3

<400> 2

<210> 3 5 <211> 382

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 1A3 10 <400> 3

<210> 4

<211> 127

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<22 3> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 1A3

<400> 4

<210> 5

<211> 5

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR1 de cadena pesada sintética 1A3

<400> 5

15 <210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> CDR2 de cadena pesada sintética 1A3

<400> 6 <210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena pesada sintética 1A3

<400> 7

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR1 de cadena ligera (kappa) sintética 1A3

<4 00> 8

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena ligera (kappa) sintética 1A3

<400> 9

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena ligera (kappa) sintética 1A3

<400> 10

<210> 11

<211> 412

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 2B8

<400> 11

<210> 12

<211> 137

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<22 3> Región variable de cadena pesada sintética 2B8

<400> 12 <210> 13

<211> 382

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 2B8

<400> 13

<210> 14

<211> 127 «:212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 2B8

<400> 14

<210> 15

<211> 5

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR1 de cadena pesada sintética 2B8

<400> 15

15 <210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> CDR2 de cadena pesada sintética 2B8

<400> 16

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena pesada sintética 2B8

<400> 17

<210> 18

<211> 11 <=212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR1 de cadena ligera (kappa) sintética 2B8

<400> 18

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena ligera (kappa) sintética 2B8

<400> 19

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena ligera (kappa) sintética 2B8

<400> 20

<210> 21 5 <211> 412

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 2F8 10 <400> 21

<210> 22

<211> 137 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 2F8

<400> 22 <210> 23

<211> 394

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 2F8

<400> 23

10 <210> 24

<211> 131

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 2F8

<400> 24

5 <210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> CDR1 de cadena pesada sintética 2F8

<400> 25

<210> 26

<211> 17 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena pesada sintética 2FB

<400> 26

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena pesada sintética 2F8

<400> 27

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR1 de cadena ligera (kappa) sintética 2F8

<400> 28

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena ligera (kappa) sintética 2F8

<400> 29

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena ligera (kappa) sintética 2F8

<400> 30

<210> 31 5 <211> 418

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 3B6 10 <400> 31

<210> 32

<211> 139

<212>

PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 3B6

<400> 32

<210> 33

<211> 388

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 3B6 (2 posibles codones de inicio ATG)

<400> 33

<210> 34

<211> 129

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 3B6 (2 posibles metioninas de inicio)

<400> 34

<210> 35

<211> 5

<212>

PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR1 de cadena pesada sintética 3B6

<400> 35

15 <210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena pesada sintética 3B6

<400> 36

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena pesada sintética 3B6

<400> 37

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR1 de cadena ligera (kappa) sintética 3B6

<400> 38

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena ligera (kappa) sintética 3B6

<400> 39

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena ligera (kappa) sintética 3B6

<400> 40

<210> 41

<211> 397

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 3D11

<400> 41

15 <210> 42

<211> 132

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Región variable de cadena pesada sintética 3D11

<400> 42 <210> 43

<211> 385

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 3D11

<400> 43

<210> 44

<211> 128

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 3D11

<400> 44

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> CDR1 de cadena pesada sintética 3D11

<400> 45

<210> 46 15 <211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena pesada sintética 3D11

<400> 46

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena pesada sintética 3D11

<400> 47

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR1 de cadena ligera (kappa) sintética 3D11

<400> 48

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena ligera (kappa) sintética 3D11

<400> 49

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<22 3> CDR3 de cadena ligera (kappa) sintética 3D11

<400> 50

<210> 51

<211> 424

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 1D3

<400> 51

<210> 52

<211> 141

<212> PRT

<213>

Secuencia artificial 15 <220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 1D3

<400> 52

<210> 53

<211> 382

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 1D3

<400> 53

<210> 54

<211> 127 <=212> PRT

<213>

Secuencia artificial 15 <220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 1D3

<400> 54

5 <210> 55

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> CDR1 de cadena pesada sintética 1D3

<400> 55

<210> 56

<211> 17 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena pesada sintética 1D3

<400> 56 <210> 57

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena pesada sintética 1D3

<400> 57

<210> 58

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR1 de cadena ligera (kappa) sintética 1D3

<400> 58

<210> 59

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena ligera (kappa) sintética 1D3

<400> 59

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena ligera (kappa) sintética 1D3

<400> 60

<210> 61

<211> 424

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 1F3

<400> 61

<210> 62

<211> 141

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 1F3

<400> 62 <210> 63

<211> 382

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 1F3

<400> 63

10 <210> 64

<211> 127

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 1F3

<400> 64

<210> 65

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> CDR1 de cadena pesada sintética 1F3

<400> 65

<210> 66 15 <211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena pesada sintética 1F3

<400> 66

<210> 67

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena pesada sintética 1F3

<400> 67

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR1 de cadena ligera (kappa) sintética 1F3

<400> 68

<210> 69

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena ligera (kappa) sintética 1F3

<400> 69

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena ligera (kappa) sintética 1F3

<400> 70

<210> 71 5 <211> 424

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 3A12 10 <400> 71

<210> 72

<211> 141

<212>

PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena pesada sintética 3A12

<400> 72

<210> 73

<211> 382

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 3A12

<400> 73

<210> 74

<211> 127

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región variable de cadena ligera (kappa) sintética 3A12

<400> 74

<210> 75

<211> 5

<212>

PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR1 de cadena pesada sintética 3A12

<400> 75

15 <210> 76

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena pesada sintética 3A12

<400> 76

<210> 77

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena pesada sintética 3A12

<400> 77

<210> 78

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR1 de cadena ligera (kappa) sintética 3A12

<400> 78

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR2 de cadena ligera (kappa) sintética 3A12

<400> 79

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CDR3 de cadena ligera (kappa) sintética 3A12

<400> 80

<210> 81

<211> 974

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> Región constante de cadena pesada de IgG1 de ratón de referencia (J00453)

<400> 81

<210> 82

15 <211> 974 <212 ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región constante de cadena pesada de IgG1 de ratón determinada para 1A3, 1D3, 1F3 y 2B8 (derivada de 20 ratones de cepa AJ)

<400> 82

<210> 83

<211> 323 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región constante de cadena ligera kappa de ratón de referencia (V00807) y región constante de cadena ligera kappa de ratón determinada para 1D3, 1F3 y 2B8 (derivadas de ratones de cepa AJ)

10 <400> 83

<210> 84

<211> 323 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Región constante de cadena ligera kappa de ratón sintética determinada para 1A3 que contiene un nucleótido alterado como posición 207 en comparación con 1D3, 1F3 y 2B8.

<400> 84

5 <210> 85

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Cebador oligonucleotídico sintético BD SMART II A

<400> 85

<210> 86

<211> 27 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico sintético RACE CDS

<220> 20 <221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n es a, c, g, t o u

<400> 86

25 <210> 87

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Cebador oligonucleotídico sintético de mezcla de cebadores universal A

<400> 87 <210> 88

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico sintético de mezcla de cebadores universal A

<400> 88

<210> 89

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador específico de región constante IgG1 sintética

<400> 89

<210> 90

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador específico de región constante IgG1 sintética

<400> 90

<210> 91

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico sintético

<400> 91

<210> 92

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico sintético

<400> 92

<210> 93

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico sintético T7

<400> 93

<210> 94

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico sintético M13 directo

<400> 94

<210> 95

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotídico sintético M13 inverso

<400> 95

<210> 96

<211> 63

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético

<400> 96 <210> 97

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético

<400> 97

<210> 98

<211> 62

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético

<400> 98

<210> 99

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético

<400> 99

<210> 100

<211> 62

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo oligonucleotídico sintético

<400> 100 <210> 101

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso oligonucleotídico sintético

<400> 101

<210> 102

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador hHGF NheI 5 prima oligonucleotídico sintético

<400> 102

<210> 103

<211> 46

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador hHGF Notl marcador his 3 prima oligonucleotídico sintético

<400> 103

<210> 104

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador His IgFc 5 prima oligonucleotídico sintético

<400> 104

<210> 105

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador IgFc BamHI 3 prima oligonucleotídico sintético

<400> 105

<210> 106

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sentido hHGF-Fc (G555E) sintético

<400> 106

<210> 107

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido hHGF-Fc (G555E) sintético

<400> 107

<210> 108

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador sentido hHGF-Fc (C561R) sintético

<400> 108

<210> 109

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador antisentido hHGF-Fc (C561R) sintético

<400> 109 <210> 110

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de fragmento sintético 1 para NheI 5 prima de cadena mHGF alfa

<400> 110

<210> 111

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de fragmento sintético 1 para NheI 5 prima de cadena mHGF alfa

<400> 111

<210> 112

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de fragmento sintético 2 para cadena hHGF beta aa V495-585

<400> 112

<210> 113

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de fragmento sintético 2 para cadena hHGF beta aa V495-585

<400> 113

<210> 114

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de fragmento sintético 3 para NotI 3 prima de C terminal de cadena beta de mHGF

<400> 114

<210> 115

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de fragmento sintético 3 para NotI 3 prima de C terminal de cadena beta de mHGF

<400> 115

<210> 116

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de mutagénesis sintético 1

<400> 116

<210> 117

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de mutagénesis sintético 2

<400> 117

<210> 118

<211> 2922

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos de proteína hHGF-Fc sintética <400> 118

<210> 119

<211> 919

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> <:223> Secuencia de aminoácidos de proteína hHGF-Fc sintética (sin secuencia señal y prodominio)

<400> 119

<210> 120

<211> 2901

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína quimérica sintética mhm (V495-L.585)-Fe

<400> 120

<210> 121

<211> 911

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de la forma activa de mhm-Fc sintética (secuencia señal y prodominio eliminados)

<400> 121

<210> 122

<211> 1398

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada de 1A3 de longitud completa sintética (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 1A3)

<400> 122

<210> 123

<211> 446

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena pesada de 1A3 de longitud completa sintética (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 1A3) (sin secuencia señal)

<400>123

<210> 124

<211> 705

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena ligera de 1A3 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 1A3)

<400> 124

<210> 125

<211> 214

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena ligera de 1A3 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 1A3) (sin secuencia señal)

<400> 125

<210> 126

<211> 1386

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada de 2B8 de longitud completa sintética (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 2B8)

<400> 126

<210> 127 5 <211> 442

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena pesada de 2B8 de longitud completa sintética (región 10 constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 2B8) (sin secuencia señal)

<400>127

<210> 128

<211> 705

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena ligera de 2B8 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 2B8)

<400> 128

<210> 129

<211> 214

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena ligera de 2B8 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 2B8) (sin secuencia señal)

<400> 129

<210> 130

<211> 1386

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada de 2F8 de longitud completa sintética (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 2F8)

<400> 130

<210> 131

<211> 442

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena pesadas de 2F8 de longitud completa sintética (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 2F8) (sin secuencia señal)

<400>131

<210> 132

<211> 717

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena ligera de 2F8 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 2F8)

<400> 132

<210> 133

<211> 218

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena ligera de 2F8 de longitud completa (región constante y región variable kappa de 2F8) (sin secuencia señal)

<400>133

<210> 134

<211> 1392

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada de 3B6 de longitud completa sintética (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 3B6)

<210> 135

<211> 444

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena pesada de 3B6 de longitud completa (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 3B6) (sin secuencia señal)

<400> 135 10

<210> 136

<211> 711

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena ligera de 3B6 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 3B6)

<400> 136

<210> 137

<211> 214 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena ligera de 3B6 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 3B6) (sin secuencia señal)

10 <400> 137 <210> 138

<211> 1361

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada de 3D11 de longitud completa sintética (Región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 3D11)

<400> 138

<210> 139

<211> 437

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena pesada de 3D11 de longitud completa sintética (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 3D11) (sin secuencia señal)

<400> 139

<210> 140

<211> 708

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena ligera de 3D11 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 3D11)

<400> 140

<210> 141

<211> 213 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena ligera de 3D11 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 3D11) (sin secuencia señal)

10 <400> 141 <210> 142

<211> 1398

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada de 1D3 de longitud completa sintética (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 1D3)

<400> 142

<210> 143 5 <211> 446

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena pesada de 1D3 de longitud completa sintética (región 10 constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 1D3) (sin secuencia señal)

<400> 143

<210> 144

<211> 705

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena ligera de 1D3 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 1D3)

<400> 144

<210> 145

<211> 214

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena ligera de 1D3 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 1D3) (sin secuencia señal)

<400> 145

<210> 146

<211> 1398

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada de 1F3 de longitud completa sintética (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 1F3)

<400> 146

<210> 147

<211> 446

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena pesada de 1F3 de longitud completa sintética (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 1F3) (sin secuencia señal)

<400> 147

<210> 148 <211> 705

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena ligera de 1F3 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 1F3)

<400> 148

<210> 149 10 <211> 214

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena ligera de 1F3 de longitud completa sintética (región 15 constante y región variable kappa de 1F3) (sin secuencia señal)

<400> 149 <210> 150

<211> 1398

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena pesada de 3A12 de longitud completa sintética (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 3A12)

<400> 150

<210> 151

<211> 446 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena pesada de 3A12 de longitud completa sintética (región constante de IgG1 y región variable de cadena pesada de 3A12) (sin secuencia señal)

10 <400> 151

<210> 152

<211> 705

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de cadena ligera de 3A12 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 3A12)

<400> 152

<210> 153

<211> 214 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia de cadena ligera de 3A12 de longitud completa sintética (región constante y región variable kappa de 3A12) (sin secuencia señal)

10 <400> 153 <210> 154

<211> 1404

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de 2B8 quimérica de longitud completa sintética (región variable de ratón y región constante de IgG1 humana) (alotipo G1m (17,1))

<400> 154

<210> 155

<211> 448

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la cadena pesada de 2B8 quimérica de longitud completa sintética (IgG1 (alotipo G1m (17,1) (sin secuencia señal)

<400> 155

<210> 156

<211> 705

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de 2B8 quimérica de longitud completa sintética (región variable de ratón y región constante humana) (kappa de 2B8 quimérica (Km(3)))

<400> 156

<210> 157

<211> 214 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la cadena ligera de 2B8 quimérica de longitud completa sintética (kappa de 2B8 quimérica) (sin secuencia señal)

10 <400> 157 <210> 158

<211> 412

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv1-f.1 humanizada sintética

<400> 158

5 <210> 159

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>.

10 <223> Secuencia proteica que define la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv1-f.1 humanizada sintética (sin secuencia señal)

<400> 159

15 <210> 160

<211> 992

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena pesada de IgG1 humana sintética (alotipo G1m(17,1))

<400> 160

10 <210> 161

<211> 330

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

15 <223> Secuencia proteica que define la región constante de cadena pesada de IgG1 humana sintética (Alotipo G1m(17,1))

<400> 161

<210> 162

<211> 1404

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (alotipo G1m(17,1)) y región variable Hu2B8 Hvlf.1 humanizada de cadena pesada de longitud completa sintética

<400> 162

<210> 163

<211> 448 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (alotipo G1m(17,1)) y región variable Hu2B8 Hvlf.1 humanizada de cadena pesada de longitud completa sintética (sin secuencia señal)

10 <400> 163

<210> 164

<211> 412

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada Hu2B8 HvSa.1 humanizada sintética

<400> 164

<210> 165

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5a.1 humanizada sintética (sin secuencia señal)

<400> 165

<210> 166

<211> 1404

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (alotipo G1m(17,1)) y región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5a.1 de longitud completa sintética

<400> 166

<210> 167

<211> 448

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (alotipo G1m(17,1)) y región variable de cadena pesada Hv5a.l humanizada de longitud completa sintética (sin secuencia señal)

<400> 167

<210> 168

<211> 412

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51.1 humanizada sintética

<400> 168

<210> 169

<211> 11B 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la secuencia variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51.1 humanizada sintética (sin secuencia señal)

10 <400> 169

<210> 170

<211> 1404

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220> <223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (alotipo G1m(17,1) y región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51.1 humanizada de longitud completa sintética

<400> 170

5 <210> 171

<211> 448

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

10 <223> Secuencia proteica que define la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (alotipo G1m(17,1)) y región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51.1 humanizada de longitud completa sintética (sin secuencia señal)

<400> 171

<210> 172

<211> 388

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena kappa Hu2B8 Kv1-39.1 humanizada sintética

<400> 172

<210> 173

<211> 107 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región variable de cadena kappa Hu2B8 Kv1-39.1 humanizada sintética (sin secuencia señal)

10 <400> 173

<210> 174

<211> 323

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena kappa humana sintética (alotipo Km(3)) (alelo 2)

<400> 174

<210> 175

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región constante de cadena kappa humana sintética (alotipo Km(3)) (alelo 2)

<400> 175

<210> 176

<211> 711

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena kappa humana (alotipo km(3)) (alelo 2) y región variable de cadena ligera Hu2B8 Kv-39.1 humanizada de longitud completa sintética

<400> 176

<210> 177

<211> 214

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región constante de cadena kappa humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) y región variable de cadena ligera Hu2B8 Kv1-39.1 humanizada de longitud completa sintética

<400> 177

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera Hu2B8 Kv3-15.1 humanizada sintética

<400> 178

<210> 179 5 <211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región variable de cadena ligera Hu2B8 Kv3-15.1 humanizada sintética (sin 10 secuencia señal)

<400> 179

<210> 180

<211> 705 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> �?cido nucleico que codifica la región constante de cadena kappa humana (alotipo km(3)) (alelo 2) y región variable de cadena ligera Hu2B8 Kv3-15.1 humanizada de longitud completa sintética

<400> 180

<210> 181

<211> 214

<212> PRT

<213> Secuencia artificial. 10 <220>

<223> Secuencia proteica que define la región constante de cadena kappa humana (alotipo km(3)) (alelo 2) y región variable de cadena ligera Hu2B8 Kv3-15.1 humanizada sintética (sin secuencia señal)

<400> 181

<210> 182

<211> 412

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada LR2B8HC humanizada sintética

<400> 182

<210> 183 10 <211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región variable de cadena pesada LR2B8HC humanizada sintética (sin 15 secuencia señal)

<400> 183

<210> 184

<211> 992 5 <:212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena pesada de IgG1 humana sintética (alotipo G1m(3)) (alelo 1)

10 <400> 184 <210> 185

<211> 330 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región constante de cadena pesada de IgG1 humana sintética (alotipo G1m(3)) (alelo 1 o 2)

10 <400> 185

<210> 186

<211> 1404

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (alotipo G1m(3)) (alelo 1) y región variable de cadena pesada LR2B8HC humanizada de cadena pesada de longitud completa sintética

<400> 186

<:210> 187 <:211> 448

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> Secuencia proteica que define la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (alotipo G1m(3)) (alelo 1) y región variable de cadena pesada LR2B8HC humanizada de cadena pesada de longitud completa sintética (sin secuencia señal)

<400> 187

<210> 188

<211> 412

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada LRMR2B8HC humanizada sintética

<400> 188

5 <210> 189

<211> 118

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

10 <223> Secuencia proteica que define la región variable de cadena pesada LRMR2B8HC humanizada sintética (sin secuencia señal)

<400> 189

15 <210> 190

<211> 1404

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (alotipo G1m(3)) (alelo 1) y región variable de cadena pesada LRMR2B8HC humanizada de cadena pesada de longitud completa sintética

<400> 190

10 <210> 191

<211> 448

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (alotipo G1m(3)) (alelo 1) y región variable de cadena pesada LRMR2B8HC humanizada de cadena pesada de longitud completa sintética (sin secuencia señal)

<400> 191

<210> 192 <211> 360

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera LR2B8LC humanizada sintética

<400> 192

<210> 193

<211> 107 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región variable de cadena ligera LR2B8LC humanizada sintética (sin secuencia señal)

15 <400> 193

<210> 194

<211> 323

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena kappa humana sintética (alotipo Km(3)) (alelo 1)

<400> 194

<210> 195 10 <211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que codifica la región constante de cadena kappa humana sintética (alotipo Km(3)) (alelo 1) 15 <400> 195

<211> 705

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<22 3> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena kappa humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) y región variable de cadena ligera LR2B8LC humanizada de longitud completa sintética

<400> 196

<210> 197 10 <211> 214

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que codifica la región constante de cadena kappa humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) y región 15 variable de cadena ligera LR2B8LC humanizada de longitud completa sintética

<400> 197 <210> 198

<211> 382

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera LRMR2B8LC humanizada sintética

<400> 198 <210> 199

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región variable de cadena ligera LRMR2B8LC humanizada sintética (sin secuencia señal)

<400> 199

<210> 200

<211> 705

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15 <220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena kappa humana (alotipo Km(3)) (alelo 1) y región variable de cadena ligera LRMR2B8LC humanizada de longitud completa sintética

<210> 201

<211> 214

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<22 3> Secuencia proteica que define la región constante de cadena kappa humana (alotipo Km(3) (alelo 1) y región variable de cadena ligera LRMR2B8LC humanizada de longitud completa sintética

<400> 201

<210> 202

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de CDR2 de cadena pesada (Definición de Kabat) de anticuerpo Hu2B8 Hv1f.1 humanizado sintético

<400> 202 <210> 203

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de CDR2 de cadena pesada (Definición de Kabat) de anticuerpo Hu2B8 Hv5a.1 humanizado sintético

<400> 203

10 <210> 204

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Secuencia de CDR2 de cadena pesada (Definición de Kabat) de anticuerpo LR2B8HC humanizado sintético

<400> 204

<210> 205

<211>

17 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de CDR2 de cadena pesada (Definición de Kabat) de anticuerpo LRMR2B8HC humanizado sintético

<400> 205

<210> 206

«211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de CDR2 de cadena ligera (Definición de Kabat) de anticuerpo LRMR2B8LC humanizado sintético

<400> 206

<210> 207

<211>

992 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante de cadena pesada de IgGl1 humana sintética 15 (alotipo G1m(3)) (alelo 2)

<400> 207

<210> 208

<211> 330

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la región constante de cadena pesada de IgG1 humana sintética (alotipo G1m(3)) (alelo 1 o 2)

<400> 208

<210> 209

<211> 1404

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena de longitud completa sintética que contiene región variable de cadena pesada Hu2B8 Hv5-51.1 humanizada y la región constante de cadena pesada de IgG1 humana alotipo G1m(3) (alelo 2)

10 <400> 209 <210> 210

<211> 448

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia proteica que define la cadena pesada de longitud completa sintética que contiene Hu2B8 Hv5-51.1 humanizada y la región constante de cadena pesada de IgG1 humana alotipo G1m(3) (alelo 2) (sin secuencia señal)

<400> 210

<210> 211

<211> 2209

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HGF mhm (V495-L585) sintética

<400> 211

<210> 212

<211> 680

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HGF mhm 495-585 sintética activa

<400> 212

<210> 213

<211> 2194

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HGF mhm (I499-RS56) sintética

<400> 213

<210> 214

<211> 675

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HGF mhm 499-556 sintética activa

<400> 214

<210> 215

<211> 2194

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HGF mhm (W507-L585) sintética

<400> 215

<210> 216

<211> 675

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> HGF mhm 507-585 sintética activa

<400> 216

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una proteína de unión aislada que se une al factor de crecimiento de hepatocitos humano (HGF) que comprende

   (i)

   una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 18, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 19 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 20; y

   (ii)

   una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 15, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 16 ó SEC ID Nº: 203 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 17.

2. 2. La proteína de unión de la reivindicación 1, en la que

   la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina comprende una CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 18, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 19 y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 20; y

   la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina comprende una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 15, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 203 y una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 17.

3. 3.

   La proteína de unión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que las secuencias CDR se interponen entre secuencias flanqueantes humanas o humanizadas.

4. 4.

   La proteína de unión de la reivindicación 1 que se une al factor de crecimiento de hepatocitos humano (HGF) que comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en:

   (a)

   una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21-127 de SEC ID Nº: 14, y una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20-137 de SEC ID Nº: 12;

   (b)

   una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 173 y una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 165;

   (c)

   una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 173 y una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 169;

   (d)

   una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 179 y una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 165; y

   (e)

   una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 179 y una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 169.

5. 5.

   La proteína de unión de la reivindicación 4, en la que la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 21-127 de SEC ID Nº: 14, y la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20-137 de SEC ID Nº: 12.

6. 6.

   La proteína de unión de la reivindicación 4, en la que la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 173 y la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 169.

7. 7.

   La proteína de unión de la reivindicación 1 que se une al factor de crecimiento de hepatocitos humano (HGF) que comprende una cadena ligera de inmunoglobulina y una cadena pesada de inmunoglobulina seleccionadas del grupo que consiste en:

   (a)

   una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 177 y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 167;

   (b)

   una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 177 y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 171;

   (c)

   una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 177 y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 210;

   (d)

   una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 181 y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 167;

   (e)

   una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 181 y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 171; y

   (f)

   una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 181 y una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 210.

8. 8.

   La proteína de unión de la reivindicación 7, siendo la proteína de unión un anticuerpo monoclonal o fragmento de proteína de unión a antígeno del mismo.

9. 9.

   La proteína de unión de la reivindicación 7, en la que la cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 177 y la cadena pesada de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 171.

10. 10.

    La proteína de unión de la reivindicación 7, en la que la cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 177 y la cadena pesada de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 210.

11. 11.

    La proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en terapia.

12. 12.

    La proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en la inhibición o reducción de proliferación de una célula tumoral.

13. 13.

    La proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en la inhibición o reducción del crecimiento tumoral en un mamífero.

14. 14.

    Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de las reivindicaciones 1-6 y una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de las reivindicaciones 1-6.

15. 15.

    Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 14.

16. 16.

    Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 15.

17. 17.

    Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de las reivindicaciones 1-6 y un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de las reivindicaciones 1-6.

18. 18.

    Un método para producir la proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el método:

    (i)

    dejar crecer la célula hospedadora de la reivindicación 16 o reivindicación 17 en condiciones tales que la célula hospedadora exprese la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina; y

    (ii)

    recoger la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina.

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    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

    Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

    Documentos de patentes citados en la descripción

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