CN113773385A - 缓激肽b1受体配体的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及缓激肽B1受体配体的抗体，具体地提供可以特异性结合胰激肽或脱‑Arg10‑胰激肽的抗体。本公开也提供药物组合物，及编码抗胰激肽或脱‑Arg10‑胰激肽抗体的核酸，用于制备此类抗体或其片段的重组载体及宿主细胞。本发明也提供利用公开的抗体，在体内或体外调节胰激肽或脱‑Arg10‑胰激肽活性，或检测胰激肽或脱‑Arg10‑胰激肽的方法。本公开进一步提供制备可特异性结合脱‑Argg‑缓激肽和脱‑Arg10‑胰激肽样多肽抗体的方法。

Description

缓激肽B1受体配体的抗体
本发明申请是基于申请日为2013年03月15日，申请号为201380027405.8(国际申请号为PCT/US2013/031836)、名称为“缓激肽B1受体配体的抗体”的发明专利申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2012年3月28日提交的美国临时申请61/616,845及2013年2月4日提交的法国专利申请1350953的权益。这些申请的内容通过提及完整并入本文。
发明背景
缓激肽B1受体涉及炎性疾病和慢性疼痛的发病机理。通过调节组织炎症和肾纤维化，B1受体也与急性肾损伤及慢性肾脏疾病的发病机理相关，慢性肾脏疾病是终末期肾功能衰竭的主要原因。
在人类，缓激肽B1受体的主要激动剂是激肽。激肽是由激肽原蛋白经蛋白水解裂解产生的生物活性肽。缓激肽B1受体的主要激肽激动剂是十肽胰激肽，和九肽脱-Arg10-胰激肽(通过蛋白水解裂解胰激肽的C端精氨酸形成)。因此，可以抑制胰激肽和脱-Arg10-胰激肽结合缓激肽B1受体的制剂，具有潜力治疗或预防缓激肽B1受体介导的病理过程。
相应地，有必要在本领域利用可以抑制胰激肽和脱-Arg10-胰激肽结合缓激肽B1受体新型制剂，来治疗缓激肽B1受体介导的人类病理过程。
发明概述
本发明提供的抗体或其片段，可以特异性结合胰激肽和脱-Arg10-胰激肽，并可阻止胰激肽和脱-Arg10-胰激肽与缓激肽B1受体的结合。这类抗体对治疗胰激肽和脱-Arg10-胰激肽相关疾病或失调(例如，疼痛或纤维化)特别有效。本发明也提供药物组合物，以及可以制备这类抗体或其片段的编码抗胰激肽和脱-Arg10-胰激肽抗体的核酸，重组表达载体和宿主细胞。利用本发明所述抗体或其片段检测或调节胰激肽和脱-Arg10-胰激肽活性的方法，也包含在本发明中。本发明还提供制备可特异性结合脱-Arg9-缓激肽和脱-Arg10-胰激肽样肽的抗体的方法。
相应地，一方面本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其：
a)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽；
b)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽，其KD值小于1x10-10 M；
c)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽，其Koff小于1x104s-1；或
d)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽并抑制其结合缓激肽B1受体。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段结合至胰激肽或脱-Arg10-胰激肽N-末端赖氨酸残基。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段抑制胰激肽或脱-Arg10-胰激肽结合缓激肽-1受体。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合小鼠胰激肽样肽(KLP)。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含一个重链可变区，该重链可变区包含选自下组的HCDR3氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:7[X1Y X2 X3D X4HAM X5Y]，其中
X1是Y，F或H，
X2是R，D，A，V，L，I，M，F，Y或W，
X3是Y，F，W或H，
X4是D，E或Y，和，
X5是D或E；
b)SEQ ID NO:63[X1EYDGX2YX3X4LDX5]，其中
X1是W或F
X2是N或无氨基酸；
X3是Y或S，
X4是D或P，和
X5是F或Y；
c)SEQ ID NO:13；
d)SEQ ID NO:32；
e)SEQ ID NO:40；
f)SEQ ID NO:47；和
g)SEQ ID NO:55。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组中的HCDR2氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:8[YFX1PX2NGNTGYNQKFRG]，其中
X1是D，R，A，V，L，I，M，F，Y或W，和
X2是Y，D，E，N或Q；
b)SEQ ID NO:64[WX1DPENGDX2X3YAPKFQG]，其中
X1是I或V，
X2是T或S，和
X3为G或D；
c)SEQ ID NO:14
d)SEQ ID NO:33；
e)SEQ ID NO:41；
f)SEQ ID NO:48；和
g)SEQ ID NO:56。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组中的HCDR1氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:9[GYSFTDYX1IY]，其中X1为N，W或Y；
b)SEQ ID NO:65[GFNIKDYYX1H]，其中X1是L，或M；
c)SEQ ID NO:15；
d)SEQ ID NO:34；
e)SEQ ID NO:42；
f)SEQ ID NO:49；和
g)SEQ ID NO:57。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含一个轻链可变区，该轻链可变区包含选自下组的LCDR3氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:10[QQ X1 X2S X3P X4T]，其中
X1是Y，F或H，
X2是Y，F，H或W，
X3是Y，F，T或H，和，
X4是W，Y，F，H或L：
b)SEQ ID NO:66[QX1X2X3SX4PX5T]，其中
X1是Q或N，
X2是Y，F，D或H，
X3是Y，F，H或W，
X4是Y，F，T或H，和
X5是W，Y，F，H或L；
c)SEQ ID NO:69[X1QGTHFPYT]，其中X1为L或M；
d)SEQ ID NO:16；
e)SEQ ID NO:35；
f)SEQ ID NO:43；
g)SEQ ID NO:50；和
h)SEQ ID NO:58。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的LCDR2氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:11[WASTRX1]，其中X1是E，D，Q或N；
b)SEQ ID NO:67[X1ASTRX2]，其中
X1是W或G和
X2是E，D，Q或N；
c)SEQ ID NO:17；
d)SEQ ID NO:36；
e)SEQ ID NO:51；和
f)SEQ ID NO:59。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的LCDR1氨基酸序列:
a)SEQ ID NO:12[KSSQSLL X1SSNQKN X2LA]，其中
X1是W，H，Y或F，和
X2是H或Y；
b)SEQ ID NO:68[KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA]，其中
X1是W，H，Y或F，
X2是S或G，
X3是N或D，
X4是K或R，
X5是H或Y。
c)SEQ ID NO:70[KSSQSLLYSNGX1TYLN]，其中X1为K或E；
b)SEQ ID NO:18；
c)SEQ ID NO:37；
d)SEQ ID NO:44；
e)SEQ ID NO:52；和
f)SEQ ID NO:60。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含一个轻链可变区，该轻链可变区包含选自下组的LCDR3氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:10[QQ X1 X2S X3P X4T]，其中
X1是Y，F或H，
X2是Y，F，H或W，
X3是Y，F，T或H，和，
X4是W，Y，F，H或L：
b)SEQ ID NO:66[QX1X2X3SX4PX5T]，其中
X1是Q或N，
X2是Y，F，D或H，
X3是Y，F，H或W，
X4是Y，F，T或H，和
X5是W，Y，F，H或L；
c)SEQ ID NO:69[X1QGTHFPYT]，其中X1为L或M；
d)SEQ ID NO:16；
e)SEQ ID NO:35；
f)SEQ ID NO:43；
g)SEQ ID NO:50；和
h)SEQ ID NO:58。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的LCDR2氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:11[WASTRX1]，其中X1是E，D，Q或N；
b)SEQ ID NO:67[X1ASTRX2]，其中
X1是W或G和
X2是E，D，Q或N；
c)SEQ ID NO:17；
d)SEQ ID NO:36；
e)SEQ ID NO:51；和
f)SEQ ID NO:59。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的LCDR1氨基酸序列:
a)SEQ ID NO:12[KSSQSLL X1SSNQKN X2LA]，其中
X1是W，H，Y或F，和
X2是H或Y；
b)SEQ ID NO:68[KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA]，其中
X1是W，H，Y或F，
X2是S或G，
X3是N或D，
X4是K或R，
X5是H或Y。
c)SEQ ID NO:70[KSSQSLLYSNGX1TYLN]，其中X1为K或E；
b)SEQ ID NO:18；
c)SEQ ID NO:37；
d)SEQ ID NO:44；
e)SEQ ID NO:52；和
f)SEQ ID NO:60。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区含有HCDR3,HCDR2和HCDR1区，HCDR3,HCDR2和HCDR1的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs 13,14,和15所示，且根据Kabat，其有一个或多个选自下列位点的氨基酸取代：H1，H5，H9，H11，H12，H16，H38，H40，H41，H43，H44，H66，H75，H79，H81，H82A，H83，H87，和H108。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区含有LCDR3,LCDR2和LCDR1区，LCDR3,LCDR2和LCDR1区的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs 16,17,和18所示，且根据Kabat，其有一个或多个选自下列位点的基酸取代选自L5，L9，L15，L18，L19，L21，L22，L43，L63，L78，L79，L83，L85，L100和L104。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含有一个重链可变区氨基酸序列，该序列与包含SEQ ID NOs：19，20，21，22，24，25，38，45，53，和61的组的任何序列具有至少90％一致性。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含有一个轻链可变区氨基酸序列，该序列与包含SEQ ID NOs：26，27，28，29，29，30，31，39，46，54，和62的组的任何序列具有至少90％一致性。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含有一个轻链可变区氨基酸序列，该序列与包含SEQ ID NOs：26，27，28，29，29，30，31，39，46，54，和62的组的任何序列具有至少90％一致性。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含有一个重链可变区氨基酸序列，其选自包含SEQ ID NOs：19，20，21，22，24，25，38，45，53，和61的组。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含有一个轻链可变区氨基酸序列，其选自包含SEQ ID NOs：26，27，28，29，29，30，31，39，46，54，和62的组。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含有一段选自SEQ ID NOs：26，27，28，29，29，30，31，39，46，54，和62的氨基酸序列。
在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含的重链和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19和26，SEQ ID NO:20和27；SEQ ID NO:21和28；SEQ ID NO:22和28；SEQ ID NO:23和29；SEQ ID NO:24和30；SEQ ID NO:25和31；SEQ ID NO:38和39；SEQ IDNO:45和46，SEQ ID NO:53和54，或SEQ ID NO:61和62所示。
在另一方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，可特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽，上述抗体或其抗原结合片段，与含重链和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQID NO:19和26，SEQ ID NO:38和39，SEQ ID NO:45和46，SEQ ID NO:53和54，或SEQ ID NO:61和62所示的抗体，竞争性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽。
在另一方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，与前述任一权利要求所述的抗体竞争结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽，并且不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽。
在另一方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，可特异性结合胰激肽(KD)或脱-Arg10-胰激肽(DAKD)的一个构象表位，其中KD或DAKD采用一个包括在4位脯氨酸II型紧密转角的Pro4结节构象。在一个实施例中，KD或DAKD的Pro 4结节构象进一步包含一个S形的氨基酸重复，其将氨基酸链的疏水性侧链排成空间堆积模式。在另一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：(a)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽；(b)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽，KD值小于1x10-10 M；(c)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽，Koff小于1x104s-1；或(d)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽并抑制其结合缓激肽B1受体。
在另一方面，本发明所述抗体或抗原结合片段结合到一种诊断或治疗试剂上。
在另一方面，本发明提供一种分离的编码本发明所述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的核酸。
在另一方面，本发明提供包含有本发明所述核酸的重组表达载体。
在另一方面，本发明提供包含有本发明所述重组表达载体的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供一种生产可特异结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽的抗体的方法，包括：在可让宿主细胞产生一种特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽的抗体的条件下培养本发明所述的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明所述抗体或其抗原结合片段，及一种或多种药学上可接受的载体。
在另一方面，本发明提供一种用于治疗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽相关的疾病或失调的方法，其包括给需要的受试者施用本发明所述的药物组合物。
在一个实施例中，所述疾病或失调是慢性疼痛。
在另一方面，本发明提供一种产生特异性结合脱-Arg9-缓激肽和脱-Arg10-胰激肽样肽的抗体的方法，包括：用包含肽的免疫原免疫动物，其中所述肽含有如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列，并且其中所述肽的氨基末端的精氨酸通过连接体被间接偶联到一个载体基团上，这样，动物的免疫系统可产生特异性结合脱-Arg9-缓激肽，脱-Arg10-胰激肽和脱-Arg10-胰激肽样肽的抗体。
在另一个实施例中，本发明所述的方法进一步包括：从所述动物中，分离所述抗体，分离编码该抗体的核酸，或表达该抗体的免疫细胞。
在一个实施例中，所述载体基团是蛋白质。在另一个实施例中，上述蛋白质是匙孔血蓝蛋白(KLH)。在另一个实施例中，其中所述连接体基团包含：[Gly-Gly-Gly]n，其中n至少为1。
具体地，本发明涉及如下各项：
1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其：
a)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽；
b)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽，KD值小于1x10-10 M；
c)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽，Koff小于1x104s-1；和/或
d)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽并抑制其结合缓激肽B1受体。
2.前述任一项所述抗体或其抗原结合片段，结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽的N-末端赖氨酸残基。
3.前述任一项所述抗体或抗原结合片段，抑制胰激肽或脱-Arg10-胰激肽结合缓激肽-1受体。
4.前述项所述抗体或其抗原结合片段，特异性结合小鼠胰激肽样肽(KLP)。
5.前述任一项所述抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，该重链可变区包含选自下组的HCDR3氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:7[X1Y X2 X3D X4HAM X5Y]，其中
X1是Y，F或H，
X2是R，D，A，V，L，I，M，F，Y或W，
X3是Y，F，W或H，
X4是D，E或Y，和，
X5是D或E；
b)SEQ ID NO:63[X1EYDGX2YX3X4LDX5]，其中
X1是W或F
X2是N或无氨基酸；
X3是Y或S，
X4是D或P，和
X5是F或Y；
c)SEQ ID NO:13；
d)SEQ ID NO:32；
e)SEQ ID NO:40；
f)SEQ ID NO:47；和
g)SEQ ID NO:55。
6.前述任一项所述抗体或其抗原结合片段，进一步包含选自下组的HCDR2氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:8[YFX1PX2NGNTGYNQKFRG]，其中
X1是D，R，A，V，L，I，M，F，Y或W，和
X2是Y，D，E，N或Q；
b)SEQ ID NO:64[WX1DPENGDX2X3YAPKFQG]，其中
X1是I或V，
X2是T或S，和
X3为G或D；
c)SEQ ID NO:14
d)SEQ ID NO:33；
e)SEQ ID NO:41；
f)SEQ ID NO:48；和
g)SEQ ID NO:56。
7.前述任一项所述抗体或其抗原结合片段，进一步包含选自下组的HCDR1氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:9[GYSFTDYX1IY]，其中X1为N，W或Y；
b)SEQ ID NO:65[GFNIKDYYX1H]，其中X1是L，或M；
c)SEQ ID NO:15；
d)SEQ ID NO:34；
e)SEQ ID NO:42；
f)SEQ ID NO:49；和
g)SEQ ID NO:57。
8.前述任一项所述抗体或其抗原结合片段，进一步包括轻链可变区，该轻链可变区包含选自下组的LCDR3氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:10[QQ X1 X2S X3P X4T]，其中
X1是Y，F或H，
X2是Y，F，H或W，
X3是Y，F，T或H，和，
X4是W，Y，F，H或L；
b)SEQ ID NO:66[QX1X2X3SX4PX5T]，其中
X1是Q或N，
X2是Y，F，D或H，
X3是Y，F，H或W，
X4是Y，F，T或H，和
X5是W，Y，F，H或L；
c)SEQ ID NO:69[X1QGTHFPYT]，其中X1为L或M；
d)SEQ ID NO:16；
e)SEQ ID NO:35；
f)SEQ ID NO:43；
g)SEQ ID NO:50；和
h)SEQ ID NO:58。
9.前述任一项所述抗体或其抗原结合片段，进一步包含选自下组的LCDR2氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:11[WASTRX1]，其中X1是E，D，Q或N；
b)SEQ ID NO:67[X1ASTRX2]，其中
X1是W或G，和
X2是E，D，Q或N；
c)SEQ ID NO:17；
d)SEQ ID NO:36；
e)SEQ ID NO:51；和
f)SEQ ID NO:59。
10.前述任一项所述抗体或其抗原结合片段，进一步包含从下组中选出的LCDR1氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:12[KSSQSLL X1SSNQKN X2LA]，其中
X1是W，H，Y或F，和
X2是H或Y；
b)SEQ ID NO:68[KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA]，其中
X1是W，H，Y或F，
X2是S或G，
X3是N或D，
X4是K或R，
X5是H或Y。
c)SEQ ID NO:70[KSSQSLLYSNGX1TYLN]，其中X1为K或E；
b)SEQ ID NO:18；
c)SEQ ID NO:37；
d)SEQ ID NO:44；
e)SEQ ID NO:52；和
f)SEQ ID NO:60。
11.项1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，该轻链可变区含有选自下组的LCDR3氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:10[QQ X1 X2S X3P X4T]，其中
X1是Y，F或H，
X2是Y，F，H或W，
X3是Y，F，T或H，和，
X4是W，Y，F，H或L：
b)SEQ ID NO:66[QX1X2X3SX4PX5T]，其中
X1是Q或N，
X2是Y，F，D或H，
X3是Y，F，H或W，
X4是Y，F，T或H，和
X5是W，Y，F，H或L；
c)SEQ ID NO:69[X1QGTHFPYT]，其中X1为L或M；
d)SEQ ID NO:16；
e)SEQ ID NO:35；
f)SEQ ID NO:43；
g)SEQ ID NO:50；和
h)SEQ ID NO:58。
12.项11所述抗体或其抗原结合片段，进一步包含选自下组的LCDR2氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:11[WASTRX1]，其中X1是E，D，Q或N；
b)SEQ ID NO:67[X2ASTRX2]，其中
X1是W或G，和
X2是E，D，Q或N；
c)SEQ ID NO:17；
d)SEQ ID NO:36；
e)SEQ ID NO:51；和
f)SEQ ID NO:59。
13.项12所述抗体或其抗原结合片段，进一步包含选自下组的LCDR1氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:12[KSSQSLLX1SSNQKN X2LA]，其中
X1是W，H，Y或F，和
X2是H或Y；
b)SEQ ID NO:68[KSSQSLLX1X2SX3QX4NX5LA]，其中
X1是W，H，Y或F，
X2是S或G，
X3是N或D，
X4是K或R，
X5是H或Y。
c)SEQ ID NO:70[KSSQSLLYSNGX1TYLN]，其中X1为K或E；
b)SEQ ID NO:18；
c)SEQ ID NO:37；
d)SEQ ID NO:44；
e)SEQ ID NO:52；和
f)SEQ ID NO:60。
14.项1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，该重链可变区含有HCDR3,HCDR2和HCDR1区，HCDR3,HCDR2和HCDR1区的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs 13,14,和15所示，且根据Kabat，有一个或多个选自下列位点的氨基酸取代：H1，H5，H9，H11，H12，H16，H38，H40，H41，H43，H44，H66，H75，H79，H81，H82A，H83，H87，和H108。
15.项14所述抗体或其抗原结合片段，其进一步包含轻链可变区，该轻链可变区含有LCDR3,LCDR2和LCDR1区，LCDR3,LCDR2和LCDR1区的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs 16,17,和18所示，且根据Kabat，有一个或多个选自下列位点的氨基酸取代：L5，L9，L15，L18，L19，L21，L22，L43，L63，L78，L79，L83，L85，L100和L104。
16.项1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，该轻链可变区含有LCDR3,LCDR2和LCDR1区，LCDR3,LCDR2和LCDR1区的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs 16,17,和18所示，且根据Kabat，有一个或多个选自下列氨基酸位点的取代：L5，L9，L15，L18，L19，L21，L22，L43，L63，L78，L79，L83，L85，L100和L104。
17.项1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含一个重链可变区氨基酸序列，该序列与包含SEQ ID NOs：19，20，21，22，24，25，38，45，53，和61的组的任何序列具有至少90％一致性。
18.项17所述抗体或其抗原结合片段，其进一步包含一个轻链可变区氨基酸序列，该序列与包含SEQ ID NOs：26，27，28，29，29，30，31，39，46，54，和62的组中任何序列具有至少90％一致性。
19.项1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含一个轻链可变区氨基酸序列，该序列与包含SEQ ID NOs：26，27，28，29，29，30，31，39，46，54，和62的组中的任何序列具有至少90％一致性。
20.项1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含一个重链可变区氨基酸序列，其选自包含SEQ ID NOs：19，20，21，22，24，25，38，45，53，和61的组。
21.项20所述抗体或其抗原结合片段，其进一步包含一个轻链可变结构域氨区基酸序列，其选自包含SEQ ID NOs：26，27，28，29，29，30，31，39，46，54，和62的组。
22.项1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含的氨基酸序列选自包含SEQ IDNOs：26，27，28，29，29，30，31，39，46，54，和62的组。
23.项1-4任一所述抗体或其抗原结合片段，其包含的重链和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19和26，SEQ ID NO:20和27；SEQ ID NO:21和28；SEQ ID NO:22和28；SEQ ID NO:23和29；SEQ ID NO:24和30；SEQ ID NO:25和31；SEQ ID NO:38和39；SEQ IDNO:45和46，SEQ ID NO:53和54，或SEQ ID NO:61和62所示。
24.一种抗体或其抗原结合片段，可特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽，其中所述抗体或其抗原结合片段，与含重链和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19和26，SEQ ID NO:38和39，SEQ ID NO:45和46，SEQ ID NO:53和54，或SEQ ID NO:61和62所示的抗体，竞争性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽。
25.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，与前述任一项所述的抗体竞争性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽，并且不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽。
26.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，可特异性结合胰激肽(KD)或脱-Arg10-胰激肽(DAKD)的一个构象表位，其中KD或DAKD采用一个包括在4位脯氨酸II型紧密转角的Pro4结节构象。
27.项26所述抗体或抗原结合片段，其中KD或DAKD的Pro 4的结节构象还包括一个S形的氨基酸重复，其将氨基酸链的疏水性侧链排成空间堆积模式。
28.项26或27所述的抗体或抗原结合片段，其
a)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽；
b)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽，KD值小于1x10-10 M；
c)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽，Koff小于1x104s-1；和/或
d)特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽并抑制其结合缓激肽B1受体。
29.前述任一项所述的抗体，结合至一种诊断性或治疗性试剂。
30.一种分离的核酸，其编码前述任一项所述的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。
31.一种重组表达载体，其包含项30所述的核酸。
32.一种宿主细胞，其包含项31所述的重组表达载体。
33.一种生产可特异结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽的抗体的方法，包括：在可让宿主细胞产生一种特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽的抗体的条件下培养项32所述的宿主细胞。
34.一种药物组合物，其包含项1-28任一所述抗体或其抗原结合片段，及一种或多种药学上可接受的载体。
35.一种用于治疗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽相关的疾病或失调的方法，包括给需要的受试者施用项34所述的药物组合物。
36.项35所述的方法，其中所述疾病或失调是慢性疼痛。
37.一种产生特异性结合脱-Arg9-缓激肽和脱-Arg10-胰激肽样肽的抗体的方法，包括：用包含肽的免疫原免疫动物，其中所述肽含有如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列，并且其中所述肽的氨基末端的精氨酸通过连接体被间接偶联到一个载体基团上，这样，动物的免疫系统可产生特异性结合脱-Arg9-缓激肽，脱-Arg10-胰激肽和脱-Arg10-胰激肽样肽的抗体。
38.项37所述的方法，进一步包括从所述动物中，分离抗体，分离编码该抗体的核酸，或表达该抗体的免疫细胞。
39.项37所述的方法，其中所述载体基团是蛋白质。
40.项39所述的方法，其中所述蛋白质是匙孔血蓝蛋白(KLH)。
41.项40所述的方法，其中所述连接体基团包含：[Gly-Gly-Gly]n，其中n至少为1。
附图简述
图1示出了ELISA分析法验证EE1抗体与激肽结合的结果。
图2示出了差示扫描量热法测量抗体F151的结果。
图3示出了鼠和人源化F151抗体的可变区的氨基酸序列比对。所有相同的残基列在直线上，同源性残基用“+”号标识，非同源残基被留为空白。
图4示出了F151抗体/胰激肽复合物的抗原结合位点的电子密度图。
图5示出了F151抗体/脱-Arg10-胰激肽复合物的抗原结合位点的电子密度图。
图6示出了结合到胰激肽的F151的Fv亚基的一个条带球棍表示法。
图7示出了本发明的示例性鼠抗胰激肽抗体的轻链可变区的一个氨基酸序列比对。与胰激肽相互作用的氨基酸残基以星号标识。
图8示出了本发明的示例性鼠抗胰激肽抗体的重链可变区的一个氨基酸序列比对。与胰激肽相互作用的氨基酸残基以星号标识。
图9示出了体内试验确定EE1抗体对福尔马林诱导的急性炎性痛的作用结果。
图10示出了体内试验确定EE1抗体对弗氏完全佐剂(CFA)诱导的机械性超敏反应的作用结果。
图11示出了体内试验确定EE1抗体对弗氏完全佐剂(CFA)诱导的热超敏性的作用结果。
图12示出了体内实验确定EE1抗体对CCI诱导的机械性超敏性的作用结果。
图13示出了体内试验确定EE1抗体对CCI诱导的热超敏性的作用结果。
图14示出了用于产生人源化F151变种HC3a/LC3a的VL和VH表达构建体示意图，构建体有限制性DNA的核酸内切酶位点，推导的酶切位点序列以粗体和下划线表示。图A示出了轻链,图B示出了重链。
图15示出了F151重链(A)和轻链(B)氨基酸序列与最接近的人源氨基酸序列的比对。
图16示出了F151重链(A)和轻链(B)与VH1亚家族的重链基因座(1-08&1-18)和轻链基因座(V IV-B3)的比对。CDR区和游标区域表示为粗体，人源化突变表示为下划线。
图17示出了当胰激肽(KD)结合到F151抗体时，其主链多肽骨架构象的(A)二级和(B)三级结构，F151抗体含有在4位脯氨酸处II型紧密转角(C)。
发明详述
本发明提供可特异性结合胰激肽和脱-Arg10-胰激肽并阻止胰激肽和脱-Arg10-胰激肽与缓激肽B1受体结合的抗体。这类抗体对治疗胰激肽和脱-Arg10-胰激肽相关的疾病或失调特别有效(例如，疼痛)。本发明也提供药物组合物，及用于制备这类抗体或其抗原结合片段的编码抗胰激肽和脱-Arg10-胰激肽抗体的核酸，重组表达载体及宿主细胞。本发明也包括：利用本发明所述抗体在体外或体内检测或调节胰激肽和脱-Arg10-胰激肽活性的方法。
I.定义
便于本发明更好地被理解，首先定义一些术语。
本文所用术语“胰激肽”，指包含或由氨基酸序列KRPPGFSPFR(SEQ ID NO.1)构成的多肽。
本文所用术语“脱-Arg10-胰激肽”，指包含或由氨基酸序列KRPPGFSPF(SEQ IDNO.2)构成的多肽。
本文所用术语“小鼠胰激肽”或“胰激肽样肽”，指包含或由氨基酸序列RRPPGFSPFR(SEQ ID NO.3)构成的多肽。
本文所用术语“小鼠脱-Arg10-胰激肽”或“脱-Arg10-胰激肽样肽”，指包含或由氨基酸序列RRPPGFSPF(SEQ ID NO.4)构成的多肽。
本文所用术语“缓激肽”，指包含或由氨基酸序列RPPGFSPFR(SEQ ID NO.5).构成的多肽。
本文所用术语“脱-Arg9-缓激肽”，指包含或由氨基酸序列RPPGFSPF(SEQ IDNO.6)构成的多肽。
本文所用术语“抗体”，指包括四条多肽链的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如IgM)，免疫球蛋白分子的两条重(H)链和两条轻(L)链通过二硫键相互连接。每条重链包含一个重链可变区(简写为VH或VH)和一个重链恒定区(简写为CH或CH)。重链恒定区包含三个结构域，CH1，CH2，CH3。每条轻链包含一个轻链可变区(简写为VL)和一个轻链恒定区(简写为CL或CL)。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDRs)，及散布的更加保守的，称为骨架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDRs和四个FRs，从N端至C端按以下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。
本文所用术语抗体的“抗原结合片段”包括：任何天然存在的、酶法制得的、合成的或遗传工程制备的多肽或糖蛋白，这些多肽或糖蛋白可特异性结合抗原形成复合物。抗体的抗原结合片段可以源自，例如，通过使用任何适宜的标准技术从全抗体分子获得，如蛋白水解消化或重组基因工程技术，该技术涉及操纵和表达编码抗体可变区和可选的恒定结构域的的DNA。非限制性的抗原结合部分的实施例包括：(i)Fab片段；(ii)的F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(ⅶ)模仿抗体高变区(例如，分离的互补决定区(CDR))的氨基酸残基构成的最小识别单位。“抗原结合片段”的表述中也包括其它工程分子，如双体，三体，四体和微体。
本文所用术语“CDR”或“互补决定区”，指从重链和轻链多肽链可变区中所发现的不连续的抗原结合位点。Kabat等.J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等Sequences of protein of immunological interest.(1991),及Chothia等.J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和MacCallum等.J.Mol.Biol.262:732-745(1996)中已经描述过这些具体区域，相互比较起来，其中的定义包含一定的重叠及氨基酸残基亚群。根据以上引用的参考文献定义所确定的构成CDR的氨基酸残基，展示用于比较。在本发明的一个实施例中，术语“CDR”是根据Kabat的定义，即基于序列比较所确定的一个CDR。
本文所用术语“框架(FR)氨基酸残基”，指在Ig链框架区的氨基酸。本文所用的术语“构架区”或“FR区”，包含的氨基酸残基：是可变区的一部分，但不是CDR(例如，根据Kabat定义的CDRs)的一部分。因此，可变区框架长度约为100-120个氨基酸之间，但它仅包括CDR外的那些氨基酸。
本文所用术语“特异性结合”，指抗体或其抗原结合片段结合抗原的能力表示为平衡解离常数(Kd)，至少约1x10－6M，1x10-7M，1x10-8M，1x10-9M，1x10-10M，1x10-11M，1x10-12M，或者更高。该术语也包括指：抗体或其抗原结合片段结合所述抗原的亲和力至少在非特异性抗原的两倍以上。应当理解，然而，抗体或其抗原结合片段能够特异性结合两个或更多的抗原，这些抗原与序列相关(例如，胰激肽或脱-Arg10-胰激肽和小鼠胰激肽或脱-Arg10-胰激肽)。
本文所用术语“抗原”，指被抗体或其抗原结合片段识别的结合位点或表位。
本文所用术语“载体”，意指一个可以转运与其相连的另一个核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指的是可以把另外的DNA片段连接到它上边的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体可以在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有复制原点的细菌性载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)导入宿主细胞时可以被整合到宿主细胞的基因组中，因而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。此类载体，在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般来说，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒。术语“质粒”和“载体”可以互换使用。然而，本发明也意图包括此类其他形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)，它们可以发挥与质粒等效的功能。
本文所用术语“宿主细胞”，意指导入了重组表达载体的细胞。但是应当理解的是，这个术语不仅意指特定的主细胞，还指这种细胞的子代。因为在随后的传代中由于突变或环境影响可以发生某些修饰，此种后代细胞实际上不等同于亲本细胞，但仍包括在本文所用术语“宿主细胞”的范围之内。
本文所用术语“治疗”("treat")，“治疗”("treating")和“治疗”("treatment")是指本文所述的治疗性或预防性措施。“治疗”("treatment")的方法采用给具有胰激肽或脱-Arg10-胰激肽相关的疾病或失调(例如炎性疾病)或倾向于患这类疾病或失调的受试者施用本发明的抗体或其抗原结合片段，来预防，治愈，延迟该疾病或失调、或复发性疾病或失调，降低其严重程度，或改善其一种或多种症状，或延长受试者在无此类治疗情况下预期的存活期。
本文所用术语“胰激肽或脱-Arg10-胰激肽相关疾病或失调”，包括疾病状态和/或疾病状态相关症状，在其发现胰激肽或脱-Arg10-胰激肽水平或活性变化。示例性胰激肽或脱-Arg10-胰激肽相关疾病或失调包括，但不限于，疼痛和纤维化。
本文所用术语“有效量”，指施用与受试者时，结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽的抗体或其抗原结合片段的量，足以对如本文所述的胰激肽或脱-Arg10-胰激肽相关疾病或失调，产生治疗，预防或诊断的效果。治疗有效量根据受试者和用于治疗的疾病情况，受试者体重和年龄，疾病状况的严重程度，给药方式等不同而变化，可由本领域普通技术人员容易地确定。本发明所述抗体或其抗原结合片段的施用剂量范围，例如，从约1ng到约10,000mg,约1ug到约5,000mg,约1mg到约1,000mg,约10mg到约100mg。剂量方案可进行调整以提供最佳治疗反应。有效量也指抗体或其抗原结合片段的毒性或有害作用(即副作用)最小或受益效果更明显时的量。
本文所使用术语“受试者”，包括任何人或非人类动物。
本文所用术语“表位”，指抗原决定簇，其可与被称为互补位的抗体分子的可变区特异性的抗原结合位点相互作用。一个单一的抗原可以具有一个以上的表位。因此，不同的抗体可结合到一个抗原上不同的区域，并且可以具有不同的生物效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位是由线性多肽链上不同片段在空间上靠近的氨基酸所产生的。线性表位是由多肽链的相邻氨基酸残基产生的。
这里应当注意的是，本说明书和所附权利要求书中所用单数形式"a,""an,"及"the"包括相关复数，除非上下文另有明确说明。
II.抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体
一方面，本发明提供抗体或其片段，可以特异性结合胰激肽和脱-Arg10-胰激肽。本发明的示例性的抗体的VH,VL和CDR列于表1
表1.代表性抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体的VH,VL和CDR氨基酸序列
Figure BDA0003269908170000211
Figure BDA0003269908170000221
Figure BDA0003269908170000231
Figure BDA0003269908170000241
Figure BDA0003269908170000251
在一些实施例中，本发明所述抗体或其抗原结合片段含有一个或更多由SEQ IDNO:7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,32,33,34,35,36,37,40,41,42,43,44,47,48,49,50,51 52,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,或70构成的组中选出的CDR区氨基酸序列。
在另一些实施例中，本发明所述抗体或其抗原结合片段含有分别自下组中选出的HCDR3,HCDR2和HCDR1氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:7，8，和9；
b)SEQ ID NO:13，14，和15；
c)SEQ ID NO:32，33，和34；
d)SEQ ID NO:40，41，和42；
e)SEQ ID NO:47，48，和49；
f)SEQ ID NO:55，56，和57；和
g)SEQ ID NO:63，64，和65。
在另一些实施例中，本发明所述抗体或其抗原结合片段含有分别自下组中选出的LCDR3,LCDR2和LCDR1氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:10，11，和12；
b)SEQ ID NO:16，17，和18；
c)SEQ ID NO:35，36，和37；
d)SEQ ID NO:43，17，和44；
e)SEQ ID NO:50，51，和52；
f)SEQ ID NO:58，59，和60；
g)SEQ ID NO:66，67，和68；和
h)SEQ ID NO:69，25，和70
在另一些实施例中，本发明所述抗体或其抗原结合片段含有分别自下组中选出的HCDR3，HCDR2，HCDR1，LCDR3,LCDR2和LCDR1氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:7，8，9，10，11，和12；
b)SEQ ID NO:13，14，15，16，17，和18；
c)SEQ ID NO:32，33，34，35，36，和37；
d)SEQ ID NO:40，41，42，43，17，和44；
e)SEQ ID NO:47，48，49，50，51，和52；和
f)SEQ ID NO:55，56，57，58，59，和60。
在另一些实施例中，本发明提供人源化抗体或其抗原结合片段，其含有的一个或多个CDR区(或者保守修饰突变)来自本文所公开的鼠抗体。人源化的任何方法可以用于产生本发明所述的人源化抗体。适宜的人源化方法在实施例4中公开并具体举例说明。
在一个特定的实施例中，本文所述人源化抗体或其抗原结合片段包含：
一个含有HCDR3,HCDR2和HCDR1区的重链可变区，其HCDR3,HCDR2和HCDR1的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs 13,14,和15所示，和其有一个或多个选自H1，H5，H9，H11，H12，H16，H38，H40，H41，H43，H44，H66，H75，H79，H81，H82A，H83，H87，和H108位点的氨基酸取代：和/或
一个含有LCDR3,LCDR2和LCDR1区的轻链可变区，其LCDR3,LCDR2和LCDR1区的氨基酸序列分如SEQ ID NOs 16,17,和18所示，和其有一个或多个选自L5，L9，L15，L18，L19，L21，L22，L43，L63，L78，L79，L83，L85，L100和L104位点的氨基酸取代(根据Kabat编号习惯)。
在另一些实施例中，抗体或其抗原结合片段，包括如SEQ ID NO:19,20,21,22,24,25,38,45,53,和/或61所示的氨基酸序列的VH区。
在另一些实施例中，抗体或其抗原结合片段，包括如SEQ ID NO:26,27,28,29,29,30,31,39,46,54,和/或62所示的氨基酸序列的VL区。
在另一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含分别从SEQ ID NO:19和26，SEQ ID NO:20和27；SEQ ID NO:21和28；SEQ ID NO:22和28；SEQ ID NO:23和29；SEQ IDNO:24和30；SEQ ID NO:25和31；SEQ ID NO:38和39；SEQ ID NO:45和46，SEQ ID NO:53和54，或SEQ ID NO:61和62中选出的的VH和VL区氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段，包含一个或多个选自SEQ ID NO:7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,32,33,34,35,36,37,40,41,42,43,44,47,48,49,50,51 52,55,56,57,58,59和60的CDR区氨基酸序列，其中上述一个或者多个CDR区至少有一个或多个氨基酸取代。
发明所述抗体的CDR氨基酸序列(例如SEQ ID NOs:,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,32,33,34,35,36,37,40,41,42,43,44,47,48,49,50,51 52,55,56,57,58,59和60)中的“保守氨基酸取代”也包含在本发明中，即：氨基酸序列修饰不会消除抗体结合抗原，例如胰激肽或脱-Arg10-胰激肽。保守氨基酸取代包括一个氨基酸被一个同类氨基酸所取代，其中氨基酸的类是由侧链氨基酸普通理化特性及自然中发现的同源蛋白质中的高频取代定义的，高频取代可通过，例如一个标准Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵确定。氨基酸侧链的六个一般分类已经完成，其包括：I类(Cys)；II类(Ser,Thr,Pro,Ala,Gly)；III类(Asn,Asp,Gln,Glu)；IV类(His,Arg,Lys)；V类(Ile,Leu,Val,Met)；和VI类(Phe,Tyr,Trp)。例如，Asp被其他III类残基如Asn,Gln,或Glu所取代，即为保守取代。这样，抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体中一个经预测认定的并不重要的氨基酸残基优选由其同类氨基酸替代。鉴定不会消除抗原结合能力的氨基酸保守取代的方法在本领域是公知的(见，例如.,Brummell等.,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等.Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)).。
在另一个实施例中，本发明提供抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体或其抗原结合片段，其含有VH和/或VL氨基酸序列，VH与SEQ ID NO:19,20,21,22,24,25,38,45,53,或61所示VH区氨基酸序列，VL与SEQ ID NO:26,27,28,29,29,30,31,39,46,54,或62所示VL区氨基酸序列，分别具有约80％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％的一致性。
在另一个实施例中，本发明提供抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体，其可以结合相同表位，和/或与另一含有VH和VL区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19和25,SEQ ID NO:38和39,SEQ ID NO:45和46,SEQ ID NO:53和54,或SEQ ID NO:61和62所示的抗体或其抗原结合片段相互竞争。这类抗体可以通过常规竞争结合分析确定，包括，例如基于表面等离子共振(SPR)的竞争分析。
在一些实施例中，本发明所述抗体结合胰激肽(KD)或脱-Arg10-胰激肽(DAKD)的一个构象表位，其采用了“Pro4结节”(Pro4 kink)构象。如图17所示，“Pro 4结节”构象的一个标志是KD或DAKD主肽链骨架在Pro4位的一个二型紧密转角(type II tight turn)。为本领域技术人员所公知的是，二型紧密转角构象包括三个残基(X1-X2-X3)，X1残基的羰基与X3残基的酰胺氮形成一个氢键，X3通常是甘氨酸(见Richardson JS."The anatomy andtaxonomy of protein structure."Adv Protein Chem.1981；34:167-339,其通过此处引用并入本文)。相应地，在一些实施例中，二型紧密转角由KD或DAKD的Pro3-Pro4-Gly5基序构成。在更具体的实施例中，“Pro4结节”构象进一步通过KD(1-2和6-9)或DAKD的全部或大部份剩余残基来限定，其采用一个S形的重复将疏水侧链排成空间堆积模式。
III.抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体修饰
在一些实施例中，本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体或其抗原结合片段可能包含一个或多个修饰。本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体的修饰形成可以通过本领域公知的任何技术来获得。
i)降低免疫原性
在一些实施例中，通过运用本领域所认可的技术，对本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体或其抗原结合片段进行修饰以降低其免疫原性。例如，抗体或抗原结合片段可以被嵌合，人源化，和/或去免疫性。
在一个实施例中，本发明所述抗体或其抗原结合片段可能被嵌合。嵌合抗体是指不同部分源自不同动物物种的抗体，例如含有一个源自鼠源单克隆抗体的可变区和一个人免疫球蛋白恒定区的抗体。制备嵌合抗体或其片段的方法是本领域所公知的。见,例如,Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi等,BioTechniques 4:214(1986)；Gillies等,J.Immunol.Methods 125:191-202(1989)；U.S.Pat.Nos.5,807,715；4,816,567；和4,816,397,其通过提及完整并入本文。为制备嵌合抗体发展而来的技术(Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855(1984)；Neuberger等,Nature 312:604-608(1984)；Takeda等,Nature 314:452-454(1985))可以用于合成该分子。例如，一个编码鼠抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体分子的基因序列可以和一个来自具有适当生物活性的人抗体分子的序列融合在一起。如本文所述，嵌合抗体指不同部分来自不同动物物种的分子，例如那些含有源自鼠源单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，例如人源化抗体。
在另一个实施例中，本发明所述抗体或其抗原结合片段被人源化。人源化抗体，具有结合特异性，包含一个或多个来自非人抗体的互补决定区(CDRs)和来自人抗体分子的框架区。通常，人框架区的框架残基将被CDR供体抗体的相应残基取代以改变，优选是改善与抗原的结合。这些框架取代可以通过本领域所熟知的方法鉴定，例如通过模拟CDR与框架残基相互作用来鉴定对抗原结合有重要作用的框架区残基，及序列比较来鉴定特定位置上的不寻常框架残基(见,例如,Queen等,U.S.Pat.No.5,585,089；Riechmann等.,Nature332:323(1988),这些文献通过提及完整并入本文)。可以运用本领域所公知的多种技术对抗体进行人源化，包括，例如CDR移植(EP 239,400；PCT publication WO 91/09967；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；and 5,585,089)，修饰或表面重修(EP 592,106；EP519,596；Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka等.,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguska.等,PNAS 91:969-973(1994)),和链改组(U.S.Pat.No.5,565,332)。
在一个特定的实施例中，运用基于对抗体在免疫识别中分子柔性的影响的方法来人源化(见WO2009/032661,通过提及完整并入本文)。蛋白质柔性与蛋白质分子的分子运动相关。蛋白质柔性是整个蛋白质或其部分或其一个氨基酸残基形成一个整体构象的能力，这种构象各个蛋白质分子之间差别明显。关于蛋白质的柔性信息可以通过进行蛋白质X射线晶体学实验(见,例如,Kundu等,2002,Biophys J 83:723-732.)，核磁共振实验(见,例如，Freedberg等,J Am Chem Soc 1998,120(31):7916-7923)或运行分子动力学(MD)模拟来获得。蛋白质分子的MD模拟在计算机上进行，通过计算原子之间的物理相互作用来确定蛋白质分子所有原子在一段时间内的运动。MD模拟输出为所研究蛋白质在模拟时间段的轨迹。轨迹即蛋白质所有构象的一个总体，也叫快照集，通过在模拟时间段周期性抽样采集，例如每1皮秒(ps)。通过分析快照的集合进而定量蛋白质氨基酸残基的柔性。即，一个柔性残基是指在其所在多肽链环境中采用一个不同构象集合的残基。MD方法在本领域是公知的，见，例如Brooks等"Proteins:A Theoretical Perspective of Dynamics,Structureand Thermodynamics"(Wiley,New York,1988)。一些软件可以进行MD模拟，例如Amber(seeCase et al.(2005)J Comp Chem 26:1668-1688),Charmm(见Brooks等.(1983)J CompChem 4:187-217；和MacKerell等.(1998)in"The Encyclopedia of ComputationalChemistry"vol.1:271-177,Schleyer等,eds.Chichester:John Wiley&Sons)或Impact(见Rizzo等.J Am Chem Soc；2000；122(51):12898-12900.)
大多数蛋白质复合物具有一个相对大而深埋的表面，已经表明结合对象的柔性为蛋白质可塑性提供了起源，允许它们在构象上彼此适应(Structure(2000)8,R137-R142)。同样，诸如“诱导契合”在蛋白质相互作用中发挥了显著作用。另位，稳步增长的数据显示蛋白质实际上可结合多种形状尺寸及不同组成的配体(Protein Science(2002)11:184-187)，构象上的多样性似乎是识别不同配体能力的一个重要组成(Science(2003)299,1362-1367)。柔性残基参与蛋白质-蛋白质之间的相互结合(Structure(2006)14,683-693)。
柔性残基可采用多种构象来提供一系列相互作用区域，这些区域可能被记忆B细胞识别并引发免疫反应。这样，抗体可以通过修饰一些框架残基来人源化，使得修饰后的抗体所表现的总构象及识别区域与人抗体尽可能的相似。这可通过运用以下方式修饰有限数量的残基来达到：(1)构建一个亲本mAb的同源模型并进行MD模拟；(2)分析柔性残基，并鉴定非人抗体分子的最柔性残基及可能引起异质性和降解反应的残基和基序；(3)鉴定与亲本抗体表现出最相似识别区域的人抗体；(4)确定要进行突变的柔性残基，可能引起异质性和降解反应的残基和基序也要进行突变；和(5)检查已知的T细胞或B细胞表位的存在情况。柔性残基可运用如本文所述MD计算来发现，MD计算运用隐含溶液模式，其表示模拟时间段水溶液与蛋白质原子之间的相互作用。
一旦可变轻链和重链中的柔性残基组被鉴定出来，即可鉴定出一组与前述感兴趣抗体极为相似的人重链和轻链可变区框架。这可通过诸如利用BLAST在抗体人类种系序列数据库搜索上述残基组而实现。也可通过亲本mAb与人类种系典型结构文库动力学比较来实现。CDR及临近残基从搜索中剔除以确保保留对抗原的高亲和力。随后柔性残基被替换。
当一些人类残基表现相似的同源性时，选择取决于可能影响人化抗体溶液行为的残基的性质。例如，在暴露环中相比疏水性残基优选极性残基。潜在的可引发不稳定及异质性的残基也要进行突变，即使这些残基是在CDRs中发现的。这包括：暴露的蛋氨酸，因其在氧自由基下可形成亚砜形式；对酸不稳定键的蛋白酶解位点，例如那些Asp-Pro二肽(DrugDev Res(2004)61:137-154)；发现的脱酰胺化位点，暴露的精氨酸残基后伴有一个小氨基酸，例如Gly,Ser,Ala,His,Asn或Cys(J Chromatog(2006)837:35-43)837：35-43)，和N-糖基化位点，例如Asn-X-Ser/Thr。典型地，暴露的蛋氨酸将由一个亮氨酸取代，暴露的天冬酰胺将由一个谷氨酰胺或天冬氨酸所取代，或随后的残基将被改变。对于糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)，天冬酰胺或丝氨酸/苏氨酸残基都将被改变。
对形成的复合抗体进行已知的B细胞或线性T细胞表位存在情况检查。可通过，例如，公众可用的免疫表位数据库(IEDB)(PLos Biol(2005)3(3)e91)进行检索。如果在复合序列中发现了已知表位，则获取另一组人类序列并对其进行替换。这样，不同于U.S.Pat.No.5,639,641所述的表面修饰方法，本方法可以同时解决B细胞介导和T细胞介导的免疫反应。本方法也可避免CDR移植后间或发现的活性丧失(U.S.Pat.No.5,530,101)。另外，在工程及选择过程中也考虑了稳定性和溶解性的问题，结果是抗体在低免疫原性，高亲和力和改善生物特性上被最优化。
在一些实施例中，去免疫化可以被用来降低抗体或其抗原结合片段的免疫原性。本文所用术语“去免疫化”包括：抗体或其抗原结合片段的改变，来修饰T细胞表位(见,例如，WO9852976A1,WO0034317A2)。例如，分析来自最初抗体的VH和VL序列，并从每个V区生成一个T细胞表位“图”，显示互补决定区(CDRs)和其他关键残基相关的表位位置。T细胞表位图中单个的T细胞表位将被分析以鉴定出可供选择的、对终抗体活性改变风险较低的氨基酸取代。一系列可供选择的、包含有氨基酸取代组合的VH和VL序列被设计出来，随后这些序列成为一系列胰激肽或脱-Arg10-胰激肽特异性抗体或其片段中的一部分，用于本文所公开的诊断和治疗措施中，随后对其进行功能测试。典型地，生成12到24个变体抗体并进行测试。包含有修饰后V区及人C区的完整重链和轻链基因被克隆到表达载体中，形成的质粒被导入用于生产全抗体的细胞系中。通过适当的生化及生物学分析比较抗体并鉴定出最优变体。
ii)效应器功能和Fc修饰
本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体可能包含一个抗体恒定区(例如一个IgG恒定区，例如一个人IgG恒定区，例如一个人IgG1或IgG4恒定区)，其介导一个或更多的效应器功能。例如，补体的C1成分结合抗体恒定区可能激活补体系统。补体活化对调理及溶解细胞病原体有重要作用。补体活化也可能刺激炎症反应并参与自身超敏反应。另外，抗体通过Fc区结合到多种细胞上，即抗体的一个FcR结合位点结合到细胞的一个FcR上。Fc受体有许多，针对抗体的不同类有特异性，包括IgG(γ受体),IgE(ε受体),IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体结合到细胞表面的Fc受体上触发一系列重要而多样的生物性反应，包括吞噬和破坏抗体包被的颗粒，清除免疫复合物，通过杀伤细胞溶解抗体包被靶细胞(叫做抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，或ADCC)，释放炎症介质，穿过胎盘及控制免疫球蛋白产量。在一个优选的实施例中，所述抗体或其抗原结合片段，结合到Fcγ受体上。在可选的实施例中，本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体可能包含一个无效应器功能(例如,ADCC活性)和/或不能结合Fcγ受体的恒定区。
本发明的一些实施例包括：抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体，其一个或多个恒定区有至少一个氨基酸的缺失或其他变化，以此来提供所期望的生化特性，例如与免疫原性大致相同的未改变的全抗体比较，有：降低或增强的效应器功能，形成非共价二聚体的能力，定位到肿瘤位点能力的增强，降低的或增加的血清半衰期。例如，用于如本文所述的诊断或治疗措施中的一些抗体或其抗原结合片段是有结构域缺失的抗体，其包含一个类似于免疫球蛋白重链的多肽链，但该链缺少一个或多个重链结构域的至少一个部分。例如，在一些实施例中，修饰抗体的重链恒定区的一整个结构域将被清除，例如，CH2结构域的全部或部分将被清除。
在一些实施例中，抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体包含源自不同的抗体同种型的恒定区(例如，恒定区源自两个或更多的人IgG1,IgG2,IgG3,或IgG4)。在另一些实施例中，抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体包含一个嵌合铰链(即铰链各部分源自不同的抗体同种型的铰链域，例如上部铰链域源自IgG4分子、中部铰链域源自IgG1分子)。在一个实施例中，抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体含有一个源自IgG4分子的Fc区或部分，并且在核心铰链区有Ser 228Pro(EU编号)突变。
在一些抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体中，运用本领域公知的技术对Fc部分进行突变以增强或降低效应器功能。例如，一个恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方法)可能降低Fc受体与循环中修饰抗体结合从而增强肿瘤定位。在另一些例子中，恒定区修饰与本发明减轻补体结合一致，并以此降低血清半衰期和偶联细胞毒素的非特异性关联。由于抗原特异性或灵活性增强带来的定位增强，恒定区的其他修饰可能用于修饰二硫键或寡糖部分。修饰导致的生理特性，生物可及性及其他生化效应，例如肿瘤定位，分布和血清半衰期，可以运用公知的免疫技术测量并量化，不需要过度的实验。
在一些实施例中，用于本发明所述抗体中的Fc结构域是Fc变体。本文所用术语“Fc变体”，指与衍生其的野生型Fc结构域相比具有至少一个氨基酸取代的Fc结构域。例如，其中Fc结构域源自人IgG1抗体，所述人IgG1 Fc结构域的Fc变体，相对于所述人Fc结构域，含有至少一个氨基酸取代。
Fc变体的氨基酸取代可以在Fc结构域的任何位置(即，任何EU惯例氨基酸位置)。在一个实施例中，Fc变体包含一个氨基酸取代，其定位在铰链结构域或其部分中。在另一个实施例中，Fc变体包含一个氨基酸取代，其定位在CH2结构域或其部分中。在另一个实施例中，Fc变体包含一个氨基酸取代，其定位在CH3结构域或其部分中。在另一个实施例中，Fc变体包含一个氨基酸取代，其定位在CH4结构域或其部分中。
本发明所述抗体可使用公知的本领域认可的任何Fc变体，赋予改善(例如，降低或增强)效应器功能和/或Fc受体结合。所述Fc变体可能包括，例如国际PCT出版物WO88/07089A1,WO96/14339A1,WO98/05787A1,WO98/23289A1,WO99/51642A1,WO99/58572A1,WO00/09560A2,WO00/32767A1,WO00/42072A2,WO02/44215A2,WO02/060919A2,WO03/074569A2,WO04/016750A2,WO04/029207A2,WO04/035752A2,WO04/063351A2,WO04/074455A2,WO04/099249A2,WO05/040217A2,WO05/070963A1,WO05/077981A2,WO05/092925A2,WO05/123780A2,WO06/019447A1,WO06/047350A2,和WO06/085967A2或U.S.Pat.Nos.5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；和7,083,784中所公开的任何一个氨基酸取代，它们每一个都通过提及并入本文。在一个示范实施例中，本发明所述抗体可能包含一个EU268位(例如，H268D或H268E)的氨基酸取代。在另一个示范实施例中，本发明所述抗体可能包含一个EU239位(例如，S239D或S239E)和/或EU332位(例如,I332D或I332Q)的氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明所述抗体可能包含一个Fc变体，其含有一个可以改变所述抗体非抗原依赖的效应器功能的氨基酸取代，特别是抗体的循环半衰期。相比与缺乏此类取代的抗体，这些抗体显示出与FcRn结合的增强或降低，从而各自有血清半衰期的增强或降低。与FcRn亲和力增强的Fc变体被期望有一个增长的血清半衰期，在哺乳动物治疗措施中，需要施用的抗体有延长的血清半衰期时，这类分子具有有效应用，例如，用于治疗慢性疾病或失调。相反，与FcRn亲和力降低的Fc变体被期望有一个降低的血清半衰期，同样这类分子也是有用的，例如，施用于哺乳动物当一个短的循环时间更有利时，例如，用于体内诊断性成像或当原始抗体在循环中存在较久时有毒副作用。与FcRn亲和力降低的Fc变体穿过胎盘的可能性较低，因此，在孕妇的疾病或失调治疗中有用。另外，其他需要FcRn亲和力降低的应用包括那些需要定位在脑，肾和/或肝中的应用。在一个示范实施例中，本发明所述改变抗体显示了从血管穿过肾小球上皮的转运降低。在另一个实施例中，本发明所述改变抗体从脑穿过血脑屏障进入血管的转运降低。在一个实施例中，一个伴有FcRn结合改变的抗体包含一个Fc结构域，其“Fc结合环”有一个或多个氨基酸取代。Fc结合环由280-299位(根据EU编号)氨基酸残基组成。改变了FcRn结合活性的示范性氨基酸取代在国际PCT出版物No.WO05/047327中公开，其通过提及并入本文。在一些示范实施例中，本发明所述抗体或其抗原结合片段含有一个Fc结构域，其有一个或多个以下取代：V284E,H285E,N286D,K290E和S304D(EU编号)。
在另一些实施例中，用于本文所述诊断或治疗措施中的抗体包含一个恒定区，例如，一个IgG1或IgG4重链恒定区，其被改变以减少或消除糖基化。例如，本发明所述抗体还可包含Fc变体，其含有可改变抗体糖基化的氨基酸取代。例如，所述Fc变体可以具有降低的糖基化(例如，N-或O-连接的糖基化)。在示范性实施例中，Fc变体包含正常发现于氨基酸297(EU编号)位的N-连接多糖的糖基化降低。在另一个实施方案中，所述抗体有一个临近或在糖基化基序中的氨基酸取代，例如，一个包含NXT或NXS氨基酸序列的N-连糖基化基序。在一个具体的实施例中，所述抗体包含一个Fc变体，其伴有氨基酸位228或299(EU编号)上的氨基酸取代。在更具体的实施例中，所述抗体包含一个IgG1或IgG4恒定区，其包含S228P和T299A突变(EU编号)。
可赋予改变或降低糖基化的典型氨基酸取代在国际PCT出版物No.WO05/018572中公开，其通过提及并入本文。在优化的实施例中，本发明所述抗体或其抗原结合片段被修饰以消除糖基化。此类抗体或其抗原结合片段，可被称为“"未糖基化”抗体或其抗原结合片段。尽管无理论根据，但据信“未糖基化”抗体或其抗原结合片段在体内可能具有更好的安全性和稳定性。典型未糖基化抗体或其抗原结合片段包含一个IgG4抗体的未糖基化Fc区，其缺乏Fc效应器功能，因此消除了由Fc介导的对表达胰激肽或脱-Arg10-胰激肽的正常生命器官的潜在毒性。在另一些实施例中，本发明所述抗体或其抗原结合片段，包含一个改变了的多糖。例如，所述抗体可有Fc区Asn297上N-聚糖岩藻糖残基数量减少，即去岩藻糖化。在另一个实施例中，所述抗体可有Fc区N-聚糖唾液酸残基的数量变化。
iii)共价连接
本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体可以被修饰，例如，通过共价连接一类不阻止抗体特异性结合到其同源抗原表位的分子到所述抗体。例如，但不作为限制，本发明所述抗体或其片段可以通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化，酰胺化，已知的保护/封闭基团衍化，蛋白水解切割，连接至细胞配体或其它蛋白质等，等方式进行修饰。任何的许多化学修饰可以通过已知的技术，包括，但不限于特定化学切割，乙酰化，甲酰化，等等。另外，该衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。
本发明所述抗体或其抗原结合片段，可进一步重组融合到异源多肽N-或C-末端或化学偶联(包括共价和非共价缀合)到多肽或其它组合物上。例如，抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体可被重组融合或偶联到检测分析中有用的标签分子和诸如异源多肽，药物，放射性核素或毒素等效应分子上。见,例如,PCT出版物WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；U.S.Pat.No.5,314,995；和EP 396,387。
抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体可用本领域公知的方法融合到异源多肽以增加其体内半衰期或用于免疫分析。例如，在一个实施例中，PEG被偶联至本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体上以增加其在体内的半衰期。Leong,S.R.等,Cytokine 16:106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54:531(2002)；或Weir等,Biochem.Soc.Transactions30:512(2002)。
此外，本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体可被融合到标记序列上，例如一个多肽以促进其纯化或检测。在优化的实施例中，标记氨基酸序列是一个六-组氨酸多肽，例如pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)提供的标签，在其他中许多可市场购得。如Gentz等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824(1989)所描述，例如，六-组氨酸多肽为融合蛋白纯化提供方便。其他对纯化有用的标签包括但不限于，“HA”标签，其与流感病毒血凝素蛋白的一个表位(Wilson等，Cell37：767(1984))一致，和“flag”标记。
本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体可以以非偶联形式使用或可偶联至许多分子中的至少一个上，例如，以提高该分子的治疗特性，促进目标检测或用于患者的成像或治疗。本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体可在纯化前或纯化后被标记或偶联，当需要进行纯化操作时。特别地，本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体可被偶联至治疗剂，药物前体，肽，蛋白质，酶，病毒，脂质，生物反应调节剂，药剂，或PEG。
本发明进一步包含所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体，其偶联至诊断性或治疗性试剂上。所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体可用于诊断上，例如，作为临床检测程序的一部分，监测免疫细胞失调(例如，CLL)的发展或进展，进而例如，以确定给定的治疗和/或预防方案功效。可以通过偶合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体至可检测物质来方便检测。可检测物质的实例包括各种酶，辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，放射性材料，使用各种正电子发射扫描的正电子发射金属，和非放射性顺磁金属离子。根据本发明，可以用作诊断剂偶联到抗体的金属离子参见，例如，U.S.Pat.No.4,741,900。适宜的酶的实例包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适宜的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适宜的荧光材料的实例包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的一个实例包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶，萤光素，和水母发光蛋白；及适宜的放射性物质的实例包括125I,131I,111In或99Tc。
用于本文所公开的诊断和治疗措施中的抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体，可以偶联至细胞毒素(诸如放射性同位素，细胞毒性药物或毒素)，治疗剂，细胞抑制剂，生物毒素，药物前体，肽，蛋白质，酶，病毒，脂质，生物反应调节剂，药剂，免疫活性配体(例如淋巴因子或其它抗体，其中所形成到分子结合到肿瘤细胞和效应细胞上，如T细胞)，或PEG。
在另一个实施例中，用于本文所公开的诊断和治疗措施中的抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体，可以偶联至降低肿瘤细胞生长的分子上。在其它实施例中，所公开的组合物可包含抗体，偶联药物或药物前体。本发明的其它实施例包含抗体或其片段偶联至特异性生物毒素或其细胞毒性片段的使用，诸如蓖麻毒蛋白，白树毒素，假单胞菌外毒素或白喉毒素。选择使用偶联或非偶联抗体，将取决于癌症的类型和阶段，使用的辅助治疗(例如化疗或外部放疗)和患者状况。应当理解的是，本领域技术人员根据此处的指导能够容易地作出这类选择。
应当理解的是，在以前的研究中，同位素标记的抗肿瘤抗体已成功地用于破坏动物模型中的肿瘤细胞，及某些情况下的人肿瘤细胞。典型的放射性同位素包括：90Y,125I,131I,123I,111In,105Rh,153Sm,67Cu,67Ga,166Ho,177Lu,186Re和188Re。放射性核素通过产生电离辐射引起核DNA的多重链断裂起作用，导致细胞死亡。用于产生治疗性偶联物的同位素通常产生高能量α-或β-粒子，其具有短的路径长度。此类放射性核素杀死它们非常接近的细胞，例如已有偶联物连接或进入的肿瘤细胞。它们对非定位细胞有轻微作用或没有作用。放射性核素基本上无免疫原性。
IV.抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体，或其抗原结合片段的表达
用于制备本文所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体的、针对分离基因物质的后续操作，如前所述，所述基因被插入到表达载体以导入可用于制备需要数量的所要求抗体或其片段的宿主细胞。
用于本文说明书和权利要求书目的的术语“载体”或“表达载体”，意指依照本发明所使用的载体，作为将目的基因导入细胞并在细胞中表达的工具。为本领域技术人员所熟知的是，这样的载体可以容易地从包括质粒，噬菌体，病毒和逆转录病毒的组中选出。通常，与本发明兼容的载体包含一个选择标记，适当的限制性位点，以促进目的基因的克隆，及其进入和/或在真核或原核细胞中复制的能力。
许多表达载体系统可用于本发明用途。例如，一类载体利用源自动物病毒的DNA元件，如牛乳头状瘤病毒，多瘤病毒，腺病毒，牛痘病毒，杆状病毒，逆转录病毒(RSV，MMTV或MOMLV)或SV40病毒。另外的载体涉及有内部核糖体结合位点的多顺反子体系的使用。此外，可通过引入一个或多个能够选择转染的宿主细胞的标记，来选择基因组中整合有DNA的细胞。该标记可为营养缺陷型宿主提供原营养，杀生物剂抗性(例如，抗生素)或耐重金属性如铜。选择标记基因可以直接连接到要表达的DNA序列，或者通过共转化导入到相同的细胞中。可能还需要另外的元件来达到mRNA的最佳合成。这些元件可能包括信号序列，剪接信号，以及转录启动子，增强子和终止信号。在特别优选的实施例中，所克隆的可变区基因同上述重链和轻链恒定区基因(优选人)合成物一起插入到表达载体中。
在另一些优选的实施例中，抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体或其片段，可以使用多顺反子构建体表达。在此类表达系统中，多个目的基因产物例如抗体的重链和轻链可以由一个单一的多顺反子构建体产生。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)，从而在真核宿主细胞中产生相对高含量的本发明所述多肽。兼容的IRES序列在U.S.Pat.No.6,193,980中公开，其通过提及并入本文。本领域的技术人员将理解，此类的表达系统可用于有效产生本申请中公开的所有多肽。
更一般地，一旦一个编码抗体或其片段的载体或DNA序列已经被制备，该表达载体可被引入适当的宿主细胞中。也就是说，宿主细胞可以被转化。质粒导入宿主细胞可以通过本领域技术人员公知的各种技术来完成。这些技术包括，但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)，原生质体融合，磷酸钙沉淀，细胞与包膜DNA融合，显微注射，和完整病毒感染。见，Ridgway,A.A.G."Mammalian Expression Vectors"Chapter 24.2,pp.470-472Vectors,Rodriguez和Denhardt编(Butterworths,Boston,Mass.1988)。最优选地，是通过电穿孔将质粒导入宿主。转化细胞在适合产生轻链和重链的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白合成情况。示例性的测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，或荧光激活细胞分类分析(FACS)，免疫组化等。
本文所用术语“转化”，用在广泛的意义上是指DNA导入受体宿主细胞改变了细胞的基因型，相应地导致该受体细胞的某种改变。
同前，“宿主细胞”是指被重组DNA技术构建、可编码至少一个异源基因的载体转化了的细胞。在描述从重组宿主分离多肽过程时，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用，以表示抗体的来源，除非另有明确规定。换言之，从“细胞”(cells)重获多肽，可指从完整细胞旋转物或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物中重获。
在一个实施例中，用于抗体表达的宿主细胞系是哺乳动物来源的；本领域技术人员能够确定最适合于目的基因产物在其中表达的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括，但不限于，DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR-)，HELA(人宫颈癌)，CVI(猴肾细胞系)，COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)，R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)，HAK(仓鼠肾细胞系)，SP2/O(小鼠骨髓瘤)，BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)，RAJI(人淋巴细胞)，293(人肾)。在一个实施例中，所述细胞系(例如，PER.C6.RTM.(Crucell)或FUT8敲除CHO细胞系(Potelligent.RTM.Cells)(Biowa,Princeton,N.J.))提供了表达于其中的抗体的糖基化改变，例如去岩藻糖化。在一个实施例中，可使用NS0细胞。CHO细胞是特别优选的。宿主细胞系通常可从商业服务，美国组织培养物保藏中心(American TissueCulture Collection)，或者从公开资料获得。
体外生产允许放大，以得到大量的所需多肽。组织培养条件下的哺乳动物细胞培养技术是本领域公知的，包括均质悬浮培养，例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中，或固定化或包埋细胞培养，例如在中空纤维，微囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷墨盒上。如果必要和/或需要的话，多肽溶液可通过常规层析方法进行纯化，例如凝胶过滤，离子交换色谱，DEAE-纤维素色谱法和/或(免疫)亲和层析。
编码本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体或其片段的基因，也可在非哺乳动物细胞内表达，例如细菌或酵母或植物细胞。在这方面，应当理解，各种单细胞非哺乳动物微生物，如细菌，也可被转化；即那些能在培养基上生长或发酵的微生物。细菌，容易被转化，包括肠杆菌科成员，例如大肠杆菌或沙门氏菌菌株；芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌和流感嗜血杆菌。进一步需要理解的是，在细菌中表达时，所述多肽可成为包涵体的一部分。所述多肽必须被分离，纯化，然后组装成功能性分子。
除原核生物外，也可使用真核微生物。酿酒酵母或普通面包酵母是真核微生物中最常用的，虽然许多其他菌株通常也可用。对于在酵母中表达，质粒YRp7是常用，例如，(Stinchcomb等,Nature,282:39(1979)；Kingsman等,Gene,7:141(1979)；Tschemper等,Gene,10:157(1980))。该质粒本身含有TRP1基因，其为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株提供了一个选择标记，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones,Genetics,85:12(1977))。作为酵母宿主细胞基因组的特征，Trpl障碍的存在则提供了通过在缺乏色氨酸的环境中生长来检测转化的有效环境。
V.抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体药物制剂及施用方式
在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包括：抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体，或其抗原结合片段。
制备及给受试者施用本发明所述抗体或其片段的方法，是本领域技术人员所熟知的，或可由本领域技术人员容易地确定。本发明所述抗体或其片段的给药途径，可以是口服，肠胃外，吸入或局部给药。本文所用术语肠胃外包括：静脉内，动脉内，腹膜内，肌内，皮下，直肠或阴道给药。肠胃外给药的静脉内，动脉内，皮下和肌内途径通常是优选的。尽管所有这些给药途径都明确地涵盖在本发明的范围内，一种给药的药物形式将会是注射用溶液，特别是静脉或动脉注射或点滴。通常，用于注射的合适的药物组合物可包含缓冲液(例如乙酸盐，磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)，表面活性剂(如聚山梨醇酯)，任选的稳定剂(例如人类白蛋白)等。然而，在与本文指导相容的其它方法中，所述多肽可以直接释放到有害细胞群从而提高病变组织在治疗剂中的暴露。
肠胃外给药制剂包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例有丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水，醇/水溶液，乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，药学上可接受的载体包括但不限于，0.01-0.1M，优选0.05M，磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常见肠胃外载体包括磷酸钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格，或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂，电解质补充剂，如那些基于林格氏葡萄糖的补充剂等。防腐剂和其他添加剂也可有，例如，抗菌剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体等。更具体地，适合于注射用的药物组合物包括无菌水溶液(其中水可溶)或分散剂及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。此类情形下，组合物必须是无菌的，并且应当是在易注射性范围内的流体。其应在制造和储存条件下稳定，并且在保存中有利于防止微生物污染，如细菌和真菌。载体可以是溶剂或分散介质，例如水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，和液体聚乙二醇等)，及其适当的混合物。适当的流动性可以通过例如，使用包衣如卵磷脂，维持分散剂中所需的粒子尺度，和使用表面活性剂来保持。防止微生物的作用可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞等。在许多情况下，优选组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇，如甘露糖醇，山梨糖醇，或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中加入一种延长吸收的试剂来实现，例如，单硬脂酸铝和明胶。
在任何情况下，无菌注射液可通过以下方法来制备：将适当溶剂中需要量的活性化合物(例如，抗体自身或与其他活性剂结合)，与本文所列举的一种或几种成分组合物混合，然后根据需要过滤灭菌。通常，分散剂通过将活性化合物加入无菌载体来制备，其中无菌载体含有基本分散介质和上述列举中所需的其它成分。在用无菌粉末制备无菌注射液时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥产生活性成分的粉末，加上先前无菌滤液中的任何其他所需成分。该注射用制剂经过处理后，分装到容器如安瓿，袋，瓶，注射器或小瓶中，并根据本领域公知的方法在无菌条件下密封。另外，该制剂可以被包装并以试剂盒的形式出售，例如共同专利U.S.Ser.No.09/259,337和U.S.Ser.No.09/259,338中所描述的试剂盒，这两个专利中的每一个都通过提及并入本文。这些制品最好具有标签或包装插页，指出相关组合物对治疗患有或易患自身免疫或肿瘤失调的病人有效。
本发明所述稳定化的抗体或其片段，用于治疗上述失调的有效剂量因许多不同因素而变化，包括施用手段，靶位点，患者的生理状态，患者是人或动物，施用的其它药物，和治疗是预防性或治疗性的。通常，患者是人，但非人类哺乳动物包括转基因哺乳动物也可治疗。治疗剂量可使用本领域技术人员公知的常规方法进行滴定，以优化安全性和有效性。
本发明的抗体用于被动免疫时，剂量范围可以是，根据给药对象体重，例如，0.0001至100mg/kg,及更常用的0.01至5mg/kg(例如,0.02mg/kg,0.25mg/kg,0.5mg/kg,0.75mg/kg,1mg/kg,2mg/kg,等)。例如，剂量可以为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg之间，优选为至少1mg/kg。剂量介于上述范围内时也意为在本发明的范围之内。
受试者可以每天，隔天，每周一次，或根据经验分析确定的其他任何服药时间安排服用这种剂量。一个示例性的治疗限定在较长的时间段施用多剂，例如，至少为六个月。另外的示例性治疗方案限定每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。示例性的剂量方案包括连续数天每天1-10mg/kg或15mg/kg，或隔天每次30mg/kg，或每周一次60mg/kg。在一些方法中，两种或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体同时施用，这种情况下施用的每种抗体的剂量可落在其指定的范围内。
本发明的抗体或其片段可有多种施用间隔。单剂间隔可以是，例如，每天一次，每周一次，每月一次或每年一次。间隔也可以是不规则的，通过测量患者的多肽或靶分子血液水平来指导施用。在一些方法中，可调整剂量以达到一定的抗体或毒素血浆浓度，例如，1-1000ug/ml，或25-300ug/ml。可选的，抗体或其片段可作为持续释放剂施用，这种情况下，需要低频率施用。施用剂量和频率取决于抗体在患者体内的半衰期。通常，人源化抗体显示最长的半衰期，然后依次是嵌合抗体和非人抗体。在一个实施例中，本发明所述抗体或其片段，可以非偶联形式施用。在另一个实施例，本发明所述抗体可以偶联的形式多次施用。在另一个实施例中，本发明所述抗体或其片段，可先以非偶联形式施用，随后以偶联形式施用，或者相反。
施用剂量和频率可根据治疗是预防性或治疗性而改变。在预防性应用中，给尚未到达疾病状态的患者施用含有本发明所述抗体或其混合物的组合物，以增强患者的抵抗力。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在这种应用中，精确剂量同样取决于患者的健康状况和一般免疫状态，但通常为0.1至25mg每剂，特别是0.5至2.5mg每剂。在较长的时间段，以相对低的剂量相对长的间隔施用。有些患者在他们以后的时间中一直接受治疗。
在治疗性应用中，有时需要以相对高的剂量(例如，抗体从约1至400mg/kg每剂，其中5至25mg/kg常用在放射性免疫偶联中，更高剂量常用在细胞毒素-药物偶联分子中)相对短的间隔施用，直到疾病的进展减轻或终止，优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全改善为止。此后，该专利可施用预防性方案。
在一个实施例中，受试者可用编码本发明所述多肽的核酸分子来治疗(例如，在载体中)。编码多肽的核酸的剂量范为每名患者约10ng至1g，100ng至100mg，1ug到10mg，30-300ugDNA。感染性病毒载体剂量为每剂10-100，或更多病毒。
治疗剂可通过肠胃外，局部，静脉内，口服，皮下，动脉内，颅内，腹膜内，鼻内或肌内途径给药，用于预防和/或治疗性治疗。施用本发明的抗体优选药肌内注射或静脉内输注。在一些方法中，治疗性抗体或其片段，被直接注射到颅内。在一些方法中，抗体或其片段，作为缓释组合物或缓释装置施用，如MedipadTM设备。
本发明所述制剂可选择与其他对需要治疗的失调或病症治疗有效的制剂组合施用(例如，预防性或治疗性)。优选的附加剂是那些本领域公认的并且标准施用于特定失调的制剂。
本发明所述90Y标记抗体的有效单次治疗剂量(即治疗性有效量)范围是约5-约75mCi，更优选为约10-约40mCi。131I标记抗体的有效单次治疗非骨髓消融剂量范围是约5-约70mCi，更优选为约5-约40mCi。131I标记抗体的有效单次治疗消融剂量(即，可能需要自体骨髓移植)范围在约30至约600mCi之间，更优选介于约50和低于约500mCi之间。与嵌合修饰抗体偶联时，由于嵌合修饰抗体相比鼠抗体有较长的循环半衰期，131I标记嵌合修饰抗体的有效单次治疗非骨髓消融的剂量范围是约5-约40mCi，更优选低于约30mCi。成像剂量标准，例如，在111In标记时，通常低于约5mCi。
虽然已经获得了131I和90Y的大量临床经验，其它放射性标记也是本领域公知的并已被用于相似用途。还有其它放射性同位素也被用于成像。例如，与本发明范围兼容的另外的放射性同位素包括，但不限于，123I，125I，32P，57Co，64Cu，67Cu，77Br，81Rb，81Kr，的87Sr，113In，127Cs，129Cs，132I，197Hg，203Pb，206Bi，177Lu，186Re，212Pb，212Bi，47Sc，105Rh，109Pd，153钐，188Re标记，199Au，225Ac，211A213Bi。在这方面，α，γ和β发射体都与本发明兼容。此外，本公开内容默认本领域技术人员无需过度实验，可以容易地确定哪些放射性核素与选定疗程兼容。为此，其他已经在临床诊断中使用的放射性核素包括125I，123I，99Tc，43K，52Fe，67Ga，68Ga，以及111In。抗体也已被多种放射性核素标记用于靶向免疫治的潜在使用中(Peirersz等.Immunol.Cell Biol.65:111-125(1987))。这些放射性核素也包括188Re和186Re以及199Au和67Cu，但使用较少。U.S.Pat.No.5,460,785提供了这类放射性同位素方面的其他数据，其通过提及并入本文。
如先前所讨论的，本发明所述抗体或其片段，可以药学有效量施用，用于哺乳动物失调的体内治疗。在这方面，应当理解，所公开的抗体或其片段，将被配制以便于给药和促进活性剂的稳定性。优选地，基于本发明的药物组合物包含药学上可接受的，无毒，无菌载体，诸如生理盐水，无毒缓冲液，防腐剂等。本发明所述抗体，偶联或未偶联至治疗剂的，其药学有效量用于本申请是指，足以达到与靶有效结合并实现一个益处的剂量，例如改善疾病或失调的症状，或检测物质或细胞。在肿瘤细胞的情况下，该多肽最好是能与肿瘤细胞细胞或免疫反应性细胞上的经筛选的免疫反应性抗原相互作用，并增加这些细胞的死亡。当然，本发明所述药物组合物可以以单剂量或多剂量施用，以提供药学有效量的所述多肽。
与本公开一致，本发明所述抗体可以按照上述治疗方法，以足以产生治疗或预防效果的剂量施用于人或其它动物。本发明所述多肽，可通过将本发明所述抗体与药学上可接受的载体结合或根据已知技术进行稀释来制成常规剂量形式，施用于人及其他动物。被本领域技术人员所认可的是，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特性根据结合与其中的活性成分的量，给药途径及其它公知变量决定的。本领域技术人员将进一步理解，包含本发明所述一种或多种多肽的混合物可能被证明是特别有效的。
VI.胰激肽或脱-Arg10-胰激肽相关疾病或失调的治疗方法
本发明所述抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体或其片段，可有效拮抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽活性。相应地，另一方面，本发明通过给需要的受试者施用含有所述一种或多种抗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽抗体或其抗原结合片段的药物组合物，提供治疗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽相关疾病或失调的方法。
需要治疗的胰激肽或脱-Arg10-胰激肽相关疾病或失调包括，但不限于，病理生理状态如炎症，外伤，烧伤，休克，变态反应，急性或慢性疼痛，及纤维化，例如肾纤维化。在某些示例性实施例中，本发明所述抗体被用于治疗肾纤维化和相关急性肾损伤以及慢性肾脏疾病，其是终末期肾功能衰竭的主要原因。
本领域技术人员能够通过常规实验确定，用于治疗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽相关疾病或失调的抗体(或其它治疗剂)的有效无毒剂量。例如，多肽的治疗活性量可根据多种因素而变化，例如疾病阶段(如，I期与IV期)，年龄，性别，医学并发症(例如，免疫抑制状态或疾病)和受试者体重，及抗体引发受试者预期反应的能力。剂量方案可调整以提供最佳的治疗反应。例如，可以几个分割剂量每日给药，或可根据治疗情况的紧急程度相应减小剂量。然而，一般地，有效剂量预期在约0.05至100毫克每千克体重每天的范围内，更优选约0.5至10毫克每千克体重每天。
VII.实施例
以下实施例用于进一步阐释本发明，而非进一步限制。引用在本申请的序列表，附图和所有参考文献，专利及公布的专利申请的内容，通过提及明确并入本文。
另外，本发明中可能用到了本领域中常规的分子生物学，微生物学，重组DNA技术。这些技术在文献中有详细的解释。见,例如.,Sambrook,Fritsch&Maniatis,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,New York(herein“Sambrook等,1989”)；DNA Cloning:APractical Approach,Volumes I and II(D.N.Glover编1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames&S.J.Higgins编(1984)]；AnimalCell Culture[R.I.Freshney编(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(编),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)
实施例1:杂交瘤生产:用偶联至KLH的胰激肽多肽免疫小鼠并产生针对BKR1配体的抗体
目的是开发针对胰激肽(KD；SEQ ID NO:1)和脱-Arg10-胰激肽(DAKD；SEQ ID NO:2)的交叉反应抗体，其可抑制配体结合人BKR1。通常，用C-端或N-端通过额外半胱氨酸偶联KLH的KD免疫小鼠，获取其小鼠脾细胞用于和作为融合配体的小鼠骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞。
简言之，免疫程序如下：在第0天，用磷酸盐缓冲液(PBS)中等量KLH-KD和KD-KLH混合物每只小鼠100ug作为抗原总量，按1：1比例混合西格玛佐剂系统(Sigma cat#6322)至每只小鼠总体积200μl，腹腔免疫BALB/c小鼠(8-20周，雌性幼鼠)。在第21天，用PBS中等量KLH-KD和KD-KLH混合物每只小鼠50ug作为抗原总量，按1：1比例混合西格玛佐剂系统(Sigma cat#6322)至每只小鼠总体积200μl加强免疫小鼠。在第30天，收集血样进行KD特异性抗体滴定分析。在第51天，用PBS中等量KLH-KD和KD-KLH混合物每只小鼠50ug作为抗原总量，按1：1比例混合西格玛佐剂系统(Sigma cat#6322)至每只小鼠总体积200μl加强免疫小鼠，用于融合。在第55天，CO2密室处死小鼠，心脏穿刺收集血液，收集脾用于制备杂交瘤。
通过融合腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)缺陷的小鼠骨髓瘤和经过特异抗原免疫的小鼠脾细胞来制备杂交瘤细胞。采用HAT(次黄嘌呤，重氮丝氨酸和胸腺嘧啶)培养基的选择系统可消除其他细胞，仅留下APRT+融合细胞。成功的杂交瘤细胞应保持免疫球蛋白(Igh)重链，一个免疫球蛋白轻链位点并能分泌功能性抗体。
杂交瘤培养基(IMDM)由以下混合而成：500ml Iscove's Modified Dulbecco's培养基(HyClone SH30259.01)，50ml胎牛血清(HyClone SH30070.03)，5ml L-谷氨酰胺(Gibco Invitrogen cat#25030)，5ml非必需氨基酸(Gibco Invitrogen cat#11140050)，5ml丙酮酸钠(Gibco Invitrogen cat#11360070)，5ml 0.1％青霉素-链霉素(GibcoInvitrogen cat#15140148)。使用之前过滤培养基。扩大培养基由以下混合而成：1000ml无血清培养基(Gibco Hybridoma SFM#12045)，100ml 10％HyClone超低IgG规定为FBS#SH30898.03和10ml青霉素/链霉素。冷冻培养基是45ml加热灭活FBS(HyClone SH30070.03)和5mlDMSO，过滤除菌。其它材料包括以下：获自Sigma-Aldrich(#HO262)的HAT(50x)；Hybridoma Fusion and Cloning Supplement(50X)(Roche Diagnostics 11 363 735001)；0.4％台盼蓝染液(Invitrogen cat#15250-061或T10282)；PEG1500在75mM的Hepes中配成50％w/v的溶液(Roche cat#783641(10783641001)。除HAT和Hybridoma Fusion andcloning supplement外，所有试剂在37℃使用。
表2.用于免疫及筛选的多肽试剂
Figure BDA0003269908170000461
Figure BDA0003269908170000471
简言之，在融合前三或四天，用目标抗原通过腹腔或静脉内加强免疫小鼠。在融合当天，CO2密室处死小鼠，心脏穿刺收集血液，取出脾脏置于含10ml无血清IMDM的有盖培养皿中。融合配体骨髓瘤细胞：FO(ATCC ref CRL-1646)/X63 Ag8.653(ATCC ref CRL1580)在对数期生长，于融合前一天分离(1:2和1:5)，收集到20ml离心管中，离心并再次悬浮于10ml的IMDM中。沉淀物用无血清IMDM培养基洗涤两次。所有离心均在1570rpm下进行5分。最终再次悬浮在10ml无血清IMDM中。从脾脏剔除结缔组织。用1ml注射器、25号针头向脾注射1ml预热至37℃的无血清IMDM。用镊子从纤维弹性被膜中挤出脾细胞并用10ml无血清IMDM洗涤两次(包括初始离心)，并重悬于10ml无血清IMDM中。细胞在Countess自动细胞计数器上进行计数。
融合配体细胞和脾细胞以1:2到1:10(根据细胞数量)混合在一个50ml试管中并以970rpm离心沉淀10分钟(低速旋转)以形成松散的细胞颗粒。“低速”旋转后，移出上清，并非担心其影响细胞颗粒，而是为减少细胞周围液体量以免稀释PEG 1500。最后剩余的培养液被保存并在加完PEG(下边)后回加进去。在1分钟左右时间内逐滴加入预热至37℃的PEG1500总量1ml到细胞颗粒，之后混匀细胞。再孵育细胞颗粒和PEG 1分钟，之后在1分钟内加入10ml无血清IMDM培养液，其中最开始的1ml在30秒中加入。细胞以970rpm低速旋转10分钟，将上清倒入其他容器。在(2)个100ml凹槽中，添加以下试剂：70ml含10％FBS的IMDM，2mlHAT及2ml Hybridoma and Fusion Cloning Supplement。细胞重悬于10ml含10％FBS的IMDM中，并分加到(2)个50ml试管(5ml细胞/每管)中，再各加含10％FBS的IMDM25ml到前50ml试管中。所得30ml转移至含有70ml HBSS/HAT/cloning supplement的凹槽中，并用移液器吸取添加到(10)个96孔板上，200ul细胞/每孔。约10至14天后或当孔中培养液变黄，融合准备妥当可用ELISA(50ul)进行筛选。经过初次筛选，选出阳性克隆，计数并通过含10％FBSHI的IMDM转移至一个24孔板上，每孔500ul。杂交瘤上清通过ELISA在包被有N-和C-末端生物素化肽的链霉亲和素平板上进行筛选(见下)。
实施例2:表达针对人BKR1配体的抗体杂交瘤细胞的表征及筛选
杂交瘤上清通过ELISA在包被有N-和C-末端生物素化肽(见，例如,表2所示)的链霉亲和素平板上筛选并测量抗体结合动力学用于确认阳性杂交瘤克隆。
杂交瘤上清中的抗体结合BKR1配体多肽的能力通过ELlSA分析进行评价。室温下，经过1小时，5ug/ml的DAKD-生物素或KD-生物素多肽磷酸盐缓冲液(PBS)中的DAKD-生物素或KD-生物素包被在96孔SA平板上，非特异性结合位点用1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液封闭。该平板用于粗杂交瘤上清的初次及二次筛选。向该平板添加杂交瘤上清以结合包被的KD或DAKD多肽。孵育1小时后，洗涤平板并用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(HRP羊抗鼠IgG(H+L):Jackson ImmunoResearch Labs#115-035-166)及进一步用2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)(Roche diagnostics#11 204 521 001)作为其底物，检测结合的抗体。数据使用Excel进行分析。选出显示阳性信号(高于1：10000稀释的血清ELISA信号2倍)的抗体并再次重复筛选以进行确认。经确认的阳性杂交瘤克隆被选出并通过Biacore进行结合解离率分级。
抗体的结合动力学测定使用的设备是BIACORE 2000或BIACORE 3000(GEHealthcare)，其设计用于实时生物分子相互作用分析(BIA)。所用传感芯片是母体羧甲基聚糖上共价固定有链霉亲和素的SA芯片(GE Healthcare)。每个芯片有四个平行流动池(Fc)。每个生物素化BKR1或BKR2配体多肽固定到SA芯片的流动池2到4(Fc2到Fc4)中的一个上，用于结合解离率筛选及选择性筛选。流动池1(Fc1)保留并用于固定一个随机多肽(一端生物素化)作为阴性对照，该多肽同所检测的配体多肽相比具有相等或相近的肽链长度。在筛选分析中，经初次筛选瞬时表达人源化变体的杂交瘤克隆的细胞培养上清被注入到固定多肽上。杂交瘤细胞培养基也被注入到芯片表面作为空白以建立基线。扣除Fc1和空白缓冲液运行信号，源自上清液中的抗体对每个多肽的解离率被分析并用BIAevaluation软件分级。只有那些展示出优越(kd＜10-4 1/s)结合解离率的抗体克隆被选择用于亚克隆及进一步表征。在动力学分析中，筛选中被检测抗体识别的相应的生物素-多肽被固定在流动池2到4(Fc2到Fc4)上，同时一个随机多肽被固定在流动池1(Fc1)上作为参考池。经筛选选出的每个纯化抗体，被制成在流动缓冲液(1x HBS-EP buffer,GE Healthcare)中介于0.1到10nM的一个连续的二倍稀释液。结合结合率，解离率及总的亲和力在BIAevaluation中计算。每种抗体的抗体结合动力学通过运用Biacore一式三份进行确认。
共有8只小鼠用KLH-KD/KD-KLH和KLH-DAKD/DAKD-KLH混合物进行免疫并用上述方法融合其脾细胞。7680个杂交瘤克隆经DAKD-生物素和KD-生物素ELISA初次筛选后，只有76个克隆被确认为阳性，并被选出在Biacore 3000/2000上，进行针对固定在链霉亲和素(SA)芯片上的DAKD-生物素或KD-生物素结合解离率分级。其中，8个结合解离率＜＝of 10-4的杂交瘤克隆被亚克隆，测序，纯化及进一步表征(见表3)。
表3.KLH-KD/KD-KLH和KLH-DAKD/DAKD-KLH免疫结果
Figure BDA0003269908170000491
Figure BDA0003269908170000501
基于表3所见结果，有独特序列的五个克隆被选出用于动力学研究。这些抗体高选择性结合DAKD-生物素,KD-生物素,DAKLP-生物素和KLP-生物素(见表4)。它们不结合其他激肽多肽或N-端生物素化多肽。
表4.选出的抗DAKD/KD候选物的抗体动力学总结
Figure BDA0003269908170000511
用一系列免疫原(见多肽列表,表2)进行额外的免疫反应，以产生封闭啮齿类动物BKR1配体，DABK和DAK的抗体及与激肽家族不同多肽成员具有其他结合特异性的抗体。表5列出了产生的抗体的重链和轻链序列
表5.抗体的重链和轻链序列
Figure BDA0003269908170000512
Figure BDA0003269908170000521
Figure BDA0003269908170000531
实施例3:鼠类动物研究中的替代抗体生成
用于鼠类动物研究中的替代抗体要能够结合并中和啮齿类动物BKR1配体，DABK和DAKLP(DAKD的小鼠对应物)。为了产生所需的替代抗体，首先用N-端直接连接KLH的DABK和/或DAKD免疫小鼠。用ELISA方法筛选出的生物素-DABK/生物素-DAKD(生物素直接连在其N-端)阳性杂交瘤克隆，被选出来用于扩大化和纯化。家族7中列出的抗体(见表12)，其展示了与生物素-DABK，生物素-DAKLP和生物素-DAKD高结合亲和力,是基于Biacore直接结合分析选出来的(见表10)。然而，这些家族7抗体在竞争性ELISA中显示不与原始的未经修饰的DABK和DAKD多肽结合，并且在用功能性药物筛选系统(FDSS)(Hamamatsu Photonics K.K.,Japan)分析钙内流时缺乏中和功能。另外，在进行FDSS分析时，生物素-DABK和生物素-DAKD相比原始的未经修饰的DABK和DAKD完全丧失了生物活性(数据未显示)。
假说认为，DABK和DAKD N-端直接连接KLH和生物素阻止了DABK和DAKD原始构象的形成。为修复KLH-和生物素-偶联多肽的原始构象，接头被设计并添加到DABK和/或DAKD N-端以期“缓冲”KLH和生物素在多肽构象上的偶联效应。多聚甘氨酸接头首先被尝试并检验，由于其基于模拟结果的简单，非极性和中性特点。FDSS分析结果表明gly-gly-gly(3G)接头是最佳的，依其恢复KLH和生物素偶联的DABK和DAKD多肽生物活性的能力(数据未显示)。因此，KLH-3G-DABK被选用于免疫小鼠。同时生物素-3G-DABK和生物素-3G-KD被用于基于结合的筛选分析(ELISA和Biacore)。在这新一轮的替代抗体杂交瘤选择中，一些DABK/DAKD特异性抗体(家族3,见表13)被鉴定出来。基于EE1针对原始DABK/DAKD的优越结合亲和力和中和活性，以及和其他肽缺少交叉反应，其被选为主要的替代抗体。
用表13所列不同免疫原进行免疫，产生了特异性不同的抗体。家族4抗体对BKR2受体配体，BK和KD具有特异性。家族5抗体特异性结合BK和DABK的C-端。家族6抗体结合BK,DABK和DAKD，但不结合KD。
其他接头适应DABK/DAKD结合口袋的能力所决定的其与替代性EE1抗体的结合也被评价，包括更长的多聚甘氨酸接头，多聚丙氨酸接头和已存在接头例聚乙二醇(PEG2)接头和氨基己酸酸(Ahx)接头(6-碳惰性接头)。所有接头多肽通过定制由Abgent(Can Diego,CA)合成。所有经检验的伴有接头的生物素化多肽(生物素-接头-DABK/DAKD)与EE1结合良好，表明任何的惰性N-端接头都可帮助偶联有生物素或其他分子的DABK和DAKD多肽恢复它们的原始活性构象。相反，据观察EE1与生物素-DABK和生物素-DAKD，这类N-端直接偶联生物素的多肽，不结合或弱结合(见图1)。
生成抗体的结合动力学总结在表5-11中。随后，所有生成的抗体被分类到家族中，它们的结合特异性总结在以下表12中。表13提供了基于结合特异性(见表12)归于家族1和2中抗体的重链和轻链序列。
表6.针对b-3G-DABK和b-3G-DAKD多肽的抗体动力学总结
Figure BDA0003269908170000541
表7.针对b-3G-DAKLP和b-3G-BK的抗体动力学总结
Figure BDA0003269908170000551
表8.针对b-3G-KLP和b-3G-KD多肽的抗体动力学总结
Figure BDA0003269908170000552
表9.针对DABK-b和DAKLP-b多肽的抗体动力学总结
Figure BDA0003269908170000561
表10.针对BK-b和b-BK多肽的抗体动力学总结
Figure BDA0003269908170000562
表11.针对b-DABK和b-DAKD多肽的抗体动力学总结
Figure BDA0003269908170000563
Figure BDA0003269908170000571
表12.针对b-DAKLP和b-KD多肽的抗体动力学总结
Figure BDA0003269908170000572
表13.抗激肽多肽抗体生成总结
Figure BDA0003269908170000573
Figure BDA0003269908170000581
实施例4:运用钙流动表征脱-精氨酸-激肽配体消耗
功能性分析被用于进一步表征所生成的七个抗体家族。缓激肽B1受体信号转导与Gq偶联，因此受体活化可通过Gq活化IP3和下游钙流动来监测。HEK mBKR1(重组小鼠缓激肽B1受体)细胞或MRC5(B2受体内源性表达(ATCC CCL-171))被用于测量钙流动。
简言之，用引物804_cGWY_F:
5’-AAAAGCAGGCTTAGGAGCGGCCGCCATGGCGTCCCAGGCCTCGCTG-3’(SEQ ID NO:107)和804_cGWY_R:
5’-CAAGAAAGCTGGGTCGGATCCTTATAAAGTTCCCAGAACCCTGGTC-3’(SEQ ID NO:108)及Pfu Polymerase(Agilent Technologies,Cat#600264)从小鼠肺cDNA(Biochain,Cat#C1334152)扩增小鼠Bdkrb1基因(序列见后)，并用BP clonase酶混合物(Invitrogen,Cat#11789-020)将其克隆到pDONR201中。平行地，通过插入N-端HA尾(GCATACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT,GenBank SEQ ID NO:109 CY100443)到经EcoRI和HindIII线性化的pEAK8表达载体(EDGE Biosystems)中(形成载体pEAK8-nHA)及随后再插入Gateway cassette B(Invitrogen,Cat#11828-029)到经EcoRI和NotI消化并用Klenow聚合酶(NEB,cat#M0210S)末端钝性连接的pEAK8_nHA中，对pEAK8表达载体(EDGEBiosystems)进行修饰，形成载体pEAK8_nHA_DEST。接着，用LR clonase(Invitrogen,Cat#11791-100)将小鼠Bdkrb1基因亚克隆到pEAK8_nHA_DEST中。随后用Fugene6转染试剂将pEAK8-Bdkrb1质粒转染到293-PSC细胞中。转染24小时后细胞置于抗生素(嘌呤霉素)选择环境中，维持选择以生成稳定的细胞系。通过
实时RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳确认所生成的稳定细胞系中Bdkrb1基因的存在。通过使用抗缓激肽B1受体上N-端HA尾(Covance,Cat#MMS-101P)抗体在FACS设备上检测缓激肽B1受体在细胞表面的表达。缓激肽B1受体的功能活性通过选择性激动剂钙流分析来展示。
亚克隆到细胞中的Bdkrb1基因基因：
ATGGCGTCCCAGGCCTCGCTGAAGCTACAGCCTTCTAACCAAAGCCAGCAGGCCCCTCCCAACATCACCTCCTGCGAGGGCGCCCCGGAAGCCTGGGATCTGCTGTGTCGGGTGCTGCCAGGGTTTGTCATCACTGTCTGTTTCTTTGGCCTCCTGGGGAACCTTTTAGTCCTGTCCTTCTTCCTTTTGCCTTGGCGACGATGGTGGCAGCAGCGGCGGCAGCGCCTAACCATAGCAGAAATCTACCTGGCTAACTTGGCAGCTTCTGATCTGGTGTTTGTGCTGGGCCTGCCCTTCTGGGCAGAGAACGTTGGGAACCGTTTCAACTGGCCCTTTGGAAGTGACCTCTGCCGGGTGGTCAGCGGGGTCATCAAGGCCAACCTGTTCATCAGCATCTTCCTGGTGGTGGCCATCAGTCAGGACCGCTACAGGTTGCTGGTATACCCCATGACCAGCTGGGGGAACCGGCGGCGACGGCAAGCCCAAGTGACCTGCCTGCTCATCTGGGTAGCTGGGGGCCTCTTGAGCACCCCCACGTTCCTTCTGCGTTCCGTCAAAGTCGTCCCTGATCTGAACATCTCTGCCTGCATCCTGCTTTTCCCCCACGAAGCTTGGCACTTTGTAAGGATGGTGGAGTTGAACGTTTTGGGTTTCCTCCTCCCATTGGCTGCCATCCTCTACTTCAACTTTCACATCCTGGCCTCCCTGAGAGGACAGAAGGAGGCCAGCAGAACCCGGTGTGGGGGACCCAAGGACAGCAAGACAATGGGGCTGATCCTCACACTGGTAGCCTCCTTCCTGGTCTGCTGGGCCCCTTACCACTTCTTTGCCTTCCTGGATTTCCTGGTCCAGGTGAGAGTGATCCAGGACTGCTTCTGGAAGGAGCTCACAGACCTGGGCCTGCAGCTGGCCAACTTCTTTGCTTTTGTCAACAGCTGCCTGAACCCACTGATTTATGTCTTTGCAGGCCGGCTCTTTAAGACCAGGGTTCTGGGAACTTTATAA(GenBank NM_007539；SEQ ID NO:110)。
HEK mBKR1或MRC5细胞被铺到384孔透明底平板上的生长培养液中，并使其过夜附着。然后，除去生长培养液，用分析缓冲液(HBSS，20mM的HEPES，2.5mM丙磺舒)洗涤细胞，用0.5uM细胞通透性钙敏感染料Fluo-4AM伴0.04％聚醚酸37℃下加载1小时。AM酯被裂解，钙染料保留在细胞质中。1小时后，洗涤细胞以除去过量的染料，及留在细胞上的20ul残余缓冲液。加入2x溶液(FDSS)到Hamamatsu功能性药物筛选系统(FDSS)上进行处理，并动态检测钙流动至少4分钟。B1R和B2R受体活化导致Galpha q介导的磷脂酶C活化及IP3介导的钙流动。Fluo-4染料螯合释放钙，并可观察到强的荧光变化。结果输出为最大-最小相对荧光单位，以标化细胞密度或平板染料加载的差异。
通过每天运行配体浓度反应曲线来测量配体效价，并选出配体的一个近似EC70-80浓度用于同抗体孵育。选择EC80浓度是由于其在检测曲线的线性范围内且有激动剂或配体消耗抗体下降的足够视窗。允许将配体EC80浓度与荧光变化监测到的配体消耗相联系来得到抗体剂量反应曲线。用缓冲液及EC80配体的反应值标化结果并计算出配体消耗的EC50值。然后结果被表示为对应于减少消耗配体反应50％的抗体浓度(即，抗体EC50)除以所用配体浓度的摩尔比率。理论上最大值应为0.5，因为一单位抗体理论上可消耗2单位配体，但实际中见到的值偏低，这可能是低配体浓度检测方法不敏感的反映，而非抗体化学计量的约束。这些实验的结果如表14-16所示。
抗体家族1和2(见表13)在Biacore(表3)显示了优越的结合动力学，并通过钙流测定显示了对DAKD和KD多肽的优越中和活性(表14和15)。进一步分析这些抗体在用于人源化时的热稳定性和序列适宜性。F151用于人源化是优良的，因其是热稳定的，CDR区无问题残基且对小鼠配体KLP和DAKLP交叉反应。
表14.HEK mBKR1细胞中使用钙流动进行脱-精氨酸-胰激肽配体消耗表征
Figure BDA0003269908170000601
Figure BDA0003269908170000611
表15.MRC5胎儿肺纤维母细胞中使用钙流动进行脱-精氨酸-胰激肽配体消耗表征
Figure BDA0003269908170000612
Figure BDA0003269908170000621
实施例5:F151工程化：人源化，稳定化及突变不需要序列基序
1.人源化
本文所用人源化方案已在PCT/US08/74381(US20110027266)中有过描述，此处通过提及完整并入。用小鼠F151的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)序列在MolecularOperating Environment(MOE；v.2009.10；Chemical Computing Group)中构建抗-DAKD/KDF151 LC和HC的同源模型。需要使用以下模板：轻链框架–1SBS(框架区有93％一致性),重链框架–2VXT(框架区有84％一致性),L1–1LVE(93％一致性),L2–1EEU(100％一致性),L3–2R56(93％一致性),H1–1NJ9(95％一致性),H2–2VXU(76％一致性)及H3–1HIL(49％一致性)。模版可在www.rcsb.org上的RCSB蛋白质数据库(RCSB Protein Data Bank)中找到，该网站由Rutgers和加州大学圣地亚哥分校管理(Berman,H.M；Westbrook J.；Feng.Z.；Gilliland,G.；Bhat,T.N.；Weissig,H.；Shindyalov,I.N.；Bourne,P.E.The Protein DataBank,Nucleic Acids Research,2000,28,235-242.)。使用MOE法的标准程序构建蛋白同源模型并使其能量最小化。随后对鼠F151蛋白能量最小化的3D同源模型进行了分子动力学模拟(MD)，蛋白质骨架约束在常规的Born implicit溶剂中，温度为500k，时间1.1ns，。最初的MD运行中，在最后1ns内每100ps(抽取1个)共抽取出10个不同构象。然后针对这些不同的构象逐个再进行MD模拟，对于蛋白质骨架不作约束限制，温度为300k，持续时间2.3ns。选取以上10个MD运行中的每个结果，其MD轨迹中的最后2000个快照(每ps 1个)用于计算鼠F151每个氨基酸相比一个参考中心点位置的均方根偏差。通过比较一个给定氨基酸在以上10个独立MD运行中的平均均方根偏差与小鼠F151所有氨基酸(在以上10个独立MD运行中)总的平均均方根偏差的结果，来判定此氨基酸是否具有足够的柔性，从而在MD中被考虑是否有可能与T细胞受体作用并负责激活免疫反应。鼠F151抗体中的62个氨基酸被鉴定为柔性的，其中不包括CDR及其紧邻
Figure BDA0003269908170000631
的区域。
然后通过MD模拟的方法，对鼠F151最具柔性的28个氨基酸在20ns(10x 2ns)内的运动，与49个人类种系同源模型中相应最具柔性的氨基酸在10x 2ns内的运动进行比较。这49个人类种系模型是通过系统组合7个最普遍人类种系轻链(vk1,vk2,vk3,vk4,vlambda1,vlambda2,vlambda3)和7个最普遍人类种系重链(vh1a,vh1b,vh2,vh3,vh4,vh5,vh6)构建的。人类种系抗体vk1-vh1b的柔性氨基酸与鼠F151抗体的柔性氨基酸显示出0.8 4D相似性；因此人类种系抗体vk1-vh1b被用于聚焦在柔性氨基酸上人源化F151。基于这两个相应同源模型的α碳的3D最佳重叠进行其序列比对，用于鼠F151与vk1-vh1b氨基酸之间的成对氨基酸关联(F151 LC同vk1，F151HC和vh1b比对，见图15)。
2.稳定化
两种途径被用于提升该抗体的稳定性。
a)基于知识的途径
重链和轻链中同它们的相对合规序列相比出现频率较低的氨基酸，不包括CDR，被建议突变为发现的最高频氨基酸(ΔΔGth>0.5kcal/mol；E.Monsellier,H.Bedouelle.J.Mol.Biol.362,2006,p.580-593)。重链和轻链中的这第一批一致性突变被限定于最接近的人类种系(vk1-vh1b)中发现的氨基酸。当建议的变化在紧邻CDR时(5埃“游标”区，J.Mol.Biol.224,1992,p.487-499)，其不予考虑。这就导致了LC中5个稳定化突变(见表19)和HC中4个稳定化突变(见表20)。考虑其他标准，以判断这些突变用于潜在稳定抗DAKD/KD F151抗体的能力。这些标准是指基于预测的稳定化突变能带来亲水性表面或分子力学的一个有利改变。另外，文献(E.Monsellier&H.Bedouelle,J.Mol.Biol.,362,2006,p.580-593；B.J.Steipe等J.Mol.Biol,1994,240,188-192)中报道的其他应用成功的稳定化突变也予以考虑(见表16-22)。这样的一个改变被吸收作为一个稳定化突变(D89E)用于后边的HC2a,HC2b和HC2c序列中。另一个建议的改变(Q62E)被引入变体HC2b中。
b)基于3D和MD的途径
基于3D和MD的途径之前已有报道(Seco J,Luque FJ,Barril X.,J MedChem.2009 Apr 23；52(8):2363-71；Malin Jonsson等.,J.Phys.Chem.B 2003,107,5511-5518)。通过分析Fab在二元溶剂(20％异丙醇在水中，20纳秒仿真结果)中的分子动力学模拟，明确鉴定该抗体的疏水区。赖氨酸突变被引入到这些疏水区域的紧邻以尝试阻止聚合。其他分析通过在Schrodinger’s maestro software(v.8.5.207)中使用疏水表面图来完成。结合这两种方法，有2个赖氨酸突变被推荐，1个在重链，1个在轻链。
3.通过移植人源化
使用移植进行人源化的技术之前已有报道(Peter T.Jones,Paul H.Dear,Jefferson Foote,Michael S.Neuberger&Greg Winter Nature,1986,321,522-525)。这种人源化方法始于鉴定最接近的人类种系抗DAKD/KD重链和轻链。这可通过运用BLAST检索工具在所有人类种系中搜索来完成，所有的人类种系被系统地列举出来(对于kappa和lambda链，V&J结构域的所有可能组合；对于重链，V，D和J结构域的所有可能组合)。
以下最接近的人类种系轻链和重链被鉴定出来，它们相对于抗DAKD/KD F151轻链(LC)和重链(HC)分别具有83％和62％的序列一致性(见图16)。运用国际VBASE种系，轻链被发现接近V IV-B3(～83％一致性)座位，重链被发现接近1-08&1-18(～62％一致性)座位，这两个座位为VH1的亚家族。CDR区(如MOE所定义)和游标区(如Foote&Winter,J.Mol.Biol.,1992,224,487-499中所定义)用粗体表示。下划线上的人化突变是通过进行两个线性序列成对比较得到的，其中排除了如前定义的CDR和游标区残基。在另一个人源化变体中，比较只排除了CDRs。
4.不需要序列基序的突变
以下序列基序纳入考虑：Asp-Pro(对酸不稳定键),Asn-X-Ser/Thr(糖基化,X＝任何氨基酸除Pro),Asp-Gly/Ser/Thr(在柔性区形成琥珀酰亚胺/异天冬氨酸),Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys(暴露的脱酰胺化位点),和Met(在暴露区域氧化)。根据另外一些标准，鼠F151的VL和VH结构域被从其他鼠抗体中选择出来，因为鼠F151没有暴露的不需要的序列基序，但他们在一些人源化变体中却引入了。
LC3A，LC3B，HC3a和HC3b各有已查明的潜在问题的琥珀酰亚胺位点。在推荐序列中这些位点并没有被修饰，因为涉及到的残基可能参与了氢键网络(同源模型的肉眼检查)。同样，在许多其它抗体结构中也发现了这些位点。此外，在HC3a和HC3b中，通过移植进行严格的人源化将包括把Ser115取代为Met。此位置上甲硫氨酸是暴露的。建议将此位点取代为亮氨酸作为一个人源化化突变，因为亮氨酸是许多接近人类种系序列中的一个常见残基。
由此产生的人源化序列在国际表位数据库(IEDB)(见于www.immuneepitope.com；version June 2009；Vita R,Zarebski L,Greenbaum JA,Emami H,Hoof I,Salimi N,Damle R,Sette A,Peters B.The immune epitope database 2.0.Nucleic AcidsRes.2010 Jan；38(Database issue):D854-62.Epub 2009 Nov 11)中检索其相似序列，以确保没有一个人源化序列包含任何已知的人类B-或T-细胞表位(序列一致性70％被用作BLAST检索结果的临界点，并且只考虑从人类种系检索所得结果)。
5.鼠F151可变结构域的原始序列
CDRs用粗体来突出表示，游标区(如Foote&Winter,J.Mol.Biol.,1992,12，24,487-499所定义)用下划线表示。
轻链(SEQ ID NO:26)
Figure BDA0003269908170000651
种系指数＝83％Z46615_1_V_X67858_1_J[V IV-B3]
重链(SEQ ID NO:19)
Figure BDA0003269908170000652
种系指数＝62％Z12316_1_VX97051_4_D_X97051_5_J[VH1 1-18]
6.工程化序列
a)背景
5个版本的轻链(LC1，LC2a，LC2b，LC3A和LC3B)和5个版本的重链(HCl，HC2a，HC2b，HC3a和HC3b)被推荐。
LC1含有5个通过4D人源化方案鉴定出的人源化突变。LC2a额外引入了5个稳定化突变。LC2b附加了1个赖氨酸突变，以帮助防止聚集。LC3a含有15个突变，其源自移植到最接近的人类种系序列及保留鼠CDR和游标区残基。LC3b含有16个突变，其源自CDR移植及一个额外的人源化突变。
HC1具有6个通过内部协议鉴定出的人源化突变。HC2a额外引入了5个稳定化突变，同时，HC2b相比HC1包含6个额外的稳定化突变。除了含有HC2a的稳定化突变，HC2c另外含有1个赖氨酸突变，以帮助防止聚集。HC3a包含19突变，其源自移植到最接近的人类种系序列及保留鼠CDR和游标区残基。HC3b包含25个源自CDR移植的突变。
共有6种组合被推荐(总结于表16)：
·LC1 X HC1(突变只解决人源化)
·LC2a X HC2a(突变解决人源化和稳定化)
·LC2a X HC2b(突变解决人源化和稳定化)
·LC2b X HC2c(突变解决人源化，稳定化及“抗聚集”)
·LC3a X HC3a(突变通过移植+游标解决多数人源化)
·LC3b X HC3b(突变通过嫁接解决人源化)表16.6个推荐的LCxHC组合总结
Figure BDA0003269908170000661
表17.抗DAKD/KD F151抗体的5个LC变体的突变
Figure BDA0003269908170000662
Figure BDA0003269908170000671
表18.抗DAKD/KD F151抗体的6个HC变体的突变
Figure BDA0003269908170000672
Figure BDA0003269908170000681
b)工程化轻链序列
所有推荐变体中未发现潜在有问题的已知T细胞或B细胞表位。
LC1(SEQ ID NO:27)，人源化突变为下划线，CDRs和游标区为粗体：
Figure BDA0003269908170000682
LC2a(SEQ ID NO:28)，人源化突变为下划线，CDRs和游标区为粗体，稳定化突变为斜体(如下所示，5位上的T，12位上的S，21位上的I，69位上的S，91位上的T)：
Figure BDA0003269908170000683
LC2b(SEQ ID NO:29)，人源化突变为下划线，CDRs和游标区为粗体，稳定化突变为斜体(如下所示，5位上的T，12位上的S，21位上的I，69位上的S，91位上的T)，抗聚集突变是89位的K：
Figure BDA0003269908170000691
LC3a(SEQ ID NO:30)，移植突变表示为下划线，CDRs和游标区表示为粗体：
Figure BDA0003269908170000692
LC3b(SEQ ID NO:31)，移植突变表示为下划线，CDRs和游标区表示为粗体：
Figure BDA0003269908170000693
注意：52位的L是游标区残基，被突变为人源化。
C)工程化重链序列
HC1(SEQ ID NO:20)，人源化突变为下划线，CDRs和游标区为粗体：
Figure BDA0003269908170000694
HC2a(SEQ ID NO:21)，人源化突变为下划线，CDRs和游标区为粗体，稳定化突变为斜体(如下所示，1位上的Q，9位上的A,44位上的G，80位上的Y，90位上的E)：
Figure BDA0003269908170000695
HC2b(SEQ ID NO:22)，人源化突变为下划线，CDRs和游标区为粗体，稳定化突变为斜体(如下所示，1位上的Q，9位上的A,44位上的G，62位上的E,80位上的Y，90位上的E)：
Figure BDA0003269908170000696
Figure BDA0003269908170000701
序列HC2b中未鉴定出IEDB数据库中的人类表位。
HC2c(SEQ ID NO:23)，人源化突变为下划线，CDRs和游标区为粗体，稳定化突变为斜体(如下所示，1位上的Q，9位上的A,44位上的G，80位上的Y，90位上的E)，抗聚集突变是86位的K：
Figure BDA0003269908170000702
HC3a(SEQ ID NO:24)，移植突变表示为下划线，CDRs和游标区表示为粗体：
Figure BDA0003269908170000703
HC3b(SEQ ID NO:25)，移植突变表示为下划线，CDRs和游标区表示为粗体：
Figure BDA0003269908170000704
注意：以下游标区残基被突变至人源化：2位上的V，48位上的M,68位上的V，70位上的M，74位上的T。
序列HC3b中未鉴定出IEDB数据库中的人类表位
HC3b种系指数＝83％Z12316_1_V_J00235_1_D_U42590_1_J[1-18/DP-14]。
表19.轻链中推荐的稳定化改变
残基 推荐的改变 算得的Gth 接受改变
Ser-5 Thr 2.32286 是
Ala-12 Ser 0.75228 是
Met-21 Ile 0.768959 是
Pro-52 Leu 1.70059 否–游标区
Thr-69 Ser 1.10843 是
Lys-86 Glu 2.00115 否–在人源化过程中变为Gln
Ile-91 Thr 1.27255 是
表20.重链中推荐的稳定化改变
残基 推荐的改变 算得的Gth 接受改变
Glu-1 Gln 0.562423 是
Ile-2 Val 2.15882 否–游标区
Pro-9 Ala 0.505324 是
Thr-16 Ala 1.50552 人源化中已经变为Ala
Val-20 Leu 2.21586 否–不在种系序列中
Ser-40 Arg 1.03643 否–不在种系序列中
His-41 Pro 1.67738 在人源化中已经变为Pro
Ser-44 Gly 1.5068 是
Gln-62 Glu 0.74934 否–不在种系序列中
Arg-65 Lys 2.32314 否–不在种系序列中
Phe-80 Tyr 1.30935 是
His-82 Gln 2.24674 否–不在种系序列中
Asp-89 Glu 1.65409 在人源化中已经变为Glu
Asn-98 Arg 3.65643 否–游标区
表21.经评估的稳定性突变组合
Figure BDA0003269908170000711
表22.潜在的稳定性突变
Figure BDA0003269908170000712
Figure BDA0003269908170000721
实施例6:人源化变体的表征
基于表16中所列的轻、重链的计算机建模，人源化F151轻链和重链可变区DNA进行密码优化以方便在HEK293表达，其基因由GeneArt(Life Technologies的子公司)合成。合成的DNA片段，轻链可变区基因在ApaLI/BsiWI位点克隆到编码轻链恒定区(CL)的载体pFF0362(A.人Kappa LC载体)中，重链可变区基因在ApaLI/ApaI位点克隆到编码重链恒定区(CH1,CH2和CH3)的载体pFF0363(B.人IgG1 HC载体)中。所形成的含有人源化F151变体轻链全长序列的质粒pFF0460和含有重链全长序列的质粒pFF0466共转染FreeStyleTM293表达系统(Invitrogen/Life Technologies,catalog no.K9000-01)并在其中短暂表达。
表16所示的六个人源化变体，通过本领域常规使用的多种参数诸如结合动力学(前边讨论过)和理化特性，例如热稳定性等来进行表征。
在两个层面对以上变体进行表征。第一层包括如表24和图2所示差示扫描量热法(DSC)。简言之，DCS实验中，用磷酸盐缓冲盐溶液透析抗体。通过紫外(UV)吸收测定抗体浓度。用PBS将抗体稀释至1mg/mL。使用用Calorimetry Sciences Corporation N-DSC II设备，用含有PBS的0.3268mL毛细管在参考池来进行扫描。扫描率为2℃/min，将样品从20℃扫描至100℃。
所有变体，除HC3b/LC3b外都表现出与亲本抗体相似的结合亲和力。基于其他的理化特性诸如SEC数据，稳定性及不发生聚集(见表23-25)，变体HC3a/LC3a从其他抗体中选取出来。
表23.人源化F151变体动力学比较
Figure BDA0003269908170000722
Figure BDA0003269908170000731
表24.人源化变体第一层比较
Figure BDA0003269908170000732
Figure BDA0003269908170000741
表25.人源化变体第二层比较
Figure BDA0003269908170000742
表26.亲本F151与人源化变体F151(HC3a/LC3a)比较
Figure BDA0003269908170000743
Figure BDA0003269908170000751
亲本F151与人源化变体F151(HC3a/LC3a)的轻链和重链比对见图3。
实施例7:抗BRK1配体胰激肽和脱-Arg10-胰激肽的人源化抗体F151的晶体结构
测定结合至胰激肽或脱-Arg10-胰激肽的人源化F151(HC3a/LC3a)Fab的晶体结构并分析分子间相互作用。
胰激肽粉末购自Phoenix Pharmaceuticals(Cat.No.009-37)。为生成Fab蛋白，从人源化F151 HC3a/LC3a而来的重链可变区DNA克隆到6Xhis标记的CH1载体pFF0366。此处用到的轻链质粒和原始F151 LC3a在F151人源化(见实施例5)中所用的相同。这两种质粒共转染到自由型HEK293细胞中用于Fab蛋白的表达。然后使用钴树脂纯化Fab蛋白，并将缓冲液换为50mM MES pH6.0,50mM NaCl，再浓缩至9mg/mL。纯化后的F151Fab蛋白与胰激肽以1:2摩尔比率混合并用于结晶筛选。其在宽范围的条件下进行。在Hampton Research公司筛选试剂盒PEG/ION HT所提供的B10,B12和G10条件下，观察到了最优的晶体。该晶体用缓冲良好的20％的甘油冷冻保护并冷冻，用于衍射数据收集。两种复合物的X线衍射数据均用Canadian Light Source，光束CMCF-08ID收集。对于F151-KD复合物而言，其Rmerge值为8.9％，I/s(I)为20.2；而对于F151-DAKD复合物而言，其Rmerge值为7.7％，I/s(I)为18.5。在Phaser中通过分子置换法对F151-KD结构进行处理，其使用的Fab对应物来自蛋白质数据库(PDB)条目3QOS，VL-VH和CL-CH1结构域被作为独立单元进行处理。在autoBuste中，在分辨率
Figure BDA0003269908170000761
的条件下，在空间群P212121中将其结构修正到剩余值(Rfactor)0.205，自由剩余值(Rfree)0.228。运用前述F151-KD的对应物对F151-DAKD结构进行处理。在Phaser中分辨率为
Figure BDA0003269908170000762
的条件下，在空间群P212121中将其结构修正到剩余值(Rfactor)0.232，自由剩余值(Rfree)0.238。
图4和5所示电子密度图显示了KD和DAKD与F151的结合并明确地确定了每个氨基酸位置。对于胰激肽，其C末端残基Arg10的电子密度图不存在。这与在DAKD上的观察一致，其缺少C端精氨酸(如下，表27所示)，与F151结合和KD一样良好。F151对KD和DAKD中和FDSS细胞分析中的IC50值分别是0.12nM和0.09nM。两种情形下，电子密度均朝着多肽C端减弱。然而Phe9在KD中的电子密度略好于其在DAKD，可能是结合至F151时，KD C端额外精氨酸的存在稳定了其C端，虽然这个精氨酸本身不是足够稳定到可通过X线观察到。由于这两个结构基本上是相同的(KD和DAKD C原子间均方根(rms)是0.139，所有原子间均方根是0.328)，故以下所有讨论都将基于F151-KD的结构。
表27.所选激肽名单
Figure BDA0003269908170000771
KD通过将其N端埋入重链和轻链的Fv亚基之间的界面而被结合，如图6所示。重链和轻链之间的界面布满芳香族氨基酸，包括Tyr-L42,Tyr-L93,Tyr-L100,Trp_L102,Phe-L104和Tyr-H35,Trp-H47,Tyr-H50,Tyr-H99,Trp-H110，通过堆积和疏水作用彼此相互稳定。重链和轻链的每个CDR中的残基都对结合有贡献。如图7和8的CDRs图谱所示，轻链和重链的残基参与同KD的相互作用。重链CDR H3是最长的环，也是与KD相互作用中最常用的，其形成KD的一个侧盖。该环主要通过与其他两个CDR(重链的H1和H2)相互作用来稳定，即：Asp-H101和Arg-H52之间的盐桥(稳定H1和H3)，Tyr-H102和Tyr-H54之间芳烃与氢的相互作用(稳定H2和H3)，Asp-H108和Tyr-H35之间的氢键，His-H105和Tyr-L55之间的氢键(稳定H3和L2)。
在所生成的抗体间，比较其与KD相互作用的残基，可以看到抗体之间有相似性，而且在用特定氨基酸与KD相互作用上一些比其他的更加相近。例如，在轻链，F151,C63和I22在它们的CDRs中使用更加相似的氨基酸同KD结合，而B21和I54更相似。在重链，F151和C63彼此之间并同B21,I22和I54惊奇的不同。后三个似乎可依相似性划为一组。在其重链，C63特别有趣，即其H2和H3的环长同其他所有的更加不同。将Fab作为一个整体看待，B21和I54是最密切相关的。
在晶体结构中，我们发现KD参与系统氢键和与Fab的疏水相互作用。KD的N端埋入Fab且包藏有更多的密集作用，而C端基本上是溶剂暴露的。除了开始的4个残基(Lys-Arg-Pro-Pro)，KD的其他残基逐渐伸入大量溶剂中。Lys1侧链的脒基通过盐桥被Glu-L61(L:轻链)锚定，而氨基端的Lys1氨基则与Asp-H108(H:重链)形成盐桥。同时Lys1侧链的脒基笼罩在Tyr-L55的芳香环上，参与阳离子相互作用。涉及Lys1的这些密集作用，将KD N端牢固地锚定在Fab上。这也解释了Lys1在KD结合到F151上的重要性。没有它(即缓激肽)，就测量不到与hF151或F151可检测的结合。类似Lys1，Arg2通过一个盐桥与Fab相互作用。Arg2的胍基与Asp-H104的侧链相互作用。Arg2的侧链也与Arg-H101主链羰基氧形成氢键。另外，Pro8主链氧与Arg-H101侧链形成氢键。TYR-H102从插入Phe8和Pro9中间，参与与KD疏水相互作用。除直接作用外，也可看到KD与Fab之间无数由水介导的的氢键。另外有趣是，相比其他氨基酸，在相互作用中酪氨酸残基是被最频繁使用的；图7和8中标有星号的16个氨基酸残基中就有9个是酪氨酸。F151中所有包绕KD的残基似乎都在配体结合中发挥作用，除了Asn-H33，其接近Phe6侧链但极性不兼容且缺乏其他重要的相互作用。如果考虑亲和力成熟的话，用芳香/疏水残基取代，例如Trp或Tyr去与Phe8相互作用，似乎是一个快速选择。事实上，这两种芳香族氨基酸可见于其它抗体(Trp在C63,Tyr在B21,I22,I54)中。下面表28提供了图7和8标出的与KD相互作用的氨基酸残基的详细分析，并阐释了可在CDR区进行的、不会影响到抗原结合的功能取代。
表28.KD结合袋周围氨基酸残基列表，及其在KD结合中的功能和可能的功能取代(轻链残基为灰色单元格，重链残基为无阴影单元格)
Figure BDA0003269908170000781
Figure BDA0003269908170000791
胰激肽(KD)或脱-Arg10-胰激肽(DAKD)的构象表位分析显示其采用一个"Pro4结节"构象。如图17所示，“Pro4结节”构象的一个标志是KD或DAKD主肽链骨架在Pro4位的一个二型紧密转角(见Richardson JS."The anatomy and taxonomy of protein structure."Adv Protein Chem.1981；34:167-339,其通过此处提及并入)。“Pro4结节”构象进一步通过KD(1-2和6-9)或DAKD的全部或大部份剩余残基来限定，其采用一个S形的重复将疏水侧链排成空间堆积模式。
实施例8:抗-BKR1-配体抗体在疼痛模型中的体内药理学
本发明的这些实施例阐释抗-BKR1-配体抗体在急性和慢性痛不同临床前模型中的体内作用，这些模型是根据(a)Saddi GM和Abbott FV.,Pain(2000),89:53-63；(b)Chen等.,Molecular Pain(2010),2:6-13和(c)Bennett GJ和Xie YK.,Pain(1988),33:87-107.中所述的改进程序进行的。
动物
用20-30克成年雄性OF1小鼠进行福尔马林研究，25-30克成年雄性C57Bl/6J小鼠进行CFA和CCI研究。所用小鼠在一个控制温度、12小时光-暗循环的房间内饲养。食物和水随意添加。对于所有实验，试验前先让小鼠至少适应实验室环境2小时。研究不按随机化进行。处理不对进行行为学试验的试验者保密；但他们并不知道本研究的假说。所有程序获得sanofi-aventis的“Comitéd’Expérimentation pour la Protection de l’Animal deLaboratoire”(动物照看和使用委员会)批准，并遵照执行欧洲指导86/609/EEC的法国法律(Decree n°87-848–19 October 1987-and decision–19 April 1988)实施。
A.福尔马林诱导急性炎性痛
福尔马林试验用于测量伤害性疼痛和炎性痛。确实，足底注射福尔马林诱导了一个初始急性疼痛行为反应(0-12分钟)，紧接着是第二个炎症介导的反应(15-45分钟)，其归因于脊髓的兴奋性。
甲醛(37％，Sigma)按体积/体积在生理盐水中稀释为2.5％甲醛浓度(即约为6.25％福尔马林浓度)。轻柔固定小鼠并在一只后爪背侧皮下注射20μL2.5％甲醛浓度溶液。福尔马林注射后立即进行行为反应评分，然后在45分钟内每间隔3分钟，按如下标准评分：(0)：注射的爪子正常负重；(1)：注射的爪子轻放在地上(2)：抬举注射的爪子；(3)：舔或咬注射的爪子。组大小为11-12只雄性OF1小鼠。
评分对时间作图，曲线下面积通过早期(0-12分钟)和后期(15-45分钟)的平均得分(±SEM)进行计算。疼痛样行为的逆转表述为曲线下面积变化的百分率。
EE1抗体抑制雄性OF1小鼠在福尔马林试验后期阶段的疼痛样行为。EE1抗体在足底注射福尔马林前48小时静脉施用，显示出只针对后期疼痛样行为的剂量依赖性的逆转，其最小有效剂量(MED)＝2.5mg/kg，如图9所示。事实上，当施用量为2.5，10和30mg/kg时，EE1对后期分别逆转：35±5％，33±5％和45±7％，如表29所示。
相反，F151抗体在足底注射福尔马林前48小时静脉施用，对福尔马林试验后期阶段的疼痛样行为抑制作用较弱。事实上，当施用量为2.5和10mg/kg时，EE1对后期的逆转分别为：15±7％和21±5％，如表29所示。
表29.EE1和F151抗体对雄性OF1小鼠福尔马林诱导的疼痛样行为的作用
Figure BDA0003269908170000811
B1.CFA(完全弗氏佐剂)诱导的慢性炎性痛
慢性炎性痛的诱导是在3％异氟烷简单麻醉下，通过足底施用25μL完全弗氏佐剂(CFA)实现的，其含有：在矿物油中1μg/μL的热灭活结核分枝杆菌和二缩甘露醇单油酸酯(Sigma)。组大小为8只雄性C57Bl/6小鼠。
足底注射CFA22小时后，静脉施用EE1抗体2.5和30mg/kg，并在足底注射CFA后第1天，第4天和第7天评估机械和热超敏反应。
B1.机械性超敏反应
通过测量紧接Von Frey纤丝(Bioseb,France)在注射爪足底表面的10个刺激后的缩爪反应频率(FR,表示为％)，来评价机械性超敏反应。
为研究EE1抗体对疼痛样行为的效果，我们通过如下方法计算机械性超敏反应的逆转(用百分率)：
每只小鼠的逆转百分率＝(同种型对照组处理后FR均值－Ipsi处理后FR均值)/(同种型对照组处理后FR均值-空白组FR均值)
在足底注射CFA后第1天，第4天和第7天，观察到同种型对照1B7.11处理组同空白组相比FR有显著增加，表明机械性超敏反应的发展。足底注射CFA22小时后静脉施用EE1抗体，相比同种型对照1B7.11处理组，可显著降低在研究不同时间所测得FR(图10)。
EE1抗体静脉施用量为2.5和10mg/kg时，机械性超敏反应在第1天，第4天，和第7天的逆转分别为：41±8％和22±8％(第1天),36±9％和32±9％(第4天)，27±10％和50±9％(第7天)(表30)。
表30.EE1抗体对雄性C57Bl/6小鼠CFA诱导的机械性超敏反应的作用
Figure BDA0003269908170000821
B2.热超敏反应
用一个足底装置(IITC,Woodland Hills,USA)产生辐射热，通过测量对辐射热的缩爪潜伏期(PWL，用秒)来评价热超敏反应。
为研究EE1抗体对疼痛样行为的效果，我们通过如下方法计算热超敏反应的逆转(用百分率)：
每只小鼠的逆转百分率＝(EE1抗体处理后缩爪潜伏期-同种型对照组处理后缩爪潜伏期均值)/(同种型对照组处理前缩爪潜伏期均值-同种型对照组处理后缩爪潜伏期均值)
在足底注射CFA之前，所有组热超敏反应在基线水平没有差别(数据未显示)。
在足底注射CFA后第1天，第4天和第7天，观察到同种型对照1B7.11处理组小鼠注射爪缩爪潜伏期显著减小，表明CFA诱导了热超敏反应(数据未显示)。
足底注射CFA22小时后，静脉施用EE1抗体(即在足底注射CFA后第1天)，不管所用剂量如何，均不能增加小鼠第1天缩爪潜伏期。但是，EE1可显著增加第4天缩爪潜伏期，这种效果同样见于第7天(图11)。
EE1静脉施用量为2.5和30mg/kg时，热超敏反应在第4天，第7天的逆转分别为：41±15％和58±21％(第4天)，46±10％和52±17％(第7天)(表31).
表31.EE1抗体对雄性C57Bl/6小鼠CFA诱导的热超敏反应的作用
Figure BDA0003269908170000831
C.CCI(慢性压迫性损伤)诱导的神经样痛(Bennett’s模型)
CCI模型被作为周围神经损伤的一个模型而应用。简言之，用3％异氟烷麻醉小鼠，并在大腿中段水平通过一个小的切口暴露右侧坐骨神经。三根松散的6.0铬肠线(Ethicon)在1mm空间环扎坐骨神经。缝合肌肉和皮肤完成手术。CCI手术当天为第0天。组大小为6-10只雄性C57BL/6小鼠。
手术后第11天，静脉施用EE1抗体2.5和30mg/kg，并在手术后第12天(D12)，第14天(D12)和第18天(D12)评估机械和热超敏反应，以上天数分别对应于抗体处理后第1天(D1)，第3天(D3)，第7天(D7)。
C1.机械性超敏反应
用动态足底触觉计(Dynamic Plantar Aesthesiometer(Ugo-Basile,Italy))测量受伤(即，Ipsi)与非受伤(即，对照)后爪在一个不断增加的压力刺激下的缩回域值。用一根钢棒对小鼠后爪不断加力(10秒增加5克)。
为研究EE1抗体对疼痛样行为的效果，我们通过如下方法计算机械性超敏反应的逆转(用百分率)：
每只小鼠的逆转百分率＝(处理后Ipsi-处理前Ipsi)/(处理前对照–处理前Ipsi)。
手术后，进行了手术的小鼠受伤爪表现出对机械性刺激强敏感性，而其未受伤爪则没有受到影响。第11天，受伤爪对机械性刺激的敏感性达到了一个平台(数据未显示)。
手术后第11天，静脉施用EE1抗体显示其对CCI诱导的机械性超敏反应在第12天，14天和18天，有轻微的逆转趋势，施用量为2.5和30mg/kg时，逆转分别为：15.2±4.9％和15.2±5.7％(第12天),26.8±5.7％和25.7±4.5％(第14天)，30.3±7.1％和20.8±5.9％(第18天)(图12及表32)。
表32.EE1抗体对雄性C57Bl/6小鼠CCI诱导的机械性超敏反应的作用
Figure BDA0003269908170000841
C2.热超敏反应
用一个足底装置(IITC,Woodland Hills,USA)产生辐射热，通过测量对辐射热的缩爪潜伏期(PWL，用秒)来评价受伤爪热超敏反应。
为研究EE1抗体对疼痛样行为的效果，我们通过如下方法计算热超敏反应的逆转(用百分率)：
每只小鼠的逆转百分率＝(处理后Ipsi-同种型对照组处理后均值)/(空白组处理后均值-同种型对照组处理后均值)。
手术后，被手术的小鼠受伤爪表现出对热刺激强敏感性，而其未受伤爪则没有受到影响。第11天，受伤爪热敏感性达到了一个平台(数据未显示)。
手术后第11天，静脉施用EE1抗体，不能显著增加受伤爪在第12天的缩爪潜伏期，虽然观察到了增加的趋势。然而，从第14天开始，EE1抗体显著增加缩爪潜伏期(图13)。
施用量为2.5和30mg/kg时，对热超敏反应的逆转分别为：41±16％和56±24％(第12天)，51±16％和98±48％(第14天)，78±19％和84±22％(第18天)(表33)。
表33.EE1抗体对雄性C57Bl/6小鼠CCI诱导的热超敏反应的作用
Figure BDA0003269908170000842
Figure BDA0003269908170000851
序列表
<110> 赛诺菲(SANOFI)
<120> 缓激肽B1受体配体的抗体
<130> SA9-029CNDIV
<140> 新申请
<141> 随信同时
<150> 61/616,845
<151> 2012-03-28
<150> FR 1350953
<151> 2013-02-04
<160> 137
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 3
Arg Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 4
Arg Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /注=" 未知的描述: 缓激肽多肽"
<400> 5
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /注=" 未知的描述: 缓激肽多肽"
<400> 6
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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共有肽"
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<400> 7
Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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共有肽"
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<400> 8
Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 9
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn Ile Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 10
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成共有肽"
<220>
<221>变体
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<221> misc_feature
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<400> 11
Trp Ala Ser Thr Arg Glu
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成共有肽"
<220>
<221>变体
<222> (8)..(8)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
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<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<400> 12
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Ser Ser Asn Gln Lys Asn His Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 13
Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 14
Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 15
Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asn Ile Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 16
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 17
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 18
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 19
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 20
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 21
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 22
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: “合成多肽"
<400> 23
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Lys Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 24
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 26
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 27
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 27
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 29
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Lys Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 30
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 31
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 32
Trp Glu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Asp Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 33
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Arg Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 34
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Leu His
1 5 10
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 35
Leu Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 36
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 37
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 38
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 38
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Arg Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Phe
85 90 95
Asn Ala Trp Glu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 39
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 40
Glu Asp Tyr Gly Gly Asp Tyr
1 5
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 41
Glu Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 42
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn
1 5 10
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 43
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 44
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asp Gln Arg Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 45
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 45
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ile Gly Glu Asp Tyr Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 46
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asp Gln Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 47
Phe Glu Tyr Asp Gly Asn Tyr Ser Pro Leu Asp Phe
1 5 10
<210> 48
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 48
Trp Val Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 49
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 50
Gln Asn Asp His Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 51
Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 52
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 53
<211> 121
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 53
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Val Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Phe Glu Tyr Asp Gly Asn Tyr Ser Pro Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 54
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp His Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 55
Phe Glu Tyr Asp Gly Asn Tyr Ser Pro Leu Asp Phe
1 5 10
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 56
Trp Val Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 57
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 58
Met Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 59
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 60
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Glu Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 61
<211> 121
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 61
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Val Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Phe Glu Tyr Asp Gly Asn Tyr Ser Pro Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 62
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 62
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Pro Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Glu Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ser Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成共有肽"
<220>
<221>变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换="Phe"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换=" "
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
<222> (8)..(8)
<223> /替换="Ser"
<220>
<221>变体
<222> (9)..(9)
<223> /替换="Pro"
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
<222> (12)..(12)
<223> /替换="Tyr"
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<400> 63
Trp Glu Tyr Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Leu Asp Phe
1 5 10
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成共有肽"
<220>
<221>变体
<222> (2)..(2)
<223> /替换="Val"
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
<222> (9)..(9)
<223> /替换="Ser"
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
<222> (10)..(10)
<223> /替换="Asp"
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<400> 64
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成共有肽"
<220>
<221>变体
<222> (9)..(9)
<223> /替换="Met"
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<400> 65
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Leu His
1 5 10
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成共有肽"
<220>
<221>变体
<222> (2)..(2)
<223> /替换="Asn"
<220>
<221>变体
<222> (3)..(3)
<223> /替换="Phe" or "Asp" or "His"
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换="Phe" or "His" or "Trp"
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换="Phe" or "Thr" or "His"
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
<222> (8)..(8)
<223> /替换="Tyr" or "Phe" or "His" or "Leu"
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<400> 66
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成共有肽"
<220>
<221>变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换="Gly"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
<222> (6)..(6)
<223> /替换="Asp" or "Gln" or "Asn"
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<400> 67
Trp Ala Ser Thr Arg Glu
1 5
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成共有肽"
<220>
<221>变体
<222> (8)..(8)
<223> /替换="His" or "Tyr" or "Phe"
<220>
<221>变体
<222> (9)..(9)
<223> /替换="Gly"
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
<222> (11)..(11)
<223> /替换="Asp"
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
<222> (13)..(13)
<223> /替换="Arg"
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<220>
<221>变体
<222> (15)..(15)
<223> /替换="Tyr"
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<400> 68
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Ser Ser Asn Gln Lys Asn His Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成共有肽"
<220>
<221>变体
<222> (1)..(1)
<223> /替换="Met"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<400> 69
Leu Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 70
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成共有肽"
<220>
<221>变体
<222> (12)..(12)
<223> /替换="Glu"
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> /注=“序列中的残基对于注释中的所述位置的残基没有优势”
<400> 70
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注="生物素 C端"
<400> 71
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" KLH N端 "
<400> 72
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" KLH C 端"
<400> 73
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" 生物素 N端"
<400> 74
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5 10
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注="生物素 C端"
<400> 75
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5 10
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" KLH N端"
<400> 76
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5 10
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" KLH C端"
<400> 77
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5 10
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注="生物素 N端"
<400> 78
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注="生物素 C端"
<400> 79
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" KLH N端"
<400> 80
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" KLH C端"
<400> 81
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注="生物素 N端"
<400> 82
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注="生物素 C端"
<400> 83
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" KLH N端"
<400> 84
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" KLH C端"
<400> 85
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注="生物素 N端"
<400> 86
Arg Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5 10
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注="生物素 C端"
<400> 87
Arg Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5 10
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" KLH N端"
<400> 88
Arg Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5 10
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" KLH C端"
<400> 89
Arg Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5 10
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 90
Arg Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注="生物素 N端"
<400> 91
Arg Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注="生物素 C端"
<400> 92
Arg Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" KLH N端"
<400> 93
Arg Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注=" KLH C端"
<400> 94
Arg Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1 5
<210> 95
<211> 5
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /注=" 未知描述: 缓激肽 1-5 肽"
<400> 95
Arg Pro Pro Gly Phe
1 5
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注="生物素 N端"
<400> 96
Arg Pro Pro Gly Phe
1 5
<210> 97
<211> 136
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 97
Leu Pro Glu Phe Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val
1 5 10 15
Arg Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn
20 25 30
Ile Lys Asp Tyr Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Gly Tyr
50 55 60
Ala Arg Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser
65 70 75 80
Asn Thr Val Tyr Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Phe Asn Ala Trp Glu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Asp Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr
115 120 125
Pro Pro Ser Val Tyr Gly Ser Ser
130 135
<210> 98
<211> 134
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 98
Leu Pro Glu Phe Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
1 5 10 15
Gln Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr
20 25 30
Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr
50 55 60
His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
65 70 75 80
Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp
85 90 95
Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Ile Gly Glu Asp Tyr Gly Gly Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
115 120 125
Ser Val Tyr Gly Ser Ser
130
<210> 99
<211> 136
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 99
Leu Pro Glu Phe Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val
1 5 10 15
Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser
20 25 30
Phe Thr Asp Tyr Asn Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser
35 40 45
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr
50 55 60
Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser
65 70 75 80
Ser Thr Ala Phe Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr
115 120 125
Pro Pro Ser Val Tyr Gly Ser Ser
130 135
<210> 100
<211> 137
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 100
Leu Pro Glu Phe Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val
1 5 10 15
Arg Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn
20 25 30
Ile Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Ile Gly Trp Val Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Asp Tyr
50 55 60
Ala Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser
65 70 75 80
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Phe Glu Tyr Asp Gly Asn Tyr Ser Ser Leu
100 105 110
Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr
115 120 125
Thr Pro Pro Ser Val Tyr Gly Ser Ser
130 135
<210> 101
<211> 137
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 101
Leu Pro Glu Phe Glu Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val
1 5 10 15
Arg Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn
20 25 30
Ile Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Ile Gly Trp Val Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Asp Tyr
50 55 60
Ala Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser
65 70 75 80
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Phe Glu Tyr Asp Gly Asn Tyr Ser Pro Leu
100 105 110
Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr
115 120 125
Thr Pro Pro Ser Val Tyr Gly Ser Ser
130 135
<210> 102
<211> 133
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 102
Glu Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Thr Leu Ser Val Thr
1 5 10 15
Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
20 25 30
Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly
35 40 45
Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly
50 55 60
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
65 70 75 80
Lys Ile Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu
85 90 95
Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Lys Leu Glu Leu Tyr
130
<210> 103
<211> 134
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 103
Glu Leu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser
1 5 10 15
Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
20 25 30
Tyr Ser Ser Asp Gln Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Ser
35 40 45
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
50 55 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75 80
Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Ser Lys Leu Glu Leu Tyr
130
<210> 104
<211> 134
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 104
Glu Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser
1 5 10 15
Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
20 25 30
Tyr Thr Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
35 40 45
Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
50 55 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75 80
Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Ser Lys Leu Glu Leu Tyr
130
<210> 105
<211> 133
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 105
Glu Leu Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Ser Val Pro
1 5 10 15
Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Arg Gln Ser Leu Leu
20 25 30
Tyr Ser Asn Gly Glu Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly
35 40 45
Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly
50 55 60
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
65 70 75 80
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ser Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met
85 90 95
Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Lys Leu Glu Leu Tyr
130
<210> 106
<211> 133
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 106
Glu Leu Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Thr Leu Thr Leu Ser Val Pro
1 5 10 15
Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
20 25 30
Tyr Ser Asn Gly Glu Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly
35 40 45
Gln Ser Pro Lys Arg Gln Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly
50 55 60
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
65 70 75 80
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ser Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met
85 90 95
Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Lys Leu Glu Leu Tyr
130
<210> 107
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成引物"
<400> 107
aaaagcaggc ttaggagcgg ccgccatggc gtcccaggcc tcgctg 46
<210> 108
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成引物"
<400> 108
caagaaagct gggtcggatc cttataaagt tcccagaacc ctggtc 46
<210> 109
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成寡核苷酸"
<400> 109
gcatacccat acgacgtccc agactacgct 30
<210> 110
<211> 1005
<212> DNA
<213> 小鼠肌肉
<400> 110
atggcgtccc aggcctcgct gaagctacag ccttctaacc aaagccagca ggcccctccc 60
aacatcacct cctgcgaggg cgccccggaa gcctgggatc tgctgtgtcg ggtgctgcca 120
gggtttgtca tcactgtctg tttctttggc ctcctgggga accttttagt cctgtccttc 180
ttccttttgc cttggcgacg atggtggcag cagcggcggc agcgcctaac catagcagaa 240
atctacctgg ctaacttggc agcttctgat ctggtgtttg tgctgggcct gcccttctgg 300
gcagagaacg ttgggaaccg tttcaactgg ccctttggaa gtgacctctg ccgggtggtc 360
agcggggtca tcaaggccaa cctgttcatc agcatcttcc tggtggtggc catcagtcag 420
gaccgctaca ggttgctggt ataccccatg accagctggg ggaaccggcg gcgacggcaa 480
gcccaagtga cctgcctgct catctgggta gctgggggcc tcttgagcac ccccacgttc 540
cttctgcgtt ccgtcaaagt cgtccctgat ctgaacatct ctgcctgcat cctgcttttc 600
ccccacgaag cttggcactt tgtaaggatg gtggagttga acgttttggg tttcctcctc 660
ccattggctg ccatcctcta cttcaacttt cacatcctgg cctccctgag aggacagaag 720
gaggccagca gaacccggtg tgggggaccc aaggacagca agacaatggg gctgatcctc 780
acactggtag cctccttcct ggtctgctgg gccccttacc acttctttgc cttcctggat 840
ttcctggtcc aggtgagagt gatccaggac tgcttctgga aggagctcac agacctgggc 900
ctgcagctgg ccaacttctt tgcttttgtc aacagctgcc tgaacccact gatttatgtc 960
tttgcaggcc ggctctttaa gaccagggtt ctgggaactt tataa 1005
<210> 111
<211> 111
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 111
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
100 105 110
<210> 112
<211> 105
<212> PRT
<213> 人
<400> 112
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
100 105
<210> 113
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 113
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 114
<211> 123
<212> PRT
<213> 人
<400> 114
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Tyr Asp Tyr Asp Val Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 115
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 115
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 116
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 116
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Ser Ser Ser Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<220>
<221> 来源
<223> /注="生物素 N端"
<400> 117
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1 5
<210> 118
<211> 127
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 118
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Arg Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Phe
85 90 95
Asn Ala Trp Glu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
<210> 119
<211> 125
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 119
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ile Gly Glu Asp Tyr Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
<210> 120
<211> 127
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 120
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
<210> 121
<211> 128
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 121
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Val Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Phe Glu Tyr Asp Gly Asn Tyr Ser Pro Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
<210> 122
<211> 128
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 122
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Val Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Phe Glu Tyr Asp Gly Asn Tyr Ser Pro Leu Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
<210> 123
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 123
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
115
<210> 124
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 124
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asp Gln Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
115 120
<210> 125
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 125
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
115 120
<210> 126
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 126
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp His Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
115 120
<210> 127
<211> 360
<212> DNA
<213> 小鼠肌肉
<400> 127
gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctgggacttc agtgaaggtg 60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacaaca tctactgggt gaaacagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggatat tttgatcctt acaatggtaa tactggctac 180
aaccagaagt tcaggggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagccttc 240
atgcatctca gcagcctgac atctgatgac tctgcagtct attactgtgc aaactactat 300
aggtatgacg accatgctat ggactattgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 128
<211> 339
<212> DNA
<213> 小鼠肌肉
<400> 128
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaaccgctga tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgaaggctga agacctggca atttattact gtcagcaata ttatagctat 300
ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaa 339
<210> 129
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成聚核苷酸"
<400> 129
cagattcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc gactacaaca tctactgggt ccgacaggct 120
ccaggccagg gactggaatg gatcggctac ttcgacccct acaacggcaa caccggctac 180
aaccagaagt tccggggcag agccaccctg accgtggaca agagcaccag caccgcctac 240
atggaactgc ggagcctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcgc caactactac 300
agatacgacg accacgccat ggactactgg ggccagggca ccctggtcac cgtgtcctct 360
<210> 130
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成聚核苷酸"
<400> 130
gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtgt ctctgggcga gcgggccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcctgctg tactctagca accagaagaa ctacctggcc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccagcccccc aagcccctga tctactgggc cagcacccgc 180
gagagcggcg tgcccgatag attttccggc agcggctccg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagcagta ctacagctac 300
ccctggacct tcggccaggg caccaaggtg gaaatcaag 339
<210> 131
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠肌肉
<400> 131
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Pro Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Glu Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ser Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
115
<210> 132
<211> 4
<212> PRT
<213> 人
<400> 132
Lys Arg Pro Pro
1
<210> 133
<211> 6
<212> PRT
<213> 人
<400> 133
Arg Pro Pro Gly Phe Ser
1 5
<210> 134
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 134
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 135
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成多肽"
<400> 135
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Asp Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Asn Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys His
210 215 220
His His His His His
225
<210> 136
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成肽"
<400> 136
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
1 5
<210> 137
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列描述”: 合成6xHis tag"
<400> 137
His His His His His His
1 5
72

Claims (20)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽；其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的三个重链互补决定区(CDR)序列和三个轻链CDR序列：
a)SEQ ID NO:32；
SEQ ID NO:33；
SEQ ID NO:34；
SEQ ID NO:35；
SEQ ID NO:36；和
SEQ ID NO:37；
b)SEQ ID NO:40；
SEQ ID NO:41；
SEQ ID NO:42；
SEQ ID NO:43；
SEQ ID NO:17；和
SEQ ID NO:44；
c)SEQ ID NO:47；
SEQ ID NO:48；
SEQ ID NO:49；
SEQ ID NO:50；
SEQ ID NO:51；和
SEQ ID NO:52；以及
d)SEQ ID NO:55；
SEQ ID NO:56；
SEQ ID NO:57；
SEQ ID NO:58；
SEQ ID NO:59；和
SEQ ID NO:60。
2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段采用Pro4结节构象，所述Pro4结节构象包括在胰激肽(KD)或脱-Arg10-胰激肽(DAKD)的4位脯氨酸处的II型紧密转角。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中KD或DAKD的Pro 4结节构象还包括S形的氨基酸重复，其将氨基酸链的疏水性侧链排成空间堆积模式。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其结合至一种诊断性或治疗性试剂。
5.一种分离的核酸，其编码前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。
6.一种重组表达载体，其包含权利要求5所述的核酸。
7.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的重组表达载体。
8.一种生产可特异结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在可让宿主细胞产生一种特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽的抗体的条件下培养权利要求7所述的宿主细胞。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，及一种或多种药学上可接受的载体。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其用于治疗胰激肽或脱-Arg10-胰激肽相关的疾病或失调。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述疾病或失调是慢性疼痛、急性疼痛或感染。
12.一种产生根据权利要求1所述的抗体的方法，包括：用包含肽的免疫原免疫动物，其中所述肽含有如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列，并且其中所述肽的氨基末端的精氨酸通过连接体被间接偶联到一个载体基团上，使得通过所述动物的免疫系统产生特异性结合脱-Arg9-缓激肽，脱-Arg10-胰激肽和脱-Arg10-胰激肽样肽的抗体。
13.根据权利要求12所述的方法，进一步包括从所述非人动物中分离所述抗体，分离编码所述抗体的核酸，或表达所述抗体的免疫细胞。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述载体基团是蛋白质。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述蛋白质是匙孔血蓝蛋白(KLH)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述连接体基团包含：[Gly-Gly-Gly]n，其中n至少为1。
17.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽；其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链可变区，其包含分别在SEQ ID NO:32、33和34中所示的HCDR3、HCDR2和HCDR1区氨基酸序列；和
b)轻链可变区，其包含分别在SEQ ID NO:35、36和37中所示的LCDR3、LCDR2和LCDR1区氨基酸序列。
18.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽；其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链可变区，其包含分别在SEQ ID NO:40、41和42中所示的HCDR3、HCDR2和HCDR1区氨基酸序列；和
b)轻链可变区，其包含分别在SEQ ID NO:43、17和44中所示的LCDR3、LCDR2和LCDR1区氨基酸序列。
19.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽；其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链可变区，其包含分别在SEQ ID NO:47、48和49中所示的HCDR3、HCDR2和HCDR1区氨基酸序列；和
b)轻链可变区，其包含分别在SEQ ID NO:50、51和52中所示的LCDR3、LCDR2和LCDR1区氨基酸序列。
20.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合胰激肽或脱-Arg10-胰激肽而不结合缓激肽或脱-Arg9-缓激肽；其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)重链可变区，其包含分别在SEQ ID NO:55、56和57中所示的HCDR3、HCDR2和HCDR1区氨基酸序列；和
b)轻链可变区，其包含分别在SEQ ID NO:58、59和60中所示的LCDR3、LCDR2和LCDR1区氨基酸序列。
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