ES2673869T3

ES2673869T3 - Anticuerpos frente a ligandos del receptor B1 de bradicinina

Info

Publication number: ES2673869T3
Application number: ES13715049.6T
Authority: ES
Inventors: Dorothea Kominos; Jie Zhang; Alla PRITSKER; Matthew Davison; Nicolas Baurin; Govindan Subramanian; Xin Chen; Han Li
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 2012-03-28
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2018-06-26
Anticipated expiration: 2033-03-15
Also published as: DOP2014000199A; CL2017003039A1; CO7111293A2; KR20190121861A; GT201400192A; US9376494B2; US9879079B2; JP2024038036A; AR090352A1; CN104334578B; US20200115441A1; EP2831113B1; KR20200121370A; JP2019050822A; AU2013240242A1; PH12014501970A1; SI2831113T1; HRP20180928T1; JP2015513903A; JP6779012B2

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: i) un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR3), una secuencia de aminoácidos de la región 2 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR2) y una secuencia de aminoácidos de la región 1 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR1), seleccionadas del grupo que consiste en: a) SEQ ID NO: 7 [X1Y X2 X3D X4HAM X5Y], en donde X1 es Y, F o H, X2 es R, D, A, V, L, I, M, F, Y o W, X3 es Y, F, W o H, X4 es D, E o Y, y X5 es D o E; SEQ ID NO: 8 [YFX1PX2NGNTGYNQKFRG], en donde X1 es D, R, A, V, L, I, M, F, Y o W, y X2 es Y, D, E, N o Q; y SEQ ID NO: 9 [GYSFTDYX1IY], en donde X1 es N, W o Y; respectivamente, b) SEQ ID NO: 63 [X1EYDGX2YX3X4LDX5], en donde X1 es W o F, X2 es N o ningún aminoácido; X3 es Y o S, X4 es D o P, y X5 es F o Y; SEQ ID NO: 64 [WX1DPENGDX2X3YAPKFQG], en donde X1 es I o V, X2 es T o S, y X3 es G o D; SEQ ID NO: 65 [GFNIKDYYX1H], en donde X1 es L o M; respectivamente, c) SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; y SEQ ID NO: 15; respectivamente, d) SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; y SEQ ID NO: 34; respectivamente, e) SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; y SEQ ID NO: 42; respectivamente, f) SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 48; y SEQ ID NO: 49; respectivamente, y g) SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57; respectivamente; y e) SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; y SEQ ID NO: 42; respectivamente, f) SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 48; y SEQ ID NO: 49; respectivamente, y g) SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57; respectivamente; y X2 es S o G, X3 es N o D, X4 es K o R, X5 es H o Y; respectivamente, j) SEQ ID NO: 69 [X1QGTHFPYT], en donde X1 es L o M; SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 70 [KSSQSLLYSNGX1TYLN], en donde X1 es K o E; respectivamente, k) SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; y SEQ ID NO: 18; respectivamente, l) SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37; respectivamente, m) SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 17; y SEQ ID NO: 44; respectivamente, n) SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 51; y SEQ ID NO: 52; respectivamente, y o) SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60; respectivamente.

Description

5

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpos frente a ligandos del receptor B1 de bradicinina.

Antecedentes

El receptor B1 de bradicinina se ha implicado en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria y del dolor crónico. Al modular la inflamación tisular y la fibrosis renal, el receptor B1 se ha asociado también con la patogénesis de la lesión renal aguda, así como con las enfermedades renales crónicas que son las principales causas de insuficiencia renal terminal.

En humanos, los principales agonistas del receptor B1 de bradicinina son las cininas. Las cininas son péptidos bioactivos producidos a partir de la escisión proteolítica de proteínas cininógenas. Los principales agonistas de cinina del receptor B1 de bradicinina son el decapéptido Calidina y el nonapéptido des-Arg10-Calidina (formado por la escisión proteolítica de la arginina C-terminal de Calidina). Por lo tanto, los agentes que pueden inhibir la unión de Calidina y des-Arg10-Calidina con el receptor B1 de bradicinina tienen el potencial de tratar o prevenir las patologías mediadas por el receptor B1 de bradicinina.

Según esto, existe en la técnica una necesidad de agentes novedosos que inhiban la unión de Calidina y des-Arg10- Calidina con el receptor B1 de bradicinina para uso en el tratamiento de patologías humanas mediadas por el receptor B1 de bradicinina.

Bedi y col. (Biochimica et Biophysica Acta, volumen 842, n.° 1, 1985, páginas 90-99) divulga anticuerpos monoclonales que se unen a bradicinina.

Hilgenfeldt y col. (Analytical Biochemistry, vol. 228, n.° 1, 1995, páginas 35-41) describe un antisuero específico para calidina.

Carretero y col. (Biochemical Pharmacology, vol. 25, n.° 20, 1976, páginas 2265-2270) describe antisueros anti- calidina.

Geppetti y col. (Regulatory Peptides, vol 33, n.° 3, 1991, páginas 321-329) describe el efecto analgésico de calidina sobre la mucosa nasal humana.

Sumario

La invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Argg-Bradicinina, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

i) un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR3), una secuencia de aminoácidos de la región 2 determinante de la complementariedad de variable pesada (HCDR2) y una secuencia de aminoácido de la región 1 determinante de la complementariedad variable de la cadena pesada (HCDR1) seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 7 [X1YX2X3DX4HAMX5Y], en donde

X1 es Y, F o H,

X2 es R, D, A, V, L, I, M, F, Y o W,

X3 es Y, F, W o H,

X4 es D, E o Y, y X5 es D o E;

SEQ ID NO: 8 [YFX1PX2NGNTGYNQKFRG], en donde X1 es D, R, A, V, L, I, M, F, Y o W, y X2 es Y, D, E, N o Q; y

SEQ ID NO: 9 [GYSFTDYX1IY], en donde X1 es N, W o Y; respectivamente,

b) SEQ ID NO: 63 [X1EYDGX2YX3X4LDX5], en donde

5

10

15

20

25

30

35

><: es W o LL

X2: es N o ningún aminoácido

X co: es Y o S,

X4: es D o P, y

X5: es F o Y;

SEQ ID NO: 64 [WX1DPENGDX2X3YAPKFQG], en donde Xi es I, o V,

X2 es T, o S, y X3 es G, o D; y

SEQ ID NO: 65 [GFNIKDYYX1H], en donde X1 es L, o M; respectivamente,

c) SEQ ID NO: 13;

SEQ ID NO: 14; y SEQ ID NO: 15; respectivamente,

d) SEQ ID NO: 32;

SEQ ID NO: 33; y SEQ ID NO: 34; respectivamente,

e) SEQ ID NO: 40;

SEQ ID NO: 41; y SEQ ID NO: 42; respectivamente,

f) SEQ ID NO: 47;

SEQ ID NO: 48;

SEQ ID NO: 49; respectivamente,

y

g) SEQ ID NO: 55;

SEQ ID NO: 56;

SEQ ID NO: 57; respectivamente; y

ii) un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR3), una secuencia de aminoácidos de la región 2 determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR2) y una secuencia de aminoácidos de la región 1 determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR1) seleccionadas del grupo que consiste en:

h) SEQ ID NO: 10 [QQ X1 X2S X3P X4T], en donde

X1 es Y, F o H,

5

10

15

20

25

30

35

X2 es Y, F, H o W,

X3 es Y, F, T o H, y,

X4 es W, Y, F, H o L:

SEQ ID NO: 11 [WASTRX1], en donde Xi es E, D, Q o N; y SEQ ID NO: 12 [KSSQSLL X1SSNQKN X2LA], en donde X1 es W, H, Y o F, y X2 es H o Y; respectivamente,

i) SEQ ID NO: 66 [QX1X2X3SX4PX5T], en donde

X1 es Q o N,

X2 es Y, F, D o H,

X3 es Y, F, H o W,

X4 es Y, F, T o H, y X5 es W, Y, F, H o L;

SEQ ID NO: 67 [X2ASTRX2], en donde X1 es W o G, y X2 es E, D, Q o N; y

SEQ ID NO: 68 [KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA], en donde X1 es W, H, Y o F,

X2 es S o G,

X3 es N o D,

X4 es K o R,

X5 es H o Y; respectivamente,

j) SEQ ID NO: 69 [X1QGTHFPYT], en donde X1 es L o M;

SEQ ID NO: 36; y

SEQ ID NO: 70 [KSSQSLLYSNGX1TYLN], en donde X1 es K o E; respectivamente,

k) SEQ ID NO: 16;

SEQ ID NO: 17; y SEQ ID NO: 18; respectivamente,

l) SEQ ID NO: 35;

SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37; respectivamente,

m) SEQ ID NO: 43;

5

10

15

20

25

30

35

40

SEQ ID NO: 17; y SEQ ID NO: 44; respectivamente,

n) SEQ ID NO: 50;

SEQ ID NO: 51; y SEQ ID NO: 52; respectivamente,

y

o) SEQ ID NO: 58;

SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60; respectivamente.

En una realización de la invención, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 comprende

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amínicas de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, y una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas del grupo que consiste en H1, H5, H9, H11, H12, H16, H38, H40, H41, H43, H44, H66, H75, H79, H81, H82A, H83, H87 y H108, según Kabat; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amínicas de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente, y una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas del grupo que consiste en L5, L9, L15, L18, L19, L21, L22, L43, L63, L78, L79, L83, L85, L100 y L104, según Kabat.

En una realización de la invención, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 comprende las secuencias de aminoácidos de dominio variable de la cadena pesada y cadena ligera expuestas en las SEQ ID NO: 24 y 30, respectivamente.

En una realización de la invención, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo está en una composición farmacéutica con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.

En una realización de la invención, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 comprende:

una secuencia de aminoácidos del dominio de la región variable de la cadena pesada, y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 19 y 26, respectivamente,

b) SEQ ID NO: 20 y 27, respectivamente,

c) SEQ ID NO: 21 y 28, respectivamente,

d) SEQ ID NO: 22 y 28, respectivamente,

e) SEQ ID NO: 23 y 29, respectivamente,

f) SEQ ID NO: 24 y 30, respectivamente,

g) SEQ ID NO: 25 y 31, respectivamente,

h) SEQ ID NO: 38 y 39, respectivamente,

i) SEQ ID NO: 45 y 46, respectivamente,

j) SEQ ID NO: 53 y 54, respectivamente,

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k) SEQ ID NO: 61 y 62, respectivamente.

En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 comprende:

un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos, y una secuencia de aminoácidos de un dominio variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 19 y 26, respectivamente,

b) SEQ ID NO: 20 y 27, respectivamente,

c) SEQ ID NO: 21 y 28, respectivamente,

d) SEQ ID NO: 22 y 28, respectivamente,

e) SEQ ID NO: 23 y 29, respectivamente,

f) SEQ ID NO: 24 y 30, respectivamente,

g) SEQ ID NO: 25 y 31, respectivamente,

h) SEQ ID NO: 38 y 39, respectivamente,

i) SEQ ID NO: 45 y 46, respectivamente,

j) SEQ ID NO: 53 y 54, respectivamente,

k) SEQ ID NO: 61 y 62, respectivamente.

En una realización de la invención, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende:

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de consenso de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 7, 8 y 9, respectivamente; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, respectivamente.

En una realización, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende:

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente.

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 32, 33 y 34, respectivamente; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 35, 36 y 37, respectivamente.

En una realización de la invención, el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Argg-Bradicinina de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno comprende:

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 40, 41 y 42, respectivamente; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 43, 17 y 44, respectivamente.

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 47, 48 y 49, respectivamente; y

5

10

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25

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40

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 50, 51 y 52, respectivamente.

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 55, 56 y 57, respectivamente; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 58, 59 y 60, respectivamente.

La presente aplicación divulga además ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-Calidina y des-Arg10-Calidina, vectores de expresión recombinantes y células anfitrionas para producir tales anticuerpos, o fragmentos de los mismos. También se describen procedimientos para usar anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, para detectar Calidina y des-Arg10-Calidina o para modular la actividad de Calidina y des-Arg10-Calidina, in vitro o in vivo. La presente aplicación también describe procedimientos para fabricar anticuerpos que se unen específicamente a péptidos des-Argg-Bradicinina y des-Arg10-Calidina.

En consecuencia, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que:

a) se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Argg-Bradicinina;

b) se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina con una KD de menos de 1x10-10 M;

c) se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina con un Kdis de menos de 1 x104 s-1; o

d) se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina e inhibe la unión al receptor B1 de bradicinina.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al resto N-terminal de Lisina de Calidina o des-Arg10-Calidina.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la unión de Calidina o des-Arg10- Calidina a un receptor 1 de bradicinina.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente al péptido similar a Calidina de ratón (KLP).

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de HCDR3 seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 7 [X1Y X2 X3D X4HAM X5Y], en donde X1 es Y, F o H,

X2 es R, D, A, V, L, I, M, F, Y o W,

X3 es Y, F, W o H,

X4 es D, E o Y, y X5 es D o E;

b) SEQ ID NO: 63 [X1EYDGX2YX3X4LDX5], en donde X1 es W o F,

X2 es N o ningún aminoácido;

X3 es Y o S,

X4 es D o P, y X5 es F o Y;

c) SEQ ID NO: 13;

d) SEQ ID NO: 32;

e) SEQ ID NO: 40;

5

10

15

20

25

30

35

f) SEQ ID NO: 47; y

g) SEQ ID NO: 55.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de HCDR2 seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 8 [YFX1PX2NGNTGYNQKFRG], en donde X1 es D, R, A, V, L, I, M, F, Y o W, y

X2 es Y, D, E, N o Q;

b) SEQ ID NO: 64 [WX1DPENGDX2X3YAPKFQG], en donde X1 es I, o V,

X2 es T, o S, y X3 es G, o D;

c) SEQ ID NO: 14

d) SEQ ID NO: 33;

e) SEQ ID NO: 41;

f) SEQ ID NO: 48; y

g) SEQ ID NO: 56.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de HCDR1 seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 9 [GYSFTDYX1IY], en donde X1 es N, W o Y;

b) SEQ ID NO: 65 [GFNIKDYYX1H], en donde X1 es L, o M;

c) SEQ ID NO: 15;

d) SEQ ID NO: 34;

e) SEQ ID NO: 42;

f) SEQ ID NO: 49; y

g) SEQ ID NO: 57.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de LCDR3 seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 10 [QQX1X2SX3PX4T], en donde X1 es Y, F o H,

X2 es Y, F, H o W,

X3 es Y, F, T o H, y,

X4 es W, Y, F, H o L:

b) SEQ ID NO: 66 [QX1X2X3SX4PX5T], en donde X1 es Q o N,

X2 es Y, F, D o H,

X3 es Y, F, H o W,

X4 es Y, F, T o H, y X5 es W, Y, F, H o L;

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c) SEQ ID NO: 69 [XiQGTHFPYT], en donde Xi es L o M;

d) SEQ ID NO: 16;

e) SEQ ID NO: 35;

f) SEQ ID NO: 43;

g) SEQ ID NO: 50; y

h) SEQ ID NO: 58.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de LCDR2 seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 11 [WASTRX1], en donde X1 es E, D, Q o N;

b) SEQ ID NO: 67 [X2ASTRX2], en donde X1 es W o G, y

X2 es E, D, Q o N;

c) SEQ ID NO: 17;

d) SEQ ID NO: 36;

e) SEQ ID NO: 51; y

f) SEQ ID NO: 59.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de LCDR1 seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 12 [KSSQSLL X1SSNQKN X2LA], en donde X1 es W, H, Y o F, y

X2 es H o Y;

b) SEQ ID NO: 68 [KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA], en donde X1 es W, H, Y o F,

X2 es S o G,

X3 es N o D,

X4 es K o R,

X5 es H o Y.

c) SEQ ID NO: 70 [KSSQSLLYSNGX1TYLN], en donde X1 es K o E;

b) SEQ ID NO: 18;

c) SEQ ID NO: 37;

d) SEQ ID NO: 44;

e) SEQ ID NO: 52; y

f) SEQ ID NO: 60.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de LCDR3 seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 10 [QQ X1 X2S X3P X4T], en donde

X1 es Y, F o H,

X2 es Y, F, H o W,

5

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X3 es Y, F, T o H, y,

X4 es W, Y, F, H o L:

b) SEQ ID NO: 66 [QX1X2X3SX4PX5T], en donde Xi es Q o N,

X2 es Y, F, D o H,

X3 es Y, F, H o W,

X4 es Y, F, T o H, y X5 es W, Y, F, H o L;

c) SEQ ID NO: 69 [X1QGTHFPYT], en donde X1 es L o M;

d) SEQ ID NO: 16;

e) SEQ ID NO: 35;

f) SEQ ID NO: 43;

g) SEQ ID NO: 50; y

h) SEQ ID NO: 58.

a) SEQ ID NO: 11 [WASTRX1], en donde X1 es E, D, Q o N;

b) SEQ ID NO: 67 [X2ASTRX2], en donde X1 es W o G, y

X2 es E, D, Q o N;

c) SEQ ID NO: 17;

d) SEQ ID NO: 36;

e) SEQ ID NO: 51; y

f) SEQ ID NO: 59.

a) SEQ ID NO: 12 [KSSQSLL X1SSNQKN X2LA], en donde X1 es W, H, Y o F, y

X2 es H o Y;

b) SEQ ID NO: 68 [KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA], en donde X1 es W, H, Y o F,

X2 es S o G,

X3 es N o D,

X4 es K o R,

X5 es H o Y.

c) SEQ ID NO: 70 [KSSQSLLYSNGX1TYLN], en donde X1 es K o E; b) SEQ ID NO: 18;

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50

c) SEQ ID NO: 37;

d) SEQ ID NO: 44;

e) SEQ ID NO: 52; y

f) SEQ ID NO: 60.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, y una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas del grupo que consiste en H1, H5, H9, H11, H12, H16, H38, H40, H41, H43, H44, H66, H75, H79, H81, H82A, H83, H87 y H108 según Kabat.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente, y una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas del grupo que consiste en L5, L9, L15, L18, L19, L21, L22, L43, L63, L78, L79, L83, L85, L100 y L104, según Kabat.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de

aminoácidos de la región variable de la cadena pesada con al menos un 90% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 19, 20, 21,22, 24, 25, 38, 45, 53 y 61.

aminoácidos de un dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 29, 30, 31,39, 46, 54 y 62.

aminoácidos de la región variable de la cadena ligera con al menos un 90% de identidad con una secuencia de

aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 29, 30, 31,39, 46, 54 y 62.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 19, 20, 21,22, 24, 25, 38, 45, 53 y 61.

aminoácidos de un dominio variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 26, 27,

28, 29, 29, 30, 31,39, 46, 54 y 62.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 29, 30, 31,39, 46, 54, y 62.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera expuestas en las SEQ ID NO: 19 y 26, SEQ ID NO: 20 y 27, SEQ ID NO: 21 y 28; SEQ ID NO: 22 y 28; SEQ ID NO: 23 y 29; SEQ ID NO: 24 y 30; SEQ ID NO: 25 y 31; SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 45 y 46, SEQ ID NO: 53 y 54, o SEQ ID NO: 61 y 62, respectivamente.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Calidina y des-Arg10-Calidina, en donde el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, compite por la unión a Calidina y des-Arg10-Calidina con un anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y cadena ligera expuestas en las SEQ ID NO: 19 y 26, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 45 y 46, SEQ ID NO: 53 y 54, o SEQ ID NO: 61 y 62, respectivamente.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a Calidina o des-Arg10-Calidina con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y no se une a Bradicinina o des-Argg-Bradicinina.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítope conformacional de calidina (KD) o desArg10-Calidina (DAKD) que adopta una conformación de trenzado de Pro4 que comprende un giro cerrado de tipo II en Prolina 4 de KD o DAKD). En una realización, la conformación de trenzado de Pro 4 de KD o DAKD comprende además repeticiones de aminoácidos de forma sigmoidea que alinean las cadenas laterales hidrófobas de los aminoácidos en un modo de apilamiento espacial. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende que (a) se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina; b) se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina con una KD de menos de 1 x10-10 M; c) se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina con un Kdis de menos de 1 x104 s-1; o d) se une específicamente a Calidina o des-Arg10- Calidina e inhibe la unión al receptor B1 de bradicinina.

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En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se conjuga con un agente de diagnóstico o terapéutico.

En otro aspecto, la divulgación proporciona ácido nucleico aislado que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la divulgación, o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la divulgación.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una célula anfitriona que comprende el vector de expresión recombinante de la divulgación.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo que se une específicamente a Calidina y des-Arg10-Calidina, que comprende cultivar la célula anfitriona de la divulgación en condiciones tales que un anticuerpo que se une específicamente a Calidina y desArg10-Calidina es producido por la célula anfitriona.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la divulgación, o fragmento de unión a antígeno del mismo y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno asociado a Calidina o a des-Arg10-Calidina, el procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesite la composición farmacéutica de la divulgación.

En una realización, la enfermedad o trastorno es dolor crónico.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para generar un anticuerpo que se une específicamente a des-Arg9-Bradicinina y a un péptido similar a des-Arg10-Calidina que comprende: inmunizar un animal con un inmunógeno que comprende un péptido, en donde el péptido consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO. 11, y en donde la arginina amino terminal del péptido está acoplada indirectamente a una mitad portadora a través de una mitad enlazadora, de modo que un anticuerpo que se une específicamente a des-Arg9-Bradicinina, des-Arg10-Calidina y a un péptido similar a des-Arg10-Calidina es producido por el sistema inmune del animal.

En otra realización, el procedimiento comprende además aislar del animal, el anticuerpo, un aislamiento nucleico que codifica el anticuerpo, o una célula inmune que expresa el anticuerpo.

En una realización, la mitad portadora es una proteína. En otra realización, la proteína es hemocianina de lapa californiana (KLH). En otra realización, en donde la mitad enlazadora comprende [Gly-Gly-Gly]n, en donde n es al menos 1.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa los resultados de los ensayos ELISA que demuestran la unión del anticuerpo EE1 a péptidos de cinina.

La Figura 2 representa los resultados de las medidas de calorimetría diferencial de barrido del anticuerpo F151.

La Figura 3 representa alineamientos de secuencias de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo F151 de murino y humanizado. Los restos idénticos se enumeran en el alineamiento, mientras que los restos homólogos se identifican mediante el signo "+" y los restos no homólogos se dejan en blanco.

La Figura 4 representa un mapa de densidad electrónica del sitio de unión al antígeno del complejo anticuerpo F151 /Calidina.

La Figura 5 representa un mapa de densidad electrónica del sitio de unión al antígeno del complejo anticuerpo F151/des-Arg 10-Calidina.

La Figura 6 representa una representación de cintas y palitos de la subunidad Fv de F151 unida a calidina.

La Figura 7 representa un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera de los anticuerpos de murino anti-calidina ejemplares de la divulgación. Los restos de aminoácidos que interactúan con calidina están marcados con asteriscos.

La Figura 8 representa un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de los anticuerpos de murino anti-calidina ejemplares de la divulgación. Los restos de aminoácidos que interactúan con la calidina están marcados con asteriscos.

La Figura 9 representa los resultados de los experimentos in vivo que determinan el efecto del anticuerpo EE1 sobre el dolor inflamatorio agudo inducido por formalina.

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La Figura 10 representa los resultados de experimentos in vivo que determinan el efecto del anticuerpo EE1 sobre la hipersensibilidad mecánica inducida por CFA.

La Figura 11 representa los resultados de experimentos in vivo que determinan el efecto del anticuerpo EE1 sobre la hipersensibilidad térmica inducida por CFA.

La Figura 12 representa los resultados de experimentos in vivo que determinan el efecto del anticuerpo EE1 sobre la hipersensibilidad mecánica inducida por CCI.

La Figura 13 representa los resultados de experimentos in vivo que determinan el efecto del anticuerpo EE1 sobre la hipersensibilidad térmica inducida por CCI.

La Figura 14 representa mapas esquemáticos de construcciones de expresión de VL y VH para generar la variante de HC3a/LC3a de F151 humanizado con los sitios de restricción de ADN endonucleasa presentados como secuencias deducidas en negrita y subrayadas. El panel A representa la cadena ligera y el panel B representa la cadena pesada.

La Figura 15 representa un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada (A) y de la cadena ligera (B) del F151 con las secuencias de aminoácidos de línea germinal humana más cercana.

La Figura 16 representa un alineamiento de la cadena pesada (A) y de la cadena ligera (B) del F151 con un locus de la cadena pesada (1-08 y 1-18) y un locus de la cadena ligera (V IV-B3) de la subfamilia VH1. Las regiones CDR y las regiones Vernier están indicadas en negrita y las mutaciones de humanización están subrayadas.

La Figura 17 representa la estructura secundaria (A) y terciaria (B) de la conformación de la estructura principal del polipéptido de la cadena principal de calidina (KD) unida al anticuerpo F151 que comprende un giro cerrado de tipo II en Prolina 4 (C).

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a Calidina y des-Arg10-Calidina e impiden la unión al receptor B1 de bradicinina. Tales anticuerpos son particularmente útiles para tratar la enfermedad o los trastornos asociados con Calidina y des-Arg10-Calidina (p. ej., el dolor). La divulgación también proporciona composiciones farmacéuticas, así como ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-Calidina y des- Arg10-Calidina, vectores de expresión recombinantes y células anfitrionas para producir tales anticuerpos, o fragmentos de los mismos. Los procedimientos para usar anticuerpos de la divulgación para detectar Calidina y des- Arg 10-Calidina o para modular la actividad de Calidina y des-Arg10-Calidina, ya sea in vitro o in vivo, también están abarcados por la divulgación.

I. Definiciones

Para que la presente divulgación se pueda entender más fácilmente, primero se definen ciertos términos.

Como se usa en el presente documento, el término "Calidina" se refiere a un péptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos KRPPGFSPFR (SEQ ID NO. 1).

Como se usa en el presente documento, el término "des-Arg10-Calidina" se refiere a un péptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos KRPPGFSPF (SEQ ID NO. 2).

Como se usa en el presente documento, las expresiones "Calidina de ratón" o "péptido similar a Calidina" se refieren a un péptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos RRPPGFSPFR (SEQ ID NO. 3).

Como se usa en el presente documento, las expresiones "des-Arg10-Calidina de ratón" o "péptido similar a la des- Arg10-Calidina" se refieren a un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos RRPPGFSPF (SEQ ID NO. 4).

Como se usa en el presente documento, el término "Bradicinina" se refiere a un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos RPPGFSPFR (SEQ ID N.° 5).

Como se usa en el presente documento, el término "des-Argg-bradicinina" se refiere a un péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos RPPGFSPF (SEQ ID N.° 6).

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (p. ej., IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada Vh o VH) y una región constante de la cadena pesada (Ch o CH). La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviado VL) y una región constante de la cadena ligera (CL o CL). La región constante de la cadena ligera comprende un dominio (Cl1). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse

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adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones entramado (FR). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Como se usa en el presente documento, la expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo incluye cualquier polipéptido o glicoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o de ingeniería genéticamente que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden derivarse, p. ej., de moléculas de anticuerpo completas usando cualquier técnica estándar adecuada tal como técnicas de digestión proteolítica o de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios de anticuerpo variables y opcionalmente constantes. Los ejemplos no limitantes de porciones de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab’)2; (iii) fragmentos Fd; (iv) Fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena simple (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (p. ej., una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada). Otras moléculas de ingeniería, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos, también están abarcadas dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno".

Como se usa en el presente documento, el término "CDR" o la expresión "región determinante de la complementariedad" significa los sitios de combinación de antígeno no contiguos encontrados dentro de la región variable de ambos polipéptidos de la cadena pesada y ligera. Estas regiones particulares han sido descritas por Kabat y col., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) y Kabat y col., Sequences of protein of immunological interest, (1991), y por Chothia y col., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) y por MacCallum y col., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996) donde las definiciones incluyen superposición o subconjuntos de restos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. Para su comparación se exponen restos de aminoácidos que abarcan las CDR como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente. En una realización de la divulgación, el término "CDR" es una CDR tal como la define Kabat, basada en comparaciones de secuencias.

Como se usa en el presente documento, la expresión "restos de aminoácidos de entramado (FR)" se refiere a aquellos aminoácidos en la región de entramado de una cadena de Ig. Las expresiones "región de entramado" o "región FR" como se usan en el presente documento, incluyen los restos de aminoácidos que forman parte de la región variable, pero que no forman parte de las CDR (p. ej., usando la definición de Kabat de las CDR). Por lo tanto, un entramado de región variable tiene entre aproximadamente 100-120 aminoácidos de longitud, pero incluye solo aquellos aminoácidos fuera de las CDR.

Como se usa en el presente documento, la expresión "se une específicamente a" se refiere a la capacidad de un anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse a un antígeno con una Kd de al menos aproximadamente 1 x 10~6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M o más. La expresión abarca también la capacidad de un anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse a un antígeno con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por un antígeno no específico. Debe entenderse, sin embargo, que un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, es capaz de unirse específicamente a dos o más antígenos que están relacionados en secuencia (p. ej., Calidina o des- Arg10-Calidina y Calidina o des-Arg10-Calidina de ratón).

Como se usa en el presente documento, el término "antígeno" se refiere al sitio de unión o epítope reconocido por un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Como se usa en el presente documento, el término "vector" pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula anfitriona en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (p. ej., vectores no episomales de mamíferos) se pueden integrar en el genoma de una célula anfitriona tras la introducción en la célula anfitriona, y de ese modo se replican junto con el genoma anfitrión. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están vinculados operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. Los términos "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente. Sin embargo, la divulgación pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (p. ej., retrovirus defectuosos en replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.

Como se usa en el presente documento, la expresión "célula anfitriona" se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que este término pretende referirse no solo a la célula objeto particular sino a la progenie de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero puede estar incluida todavía dentro del alcance de la expresión "célula anfitriona" como se

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usa en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "que tratan" y "tratamiento" se refieren a medidas terapéuticas o preventivas descritas en el presente documento. Los procedimientos de "tratamiento" emplean administrar a un sujeto un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente divulgación, por ejemplo, un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno asociado a Calidina y a des-Arg10-Calidina (p. ej., una enfermedad inflamatoria) o predispuesto a tener una enfermedad o trastorno de este tipo, con el fin de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad, o mejorar uno o más síntomas, de la enfermedad o trastorno o recurrencia de la enfermedad o trastorno, o para prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento.

Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad o trastorno asociado a Calidina o des-Arg10- Calidina" incluye estados de enfermedad y/o síntomas asociados con un estado de enfermedad, donde se hallan niveles o actividad alterados de Calidina o des-Arg10-Calidina. Ejemplos de enfermedades o trastornos asociados con Calidina o des-Arg10-Calidina incluyen, pero no se limitan a, dolor y fibrosis.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a esa cantidad de un anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a Calidina o des-Arg10-Calidina, que es suficiente para efectuar el tratamiento, pronóstico o diagnóstico de una enfermedad o trastorno asociado a Calidina o des-Arg10- Calidina, como se describe en el presente documento, cuando se administra a un sujeto. Una cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo del sujeto y del estado de la enfermedad que es tratada, del peso y de la edad del sujeto, de la gravedad del estado de la enfermedad, de la forma de administración y aspectos similares, que pueden ser fácilmente determinados por una persona con experiencia ordinaria. Las dosificaciones para la administración pueden variar desde, por ejemplo, aproximadamente 1 ng hasta aproximadamente 10.000 mg, aproximadamente 1 ug hasta aproximadamente 5.000 mg, aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 1.000 mg, aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 100 mg, de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la divulgación. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad eficaz es también aquella en la que cualquiera de los efectos tóxicos o perjudiciales (es decir, los efectos secundarios) de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo son minimizados o compensados por los efectos beneficiosos.

Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano.

Como se usa en el presente documento, el término "epítope" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio específico de unión a antígeno en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como paratopo. Un único antígeno puede tener más de un epítope. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopes pueden ser conformacionales o lineales. Un epítope conformacional es producido por aminoácidos espacialmente yuxtapuestos de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítope lineal es el producido por restos adyacentes de aminoácidos en una cadena polipeptídica.

Se observa aquí que, tal como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

II. Anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina

En un aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina. Ejemplos de secuencias de aminoácidos VH, VL y CDR de los anticuerpos de la divulgación se exponen en la Tabla 1.

Tabla 1. Secuencias de aminoácidos VH, VL y CDR de anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina ejemplares.

Anticuerpo clon: Secuencia SEQ ID NO.

HCDR3 de consenso de F151: X1YX2X3DX4HAMX5Y donde: X1 es Y, F o H; X2 es R, D, A, V, L, I, M, F, Y o W; X3 es Y, F, W o H; X4 es D, E o Y; y X5 es D o E. 7

Anticuerpo clon: Secuencia SEQ ID NO.

HCDR2 de consenso de F151: YFX1PX2NGNTGYNQKFRG donde: X1 es D, R, A, V, L, I, M, F, Y o W; y X2 es Y, D, E, N, o Q. 8

HCDR1 de consenso de F151: GYSFTDYX1IY Donde X1 es N, W o Y. 9

LCDR3 de consenso de F151: QQX1X2SX3PX4T donde: X1 es Y, F o H; X2 es Y, F, H o W; X3 es Y, F, T o H; y X4 es W, Y, F, H o L. 10

LCDR2 de consenso de F151: WASTRX1 donde X1 es E, D, Q o N. 11

LCDR1 de consenso de F151: KSSQSLLX1SSNQKNX2LA donde: X1 es W, H, Y o F; y X2 es H o Y. 12

HCDR3 de F151: YYRYDDHAMDY 13

HCDR2 de F151: YFDPYNGNTGYNQKFRG 14

HCDR1 de F151: GYSFTDYNIY 15

LCDR3 de F151: QQYYSYPWT 16

LCDR2 de F151: WASTRES 17

LCDR1 de F151: KSSQSLLYSSNQKNYLA 18

VH de F151: EIQLQQ5GPELVEÍPGT2VKV5CKAGGYSFTDYNIYWVKQÜHGK SLEWIGYFDPYHGNTGYIIQKFRGKATLTVDKGSSTAFMHLSSL TSDD5AYYYCA1JYYRYDDHAMDYWGQGTSVTVS5 19

HC1 humanizada de F151: EIQLVQGGPEVKEÍPGAGVKVSCKAGGYSFTDYNIYWVKQGPGK SLEWIGYFDPYMGT-ITGYNQKFRGKATLTVDKSSSTAFMHLSSL TSED5AYYYCA1JYYRYDDHAMDYWGQGTSVTVS5 20

HC2a humanizada de F151: (nQLVQSGAEVKEíPGAGVEíVGCKAGGYSFTDYNI YWVKQ3PGK GLEWIGYFDPY1JGNTGY1IQKFRGKATLTVDKG3STA YMHLS3L TSEESAVYYCALJYYRYDDHAMDYWGQGTSVTV5S 21

Anticuerpo clon: Secuencia SEQ ID NO.

HC2b humanizada de F151: QIQLVQSGAEVKKPGA3VKVSCKAGGYSFTDYIIIYWVKQ3PGK GLEWIGYFDPYIJGNTGYNEKFRGKATLTVDKS3STA YMHL33L TSEESAVYYCA1JYYRYDDHAMDYWGQGTSVTV5S 22

HC2c humanizada de F151: 0IQLVQ3GAEVKEÍPGA3VKV3CKA3GY3FTDYNIYWVKQ3PGK GLEWIGYFDPYHGNTGYIJQKFRGKATLTVDKGSSTA YMHL33K T3EEGAVYYCA1.JYYRYDDHAMDYWGQGT3YTV33 23

HC3a humanizada de F151: QIQLVQ3GAEVK[-ÍPGA3VKV3CKA3GY3FTDYNI YWVRQAPGQ GLEWIGYFDPYUGíITGYNQKFRGRATLTVDKSTSTAYMELRSL R3DDTAVYYCA1.JYYRYDDHAMDYWGQGTLYTV33 24

HC3b humanizada de F151: QVQLVQSGAEVKEÍPGAGVEÍVGCKAEGYSFTDYNIYWVRQAPGQ GLEWMGYFDPY1JGNTGY1JQKFRGRYTMTTDTGT5TAYMELRSL RSDDTAYYYCA1IYYRYDDHAMDYWGQGTLVTVSS 25

VL de F151: DIVMSQSPGGLAV5VGEKVTMGCK5GQ5LLYSSNQKNYLAWYQ QEÍPGQSPKPLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKA EDLAIYYCQQYY5YPWTFGGGTKLEIK 26

LC1 humanizada de F151: DIVHSQSPGGLAASVGDRVTtISCKSSQSLLYSCNQKNYLAWYQ QE<PGK3PKPLTYl'ÍA5TRESGWDRFTGSGSGTDFTLTIS3VQA EDLAI YYCQQYYSYPt'ITFGGGTKLEIK 27

LC2a humanizada de F151: DIVMTQ3PSSL3ASVGDRVTTSCK33Q3LLY3 SNQKNYLAWYQ QKPGKoPKPLIYWAGTRESGVPDRF GG3G3GTDFTLTI3GVQA EDLArYYCQQYYSYPwTFGGGTKLEIK 28

LC2b humanizada de F151: DIVHTQSPGGLSASVGDRVTISCKSSQSLLYSCNQKNYLAWYQ QEÍPGKGPKPLTYlíAGTRESGWDRFSGSGSGTDFTLTISGVQA EDKATYYCQQYYSYPATTFGGGTKLEIK 29

LC3a humanizada de F151: DIVHTQ3PD3LAV3LGERATinCK33Q3LLYS3NQKNYLAWYQ QEÍPGQPPKPLTYl'JAGTRESGVPDRFGGGGSGTDFTLTIGGLQA E D VA V Y Y C Q Q Y Y 3 Y P W T F G Q G T K V EIK 30

LC3b humanizada de F151: DIVHTQ3PD3LAVSLGERATIMCK33Q3LLYS3NQKNYLAWYQ QE<PGQPPKLLTY?JA5TRE3GVPDRFGGSGSGTDFTLTI3GLQA E D V A V Y Y C Q Q Y Y 3 Y P V'J T F G Q G T K V EIK 31

HCDR3 del B21: WEYDGYYDLDY 32

HCDR2 del B21: WIDPENGDTGYARKFQG 33

HCDR1 del B21: GFNIKDYYLH 34

LCDR3 del B21: LQGTHFPYT 35

LCDR2 del B21: LVSKLDS 36

LCDR1 del B21: KSSQSLLYSNGKTYLN 37

VH del B21: EVQLQQ3GAE1VRSGA3VKLGCTA3GFNIKDYYLHWVKQRPEQ GLEWIGWIDPE1JGDTGYARKFQGKATMTADTS3MTVYLHL33L TSEDTAVYYFEAWEYDGYYDLDYWGQGTGVTVS5 38

VL del B21: DVyMTQTPLTLGVTIGQPASISCKGGQSLLYGriGEÍTYLNWLLQ RPGQSPKRLIYLVSKLDGGVPDRFTGSGSGTDFTLEÍI IRVEAE DLGVYYCLQGTHFPYTFGGGTEÍLEIK 39

Anticuerpo clon: Secuencia SEQ ID NO.

HCDR3 de C63: EDYGGDY 40

HCDR2 de C63: EIRSKSNNYATHYAESVKG 41

HCDR1 del C63: GFTFSNYWMN 42

LCDR3 del C63: QQYYSYPYT 43

LCDR2 del C63: WASTRES 17

LCDR1 del C63: KSSQSLLYSSDQRNYLA 44

VH del C63: EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVAjGFTFSHYKMNWVRQÜPEK GLEiWAEIRSKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMH NLRAEDTGIYYCIGED YGGDYÍÍGQGTSVTVS3 45

VL del C63: DIVHSQSPGSLAVSVGEKVTtISCKSSQSLLYSCDQRNYLAWYQ QRSGQSPKLLIYTÍÍASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKA EDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEIK 46

HCDR3 del I22: FEYDGNYSPLDF 47

HCDR2 del I22: WVDPENGDSDYAPKFQ 48

HCDR1 del I22: GFNIKDYYMH 49

LCDR3 del I22: QNDHSYPLT 50

LCDR2 del I22: GASTRES 51

LCDR1 del I22: KSSQSLLNSGNQKNYLA 52

VH del I22: EVQLQQSGAEIVR5GASVKLSCTASGFHIKDYYMHWVKQRPEQ GLEWIGl-JVDPEHGDSDYAPKFQGKATMTADTGSNTVYLQFGSL TSEDTAVYYCMAEEYDGMYGPLDFWGQGTSVTV5G 53

VL del I22: DIVHTQ5PGGL GVSAGEKVTMGCKSGQSLLIJSGNQKNYLAWYQ QKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQA EDLAVYYCQMDHGYPLTFGAGTKLELK 54

HCDR3 del I54: FEYDGNYSPLDF 55

HCDR2 del I54: WVDPENGDSDYAPKFQG 56

HCDR1 del I54: GFNIKDYYMH 57

LCDR3 del I54: MQGTHFPYT 58

LCDR2 del I54: LVSKLDS 59

LCDR1 del I54: KSSQSLLYSNGETYLN 60

VH del I54: EVQLQQSGAEIVR5GASVKLSCTAGGFNIKDYYMHWVKQRPEQ GLEWIGWVDPE1JGDSDYAPKFQGKATMTADTS3HTVYLQF33L TSEDTAVYYCMAFEYDGl-TYGPLDFWGQGTGVTVSG 61

Anticuerpo clon: Secuencia SEQ ID NO.

VL del I54: DVVMTQTPLTLGVPIGQPASISCKGGQSLLYSNGETYLNWLLQ RPGQ5FKRLIYLV5KLDGGVPDRFTG5RSGTDFTLKI5RVE5E DLGVYYCMQGTHFPYTFGGGTKLEIK 62

HCDR3 de consenso de B21/I22/I54: X1EYDGX2YX3X4LDX5 donde: X1 es W o F; X2 es N o ningún aminoácido; X3 es Y o S; X4 es D o P; y X5 es F o Y. 63

HCDR2 de consenso de B21/I22/I54: WX1DPENGDX2X3YAPKFQG donde: X1 es I, o V; X2 es T, o S; y X3 es G, o D. 64

HCDR1 de consenso de B21/I22/I54: GFNIKDYYX1H donde X1 es L, o M. 65

LCDR3 de consenso de F151/C63/I22: QX1X2X3SX4PX5T donde: X1 es Q o N; X2 es Y, F, D o H; X3 es Y, F, H o W; X4 es Y, F, T o H; y X5 es W, Y, F, H o L. 66

LCDR2 de consenso de F151/C63/I22: X2ASTRX2 donde: X1 es W o G; y X2 es E, D, Q o N 67

Anticuerpo clon: Secuencia SEQ ID NO.

LCDR1 de consenso de F151/C63/I22: KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA donde: X1 es W, H, Y o F; X2 es S o G; X3 es N o D; X4 es K o R; X5 es H o Y. 68

LCDR3 de consenso de B21/I54: X1QGTHFPYT donde: X1 es L o M; 69

LCDR2 de B21/I54, ambos idénticos: LVSKLDS 36

LCDR1 de consenso de B21/I54: KSSQSLLYSNGX1TYLN donde: X1 es K o E; 70

En ciertas realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una o más secuencias de aminoácidos de las regiones CDR seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 5 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 y 70.

En otras realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 seleccionadas del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 7, 8 y 9;

b) SEQ ID NO: 13, 14 y 15;

10 c) SEQ ID NO: 32, 33 y 34;

d) SEQ ID NO: 40, 41 y 42;

e) SEQ ID NO: 47, 48 y 49;

f) SEQ ID NO: 55, 56 y 57; y

g) SEQ ID NO: 63, 64 y 65, respectivamente.

15 En otras realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 seleccionadas del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 10, 11 y 12;

b) SEQ ID NO: 16, 17 y 18;

c) SEQ ID NO: 35, 36 y 37;

20 d) SEQ ID NO: 43, 17 y 44;

e) SEQ ID NO: 50, 51 y 52;

f) SEQ ID NO: 58, 59 y 60;

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g) SEQ ID NO: 66, 67 y 68; y

h) SEQ ID NO: 69, 25 y 70, respectivamente.

En otras realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende las secuencias de aminoácidos de la región HCDR3, HCDR2, HCDR1, LCDR3, LCDR2 y LCDR1 seleccionadas del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12;

b) SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 y 18;

c) SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36 y 37;

d) SEQ ID NO: 40, 41,42, 43, 17 y 44;

e) SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51 y 52; y

f) SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59 y 60, respectivamente

En otra realización, la divulgación proporciona anticuerpos humanizados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una o más regiones CDR (o variantes de las mismas modificadas de forma conservadora) a partir de los anticuerpos de murino descritos en el presente documento. Se puede emplear cualquier procedimiento de humanización para generar los anticuerpos humanizados de la divulgación. Los procedimientos adecuados se describen en el presente documento y se ejemplifican específicamente en el Ejemplo 4.

En una realización particular, el anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende:

una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en 13, 14 y 15, respectivamente, y una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas del grupo que consiste en H1, H5, H9, H11, H12, H16, H38, H40, H41, H43, H44, H66, H75, H79, H81, H82A, H83, H87 y H108; y/o

una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en 16, 17 y 18, respectivamente, y una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas del grupo que consisten en L5, L9, L15, L18, L19, L21, L22, L43, L63, L78, L79, L83, L85, L100 y L104 (según el convenio de numeración de Kabat).

En otras realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende las secuencias de aminoácidos de la región VH expuestas en las SEQ ID NO: 19, 20, 21,22, 24, 25, 38, 45, 53, y/o 61.

En otras realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende las secuencias de aminoácidos de la región VL expuestas en las SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 29, 30, 31,39, 46, 54, y/o 62.

En otras realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 19 y 26, SEQ ID NO: 20 y 27, SEQ ID NO: 21 y 28; SEQ ID NO: 22 y 28; SEQ ID NO: 23 y 29; SEQ ID NO: 24 y 30; SEQ ID NO: 25 y 31; SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 45 y 46, SEQ ID NO: 53 y 54, o SEQ ID NO: 61 y 62, respectivamente.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una o más secuencias de aminoácidos de la región CDR seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 48, 49, 50, 51,52, 55, 56, 57, 58, 59 y 60, en donde las una o más secuencias de aminoácidos de la región CDR comprenden al menos una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras.

La presente divulgación también abarca "sustituciones conservadoras de aminoácidos " en las secuencias de aminoácidos de CDR (p. ej., las SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 48, 49, 50, 51 52, 55, 56, 57, 58, 59 y 60) de los anticuerpos de la divulgación, es decir, modificaciones de la secuencia de aminoácidos que no anulan la unión del anticuerpo al antígeno, p. ej., Calidina o des-Arg10-Calidina. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen la sustitución de un aminoácido de una clase por un aminoácido de la misma clase, donde una clase se define por las propiedades fisicoquímicos normales de la cadena lateral de aminoácidos y altas frecuencias de sustitución en proteínas homólogas de origen natural, según se determina, por ejemplo, mediante una matriz estándar de intercambio de frecuencia Dayhoff o matriz BLOSUM. Se han clasificado seis clases generales de cadenas laterales de aminoácidos e incluyen: Clase I (Cys); Clase II (Ser, Thr, Pro, Ala y Gly); Clase III (Asn, Asp, Gln y Glu); Clase IV (His, Arg y Lys); Clase V (Ile, Leu, Val y Met); y Clase VI (Phe, Tyr y Trp). Por ejemplo, la sustitución de un Asp por otro resto de clase III, como Asn, Gln o Glu, es una sustitución conservadora. De ese modo, un resto de aminoácido no esencial previsto en un anticuerpo anti-Calidina o des-Arg10-Calidina se reemplaza preferiblemente con otro resto de aminoácido de la misma clase. Los procedimientos para identificar sustituciones conservadoras de aminoácidos que no eliminan la

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unión al antígeno son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Brummell y col., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi y col., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999) y Burks y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94: 412-417 (1997)).

En otra realización, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina, o fragmento de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una secuencia de aminoácidos de las regiones VH y/o VL con aproximadamente 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, de identidad con la secuencia de aminoácidos de la región VH expuesta en las SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 24, 25, 38, 45, 53 o 61, o la secuencia de aminoácidos de la región VL expuesta en las SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 29, 30, 31, 39, 46, 54 o 62, respectivamente.

En otra realización, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina que se unen al mismo epítope y/o compiten de forma cruzada con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL expuestas en las SEQ ID NO: 19 y 25, SEQ ID NO: 38 y 39, SEQ ID NO: 45 y 46, SEQ ID NO: 53 y 54, o SEQ ID NO: 61 y 62, respectivamente. Dichos anticuerpos pueden ser identificados usando ensayos de unión competitiva de rutina que incluyen, por ejemplo, ensayos de competición basados en resonancia de plasmón de superficie (SPR).

En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la divulgación se unen a un epítope conformacional de calidina (KD) o des-Arg10-Calidina (DAKD) que adopta una conformación de "trenzado de Pro4". Como se representa en la Figura 17, un sello distintivo de la conformación de “trenzado de Pro 4" es un giro cerrado de tipo II en la estructura principal de polipéptidos de la cadena principal de KD o DAKD en Prolina 4. Como saben los expertos en la técnica, una conformación de giro cerrado de tipo II comprende tres restos (X1-X2-X3) con el carbonilo del resto X1 formando un enlace de hidrógeno con el N amido del resto X3, que típicamente es una glicina (véase Richardson JS. "The anatomy and taxonomy of protein structure”. Adv Protein Chem. 1981; 34:167-339, que se incorpora en el presente documento por referencia). Según esto, en ciertas realizaciones, se forma una conformación de giro cerrado de tipo II mediante el motivo Pro3-Pro4-Gly5 de KD o DADK. En realizaciones más específicas, la conformación de "trenzado Pro 4" se define adicionalmente por todos o sustancialmente todos los aminoácidos restantes de KD (1-2 y 6-9) o DAKD que adoptan repeticiones de una forma sigmoidea que alinean las cadenas laterales hidrófobas en un modo de apilamiento espacial.

III. Anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina modificados

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina de la divulgación pueden comprender una o más modificaciones. Se pueden preparar formas modificadas de anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina de la divulgación usando cualquier técnica conocida en la materia.

i) Reducir la inmunogenicidad

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina, o fragmentos de unión a antígeno de las mismas, de la divulgación se modifican para reducir su inmunogenicidad usando técnicas reconocidas en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, pueden ser quimerizados, humanizados y/o desinmunizados.

En una realización, un anticuerpo, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, de la divulgación puede ser quimérico. Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo en el que diferentes porciones del anticuerpo se derivan de diferentes especies animales, tales como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los procedimientos para producir anticuerpos quiméricos, o fragmentos de los mismos, son conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi y col., BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies y col., J. Immunol. Methods 125: 191-202 (1989); patentes de EE.UU. n.° 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397, que se incorporan en el presente documento en su totalidad por referencia. Las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855 (1984); Neuberger y col., Nature 312: 604-608 (1984); Takeda y col., Nature 314: 452-454 (1985)) se pueden emplear para la síntesis de dichas moléculas. Por ejemplo, una secuencia genética que codifica una especificidad de unión de una molécula de anticuerpo anti-Calidina o des-Arg10-Calidina de ratón puede fusionarse junto con una secuencia de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como las que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de murino y una región constante de inmunoglobulina humana, p. ej., anticuerpos humanizados.

En otra realización, un anticuerpo de la divulgación, o fragmento de unión a antígeno del mismo está humanizado. Los anticuerpos humanizados tienen una especificidad de unión que comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo no humano y regiones de entramado de una molécula de anticuerpo humano. A menudo, los restos del entramado en las regiones de entramado humanas se sustituirán con el resto correspondiente del anticuerpo donante de la CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones del entramado se identifican por procedimientos bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante modelización de las interacciones de los restos de CDR y de entramado para identificar los restos de

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entramado importantes para la unión de antígeno y comparación de la secuencia para identificar restos de entramado inusuales en posiciones particulares (Véanse, p. ej., Queen y col., patente de EE.UU. n.° 5.585.089; Riechmann y col., Nature 332: 323 (1988), que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad). Los anticuerpos se pueden humanizar usando diversas técnicas conocidas en la materia que incluye, por ejemplo, el injerto de CDR (EP 239.400; publicación PCT WO 91/09967; la patente de EE.UU. n.° 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), recubrimiento o rejuvenecimiento (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498 (1991); Studnicka y col., Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska y col., PNAS 91: 969973 (1994)), y barajado de cadenas (patente de EE.UU. n.° 5.565.332).

En una realización particular, se emplea un procedimiento de humanización que se basa en el impacto de la flexibilidad molecular del anticuerpo durante y en el reconocimiento inmunitario (véase el documento WO2009/032661, que se incorpora en el presente documento en su totalidad por referencia). La flexibilidad de la proteína está relacionada con el movimiento molecular de la molécula de proteína. La flexibilidad de la proteína es la capacidad de una proteína completa, una parte de una proteína o un único resto de aminoácido para adoptar un conjunto de conformaciones que difieren significativamente entre sí. La información sobre la flexibilidad de la proteína se puede obtener realizando experimentos de cristalografía de rayos X de las proteínas (véase, por ejemplo, Kundu y col., 2002, Biophys J 83: 723-732), experimentos de resonancia magnética nuclear (véase, por ejemplo, Freedberg y col.., J Am Chem Soc 1998, 120(31): 7916-7923) o ejecutando simulaciones de dinámica molecular (MD). Una simulación de MD de una proteína se realiza en un ordenador y permite determinar el movimiento de todos los átomos de la proteína a lo largo de un período de tiempo mediante el cálculo de las interacciones físicas de los átomos entre sí. El resultado de una simulación de MD es la trayectoria de la proteína estudiada durante el período de tiempo de la simulación. La trayectoria es un conjunto de conformaciones de las proteínas, también llamadas instantáneas, que se muestrean periódicamente durante el período de simulación, p. ej., cada 1 picosegundo (ps). Analizando el conjunto de instantáneas se puede cuantificar la flexibilidad de los restos de aminoácidos de la proteína. Por ello, un resto flexible es el que adopta un conjunto de conformaciones diferentes en el contexto del polipéptido dentro del cual reside dicho resto. Los procedimientos de MD son conocidos en la técnica, véase, p. ej., Brooks y col. "Proteins: A Theoretical Perspective of Dynamics, Structure and Thermodynamics” (Wiley, Nueva York, 1988). Varios softwares permiten simulaciones de MD, como Amber (véase Case y col. (2005) J Comp Chem 26: 1668-1688), Charmm (véase Brooks y col. (1983) J Comp Chem 4: 187-217; y MacKerell y col. (1998) en "The Encyclopedia of Computational Chemistry" vol. 1: 271-177, Schleyer y col., editores Chichester: John Wiley & Sons) o Impact (véase Rizzo y col., J Am Chem Soc; 2000; 122(51): 12898-12900).

La mayoría de los complejos proteicos comparten una superficie enterrada relativamente amplia y plana y se ha demostrado que la flexibilidad de los socios de unión proporciona el origen de su plasticidad, lo que les permite adaptarse conformacionalmente entre sí (Structure (2000) 8, R137-R142). Como tal, se ha demostrado que los ejemplos de "ajuste inducido" desempeñan un papel dominante en las interfaces proteína-proteína. Además, hay un conjunto de datos en constante aumento que muestra que las proteínas se unen de hecho a ligandos de diversas formas, tamaños y composiciones (Protein Science (2002) 11:184-187) y que la diversidad conformacional parece ser un componente esencial de la capacidad de reconocer diferentes socios (Science (2003) 299, 1362-1367). Los restos flexibles están implicados en la unión de los socios proteína-proteína (Structure (2006) 14, 683-693).

Los restos flexibles pueden adoptar una variedad de conformaciones que proporcionan un conjunto de áreas de interacción que es probable que sean reconocidas por las células B de memoria y desencadenar una respuesta inmunogénica. Por ello, un anticuerpo se puede humanizar modificando varios restos del entramado de manera que el conjunto de las conformaciones y de las áreas de reconocimiento visualizadas por el anticuerpo modificado se asemejen lo más posible a las adoptadas por un anticuerpo humano. Esto se puede lograr modificando un número limitado de restos: (1) construyendo un modelo de homología del mAb progenitor y ejecutando una simulación de MD; (2) analizando los restos flexibles e identificando los restos más flexibles de una molécula de anticuerpo no humano, así como identificando restos o motivos que probablemente sean una fuente de heterogeneidad o de reacción de degradación; (3) identificando un anticuerpo humano que muestra el conjunto más similar de áreas de reconocimiento como anticuerpo progenitor; (4) determinando los restos flexibles a mutar, los restos o motivos que sean probablemente una fuente de heterogeneidad y degradación también son mutados; y (5) verificando la presencia de epítopes de células T o células B conocidos. Los restos flexibles se pueden encontrar usando un cálculo de MD tal como se describe en el presente documento utilizando un modelo de disolvente implícito, que tiene en cuenta la interacción del disolvente agua con los átomos de proteína durante el período de tiempo de la simulación.

Una vez que se ha identificado el conjunto de restos flexibles dentro de las cadenas ligera y pesada variables, se identifican un conjunto de entramados de región variable de las cadena pesada y ligera humanas que se asemejan mucho a las del anticuerpo de interés. Eso se puede hacer, por ejemplo, utilizando una búsqueda BLAST en el conjunto de restos flexibles contra una base de datos de secuencia de línea germinal humana del anticuerpo. También se puede hacer comparando la dinámica del mAb progenitor con la dinámica de una biblioteca de estructuras canónicas de línea germinal. Los restos de CDR y los restos vecinos se excluyen de la búsqueda para asegurar que se preserve la alta afinidad por el antígeno. Los restos flexibles se sustituyen después.

Cuando varios restos humanos ácidos muestran homologías similares, la selección también está dirigida por la naturaleza de los restos que es probable que afecten al comportamiento de la solución del anticuerpo humanizado.

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Por ejemplo, los restos polares serán preferidos en bucles flexibles expuestos antes que los restos hidrófobos. Los restos que son una fuente potencial de inestabilidad y heterogeneidad también se mutan incluso si se encuentran en los CDR. Esto incluirá metioninas expuestas ya que la formación de sulfóxido puede resultar de radicales oxigenados, escisión proteolítica de enlaces lábiles ácidos como los del dipéptido Asp-Pro (Drug Dev Res (2004) 61:137-154), sitios de desamidación encontrados con un resto de asparagina expuesto seguido de un pequeño aminoácido, como Gly, Ser, Ala, His, Asn o Cys (J Chromatog (2006) 837: 35-43) y sitios de N-glucosilación, como el sitio Asn-X-Ser/Thr. Típicamente, las metioninas expuestas serán sustituidas por un Leu, las asparaginas expuestas serán sustituidas por una glutamina o por un aspartato, o se cambiará el resto subsiguiente. Para el sitio de glucosilación (Asn-X-Ser/Thr), se cambiarán el Asn o el resto Ser/Thr.

La secuencia de anticuerpo compuesto resultante se verifica por la presencia de epítopes conocidos de células B o células T lineales. Se realiza una búsqueda, por ejemplo, con la Base de Datos de Epítopes Inmunológicos (IEDB) disponible para el público (PLos Biol (2005) 3(3)e91). Si se encuentra un epítope conocido dentro de la secuencia compuesta, otro conjunto de secuencias humanas se recupera y se sustituye. De ese modo, a diferencia del procedimiento de rejuvenecimiento de la patente de EE.UU. n.° 5.639.641, las respuestas inmunogénicas mediadas tanto por células B como mediadas por células T se abordan mediante el procedimiento. El procedimiento también evita el problema de la pérdida de actividad que a veces se observa con el injerto de CDR (patente de EE.UU. n.° 5.530.101). Además, los problemas de estabilidad y solubilidad se consideran también en el proceso de ingeniería y selección, dando como resultado un anticuerpo que es optimizado para una baja inmunogenicidad, una alta afinidad antigénica y propiedades biofísicas mejoradas.

En algunas realizaciones, la desinmunización puede usarse para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo. Como se usa en el presente documento, el término "desinmunización" incluye la alteración de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, para modificar epítopes de células T (véanse, p. ej., WO9852976A1 y WO0034317A2). Por ejemplo, se pueden analizar las secuencias VH y VL del anticuerpo de partida y se puede generar un "mapa" de epítopes de células T humanas de cada región V mostrando la ubicación de epítopes en relación con las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y otros restos clave dentro la secuencia. Los epítopes de célula T individuales del mapa de epítopes de células T se analizan para identificar sustituciones alternativas de aminoácidos con un riesgo bajo de alterar la actividad del anticuerpo final. Se diseñan una gama de secuencias VH y VL alternativas que comprenden combinaciones de sustituciones de aminoácidos y estas secuencias se incorporan posteriormente en un intervalo de anticuerpos específicos de Calidina o des-Arg10-Calidina, o fragmentos de los mismos, para uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento, que luego se prueban para la función. Típicamente, se generan y prueban entre 12 y 24 anticuerpos variantes. Los genes completos de la cadena pesada y ligera que comprenden regiones V modificadas y C humanas se clonan a continuación en vectores de expresión y los plásmidos posteriores se introducen en líneas celulares para la producción de anticuerpo completo. Luego se comparan los anticuerpos en ensayos bioquímicos y biológicos apropiados, y se identifica la variante óptima.

ii) Funciones efectoras y modificaciones Fc

Los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina de la divulgación pueden comprender una región constante de anticuerpo (p. ej., una región constante de IgG, p. ej., una región constante de IgG humana, p. ej., una región constante de IgG1 o IgG4 humanas) que media una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 de complemento a una región constante del anticuerpo puede activar el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de los patógenos de las células. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede estar involucrada en la hipersensibilidad autoinmunitaria. Además, los anticuerpos se unen a receptores en diversas células a través de la región Fc, con un sitio de unión al receptor Fc en la región Fc del anticuerpo que se une a un receptor Fc (FcR) en una célula. Hay varios receptores Fc que son específicos para diferentes clases de anticuerpos, incluidos IgG (receptores gamma), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión del anticuerpo a los receptores Fc en las superficies de las células desencadena una serie de respuestas biológicas importantes y diversas que incluyen la absorción y destrucción de partículas recubiertas de anticuerpos, supresión de complejos inmunitarios, la lisis de células diana recubiertas de anticuerpos por linfocíticos citolíticos (denominada citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo, o ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulinas. En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, se unen a un receptor Fc-gamma. En realizaciones alternativas, los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina de la divulgación pueden comprender una región constante que está desprovista de una o más funciones efectoras (p. ej., actividad ADCC) y/o es incapaz de unirse al receptor Fc.

Ciertas realizaciones de la divulgación incluyen anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina en los que al menos un aminoácido en uno o más de los dominios de la región constante se ha eliminado o, de otro modo, alterado para proporcionar características bioquímicas deseadas tales como funciones efectoras reducidas o mejoradas, la capacidad para dimerizar de forma no covalente, mejoró la capacidad para localizar en el sitio de un tumor, redujo la semivida del suero o aumentó la semivida del suero cuando se comparó con un anticuerpo completo, no alterado, de aproximadamente la misma inmunogenicidad. Por ejemplo, ciertos anticuerpos, o fragmentos de los mismos, para uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento son anticuerpos eliminados del dominio que comprenden una cadena polipeptídica similar a una cadena pesada de inmunoglobulina,

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pero que carecen al menos de una porción de uno o más dominios de la cadena pesada. Por ejemplo, en ciertos anticuerpos, se eliminará un dominio completo de la región constante del anticuerpo modificado, por ejemplo, se borrará todo o parte del dominio CH2.

En otras determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina comprenden regiones constantes derivadas de diferentes isotipos de anticuerpos (p. ej., regiones constantes de dos o más de una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas). En otras realizaciones, los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina comprenden una bisagra quimérica (es decir, una bisagra que comprende porciones de bisagra derivadas de dominios bisagra de diferentes isotipos de anticuerpos, p. ej., un dominio bisagra superior de una molécula de IgG4 y un dominio bisagra medio de IgG1). En una realización, los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina comprenden una región Fc o una porción de la misma de una molécula de IgG4 humana y una mutación Ser228Pro (numeración de UE) en la región bisagra central de la molécula.

En ciertos anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina, la porción Fc puede ser mutada para aumentar o disminuir la función efectora usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la supresión o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión del receptor Fc del anticuerpo modificado circulante, aumentando por ello la localización del tumor. En otros casos, puede ser que las modificaciones de la región constante consistentes con la presente divulgación moderen la unión del complemento y así reduzcan la semivida del suero y la asociación no específica de una citotoxina conjugada. Aún otras modificaciones de la región constante se pueden usar para modificar enlaces disulfuro o restos de oligosacáridos que permiten una localización potenciada debido a una mayor especificidad o flexibilidad del antígeno. El perfil fisiológico resultante, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tales como la localización del tumor, la biodistribución y la semivida del suero, pueden medirse y cuantificarse fácilmente usando técnicas inmunológicas bien conocidas sin una excesiva experimentación.

En ciertas realizaciones, un dominio Fc empleado en un anticuerpo de la divulgación es una variante Fc. Como se usa en el presente documento, el término "variante Fc" se refiere a un dominio Fc que tiene al menos una sustitución de aminoácido en relación con el dominio Fc de tipo salvaje del que se deriva dicho dominio Fc. Por ejemplo, en donde el dominio Fc se deriva de un anticuerpo IgG1 humano, la variante Fc de dicho dominio Fc de IgG1 humana comprende al menos una sustitución de aminoácido en relación con dicho dominio Fc.

Las sustituciones de aminoácido de una variante Fc se puede localizar en cualquier posición (es decir, cualquier posición de aminoácido de la convención de la UE) dentro del dominio Fc. En una realización, la variante Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio bisagra o porción del mismo. En otra realización, la variante Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio CH2 o porción del mismo. En otra realización, la variante Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio CH3 o porción del mismo. En otra realización, la variante Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio CH4 o porción del mismo.

Los anticuerpos de la divulgación pueden emplear cualquier variante Fc reconocida en la técnica que se sabe que imparte una mejora (p. ej., reducción o potenciación) en la función efectora y/o unión a FcR. Dichas variantes Fc pueden incluir, por ejemplo, una cualquiera de las sustituciones de aminoácidos divulgadas en las publicaciones PCT internacionales WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2,

WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2,

WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2,

WO06/019447A1, WO06/047350A2, y WO06/085967A2 o en las patentes de EE.UU. n.2 5.648.260; 5.739.277; 5.834.250; 5.869.046; 6.096.871; 6.121.022; 6.194.551; 6.242.195; 6.277.375; 6.528.624; 6.538.124; 6.737.056; 6.821.505; 6.998.253; y 7.083.784, cada una de los cuales se incorpora en el presente documento por referencia. En una realización ejemplar, un anticuerpo de la divulgación puede comprender una variante Fc que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 268 de la UE (p. ej., H268D o H268E). En otra realización ejemplar, un anticuerpo de la divulgación puede comprender una sustitución de aminoácido en la posición 239 de la UE (p. ej., S239D o S239E) y/o en la posición 332 de la UE (p. ej., I332D o I332Q).

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la divulgación puede comprender una variante Fc que comprende una sustitución de aminoácido que altera las funciones efectoras del anticuerpo independientes del antígeno, en particular la semivida circulante del anticuerpo. Tales anticuerpos muestran una unión aumentada o disminuida para FcRn cuando se comparan con anticuerpos que carecen de estas sustituciones, por lo tanto, tienen una semivida en suero aumentada o disminuida, respectivamente. Se anticipa que las variantes Fc con afinidad mejorada por FcRn tienen semividas en suero más largas, y tales moléculas tienen aplicaciones útiles en procedimientos de tratamiento de mamíferos donde se desea una semivida larga del anticuerpo administrado, p. ej., para tratar una enfermedad o trastorno crónico. Por el contrario, se espera que las variantes Fc con afinidad de unión a FcRn disminuida tengan semividas más cortas, y tales moléculas también son útiles, por ejemplo, para la administración a un mamífero donde un tiempo de circulación acortado puede ser ventajoso, p. ej., para imágenes de diagnóstico in vivo o en situaciones en las que el anticuerpo de partida tiene efectos secundarios tóxicos cuando está presente en la circulación durante períodos prolongados. Las variantes Fc con afinidad de unión a FcRn disminuida tienen también menos probabilidades de atravesar la placenta y, por ello, también son útiles en el tratamiento de enfermedades o

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trastornos en mujeres embarazadas. Además, otras aplicaciones en las que puede desearse una afinidad de unión a FcRn reducida incluyen aquellas aplicaciones en las que se desea la localización del cerebro, riñón y/o hígado. En una realización ejemplar, los anticuerpos alterados de la divulgación muestran un transporte reducido a través del epitelio de los glomérulos renales desde la vasculatura. En otra realización, los anticuerpos alterados de la divulgación muestran un transporte reducido a través de la barrera hematoencefálica (BBB) desde el cerebro hacia el espacio vascular. En una realización, un anticuerpo con unión a FcRn alterada comprende un dominio Fc que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro del "bucle de unión a FcRn" de un dominio Fc. El bucle de unión a FcRn está comprendido de los restos 280-299 de aminoácidos (según la numeración de la UE). Ejemplos de sustituciones de aminoácidos que alteraron la actividad de unión de FcRn se describen en la Publicación PCT Internacional N.° WO05/047327 que se incorpora en el presente documento por referencia. En ciertas realizaciones ejemplares, los anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, comprenden un dominio Fc que tiene una o más de las siguientes sustituciones: V284E, H285E, N286D, K290E y S304D (numeración de la UE).

En otras realizaciones, los anticuerpos, para uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento tienen una región constante, p. ej., una región constante de la cadena pesada de IgG1 o IgG4, que es alterada para reducir o eliminar la glucosilación. Por ejemplo, un anticuerpo de la divulgación puede comprender también una variante Fc que comprende una sustitución de aminoácido que altera la glucosilación del anticuerpo. Por ejemplo, dicha variante Fc puede tener glucosilación reducida (p. ej., glucosilación ligada a N o a O). En realizaciones ejemplares, la variante Fc comprende glucosilación reducida del glicano ligado a N normalmente encontrado en la posición 297 de aminoácido (numeración de la UE). En otra realización, el anticuerpo tiene una sustitución de aminoácido cerca o dentro de un motivo de glucosilación, por ejemplo, un motivo de glucosilación ligado a N que contiene las secuencias NXT o NXS de aminoácidos. En una realización particular, el anticuerpo comprende una variante Fc con una sustitución del aminoácido en la posición 228 o 299 del aminoácido (numeración de la UE). En realizaciones más particulares, el anticuerpo comprende una región constante de IgG1 o IgG4 que comprende una mutación S228P y una T299A (numeración de la UE).

Las sustituciones ejemplares de aminoácidos que confieren glucosilación reducida o alterada se describen en la publicación PCT Internacional N.° WO05/018572, que se incorpora en el presente documento por referencia. En realizaciones preferidas, los anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, se modifican para eliminar la glucosilación. Tales anticuerpos, o fragmentos de los mismos, se pueden denominar anticuerpos "agly", o fragmentos de los mismos, (p. ej., anticuerpos "agly"). Aunque no está limitado por la teoría, se cree que los anticuerpos "agly", o fragmentos de los mismos, pueden tener un perfil mejorado de seguridad y estabilidad in vivo. Ejemplos de anticuerpos agly, o fragmentos de los mismos, comprenden una región Fc aglucosilada de un anticuerpo IgG4 que está desprovista de función efectora de Fc, eliminando de ese modo el potencial de toxicidad mediada por Fc a los órganos vitales normales que expresan Calidina o des-Arg10-Calidina. En aún otras realizaciones, los anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, comprenden un glicano alterado. Por ejemplo, el anticuerpo puede tener un número reducido de restos de fucosa en un N-glicano en Asn297 de la región Fc, es decir, está afucosilado. En otra realización, el anticuerpo puede tener un número alterado de restos de ácido siálico en el N-glicano en Asn297 de la región Fc.

iii) Unión covalente

Los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina de la divulgación se pueden modificar, p. ej., mediante la unión covalente de una molécula al anticuerpo de manera que la unión covalente no evite que el anticuerpo se una específicamente a su epítope cognado. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, pueden modificarse mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, procedimientos indirectos mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a escisión química específica, acetilación, formilación, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Los anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, pueden fusionarse adicionalmente de forma recombinante a un polipéptido heterólogo en el N- o C-terminal o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) a polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos anti- Calidina o des-Arg10-Calidina se pueden fusionar o conjugar de forma recombinante con moléculas útiles como marcadores en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos, fármacos, radionucleidos o toxinas heterólogos. Véanse, p. ej., las publicaciones PCT WO 92/08495; Wo 91/14438; WO 89/12624; patente de EE.UU. n.2 5.314.995; y EP 396.387.

Los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina se pueden fusionar con polipéptidos heterólogos para aumentar la semivida in vivo o para uso en inmunoensayos utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización, el PEG puede conjugarse con los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina de la divulgación para aumentar su semivida in vivo. Leong, S. R., y col., Cytokine 16: 106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54: 531 (2002); o Weir y col., Biochem. Soc. Transactions 30: 512 (2002).

Además, los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina de la divulgación se pueden fusionar con secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar su purificación o detección. En realizaciones preferidas, la

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secuencia de aminoácidos marcadores es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 821-824 (1989), por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas de péptidos útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta "HA", que corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson y col., Cell 37: 767 (1984)) y la etiqueta de "bandera".

Los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina de la divulgación se pueden usar en forma no conjugada o se pueden conjugar con al menos una de una variedad de moléculas, p. ej., para mejorar las propiedades terapéuticas de la molécula, para facilitar la detección de la diana, o para imágenes o terapia del paciente. Los anticuerpos anti- Calidina o des-Arg10-Calidina de la divulgación pueden ser marcados o conjugados antes o después de la purificación, cuando se realiza la purificación. En particular, los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina de la divulgación se pueden conjugar con agentes terapéuticos, profármacos, péptidos, proteínas, enzimas, virus, lípidos, modificadores de la respuesta biológica, agentes farmacéuticos o PEG.

La presente divulgación abarca además anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina de la divulgación conjugados con un agente de diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina se pueden usar de forma diagnóstica para, por ejemplo, controlar el desarrollo o progresión de un trastorno de células inmunitarias (p. ej., CLL) como parte de un procedimiento de prueba clínica para, p. ej., determinar la eficacia de un régimen de tratamiento y/o de prevención determinados. La detección se puede facilitar por acoplamiento de los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales que emiten positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones e iones de metales paramagnéticos no radiactivos. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. n.° 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como diagnóstico según la presente divulgación. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluorescein-diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc.

Los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina para uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento divulgados en el presente documento pueden conjugarse con citotoxinas (tales como radioisótopos, fármacos citotóxicos o toxinas), agentes terapéuticos, agentes citostáticos, toxinas biológicas, profármacos, péptidos, proteínas, enzimas, virus, lípidos, modificadores de la respuesta biológica, agentes farmacéuticos, ligandos inmunológicamente activos (p. ej., linfocinas u otros anticuerpos en los que la molécula resultante se une tanto a la célula neoplásica como a una célula efectora como una célula T) o PEG.

En otra realización, un anticuerpo anti-Calidina o des-Arg10-Calidina para uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento divulgados en el presente documento puede conjugarse con una molécula que disminuye el crecimiento de células tumorales. En otras realizaciones, las composiciones divulgadas pueden comprender anticuerpos, o fragmentos de los mismos, acoplados a fármacos o profármacos. Todavía otras realizaciones de la presente divulgación comprenden el uso de anticuerpos, o fragmentos de los mismos, conjugados con biotoxinas específicas o sus fragmentos citotóxicos tales como ricina, gelonina, exotoxina de Pseudomonas o toxina de la difteria. La selección de qué anticuerpo conjugado o no conjugado usar dependerá del tipo y estadio del cáncer, del uso de tratamiento complementario (p. ej., quimioterapia o radiación externa) y el estado del paciente. Se comprenderá que un experto en la técnica podría hacer fácilmente tal selección a la vista de las enseñanzas del presente documento.

Se comprenderá que, en estudios previos, los anticuerpos antitumorales marcados con isótopos se han usado con éxito para destruir células tumorales en modelos animales, y en algunos casos en humanos. Radioisótopos ejemplares incluyen: 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re y 188Re. Los radionucleidos actúan produciendo radiación ionizante que provoca múltiples roturas de cadena en el ADN nuclear, lo que lleva a la muerte celular. Los isótopos utilizados para producir conjugados terapéuticos producen típicamente partículas alfa o beta de alta energía que tienen una longitud de trayecto corta. Dichos radionucleidos destruyen las células con las que se encuentran muy próximos, por ejemplo, las células neoplásicas con las que se ha unido o en las que ha entrado el conjugado. Tienen poco o ningún efecto sobre las células no localizadas. Los radionucleidos son esencialmente no inmunogénicos.

IV. Expresión de anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos

Después de la manipulación del material genético aislado para proporcionar anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10- Calidina de la divulgación como se expuso anteriormente, los genes se insertan típicamente en un vector de expresión para introducción en células anfitrionas que se pueden usar para producir la cantidad deseada de los anticuerpos reivindicados, o fragmentos de los mismos.

El término "vector" o la expresión "vector de expresión" se usa en el presente documento para los fines de la

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memoria descriptiva y las reivindicaciones, para referirse a vectores usados de acuerdo con la presente divulgación como un vehículo para introducir y expresar un gen deseado en una célula. Como saben los expertos en la técnica, tales vectores se pueden seleccionar fácilmente del grupo que consiste en plásmidos, fagos, virus y retrovirus. En general, los vectores compatibles con la presente divulgación comprenderán un marcador de selección, sitios de restricción apropiados para facilitar la clonación del gen deseado y la capacidad de entrar y/o replicarse en células eucariotas o procariotas.

Se pueden emplear numerosos sistemas de vectores de expresión para los fines de esta divulgación. Por ejemplo, una clase de vector utiliza elementos de ADN que se derivan de virus animales tales como virus del papiloma bovino, virus del polioma, adenovirus, virus de la viruela vacuna, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV o MOMLV) o virus SV40. Otros implican el uso de sistemas policistrónicos con sitios de unión a ribosomas internos. Además, las células que han integrado el ADN en sus cromosomas se pueden seleccionar introduciendo uno o más marcadores que permitan la selección de células anfitrionas transfectadas. El marcador puede contemplar la prototrofía a un anfitrión auxótrofo, resistencia a biocidas (p. ej., antibióticos) o resistencia a metales pesados tales como cobre. El gen marcador seleccionable se puede unir directamente a las secuencias de ADN que van a ser expresadas, o introducidas en la misma célula mediante cotransformación. También se pueden necesitar elementos adicionales para la síntesis óptima de ARNm. Estos elementos pueden incluir secuencias de señales, señales de empalme, así como promotores transcripcionales, potenciadores y señales de terminación. En realizaciones particularmente preferidas, los genes de la región variable clonada se insertan en un vector de expresión junto con los genes (preferiblemente humanos) de la región constante de la cadena pesada y ligera sintéticos como se discutió anteriormente.

En otras realizaciones preferidas, los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina, o fragmentos de los mismos, de la divulgación, se pueden expresar usando construcciones policistrónicas. En tales sistemas de expresión, pueden producirse múltiples productos génicos de interés, tales como cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, a partir de una única construcción policistrónica. Estos sistemas usan ventajosamente un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para proporcionar niveles relativamente altos de polipéptidos de la divulgación en células anfitrionas eucariotas. Las secuencias de IRES compatibles se describen en la patente de EE.UU. n.° 6.193.980, que se incorpora en el presente documento por referencia. Los expertos en la materia comprenderán que tales sistemas de expresión se pueden usar para producir de forma eficaz la gama completa de polipéptidos divulgados en la presente solicitud.

Más generalmente, una vez que se ha preparado un vector o secuencia de ADN que codifica un anticuerpo, o un fragmento del mismo, el vector de expresión se puede introducir en una célula anfitriona apropiada. Es decir, las células anfitrionas pueden transformarse. La introducción del plásmido en la célula anfitriona se puede llevar a cabo mediante diversas técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen, pero no se limitan a, transfección (que incluye electroforesis y electroporación), fusión de protoplastos, precipitación con fosfato de calcio, fusión celular con ADN con envoltura, microinyección e infección con virus intactos. Véase, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Capítulo 24.2, pág. 470-472 Vectors, Rodriguez y Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). Lo más preferiblemente, la introducción del plásmido en el anfitrión es por electroporación. Las células transformadas se cultivan en condiciones apropiadas para la producción de cadenas ligeras y cadenas pesadas, y se ensayan para la síntesis de proteínas de la cadena pesada y/o ligera. Las técnicas de ensayo ejemplares incluyen un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o un análisis de clasificación de células activadas por flourescencia (FACS), inmunohistoquímica y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "transformación" se usará en un sentido amplio para referirse a la introducción de ADN en una célula anfitriona receptora que cambia el genotipo y, en consecuencia, da como resultado un cambio en la célula receptora.

En la misma línea, "células anfitrionas" se refiere a células que se han transformado con vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un gen heterólogo. En las descripciones de procesos para el aislamiento de polipéptidos a partir de anfitriones recombinantes, el término "célula" y la expresión "cultivo celular" se usan indistintamente para indicar la fuente de anticuerpo a menos que se especifique claramente lo contrario. En otras palabras, la recuperación del polipéptido a partir de las "células" puede significar tanto a partir de células enteras centrifugadas, como a partir del cultivo celular que contiene tanto el medio como las células suspendidas.

En una realización, la línea celular anfitriona utilizada para la expresión del anticuerpo es de origen mamífero; los expertos en la técnica pueden determinar líneas celulares anfitrionas particulares que son las más adecuadas para que el producto génico deseado se exprese en ellas. Ejemplos de líneas celulares anfitrionas incluyen, pero no se limitan a, DG44 y DUXB11 (líneas de Ovario de Hámster Chino, deficiente en DHFR), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (línea de riñón de mono), COS (un derivado de CVI con antígeno T de SV40), R1610 (fibroblasto de hámster chino), BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón), HAK (línea de riñón de hámster), SP2/O (mieloma de ratón), BFA- 1c1BPT (células endoteliales bovinas), RAJI (linfocito humano) y 293 (riñón humano). En una realización, la línea celular contempla una glucosilación alterada, p. ej., afucosilación, del anticuerpo expresado a partir de la misma (p. ej., líneas celulares PER.C6.RTM (Crucell) o de CHO con FUT8 suprimido (Potelligent.RTM. Cells) (Biowa, Princeton), NJ)). En una realización se pueden usar células NS0. Se prefieren particularmente las células de CHO.

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Las líneas celulares anfitrionas están típicamente disponibles a partir de los servicios comerciales, la American Tissue Culture Collection o a partir de la documentación publicada.

La producción in vitro permite la ampliación para dar grandes cantidades de los polipéptidos deseados. Las técnicas para el cultivo de células de mamífero en condiciones de cultivo de tejidos son conocidas en la técnica e incluyen un cultivo en suspensión homogéneo, p. ej., en un reactor de levantamiento por aire o en un reactor de agitación continua, o cultivo celular inmovilizado o atrapado, p. ej., en fibras huecas, microcápsulas, en microperlas de agarosa o cartuchos cerámicos. Si es necesario y/o si se desea, las soluciones de polipéptidos pueden purificarse mediante los procedimientos de cromatografía habituales, por ejemplo, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre celulosa DEAE y/o cromatografía de (inmuno)-afinidad.

Los genes que codifican los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina, o fragmentos de los mismos, de la divulgación, también se pueden expresar células no de mamífero tales como bacterias o levaduras o células vegetales. A este respecto, se comprenderá que también pueden transformarse diversos microorganismos unicelulares no mamíferos, tales como bacterias; es decir, aquellos capaces de crecer en cultivos o fermentación. Las bacterias, que son susceptibles de transformación, incluyen miembros de Enterobacteriacea, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tal como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus y Haemophilus influenzae. Se comprenderá además que, cuando se expresan en bacterias, los polipéptidos pueden formar parte de los cuerpos de inclusión. Los polipéptidos se deben aislar, purificar y después ensamblar en moléculas funcionales.

Además de procariotas, también se pueden usar microbios eucariotas. Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadería común, es el más comúnmente utilizado entre los microorganismos eucariotas, aunque otras diversas cepas están comúnmente disponibles. Para la expresión en Saccharomyces, se usa normalmente el plásmido YRp7, por ejemplo, (Stinchcomb y col., Nature, 282:39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10:157 (1980)). Este plásmido ya contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC n.° 44076 o PEP4- 1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de la célula anfitriona de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.

V. Formulaciones farmacéuticas y procedimientos de administración de anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10- Calidina.

En otro aspecto, la divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti- Calidina o des-Arg10-Calidina, o fragmento del mismo.

Los procedimientos para preparar y administrar a un sujeto anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, son bien conocidos o están fácilmente determinados por los expertos en la técnica. La ruta de administración de los anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. En general, se prefieren las formas intravenosa, intraarterial, subcutánea e intramuscular de administración parenteral. Si bien todas estas formas de administración se contemplan claramente dentro del alcance de la divulgación, una forma de administración sería una solución para inyección, en particular para inyección o goteo intravenoso o intraarterial. Habitualmente, una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender un tampón (p. ej., tampón de acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (p. ej., polisorbato), opcionalmente un agente estabilizador (p. ej., albúmina humana), etc. Sin embargo, en otros procedimientos compatibles con las enseñanzas en el presente documento, los polipéptidos se pueden suministrar directamente en el sitio de la población celular adversa, aumentando de ese modo la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen solución salina y medios tamponados. En la divulgación del tema, los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, tampón fosfato 0,01-0,1 M y preferiblemente 0,05 M o solución salina al 0,8%. Otros vehículos parenterales frecuentes incluyen soluciones de fosfato sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, lactato de Ringer o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de fluidos y nutrientes, reabastecedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y gases inertes y similares. Más particularmente, las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En tales casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista facilidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y preferiblemente se conservará frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua,

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etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En cualquier caso, las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando un compuesto activo (p. ej., un anticuerpo solo o en combinación con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en el presente documento, según sea necesario, seguido de esterilización por filtrado. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son secados en vacío y liofilización, que produce un polvo de un ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se introducen en recipientes tales como ampollas, bolsas, frascos, jeringas o viales, y se sellan en condiciones asépticas según procedimientos conocidos en la técnica. Además, las preparaciones pueden envasarse y venderse en forma de un kit tal como los descritos en la publicación de EE.UU. n.° 2002/0102208 que se incorpora en el presente documento por referencia. Dichos artículos de fabricación tendrán preferiblemente etiquetas o prospectos que indiquen que las composiciones asociadas son útiles para tratar a un sujeto que padece o está predispuesto a trastornos autoinmunes o neoplásicos.

Las dosis eficaces de los anticuerpos estabilizados, o fragmentos de los mismos, de la presente divulgación, para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluidos los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un ser humano, pero también pueden ser tratados mamíferos no humanos que incluyen mamíferos transgénicos. Las dosis de tratamiento se pueden titular usando procedimientos de rutina conocidos por los expertos en la técnica para optimizar la seguridad y la eficacia.

Para inmunización pasiva con un anticuerpo de la divulgación, la dosificación puede variar, p. ej., de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg (p. ej., 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.) del peso corporal del anfitrión. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg, preferiblemente al menos 1 mg/kg. También se pretende que las dosis intermedias en los intervalos anteriores estén dentro del alcance de la divulgación.

Los sujetos pueden ser administrados con tales dosis diariamente, en días alternos, semanalmente o según cualquier otro calendario determinado por análisis empírico. Un tratamiento ejemplar implica la administración en múltiples dosis durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes de tratamiento ejemplares adicionales implican la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los calendarios de dosificación ilustrativos incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg semanalmente. En algunos procedimientos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión se administran simultáneamente, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado puede caer dentro de los intervalos indicados.

Los anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, se pueden administrar en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser, p. ej., diarios, semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, como se indica midiendo los niveles sanguíneos de polipéptido o molécula diana en el paciente. En algunos procedimientos, la dosificación se ajusta para alcanzar una determinada concentración de anticuerpo o toxina en plasma, p. ej., 1-1.000 ug/ml o 25-300 ug/ml. Alternativamente, los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, se pueden administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizados muestran la semivida más larga, seguida de anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. En una realización, los anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, se pueden administrar en forma no conjugada. En otra realización, los anticuerpos de la divulgación se pueden administrar múltiples veces en forma conjugada. En otra realización más, los anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, se pueden administrar en forma no conjugada, luego en forma conjugada, o viceversa.

La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes anticuerpos o un cóctel de los mismos se administran a un paciente que aún no se encuentra en el estado de enfermedad para potenciar la resistencia del paciente. Dicha cantidad se define como una "dosis eficaz profiláctica". En este uso, las cantidades precisas dependen nuevamente del estado de salud y la inmunidad general del paciente, pero generalmente varían

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de 0,1 a 25 mg por dosis, especialmente de 0,5 a 2,5 mg por dosis. Se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente poco frecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas.

En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosificación relativamente alta (p. ej., de aproximadamente 1 a 400 mg/kg de anticuerpo por dosis, con dosis de 5 a 25 mg se usan más frecuentemente para radioinmunoconjugados y dosis más altas para moléculas conjugadas citotoxina-fármaco) a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduce o termina, y preferiblemente hasta que el paciente muestra una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A partir de entonces, la patente puede ser administrada en régimen profiláctico.

En una realización, un sujeto puede ser tratado con una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la divulgación (p. ej., en un vector). Las dosis para ácidos nucleicos que codifican polipéptidos varían de aproximadamente 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 ug a 10 mg o 30-300 ug de ADN por paciente. Las dosis para vectores víricos infecciosos varían de 10-100, o más, viriones por dosis.

Los agentes terapéuticos se pueden administrar por medios parenterales, tópicos, intravenosos, orales, subcutáneos, intraarteriales, intracraneales, intraperitoneales, intranasales o intramusculares para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. La inyección intramuscular o infusión intravenosa se prefieren para la administración de un anticuerpo de la divulgación. En algunos procedimientos, los anticuerpos terapéuticos, o fragmentos de los mismos, se inyectan directamente en el cráneo. En algunos procedimientos, los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, se administran como una composición o dispositivo de liberación sostenida, tal como un dispositivo Medipad®.

Los agentes de la divulgación pueden ser administrados opcionalmente en combinación con otros agentes que son eficaces en el tratamiento del trastorno o afección que necesitan tratamiento (p. ej., profiláctico o terapéutico). Los agentes adicionales preferidos son aquellos que se reconocen en la técnica y se administran de manera estándar para un trastorno particular.

Las dosificaciones eficaces de tratamiento único (es decir, cantidades terapéuticamente eficaces) de anticuerpos de la divulgación marcados con 90Y varían de aproximadamente 5 a aproximadamente 75 mCi, más preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 mCi. Las dosificaciones ablativas no medulares de un solo tratamiento eficaces de anticuerpos marcados con 131I varían de aproximadamente 5 a aproximadamente 70 mCi, más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mCi. Las dosificaciones ablativas de un solo tratamiento eficaces (es decir, pueden requerir trasplante de médula ósea autóloga) de anticuerpos marcados con 131I varían entre aproximadamente 30 y aproximadamente 600 mCi, más preferiblemente entre aproximadamente 50 y menos de aproximadamente 500 mCi. En combinación con un anticuerpo modificado quimérico, debido a la semivida circulante más larga frente a anticuerpos de murino, dosificaciones ablativas no medulares de un solo tratamiento eficaces de anticuerpos quiméricos marcados con yodo-131 varían entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi, más preferiblemente menos de aproximadamente 30 mCi. Los criterios de imagenología para, p. ej., la marca 111In, son típicamente menores que aproximadamente 5 mCi.

Aunque se ha adquirido una gran experiencia clínica con 131I y 90Y, en la técnica se conocen otras radiomarcas y se han usado para fines similares. Todavía otros radioisótopos se usan para imagenología. Por ejemplo, los radioisótopos adicionales que son compatibles con el alcance de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, 123I, 125I, 32P, 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 132I, 197Hg, 203Pb, 206Bi, 177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 225Ac, 211A 213Bi. A este respecto, los emisores alfa, gamma y beta son compatibles dentro de la presente divulgación. Además, a la vista de la presente divulgación, se presenta que un experto en la técnica podría determinar fácilmente qué radionucleidos son compatibles con un curso de tratamiento seleccionado sin excesiva experimentación. Con este fin, los radionucleidos adicionales que ya se han utilizado en el diagnóstico clínico incluyen 125I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, así como 111In. Los anticuerpos también se han marcado con diversos radionucleidos para su posible uso en inmunoterapia dirigida (Peirersz y col., Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987)). Estos radionucleidos incluyen 188Re y 186Re, así como 199Au y 67Cu en menor medida. La patente de EE.UU. n.° 5.460.785 proporciona datos adicionales con respecto a tales radioisótopos y se incorpora en el presente documento por referencia.

Como se comentó previamente, los anticuerpos de la divulgación, o fragmentos de los mismos, se pueden administrar en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamiento in vivo de trastornos de mamíferos. A este respecto, se comprenderá que los anticuerpos descritos, o fragmentos de los mismos, se formularán para facilitar la administración y fomentar la estabilidad del agente activo. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente divulgación comprenden un vehículo estéril, no tóxico y farmacéuticamente aceptable tal como solución salina fisiológica, tampones no tóxicos, conservantes y similares. Para los fines de la presente aplicación, una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo de la divulgación, conjugado o no conjugado con un agente terapéutico, se considerará una cantidad suficiente para lograr la unión eficaz a una diana y obtener un beneficio, p. ej., mejorar los síntomas de una enfermedad o trastorno o detectar una sustancia o una célula. En el caso de células tumorales, el polipéptido será preferiblemente capaz de interactuar con antígenos inmunorreactivos seleccionados sobre células neoplásicas o inmunorreactivas y contemplar un aumento en la muerte de esas células.

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Por supuesto, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden administrar en dosis únicas o múltiples para contemplar una cantidad farmacéuticamente eficaz del polipéptido.

Según el alcance de la presente divulgación, los anticuerpos de la divulgación pueden administrarse a un ser humano u otro animal según los procedimientos de tratamiento mencionados anteriormente en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico o profiláctico. Los polipéptidos de la divulgación se pueden administrar a dicho ser humano u otro animal en una forma de dosificación convencional preparada combinando el anticuerpo de la divulgación con un vehículo o diluyente convencional farmacéuticamente aceptable según técnicas conocidas. Un experto en la técnica comprenderá que la forma y el carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable viene dictado por la cantidad de ingrediente activo con el que se va a combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas. Los expertos en la técnica comprenderán además que un cóctel que comprenda una o más especies de polipéptidos según la presente divulgación puede demostrar ser particularmente eficaz.

VI. Procedimientos para tratar la enfermedad o trastornos asociados a Calidina o des-Arg10-Calidina

Los anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina, o fragmentos de los mismos, de la divulgación son útiles como antagonistas de la actividad de Calidina o des-Arg10-Calidina. Según esto, en otro aspecto, la divulgación proporciona procedimientos para tratar enfermedades o trastornos asociados con Calidina o des-Arg10-Calidina administrando a un sujeto que lo necesite una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos anti-Calidina o des-Arg10-Calidina de la divulgación, o fragmento de unión a antígeno de los mismos.

Las enfermedades o trastornos asociados con Calidina o des-Arg10-Calidina susceptibles de tratamiento incluyen, sin limitación, afecciones fisiopatológicas tales como inflamación, trauma, quemaduras, conmoción, alergia, dolor agudo o crónico, y fibrosis, p. ej., fibrosis renal. En ciertas realizaciones ejemplares, los anticuerpos de la divulgación se pueden generar para tratar la fibrosis renal y la lesión renal aguda asociada, así como las enfermedades renales crónicas que son las principales causas de insuficiencia renal terminal.

Un experto en la técnica podría, mediante experimentación rutinaria, determinar qué cantidad eficaz de anticuerpo no tóxico (o agente terapéutico adicional) tendría el objeto de tratar una enfermedad o trastorno asociado a Calidina o des-Arg10-Calidina. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un polipéptido puede variar según factores tales como la fase de la enfermedad (p. ej., fase I frente a fase IV), edad, sexo, complicaciones médicas (p. ej., afecciones o enfermedades inmunosupresoras) y peso del sujeto, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el sujeto. El régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, diariamente pueden administrarse varias dosis divididas, o la dosis puede reducirse proporcionalmente según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. En general, sin embargo, se espera que una dosificación eficaz esté en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal y día y más preferiblemente desde aproximadamente 0,5 a 10 miligramos por kilogramo de peso corporal y día.

VII. Ejemplificación

La divulgación proporciona adicionalmente los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como una limitación adicional.

Además, según la presente divulgación, se pueden emplear biología molecular convencional, microbiología y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, p. ej., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (en el presente documento "Sambrook y col., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames y S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames y S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Ejemplo 1: producción de hibridoma: Inmunización de ratones con péptido de Calidina conjugado con KLH y generación de anticuerpos contra ligandos BKR1 humanos

El objetivo fue desarrollar anticuerpos de reacción cruzada contra Calidina (KD, SEQ ID NO: 1) y des-arg-Calidina (DAKD; SEQ ID NO: 2) que inhibirían estos ligandos que se unen al BKR1 humano. En general, la inmunización de ratones con KD conjugado con KLH a través de cisteínas adicionales en el C- o N-terminal del péptido se usó para obtener esplenocitos de ratón para la fusión con líneas celulares de mieloma de ratón como socio de fusión para producir los hibridomas.

En resumen, el protocolo de inmunización fue el siguiente: Ratones BALB/c (hembras sin tratamiento de 8-20 semanas de vida) se inmunizaron intraperitonealmente con una mezcla de cantidades uniformes de KLH-KD y KD- KLH en solución salina tamponada con fosfato (PBS) como un antígeno total de 100 ug por ratón mezclado en proporción de 1:1 de Sigma Adjuvant System (Sigma cat. #6322) en un volumen total de 200 gl por ratón (día 0). El día 21, los ratones se reforzaron con una mezcla de cantidades uniformes de KLH-KD y KD-KLH en PBS como un

antígeno total de 50 ug por ratón mezclado en proporción de 1:1 de Sigma Adjuvant System (Sigma cat. n.° 6322) en un volumen total de 200 pl por ratón. El día 30, se recogieron muestras de sangre para la evaluación del título de anticuerpo específico de KD. El día 51, los ratones se reforzaron para fusión con una mezcla de cantidades uniformes de KLH-KD y KD-KLH en PBS como un antígeno total de 50 ug por ratón mezclado en proporción de 1:1 5 de Sigma Adjuvant System (Sigma cat. #6322) en un volumen total de 200 pl por ratón. En el día 55, los ratones fueron sacrificados mediante cámara de CO2, se recogió sangre a través de punción cardíaca y se recogió el bazo para la producción de hibridoma.

Se hicieron hibridomas fusionando células de mieloma de ratón que son deficientes en adenosina fosforribosiltransferasa (APRT) con células del bazo de ratones inmunizados con antígenos específicos. Un sistema 10 de selección que utiliza medio HAT (hipoxantina, azaserina y timidina) elimina todas las células de fusión excepto las que son APRT+. Los hibridomas satisfactorios deben retener también la cadena pesada de inmunoglobulina (Igh), uno de los loci de la cadena ligera de inmunoglobulina y secretar un anticuerpo funcional.

El medio de producción de hibridoma (IMDM) se preparó combinando lo siguiente: 500 ml de medio de Dulbecco de Iscove Modificado (HyClone SH30259.01), 50 ml de suero fetal bovino (HyClone SH30070.03), 5 ml de L-glutamina 15 (Gibco Invitrogen cat. #25030), 5 ml de aminoácidos no esenciales (Gibco Invitrogen cat. #11140050), 5 ml de piruvato sódico (Gibco Invitrogen cat. #11360070), 5 ml de penicilina-estreptomicina al 0,1% (Gibco Invitrogen cat. #15140148). El medio fue filtrado antes de su uso. El medio de expansión se preparó combinando lo siguiente: 1.000 ml de medio exento de suero (Gibco Hybridoma SFM # 12045), 100 ml de HyClone SuperLow IgG al 10 % definido FBS # SH30898.03 y 10 ml de penicilina/estreptomicina. El medio de congelación fue 45 ml de FBS desactivado por 20 calor (HyClone SH30070.03) y 5 ml de DMSO, esterilizado en filtro. Otros materiales incluyeron lo siguiente: HAT (50x) se obtuvo de Sigma-Aldrich (# HO262); Suplemento de fusión y clonación de hibridoma (50x) (Roche Diagnostics 11 363 735 001); Mancha con azul tripán al 0,4% (Invitrogen cat. # 15250-061 o T10282); PEG 1500 en Hepes 75 mM al 50 % peso/vol. (Roche cat. # 783641 (10783641001). Todos los reactivos excepto HAT y el suplemento de fusión de hibridoma y de clonación se usaron a 37 °C.

25 Tabla 2. Reactivos peptídicos utilizados en inmunización y cribado

Péptido N.°.: SEQ ID NO. Secuencia de péptidos Nombre del péptido Nombre Alternativo

1: 5 RPPGFSPFR bradicinina BK

2: 70 biotina-RPPGFSPFR b-BK

3: 71 RPPGFSPFR-biotina BK-b

4: 72 KLH-RPPGFSPFR KLH-BK

5: 73 RPPGFSPFR-KLH BK-KLH

6: 1 KRPPGFSPFR calidina KD

7: 74 biotina-KRPPGFSPFR b-KD

8: 75 KRPPGFSPFR-biotina KD-b

9: 76 KLH-KRPPGFSPFR KLH-KD

10: 77 KRPPGFSPFR-KLH KD-KLH

11: 6 RPPGFSPF Des-Argg-bradicinina DABK

12: 78 biotina-RPPGFSPF b-DABK

13: 79 RPPGFSPF-biotina DABK-b

14: 80 KLH-RPPGFSPF KLHDABK

15: 81 RPPGFSPF-KLH DABK-KLH

16: 2 KRPPGFSPF Des-Arg10-calidina DAKD

17: 82 biotina-KRPPGFSPF b-DAKD

18: 83 KRPPGFSPF-biotina DAKD-b

19: 84 KLH-KRPPGFSPF KLH-DAKD

20: 85 KRPPGFSPF-KLH DAKD-KLH

21: 3 RRPPGFSPFR Péptido similar a la Calidina KLP

22: 86 biotina-RRPPGFSPFR b-KLP

23: 87 RRPPGFSPFR-biotina KLP-b

24: 88 KLH-RRPPGFSPFR KLH-KLP

25: 89 RRPPGFSPFR-KLH KLP-KLH

26: 90 RRPPGFSPF Péptido similar a des-Arg10-calidina DAKLP

27: 91 biotina-RRPPGFSPF b-DAKLP

28: 92 RRPPGFSPF-biotina DAKLP-b

29: 93 KLH-RRPPGFSPF KLH-DAKLP

30: 94 RRPPGFSPF-KLH DAKLP-b

31: 95 RPPGF bradicinina 1-5 BK15

32: 96 biotina-RPPGF b-BK15

En resumen, tres o cuatro días antes de la fusión, el ratón se reforzó con un antígeno de interés de forma intraperitoneal o intravenosa. El día de la fusión, el ratón fue sacrificado en la cámara de CO2, se recogió sangre mediante punción cardíaca y se extrajo el bazo y se colocó en 10 ml de IMDM exento de suero en una placa de 5 Petri. El mieloma de células socios de fusión: FO (ATCC ref. CRL-1646)/X63 Ag8.653 (ATCC ref. CRL1580) se cultivaron en una fase logarítmica, luego se dividieron un día antes de la fusión (1:2 y 1:5), y se recogieron en tubos de centrífuga de 20 ml, se centrifugaron y el sedimento se resuspendió en 10 ml de IMDM. El sedimento se lavó dos veces con medio IMDM exento de suero. Todas las centrifugaciones se realizan a 1.570 rpm durante 5 min. La resuspensión final fue en 10 ml de IMDM exento de suero. El tejido conectivo se diseccionó fuera del bazo. El bazo 10 se inyectó con 1 ml de IMDM exento de suero precalentado a 37 °C mediante una jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 25. Los esplenocitos se extraen del recubrimiento fibroelástico mediante fórceps y se lavan dos veces en 10 ml de IMDM exento de suero (incluido el centrifugado inicial) y se resuspendieron en 10 ml de IMDM exento de suero. Las células se contaron en un Contador de Células Automático Countess.

Se combinaron células socios de fusión y esplenocitos en un tubo de 50 ml en una relación de 1:2 a 1:10 (por 15 número de células) y se centrifugaron a 970 rpm durante 10 minutos (centrifugado lento) para formar un sedimento suelto. Después del centrifugado "lento", se extrajo el sobrenadante con la precaución de no alterar el sedimento, pero se minimizó la cantidad de líquido sobre las células para no diluir el PEG 1500. El último medio restante se reservó y se volvió a agregar después de que el PEG se agregó (más adelante). Se añadió PEG 1500 precalentado (37 °C, un total de 1 ml) gota a gota al sedimento celular durante un período de tiempo de 1 minuto y las células se 20 mezclaron después de que se añadiera cada gota de PEG. El sedimento se incubó con PEG durante 1 minuto más, seguido de la adición de 10 ml de medio IMDM exento de suero durante 1 minuto, de modo que el primer 1 ml de cada 10 se añadió durante 30 segundos. Las células se sometieron a centrifugación lenta a 970 rpm durante 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

minutos y el sobrenadante se decantó. En cubetas (2) de 100 ml, se añadió lo siguiente: 70 ml de IMDM con 10 % de FBS, 2 ml de HAT y 2 ml de hibridoma y Suplemento de Clonación con Fusión. Las células se resuspendieron en 10 ml de IMDM con 10 % de SFB y se dividieron en tubos (2) de 50 ml (5 ml de células/tubo) y se añadieron 25 ml de IMDM con 10 % de FBS. Los 30 ml resultantes se transfirieron a las cubetas que contenían 70 ml de HBSS/HAT/suplemento de clonación y 200 gl de células/pocillo se pipetearon en placas (10) de 96 pocillos. La fusión estaba lista para el cribado mediante ELISA (50 ul) aproximadamente de 10 a 14 días después, o cuando el medio en los pocillos se vuelve amarillo. Después del cribado primario, los clones positivos se seleccionan, se numeran y se trasladan a una placa de 24 pocillos en 500 ul por pocillo de IMDM con 10% de FBSHI. Los sobrenadantes de hibridoma se cribaron mediante ELISA sobre placas de estreptavidina recubiertas con péptidos biotinilados N- y C-terminales (véase a continuación).

Ejemplo 2: Caracterización y selección de hibridomas que expresan anticuerpos contra ligandos BKR1 humanos

Los sobrenadantes de hibridoma se cribaron mediante ELISA sobre estreptavidina recubierta en placas con péptidos biotinilados N- y C-terminales (véanse, p. ej., los expuestos en la Tabla 2) y luego se determinaron las cinéticas de unión de anticuerpos para clones de hibridoma positivos confirmados.

La capacidad de los anticuerpos en sobrenadantes de hibridoma para unirse al péptido ligando de BKR1 se evaluó con un ensayo ELISA. Se recubrieron péptidos DAKD-biotina o KD-biotina en una placa SA de 96 pocillos en tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante una hora a temperatura ambiente a 5 ug/ml, y se bloquearon los sitios de unión no específicos con seroalbúmina bovina al 1% (BSA) en tampón PBS. Esta placa se usó para realizar el cribado primario y secundario de los sobrenadantes de hibridoma en crudo. Se añadieron sobrenadantes de hibridoma a las placas para unirse a los péptidos KD o DAKD recubiertos. Después de 1 hora de incubación, la placa se lavó y los anticuerpos unidos se detectaron usando anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (HRP-IgG (H+L) anti-ratón de cabra: Jackson ImmunoResearch Labs # 115035-166) y se desarrolló usando sustrato de 2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS) (Roche Diagnostics #11 204 521 001). Los datos se analizaron usando Excel. Los anticuerpos que muestran señales positivas (2 veces más alta que la señal de ELISA de dilución de suero 1:10.000) se seleccionaron y se volvieron a cribar por duplicado para confirmación. Los clones de hibridoma positivos confirmados se seleccionaron y se sometieron a la calificación de la velocidad de disociación de la unión por Biacore.

Para la cinética de unión a anticuerpo, los instrumentos utilizados fueron BIACORE 2000 o BIACORE 3000 (GE Healthcare), diseñados para análisis de interacción biomolecular (BIA) en tiempo real. El chip sensor utilizado fue un chip SA (GE Healthcare) con estreptavidina inmovilizada de forma covalente en una matriz de dextrano carboximetilada. Cada chip sensor tiene cuatro celdas de flujo (Fc) paralelo. Todos los péptidos ligandos biotinilados BKR1 o BKR2 se inmovilizaron en una de las celdas de flujo 2 a 4 (Fc2 a Fc4) en el chip SA para el cribado de la velocidad de disociación de la unión y el cribado de selectividad. La celda de flujo 1 (Fc1) se reservó e inmovilizó con un péptido aleatorio (biotinilado en un extremo) con una longitud de péptido igual o casi igual en comparación con los péptidos de ligando de prueba como control negativo. En los ensayos de cribado, los sobrenadantes de los cultivos celulares de los clones de hibridoma seleccionados mediante cribado primario de variantes humanizadas expresadas transitoriamente se inyectaron sobre péptidos inmovilizados. También se inyectó medio de cultivo celular de hibridoma sobre la superficie del chip como blanco para establecer una línea referencia. Después de restar las señales de Fc1 y las pasadas del tampón en blanco, la velocidad de disociación de los anticuerpos de los sobrenadantes para cada péptido se analizó y se calificó usando el software BIAevaluation. Solamente los clones de anticuerpo que mostraron una velocidad de disociación de unión superior (kd <10-4 1/s) se seleccionaron para subclonación y caracterización adicional. En el análisis cinético, los correspondientes biotina-péptidos identificados en el cribado del anticuerpo de ensayo se inmovilizaron en Fc2 a Fc4 mientras Fc1 con un péptido aleatorio usado como celda de referencia. Cada anticuerpo purificado seleccionado de los cribados se hicieron en una serie diluyendo dos veces en tampón de migración (1 x tampón HBS-EP, GE Healthcare) entre 0,1 y 10 nM. La velocidad de asociación de unión, la velocidad de disociación y la afinidad global se calcularon en BIAevaluation. La cinética de unión a anticuerpo para cada anticuerpo se confirmó siempre en ensayos por triplicado usando Biacore.

Un total de 8 ratones se inmunizaron con KLH-KD/KD-KLH y KLH-DAKD/DAKD-KLH mezclados y los bazos se fusionaron usando los protocolos anteriores. Después del cribado primario de aproximadamente 7.680 clones de hibridoma en ELISA con DAKD-biotina y KD-biotina, solo se confirmaron 76 clones positivos y se seleccionaron para la calificación de la velocidad de disociación de la unión en Biacore 3000/2000 sobre la DAKD-biotina y KD-biotina inmovilizadas en chips de Streptavidina (SA). Entre ellos, 8 clones de hibridoma con velocidad de disociación de unión < de 10-4 se subclonaron, secuenciaron, purificaron y caracterizaron adicionalmente (véase la Tabla 3).

Tabla 3: Resultados de inmunización con KLH-KD/KD-KLH y KLH-DAKD/DAKD-KLH



: ID del clon


: Ensayo B21 C63 F151 F306 I2 18 I22” 154**

Ligando: Péptido usado en el ensayo


: ELISA + + + -1- -1- +


: Biacore - - - - - - NS NS

: □ < Q (KD,M)

: _D


: ELISA +■ + -I- + + + -1- +


: Biacore 4,15 1,42 1,60 1,60 1,10 6,25 NTD NTD

: _Q

: Ó (KD,M) E-11 E-10 E-10 E-10 E-10 E-10

: O


: FLIPR 22-25,9 6,9 6,9 9,4 8,1

DAKD: DAKD (50 nM) (nM)


: ELISA +/- +/- + + -1- +


: Biacore - - - - - - NS NS

: CÜ < Q (KD,M)

: _Q


: ELISA +■ +/- + 4- -1- +


: Biacore * - - - - - NS NS

: _Q

: CÜ (KD,M)

DABK: Q

DABK: FLIPR (nM)



: ID del clon

Ligando: Péptldo usado en el ensayo Ensayo B21 C63 F151 F306 I2 18 I22** 154**

en: b-BK ELISA - " " " " "

Biacore (KD,M): NS NS

BK-b: ELISA -H + + -1- +

Biacore (KD,M): 8,57 E-09 NS NS

en: FLIPR (nM)

o: b-KD ELISA +

Biacore (KD,M): NS NS

KD-b: ELISA -I- + -I- + + + -1- +

Biacore (KD,M): 8,4 E-11 2,21 E-10 2,9 E-11 2,9 E-11 7,8 E-11 7,53 E-10 NTD NTD

KD (15nM)M): FLIPR (nM) 12 3,0 3,0 7,3 8,3 25 30

NA = no aplicable, negativo en ELISA NS = unión no especifica NTD = no se determinó

unión residual (baja RU en Biacore)

Basado en los resultados observados en la Tabla 3, se seleccionaron cinco clones con secuencias únicas para estudios cinéticos. Estos anticuerpos eran muy selectivos para las uniones DAKD-biotina, KD-biotina, DAKLP-biotina 5 y KLP-biotina (véase la Tabla 4). No se unen a otros péptidos de cinina ni a péptidos biotinilados en el N-terminal.

Tabla 4. Resumen de la cinética de los candidatos de anticuerpos anti-DAKD/KD seleccionados

: DAKD-b KD-b '

Anticuerpo: Kdis KD Kdis KD '

' C63: 9,36E-05 1,42E-10 1,00E-04 2,21 E-10 '

' B21: 9,89E-05 4,15E-11 2,04E-04 8,40E-11 '

' F151: 1,36E-04 1,62E-10 2,00E-05 2,88E-11 '

' I22: 3,19E-04 2,17E-10 2,10E-05 4,40E-12 '

' I54: 3,06E-05 9,53E-12 3,88E-05 1, 12E-11 '

: DAKLP-b KLP-b '

: kdis KD Kdis KD '

' C63: n/b n/b n/b n/b '

' B21: 2,30E-04 1,34E-10 1,12E-04 1,92E-10 '

' F151: 6,58E-05 2,12E-10 <1,0E-06 »1,66E-11 '

' I22: <1,0E-06 =1,83E-12 1,03E-05 1,82E-12 '

' I54: 5,66E-05 1,17E-11 6,04E-05 9,56E-12 '

n/b = no hay unión

Se realizó una inmunización adicional con una matriz de inmunógenos (véase la lista de péptidos, Tabla 2) para generar anticuerpos que bloquean los ligandos BKR1 de roedor, DABK y DAKD así como los anticuerpos con otras 5 especificidades de unión contra diferentes miembros de la familia cinina de péptidos. La Tabla 5 enumera las secuencias pesada y ligera de los anticuerpos generados.

Anticuerpo: Isotipo SEQ ID NO. Secuencia de la Gadena pesada

B21: lgG1/k 97 LP EF OVKLEE SGAELVRSGASVKLSC TASGFHIKDYYLHWVKORPEOGLEWIGWIDPEHGDT GYARKFQGKATMTADTS SWTVYLHLSSLTSEDTAVYYFNAWEYD GY YD LD YÍÍGOGTSVTVS S

AKTTPPSVYGSS

C63: 98 LPEFOVOLEESGGGLVOPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVROSPEKGLEWVAEIRSKSH NYATHYAE£VKGRFTI£RDD £K£ SVYLQMWNLRAED TGIYYCIGEDYGGDYÍÍGOGT SVTV

£ SAKTTPPSVYGSS

F151: 99 LPEFEVOLEESGPELVKPGTSVKVSCKASGYSFTDYNIYWVKOSHGKSLEWIGYFDPYHGHT GYNQKFRGKATLTVDKS3 5TAFMHL3 5LT3 DD£AVY YCANYYRY DD HAMD YÍÍGOGT SVTVS3

AKTTPPSVYGSS

I22: 100 LP EF EVKLOE £GAELVRS GASVKLSC TASGFH IKDY YMHWVKORPEOGLEWIGWVDPENGDS DYAPKFQGKATMTADTS5NTVYLQF5SLT5EDTAVYYCNAFEYDGNY5SLDFWGOGTSVTVS

SAKTTPPSVYGSS

154: 101 LP EF EVKLEOSGAELVRS GASVKLSC TASGFH IKDY YMHWVKORPEOGLEWIGWVDPENGDS DYA.PKFOGKATMTADTSSNTVYLQFSSLTSEDTAVYYCNAFEYDGMYSPLDFWGOGTSVTVS

SAKTTPPSVYGSS

B21: mlgG1/K 38 EVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFHIKDYYLHWVKQRPEOGLEWIGWIDPENGDTGYAR KF OGKATMTADTSSNTVYLHLSSLTSED TAVY YFNAWEYD GY YD LD YHGQGTSVTVSSAKTT PPS

C63: 45 EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWRQSPEKGLEWA.EIRSKSWMYATHY AE SVKGRFTISRDD SKS SVY LQMHWLRAED TGIY YCIGED YGGD YWGQGT SVTVS SAKTTPP S

F151: 19 EIQLQQSGPELVKPGTSVKVSCKASGYSFTDYNIYWKQSHGKSLEWIGYFDPYNGMTGYMQ KF RGKATLTVDKS S STAFMH LS SLTS DDSAVYYCAJIYY RY DD HAMD YHGQGTSVTVSSAKTT PPS

I22: 53 EVQLQQSGAELVR3GASVKLSCTA£GFNIKDYYMHm7KQRPEOGLEHIGm7DPENGDSDYAP KF QGKATMTADT SSNTVY LQFS SLTS ED TAVY YCNAFE YD GNY S PLDFWGQGT SVTVS SAKT TPPS

154: 61 EVQLQQ3GAELVRS GASVKLSC TASGFHIKDY YMHWVKQRPEOGLEWIGWDPENGDS DYAP KF QGKATMTADT SSNTVY LQFS SLTS ED TAVY YCNAFE YD GHY S PLDFWGQGT SVTVS SAKT TPPS

O: ó

p_: z

Oí: o

o: o Q_ o Secuencia de la cadena ligera

<: V)

B21: 102 ELDIVMTQTTLTL5VTIGQPA.5ISCKSSQ5LLY5NGKTYLNWLL0RPG05PKRLIYLVSKLD SGVPDRFTGSGSGTDFTLKIIRVEAEDLGVYY CLOGTHFPYTFGGGTKLEIKRADAAPTV3I FPP3KLELY

C63: 103 ELDIVLTQSPSS LAVSVG EKVTMS CK S S Q5 LL Y5 S D ORN Y LAWY OORSGOSPKLLIYWAS T R ES GVP D RF TG S G S G TD FT LTIS S VRAEDLAVYYCOOYY SYPYTFGGGTKLEIKRADAAPT VS IFPPSKLELY

F151: lgG1/k 104 EL DIVMTQTP S S LAVSVG EKVTMS CK S S QS LL YT S N QKNY LAWY QQ KP GQ S P KP LIYWAS T R ES GVP D RF TG S G S G TD FT LT 13 S VKAED LAIY YC 00 Y Y S Y P WTF GG GT KL EI KRADAAP TVD IFPPSKLELY

I22: 105 ELDIVITOTTLSLSyPIGQPA,SISCKSRQSLLYSHGETYLHWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLD S GVPDRFTG3R5GTDFTLKIS RVE5 E DL GVYY CMOG TH FP YT FG GG TK LEIKRADAAP TV SI FPPSKLELY

154: 106 ELDIVITQSTLTLSVPIGQPA.SISCKSSQSLLYSNGETYLNWLLORPGOSPKRQIYLVSKLD S GVP DRFTGSRSGTDFTLKISRVE S E DL GVYY CMOG TH FP YT FG GG TK LEIKRADAAP TV SI FPPSKLELY

B21: 39 DWMTOTPLTLSVTIGOPASISCKSSOSLLYSNGKTYLNWLLORPGOSPKRLIYLVSKLDSG VPDRFTGSGSGTDFTLKIIRVEA.EDLGVYYCLQGTHFPYTFGGGTKLEIKRADAAPT

C63: mlgG1/K 46 DIVMS Q S P S S LAVSVG EKVTMSCK S S QS LL YS S D QRNYLAWY QQ RS GQ S PKLLIYWASTRES GVP D RF TG S G S G TD FT LTIS SVKAED LAVY YCQQYY SYPYTFGGGTKLEIKRADAAP T

F151: 26 DI'VMSQ S P S SLAVSVG EKVTMSCK S S QS LL YS S N QKNY LAWY QQKPGQSPKPLIYKASTRES GVP D RF TG S G S G TD FT LT IS S VKAED LAI Y YC QQ Y Y S Y PWTFGGGTKL EIKRADAAP T

I22: 54 DIVMTQSPSSLSVSA.GEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWY QQKPGQPPKLLIYGACTREC gvpdrftgsgsgtdftltissvqaedlavyycqndhsypltfgagtklelkradaa.pt

154: 62 DWMTOTPLTLSyPIGOPASISCKSSOSLLYSNGETYLNWLLORPGOSPKRLIYLVSKLDSG VPDRFTGSRSGTDFTLKIS RVE S E DL GVYYCMQG TH FP YT FG GG TK LEIKRADAAP T

Subrayado sencillo = región CDR; doble subrayado = aminoácidos característicos para identificar las CDR

Ejemplo 3: Generación de anticuerpos sustitutos para estudios en animales murinos

Un anticuerpo sustituto para ser utilizado en estudios de animales murinos necesitaba poder unirse y neutralizar 5 ligandos de BKR1 de roedores, DABK y DAKLP (equivalente de ratón de DAKD). Con el fin de generar el anticuerpo sustituto requerido, los ratones primero se inmunizaron con DABK y/o DAKD con KLH directamente conjugado con los N-terminales de los péptidos. Los clones de hibridoma positivo de biotina-DABK/biotina-DAKD (biotinilación directamente en el N-terminal del péptido) mediante cribado ELISA se seleccionaron para el aumento proporcional y la purificación. Los anticuerpos enumerados en la Familia 7 (véase la Tabla 12) que demostraron altas afinidades de 10 unión a biotina-DABK, biotina-DAKLP y biotina-DAKD se seleccionaron basados en el ensayo de unión directa Biacore (Tabla 10). Sin embargo, estos anticuerpos de la Familia 7 no mostraron unión a los péptidos DABK y DAKD nativos no modificados en ELISA competitivo, y carecían de funcionalidad neutralizante en un ensayo de afluencia de calcio con el Sistema Funcional de Cribado de Fármacos (Functional Drug Screening System (FDSS), en inglés)

5

10

15

20

25

30

(Hamamatsu Photonics K.K., Japón). Además, la biotina-DABK y la biotina-DAKD perdieron completamente la bioactividad en el ensayo FDSS en comparación con los péptidos DABK y DAKD nativos no modificados (datos no mostrados).

Se formuló la hipótesis de que la conjugación directa N-terminal de KLH y biotina impedía la confirmación nativa de que se formaran DABK y DAKD. Con el objetivo de restaurar la conformación nativa en péptidos conjugados con KLH y biotina, se diseñaron y se agregaron enlazadores al N-terminal de DABK y/o DAKD con la intención de "amortiguar" los efectos de la conjugación de KLH/biotina en la conformación del péptido. En primer lugar, se intentaron y probaron los enlazadores de poliglicina debido a sus propiedades simples, no polares y neutrales basadas en resultados de modelización. Los resultados del ensayo FDSS indicaron que el enlazador gly-gly-gly (3G) era el mejor según su capacidad para restaurar las bioactividades de los péptidos DABK y DAKD conjugados con KLH y biotina (datos no mostrados). Por lo tanto, se eligió KLH-3G-DABK para inmunizar ratones. Y se usaron biotina-3G-DABK y biotina-3G-KD en ensayos de cribado basados en unión (ELISA y Biacore). Varios anticuerpos específicos DABK/DAKD (Familia 3, véase la Tabla 13) se identificaron en esta nueva ronda de selección de hibridoma de anticuerpos sustitutos. El EE1 se seleccionó como el principal anticuerpo sustituto basado en sus superiores afinidad de unión y actividad de neutralización frente a DABK/DAKD nativo y la falta de reactividad cruzada con otros péptidos (véanse las Tablas 6-12).

Se generaron anticuerpos con diferentes especificidades cuando se usaban los diferentes inmunógenos enumerados en la Tabla 13. Los anticuerpos de la Familia 4 eran específicos para los ligandos del receptor BKR2, para BK y para KD. Los anticuerpos de la familia 5 se unen específicamente al C-terminal de BK y DABK. Los anticuerpos de familia 6 se unen a BK, DABK y DAKD pero no se unen a KD.

Se evaluaron enlazadores adicionales para la unión al anticuerpo EE1 sustituto por su capacidad para ajustarse en la bolsa de unión DABK/DAKD en EE1, que incluyen enlazadores de poli-glicina más largos, enlazadores de poli- alanina y enlazadores preexistentes tales como enlazador de polietilenglicol (PEG2) y enlazador de ácido aminohexanoico (Ahx) (un enlazador inerte de 6 carbonos). Todos los péptidos enlazadores se sintetizaron a medida por Abgent (San Diego, CA). Todos los péptidos biotinilados ensayados con enlazadores (biotina-enlazador- DABK/DAKD) se unieron bien a EE1, lo que indica que cualquiera de los enlazadores N-terminal inertes ayudaba a los péptidos DABK y DAKD a retener su conformación bioactiva nativa cuando se conjugaba con biotina y otras moléculas. Por el contrario, no se observó ninguna unión o una deficiente unión con EE1 con biotina-DABK y biotina- DAKD, péptidos que tienen conjugación directa de biotina N-terminal (véase la Figura 1).

La cinética de unión de los anticuerpos generados se resume en las Tablas 5-11. Después, todos los anticuerpos generados se clasificaron en familias y sus especificidades de unión se resumen a continuación en la Tabla 12. La Tabla 13 proporciona secuencias de cadena pesada y ligera de anticuerpos que se colocaron en la familia 1 y en la familia 2 en función de su especificidad de unión (véase la Tabla 12).

Tabla 6. Resumen de cinética de anticuerpos para péptidos b-3G-DABK y b-3G-DAKD

Clon: b-3G-DABK b-3G-DAKD '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

DD20: 1,5E+06 2,3E-04 1,6E-10 4,7E+05 4,0E-04 8,8E-10 '

UR11: 2,0E+05 3,0E-04 1,5E-09 3,0E+05 1,6E-03 5,2E-09 '

DD7: 2,3E+05 6,0E-04 2,7E-09 2,1 E+05 1,4E-03 6,6E-09 '

EE1: 4,4E+05 1,2E-04 2,8E-10 4,4E+05 2,0E-04 4,5E-10 '

EE36: 4,3E+03 5,3E-04 1,2E-07 n/b n/b n/b '

UR29: n/b* n/b n/b n/b n/b n/b '

JK3: 3,44E+05 3,91 E-05 1, 14E-10 3,18E+05 5,07E-05 1,60E-10 '

LR4: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

LR16: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

Clon: b-3G-DABK b-3G-DAKD '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

LR6: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR12: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

'nr1: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' NR15: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

n/b* = no hay unión específica, n/b = no hay unión

Tabla 7. Resumen de cinética de anticuerpos para péptidos b-3G-DAKLP y b-3G-BK

Clon: b-3G-DAKLP b-3G-BK '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

DD20: 3,1 E+05 6,1 E-04 2,0E-09 3,0E+05 7,1 E-04 2,3E-09 '

'UR11: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' DD7: 1,7E+05 2,1 E-03 1,2E-08 1,3E+05 8,8E-04 6,8E-09 '

'EE1: 4,2E+05 2,9E-04 6,8E-10 2,5E+05 2,6E-03 1,1 E-08 '

EE36: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

UR29: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

JK3: ND ND ND n/b n/b n/b '

' LR4: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR16: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR6: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR12: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

'NR1: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' NR15: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

n/b = no hay unión; ND = no se determinó

Clon: b-3G-KLP b-3G-KD '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

' DD20: 3,8E+05 5,7E-04 1,5E-09 n/b n/b n/b '

' UR11: n/b n/b n/b 1,2E+05 1,3E-03 1,1 E-08 '

' DD7: 1,5E+05 2,1 E-03 1,5E-08 2,2E+05 1,8E-03 8,4E-09 '

' EE1: 4,0E+05 2,1 E-03 5,3E-09 n/b n/b n/b '

' EE36: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' UR29: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' JK3: ND ND ND n/b n/b n/b '

' LR4: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR16: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR6: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR12: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

'NR1: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

NR15: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

n/b = no hay unión; ND = no se determinó

Tabla 9. Resumen de cinética de anticuerpos para péptidos DABK-b y DAKLP-b

Clon: DABK-b DAKLP-b '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

' DD20: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' UR11: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' DD7: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' EE1: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' EE36: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' UR29: 1,5E+06 5,8E-05 3,9E-11 3,0E+06 2,1 E-03 6,8E-10 '

' JK3: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

Clon: DABK-b DAKLP-b '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

' LR4: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR16: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR6: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR12: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

'NR1: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' NR15: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

n/b = no hay unión; ND = no se determinó

Tabla 10. Resumen de cinética de anticuerpos para péptidos BK-b y b-BK

Clon: BK-b b-BK '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

DD20: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

'UR11: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' DD7: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

'EE1: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

EE36: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' UR29: 1,5E+06 1,0E-04 7,2E-11 n/b n/b n/b '

' JK3: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR4: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR16: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR6: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR12: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

'NR1: n/b n/b n/b 8,69E+04 8,77E-04 1,01 E-08 '

' NR15: n/b n/b n/b 2,95E+05 1,09E-03 3,68E-09 '

n/b = no hay unión; ND = no se determinó

Clon: b-DABK b-DAKD '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

' DD20: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' UR11: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' DD7: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' EE1: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' EE36: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' UR29: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' JK3: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR4: 1,48E+05 1,04E-03 7,15E-09 3,27E+05 7,63E-04 2,36E-09 '

' LR16: 4,34E+05 4,38E-05 1,01 E-10 2,07E+05 3,39E-03 1,65E-08 '

' LR6: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' LR12: 2,91 E+05 5,40E-04 3,63E-09 n/b n/b n/b '

'NR1: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

NR15: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

n/b = no hay unión; ND = no se determinó

Tabla 12. Resumen de cinética de anticuerpos para péptidos b-DAKLP y b-KD

Clon: b-DAKLP b-KD '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

' DD20: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' UR11: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' DD7: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' EE1: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' EE36: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' UR29: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

' JK3: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

Clon: b-DAKLP b-KD '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

' LR4: 1,84E+05 2,58E-04 1,40E-09 n/b n/b n/b '

' LR16: 2,34E+05 1,11 E-04 4,74E-10 n/b n/b n/b '

' LR6: 6,80E+05 4,01 E-04 7,45E-10 n/b n/b n/b '

' LR12: n/b n/b n/b n/b n/b n/b '

'NR1: n/b n/b n/b 1,66E+05 5,81 E-03 3,56E-08 '

' NR15: n/b n/b n/b 7,66E+05 5,66E-03 7,41 E-09 '

n/b = no hay unión; ND = no se determinó

Tabla 13. Resumen de la generación de anticuerpos péptido anti-cinina

Familias de Anticuerpos: Immunógenos Anticuerpos representativos Especificidad de la unión

Familia 1: KD-KLH + KLH-KD o DAKD- KLH + KLH-DAKD F151, B21, I22, I54 N-terminal de DAKD (DAKLP) y KD (KLP)

Familia 2: KD-KLH + KLH-KD o DAKD- KLH + KLH-DAKD C63 N-terminal de DAKD y KD

Familia 3: KLH-3G-DABK EE1, DD20, JK3 C-terminal de DABK y DAKD (DAKLP)

Familia 4: KLH-BK y BSA-BK NR15, NR1 C-terminal de BK y KD

Familia 5: KLH-BK UR29 N-terminal de BK y DABK

Familia 6: KLH-BK UR11 BK, DABK y DAKD

Familia 7: KLH-DABK o KLH-DAKD LR4, LR6, LR12 y LR16 no hay unión con péptidos nativos

Ejemplo 4: Caracterización del agotamiento del ligando des-arg-cinina usando movilización de calcio

5 Se usó un ensayo funcional para caracterizar adicionalmente las siete familias de anticuerpos generados. La señalización del receptor B1 de bradicinina es Gq acoplada, por lo tanto, la activación del receptor puede controlarse usando la activación Gq de IP3 y aguas abajo la movilización de calcio. Para medir la movilización del calcio se usaron células HEK mBKR1 (receptor B1 recombinante de bradicinina de ratón) o MRC5 (expresión endógena de receptores B2 de bradicinina; (ATCC CCL-171)).

10 En resumen, el gen Bdkrb1 de ratón (secuencia proporcionada a continuación) se amplificó a partir de ADNc de pulmón de ratón (Biochain, Cat. # C1334152) usando cebadores de PCR 804_cGWY_F:

5'-AAAAGCAGGCTTAGGAGCGGCCGCCATGGCGTCCCAGGCCTCGCTG-3' (SEQ ID NO: 107) y 804_cGWY_R: 5'-CAAGAAAGCTGGGTCGGATCCTTATAAAGTTCCCAGAACCCTGGTC-3' (SEQ ID NO: 108) y Pfu polimerasa (Agilent Technologies, Cat. # 600264) y se clonó en pDONR201 usando mezcla de enzima PB clonasa (Invitrogen, 15 cat. #11789-020). En paralelo, el vector de expresión pEAK8 (EDGE Biosystems) se modificó insertando una etiqueta HA N-terminal (GCATACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT, GenBank SEQ ID NO: 109 CY100443) en

pEAK8 linealizado con EcoRI y HindIII (vector pEAK8-nHA) y posterior inserción de la casete B de pasarela (Invitrogen, Cat. #11828-029) en pEAK8_nHA digerido con EcoRI y Notl y extremos romos con polimerasa Klenow (NEB, cat. #M0210S) dando como resultado el vector pEAK8_nHA_DEST. Después, se subclonó Bdkrb1 de ratón en pEAK8_nHA_DEST usando LR clonasa (Invitrogen, cat. #11791-100). Las células 293-PSC se transfectaron 5 luego con el plásmido pEAK8-Bdkrb1 usando reactivo de transfección Fugene 6. Las células se sometieron a selección con antibióticos (puromicina) 24 horas después de la transfección, y la selección se mantuvo para generar una línea celular estable. La presencia del gen Bdkrb1 en las líneas celulares estables resultantes se confirmó mediante RT-PCR en tiempo real y mediante electroforesis en gel de agarosa. La expresión de la superficie celular del receptor B1 de bradicinina se realizó usando un anticuerpo contra la etiqueta HA N-terminal (Covance, cat. 10 #MMS-101P) en el B1R de Bradicinina en un instrumento FACS. La actividad funcional del receptor B1 de

bradicinina se demostró en el ensayo de movilización de calcio con agonistas selectivos.

Gen Bdkrb1 subclonado en células:

ATGGCGTCCCAGGCCTCGCTGAAGCTACAGCCTTCTAACCAAAGCCAGCAGGCCCCTCCCAACATCACCTC CTGCGAGGGCGCCCCGGAAGCCTGGGATCTGCTGTGTCGGGTGCTGCCAGGGTTTGTCATCACTGTCTGTT TCTTTGGCCTCCTGGGGAACCTTTTAGTCCTGTCCTTCTTCCTTTTGCCTTGGCGACGATGGTGGCAGCAG CGGCGGCAGCGCCTAACCATAGCAGAAATCTACCTGGCTAACTTGGCAGCTTCTGATCTGGTGTTTGTGCT GGGCCTGCCCTTCTGGGCAGAGAACGTTGGGAACCGTTTCAACTGGCCCTTTGGAAGTGACCTCTGCCGGG TGGTCAGCGGGGTCATCAAGGCCAACCTGTTCATCAGCATCTTCCTGGTGGTGGCCATCAGTCAGGACCGC TACAGGTTGCTGGTATACCCCATGACCAGCTGGGGGAACCGGCGGCGACGGCAAGCCCAAGTGACCTGCCT GCTCATCTGGGTAGCTGGGGGCCTCTTGAGCACCCCCACGTTCCTTCTGCGTTCCGTCAAAGTCGTCCCTG ATCTGAACATCTCTGCCTGCATCCTGCTTTTCCCCCACGAAGCTTGGCACTTTGTAAGGATGGTGGAGTTG AACGTTTTGGGTTTCCTCCTCCCATTGGCTGCCATCCTCTACTTCAACTTTCACATCCTGGCCTCCCTGAG AGGACAGAAGGAGGCCAGCAGAACCCGGTGTGGGGGACCCAAGGACAGCAAGACAATGGGGCTGATCCTCA CACTGGTAGCCTCCTTCCTGGTCTGCTGGGCCCCTTACCACTTCTTTGCCTTCCTGGATTTCCTGGTCCAG GTGAGAGTGATCCAGGACTGCTTCTGGAAGGAGCTCACAGACCTGGGCCTGCAGCTGGCCAACTTCTTTGC TTTTGTCAACAGCTGCCTGAACCCACTGATTTATGTCTTTGCAGGCCGGCTCTTTAAGACCAGGGTTCTGG GAACTTTATAA (GenBank NM_007539; SEQ ID NO:110)

Células HEK mBKR1 o MRC5 se sembraron en placas de fondo transparente de 384 pocillos en medio de cultivo, y 15 se dejaron fijar durante la noche. Luego se eliminó el medio de cultivo, las células se lavaron en tampón de ensayo (HBSS, HEPES 20 mM, probenecida 2,5 mM), luego se cargaron de colorante con Fluo-4AM 0,5 uM, un colorante sensible al calcio permeable a las células, con ácido plurónico al 0,04% durante 1 hora a 37C. El éster de AM se escinde y el colorante del calcio se retiene en el citoplasma. Después de 1 hora, las células se lavaron para eliminar el exceso de colorante, y en las células quedaron 20 ul de tampón residual. Los tratamientos se agregaron como 20 soluciones 2x en el sistema funcional de cribado de fármacos de Hamamatsu (FDSS), y la movilización de calcio se controló cinéticamente durante al menos 4 minutos. La activación del receptor B1R o B2R da como resultado la activación mediada por Galfa q de la fosfolipasa C y la movilización de calcio mediada por IP3. El colorante Fluo-4 experimenta quelación del calcio liberado y se observa un fuerte cambio en la fluorescencia. Los resultados se exportaron como unidades de fluorescencia relativa máxima-mínima para normalizar las diferencias entre la 25 densidad celular o la carga de colorante a través de la placa.

Cada día se determinó la potencia de ligando ejecutando las curvas de respuesta a la concentración del ligando, y se seleccionó una concentración de EC70-80 aproximada de ligando para la incubación con anticuerpos. Se seleccionó una concentración de EC80 porque está en el intervalo lineal de la curva de detección y había un amplio margen para ver una disminución con antagonistas o anticuerpos que agotan el ligando. La curva dosis respuesta de 30 los anticuerpos se dejaron unir a un ligando de concentración EC80, y el grado de agotamiento del ligando se

controló usando un cambio en la fluorescencia. Los resultados se normalizaron para tampón y respuesta del ligando EC80, y se calculó una EC50 para el agotamiento del ligando. Los resultados se informaron luego como la relación molar que corresponde a la concentración de Anticuerpo que reduce agotamientos del 50% de la respuesta del ligando (es decir, EC50 de Ab) dividido entre la concentración de ligando utilizada. El máximo teórico debería ser 0,5 35 porque una unidad de anticuerpo debería poder agotar 2 unidades de ligando pero, en la práctica, se han visto

valores más bajos, aunque eso puede ser un reflejo de la insensibilidad del procedimiento de detección para bajas concentraciones de ligando, en lugar de una restricción estequiométrica para el anticuerpo. Los resultados de estos experimentos se exponen en las Tablas 14-16.

Todos los anticuerpos de la familia 1 y de la familia 2 (véase la Tabla 13) demostraron una superior cinética de unión 40 mediante Biacore (Tabla 3) y actividad de neutralización medida mediante movilización de calcio frente a péptidos DAKD y KD (Tablas 14 y 15). Los anticuerpos se analizaron adicionalmente para determinar su estabilidad térmica y la idoneidad de la secuencia para la humanización. El F151 se anticipó para la humanización porque era térmicamente estable, no había restos problemáticos en las regiones CDR y reaccionaba de forma cruzada con el ligando KLP y DAKLP de ratón.

Tabla 14: Caracterización del agotamiento del ligando des-arg-cinina usando la movilización de calcio en células mBKRI de HEK

: Agotamiento de DABK Agotamiento de DAKD Agotamiento de DAKLP

Familia: Anticuerpo DABK (Relación Molar Media) SD de la Relación Molar n DAKD (Relación Molar Media) SD de la Relación Molar n DAKLP (Relación Molar Media) SD de la Relación Molar n

1: F151 IA100 5 0,08 0,04 7 0,15 0,04 4

1: B21 IA100 1 0,15 0,04 3 0,67
1

1: 122 IA100 1 0,07 0,02 3 0,21
1

1: 154 IA100 1 0,15 0,05 3 0,35
1

2: C63 IA100 1 0,08 0,02 3 5,85 1

3: EE1 1,03 0,52 5 0,86 0,52 3 0,57 0,36 4

3: DD20 3,45 1,34 3 1,82 0,76 3 1,31 0,86
3

: DD7 2,18 0,45 3 4,22 0,95 3 5,34 1,22 2

3: JK3 1,86 0,03 2 ND 1,44 0,03 2

4: MBK3 ND ND ND

4: NR15 ND ND ND

4: NR1 ND ND ND

5: UR29 0,60 0,12 5 IA200 3 IA300 4

6: UR11 6,99 1,61 3 19,65 14,95 3 11,09 3,13 2

7: LR4 IA100 1 IA400 1 IA400 1

7: LR6 IA100 1 IA100 1 ND

7: LR12 IA100 1 IA100 1 ND

7: LR16 IA100 1 IA100 1 ND

Los anticuerpos se preincubaron con una concentración establecida de ligando, generalmente un EC70-80 para activar la movilización de calcio en el receptor B1 de Bradicinina. La mezcla anticuerpo-ligando se añadió a células mBKR1 de HEK cargadas previamente con un colorante sensible al calcio (Fluo-4AM o Fluo-8AM) en el instrumento FDSS6000 de Hamamatsu, y se controló la movilización de calcio. Los datos se exportaron como una fluorescencia relativa máximo-mínimo de la respuesta biológica, y se calculó la IC50 para el agotamiento del ligando usando ajuste de curva sigmoidal en un Graph Pad Prism V4.03. Los datos se informaron como la relación molar para el agotamiento del ligando mediante el anticuerpo para estandarizar las diferentes concentraciones de ligando que se usaron en los diversos experimentos.

i i

Relación Molar para el agotamiento de ligando = [IC50 de Anticuerpo]/[Ligando]

SD = desviación estándar; ND = no determinado; IA100 = Inactivo a 100 nM; IA200 = inactivo a 200 nM;

: Agotamiento de DABK Agotamiento de DAKD Agotamiento de DAKLP

i i

IA300 = Inactivo a 300nM; IA400 = Inactivo a 400nM

Tabla 15: Caracterización del agotamiento del ligando de cinina usando la movilización de calcio en células de fibroblastos de pulmón fetal MRC5

: Agotamiento de BK Agotamiento de KD Agotamiento de KLP

Familia: Anticuerpo BK (Relación Molar Media) SD de la Relación Molar n KD (Relación Molar Media) SD de la Relación Molar n KLP (Relación Molar Media) SD de la Relación Molar n

' 1: F151 IA100 5 0,14 0,05 5 0,15 0,02 3 '

' 1: B21 IA100 1 0,33 1 ND

' 1: I22 IA100 1 0,22 1 ND

' 1: I54 IA100 1 0,30 1 ND

' 2: C63 IA100 1 0,23 1 ND

' 3: EE1 IA300 4 IA300 4 IA150 1 '

' 3: DD20 IA600 4 IA600 5 IA150 1 '

: DD7 7,11 3,62 3 17,37 12,11 3 4,27 1 '

' 3: JK3 IA300 2 IA300 2 ND

' 4: MBK3 22,11 14,10 9 3,46 2,64 6 9,45 1 '

' 4: NR15 15,26 11,51 5 4,34 2,55 5 11,18 1 '

' 4: NR1 39,31 1 42,15 1 32,58 1 '

' 5: UR29 1,15 0,86 5 0,30 0,08 2 0,41 1 '

' 6: UR11 5,41 0,80 2 25,21 4,54 2 1,53 1 '

' 7: LR4 IA100 1 IA100 1 ND

' 7: LR6 IA100 1 IA100 1 ND

' 7: LR12 IA100 1 IA100 1 ND

' 7: LR16 IA100 1 IA100 1 ND

5

10

15

20

25

30

35

40

Los anticuerpos se preincubaron con una concentración establecida de ligando, generalmente un EC70-80 para activar la movilización de calcio en el receptor B2 de Bradicinina. La mezcla anticuerpo-ligando se añadió a fibroblastos de pulmón fetal MRC5 (ATCC CCL-171) cargados previamente con un colorante sensible a calcio (Fluo- 4AM o Fluo-8AM) en el instrumento FDSS6000 de Hamamatsu, y se controló la movilización de calcio. Los datos se exportaron como una fluorescencia relativa máximo-mínimo de la respuesta biológica, y se calculó la IC50 para el agotamiento del ligando usando ajuste de curva sigmoidal en Graph Pad Prism V4.03. Los datos se informaron como la relación molar para el agotamiento del ligando por el anticuerpo para estandarizar la diferente concentración de ligando que se usó en los diversos experimentos.

Relación Molar para el agotamiento de ligando = [IC50 de Anticuerpo]/[Ligando]

SD = desviación estándar; ND = no se determinó; IA100 = Inactivo a 100 nM; IA150 = Inactivo a 150 nM; IA300 = Inactivo a 300nM; IA400 = Inactivo a 400 nM; IA600 = Inactivo a 600nM

Ejemplo 5: Ingeniería de F151: Humanización, estabilización y mutación de motivos de secuencia no deseados

1. HUMANIZACIÓN

El protocolo de humanización utilizado se ha descrito en PCT/US08/74381 (US20110027266), incorporado en el presente documento en su totalidad por referencia. Las secuencias de variable ligera (VL) y variable pesada (VH) de F151 de murino se usaron para construir un modelo de homología de LC y HC anti-DAKD/KD de F151 en Molecular Operating Environment (MOE; v. 2009.10; Chemical Computing Group). Se utilizaron los siguientes moldes: entramado de la cadena ligera-1SBS (93% de identidad en las regiones del entramado), entramado de la cadena pesada-2VXT (84% de identidad en las regiones del entramado), L1-1LVE (93% de identidad), L2-1EEU (100% de identidad), L3-2R56 (93% de identidad), H1-1NJ9 (95% de identidad), H2-2VXU (76% de identidad) y H3-1HIL (49% de identidad). Los moldes estaban disponibles de RCSB Protein Data Bank que se encuentra en la red mundial en rcsb.org, un sitio web administrado por Rutgers y la Universidad de California San Diego (Berman, H.M.; Westbrook J.; Feng. Z.; Gilliland, G.; Bhat, T.N.; Weissig, H.; Shindyalov, I.N.; Bourne, P.E., The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 235-242). El modelo de homología fue posteriormente minimizado de energía utilizando los procedimientos estándares implementados en el MOE. Posteriormente se realizó una simulación de dinámica molecular (MD) del modelo de homología 3D minimizado del F151 de murino, con restricciones en la estructura principal de la proteína a temperatura de 500 K durante 1,1 nanosegundos (ns) en el disolvente implícito generalizado de Born. Diez conformaciones diversas se extrajeron de esta primera ejecución de MD cada 100 picosegundos (ps) durante el último 1 ns. Estas diversas conformaciones se sometieron luego cada una a una simulación de MD, sin restricciones en la estructura principal de la proteína y a 300 K de temperatura, durante 2,3 ns. Para cada una de las 10 ejecuciones de MD, las últimas 2.000 instantáneas, una cada ps, de la trayectoria de MD se usaron luego para calcular, para cada aminoácido de F151 de murino, sus desviaciones del valor cuadrático medio (rmsd) en comparación con una posición medoidea de referencia. Al comparar el rmsd promedio en las 10 ejecuciones de MD separadas de un aminoácido dado con el rmsd promedio general de todos los aminoácidos del F151 de murino, se decide si el aminoácido es lo suficientemente flexible, como se observó durante la MD para considerarse que es probable que interactúe con los receptores de células T y sea responsable de la activación de la respuesta inmune. Se identificaron 62 aminoácidos como flexibles en el anticuerpo F151 de murino, excluyendo la CDR y su inmediata vecindad de 5 Á.

El movimiento de los 28 aminoácidos de F151 de murino más flexibles, durante las 20 ns (10 x 2 ns), se comparó entonces con el movimiento de los aminoácidos flexibles correspondientes de 49 modelos de homología de la línea germinal humana, para cada uno de los cuales se ejecutaron las simulaciones de MD de 10 x 2 ns. Los 49 modelos de línea germinal humana se construyeron combinando sistemáticamente las 7 cadenas ligeras de línea germinal humana más comunes (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) y las 7 cadenas pesadas de líneas germinales humanas más comunes (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6). El anticuerpo de la línea germinal humana vk1-vh1b mostró una similitud de 0,80 4D de sus aminoácidos flexibles en comparación con los aminoácidos flexibles del anticuerpo F151 de murino; el anticuerpo de la línea germinal vk1-vh1b se usó, por lo tanto, para humanizar el anticuerpo F151 centrándose en los aminoácidos flexibles. Para la asociación de aminoácidos por pares adecuados entre los aminoácidos vk1-vh1b de F151 de murino, las 2 secuencias se alinearon basándose en la superposición 3D óptima de los carbonos alfa de los 2 modelos de homología correspondientes (véase la Figura 15 para un alineamiento de la LC de F151 y de la HC de F151 con vk1 y vh1b, respectivamente).

2. ESTABILIZACIÓN

Se usaron dos enfoques para mejorar la estabilidad del anticuerpo. a) Enfoque basado en el conocimiento

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Se propuso que los aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas con baja frecuencia de aparición frente a sus secuencias canónicas respectivas, excluyendo las CDR, fueran mutados en los aminoácidos encontrados más frecuentemente (AAGth> 0,5 kcal/mol; E. Monsellier, H. Bedouelle, J. Mol. Biol. 362, 2006, páginas 580-593). Esta primera lista de mutaciones de consenso para la cadena ligera (LC) y para la cadena pesada (HC) se limitó a los aminoácidos encontrados en la línea germinal humana más cercana (vk1-vh1b). Los cambios sugeridos en la inmediata vecindad de las CDRs (zona “Vernier” de 5 Angstroms, J. Mol. Biol. 224, 1992, páginas 487-499) se eliminaron de la consideración. Esto dio como resultado 5 mutaciones de estabilización en la LC (véase la Tabla 19) y 4 mutaciones de estabilización en la HC (véase la Tabla 20). Se tuvieron en cuenta otros criterios para considerar estas mutaciones para estabilizar potencialmente el anticuerpo F151 anti-DAKD/KD. Estos criterios fueron un cambio favorable de hidropatía en la superficie o unos mecanismos moleculares basados en la estabilización prevista del mutante. Además, se consideraron (véanse las Tablas 16-22) mutaciones de estabilización adicionales informadas como satisfactorias en la bibliografía (E. Monsellier y H. Bedouelle, J. Mol. Biol., 362, 2006, páginas 580593; B.J. Steipe y col., J. Mol. Biol, 1994, 240, 188-192). Uno de estos cambios se incorporó como una mutación de estabilización (D89E) en las secuencias HC2a, HC2b y HC2c de más adelante. Otro cambio sugerido (Q62E) se incorporó en la variante HC2b.

b) Enfoques basados en 3D y MD

Los enfoques basados en 3D y MD se han informado previamente (Seco J, Luque FJ, Barril X., J Med Chem. 23 de abril de 2009; 52(8): 2363-71; Malin Jonsson y col., J. Phys. Chem. B 2003, 107, 5511-5518). Las regiones hidrófobas del anticuerpo se identificaron explícitamente mediante el análisis de la simulación de la dinámica molecular del Fab en un disolvente binario (20% de isopropanol en agua, 20 ns de simulación de producción). Las mutaciones de lisina se introdujeron después en la vecindad de estas regiones como un intento de evitar la agregación. Se completó el análisis adicional utilizando un mapa de superficie hidrófoba dentro del software maestro de Schrodinger (v. 8.5.207). Usando una combinación de estas dos técnicas, se sugieren 2 mutaciones Lys, 1 en la cadena pesada y 1 en la cadena ligera.

3. HUMANIZACIÓN POR INJERTO

La humanización usando técnicas de injerto se ha informado previamente (Peter T. Jones, Paul H. Dear, Jefferson Foote, Michael S. Neuberger y Greg Winter Nature, 1986, 321, 522-525). El proceso de humanización que se usó comenzó identificando las líneas germinales humanas más cercanas a cadenas ligeras y pesadas anti-DAKD/KD. Esto se hace realizando una búsqueda BLAST frente a todas las líneas germinales humanas que se enumeraron sistemáticamente (todas las combinaciones posibles de los dominios V y J para las cadenas kappa y lambda, los dominios V, D y J para las cadenas pesadas).

Se identificaron las siguientes líneas germinales humanas más cercanas con 83% y 62% de identidad de secuencia con cadenas ligeras (LC) y cadenas pesadas (HC), respectivamente, de F151 anti-DAKD/KD (véase la Figura 16). Usando la línea germinal VBASE interna, la cadena ligera se encuentra cerca del locus V IV-B3 (~83% de identidad) y la cadena pesada cerca del locus 1-08 y 1-18 (~62% de identidad) de la subfamilia VH1. Las regiones CDR (como se define por MOE) y las regiones Vernier (como se define en Foote y Winter, J. Mol. Biol., 1992, 224, 487-499) se indican en negrita. Las mutaciones de humanización en subrayado se obtuvieron realizando una comparación por pares adecuados de las 2 secuencias alineadas, excluyendo los restos de las zonas CDR y Vernier definidas anteriormente. En otra variante de la humanización, solo las CDRs se excluyeron en la comparación.

4. MUTACIÓN DE MOTIVOS DE SECUENCIA NO DESEADOS

Se consideraron los siguientes motivos de secuencias: Asp-Pro (enlace lábil de ácido), Asn-X-Ser/Thr (glucosilación, X = cualquier aminoácido excepto Pro), Asp-Gly/Ser/Thr (formación de succinimida/iso-asp en regiones flexibles), Asn-Gly/H is/Ser/Ala/Cys (sitios de desamidación expuestos) y Met (oxidación en áreas expuestas). Entre otros criterios, los dominios Vl y VH de F151 murino se seleccionaron de otros anticuerpos de murino porque F151 de murino no tenía motivos de secuencia no deseados expuestos, pero se introdujeron en algunas variantes humanizadas.

LC3a, LC3b, HC3a y HC3b tienen cada uno sitios de succinimida potencialmente problemáticos que se identificaron. Estos sitios no se modificaron en las secuencias propuestas ya que los restos involucrados están potencialmente implicados en la red de enlaces H (inspección visual del modelo de homología). Estas posiciones se encuentran también en otras diversas estructuras de anticuerpos. Además, tanto en HC3a como en HC3b, una humanización estricta mediante injerto incluiría una sustitución de Ser115 por Met. Esta Metionina está expuesta. Se sugiere una sustitución de Leucina en esta posición como una mutación de humanización ya que es un resto común entre muchas secuencias cercanas de la línea germinal humana.

Las secuencias humanizadas resultantes se sometieron a BLAST por la similitud de secuencia frente a la base de datos de International Epitope Database (IEDB) (que se encuentra en la red mundial en immuneepitope.com; versión de junio de 2009; Vita R, Zarebski L, Greenbaum JA, Emami H, Hoof I, Salimi N, Damle R, Sette A, Peters B. The immune epitope database 2.0. Nucleic Acids Res. Enero de 2010; 38 (publicación de la base de datos): D854-62. Epub 11 de noviembre de 2009) para asegurar que ninguna de las secuencias contenga ningún epítope conocido de

5

10

15

20

25

30

células B o T humanas (identidad de secuencia del 70% utilizada como punto de corte para los resultados obtenidos a través de la búsqueda BLAST y considerando únicamente los resultados de especies humanas).

5. SECUENCIAS ORIGINALES DE LOS DOMINIOS VARIABLES DE F151 DE MURINO

Las CDRs se resaltan en negrita y las regiones de Vernier (como se define en Foote y Winter, J. Mol. Biol., 1992, 224, 487-499) están subrayadas.

Cadena ligera (SEQ ID NO: 26)

DTVMSQSP3S LAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLA

WYQQKPGQSP KPLIYWASTKESGVPDRFTGSGSGTDFTLT

IS SVKAED LA IYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIK

índice de germinalidad = 83% con Z46615_1_V_X67858_1_J [V IV-B3]

Cadena Pesada (SEQ ID NO:19) :

eiqlqqsgpelvkpgtsvkvsckasgysftdyniywvkqs

HGKSLEWIGY FDPYNGNTGYNQKFRGKATLTVDKS S S TAF

MHLSSLTSDD SAVYYCANYYRYDDHAMDYWGQGTSVTVS S

Indice de germinalidad = 62% con Z12316_1 _VX97051_4_D_X97051_5_J [VH1 1-18]

6. SECUENCIAS DE INGENIERÍA

a) Antecedentes

Se propusieron 5 versiones de la cadena ligera (LC1, LC2a, LC2b, LC3a y LC3b) y 5 versiones de la cadena pesada (HC1, HC2a, HC2b, HC3a y HC3b).

LC1 contiene 5 mutaciones de humanización identificadas usando el protocolo de humanización 4D. LC2a introdujo 5 mutaciones de estabilización adicionales. LC2b agregó 1 mutación de Lisina para ayudar a prevenir la agregación. LC3a contiene 15 mutaciones derivadas de injertar en la secuencia de la línea germinal humana más cercana y retener los restos de la zona CDR y Vernier de murino. LC3b contenía 16 mutaciones derivadas de injerto de CDR con una mutación de humanización adicional.

HC1 tiene 6 mutaciones de humanización identificadas por el protocolo interno. HC2a introdujo 5 mutaciones de estabilización adicionales mientras que HC2b contiene 6 mutaciones de estabilización adicionales en comparación con HC1. HC2c contiene 1 mutación Lys, además de las mutaciones de estabilización de HC2a, para ayudar a prevenir la agregación. HC3a contiene 19 mutaciones derivadas de injertar en la secuencia de la línea germinal humana más cercana y retener los restos de la zona CDR y Vernier. HC3b contiene 25 mutaciones derivadas de injertar de CDR.

Se propusieron 6 combinaciones en total (resumidas en la Tabla 16):

• LC1 x HC1 (mutaciones que abordan la humanización solamente)

• LC2a x HC2a (mutaciones que abordan la humanización y la estabilización)

• LC2a x HC2b (mutaciones que abordan la humanización y la estabilización)

• LC2b x HC2c (mutaciones que abordan la humanización, la estabilización y la "anti-agregación")

• LC3a x HC3a (mutaciones que abordan principalmente la humanización por injerto + Vernier)

• LC3b x HC3b (mutaciones que abordan la humanización por injerto)

Tabla 16: Resumen de las 6 combinaciones LCxHC propuestas

: Humanización (LC1) Humanización + estabilización (LC2a) Humanización + estabilización + anti-agregación” (LC2b) Injerto con regiones Vernier (LC3a) Injerto (LC3b)

Humanización (HC1): x

Humanización+estabilización (HC2a): x

Humanización+estabilización (HC2b): x

Humanización+estabilización+”anti- agregación” (HC2c): x

Injerto (HC3a): X

Injerto (HC3b): x

Tabla 17: Mutaciones de las 5 variantes de LC del anticuerpo F151 anti-DAKD/KD

Cadena Ligera Numeración secuencial: Cadena Ligera Numeración Kabat Mutaciones de humanización (LC1) Mutaciones de humanización + estabilización (LC2a) Mutaciones de humanización + estabilización + mutaciones de antiagregación (LC2b) Injerto de CDRs + restos Vernier (LC3a) Injerto de solo CDRs (LC3b)

Ser5
Ser5: Thr Thr Thr Thr

Ser9
Ser9: Asp Asp

Ala12
Ala12: Ser Ser

Val13
Val13: Ala Ala Ala

Val15
Val15: Leu Leu

Glu17
Glu17: Asp Asp Asp

Lys18
Lys18: Arg Arg Arg Arg Arg

Val19
Val19: Ala Ala

Met21
Met21: Ile Ile Ile Ile

Ser22
Ser22: Asn Asn

Gln48: Gln42 Lys Lys Lys

Ser49: Ser43 Pro Pro

Pro52: Pro46 Leu

Thr69: Thr63 Ser Ser Ser Ser

Val84: Val78 Leu Leu

Lys85: Lys79 Gln Gln Gln Gln Gln

Leu89: Leu83 Lys Val Val

Ile91: Ile85 Thr Thr Val Val

Gly106: Gly100 Gln Gln

Leu110: Leu104 Val Val

Mutaciones:: 5 10 11 15 16

co <D O: Lys74 P Oí CD Lys67 Gln6£ CD oo co CD 5* Lys43 I w C0 CD O CD w oo H Oí ÍZ “0 3 CD O Oí CD ro O c Cadena Pesada Numeración secuencia)

<D ^1 en: I- *< Q> Oí I- *< V) Oí Oí O 3 o> CD- 00 co CD ■c ü) w I co w ÍD í- o i- cd w 00 -1 zr O) < P ro r~ (D CZ ~0 3 CD 0 3 Ül cd" ro O c Cadena Pesada Numeración Kabat










: "0 3 > i- < CO < P < p_ Mutaciones de humanización (HC1)








: o ■< "□ 3 > p r~ <j> P < EL Q 3 Mutaciones de humanización + estabilización (HC2a)






: O c O “ü 3 > P i- k Oí P < EL O 3 Mutaciones estabilizantes de la humanización (HC2b)








: O ■c T) 3 > p I- (jí) P < p_ 0 3 Mutaciones de humanización + estabilización + mutaciones de antíagregación (HC2c)

H zr: > CD O •< O 3 TI 3 > p > <3 > P 1“ P < p_ s 3 (njerto de CDRs + resto Vernier (HC3a)

H zr —i: —1 zr —1 CD £ CD O O 3 t 3 > p > <D > P 0) P < E < p 0 3 Injerto de soló CDRs (HC3b)

Tabla 18: Mutaciones de las 6 variantes de la HC del anticuerpo F151 anti-DAKD/KD

imagen1

Phe80: Phe79 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr

His82: His81 Glu Glu

Ser84: Ser82A Arg Arg

Leu 86: Leu82C Lys

Thr87: Thr83 Arg Arg

Asp89: Asp85 Glu Glu Glu Glu

Asp90: Asp86 Glu Glu Glu

Ser91: Ser87 Thr Thr

Ser115: Ser108 Leu Leu

Mutaciones:: 6 11 12 12 19 25

5 a) Secuencias de ingeniería de la cadena ligera:

No se encontraron epítopes conocidos de células T o células B potencialmente problemáticos en ninguna de las variantes propuestas.

LC1 (SEQ ID NO: 27), las mutaciones de humanización están subrayadas, las CDRs y las zonas Vernier están en negrita:

10

DIVMSQ SP S S LAASVGDRVTMS CKSSQSLLYSSNQKNYLA WYQQKPGKSP KPLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLT ISSVQAEDLAIYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIK

LC2a (SEQ ID NO: 28), las mutaciones de humanización están subrayadas, las CDRs y las zonas Vernier están en negrita, las mutaciones de estabilización están en cursiva (T en la posición 5, S en la posición 12, I en la posición 21, S en la posición 69, T en la posición 91 mostradas a continuación):

DIVMTQSPSS LSASVGDRVTISCKSSQSLLYSSNQKNYLA

WYQQKPGKSPKPLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLT IS SVQAEDLA TYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIK

15 LC2b (SEQ ID NO: 29) las mutaciones de humanización están subrayadas, las CDRs y las zonas Vernier están en negrita, las mutaciones de estabilización están en cursiva (T en la posición 5, S en la posición 12, I en la posición 21,

5

10

15

20

25

30

S en la posición 69, T en la posición 91 mostradas a continuación) y una mutación anti-agregación es K en la posición 89:

DIVMTQSPSS LSASVGDRVTIS CKSSQSLLYSSNQKNYLA WYQQKPGKSPKPLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLT IS SVQAEDKA TYYCQQYYSypwtfgggtkleik

LC3a (SEQ ID NO: 30), las mutaciones injertadas se muestran subrayadas y las CDRs y las zonas Vernier se muestran en negrita:

DIVMTQSPD3LAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLA

WYQQKPGQPPKPLIYHASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLT IS S LQAEDVAVYYCQQYYSYPWTFGQGTKVEIK

LC3b (SEQ ID NO: 31), las mutaciones injertadas se muestran subrayadas y las CDRs y zonas Vernier se muestran en negrita:

DIVMTQSPD3LAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNQKNYLA WYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLT IS SLQAEDVAVYY CQQYYSYPWTFGQGTKVEIK

Obsérvese que L en la posición 52 es un resto vernier que está mutado a humano. c) Secuencias de la cadena pesada de ingeniería

HC1 (SEQ ID NO: 20), las mutaciones de humanización están subrayadas, las CDRs y las zonas vernier están en negrita:

EIQLVQS GP EVKKPGASVKVSCKAS GYSFTDYNIYWVKQS PGKS LEWIGYFDPYNGNTGYNQKFRGKATL TVDKS S S TAF

MHLSSLTSEDSAVYYCANYYRYDDHAMDYWGQGTSVTVSS

HC2a (SEQ ID NO: 21), las mutaciones de humanización están subrayadas, las CDRs y las zonas vernier están en negrita, las mutaciones de estabilización están en cursiva (Q en la posición 1, A en la posición 9, G en la posición 44, Y en la posición 80 y E en posición 90 mostradas a continuación):

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNIYWVKQ5 PGKGLEWIGYFDPYNGNTGYNQKFRGKATLTVDKS S S TA Y

MHLSSLTSEPESAVYYCANYYRYDDHAMDYWGQGTSVTVSS

HC2b (SEQ ID NO: 22), las mutaciones de humanización están subrayadas, las CDRs y las zonas vernier están en negrita, las mutaciones de estabilización están en cursiva (Q en la posición 1, A en la posición 9, G en la posición 44, E en la posición 62, Y en posición 80 y E en la posición 90 mostradas a continuación):

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNIYWVKQ3 PGKGLEWIGYFDPYNGNTGYNEKFRGKATLTVDKSS S TAY

MHLSSLTSEESAVYYCANYYRYDDHAMDYWGQGTSVTVSS

No se identificaron epítopes humanos para la secuencia HC2b en la base de datos IEDB.

HC2c (SEQ ID NO: 23), las mutaciones de humanización están subrayadas, CDRs y las zonas vernier están en negrita, las mutaciones de estabilización están en cursiva (Q en la posición 1, A en la posición 9, G en la posición 44, Y en la posición 80 y E en la posición 90 mostradas a continuación) y una mutación antiagregación en K en la posición 86:

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNIYWVKQ3 PGKGLEWIGYFDPYNGNTGYNQKFRGKATLTVDKSS S TAY

MHLSSKTSEESAVYYCANYYRYDDHAMDYWGQGTSVTVSS

HC3a (SEQ ID NO: 24), las mutaciones injertadas se muestran subrayadas y las CDRs y zonas Vernier se muestran en negrita:

QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNIYWVRQA

PGQGLEWIGYFDPYNGNTGYNQKFRGRATLTVDKSTSTAY

MELRSLRSDDTAVYYCANYYRYDDHAMDYWGQGTLVTVSS

LC3b (SEQ ID NO: 25), las mutaciones injertadas se muestran subrayadas y las CDRs y zonas Vernier se muestran en negrita:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYNIYWVRQA

PGQGLEWMGYFDPYNGNTGYNQKFRGRVTMTTDTSTSTAY MELRSLRSDDTAVYYCANYYRYDDHAMDYW

GQGTLVTVSS

Obsérvese que el siguiente resto Vernier está mutado a humano: V en la posición 2, M en la posición 48, V en la posición 68, M en la posición 70 y T en la posición 74.

No se identificaron epítopes humanos para la secuencia HC3b en la base de datos IEDB.

Indice de germinalidad de HC3b = 83 % con Z12316_1_V_J00235_1_D_U42590_1_J [1 -18/DP-14].

Tabla 19: Cambios de estabilización propuestos en la cadena ligera

Resto: Cambio propuesto Gth calculado Aceptar el cambio

Ser-5: Thr 2,32286 Sí

Ala-12: Ser 0,75228 Sí

Met-21: Ile 0,768959 Sí

Pro-52: Leu 1,70059 No-región Vernier

Thr-69: Ser 1,10843 Sí

Lys-86: Glu 2,00115 No - cambió a Gln durante la humanización

Ile-91: Thr 1,27255 Sí

Tabla 20: Cambios de estabilización propuestos en cadena pesada

Resto: Cambio propuesto Gth calculado Aceptar el cambio

Glu-1: Gln 0,562423 Sí

Ile-2: Val 2,15882 No - región Vernier

Pro-9: Ala 0,505324 Sí

Thr-16: Ala 1,50552 Ya cambió a Ala en la humanización

Val-20: Leu 2,21586 No - no en la secuencia de la línea germinal

Ser-40: Arg 1,03643 No - no en la secuencia de la línea germinal

His-41: Pro 1,67738 Ya cambió a Pro en la humanización

Ser-44: Gly 1,5068 Sí

Gln-62: Glu 0,74934 No - no en la secuencia de la línea germinal

Arg-65: Lys 2,32314 No - no en la secuencia de la línea germinal

Phe-80: Tyr 1,30935 Sí

His-82: Gln 2,24674 No - no en la secuencia de la línea germinal

Resto: Cambio propuesto Gth calculado Aceptar el cambio

Asp-89: Glu 1,65409 Ya cambió a Glu en la humanización

Asn-98: Arg 3,65643 No - región Vernier

Tabla 21: Combinaciones de mutaciones de estabilización evaluadas

Combinación*: Cambios adicionales sugeridos Aceptar el cambio

' L1 (46^P y 48^Q): K48^Q No - mutación de humanización K48

' L2 (51 ^K): Ninguno - ya el K51 Ninguno

' L3 (80^T): Ninguno - ya el T80 Ninguno

' L4 (82^S): Ninguno - ya el S82 Ninguno

' L5 (90^A, 91 ^T): Ninguno - ya el A90, T91 anteriormente sugerido (Tabla 1) Ninguno

' H1 (15^G): Ninguno - ya G15 Ninguno

' H2 (62^E, 63^K, 64^F): Q62^E, ya K63 y F64 Sí -considerado en HC2b

' H3 (87^T, 88^S, 89^D): D89^E, ya T87 y S88 Sí - posibles puentes salinos con K63 y K43

' S1 (L1 y L5): K48^Q No - mutación de humanización K48

' S2 (H1 y H3): D89^E No (véase H3)

*Nota: Numeración secuencial utilizada para referirse a restos

Tabla 22: Posibles mutaciones de estabilización

Resto* de cadena ligera: Cambios adicionales sugeridos Aceptar el cambio

' 15^L: V15^L No - V15 en la línea germinal Vk1

' 96^Q: Ninguno - ya el Q96 Ninguno

' 38^Y: Ninguno - ya el Y38 Ninguno

' 112^1: Ninguno - ya el I112 Ninguno

' 69^S: G69^S No - G69 está en la región Vernier

' 21^1: M21^I Ya cambió (séase la Tabla 19)

*Nota: Numeración secuencial usada para referirse a restos

Ejemplo 6: Caracterización de variantes de humanización

Según el modelo in silico presentado en la Tabla 16, la región variable del ADN de la cadena ligera (VL) y de la cadena pesada (VH) del F151 humanizado se hizo uso de la optimización de codón para la expresión HEK293 y el gen se sintetizó por GeneArt (filial de Life Technologies). Los fragmentos de ADN sintetizados se clonaron en la 5 región constante de los vectores que codifican la cadena ligera (CL), pFF0362 (A. Vector LC Kappa humano) en los sitios ApaLI/BsiWI y las regiones constantes de los vectores que codifican la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3), pFF0363 (B. Vector HC de IgG1 humana) en sitios ApaLI/Apal respectivamente. Los plásmidos pFF0460 resultantes que contienen la secuencia completa de LC y los pFF0466 que contienen la longitud completa de HC de las variantes humanizadas de F151 se cotransfectaron y se expresaron transitoriamente en el sistema de expresión 10 FreeStyle® 293 (Invitrogen/Life Technologies, catálogo n.° K9000-01).

Las seis variantes humanizadas mostradas en la Tabla 16 se caracterizaron por diversos parámetros tales como cinética de unión (discutida anteriormente) así como propiedades químicas y físicas tales como la termoestabilidad que se usan en la técnica de forma rutinaria.

La caracterización se realizó en dos niveles. El Nivel I incluía la calorimetría de barrido diferencial (DSC) mostrada 15 en la Tabla 24 y en la Figura 2. En resumen, para los experimentos de DCS, los anticuerpos se dializaron frente a la solución salina tamponada con fosfato. Las concentraciones de anticuerpos se midieron por absorbancia UV. Los anticuerpos se diluyeron a 1 mg/ml usando PBS. Los barridos se realizaron usando un instrumento N-DSC II de Calorimetry Sciences Corporation usando una celda capilar de 0,3268 ml con PBS en la celda de referencia. La velocidad de barrido fue de 2 °C/min y las muestras se sometieron a un barrido desde 20 °C hasta 100 °C.

20 Todas las variantes, a excepción de HC3b/LC3b, mostraron afinidades de unión comparables al anticuerpo parental. La variante HC3a/LC3a se seleccionó antes que las otras variantes en función de otras propiedades fisicoquímicas tales como datos SEC, estabilidad y falta de agregación (véanse las Tablas 23-25).

Tabla 23. Comparación de la cinética de las variantes humanizadas del F151

: HC1/LC1 HC2a/LC2a '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

' DAKD-b: 4,16E+05 6,00E-06 1,45E-11 6,66E+05 1,22E-05 1,83E-11 '

'KD-b: 4,24E+05 1,74E-07 3,94E-13 7,03E+05 6,12E-06 8,71 E-12 '

DAKLP-b: 5,00E+05 7,96E-06 1,60E-11 4,10E+05 5,67E-06 1,38E-11 '

KLP-b: 4,81 E+05 2,67E-06 5,54E-12 6,15E+05 2,68E-05 4,34E-1 '

: HC2b/LC2a HC2c/LC2b '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

' DAKD-b: 4,17E+05 1,05E-05 2,57E-11 4,81 E+05 4,34E-05 9,01 E-11 '

'KD-b: 3,75E+05 1,66E-06 4,72E-12 5,64E+05 9,08E-06 1,74E-11 '

'DAKLP-b: 4,46E+05 1,30E-05 2,97E-11 9,03E+05 1,10E-05 1,21 E-11 '

'KLP-b: 4,01 E+05 2,20E-06 5,76E-12 5,16E+05 1,02E-05 1,98E-11 '

: HC3a/LC3a HC3b/LC3b '

: Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) '

HC3a/LC3a: HC2c/LC2b HC2b/LC2a HC2a/LC2a HC1/LC1 Variante





: Procedimiento Ensayo

“-si: O 05 00 1,83 JO o 1,69 Espectroscopia de UV (A280) Cono, de proteínas (mg/ml)

No Ag/Deg
No Ag/Deg
No Ag/Deg
No Ag/Deg
No Ag/Deg: Gel-1 D (reductor y no reductor) Pureza

No Ag
No Ag
No Ag
No Ag: « > OI 0^ SEC

82,3 (M) 71,8 (m) Lo más inestable: 71.0 (M) 64.0 (m) 82,5 (m) Inestable 74,6 (M) 83,0 (m) 75,0 (M) 82,5 (m) 81,6 (M) 70,0 (m) DSC (Tf 2C) (Tf del F151 parental = 73 2C) Estabilidad

Potencia nM en DAKD, potencia sub nM en KD, comparable entre 5 variantes: Ensayo FDSS Ensayo de la potencia funcional

Activo en DAKD y KD comparable entre 5 variantes: Ensayo FDSS sin preincubación

Kas10E5, kd¡s menor que o igual a 10E-6 comparable entre 5 variantes: Unión Biacore Afinidad del ligando

—I

CD

ro

4^

O

o

3

"O

0)

3

O

OÑ

Q_

CD

<

CD

Q_

CD

<

0)

Cd'

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HC3b/LC3b: 1,47 No No Ag 79,4 (M) Potencia perdida para KLP y DAKLP



: Ag/Deg 71,4 (m) Afinidad disminuida para KLP y DAKLP

Abreviaturas: Ag = agregación, Deg = degradación

Tabla 25. Comparación de Nivel 2 de variantes de humanización


: Termoestabilidad Estabilidad Confirmación de integridad (LC, HC) Confirmación de secuencia N- terminal

Variante: Gel-1 D SEC Biacore SEC LC-MS Secuenciación N- terminal

HC1/ LC1: No Ag/Deg No Ag/Deg Velocidad de disociación ligeramente más rápida a 45C que a 4C No Ag/Deg LC(+1 Da de desviación) HC(+1 Da de desviación) G0 dominante N-terminal de LC y HC intacto

HC2a/LC2a: No Ag/Deg No Ag/Deg Velocidad de disociación ligeramente más rápida a 45C que a 4C No Ag/Deg LC(coincidencia) HC(coincidencia) G0 dominante N-terminal de LC y HC intacto

HC2b/LC2a: No Ag/Deg No Ag/Deg Velocidad de disociación ligeramente más rápida a 45C que a 4C No Ag/Deg LC(+1 Da de desviación) HC(+1 Da de desviación) G0 dominante N-terminal de LC y HC intacto

HC2c/LC2b: X X X X X X

HC3a/LC3a: No Ag/Deg No Ag/Deg Velocidad de disociación ligeramente más rápida a 45C que a 4C No Ag/Deg LC(-2Da de desviación) HC(-2Da de desviación) G0 dominante N-terminal de LC y HC intacto

HC3b/LC3b: X X X X X X

Termoestabilidad = incubación a 4 °C (control) y 45 °C durante 3 días; gel-1 D estaba en condiciones no reductoras;

Estabilidad =: 2 ciclos de congelación/descongelación; LC-MS = reducida y reducida/desglucosilación

Abreviaturas: Ag = agregación, Deg = degradación, X = no se presentaron datos

Tabla 26. Comparación entre F151 parental y la variante humanizada de F151 (HC3a/LC3a)

F151 parental

Variable de cadena pesada

Variable de cadena ligera

CD

O

GAGATCCAGCTGCAGCAGTC TGGACCT GAGCTG GT G A AGC C TGGG ACT TC AGT G A AGGTG TCC T G C AAGG C TT C TGGT T AC TCATT CA C TGAC TACAAC ATCTACTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGC CT T GAGTGGAT T GGAT AT TTTGATCCT TACAAT GGTAATACTGGCTACAAC CAGAAGTTCAGGGGC AAGGCCAC AT TGACTGT T GACAAGT CC TCCAGC ACAG C CT T CATGCAT CT C AGCAGCCTGACATCT GATGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAACTAC TATA GGTATGAC GAC CAT GC TAT GGACTAT TG G GGTCAAGGflACCTCAGT CAO CGT CT CC TCA

(SEQ ID HO:127)

GA CATT GT GAT GT C ACAG TCTCCAT C CT C CC TAGCT GT GTCAG T TG GAGAG AA GGT T AC TAT GAGC T GCAA GTC CAG T CAGAGC C T T T TATATAGTAGCAAT CAAAAGAACT AC T TGGCC TG GTACCAGCAGAAACCAGG GCAGTCTC CTAAAC C GCTGAT TTAC T GG GCATCC AC TAGGGAAT CT GGGGT CC C TG ATC GCT TCACAGGC AGTGGAT CT GG GAC AG ATTT C ACT C TC AC C AT C AGC AGT GTG AAGGCTGAAGACCTGGCAATTTATTACT GTCAGCAATATTATAGCTATC CGTGGAC GTT CGGT GGAGGCAC CAAGCT GGAAATC AAA

(SEO ID NO:128)

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DIVMSQS P S SLAVSVGEKVTMSQKSSQSL LY £ S MQKN Y LAWYQQKF GQSF KF L1YWA STRESGVFDP.FTGSGSGTDFTLTIS S VK AE D LAIYY C QQYY S Y P WT FGGGTKL EIK (SEQ ID NO:19)

F151 humanizado (HC3a/LC3a)

CD

O

CAGATTCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTG AAGAAACCTGGCGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGC AAGGCCAGCGGCTACAGCTT CACCGACTACAAC ATCT AjCTGGGTCCGAC AGGC TCCAGGCCAGGGA CT GGAAT GGATC GGCTAC TTCGACC CC TACAAC GGCAACAC CGGC TACAAC CAGAAGT TC CGGGGC AGAGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCACCAGC ACCGCCTACATGGAACTGCGGAGCCTGAGAAGC GAC GACA C CGCC GTGT AC TA CT GCGCC AAC T A C TACAGATACGACGaCCACGC CatGGACtaC rGG GGC CAGGGCACC CtGGT CAC CGTGT CCTCT (SEQ ID NO:125)

GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACA GCCTGGCCGTGTCTCTGGGCGAGCGGGC CAC CATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGC C T GCTGT AC T C T AGC AAC C AG AAG AACT ACCTGGCCTG GTATCAGC AGAAGCCCGG C CAGCC CC CCAAGC C C CT GAT CTAC T GG GCCAGCACCCGCGAGAGCGGCGTGCCCG ATAGATTTTCCGGCAGCGGCTCCGGCAC CGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTG CAGGCC GAGGACG T G GCC GTGTAC TACT GC CAGO AGTAC TAC AGCTACO CC TG GAC C T T CGGCCAGGGCAC CAAGGTGGAAATC AAG

(SEQ ID NO:130)

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DIVMTQS F D£ L A"VS L GERATI NCKSSQ£ LLYSSMQKNYLAVjY QQKPGQPPKP LIYM A5TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSL QAEDVAVY YCQQYYSYPWTFGQGIKVEI

K

(SEQ ID NO:30)

Subrayado sencillo = región CDR; doble subrayado = aminoácidos característicos para identificar las CDRs

Para el alineamiento de las cadenas ligera y pesada de F151 parental frente a variante humanizada de F151 (HC3a/LC3a) véase la Figura 3.

5

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20

25

30

35

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45

Ejemplo 7: Estructura cristalina del anticuerpo F151 humanizado frente a Ligando BRK1 Calidina y des-arg10- Calidina

Se determinaron las estructuras cristalinas de Fab de F151 humanizado (HC3a/LC3a) unido a Calidina o des-arg10- calidina y se analizaron las interacciones moleculares.

Se adquirió Calidina en polvo de Phoenix Pharmaceuticals (Cat. N.° 009-37). Para la generación de la proteína Fab, el ADN de la región VH de la cadena pesada (HC) HC3a del F151 humanizado se clonó en el pFF0366 del vector CH1 etiquetado 6XHis. El plásmido de la cadena ligera (LC) usado aquí era el mismo que el LC3a de F151 original usado en la humanización de F151 (véase el Ejemplo 5). Los dos plásmidos se cotransfectaron en células HEK293 de estilo libre para la expresión de Fab. La proteína Fab se purificó usando cobalto-resina, se cambió el tampón a MES 50 mM pH 6,0, NaCl 50 mM antes de ser concentrado hasta aproximadamente 9 mg/ml. La proteína Fab F151 purificada se mezcló con calidina en una proporción molar de 1:2 y se preparó para el cribado por cristalización. El cribado por cristalización se realizó con una amplia gama de condiciones. El mejor cristal se observó en las condiciones B10, B12 y G10 del HT PEG/ION del kit de cribado de Hampton Research. Los cristales se crioprotegieron con glicerol 20 % en tampón adecuado y se congelaron para la recopilación de datos de difracción. Los datos de difracción de rayos X para ambos complejos se recogieron en Canadian Light Source, línea de haz CMCF-08ID. El Rmerge para el complejo F151-KD es 8,9% e I/s(l) = 20,2, mientras que los del F151-DAKD son 7,7% y 18,5, respectivamente. La estructura F151-KD se resolvió por sustitución molecular en Phaser usando coordenadas Fab de 3QOS de la entrada PDB, tratando los dominios Vl-Vh y Cl-Ch1 como unidades independientes. La estructura se refinó en autoBuster con una resolución de 2,07 Á en el grupo espacial P212121 a un Rfactor de 0,205 y un valor de Rfree de 0,228. La estructura F151-DAKD se resolvió utilizando las coordenadas F151-KD. La estructura se refinó en autoBuster con una resolución de 1,86 Á en el grupo espacial P212121 a un Rfactor de 0,232 y un Rfree de 0,238.

Los mapas de densidad de electrones mostrados en las Figuras 4 y 5 representan la unión de calidina (KD) y Des- Arg10-calidina (DAKD) al Fab F151 y determinan inequívocamente las posiciones de cada aminoácido. Para la calidina, la densidad de electrones para el resto Arg10 del extremo C-terminal no está presente. Esto está de acuerdo con la observación de que DAKD, al que le falta el resto arginina C-terminal (mostrado en la Tabla 27 a continuación), se une igualmente bien a F151 como KD. Los valores de CI50 de F151 en el ensayo celular FDSS de neutralización hacia KD y DAKD son de 0,12 nM y 0,09 nM, respectivamente. En ambos casos, la densidad de electrones es más débil hacia los C-terminales de los péptidos. Dado que Phe9 en KD tiene una densidad de electrones ligeramente mejor que en DAKD, es posible que la presencia de la arginina adicional en el C-terminal de KD estabilice el C-terminal de este péptido cuando se une a F151 aunque esta arginina en sí misma no es lo suficientemente estable como para ser observada por rayos X. Dado que las dos estructuras son esencialmente idénticas (rms entre KD y DAKD es 0,139 para átomos de C y 0,328 para todos los átomos), todas las discusiones siguientes se basan en la estructura F151-KD.

Tabla 27. Una lista seleccionada de péptidos de cinina

— Nombre del péptido: SEQ ID NO: Secuencia —


: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

KD (Calidina): 1 Lys -Arg -Pro -Pro -Gly -Phe -Ser -Pro -Phe -Arg

DAKD (des-Arg10-Calidina): 2 Lys -Arg -Pro -Pro -Gly -Phe -Ser -Pro -Phe

KLP (ortólogo KD de roedor): 3 Arg -Arg -Pro -Pro -Gly -Phe -Ser -Pro -Phe -Arg

BK (Bradicinina): 5 Arg -Pro -Pro -Gly -Phe -Ser -Pro -Phe -Arg

KD está unido con su N-terminal enterrado en la interfaz entre las subunidades Fv de las cadenas ligera y pesada, como se muestra en la Figura 6. La interfaz entre las cadenas ligera y pesada está empaquetada con aminoácidos aromáticos, incluyendo Tyr-L42, Tyr-L93, Tyr-L100, Trp_L102, Phe-L104 y Tyr-H35, Trp-H47, Tyr-H50, Tyr-H99, Trp- H110, estabilizando los demás mediante el apilamiento y las interacciones hidrófobas. Los restos de cada una de las CDRs de cadenas ligeras y pesadas contribuyen a la unión. Los restos a lo largo de las cadenas ligera y pesada que participan en las interacciones con KD tal como se mapean en las CDRs se muestran en las Figuras 7 y 8. La CDR H3 de la cadena pesada es el bucle más largo y el más frecuentemente utilizado en las interacciones con KD, formando una cubierta lateral para KD. El bucle se estabilizó principalmente mediante interacciones con las otras dos CDRs, H1 y H2 de la cadena pesada, concretamente, puente salino entre Asp-H101 y Arg-H52 (estabilizando H1 y H3), interacción areno-H entre Tyr-H102 y Tyr-H54 (estabilizando H2 y H3), enlace H entre Asp-H108 y Tyr- H35 y enlace de H entre His-H105 y Tyr-L55 (estabilizando H3 y L2).

5

10

15

20

25

30

Comparando los restos que interactúan con KD entre los anticuerpos generados, se puede ver que hay similitud entre los anticuerpos, y algunos estaban más relacionados en el uso de aminoácidos particulares para la interacción KD que otros. Por ejemplo, en el F151 de la cadena ligera, C63 e I22 usan aminoácidos más similares en sus CDRs para unirse a KD, mientras que B21 e I54 son más similares. En la cadena pesada, F151 y C63 fueron sorprendentemente únicos entre sí y de B21, I22 e I54. Los tres últimos parecen formar un grupo en similitud. C63 es particularmente interesante en su cadena pesada, ya que la longitud del bucle en H2 y H3 es más diferente de los demás. Considerando el Fab como un conjunto, B21 e I54 estaban más estrechamente relacionados.

En la estructura cristalina, se encontró que KD está implicado en enlaces sistemáticos de hidrógeno e interacciones hidrófobas con el Fab. El N-terminal de KD está enterrado en el Fab y alberga interacciones más intensas, mientras que el C-terminal está esencialmente expuesto al disolvente. Excepto por los primeros 4 restos (Lys-Arg-Pro-Pro), los otros restos de KD se extienden gradualmente al disolvente en masa. El grupo amidinio de la cadena lateral de Lys1 está anclado por Glu-L61 (L: cadena ligera) a través de puentes salinos, mientras que el grupo amino del amino terminal de Lys 1 forma un puente salino con Asp-H108 (H: cadena pesada). El grupo amidinio de la cadena lateral de Lys1 también cuelga sobre el anillo aromático de Tyr-L55, implicado en interacciones de catión. Tales interacciones intensivas implicadas con Lys1 anclan firmemente el amino terminal de KD en el Fab. Esto también explica la importancia de Lys1 en la unión de KD a F151. Sin él (es decir, bradicinina), no se puede medir ninguna unión detectable a hF151 o F151. Al igual que Lys1, Arg2 interactúa con el Fab a través de un puente salino. El grupo guanidio de Arg2 interactúa con la cadena lateral de Asp-H104. La cadena lateral de Arg2 está también unida por H con el oxígeno del carbonilo de la cadena principal de Arg-H101. Además, el oxígeno de la cadena principal de Pro8 está unido por H con la cadena lateral de Arg-H101. Tyr-H102 está intercalado a mitad de camino entre Phe8 y Pro9, lo que implica interacciones hidrófobas con KD. Además de la interacción directa, también se observan numerosos enlaces de H mediados por agua entre KD y Fab. También es interesante observar que los restos de tirosina se usan con mayor frecuencia en la interacción en comparación con otros aminoácidos; 9 de los 16 restos marcados con asteriscos en las Figuras 7 y 8 son tirosinas. Todos los restos de F151 que rodean KD parecen desempeñar una función en la unión del ligando, excepto Asn-H33, que está cerca de la cadena lateral de Phe6 pero es incompatible en polaridad y carece de otras interacciones importantes. La sustitución con restos aromáticos/hidrófobos, tales como Trp o Tyr frente a la interacción con Phe8 parece ser una elección rápida si se considera la maduración de afinidad. Estos dos aminoácidos aromáticos se observan de hecho en otros anticuerpos (Trp en C63 y Tyr en B21, I22, I54). La Tabla 28 a continuación proporciona un análisis detallado de 16 restos de aminoácidos que interactúan con KD marcados en las Figuras 7 y 8 y expone las sustituciones funcionales que pueden realizarse en las regiones de CDR que no deberían interrumpir la unión al antígeno.

Tabla 28. Una lista de restos de aminoácidos encontrados alrededor de la bolsa de unión de KD, y sus funciones en la unión de KD y posibles sustituciones funcionales (restos de la cadena ligera en células de color gris y restos de la cadena pesada en células no sombreadas)

Resto: Función en la unión de KD o en la estabilización de la CDR Sustitución funcional

Tyr-L31: • Interacciones hidrófobas con Pro4 en el borde • Junto con Tyr-L38 y Tyr-L98 forman tres planos ortogonales que rodean el giro de 90 grados de KD en Pro4 • His para agregar un enlace de H con el N de la amida de Pro5 • Otros a.a. aromáticos, tal como Trp y Phe

Tyr-L38: • Apilamiento hidrófobo con Pro4 • Junto con Tyr-L31 y Tyr-L98 forman tres planos ortogonales que rodean el giro de 90 grados de KD en Pro4 • His para agregar un enlace de H con el O del carbonilo de Arg2

Tyr-L55: • interacción catiónica con ion amidinio de la cadena lateral de Lys1 • Enlace de H con His-H105; el emparejamiento Tyr-L55- His-H105 añade estabilización entre los bucles L2 y H3 • Trp para emparejarse con las mutaciones H105 de Gln, Asn, Glu o Asp (manteniendo el enlace de H); Otras variantes de His_H105 son Tyr y Ser. • Otros a.a. aromáticos, como Trp, His y Phe

Glu-L61: • Formar puentes salinos clave con la cadena lateral de Lys1 • Asp, Gln, ASN (Asp se observa ya en B21 e I54, Figura 7)

Tyr-L97: • Enlace de H con el N de amida de Trp-L56 • Formar bolsa para la cadena lateral extendida de Arg1 • A.a. aromáticos como Phe o His (espacio demasiado ajustado para Trp)

Tyr-L98: • Junto con Tyr-L31 y Tyr-L38 forman tres planos ortogonales que rodean el giro de 90 grados de KD en Pro4 • Otros a.a aromáticos, tal como Phe, Trp o His

Tyr-L100: • Formar una superficie de bolsa para Pro3 • Parte de la interfaz de agrupamiento de a.a aromáticos entre las cadenas L/H, que incluye además Tyr-L42, Tyr- L93, Trp L102, Phe-L104 y Tyr-H35, Trp-H47, Tyr-H50, Tyr-H99, Trp-H110 • Apilamiento parcial con Tyr-H50 • A.a aromático, como Phe (mejores interacciones hidrófobas con Pro3) • Otras variantes vistas son Thr (en B21 e I54) y His (en I22)

Trp-L102: • Parte de la interfaz de agrupaciones de a.a. aromáticos entre las cadenas L/H • Apilamiento con Trp-H47 • Otros a.a aromáticos, tal como Tyr (en C63 y B21), Phe y His • Otros restos hidrófobos, tal como L (en I22)

Asn-H33: • Cerca de la cadena lateral Phe6 pero incompatible en polaridad, ni se observan otras funciones; puede ser una diana para la maduración de afinidad • Reemplazar con a.a. aromáticos/hidrófobos, como Trp (visto en C63) o Tyr (visto en B21, I22, I54)

Asp-H52: • Puente salino con Arg-H101, estabilizando los bucles H1 y H3 • Mutar como un par con Arg-H101 a a.a. cargados inversamente, tales como Arg- H52/Asp-H101, o un par de a.a. hidrófobos a.a. (Leu, Ile, Val, Met, Phe, Tyr, Trp, Ala) para formar un agrupamiento con Phe6 de KD

Tyr-H54: • Cerca de Pro8 pero sin interacciones específicas • Cerca de Arg-H101, pero sin interacciones de carga • Mutado a a.a. cargados negativamente para estabilizar Arg-H101, tal como D o E (observado en B21, I22 e I54) o N o Q, también proporciona enlace de H con el O del carbonilo de Pro8 (una Lys en C63, que puede ser invertido en la carga Glu)

Tyr-H99: • Parte de la interfaz aromática entre las cadenas H y L • Enlace de H con Asn-H33 • Espacio reducido • Mutar a a.a. aromático pequeño excepto W, tal como Phe y His

Arg-H101: • Enlace de H con amida de Pro8 • soportado por Asp-H52 (puente salino) • Mutar como un par con Asp-H52 a a.a. cargado inversamente, tal como Arg-H52/Asp- H101, o un par de a.a. hidrófobos para formar una agrupación con Phe6 de KD

Tyr-H102: • Intercalación a medio camino en Phe9 y Pro8, interacciones hidrófobas con KD • Phe puede ser mejor, Trp o His también puede estar bien

Asp-H104: • Resto clave para el puente salino con Arg2 • Glu para mantener el puente salino con Arg2 • A.a. mayores para llenar el hueco de Pro3, tal como Tyr como se ve en B21, I22 e I54

Asp-H108: • Resto clave para el puente salino con -NH3+ N- terminal de KD • Enlace de H con Tyr-H33, estabilizando el bucle H3 • Resto conservado! No en CDR • Glu

El análisis del epítope conformacional de calidina (KD) o des-Arg10-Calidina (DAKD) reveló que adopta una conformación de "trenzado Pro4". Como se muestra en la Figura 17, un sello distintivo de la conformación "trenzado Pro 4" es un giro cerrado de tipo II en la estructura principal del polipéptido de la cadena principal de KD o DAKD en 5 Prolina 4 (véase Richardson JS. "The anatomy and taxonomy of protein structure”. Adv Protein Chem. 1981; 34: 167339, que se incorpora por referencia en el presente documento). La conformación de "trenzado Pro 4" puede definirse adicionalmente por todos o sustancialmente todos los aminoácidos restantes de KD (1-2 y 6-9) o DAKD que adoptan repeticiones de una forma sigmoidea que alinean las cadenas laterales hidrófobas en un modo de apilamiento espacial.

10 Ejemplo 8: Farmacología in vivo de anticuerpos anti-BKR1 -ligando en modelos de dolor

Los ejemplos de la presente divulgación ilustran la eficacia in vivo de anticuerpos receptor anti-BKR1-ligando en diferentes modelos preclínicos de dolor agudo y crónico según los procedimientos modificados descritos en (a) Saddi GM y Abbott FV., Pain (2000), 89: 53-63; (b) Chen y col., Molecular Pain (2010), 2: 6-13 y (c) Bennett GJ y Xie YK., Pain (1988), 33: 87-107.

15 Animales

Los experimentos se llevaron a cabo utilizando ratones OF1 machos adultos (20-30 gr) para estudios de formalina y ratones C57BI/6J machos adultos (25-30 gr) para estudios tanto con CFA como con CCI. Los ratones se mantuvieron en un espacio de temperatura controlada en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Alimentos y agua se proporcionaron ad libitum. Para todos los experimentos, los ratones se aclimataron a la sala de laboratorio durante al 20 menos 2 horas antes de la prueba. No se realizó aleatorización en los estudios. Los experimentadores que realizan las pruebas de comportamiento no fueron cegados en el tratamiento; sin embargo, no estaban al tanto de la hipótesis del estudio. Todos los procedimientos han sido aprobados por el "Comité d’Expérimentation pour la Protection de l'Animal de Laboratoire" (Comité para el Cuidado y Uso de los Animales) de Investigación y Desarrollo de Sanofi-Aventis y se llevaron a cabo de conformidad con la legislación francesa (Decreto n ° 87-848 - 19 de 25 octubre de 1987- y decisión -19 de abril de 1988) aplicando la Directiva europea 86/609/CEE.

A. Dolor inflamatorio agudo inducido por formalina

La prueba de formalina se usó para medir el dolor nociceptivo e inflamatorio. De hecho, la inyección intraplantar de formalina induce una respuesta conductual nociceptiva aguda inicial (0-12 minutos), seguida de una segunda respuesta mediada por la inflamación (15-45 minutos), que se atribuye a la excitabilidad de la médula espinal.

30 Se diluyó formaldehído (37 %, Sigma) en solución salina (v/v) para obtener una concentración de formaldehído al 2,5% (es decir, concentración de formalina s 6,25%). A los ratones se les sujetó con cuidado y se les inyectaron 20 gl de esta solución por vía subcutánea en la parte dorsal de una pata trasera. Las respuestas conductuales se puntuaron inmediatamente después de la inyección de formalina, después a intervalos de 3 minutos durante 45 minutos de la siguiente manera: (0): soporte normal del peso de la pata inyectada; (1): pata inyectada descansando 35 ligeramente sobre el suelo; (2) elevación-alzado de la pata inyectada; (3): lamiendo o mordisqueando la pata inyectada. El tamaño de los grupos fueron 11-12 ratones OF1 machos.

Se representaron en un gráfico las puntuaciones frente al tiempo y se calcularon las áreas bajo las curvas (AUC) a partir de las puntuaciones medias (±SEM) tanto para las fases temprana (0-12 min) como tardía (15-45 min). La inversión de los comportamientos similares al dolor se expresó como un cambio en la AUC en %.

40 El anticuerpo EE1 inhibió el comportamiento similar al dolor en la fase tardía de la prueba de formalina en ratones OF1 macho. El anticuerpo EE1, cuando se administró por vía intravenosa 48 horas antes de la inyección intraplantar de formalina, mostró una inversión dependiente de la dosis del comportamiento similar al dolor solo en la fase tardía con una Dosis Eficaz Mínima (MED) = 2,5 mg/kg, como se muestra en la Figura 9. De hecho, cuando se administró a 2,5, 10 y 30 mg/kg, el EE1 invirtió la fase tardía en 35 ± 5 %, 33 ± 5 % y 45 ± 7 %, respectivamente, como se 45 muestra en la Tabla 29.

Por el contrario, F151 inhibe débilmente el comportamiento similar al dolor en la fase tardía de la prueba de

formalina cuando se administra 48 horas antes de la inyección intraplantar de formalina. De hecho, cuando se administró a 2,5 y 10 mg/kg, F151 invirtió la fase tardía en 15 ± 7 % y 21 ± 5 %, respectivamente, como se muestra en la Tabla 29.

Tabla 29. Efecto de los anticuerpos EE1 y F151 sobre el comportamiento similar al dolor inducido por formalina en 5 ratones OF1 macho

Grupo: Dosis (mg/kg, i.v.) A.U.C. ± SEM (15-45 min) Inversión del comportamiento similar al dolor (en %) ± SEM (15-45 min)

1B7.11 (EE1) de control de isotipo: 30 63,6 ± 2,9 0 ± 5

EE1: 2,5 41,6 ± 3,4 (***) 35 ± 5

: 10 42,9 ± 2,9 (***) 33 ± 5

: 30 36,5 ± 4,3 (***) 45 ± 7

1B7.11 (F151) de control de isotipo: 10 57,3 ± 3 0 ± 5

F151: 2,5 48,9 ± 3,8 (NS) 15 ± 7

: 10 45,0 ± 2,8 (*) 21 ± 5

* p<0,05; *** p<0.001: Se usó la prueba de la t de Student frente a un control adecuado.

NS: no significativo

B. Dolor inflamatorio crónico inducido por CFA (adyuvante completo de Freund)

Se indujo inflamación crónica con poca anestesia breve (isoflurano, 3 %) mediante una administración intraplantar de 25 pl de Adyuvante Completo de Freund (CFA) que contenía 1 pg/pl de tuberculosis por Micobacteria destruida 10 por calor en aceite mineral y monooleato de manida (Sigma). El tamaño de los grupos eran 8 ratones C57BI/6 machos.

El anticuerpo EE1 se administró por vía intravenosa 22 horas después de la inyección de CFA intraplantar a 2,5 y 30 mg/kg y las hipersensibilidades mecánicas y térmicas se evaluaron en el Día 1 (D1), Día 4 (D4) y Día 7 (D7) tras la administración intraplantar de CFA.

15 B1. Hipersensibilidad mecánica

La hipersensibilidad mecánica se evaluó midiendo la frecuencia de la respuesta de retraimiento (FR, en %) después de 10 aplicaciones de un filamento Von Frey de 0,6 g (Bioseb, Francia) en la superficie plantar de la pata inyectada.

Para investigar la eficacia del anticuerpo EE1 en el comportamiento similar al dolor, calculamos la inversión de la hipersensibilidad mecánica (en %) de la siguiente manera:

20 Las inversiones porcentuales se calcularon como (Media de FR-control de isotipopostdosis - FR-Ipsipostdosis)/(Media de FR-control de isotipopostdosis - Media FR-shampostdosis) para cada ratón.

En D1, D4 y D7 después de inyección intraplantar de CFA, se observó un aumento significativo de la FR para los filamentos de Von Frey en el grupo tratado con 1B7.11 de control de isotipo en comparación con el grupo sin tratamiento previo, mostrando el desarrollo de hipersensibilidad mecánica. El anticuerpo EE1, cuando se administró 25 por vía intravenosa 22 horas después del CFA intraplantar, fue capaz de disminuir significativamente esta FR a los diferentes tiempos estudiados en comparación con el obtenido en el grupo tratado con el 1B7.11 de control del isotipo. (Figura 10).

La inversión de la hipersensibilidad mecánica fue 41 ± 8% y 22 ± 8% en D1, 36 ± 9% y 32 ± 9% en D4 y 27 ± 10% y 50 ± 9% en D7 para una dosis de 2,5 mg/kg y 30 mg/kg de administración intravenosa del anticuerpo EE1, respectivamente (Tabla 30).

Tabla 30. Efecto del anticuerpo EE1 sobre la hipersensibilidad mecánica inducida por CFA en ratones C57Bl/6 5 machos

Grupo: Dosis (mg/kg, i.v.) Día 1 después de CFA FR (%) % efecto Día 4 después de CFA FR (%) % efecto Día 7 después de CFA FR (%) % efecto

Sin tratamiento: n.a. 41,3 ± 4,4 100 ± 11 43,8 ± 2,6 100 ± 8 45 ± 5 100 ± 13

1B7.11 de control de isotipo: 30 81,3 ± 4,4 0 ± 11 78,8 ± 3 0 ± 8 82,5 ± 2,5 0 ± 7

EE1: 2,5 30 65 ± 3,3 (**) 72,5 ± 3,1 (*) 41 ± 8 22 ± 8 66,3 ± 3,2 (*) 67,5 ± 3,1 (*) 36 ± 9 32 ± 9 72,5 ± 3,7 (*) 63,8 ± 3,2 (***) 27 ± 10 50 ± 9

FR: Frecuencia de Respuesta (en %) ± SEM, % del efecto ± SEM, n.a. no aplicable

* p <0,05, ** p <0,01 y *** p <0,001, ANOVA de dos vías con el tiempo como medida repetida seguida de la prueba de Dunnett para el factor grupo para cada nivel de factor tiempo

B2. Hipersensibilidad térmica

Para la hipersensibilidad térmica, se evaluaron medidas de Latencias de Retraimiento de la Pata (PWL, en segundos) en respuesta a un calor radiante usando un aparato plantar (IITC, Woodland Hills, EE.UU.).

10 Para investigar la eficacia del anticuerpo EE1 en el comportamiento similar al dolor, se calculó la inversión de la hipersensibilidad térmica (en %) de la siguiente manera:

Las inversiones porcentuales se calcularon como (PWLpostdosis - Media del Control de isotipopostdosis)/(Media de control de isotipopredosis - Media del control de isotipopostdosis) para cada ratón.

Las hipersensibilidades térmicas no fueron diferentes entre todos los grupos al inicio, antes de la inyección 15 intraplantar de CFA (datos no mostrados).

En D1, D4 y D7 después de la inyección intraplantar de CFA, se observó una disminución significativa en la latencia de retraimiento de pata de la pata inyectada en el grupo de ratones tratados con 1B7.11 de control de isotipo, demostrando que CFA inducía una hipersensibilidad térmica (datos no mostrados).

El anticuerpo EE1, administrado por vía intravenosa 22 horas después de la inyección de CFA intraplantar (es decir, 20 en el Día 1 después de la inyección de CFA intraplantar), y no fue capaz de aumentar la Latencia del Retraimiento de la Pata en el D1, cualquiera que fuera la dosis ensayada (Figura 11). Sin embargo, el EE1 aumentó significativamente la Latencia del Retraimiento de la Pata en el D4 y este efecto también estuvo presente en el D7 (Figura 11).

La inversión de la hipersensibilidad térmica fue 41 ± 15% y 58 ± 21% en D4 y 46 ± 10% y 52 ± 17% en D7 para una 25 administración intravenosa de EE1 de 2,5 mg/kg y 30 mg/kg, respectivamente (Tabla 31).

Grupo: Dosis (mg/kg, i.v.) Día 1 después de CFA PWL (s) % efecto Día 4 después de CFA PWL (s) % efecto Día 7 después de CFA PWL (s) % efecto

1B7.11 de control del isotipo: 30 3,3 ± 0,3 n.a. 4,1 ± 0,1 n.a. 3,6 ± 0,3 n.a.

EE1: 2,5 30 3,1 ± 0,3 2,6 ± 0,2 -7 ± 10 -20 ± 5 5,2 ± 0,4 5,7 ± 0,6 (*) 41 ± 15 58 ± 21 5,0 ± 0,3 (*) 5,2 ± 0,6 (*) 46 ± 10 52 ± 17

PWL: Latencia de retraimiento de la pata ± SEM, % del efecto ± SEM, n.a. no aplicable

* p <0,05, ANOVA de dos vías con el tiempo como medida repetida seguida de la prueba de Dunnett para el factor grupo para cada nivel de factor tiempo

C. Dolor de tipo neuropático inducido por CCI (lesión por constricción crónica) (modelo de Bennett)

Se usó el modelo de CCI como modelo de lesión del nervio periférico. En resumen, los ratones fueron anestesiados 5 con isoflurano (3 %) y el nervio ciático derecho se expuso al nivel de la mitad del muslo a través de una pequeña incisión. Se colocaron tres ligaduras flojas de catgut cromado 6.0 (Ethicon) en un espacio de 1 mm alrededor del nervio ciático. El procedimiento quirúrgico se completó al cerrar los músculos y la piel. El día de la cirugía de la CCI se consideró como Día 0. Los tamaños de los grupos fueron 6-10 ratones C57BI/6 machos.

El anticuerpo EE1 se administró por vía intravenosa de 2,5 y 30 mg/kg el Día 11 después de la cirugía y las 10 hipersensibilidades mecánicas y térmicas se evaluaron el Día 12 (D12), el Día 14 (D14) y el Día 18 (D18) después de la cirugía, que correspondió al Día 1 (D1), Día 3 (D3) y Día 7 (D7) después del tratamiento.

C1. Hipersensibilidad mecánica

La hipersensibilidad mecánica se evaluó midiendo los umbrales de retraimiento de la pata trasera (tanto en las patas lesionadas [es decir, Ipsi] como no lesionadas [es decir Contra]) a un estímulo de presión creciente (en g) usando un 15 Estesiómetro Plantar Dinámico (Ugo-Basile, Italia); se aplicó una varilla de acero a las patas traseras de los ratones con una fuerza creciente (5 gramos en 10 segundos).

Para investigar la eficacia del anticuerpo EE1 en el comportamiento similar al dolor, se determinó la inversión de la hipersensibilidad mecánica de la siguiente manera:

Las inversiones porcentuales se calcularon como (Ipsipostdosis -Ipsipredosis) / (Contrapredosis-Ipsipredosis) para cada ratón.

20 Tras la cirugía, los ratones operados desarrollaron una fuerte sensibilización al estímulo mecánico en la pata lesionada, mientras que la pata no lesionada no se vio afectada. En el Día 11, la sensibilización mecánica en la pata lesionada alcanzó un tope (datos no mostrados).

El anticuerpo EE1, administrado por vía intravenosa el Día 11 demostró una ligera tendencia a invertir la hipersensibilidad mecánica inducida por CCI en los D12, D14 y D18 con 15,2 ± 4,9% y 15,2 ± 5,7% en el D12, 25 26,8 ± 5,7% y 25,7 ± 4,5% en el D14 y 30,3 ± 7,1% y 20,8 ± 5,9% en el D18, a 2,5 y 30 mg/kg respectivamente

(Figura 12 y Tabla 32).

Grupo: Dosis (mg/kg, i.v.) Día 12 después de CCI % efecto ± SEM Día 14 después de CCI % efecto ± SEM Día 18 después de CCI % efecto ± SEM

1B7.11 de control de isotipo: 30 0,2 ± 3,0 1,8 ± 4,3 18,1 ± 6,6

EE1: 2,5 15,2 ± 4,9 26,8 ± 5,7 (**) 30,3 ± 7,1

: 30 15,2 ± 5,7 25,7 ± 4,5 (*) 20,8 ± 5,9

* p <0,05 y ** p <0,01 ANOVA de dos vías con el tiempo como medida repetida seguida de la prueba de Dunnett para el factor grupo para cada nivel de factor tiempo (estadísticas realizadas en valores ipsi Delta)

C2. Hipersensibilidad térmica

5 Para la hipersensibilidad térmica, se evaluaron las medidas de las latencias de retraimiento de la pata (en segundos) en respuesta a un calor radiante utilizando un aparato plantar (IITC, Woodland Hills, EE.UU.) en la pata trasera inyectada.

Para investigar la eficacia del anticuerpo EE1 en el comportamiento similar al dolor, se calculó la inversión de la hipersensibilidad térmica (en %) de la siguiente manera:

10 Las inversiones porcentuales se calcularon como (Ipsipostdosis - Media del control de isotipopostdosis ) /(Media del sin tratamientopostdosis - Media del control de isotipopostdosis) para cada ratón.

Tras la cirugía, los ratones operados desarrollaron una gran sensibilización al estímulo térmico en la pata lesionada, mientras que la pata no lesionada no se vio afectada. En el día 11, la sensibilización térmica en la pata lesionada alcanzó un tope (datos no mostrados).

15 El anticuerpo EE1, administrado por vía intravenosa el día 11, no aumentó significativamente la Latencia de Retraimiento de la Pata de la pata lesionada en D12, incluso aunque se observara una tendencia. Sin embargo, a partir del D14, el anticuerpo EE1 aumentó significativamente el Retraimiento de la Pata (Figura 13).

La inversión de la hipersensibilidad térmica fue 41 ± 16% y 56 ± 24% en D12 y 51 ± 16% y 98 ± 48% en D14 y 78 ± 19% y 84 ± 22% en el D18, para una administración intravenosa de 2,5 mg/kg y 30 mg/kg de anticuerpo EE1, 20 respectivamente (Tabla 33).

Tabla 33. Efecto del anticuerpo EE1 sobre la hipersensibilidad térmica inducida por CCI en ratones C57BI/6 machos Evaluación cinética

Grupo: Dosis (mg/kg, i.v.) Día 12 después de CCI PWL (s) % efecto Día 14 después de CCI PWL (s) % efecto Día 18 después de CCI PWL (s) % efecto

Sin tratamiento: n.a. 6,3 ± 0,5 100 ± 19 6,2 ± 0,4 100 ± 14 6,1 ± 0,5 100 ± 17

1B7.11 de control de isotipo: 30 3,8 ± 0,2 0 ± 7 3,4 ± 0,2 0 ± 5 3,4 ± 0,2 0 ± 7

Claims

5

10

15

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25

30

35

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

i) un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR3), una secuencia de aminoácidos de la región 2 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR2) y una secuencia de aminoácidos de la región 1 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR1), seleccionadas del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 7 [X1Y X2 X3D X4HAM X5Y], en donde

X1 es Y, F o H,

X2 es R, D, A, V, L, I, M, F, Y o W,

X3 es Y, F, W o H,

X4 es D, E o Y, y X5 es D o E;

SEQ ID NO: 8 [YFX1PX2NGNTGYNQKFRG], en donde X1 es D, R, A, V, L, I, M, F, Y o W, y X2 es Y, D, E, N o Q; y

SEQ ID NO: 9 [GYSFTDYX1IY], en donde X1 es N, W o Y; respectivamente,

b) SEQ ID NO: 63 [X1EYDGX2YX3X4LDX5], en donde

X1 es W o F,

X2 es N o ningún aminoácido;

X3 es Y o S,

X4 es D o P, y X5 es F o Y;

SEQ ID NO: 64 [WX1DPENGDX2X3YAPKFQG], en donde X1 es I o V,

X2 es T o S, y X3 es G o D;

SEQ ID NO: 65 [GFNIKDYYX1H], en donde X1 es L o M; respectivamente,

c) SEQ ID NO: 13;

SEQ ID NO: 14; y SEQ ID NO: 15; respectivamente,

d) SEQ ID NO: 32;

SEQ ID NO: 33; y SEQ ID NO: 34; respectivamente,

5

10

15

20

25

30

35

e) SEQ ID NO: 40;

SEQ ID NO: 41; y SEQ ID NO: 42; respectivamente,

f) SEQ ID NO: 47;

SEQ ID NO: 48; y SEQ ID NO: 49; respectivamente,

y

g) SEQ ID NO: 55;

SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57; respectivamente; y

ii) un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de la región 3 determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR3), una secuencia de aminoácidos de la región 2 determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR2) y una secuencia de aminoácidos de la región 1 determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR1), seleccionadas del grupo que consiste en:

h) SEQ ID NO: 10 [QQ X1 X2S X3P X4T], en donde

X1 es Y, F o H,

X2 es Y, F, H o W,

X3 es Y, F, T o H, y,

X4 es W, Y, F, H o L:

SEQ ID NO: 11 [WASTRX1], en donde X1 es E, D, Q o N; y SEQ ID NO: 12 [KSSQSLL X1SSNQKN X2LA], en donde X1 es W, H, Y o F, y X2 es H o Y; respectivamente,

i) SEQ ID NO: 66 [QX1X2X3SX4PX5T], en donde

X1 es Q o N,

X2 es Y, F, D o H,

X3 es Y, F, H o W,

X4 es Y, F, T o H, y X5 es W, Y, F, H o L;

SEQ ID NO: 67 [X2ASTRX2], en donde X1 es W o G, y X2 es E, D, Q o N; y

SEQ ID NO: 68 [KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA], en donde X1 es W, H, Y o F,

5

10

15

20

25

30

35

40

X2 es S o G,

X3 es N o D,

X4 es K o R,

X5 es H o Y; respectivamente,

j) SEQ ID NO: 69 [X1QGTHFPYT], en donde X1 es L o M;

SEQ ID NO: 36; y

SEQ ID NO: 70 [KSSQSLLYSNGX1TYLN], en donde X1 es K o E; respectivamente,

k) SEQ ID NO: 16;

SEQ ID NO: 17; y SEQ ID NO: 18; respectivamente,

l) SEQ ID NO: 35;

SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37; respectivamente,

m) SEQ ID NO: 43;

SEQ ID NO: 17; y SEQ ID NO: 44; respectivamente,

n) SEQ ID NO: 50;

SEQ ID NO: 51; y SEQ ID NO: 52; respectivamente,

y

o) SEQ ID NO: 58;

SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60; respectivamente.
2. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, y una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas del grupo que consiste en H1, H5, H9, H11, H12, H16, H38, H40, H41, H43, H44, H66, H75, H79, H81, H82A, H83, H87 y H108, según Kabat; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente, y una o más sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas del grupo que consiste en L5, L9, L15, L18, L19, L21, L22, L43, L63, L78,

5

10

15

20

25

30

35

40

L79, L83, L85, L100 y L104, según Kabat.
3. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada y de la cadena ligera expuestas en las SEQ ID NO: 24 y 30, respectivamente.
4. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
5. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

una secuencia de aminoácidos del dominio de la región variable de la cadena pesada, y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera con al menos un 90% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 19 y 26, respectivamente,

b) SEQ ID NO: 20 y 27, respectivamente,

c) SEQ ID NO: 21 y 28, respectivamente,

d) SEQ ID NO: 22 y 28, respectivamente,

e) SEQ ID NO: 23 y 29, respectivamente,

f) SEQ ID NO: 24 y 30, respectivamente,

g) SEQ ID NO: 25 y 31, respectivamente,

h) SEQ ID NO: 38 y 39, respectivamente,

i) SEQ ID NO: 45 y 46, respectivamente,

j) SEQ ID NO: 53 y 54, respectivamente,

k) SEQ ID NO: 61 y 62, respectivamente.
6. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos, seleccionadas del grupo que consiste en:

a) SEQ ID NO: 19, y 26, respectivamente,

b) SEQ ID NO: 20 y 27, respectivamente,

c) SEQ ID NO: 21 y 28, respectivamente,

d) SEQ ID NO: 22 y 28, respectivamente,

e) SEQ ID NO: 23 y 29, respectivamente,

f) SEQ ID NO: 24 y 30, respectivamente,

g) SEQ ID NO: 25 y 31, respectivamente,

h) SEQ ID NO: 38 y 39, respectivamente,

i) SEQ ID NO: 45 y 46, respectivamente,

j) SEQ ID NO: 53 y 54, respectivamente

k) SEQ ID NO: 61 y 62, respectivamente.
7. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la

5

10

15

20

25

30

35

40

reivindicación 2 y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
8. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de consenso de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID nO: 7, 8 y 9, respectivamente; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, respectivamente.
9. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina de la reivindicación 8, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente.
10. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 32, 33 y 34, respectivamente; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 35, 36 y 37, respectivamente.
11. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 40, 41 y 42, respectivamente; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 43, 17 y 44, respectivamente.
12. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 47, 48 y 49, respectivamente; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 50, 51 y 52, respectivamente.
13. El anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Calidina o des-Arg10-Calidina pero no a Bradicinina o des-Arg9-Bradicinina de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias amino de las regiones HCDR3, HCDR2 y HCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 55, 56 y 57, respectivamente; y

b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias amino de las regiones LCDR3, LCDR2 y LCDR1 expuestas en las SEQ ID NO: 58, 59 y 60, respectivamente.