JP7092669B2 - 完全長の高分子量キニノーゲン（ｈｍｗｋ）と切断されたｈｍｗｋとを区別するためのペプチド定量アッセイ - Google Patents

Description

関連出願との相互参照
本願は、２０１５年１２月１５日出願の米国仮特許出願第６２／２６７，７３４号の出願日の利益を請求するものであり、この内容全体は本明細書中参照として援用されている。

キニノーゲンとは、ブラジキニンおよびカリジンなどのキニンの前駆体である。ヒトのキニノーゲンには、スプライシングバリアントである、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）および低分子量キニノーゲン（ＬＭＷＫ）の二種類が存在する。ＨＭＷＫは、主に凝固および炎症の補因子であり、血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）が介在するブラジキニンの産生にとって好ましい基質である。ＨＭＷＫおよびＬＭＷＫは両方とも、システインプロテアーゼ阻害剤である。

ＨＭＷＫとは、血中の血漿タンパク質であり、凝血の開始に関与している。またＨＭＷＫは、カリクレイン―キニン系を介して血管拡張物質であるブラジキニンを産生する。ＨＭＷＫは、内皮、単球、および血小板上の細胞表面受容体に接着することにより、凝固およびブラジキニンの産生を局在化させる。ＨＭＷＫから放出された活性ペプチドのブラジキニンは、様々な生理作用を示す。これは、平滑筋収縮、低血圧、利尿、血糖値の減少と同様に、炎症の介在物質であり、ブラジキニンの作用を介して直接的、内皮に由来する弛緩因子の作用を介して間接的な、心臓の保護作用を有する。ブラジキニンは、疼痛、炎症、浮腫、および血管新生の重要な介在物質である。

血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）とは、血中においてブラジキニンを産生する主要な酵素である。ｐＫａｌの活性化は、接触系を介して起こり、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）に関連する疾患の病状に関連している。ｐＫａｌはＨＭＷＫ（一本鎖ポリペプチド）を切断してブラジキニンおよび切断された形態のＨＭＷＫを産生し、この切断されたＨＭＷＫは、ジスルフィド結合によりまとめて保持されている２つのポリペプチド鎖（重鎖および軽鎖）を含む（Ｃｕｇｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ （１９９７） ８９：３２１３－３２１８）。最初の切断されたＨＭＷＫの軽鎖は約５６ｋＤａであり、さらに切断されてより短い形態の４６ｋＤａを形成し得る。

切断されたＨＭＷＫは、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）の発作の間、総キニノーゲンの約４７％まで増加することから、ＨＡＥの発作をモニタリングするためのバイオマーカーとなっている（Ｃｕｇｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。よって、生体試料において切断されたＨＭＷＫのレベルを検出するための、確実であり高感度のアッセイを開発することに関心が集まっている。

本開示は、完全長のＨＭＷＫおよび切断されたＨＭＷＫを区別するための、たとえば多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用した液体クロマトグラフィー―質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を含み得る、高感度の選択的なアッセイ方法の開発に、少なくとも部分的に基づくものである。このようなアッセイ方法は、切断されたＨＭＷＫ（たとえば重鎖由来のＣ末端ペプチドまたは軽鎖由来のＮ末端ペプチド）、および／または完全長のＨＭＷＫ（たとえば低分子量キニノーゲンと比較）を表すシグネチャーペプチドを利用する。

よって、本開示の一態様は、試料において切断された高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）を検出するための方法であって、（ｉ）ＨＭＷＫを含む疑いのある試料を準備するステップと、（ｉｉ）前記試料をプロテアーゼと接触させて複数の消化されたペプチドを産生させるステップと、（ｉｉｉ）前記複数の消化されたペプチドにおいてシグネチャーペプチドのレベルを測定するステップであって、前記シグネチャーペプチドが、切断されたＨＭＷＫを表す、ステップと、を含む方法を提供する。

一部の実施形態では、シグネチャーペプチドは、切断されたＨＭＷＫの４６ｋＤａの軽鎖を表し、限定するものではないが、ＫＨＮＬＧＨＧＨ（配列番号１）、ＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥ（配列番号２）；ＫＨＮＬＧＨＧＨＫ（配列番号３）；またはＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥＲ（配列番号４）を含む。

一部の実施形態では、シグネチャーペプチドは、切断されたＨＭＷＫの５６ｋＤａの軽鎖、たとえばＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）を表す。

本明細書中記載の方法は、限定するものではないが、ＧＨＥＫＱＲＫＨ（配列番号６）；ＫＱＲＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥ（配列番号７）；ＤＷＧＨＫＱＲＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥＲ（配列番号８）；ＨＮＬＧＨＧＨＫ（配列番号９）；またはＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）を含む、完全長のＨＭＷＫを表すシグネチャーペプチドのレベルを測定することをさらに含んでもよい。

別の態様では、本開示は、試料において完全長の高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）と切断されたＨＭＷＫとを区別するための方法を特徴とする。本方法は、（ｉ）完全長のＨＭＷＫおよび／または切断されたＨＭＷＫを含む疑いのある試料を準備するステップと、（ｉｉ）プロテアーゼと上記試料を接触させて複数の消化されたペプチドを産生させるステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）から得た第１の消化されたペプチド（たとえばＳＳＲＩＧＥ；配列番号：５）のレベルを測定するステップであって、第１の消化されたペプチドが、完全長のＨＭＷＫと比較して切断されたＨＭＷＫに固有（たとえば切断されたＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチド）である、ステップと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）から得た第２の消化されたペプチドのレベルを測定するステップであって、第２の消化されたペプチド（たとえばＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ；配列番号１０）が、低分子量キニノーゲン（ＬＭＷＫ）と比較してＨＭＷＫに固有（たとえばＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチド）である、ステップと、（ｖ）第１の消化されたペプチドと第２の消化されたペプチドとの間の比率を決定するステップと、（ｖｉ）ステップ（ｖ）で決定した比率に基づき、上記試料において、切断されたＨＭＷＫを完全長のＨＭＷＫと区別するステップとを含む。

本明細書中記載のアッセイ方法のいずれかにおいて、試料中のＨＭＷＫの消化に使用するためのプロテアーゼは、エンドプロテイナーゼ キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、カテプシンＧ、またはエンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃであってもよい。一部の実施形態では、シグネチャーペプチドのいずれかを、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、たとえばＭＲＭ－ＭＳにより測定することができる。

本明細書中記載のアッセイ方法のいずれかにより解析される試料は、ヒトの対象、たとえば遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）を有するまたは有する疑いのあるヒトの患者から得た、生体試料（たとえば血液試料、または血漿試料、または血清試料）とすることができる。一部の例では、生体試料は、正常な血漿試料、ＦＸＩＩａにより活性化された血漿試料、または活性化されていない血漿試料とすることができる。生体試料が血漿試料である場合、当該試料は、真空採血管（ｅｖａｃｕａｔｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅ）（たとえば「ＳＣＡＴチューブ」（ｓａｍｐｌｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｔｕｂｅ））に回収することができ、このチューブはプロテアーゼ阻害剤の混合物を含む液体製剤を含む。

一部の実施形態では、本明細書中に記載のアッセイ方法のいずれかのプロテアーゼ消化ステップは、還元剤、たとえばＤＴＴ、ＢＭＥ、またはＴＣＥＰの存在下で行われてもよい。たとえば生体試料を、９０℃で１時間、還元剤とインキュベートしてもよい。一部の例では、プロテアーゼ消化のステップは、プロテアーゼ阻害剤、抗凝固剤（たとえばクエン酸塩）、またはその両方の非存在下で行われてもよい。一部の例では、プロテアーゼ／タンパク質の比率は約１：２０であり、たとえばＧｌｕ Ｃ／タンパク質の比率は１：２０である。

本アッセイ方法のいずれかを、ＨＡＥの診断および／または予後診断に使用してもよい。よって、本開示は、ＨＡＥを有するヒトの対象、またはＨＡＥの発作のリスクがあるＨＡＥ患者であるヒトの対象を同定するための方法をも提供する。一部の実施形態では、本明細書中に記載のアッセイ方法により決定された切断されたＨＭＷＫ（たとえば重鎖―軽鎖の二量体、重鎖、または軽鎖、たとえば４６ｋＤａの軽鎖もしくは５６ｋＤａの軽鎖）のレベルは、ヒトの対象がＨＡＥを有する、またはＨＡＥの発作のリスクがあるかどうかを決定するための指標になり得、ここで、上昇したレベルの切断されたＨＭＷＫは、ＨＡＥまたはＨＡＥの発作のリスクを表す。他の実施形態では、本明細書中に記載のアッセイ方法により決定した、切断されたＨＭＷＫのシグネチャーペプチドとＨＭＷＫのシグネチャーペプチドとの間の比率は、ヒトの対象がＨＡＥを有する、またはＨＡＥの発作のリスクがあるかどうかを決定するための指標となり、ここで、当該比率のレベルが高いことはＨＡＥまたはＨＡＥの発作を表す。

本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、以下の説明で明らかにされている。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、および添付の特許請求の範囲からも明らかである。

ＭＲＭ解析による、血漿中で見いだされた切断されたＨＭＷＫ（たとえば５６ｋＤａの軽鎖）および市販のＨＭＷＫ（ＨＫ）試料の最適温度での酵素消化から得た例示的なペプチドを示す図である。この図は、それぞれ、上から下まで反復した配列番号５、配列番号１９、配列番号２４、および配列番号２１を表す。 Ｓｉｇｍａ（ＨＫ＿Ｓｉｇｍａ）またはＥｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＨＫ＿Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から得たＨＭＷＫ標準物質の、２５℃および３７℃でのＧｌｕ Ｃ消化により産生されたペプチドを示す図である。この図は、それぞれ、上から下まで、配列番号５、配列番号１９、配列番号２４、配列番号３０、配列番号２９、および配列番号７を表す。 標的化アッセイＭＲＭを使用した、正常な血漿試料およびＨＡＥの血漿試料における、５６ｋＤａの軽鎖のプロテアーゼ消化に由来するペプチドＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）の定量化を示すチャートを含む。 標的化アッセイＭＲＭを使用した、正常な血漿試料およびＨＡＥの血漿試料におけるＨＭＷＫの長いペプチドの定量化を示すチャートを含む。 Ｇｌｕ Ｃで消化したＨＭＷＫおよび血漿試料における、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）／ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）の比率を示すチャートである。 ピークの曲線下面積を使用した、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）／ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）の比率の平均値を示すチャートである。 健常な個体からＨＡＥ患者を区別するための、切断されたＨＭＷＫ（４６ｋＤａの軽鎖により表される）の濃度を示すチャートである。

血漿カリクレイン（ＰＫａｌ）は、接触系のセリンプロテアーゼの構成成分であり、血中における主なブラジキニン産生酵素である。接触系は、外来もしくは陰性に荷電した表面に露呈すると第ＸＩＩａ因子（第ＸＩＩ因子またはＦＸＩＩの活性形態）により、または内皮細胞の表面でプロリルカルボキシペプチダーゼにより、活性化されている（Ｓａｉｎｚ Ｉ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ９８， ７７－８３， ２００７）。血漿カリクレインの活性化は、第ＸＩＩ因子のフィードバック活性を介して内因的な凝固を増幅し、キニノーゲン前駆体である高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）をタンパク質分解的に切断し、炎症促進性のノナペプチドであるブラジキニンおよび切断されたＨＭＷＫを放出する。切断されたＨＭＷＫは、ジスルフィド結合により結合した２つのポリペプチド鎖を含む（２鎖ＨＭＷＫとしても知られている）。

血中の主なキニノゲナーゼとして、血漿カリクレインは、脈管構造中のブラジキニンの産生に大きく貢献している。Ｃ１インヒビタータンパク質（Ｃ１－ＩＮＨ）の遺伝的欠損は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）をもたらす。ＨＡＥ患者は、多くの場合未知の引き金により誘発される疼痛を伴う浮腫の急性的な発作に苦しんでいる（Ｚｕｒａｗ Ｂ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５９， １０２７－１０３６， ２００８）。動物モデルにおける薬物の使用または遺伝的な研究を通して、血漿カリクレイン―キニン系（血漿ＫＫＳ）は、様々な疾患に関わっているとされている。

高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）は、一本鎖ポリペプチド（１鎖）マルチドメイン（ドメイン１～６）のタンパク質として、約１１０ｋＤａの分子量で血漿中に存在する。ＨＭＷＫは、ドメイン４の中でｐＫａｌにより切断され、９つのアミノ酸の、炎症促進性ペプチドのブラジキニン、および２鎖の形態のＨＭＷＫ（切断されたキニノーゲン）を放出することができる。２鎖のＨＭＷＫは、ＨＭＷＫのドメイン１～３を含む重鎖、ならびにＨＭＷＫのドメイン５および６を含む軽鎖である。この重鎖は、約６５ｋＤａの分子量を有し、対して軽鎖は、約５６ｋＤａおよび約４６ｋＤａの２種類の分子量として存在する。

切断されたＨＭＷＫ（たとえば２鎖ＨＭＷＫ）のレベルは、ＨＡＥの発作および他のｐＫａｌ関連疾患で上昇することが見いだされた。よって、切断されたＨＭＷＫは、疾患の発達および／または治療有効性をモニタリングするためのバイオマーカーとして作用することができる。しかしながら、この技術は、ＨＭＷＫの切断されたバージョンと無傷のＨＭＷＫとを効果的に区別できる適切な薬剤および／または適切なアッセイを欠いている。

本開示は、たとえば２鎖ＨＭＷＫの軽鎖（たとえば４６ｋＤａの軽鎖）である切断されたＨＭＷＫを表すシグネチャーペプチド、およびＨＭＷＫ（たとえば完全長のＨＭＷＫ）を表すシグネチャーペプチドの発見に、少なくとも部分的に基づくものである。特段他の記載がない限り、用語「切断されたＨＭＷＫ」は、本明細書中記載の２鎖の二量体、二量体の重鎖、または二量体の軽鎖（５６ｋＤａの軽鎖および４６ｋＤａの軽鎖を含む）を表す。このようなシグネチャーペプチドの発見に基づき、ＨＭＷＫと比較して切断されたＨＭＷＫを測定するための高感度の選択的なアッセイ方法を開発した。本明細書中記載のアッセイ方法は、臨床的な応用、たとえばＨＡＥの診断もしくは予後診断、ならびに非臨床的な応用、たとえば研究および前臨床の薬剤開発の両方に使用してもよい。

Ｉ．切断されたＨＭＷＫを測定するための方法
一部の態様では、試料において切断されたＨＭＷＫを測定するための、たとえば試料において、切断されたＨＭＷＫを完全長のＨＭＷＫと区別するための、方法が、本明細書中に記載されている。このような方法は、複数の消化されたペプチドを産生させるため、完全長のＨＭＷＫ、切断されたＨＭＷＫ、またはその両方を含む疑いのある適切な試料を適切なプロテアーゼで処置することと、切断されたＨＭＷＫおよび／または完全長のＨＭＷＫを表す１つまたは複数のシグネチャーペプチドのレベルを測定することとを含み得る。切断されたＨＭＷＫのレベル、または切断されたＨＭＷＫと完全長のＨＭＷＫとの間の比率のいずれかを使用して、試料におけるｐＫａｌの活性を表すことができる。この活性は、ＨＡＥまたはＨＡＥの発作のリスクと相関している。

（ｉ）完全長のＨＭＷＫおよび切断されたＨＭＷＫ
ＨＭＷＫをコードするヒトの遺伝子はキニノーゲン１（ＫＮＧ１）である。ＫＮＧ１は、ＨＭＷＫまたは低分子量キニノーゲン（ＬＭＷＫ）をコードするｍＲＮＡを形成するため、転写され、あるいはスプライシングされる。ヒトのＨＭＷＫおよびＬＭＷＫの例示的なタンパク質配列を以下に提供する（ブラジキニンの領域は、強調され、太字で示されている）。

切断されたキニノーゲンの重鎖および軽鎖の例示的な配列を以下に提供する。

（ｉｉ）試料の調製
ＨＭＷＫ（たとえば完全長のＨＭＷＫ、切断されたＨＭＷＫ、またはその両方）を含み得るいずれの試料も、本明細書中に記載の方法により解析することができる。本明細書中使用される「試料」は、対象の解析物（本発明の場合はＨＭＷＫ）を含み得る組成物を表す。試料は、対象由来の組織、たとえば血液、血漿、またはタンパク質を含んでもよい。試料は、対象から採取した初期の未処理の試料、ならびにその後処理された試料、たとえば免疫沈降などを介した、部分的に精製された形態または保存された形態を含むことができる。例示的な試料として、血液、血漿、血清、涙、または粘液が挙げられる。他の例では、試料は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの組成物であってもよい。

一部の実施形態では、試料は、血清または血漿の試料などの体液の試料である。このような試料は、解析の必要のある対象から得た生体試料であってもよい。主題の方法により治療される「患者」、「対象」、または「宿主」（これら用語は互換可能に使用される）は、ヒトまたは非ヒトの動物を意味し得る。一部の例では、対象はヒトの患者であり、接触系に関連する疾患を有する、有する疑いがある、または当該疾患のリスクがある場合がある。たとえば、ヒトの患者は、ＨＡＥの病歴を有してもよく、またはＨＡＥのリスクがあってもよい。このようなヒトの患者は、事前に治療されていてもよく、または接触系の構成成分（たとえばｐＫａｌまたはＦＸＩＩａ、または高分子量キニノーゲン）を標的とする薬剤での治療過程にある。

生体試料は、体液の試料、たとえば血液試料または血漿試料であってもよい。本明細書中記載の方法に使用するための血漿試料を、血液試料を回収するため様々な用途で医療業務に一般に使用されている、真空採血管（たとえば「ＳＣＡＴチューブ」（ｓａｍｐｌｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｔｕｂｅ））に回収し、処理してもよい。本明細書中記載のチューブは、プロテアーゼ阻害剤の混合物（プロテアーゼ阻害剤カクテル）を含む液体製剤を含む非ガラス管であってもよい。

一部の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤カクテルは、少なくとも１つのセリンプロテイナーゼ阻害剤および少なくとも１つのシステインプロテイナーゼ阻害剤を含んでもよい。少なくとも１つのセリンプロテイナーゼ阻害剤は血漿カリクレイン阻害剤とすることができる。当該プロテイナーゼ阻害剤カクテルは、複数の（たとえば２個、３個、４個、または５個の）セリンプロテアーゼ阻害剤を含んでもよく、このうちの少なくとも１つはトリプシンまたはヒトプラスミンの阻害剤とすることができる。好ましくは、本明細書中記載のプロテイナーゼ阻害剤カクテルは、水溶液中で不安定なプロテアーゼ阻害剤を実質的に含んでおらず、すなわち水溶液中で不安定なプロテアーゼ阻害剤の活性が、プロテアーゼカクテルの総阻害活性と比較してごくわずかである。一部の例では、水溶液中で不安定なプロテアーゼ阻害剤の量は、カクテル中の総プロテアーゼ阻害剤の５％（ｗ／ｗ）未満、たとえば２％未満、１％未満、または０．５％未満であってもよい。一部の例では、プロテアーゼ阻害剤カクテルは、水溶液（たとえばｐＨ４～６の水溶液）中で不安定なプロテアーゼ阻害剤を完全に含んでいない。水溶液中で安定しないプロテアーゼ阻害剤の１例として、Ｈ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－クロロメチルケトンとしても知られているＰＰＡＣＫ ＩＩがある。

例示的なセリンプロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、およびトリプシンプロテアーゼ阻害剤が、以下の表に列挙されており、これらは、本明細書中記載のプロテアーゼ阻害剤カクテルを作製するために使用され得る。

一部の例では、真空採血管に含まれているプロテアーゼ阻害剤カクテルは、少なくとも１つのトリプシン／プラスミン阻害剤（たとえば１個、２個、または３個）を含み得る少なくとも１つのセリンプロテイナーゼ阻害剤（たとえば１個、２個、または３個）、ならびに少なくとも１つのシステインプロテアーゼ阻害剤（たとえば１個、２個、または３個）を含む。このようなプロテアーゼ阻害剤カクテルは、３つのセリンプロテイナーゼ阻害剤（たとえばベンズアミジン、ＡＥＢＳＦ、およびトリプシン／プラスミン阻害剤、たとえばダイズトリプシン阻害）、および１つのシステインプロテアーゼ阻害剤（たとえばロイペプチン）を含んでもよい。

他の例では、プロテアーゼ阻害剤カクテルは、少なくとも１つのセリンプロテアーゼ阻害剤（たとえば血漿カリクレイン阻害剤）および少なくとも１つのシステインプロテアーゼ阻害剤（たとえばロイペプチン）を含んでもよい。血漿カリクレイン阻害剤は、ＥＰＩ－ＫＡＬ２（Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ；配列番号１６）であってもよく、これは、たとえばイムノアッセイを使用して、活性化血漿カリクレインの検出を可能にする試薬を含む性能をチューブに提供する、特異的な血漿カリクレインの組み換えプロテアーゼ阻害剤である。

プロテアーゼ阻害剤カクテルのいずれかを、液体製剤を形成するために適切な溶液に溶解してもよい。適切な溶液は、酸―クエン酸塩―ブドウ糖の溶液であってもよく、クエン酸三ナトリウム、クエン酸、およびブドウ糖を含んでもよい。この溶液は、約４～６、たとえば４．５のｐＨ値を有してもよい。液体製剤は、陰性に荷電した表面との相互作用により接触系の活性化を抑制し得る臭化ヘキサジメトリン分子（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標））などのカチオン性ポリマー、およびメタロプロテアーゼを阻害し得るキレート剤（たとえばＥＤＴＡ）をさらに含んでもよい。

カクテル中の各プロテアーゼ阻害剤の濃度は、実務の希釈倍率に応じて、対応するプロテアーゼの阻害に使用するための当該阻害剤の最終濃度よりも、５倍または１０倍高くてもよい。特定の市販のプロテアーゼ阻害剤の最終濃度は当該分野で既知であり、製造社のプロトコルから入手することができる。一部の例では、ＥＰＩ－ＫＡＬ２の濃度は、５～１５μＭ（たとえば５～１０μＭまたは１０～１５μＭ）の範囲であってもよく、ロイペプチンの濃度は、２００～３００μＭ（たとえば２００～２５０μＭ、２４０～２７０μＭ、または２５０～３００μＭ）の範囲であってもよく；大豆トリプシンインヒビターの濃度は、１～３ｍｇ／ｍｌ（たとえば１～２ｍｇ／ｍｌまたは２～３ｍｇ／ｍｌ）の範囲であってもよく；ベンズアミジンの濃度は、８０～１２０ｍＭ（たとえば８０～１００ｍＭまたは１００～１２０ｍＭ）の範囲であってもよく；かつ／またはＡＥＢＳＦの濃度は、１０～３０ｍＭ（たとえば１０～２０ｍＭまたは２０～３０ｍＭ）の範囲であってもよい。

ペプチドベースのプロテアーゼ阻害剤（たとえばＥＰＩ－ＫＡＬ２）を使用する場合は、従来の方法に従ってビオチン化してもよい。たとえばペプチド阻害剤は、以下のようにビオチン化されてもよい。簡単に述べると、ペプチド阻害剤を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの適切な溶液に溶解させることができる。新鮮な状態で調製したＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎをペプチド阻害剤溶液に添加し、適切な期間の間、氷上でインキュベートすることができる。過度の、反応していないビオチンおよび加水分解したビオチンを、スピン脱塩カラムを使用して除去することができる。ペプチド阻害剤の標識化は、ＥＬＩＳＡにより確認することができ、タンパク質の濃度は、ブラッドフォードアッセイにより決定することができる。

本明細書中記載の液体製剤のいずれかは、通常の方法、たとえば適切な成分を適切な溶液に溶解することにより調製し、好ましくは非ガラスの真空採血管に入れることができる。このチューブを、－２０℃で保存してもよく、使用前に適切な期間内で、氷上または冷蔵庫で解凍してもよい。

特定の例では、本明細書中記載の方法で使用する真空採血管は、以下に詳述されているＳＣＡＴ１６９およびＳＣＡＴ１５３を含む、ＳＣＡＴチューブである。
・ＳＣＡＴ１６９：真空の総容量５ｍＬのプラスチックチューブ。酸―クエン酸塩―ブドウ糖（１００ｍＭのクエン酸三ナトリウム、６７ｍＭのクエン酸、および２％のブドウ糖（ｐＨ４．５））に溶解した、１００ｍＭのベンズアミジン、４００μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）、２ｍｇ／ｍＬの大豆トリプシンインヒビター、２０ｍＭのＥＤＴＡ、２６３μＭのロイペプチン、および２０ｍＭのＡＥＢＳＦ（フッ化４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニル塩酸塩）：０．５ｍｌを含む。
・ＳＣＡＴ１５３：真空の総容量５ｍｌのプラスチックチューブ。酸―クエン酸塩―ブドウ糖（１００ｍＭのクエン酸三ナトリウム、６７ｍＭのクエン酸、および２％のブドウ糖、（ｐＨ４．５））に溶解した、１０μＭのビオチン化ＥＰＩ－ＫＡＬ２、４００μｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（登録商標）、２０ｍＭのＥＤＴＡ、および２６３μＭのロイペプチン：０．５ｍｌを含む。

血液を回収した後、適切な期間以内（たとえば１時間を超えるものではない）に、血液試料を処理して血漿試料を作製してもよい。この血漿試料を、最初の血液試料を得た対象の接触系と関連する特徴を評価するために、さらに解析にかけることができる。

（ｉｉｉ）プロテアーゼ消化
本明細書中に記載の生体試料、たとえば本明細書中に記載の工程に従って調製した全血漿（ｗｈｏｌｅ ｐｌａｓｍａ）の試料を、複数の消化されたペプチドを産生させるために適切なプロテアーゼで処置してもよい。あるいは、完全長および切断された形態の両方を含むＨＭＷＫタンパク質は、プロテアーゼ消化の前に、たとえば免疫沈降を介して試料から濃縮されてもよく、またはメタノールクラッシュ（ｍｅｔｈａｎｏｌ ｃｒａｓｈ）により変性されてもよい。

適切なプロテアーゼのいずれかを、本明細書中記載の方法に使用することができる。好ましくは、プロテアーゼは、消化されたペプチドをタンパク質のアミノ酸配列に基づき同定できるように、特定のモチーフ／残基でタンパク質を切断する。一部の例では、本方法で使用されるプロテアーゼは、グルタミン酸残基の後ろを切断する。例示的なプロテアーゼとして、限定するものではないが、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－ＣまたはカテプシンＧが挙げられる。他の例では、本明細書中記載のアッセイ方法で使用されるプロテアーゼ、たとえばエンドヌクレアーゼＡｓｐ－Ｎはアスパラギン酸残基の前を切断し、またはたとえばエンドヌクレアーゼＬｙｓ－Ｃはリジン残基の後ろを切断する。別の例では、本明細書中記載のアッセイ方法で使用されるプロテアーゼは、大きな疎水性側鎖を担持するアミノ酸（たとえばチロシン、トリプトファン、またはフェニルアラニン）の残基の後ろを切断する。このようなプロテアーゼの一例として、キモトリプシンがある。

プロテアーゼの切断反応は、試料において完全長のＨＭＷＫおよび切断されたＨＭＷＫのタンパク質の完全な消化を可能にする適切な条件下で行うことができる。一部の実施形態では、プロテアーゼの切断反応混合物は、適切な濃度（たとえば１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、または０．０５ｍＭ）で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｂ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤を含んでもよい。たとえば、ＤＴＴを使用する場合、この濃度は０．１ｍＭまたは０．０５ｍＭとすることができる。プロテアーゼの切断反応は、適切な期間（たとえば３０分、６０分、９０分、または１８０分）の間、適切な温度（たとえば２５℃、３７℃、５０℃、５５℃、または９０℃）で行ってもよい。

一部の例では、還元剤を含む混合物を、適切な期間、高温で（たとえば５５℃で３０分もしくは６０分、または９０℃で３０分もしくは６０分）インキュベートして、試料においてタンパク質の完全な変性を可能にすることができる。次に、この混合物にプロテアーゼを添加して、適切な期間適切な温度で消化反応を行わせることができる。正確な消化のための温度／時間は、本方法に使用される特定のプロテアーゼに依拠するものであり、これは当業者の知識の範囲内にある。一例では、Ｇｌｕ Ｃの酵素が使用され、消化反応を、２５℃または３７℃で一晩（たとえば１２時間、１４時間、１７時間、または１９時間）行わせることができる。別の例では、キモトリプシンが使用され、消化反応を、適切な期間、たとえば２～５時間（たとえば３時間）、４０～６０℃（たとえば５０℃）で行わせることができる。

反応混合物は、プロテアーゼ阻害剤、クエン酸塩などの抗凝固剤、またはその両方を含まなくてもよい。反応物中の酵素／タンパク質の比率は、１：５～１：３０、たとえば１：５、１：１０、１：２０、１：２５、または１：３０の範囲であってもよい。温度、反応期間、酵素／タンパク質の比率、プロテアーゼ阻害剤の有無、抗凝固剤の有無、および還元剤の有無を含む特定の反応条件の選択は、使用されるプロテアーゼの種類および処置される試料に依拠するものであり、当該分野で知られている方法または本明細書中に記載の方法を介して決定することができる。

（ｉｖ）シグネチャーペプチドの測定
シグネチャーペプチドは、プロテアーゼ反応から産生される消化されたペプチドを表し、別の種類のキニノーゲンと比較して１種のキニノーゲンに固有である。このようなペプチドは、本明細書中に記載の方法に使用されるプロテアーゼの特異性、および異なる種類のキニノーゲンのアミノ酸配列に基づき、同定することができる。たとえば本明細書中の開示を参照されたい。第２の種類のキニノーゲン（たとえば切断されたキニノーゲン）と比較して第１の種類のキニノーゲン（たとえば完全長のキニノーゲン）に固有のペプチド（シグネチャーペプチド）は、プロテアーゼを使用して第１の種類のキニノーゲンを切断することによってのみ産生できるが、同一のプロテアーゼを使用して第２の種類のキニノーゲンを切断することによっては産生することができないペプチドを表す。たとえば、切断されたＨＭＷＫ（たとえば切断されたＨＭＷＫの重鎖または４６ｋＤａの軽鎖などの軽鎖）のシグネチャーペプチドは、切断されたＨＭＷＫ（たとえば切断されたＨＭＷＫの重鎖または軽鎖）のプロテアーゼ消化からのみ産生でき、同一のプロテアーゼによる完全長のＨＭＷＫの消化によっては産生できないペプチドを表す。また、完全長のＨＭＷＫのシグネチャーペプチドは、一本鎖のＨＭＷＫのプロテアーゼ消化によってのみ産生できるが、同一のプロテアーゼを使用した切断されたＨＭＷＫの消化によっては産生できないペプチドである。ＨＭＷＫのシグネチャーペプチドは、ＨＭＷＫ（一本鎖のＨＭＷＫ、二本鎖のＨＭＷＫ、またはその両方）のプロテアーゼ消化により産生されるが、同一のプロテアーゼを使用したＬＭＷＫの消化によっては産生できないペプチドを表す。

切断されたＨＭＷＫに関する例示的なシグネチャーペプチドとして、（ａ）５６ｋＤａの軽鎖に関するシグネチャーペプチド、たとえばＧｌｕ－Ｃ消化により産生され得るＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）、および（ｂ）４６ｋＤａの軽鎖に関するシグネチャーペプチド、たとえばキモトリプシン消化、Ｇｌｕ－Ｃ消化、Ａｓｐ－Ｎ消化、およびＬｙｓ－Ｃ消化によりそれぞれ産生され得るＫＨＮＬＧＨＧＨ（配列番号１）、ＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥ（配列番号２）；ＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥＲ（配列番号４）、またはＫＨＮＬＧＨＧＨＫ（配列番号３）が挙げられる。

以下の表１は、異なるプロテアーゼにより産生された、切断されたＨＭＷＫの４６ｋＤａの軽鎖に関する例示的なシグネチャーペプチドを列挙している。

ＨＭＷＫ（たとえば完全長のＨＭＷＫ）に関するシグネチャーペプチドの例として、限定するものではないが、キモトリプシン消化により産生され得るＧＨＥＫＱＲＫＨ（配列番号６）；Ｇｌｕ－Ｃ消化により産生され得るＫＱＲＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥ（配列番号７）およびＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）；Ａｓｐ－Ｎ消化により産生され得るＤＷＧＨＫＱＲＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥＲ（配列番号８）、およびＬｙｓ－Ｃの消化により産生され得るＨＮＬＧＨＧＨＫ（配列番号９）が挙げられる。

対象の消化されたペプチドのレベルは、当該分野で知られているまたは本明細書中記載されている適切な手法を使用して、測定することができる。一部の実施形態では、対象となる当該ペプチドは、対象のペプチドに特異的な抗体、たとえばＫＨＮＬＧＨＧＨ（配列番号１）、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）および／またはＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）に特異的な抗体を使用したイムノアッセイにより、測定することができる。本明細書中記載の対象のペプチドのレベルを評価するために使用できるイムノアッセイ（ｉｍｍｕｎｅ ａｓｓａｙｓ）として、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（たとえばサンドイッチＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、電気化学発光法に基づく検出アッセイ、および関連する技術が挙げられる。アッセイ、たとえばウェスタンブロットアッセイは、たとえば市販されているＬＩＣＯＲイメージング技術（たとえばＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘインフラレッドイメージングシステム参照）といった定量的なイメージングシステムの使用をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、電気化学発光法検出アッセイまたは電気化学発光法およびパターン化アレイの技術の組み合わせに依拠するアッセイを使用する（たとえばメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）製のＥＣＬまたはＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹの技術のアッセイ）。

本明細書中使用されるように、用語「測定する」もしくは「測定」またはあるいは「検出する」もしくは「検出」は、試料の中の物質の存在の有無や量（ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｒ ａｍｏｕｎｔ）（有効量であり得る）を評価することを意味し、このような物質の定性的もしくは定量的な濃度のレベルの導出を含み、または対象の値もしくは分類を評価することを含む。

対象のペプチドに「特異的に結合する」抗体との文言は、当該分野でよく理解されており、このような特異的な結合を決定するための方法もまた当該分野でよく知られている。抗体は、別のペプチドとの反応または結合と比較して、高い頻度であり、迅速であり、長い期間であり、および／または高い親和性で、特定の標的ペプチドと反応または結合する場合、「特異的な結合」を呈すると言われている。また、たとえば第１の標的ペプチドに特異的に結合する抗体が、第２の標的ペプチドに特異的または優先的に結合し得る、またはしない場合があることは、この定義を読むことにより理解されるものである。同様に、「特異的な結合」または「優先的な結合」は、排他的な結合を（含み得るが）必ずしも必要とするものではない。一般的に、必ずというわけではないが、結合に対する言及は優先的な結合を意味する。一部の例では、標的ペプチドまたはそのエピトープに「特異的に結合する」抗体は、他のペプチドまたは同一の抗原上の他のエピトープに結合しなくてもよい。

本明細書中使用されるように、用語「抗体」は、少なくとも１つのイムノグロブリンの可変ドメインまたはイムノグロブリンの可変ドメインの配列を含むタンパク質を表す。たとえば、抗体は、重鎖（Ｈ）可変領域（本明細書中Ｖ_Ｈと略されている）および軽鎖（Ｌ）可変領域（本明細書中Ｖ_Ｌと略されている）を含むことができる。別の例では、抗体は、２つの重鎖（Ｈ）可変領域および２つの軽鎖（Ｌ）可変領域を含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合フラグメント（たとえば一本鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂのフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６； ２６（３）：６２９－３９．））、ならびに完全な抗体を含む。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそのサブタイプ）の構造上の特徴を有することができる。抗体は、いずれの供給源由来であってもよいが、霊長類（ヒトおよび非ヒトの霊長類）の抗体および霊長類化抗体が好ましい。

一部の実施形態では、本明細書中記載の抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートすることができ、対象のペプチドに対する検出試薬の結合は、検出可能な標識から放出されたシグナルの強度に基づき決定することができる。あるいは、検出試薬に特異的な二次抗体を使用することができる。１つまたは複数の抗体を、検出可能な標識に結合させてもよい。当該分野で知られているいずれかの適切な標識を、本明細書中記載のアッセイ方法に使用することができる。一部の実施形態では、検出可能な標識はフルオロフォアを含む。本明細書中使用されるように、用語「フルオロフォア」は（また「蛍光性標識」または「蛍光性色素」をも意味する）は、定義された励起波長で光エネルギーを吸収し、異なる波長で光エネルギーを放出する部分を表す。一部の実施形態では、検出部分は酵素であり、または検出部分は酵素を含む。一部の実施形態では、酵素は、無色の基質から色のついた産物を産生する酵素（たとえばβ－ガラクトシダーゼ）である。

他の実施形態では、本明細書中記載の対象のペプチドを、質量分析（ＭＳ）の質量解析の能力と、液体クロマトグラフィーの物理的な分離能力を組み合わせている解析技術である、液体クロマトグラフィー―質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の手法により測定してもよい。

多重反応モニタリング（ＭＲＭ）－質量分析は、複合的な生体試料におけるタンパク質／ペプチドの存在量を標的とした定量化のための、選択性の高い高感度の方法である。ＭＲＭ質量スペクトルは、一般に小分子の解析に使用されている。ここで、ＭＲＭは、複合的な混合物中のタンパク質の定量化を可能にし、疾患過程における候補バイオマーカーを検証するための高感度の選択的なツールを提供する。この手法では、ＡＢＳｃｉｅｘ ５５００または６５００ Ｑｔｒａｐの質量分析計などの適切な器具を使用することができ、様々な種類の血漿試料間の差異を、方法の最適化の後に評価した。本明細書中記載の切断されたＨＷＭＫまたはＨＷＭＫに関するシグネチャーペプチドを得るために、キモトリプシンまたはＧｌｕ－Ｃなどの適切なプロテアーゼを用いて、個々の血漿試料を消化した。

各シグネチャーペプチド（たとえばＡＵＣにより表されている）のレベル（たとえば濃度）は、従来の方法を介して決定することができる。このことに基づき、必要に応じて、ＬＭＷＫと比較したＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチドに対する、完全長のＨＭＷＫと比較した切断されたＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチドの比率を計算することができる。このような比率を使用して、切断されたＨＭＷＫ対完全長のＨＭＷＫの存在を区別することができる。

たとえば、キモトリプシン消化により産生された２鎖ＨＭＷＫの４６ｋＤａの軽鎖に関するシグネチャーペプチド、ＫＨＮＬＧＨＧＨ（配列番号１）の濃度は、健常なヒトの対象由来の血漿試料と比較して、ＨＡＥ患者由来の血漿試料においてかなり高いことが見いだされた。これらの結果は、当該シグネチャーペプチドにより表される、２鎖ＨＭＷＫの４６ｋＤａの軽鎖が、ＨＡＥの診断および予後診断に関して信頼できるバイオマーカーであることを示している。

別の例では、Ｇｌｕ Ｃで消化したＨＭＷＫ標準物質および試料におけるＭＲＭによるＨＭＷＫ対ＬＭＷＫのシグネチャーペプチド、ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）を含むすべてのペプチドの確認により、血漿中で見いだされた標的化ペプチドがＨＭＷＫに起因するものであることが、本研究で発見された。ＨＡＥのＳＣＡＴ血漿におけるＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）ペプチドの有意な増加が、正常なＳＣＡＴ血漿と比較する際に観察され、また、ＦＸＩＩａにより活性化された血漿対活性化されていない血漿との間でも増加が観察され、ＨＭＷＫペプチドでは変化はなかった。またＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）／ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）の間の比率は、正常なＳＣＡＴ血漿試料と比較する際にＨＡＥのＳＣＡＴ血漿試料において高いことが見出だされ、また活性化された血漿対活性化されていない血漿でも同様の結果が見いだされた。ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）およびＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）に関する比率を使用した相対的な存在比は、正常なＳＣＡＴ血漿対ＨＡＥのＳＣＡＴ血漿ではそれぞれ４．４および８．９であり、正常なクエン酸血漿およびＦＸＩＩａにより活性化されたクエン酸血漿ではそれぞれ１９．０２および４８．６３であった。

キニノーゲン欠乏性血漿（陰性対照）の試料は、ＬＭＷＫの存在により潜在的に予測されたＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）ペプチドに関する検出限界付近に低いピーク強度を示した。血漿試料中のＨＭＷＫの長いペプチド、ＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲＳＳＲＩＧＥ（配列番号１８）もまた、標的化アッセイ（ＭＲＭ）を使用して測定した。正常なＳＣＡＴ血漿試料とＨＡＥのＳＣＡＴ血漿試料との間、および活性化された試料と活性化されていない試料との間でＨＭＷＫの長いペプチドの変化はほとんどなかった。

ＩＩ．キット
また本開示は、切断されたＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチドのレベルを測定する際に使用するため、および／または試料、たとえばヒトの患者由来の生体試料において完全長のＨＭＷＫに対して切断されたＨＭＷＫを区別するための、キットを提供する。当該キットは、適切なプロテアーゼ（たとえばキモトリプシンまたはＧｌｕ Ｃ）、適切なプロテアーゼ消化により産生され得るシグネチャーペプチドに特異的な検出薬剤、真空採血管、および任意に、標準物質の切断されたキニノーゲンおよび／または対照としての無傷のキニノーゲンのうちの１つまたは複数を含むことができる。一部の実施形態では、本キットは、対象のペプチドに対する検出試薬の結合を検出するための二次抗体および／または試薬をさらに含む。

一部の実施形態では、本キットは、本明細書に記載の方法のいずれかにしたがって使用するための説明書を含むことができる。含まれている説明書は、プロテアーゼにより処置された試料におけるシグネチャーペプチドのレベルを測定するためのキットに含まれている成分の使用方法の説明を含むことができる。

本キットの使用に関連する説明書は、一般的に、本明細書中に記載のアッセイ方法を行うための各成分の量および適切な条件に関する情報を含む。本発明のキットに供給されている説明書は、概して、ラベルまたは添付文書（たとえばキットに含まれている紙状のシート）に記載された説明書であるが、機械により可読できる説明書（たとえば磁気ディスク記憶装置または光ディスク記憶装置に担持された説明書）も許容可能である。

このラベルまたは添付文書は、切断されたＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチドのレベルを測定するため、および／または完全長のＨＭＷＫに対して切断されたＨＭＷＫを区別するためにキットが使用されることを表している。説明書は、本明細書中記載の方法のいずれかを行うために提供されてもよい。

本発明のキットは適切にパッケージングされている。適切なパッケージングとして、限定するものではないが、バイアル、ビン、ジャー、可動性のパッケージ（たとえばマイラーに密封またはプラスチックバッグ）などが挙げられる。

キットは、緩衝剤および解釈上の情報などの追加的な構成成分を任意に提供してもよい。通常、本キットは、コンテナ、およびコンテナ上またはコンテナと関連したラベルまたは添付文書（複数可）を含む。一部の実施形態では、本開示は、上述のキットの内容を含む製造物品を提供する。

ＩＩＩ．アッセイ方法の応用
（ｉ）臨床的な応用：疾患の診断および予後診断
血中のプレカリクレインの約７５～９０％は、ＨＭＷＫのドメイン６との非活性部位の相互作用を介してＨＭＷＫと結合する。遊離しＨＭＷＫと結合した活性ｐＫａｌは、切断されたＨＭＷＫおよびブラジキニンを産生する。バイオマーカーの適合性は、ＨＡＥの急性発作の有無においてこのレベルを経過観察することにより、例証することができる。また、これらバイオマーカーのレベルは、ブラジキニン介在性の浮腫またはｐＫａｌの活性が介在する他の疾患の発作の間に、変化し得る。

本明細書中記載のアッセイ方法およびキットは、疾患の評価、たとえば疾患の診断または予後診断に使用することができる。評価は、本明細書中記載の疾患、たとえばＨＡＥなどのｐＫａｌ介在疾患のリスクがある、または当該疾患を有すると対象を同定することを含んでもよい。また評価は、ＨＡＥなどのＰＫａｌ介在障害の治療の有効性を評価することなどの、疾患の治療をモニタリングすることを含んでもよい。さらに評価は、ｐＫａｌ阻害剤により治療できる疾患を同定することを含んでもよい。

Ａ．診断
一部の実施形態では、アッセイ方法およびキットは、候補対象（たとえばＨＡＥなどのＰＫａｌ介在障害を有する疑いのあるヒトの患者）から回収した生体試料（たとえば血液試料または血漿試料）中の切断されたキニノーゲンおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルを決定するために、行われる。切断されたＨＭＷＫ（たとえば２鎖ＨＭＷＫ、またはその重鎖および／もしくは５６ｋＤａの軽鎖および４６ｋＤａの軽鎖を含む軽鎖）のレベル、ならびに／または切断されたＨＭＷＫのレベルと無傷のＨＭＷＫのレベルとの間の比率を、本明細書中に記載の切断されたＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチドのレベル、および／または、本明細書中に記載の切断されたＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチドとＨＭＷＫ（たとえばＬＭＷＫと比較）に関するシグネチャーペプチドとの間の比率に基づき、決定することができる。このようなシグネチャーペプチドの濃度または比率を既定の参照値または参照比率と比較して、対象がＰＫａｌ介在障害、たとえばＨＡＥを有する、またはこの障害のリスクがあるかどうかを決定することができる。たとえば、候補対象の試料におけるシグネチャーペプチドの濃度または２つのシグネチャーペプチドの比率が参照の値／比率以上である場合、対象を、ＨＡＥなどのｐＫａｌ介在障害を有する、またはそのリスクがあると同定することができる。

参照の値／比率は、本明細書中記載されるシグネチャーペプチドまたは２つのシグネチャーペプチドの比率の対照値であり得る。一部の実施形態では、対照の値／比率は、好ましくは候補対象と同種の健常な対象または健常な対象の集合から得た試料（たとえば血液または血漿の試料）などの、対照の試料におけるシグネチャーペプチド（複数可）の値／比率を表す。本明細書中使用されるように、健常な対象は、切断されたキニノーゲンおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルが測定される時点において標的疾患（たとえば、ＨＡＥなどのＰＫａｌ介在障害）を明らかに有していない対象、または当該疾患の病歴を有していない対象である。

一部の実施形態では、対照の試料は、疾患の休止期にあるヒトのＨＡＥ患者から得ることができる。このような対照の試料から得た参照の値／比率と比較した、切断されたＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチドのレベルの増加、または切断されたＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチドとＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチドとの間の比率の増加は、ＨＡＥの発作のリスクを表してもよい。

また、参照の値／比率は、規定の値または比率とすることができる。このような規定の値／比率は、標的疾患を有さない、または標的疾患のリスクがない対象の集合における、本明細書中記載の切断されたＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチド（たとえば２鎖のＨＭＷＫの４６ｋＤａの軽鎖に関するシグネチャーペプチド）の値または２つのシグネチャーペプチドの比率を表すことができる。また、規定の値／比率は、標的疾患を有する（たとえば疾患の休止期にある）対象の集合においても、本明細書中記載の切断されたＨＭＷＫ（たとえば４６ｋＤａの軽鎖）に関するシグネチャーペプチドの値（たとえば濃度）または２つのシグネチャーペプチドの比率を表すことができる。

規定の値／比率は、様々な形態をとることができる。たとえば、中央値または平均値などの単一のカットオフ値とすることができる。一部の実施形態では、このような規定のレベルは、１つの定義したグループが標的疾患を有すると知られており、もう１つの定義したグループが標的疾患を有さないと知られている場合などの比較グループに基づき、確立することができる。あるいは、規定のレベルは、ある範囲、たとえば規定のパーセンタイル内で対照集合における対象の２つのペプチドの比率を表す範囲とすることができる。

本明細書中記載の対照の値／比率は、通常の技術により決定することができる。一部の例では、対照の値／比率は、本明細書中にも記載される対照の試料において、従来の方法（たとえば本明細書中記載されるように、試験試料において対象の２つのペプチドのレベルを得るための同一のアッセイ）を行うことにより、得ることができる。他の例では、対象のシグネチャーペプチドのレベルは、対照の集合の構成員から得ることができ、この結果を、たとえばコンピュータプログラムにより解析して、対照の集合における切断されたキニノーゲンおよび／または無傷のキニノーゲンのレベルを表す対照のレベル（既定のレベル）を得ることができる。

本明細書に記載の参照の比率と、候補の対象から得た試料における、本明細書中記載の切断されたＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチドの濃度または同様に本明細書中記載の対象の２つのシグネチャーペプチドの比率を比較することにより、候補の対象がＰＫａｌ介在疾患（たとえばＨＡＥ）を有する、もしくはそのリスクがあるかどうか、またはＨＡＥ患者がＨＡＥの発作のリスクがあるかどうかを決定することができる。たとえば、候補の対象の試料における、切断されたＨＭＷＫに関するシグネチャーペプチドの値または対象の２つのシグネチャーペプチドの比率が、参照の値または比率から逸脱している場合（たとえば参照の値または比率と比較して増加している場合）、候補の対象は、当該疾患を有するもしくは当該疾患のリスクがあると同定してもよく、またはＨＡＥ患者としてＨＡＥの発作のリスクがあると同定してもよい。参照の値または比率が、標的疾患を有する対象の集合における本明細書中記載の対象のシグネチャーペプチドの値または比率の範囲を表す場合、この範囲内の、候補の試料における対象のシグネチャーペプチドの値または比率は、候補の対象が標的疾患を有するまたは当該疾患のリスクがあることを表す。

本明細書中使用されるように、「高い値／比率、または参照の値／比率を超える値／比率」は、シグネチャーペプチドの値または２つのシグネチャーペプチドの比率が、対照の試料における同一のシグネチャーペプチドまたは同一の２つのシグネチャーペプチドの参照の値または比率、たとえば規定の閾値の比率よりも大きいことを意味する。対照のレベルは本明細書中詳細に記載されている。対象のシグネチャーペプチドの高い値、または２つのシグネチャーペプチドの高い比率は、たとえば参照の値／比率よりも、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上大きい値／比率を含む。

本明細書中使用されるように、「参照の値／比率を下回る低い値／比率」は、対象のシグネチャーペプチドの値または２つのシグネチャーペプチドの比率が、対照の試料における対象の同一のシグネチャーペプチドまたは同一の２つのシグネチャーペプチドの参照の値／比率、たとえば規定の閾値よりも少ないことを意味する。対照のレベルは本明細書中詳細に記載されている。シグネチャーペプチドの低い値または２つのシグネチャーペプチドの低い比率は、たとえば、対象の２つのペプチドの参照比率よりも、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上少ない値／比率を含む。

一部の実施形態では、候補の対象は、ｐＫａｌ介在障害、たとえばＨＡＥなどの症状を有するヒトの患者である。たとえば対象は、浮腫、腫脹（ここで上記腫脹は、完全に末梢性または主に末梢性である）；蕁麻疹；感染症のエビデンスの非存在下での発赤、疼痛、および腫脹；非ヒスタミン介在性浮腫、腫脹の再発性の発作、またはそれらの組み合わせを有する。他の実施形態では、対象は、試料を回収する時点でｐＫａｌ介在障害の症状を有しておらず、ｐＫａｌ介在障害の症状の病歴を有しておらず、またはＨＡＥなどのｐＫａｌ介在障害の病歴を有していない。さらなる他の実施形態では、対象は、抗ヒスタミン療法、副腎皮質ステロイド療法、またはその両方に耐性がある。

Ｂ．治療有効性の評価
本明細書中記載のアッセイ方法を、ＰＫａｌ介在障害（たとえばＨＡＥ）の治療の有効性を評価するためにも使用することができる。たとえば、複数の生体試料（たとえば血液または血漿の試料）を、治療の前後または治療過程の間に、治療を行う対象から回収することができる。シグネチャーペプチドのレベルは、本明細書中記載のアッセイ方法のいずれかにより測定することができ、これにより、切断されたＨＭＷＫ（たとえば４６ｋＤａの軽鎖）に関するシグネチャーペプチドのレベル、またはＨＭＷＫに特異的なペプチドに対する切断されたＨＭＷＫに特異的なペプチドの比率を、決定することができる。切断されたＨＭＷＫ（たとえば４６ｋＤａの軽鎖）に関するシグネチャーペプチドの値または２つのシグネチャーペプチドの比率が、治療の後または治療過程にわたり減少する（早期に回収した試料の値と比較して、後に回収した試料において対象の切断されたＨＭＷＫ（たとえば４６ｋＤａの軽鎖）に関するシグネチャーペプチドのレベルまたは２つのシグネチャーペプチドの比率が減少する）場合、治療が有効であることを表す。一部の例では、治療は、本明細書中記載のカリクレイン結合剤、本明細書中記載のブラジキニンＢ２受容体拮抗薬、または本明細書中記載のＣ１－ＩＮＨ置換剤（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）などの治療剤を含む。治療剤の例として、限定するものではないが、ＤＸ－２９３０、ＳＨＰ６４３、またはＤＸ８８が挙げられる。

対象が治療に応答しないと同定される場合、治療剤を、より高い用量および／または投与頻度で、同定した対象に投与する。一部の実施形態では、治療に応答性がある、またはさらなる治療の必要がないと同定された対象における治療剤の用量または投与頻度を、維持され、低下し、または終了する。あるいは、第１の治療に応答しないと見いだされた対象に、異なる治療を使用することができる。

（ｉｉ）非臨床的な応用
さらに、本明細書中記載のアッセイ方法は、たとえば研究の目的および／または前臨床の薬物開発工程の目的のための非臨床的な有用性を有する。ｐＫａｌに関連する多くの疾患が同定されてきたが、他の疾患が、同様の機構により介在されているまたは同様の構成成分を含む可能性がある。一部の実施形態では、本明細書中に記載の方法は、ｐＫａｌに関連する疾患を同定するために使用されてもよい。一部の実施形態では、本明細書中記載の方法を、機構を試験（たとえば疾患の発展に関与する新規の生物学的な経路またはプロセスの発見）または疾患の進行を試験するために、使用してもよい。

一部の実施形態では、本明細書中に記載のアッセイ方法により決定したシグネチャーペプチドのレベルまたは比率は、ｐＫａｌに関連する疾患の新規治療の開発に依存し得る。たとえば、本明細書中記載のシグネチャーペプチドのレベルまたは比率は、新規治療（たとえば臨床試験）を受けている対象から得た試料、またはｉｎ ｖｉｒｏでのアッセイから得た試料で測定してもよい。一部の実施形態では、シグネチャーペプチドのレベルまたは比率は、この新規の治療の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイで表してもよく、または新規治療の有効性を臨床試験の状況下で表してもよい。

さらに詳述することなく、当業者は上記の説明に基づき、完全な度合で本発明を利用することができると考えるものである。よって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるものであり、本開示の残りを限定することは全くない。本明細書中引用されているすべての刊行物は、本明細書中参照される目的または対象に関して、参照として援用されている。

実施例
実施例１：切断された高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）と完全長のＨＭＷＫとを区別するための方法
この実施例の総合的な目的は、完全長のキニノーゲン（ＨＫ；一本鎖または１鎖のＨＫ）とカリクレイン切断型キニノーゲン（二本鎖の産物または２鎖のＨＫ、ならびに二本鎖産物の重鎖および／もしくは軽鎖）とを区別するための、ＬＣ－ＭＳベースのペプチド定量化アッセイに関する強力な方法を開発することであった。一部の例では、この半定量的なアッセイは、ＨＡＥなどの血漿カリクレインに関連する疾患を伴う患者と比較して、健常なボランティアの生体試料（たとえば血漿）における２鎖のＨＫのカットポイント（ｃｕｔ ｐｏｉｎｔ）を決定するため、１鎖のＨＫの基質に対する２鎖のＨＫ産物の比率を測定した。

一本鎖ＨＭＷＫ（１鎖ＨＫ）および二本鎖ＨＭＷＫ（２ＨＫ）（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＳｉｇｍａ）を、後述の実施例において標準物質として使用した。異なる種類の血漿試料（クエン酸血漿、クエン酸血漿＋プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、正常なＳＣＡＴ血漿（ＳＣＡＴチューブに回収した健常な対象の血漿試料）、およびＨＡＥのＳＣＡＴ血漿（ＳＣＡＴチューブに回収したＨＡＥ患者の血漿試料））を、後述の実施例に使用した。たとえば国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４６６８１号を参照されたい。この中の関連する開示は本明細書中参照として援用されている。異なる日時および異なる実験での変動を処理するために、実験の間品質管理を行い、再現性の確認を行った。方法の最適化のため、ＥＤＴＡ－Ｐｌａｓｍａ（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を対照として使用した。

本実施例で説明および開発されたアッセイは、疾患過程において候補バイオマーカーを検証するための高感度の選択的な方法を提供する。この手法では、ＡＢＳｃｉｅｘ ５５００または６５００ Ｑｔｒａｐの質量分析計を使用し、様々な種類の血漿試料間の差異を、方法の最適化の後評価した。個々の血漿試料（正常なＳＣＡＴ血漿およびＨＡＥのＳＣＡＴ血漿、キニノーゲン欠乏性血漿、正常なクエン酸血漿、第ＸＩＩａ因子で活性化された正常なクエン酸血漿、およびＨＫの標準物質を含む）を、Ｇｌｕ Ｃで消化し、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）解析を、対象のペプチドに関して行った。Ｇｌｕ Ｃを、２鎖のＨＫと１鎖のＨＫを区別する固有のペプチド（シグネチャーペプチド）を得るための例示的なプロテアーゼとして使用した。簡単に述べると、最初の実験は、特異的なペプチドに関してＭＲＭモードを使用してタンパク質の標準物質の特性を検証するように設計された。１０μｇのタンパク質を含む試料１０μｌを、Ｃ１８カラムに充填した。Ｇｌｕ Ｃで消化した血漿キニノーゲンに固有である、Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェアにより予測される前駆体およびプロテアーゼ消化産物のイオンを選択した。標的候補ペプチド、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）、ＳＳＲＩＧＥＩＫＥ ｍｉｓ２（配列番号１９）、ＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲＳＳＲＩＧＥ（配列番号２０）、ＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫ（配列番号２１）、およびＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）、および３～５個の産物のイオンを、血漿キニノーゲンに関して実験的に検証した。断片化のエネルギーおよび衝突のエネルギーを、ＭＲＭを行う指針として、ｓｋｙｌｉｎｅを使用した後、ペプチドに対して個別に最適化した。データを、Ａｎａｌｙｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＡＢＳｃｉｅｘ）を使用して解析した。この方法の開発は、試料調製、異なる種類の血漿試料およびＨＫの標準物質に関する酵素消化、クロマトグラフィー、ならびに質量分析のパラメータの最適化に焦点を当てるものであった。

（ｉ）免疫沈降の試料対全血漿試料
概念研究を検証するために、免疫沈降から得た４つのタンパク質試料（ＩＰの試料）および４つの全血漿試料（非ＩＰの試料）を試験に使用した。これら試料をＳＤＳで溶出し、次いで界面活性剤除去カラムにより除去した。試料における対象のペプチドを試験するために、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ５５００ Ｑｔｒａｐ ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄ質量分析計で、標的化アッセイを行った。

対象の４つすべてのペプチド、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）、ＳＳＲＩＧＥＩＫＥ（配列番号１９）、ＫＫＩＹＰＴＶＮＣ ＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲＳＳＲＩＧＥ（配列番号１８）、およびＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫ（配列番号２１）が、非ＩＰ試料で見いだされたが、ＩＰ血漿試料では検出されなかった。活性化された血漿試料（ＦＸＩＩａにより処理）および活性化されていない血漿試料の間ではピークの差異は見られなかった。以下の表２は、ＩＰ試料および非ＩＰ試料におけるペプチドのピーク強度を示している。活性化された試料または活性化されていない試料（ボックス列）において、ＳＳＲＲＩＧＥ（Ｇｌｕ Ｃ消化により産生された２ＨＫの軽鎖に固有のペプチド；配列番号２２）またはＫＫＩＹＰＴＶＮＣ ＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲＳＳＲＩＧＥ（Ｇｌｕ Ｃ消化により産生されたＨＫの長いペプチドに固有のペプチド；配列番号１８）に関してピーク強度に差異はなかった。

ＥＤＴＡ ｐｌａｓｍａを、ＩＰ／非ＩＰ試料との陽性対照として実験し、対象のすべてのペプチドは、両方の種類の試料で見いだされた。

この結果は、Ｇｌｕ Ｃで消化した全血漿試料が、一本鎖ＨＫおよび二本鎖ＨＫのペプチドの両方を検出するために十分な感度を提供したことを示した。よって、例示的なＧｌｕ Ｃプロテアーゼにより消化した全血漿試料を、以下に記載の実験に使用した。

（ｉｉ）試料調製の最適化
（ａ）消化プロトコル
血漿のＧｌｕ Ｃ消化を最適化するために、様々なプロトコルを使用してＧｌｕ Ｃ消化を最適化した。プロトコルの異なるパラメータを、以下にまとめるように修正した。
プロトコル１：消化前の変性ステップの追加（たとえば０．１ＭでのＤＴＴの存在下）
プロトコル２：異なる濃度の還元剤の使用（０．０５ＭのＤＴＴ）
プロトコル３：消化前の試料の１０倍での希釈；および
プロトコル４：１９時間までの酵素のインキュベーション時間の増加
プロトコル２は、ピーク強度およびピーク形状に基づき、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）およびＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫ（配列番号２１）の良好な検出をもたらした。よってプロトコル２の消化方法をその後の実験に使用した。

（ｂ）還元温度およびインキュベーション時間
同様に、還元温度およびインキュベーション時間を最適化した。簡潔に述べると、ＨＫの標準物質およびＥＤＴＡ－ｐｌａｓｍａを使用して、消化中の試料の還元に関して、温度（５５℃ｖｓ９０℃）およびインキュベーション時間（３０分ｖｓ６０分）を評価した。
ＨＫ：９０℃で１時間
ＨＫ：５５℃で３０分
Ｐｌａｓｍａ ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍ）：９０℃で１時間
Ｐｌａｓｍａ ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍ）：５５℃で３０分

多重反応モニタリング（ＭＲＭ）解析を使用し、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）およびＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲＳＳＲＩＧＥ（配列番号２０）のペプチドを検出することにより、これら試料を解析した。５５℃で３０分間還元した試料と比較して、９０℃で１時間還元した試料（ＨＫの標準物質の試料および血漿試料の両方）でピーク強度が高いことが見いだされた。９０℃で１時間のインキュベーションを含む条件を、その後の実験で試料を還元する際に使用した。

（ｃ）血漿中のプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）および抗凝固剤
また、消化効率に及ぼす血漿中のＰＩおよび抗凝固剤の存在の作用を評価した。ＰＩを含む血漿およびＰＩを含まない血漿に関して消化効率を評価し、また、抗凝固剤としてのクエン酸塩を含む血漿とＥＤＴＡを含む血漿との間でも消化効率を評価した。ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ５５００ Ｑｔｒａｐ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍを使用したＭＲＭ解析により試料を評価し、図３に矢印で示されるように、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）に関して、ピーク強度を比較した。これらの結果は、ＰＩを含まないＰｌａｓｍａ ＥＤＴＡ＞ＰＩを含むＰｌａｓｍａ ＥＤＴＡ＞ＰＩを含まないクエン酸血漿＞ＰＩを含むクエン酸血漿を表した。

またこれらの結果は、ペプチドの応答の減少が、クエン酸塩、ＰＩ、または両方を含む試料で観察されたため、クエン酸塩およびプロテアーゼ阻害剤がＧｌｕ Ｃ消化に陰性の作用を有することを示した。

（ｉｉｉ）配列のカバレッジを確認するための異なる酵素での消化
配列のカバレッジが酵素依存性かどうかを試験するために、異なる酵素のトリプシンを使用した。Ｓｉｇｍａ製のＨＫの標準物質の試料およびＢｉｏｃｈｅｍ製のＥＤＴＡ－ｐｌａｓｍａ試料をトリプシンで消化し、高分解能精密質量（ＨＲＡＭ）機器にかけ、ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒを使用して解析を行った。この結果をＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（商標）ソフトウェアを使用して解析した。

トリプシンで消化したＨＫおよび血漿試料の両方で、完全長のキニノーゲンを、良好な配列のカバレッジで検出した。

（ｉｖ）ＥＤＴＡ－ＰｌａｓｍａおよびＨＫの試料のＳＩＭ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
高い濃度を有するＨＫおよび血漿の試料をＳＩＭに使用し、対象のペプチドを、高分解能精密質量（ＨＲＡＭ）機器を使用して検出した。ＳＩＭ－ＭＳ^２のデータ解析を、ＥＤＴＡ ｐｌａｓｍａおよびＨＫ（ｓｉｇｍａ）の試料で行った。

ＨＲＡＭ機器でのＧｌｕ Ｃ消化したＥＤＴＡ ｐｌａｓｍａ試料の解析により、４つすべてのペプチド、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）、ＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫ（配列番号２１）、ＨＫの長いペプチド、およびブラジキニンが検出された。ＨＫの標準物質の試料に関しては、ペプチドＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）、ＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫ（配列番号２１）、およびブラジキニンが見いだされたが、ＨＫの長いペプチドは見いだされなかった。

標準物質の同一性を確認するために、２つの異なる供給源のＨＫ（Ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈおよびＳｉｇｍａ）を使用した。しかしながら、この実験では、２つの標準物質の間で検出可能な差異は観察されず、ＨＫの長いペプチドはいずれの標準物質の試料でも検出されなかった。

（ｖ）異なる種類の血漿、異なるＧｌｕ Ｃ、および異なる酵素：タンパク質の比率
Ｇｌｕ Ｃ消化をさらに最適化するために、異なる種類の血漿試料（ＰＩを含むＥＤＴＡ、クエン酸血漿、およびＰＩを含まないＥＤＴＡ、クエン酸血漿）、異なるＧｌｕ Ｃの供給源（ＰｒｏｔｅａおよびＰｒｏｍｅｇａ）、および異なる酵素：タンパク質の比率（１：２０および１：１０）を評価した。さらに、フルスキャン、ＳＩＭ－ＭＳ^２（ＨＲＡＭ上）、ＭＲＭ（ＱＱＱ；ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ機器上）を含む様々な検出プラットフォームを、異なる試料において対象のペプチドを検出するために使用した。表３は、この実験に使用した試料の種類、酵素、および希釈の様々な組み合わせの概要を示している。

（ａ）フルスキャンおよびＳＩＭ－ＭＳ^２（ＨＲＡＭ）
上述の異なる種類の血漿および標準物質の試料をＧｌｕ Ｃで消化し、消化産物を、フルスキャンおよびＳＩＭ－ＭＳ^２のためＨＲＡＭ機器にかけた。試料の情報は、凡例のカラーマップ（ｌｅｇｅｎｄ ｃｏｌｏｒ ｍａｐ）の右手側に示されている。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（商標）ソフトウェアおよびＸｃａｌｉｂｕｒ（商標）ソフトウェアを使用して解析を行い、対象のペプチドそれぞれのピーク強度を決定した。

血漿試料では、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）に関して以下のペプチド強度の応答が観察された：
ＰＩを含まないＰｌａｓｍａ ＥＤＴＡ＞ＰＩを含むＰｌａｓｍａ ＥＤＴＡ＞ＰＩを含まないクエン酸血漿＞ＰＩを含むクエン酸血漿。

１：２０（酵素：タンパク質）の比率が、１：１０（酵素：タンパク質）の比率よりも応答が良好であったことが判定された。ＨＫの長いペプチドでは、強度は、血漿の種類または酵素：タンパク質の比率の影響を最小限にのみ受けた。ＨＫの長いペプチドは、標準物質の試料のいずれでも観察されなかった；しかしながら、ＫＫＹＩＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫペプチド（配列番号２３）およびブラジキニンはすべての標準物質で検出され、これによりＨＫの長いペプチドが分解されている可能性があることが示されている。特定の理論により拘束されるものではないが、このことは、ＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫ（配列番号２１）、ＲＰＰＧＦＳＰＦＲ（配列番号２４）、およびＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）を含むＨＫの長いペプチドの様々なフラグメントの所見を説明することができる。

以下の表４は、ＨＲＡＭ機器でのフルスキャンおよびＳＩＭ－ＭＳ^２のデータを使用した、対象のペプチドの強度を示す（試料の種類により分類）。

（ｂ）多重反応モニタリング（ＭＲＭ）標的化アッセイ
上述の試料の同一のセットを使用して、標的化アッセイ（ＭＲＭ）を使用して対象のペプチドを検出した。これら試料を、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ｑｔｒａｐ ５５００機器を使用して検出した後に、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアを使用して解析した。試料の情報は、カラーマップの右手側に提示されている。

ＳＳＲＩＧＥペプチド（配列番号５）の検出が、試料の種類および条件に関わらず、一貫して観察された。最適化した試料調製物を用いた場合、ＳＳＲＩＧＥＫＥ（配列番号２５）ペプチドは検出されなかった。しかしながら、ＨＫの長いペプチドは、血漿試料にのみ存在していたが、ＨＫの標準物質の試料では存在しなかった。ＫＫＹＩＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫ（配列番号２３）ペプチドおよびブラジキニンペプチドはすべてのＨＫの標準物質の試料に存在していたが、ＨＫの長いペプチドは検出されなかった。これらの結果は、上述のフルスキャンおよびＭＳ^２からのデータセットと類似しており、ＨＫの長いペプチドが分解している可能性があることを示唆しており、上述のＨＫの長いペプチドのフラグメントの所見をさらに説明するものである。

以下の表５は、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ｑｔｒａｐ ５５００機器でＭＲＭデータを使用した対象のペプチドの強度を示す（試料の列挙により分類）。

（ｃ）ＨＲＡＭおよびＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（商標）ソフトウェアを使用した配列カバレッジ
タンパク質の消化にとって最適なＧｌｕ Ｃの濃度を決定するために、異なる供給源（ＰｒｏｔｅａおよびＰｒｏｍｅｇａ）ならびに異なる酵素：タンパク質の濃度（１：２０および１：１０）からの、ＨＫの標準物質の試料の配列のカバレッジを、Ｇｌｕ Ｃでの消化の後に、ＨＲＡＭ機器上でのフルスキャンにより評価した。いずれの供給源由来のＧｌｕ Ｃの１：２０の希釈も消化に最適なように行われたが、これは、配列カバレッジが対象の領域でより多かったためである。以下に提供されているように、１：１０の希釈物も対象の領域でカバレッジを提供したが、このペプチドは低い信頼スコアを有するものであった。

上記の一本鎖ＨＭＷＫのアミノ酸配列では、太字のＧｌｕ－Ｃ由来のペプチドは単一のイオンで同定されたが、下線が引かれたペプチドは複数のイオンで同定された。ブラジキニンはイタリック体および太字で表されている。

（ｖｉ）高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）および低分子量キニノーゲン（ＬＭＷＫ）の配列のアライメント
ＬＭＷＫと比較してＨＭＷＫに固有のペプチドを同定するために、これら２種類のキニノーゲンの配列のアライメントを、ＵｎｉＰｒｏｔソフトウェアを使用して行い、以下に提供した（ｈＨＭＷＫ：配列番号１１；ｈＬＭＷＫ：配列番号１２）。

ＬＭＷＫと比較してＨＭＷＫに固有の４つのペプチドを見出した。
１．ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）
２．ＩＮＰＴＴＱＭＫＥ（配列番号２６）
３．ＫＱＲＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥ（配列番号７）
４．ＥＤＳＴＴＰＳＡＱＴＱＥ（配列番号２７）

ａ．ＨＲＡＭ上でのフルスキャンおよびＭＳ^２を使用した、ＨＫ試料におけるＨＭＷＫに固有のペプチドの検出
固有のペプチドＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）から開始し、フルスキャンおよびＭＳ^２を、Ｇｌｕ Ｃで消化したＨＫの標準物質を使用して行った。フルスキャンおよびＭＳ^２を、ＨＲＡＭ機器で行い、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（商標）ソフトウェアを使用して解析した。以下に示すように、ＨＭＷＫに固有のペプチドが、ＨＫの標準物質で検出された。これは、ＨＫの標準物質がＨＭＷＫを含むものであったことを示唆している。

ＨＭＷＫに特異的なペプチドの位置が、上記に示されているＨＭＷＫのアミノ酸配列において太字および下線で示されている。

ｂ．ＭＲＭによるＨＫの試料およびＥＤＴＡ ｐｌａｓｍａにおけるＨＭＷＫに固有のペプチドの検出
標準物質においてＨＭＷＫの存在を決定するため、および血漿試料と標準物質を比較するために、Ｇｌｕ Ｃで消化したＨＫおよびＧｌｕ Ｃで消化した血漿を、標的化解析のためＡＢ Ｓｃｉｅｘ ５５００ Ｑｔｒａｐにかけた。ＨＭＷＫに固有のペプチド（ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ；配列番号１０）を、ペプチドのピーク強度がＨＫの標準物質と比較して血漿では少なかったが、ＭＲＭアッセイを使用して両方の試料で検出した。このことは、血漿の複雑さおよび高いバックグラウンドノイズにより予測されるものであった。これらの結果により、ペプチドがＨＭＷＫ由来であることを確認した。

（ｖｉｉ）消化条件
ａ．２５℃および３７℃での、Ｇｌｕ ＣでのＨＫおよび血漿の消化
３７℃よりも２５℃で、Ｇｌｕ ＣでＨＫおよび血漿試料を消化する有効性が評価された。ＨＭＷＫに固有のペプチドが、ＨＫの標準物質で検出されたが、ＨＫの長いペプチドは標準物質で検出されなかった。不完全な消化があるかどうかを試験、または高い温度がＨＫの標準物質をブラジキニンおよびＫＫＹＩＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫ（２ＨＫの重いペプチドに特異的；配列番号２３）に分解したことを試験するために、血漿およびＨＫの試料を、３７℃よりも２５℃でＧｌｕ Ｃにより消化した。ＭＲＭ解析を使用して、ＨＭＷＫに固有のペプチドを含む対象のペプチドを標的化し、検出した。ピーク強度は以下の通りである。
ＨＫ Ｓｉｇｍａ Ｇｌｕ Ｃ ２５℃：
・ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）：５９６０
・ＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲＳＳＲＩＧＥ（配列番号２０）：４０００
・ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）：７．６ ｅ４
ＨＫ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｌｕ Ｃ ２５°Ｃ：
・ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）：４．５ ｅ５
・ＳＳＲＩＧＥＩＫＥ ｍｉｓ^２（配列番号１９）：１．５ ｅ５
・ＫＫＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭＫＲＰＰＧＦＳＰＦＲＳＳＲＩＧＥ（配列番号２０）：２．３ ｅ５
・ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）：４．６ ｅ５

２５℃でのＨＫの標準物質（Ｅｎｚｙｍｅ ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＳｉｇｍａ）のＧｌｕ Ｃ消化で、ＨＫの長いペプチドを含む対象の３つのペプチドすべてが検出され、これにより高い温度が標準物質を分解し、よってＨＫの長いペプチドは、３７℃で消化する場合に観察されないことを示していることがわかった。Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得た標準物質は、Ｓｉｇｍａから得た標準物質と比較して高いピーク強度を提供した。ｍｉｓ２の切断したペプチドＳＳＲＩＧＥＩＫＥ（配列番号１９）は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈの標準物質でのみ見いだされた。血漿試料に関しては、３７℃でのＧｌｕ Ｃ消化が２５℃でのＧｌｕ Ｃ消化よりも良好な消化効率をもたらしたとの結果が示された。図１。２５℃で標準物質を使用した長いペプチドおよび他のＨＭＷＫに固有のペプチドの確認は、血漿試料で観察されたペプチドがＨＫ由来であることを示している。

ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）を除くペプチドは、２５℃の血漿試料では検出されなかった；しかしながら予測される対象のペプチドすべてが、３７℃で消化した血漿試料で検出された（図１）。ＨＫの長いペプチドは、２５℃では両方の標準物質で観察されたが、３７℃では観察されなかった。

これらの結果により、標準試料に関しては２５℃でのＧｌｕ Ｃでの消化が良好であり、血漿に関しては、３７℃での消化が良好に作用したことが示唆されている。

ａ．高分解能精密質量（ＨＲＡＭ）機器を使用した最適化消化方法
また、別の検出プラットフォームを、２５℃で消化した血漿試料において対象のペプチドを検出するために使用できるかどうかを決定するために、２５℃および３７℃でＧｌｕ Ｃで消化した試料（ＨＫおよび血漿の両方）を、フルスキャンのためＨＲＡＭ機器上で評価して、ＨＫの長いペプチドおよびＨＭＷＫに固有のペプチドを含む対象のペプチドを検出した。

対象のペプチドおよびＨＭＷＫに固有のペプチドのすべてを、２５℃で消化したＨＫの標準物質および３７℃で消化した血漿試料で検出した。このデータセットは、ｍｉｓ２の切断したペプチドＳＳＲＩＧＥＩＫＥ（配列番号１９）を除き、上述のＭＲＭデータと一致した。ｍｉｓ２の切断したペプチドＳＳＲＩＧＥＩＫＥ（配列番号１９）は、通常、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製のＨＫの標準物質で観察される。ＬＭＷＫに固有のペプチドＹＫＧＲＰＰＫＡＧＡＥ（配列番号２８）もまた、このアッセイに含まれており、血漿試料では見いだされたが、ＨＫの標準物質では見いだされず、これは、予想と一致している（図２、３）。

ｂ．２５℃でのＨＫ－フルスキャンの配列のカバレッジ
ＨＫの標準物質の配列のカバレッジを、最適化したＨＫのＧｌｕ Ｃ消化、Ｇｌｕ Ｃの供給源、および酵素：タンパク質の比率を使用して評価した。簡潔に述べると、１：２０の酵素：タンパク質の比率、２５℃でＧｌｕ Ｃ消化を行うことが、特に対象の領域（ＨＫの長いペプチド）において、高い信頼スコアを伴い有意に改善したＨＫ（Ｅｎｚｙｍｅ ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＳｉｇｍａから供給された両方のＨＫ）の配列カバレッジをもたらした。

ＨＫの長いペプチドの位置は、上記に示されているＨＭＷＫのアミノ酸配列において太字および下線で示されている。

ｃ．ＨＲＡＭ機器でのフルスキャンおよびＳＩＭ
また、ＨＲＡＭ機器を使用したＳＩＭおよびフルスキャンを、ＨＫの長いペプチドを検出するため、２５℃で消化したＨＫの標準物質で行った。ＨＫの長いペプチドが、２５℃での消化の後に、ＨＲＡＭ機器でのフルスキャンおよびＳＩＭによりＨＫの標準物質で観察された。

（ｖｉｉｉ）２５℃でのＧｌｕ Ｃ消化に関するＨＭＷＫに固有のペプチドｖｓＬＭＷＫに固有のペプチド
２つの追加的な、ＨＭＷＫの固有（ＬＭＷＫと比較）のペプチド、ＩＮＰＴＱＭＫＥ（配列番号２９）およびＳＹＹＤＤＧＬＳ（配列番号３０）を追加し、これら固有のペプチドを検出するために、ＭＲＭ解析を行った。２５℃でのＨＫの標準物質（ＨＫ（Ｓｉｇｍａ）およびＨＫ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））の消化の後、追加的なＨＭＷＫに固有のペプチドが観察され、これによりＨＫの存在を確認した。

（ｉｘ）最適化した方法を用いた、異なる種類の試料間の差異の評価
ａ．標的化アッセイ（ＭＲＭ）を使用した、血漿試料中のＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）の定量化
個々の血漿試料をＧｌｕ Ｃで消化し、対象のペプチドＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）を検出するためＭＲＭ解析を行った。この試料の種類は、正常なＳＣＡＴおよびＨＡＥのＳＣＡＴの血漿試料、キニノーゲン欠乏性の血漿試料、正常なクエン酸血漿試料、第ＸＩＩａ因子で活性化された正常なクエン酸血漿試料、ならびにＨＫの標準物質の試料を含むものであった。

図３に示されるように、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）ペプチドを、解析ソフトウェアの定量ウィザードを使用して定量化した。ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）ペプチドの有意な増加が、正常なＳＣＡＴ血漿試料と比較してＨＡＥのＳＣＡＴ血漿試料で検出された。また、活性化されていない血漿試料と比較して活性化された血漿において、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）ペプチドが顕著に増加した。キニノーゲン欠乏性の血漿試料は、最小限のＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）ペプチドを示し、これはＨＭＷＫが存在しないため予測されるものであった。

ｂ．標的化アッセイ（ＭＲＭ）を使用した、血漿試料におけるＨＫの長いペプチドの定量化
血漿試料をＧｌｕ Ｃで消化し、ＨＫの長いペプチドを検出するためにＭＲＭ解析を行った。試料の種類は、正常なＳＣＡＴおよびＨＡＥのＳＣＡＴの血漿試料、キニノーゲン欠乏性血漿試料、正常なクエン酸血漿試料、第ＸＩＩａ因子で活性化された正常なクエン酸血漿試料、ならびにＨＫの標準物質を含むものであった。正常なＳＣＡＴの血漿試料とＨＡＥのＳＣＡＴの血漿試料との間で、ＨＫの長いペプチドに非常に小さな変化が検出された。さらに、活性化された試料と活性化されていない試料との間で差異は観察されなかった。図４。

（ｘ）Ｇｌｕ Ｃ消化に関する一貫性および再現性の評価
日ごとのＧＬＵ Ｃ消化の再現性を評価するために、ＨＫの標準物質および血漿（クエン酸血漿＋ＰＩ）試料を、３日間連続で消化させ、対象のペプチドを検出するためにＭＲＭ解析を行った（以下の表６Ａおよび表６Ｂを参照）。対象のペプチド全てが、表記のピーク強度で、ＨＫの標準物質および血漿試料に存在した。表６Ａおよび表６Ｂ。ＨＫの標準物質および血漿（クエン酸血漿＋ＰＩ）に関する３日間のＧｌｕ Ｃ消化のデータのそれぞれは、一貫性のある結果を有するものであった。

表６Ａ：連続３日間Ｇｌｕ Ｃで消化したＨＫ

（ｘｉ）ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）およびＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）の間の比率
ａ．ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）およびＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）のペプチドの比率の計算
Ｇｌｕ Ｃで消化したＨＫおよび血漿試料を使用して、正常な血漿ｖｓＨＡＥ患者由来の血漿における標的化アッセイ（ＭＲＭ）により、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）およびＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）のペプチドの間の比率を計算した。ＨＭＷＫに固有なペプチドに対するＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）ペプチドの比率を測定することは、たとえば診断アッセイに使用されてもよい。すべての比率および比率の平均値を、Ａｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェアを使用して定量化におけるペプチドのピーク下面積をとることにより、計算した。

ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）／ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）の比率の全体的な増加が、正常なＳＣＡＴの血漿試料と比較した際に、ＨＡＥのＳＣＡＴの血漿試料で観察された。また、活性化された血漿ｖｓ活性化されていない血漿においてＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）／ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）の比率が有意に増加した（図５）。

ｂ．ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）およびＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）のペプチドの間の比率の平均値
ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）／ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）の比率の平均値を、ＭＲＭ標的化アッセイを使用して、ピーク下面積として、異なる種類の試料で計算した（図６）。ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）／ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）の間の比率の平均値は、正常なＳＣＡＴの血漿試料と比較して、ＨＡＥのＳＣＡＴの血漿試料で高いことがわかった。この、ＨＭＷＫに対するＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）ペプチドｖｓＬＭＷＫに固有のペプチドＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）の比率は、切断されたキニノーゲンに関連する疾患もしくは障害を診断するため、または健常な個体由来の試料と疾患状態にある個体由来の試料との間を区別するためなどの、アッセイに使用される可能性を有する。

（ｘｉｉ）ＨＫの標準物質を使用したＬＣ－ＭＳの試験の最適化
この方法の効率を上げるために、ＬＣ－ＭＳの実験を、勾配を最適化し実験時間を短縮することにより最適化した。ＬＣ－ＭＳの最適化は、主にＨＫの標準物質を使用して行った。図６に示されるように、いくつかの方法の結果が、使用される様々なＬＣの勾配および実験時間から提示されている。ＬＣ－ＭＳの方法は、１０分の実験まで短縮することに成功した。左下のクロマトグラムは、ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳのペプチド（配列番号１０）が、分裂ピークの代わりの単一のピークとして現れるため、「最適化した方法」を提示する。比率の計算に必要な両方のペプチド、ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）およびＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）は、有意に少ない実験時間で見いだされた。

（ｘｉｉｉ）血漿試料を使用した、ＬＣ－ＭＳの実験の最適化
上述の短いＬＣ－ＭＳの実験を、血漿試料を使用して検証し、ここで対象のペプチド（ＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）およびＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０））を検出した。ＨＫの標準物質および血漿試料の両方における対象のペプチドの検出を、本来の方法（４２分）よりも有意に改善している１６．５分の実験方法を使用して検出した。血漿試料の複雑さが増大するにつれて両ペプチドの強度は減少した：ＥＤＴＡ ｐｌａｓｍａ＞クエン酸血漿＞ＳＣＡＴ血漿。

実施例２：シグネチャーペプチドおよびＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用したＨＡＥの血漿における切断されたＨＷＭＫの４６ｋＤａの軽鎖の定量化
この実施例に記載される例示的な方法は、ヒトの血漿における内在性二本鎖ＨＭＷＫ（４６ｋＤａの軽鎖のレベルにより提示され得る）の濃度を決定するために設計された。この方法は、２５μＬの血漿をつぶした後、ペレットで消化させ、ＭＣＸ ＳＰＥを使用してさらに精製し、液体クロマトグラフィー―タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により解析することを含む。二次元のＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｅｔａｓｉｌ ＡＱ Ｃ１８カラム、５．０μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ（Ｃ／Ｎ Ａ０５３０１００Ｘ０２０）およびＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＱＴｒａｐ ６５００質量分析計を、エレクトロスプレーイオン化により形成した正のイオンを使用して、二本鎖ＨＭＷＫのシグネチャーペプチド、Ｈ_２Ｎ－ＫＨＮＬＧＨＧＨ－ＯＨ（配列番号１）、および安定的に標識した内部標準（ＳＬＩＳ）（ＫＨＮＬ［^１３Ｃ_６］ＧＨＧＨ）の検出に最適な条件下でＳＲＭ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）モードで作動させた。

一定分量２５μＬのヒトの血漿を、１０％のＳＤＳ２．５μＬ、５μＬのＤＴＴ（５００ｍＭ）と混合し、タンパク質を、３７℃で６０分間還元した。溶液に、７５μＬおよび６００μＬのメタノールを順次添加して、タンパク質を沈殿させた。上清を廃棄し、タンパク質のペレットを再度７００μＬのメタノールで洗浄した。遠心した後、ペレットを、１０分間強くボルテックス（ｖｅｒｔｅｘ）しながら重炭酸アンモニウム緩衝液（１００ｍＭ）５００μＬ中に再構成した。一定分量の２５μＬの内部標準物質溶液（ＫＨＮＬ［^１３Ｃ_６］ＧＨＧＨ、３０ｎｇ／ｍＬ）および５．０μＬのヨードアセトアミド溶液（５００ｍＭ）を添加し、混合物を暗室に３０分間保存した。その後、タンパク質を、１０μＬのキモトリプシン（８ｍｇ／ｍＬ）を添加することにより消化し、穏やかにボルテックスをかけながら、５０℃に３時間維持した。

結果として得られる混合物を酸性化し、脱塩のためＭＣＸ ９６ウェルカートリッジ（３０μｍ、１０ｍｇ）に充填した。このカートリッジを、２．０％のギ酸溶液９００μＬ、９００μＬの水、および９００μＬのメタノールでそれぞれ洗浄し、結果として得られるペプチドを、５．０％の水酸化アンモニウムを含むメタノール溶液６００μＬで溶出した。溶出した溶液を、窒素ガスで乾燥させ、１．０％のＨＦＢＡを含むメタノール：水（１０：９０；ｖ／ｖ）１００μＬに再構成した。

試料解析のため、ペプチドを、ＭＲＭモードで作動したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ機器に充填した。ここでシグネチャーペプチドＫＨＮＬＧＨＧＨ（配列番号１）およびその内部標準物質ＫＨＮＬ［^１３Ｃ_６］ＧＨＧＨのイオン強度を記録した。これにより、血漿試料における二本鎖ＨＭＷＫの４６ｋＤａの軽鎖の相対量を計算した。

（ｉ）アッセイの検証（精度および正確性）
ヒトの血漿（ＳＣＡＴ１６９）で４６ｋＤａの軽鎖を定量化するための日中（ｎ＝６）、および日間（ｎ＝１８）の精度（Ｒ．Ｓ．Ｄ．（％））および正確性（ＲＥ（％））を、本明細書中に記載の方法を使用して決定した。以下の表７に示されるように、本明細書中に記載の方法を使用した日中および日間のアッセイの両方で決定した４６ｋＤのレベルは、試験した試料における４６ｋＤの理論的な濃度に非常に近い値である。これらの結果は、上述の４６ｋＤａの軽鎖のシグネチャーペプチドをバイオマーカーとして使用した、本明細書中記載のアッセイ方法の正確性を示している。

（ｉｉ）安定性の評価
ヒトの血漿試料を、本明細書中に記載の方法にしたがい、ＳＣＡＴ１６９チューブに回収した。これら試料を、４つの凍結融解サイクルにかけるか、または８時間卓上に保存した（４℃）。４６ｋＤａの軽鎖のシグネチャーペプチドを使用した上述のアッセイ方法を行い、両方の試料における４６ｋＤの軽鎖のレベルを測定した。このようにして得られた結果は、二本鎖ＨＭＷＫ（４６ｋＤａの軽鎖により表される）は、ヒトの血漿試料で安定であることを示す。表８。

（ｉｉｉ）疾患診断および予後診断におけるアッセイ方法の使用
血漿試料を、健常なヒトの対象およびＨＡＥの患者から、ＳＣＡＴ１６９チューブに回収した。上述のアッセイ方法を行い、これらヒトの血漿試料において二本鎖ＨＭＷＫのレベルを測定した。図７に示されるように、ＨＡＥ患者における二本鎖ＨＭＷＫのレベルは、健常なヒトの対象のレベルよりも有意に高かった。この結果は、二本鎖ＨＭＷＫおよびそのいずれかの構成成分（たとえば４６ｋＤａの軽鎖）が、ＨＡＥの診断および／または予後診断にとって信頼できるバイオマーカーとして作用できることを示している。

他の実施形態
本明細書中に開示されるすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせてもよい。本明細書中に開示される各特徴は、同一、均等、または類似の目的を果たす代替的な特徴に置き換えてもよい。よって特段明記されない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の均等なまたは類似の特徴の単なる例である。

上述の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に突き止めることができ、かつ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な応用および条件に本発明を適合させるために、本発明に様々な変化および修正を行うことができる。よって他の実施形態も特許請求の範囲内にある。

均等論
いくつかの本発明の実施形態を本明細書中で説明および例示してきたが、本明細書中記載される機能を行い、かつ／または本明細書中に記載の結果および／もしくは利点の１つもしくは複数を得るための、様々な他の手段および／または構造を、当業者は容易に想定するものであり、このような変更および／または修正のそれぞれは、本明細書中記載の本発明の実施形態の範囲内にあるとされている。より広い意味では、当業者は、本明細書中記載されるすべてのパラメータ、次元、材料、および構成が例示的なものであることを意味し、実際のパラメータ、次元、材料、および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の用途（単数または複数）に依拠するものであることを、容易に認識するものである。当業者は、単なる通常の実験を使用して、本明細書中記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するものであり、または突き止めることができるであろう。よって、上述の実施形態が単なる例示として提示されており、添付の特許請求の範囲内およびその均等物の範囲内にあれば、本発明の実施形態を、特に記載かつ請求されているもの以外で実施できることが理解されている。本開示の本発明の実施形態は、本明細書中記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法のそれぞれを目的としている。さらに、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法のうち任意の２つ以上の組み合わせは、当該特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾するものではない場合、本開示の発明の範囲内に含まれている。

本明細書中定義および使用されているすべての定義は、辞書上の定義、参照として援用されている書類での定義、および／または定義される用語の通常の意味を超えるものとして理解すべきである。

本明細書および特許請求の範囲で使用されている不定冠詞の「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、反対の意味が明記されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。

本明細書および特許請求の範囲で使用されている「および／または」との文言は、等位結合している複数の要素、すなわち、場合によっては結合して提示され、他の場合では選言的に提示されている複数の要素のうちの「いずれかまたは両方」を意味することを理解すべきである。「および／または」と共に列挙されている複数の要素は、同じ形式で解釈されるべきであり、すなわち、結合している複数の要素のうちの「１つまたは複数」と解釈されるべきである。特に同定されている要素に関連するかまたは関連していないかどうかに関わらず、「および／または」の節により特に同定された要素以外の他の要素が、任意に存在してもよい。よって、非限定的な例として、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのオープンエンドの言語と組み合わせて使用する場合、「Ａおよび／またはＢ」との呼称は、一実施形態ではＡのみ（任意にＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）；さらなる別の実施形態ではＡおよびＢの両方（任意に他の要素を含む）などを表すことができる。

本明細書および特許請求の範囲内で使用されているように、「または」は、上記に定義した「および／または」と同じ意味を有することを理解すべきである。たとえば、ある列挙において複数の項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的、すなわち、ある数の要素または複数の要素の列挙のうちの少なくとも１つだけでなく１超の要素、および任意に列挙されていない追加的な項目をも含むと、解釈すべきである。「～のうちの１つのみ」もしくは「～のうちのちょうど１つ」などの反対の用語が明記されている場合のみ、または特許請求の範囲で使用される場合に、「～からなる」は、ある数の要素または複数の要素の列挙のうち正確に１つの要素を含むことを表す。一般的に、本明細書中使用される用語「または」は、「いずれか」、「～のうちの１つ」、「～のうちの１つのみ」、または「～のうちのちょうど１つ」などの排他的な用語に先行する場合、単に、排他的な選択肢（すなわち「１つまたはその他だが両方ではない」）を表すと解釈すべきである。特許請求の範囲で使用する場合、「～から本質的になる」は、特許法の範囲内で使用される通常の意味を有するものである。

本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、１つまたは複数の要素の列挙に関する「少なくとも１つ」との文言は、複数の要素の列挙における要素のうちのいずれか１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、必ずしも、この要素の列挙の中に特に列挙されたありとあらゆる要素のうちの少なくとも１つを含むものではなく、要素の列挙における複数の要素のいずれかの組み合わせを排除するものではないことを意味すると、理解されるべきである。またこの定義は、特に同定された要素に関連するかまたは関連していないかに関わらず、文言「少なくとも１つ」が表す複数の要素の列挙の中に特に同定された要素以外の要素が任意に存在し得ることを許容するものである。よって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または同等に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」または同等に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、任意に１超のＡを含む少なくとも１つのＡ（ここでＢは存在しておらず、かつＢ以外の要素を任意に含む）；別の実施形態では、任意に１超のＢを含む少なくとも１つのＢ（ここでＡは存在せず、かつＡ以外の要素を任意に含む）；さらなる別の実施形態では、任意に１超のＡを含む少なくとも１つのＡおよび任意に１超のＢを含む少なくとも１つのＢ（および他の要素を任意に含む）などを表すことができる。

また、反対の意味が明記されていない限り、１超のステップまたは行為を含む本明細書中請求されるいずれかの方法において、この方法のステップまたは行為の順序は、当該方法のステップまたは作用が記載されている順序に必ずしも限定されるものでないことを、理解すべきである。

特許請求の範囲および上記の明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「～から構成される」などのすべての移行句は、オープンエンド、すなわち、記載の項目を含むがこれらに限定されないことを意味することが理解されている。「～からなる」および「～から本質的になる」の移行句のみが、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２１１１．０３に記載されるように、それぞれクローズド、または半クローズドの移行句とされている。

Claims (26)

1. 試料において、切断された高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）を検出するための方法であって、
   （ｉ）ＨＭＷＫを含む疑いのある試料をプロテアーゼと接触させて、複数の消化されたペプチドを産生させるステップと、
   （ｉｉ）前記複数の消化されたペプチドにおいて、切断されたＨＭＷＫの４６ｋＤａの軽鎖または５６ｋＤａの軽鎖を表すシグネチャーペプチドのレベルを測定するステップと、
   を含み、
   前記４６ｋＤａの軽鎖を表すシグネチャーペプチドがＫＨＮＬＧＨＧＨ（配列番号１）、ＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥ（配列番号２）、ＫＨＮＬＧＨＧＨＫ（配列番号３）、またはＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥＲ（配列番号４）であるか、あるいは
   前記５６ｋＤａの軽鎖を表すシグネチャーペプチドがＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）であり、
   前記プロテアーゼは、前記試料においてＨＭＷＫから、切断されたＨＭＷＫの４６ｋＤａの軽鎖または５６ｋＤａの軽鎖を表すシグネチャーペプチドを産生させることができるプロテアーゼである、
   方法。
2. 前記プロテアーゼが、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、カテプシンＧ、およびエンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 完全長のＨＭＷＫを表すシグネチャーペプチドのレベルを測定するステップをさらに含み、前記プロテアーゼがさらに、完全長のＨＭＷＫを表すシグネチャーペプチドを産生させることができる、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記完全長のＨＭＷＫを表すシグネチャーペプチドは、
   ＧＨＥＫＱＲＫＨ（配列番号６）；
   ＫＱＲＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥ（配列番号７）；
   ＤＷＧＨＥＫＱＲＫＨＮＬＧＨＧＨＫＨＥＲ（配列番号１７）；
   ＨＮＬＧＨＧＨＫ（配列番号９）；または
   ＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）
   である、請求項３に記載の方法。
5. 前記切断されたＨＭＷＫを表すシグネチャーペプチドのレベル、前記完全長のＨＭＷＫを表すシグネチャーペプチドのレベル、またはその両方を、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により測定する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記試料が、ヒトの対象から得られた生体試料である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記生体試料が、血液試料または血漿試料であり、任意選択で、前記生体試料は、正常な血漿試料、ＦＸＩＩａにより活性化された血漿試料、または活性化されていない血漿試料であってもよい、請求項６に記載の方法。
8. 前記ヒトの対象が、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）を有する、または有する疑いがある、請求項６または７に記載の方法。
9. 前記生体試料が、プロテアーゼ阻害剤の混合物を含む液体製剤を含む、真空採血管に回収された血漿試料であり、任意選択で、前記真空採血管は、抗凝固剤を含むチューブであってもよい、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
10. ステップ（ｉ）が、
    （ａ）還元剤の存在下で行われ、任意選択で、前記生体試料は、９０℃で１時間、前記還元剤と共にインキュベートされてもよい；および／または
    （ｂ）プロテアーゼ阻害剤、抗凝固剤、またはプロテアーゼ阻害剤と抗凝固剤の両方、の非存在下で行われる、
    請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. （ｉｉｉ）前記ヒトの対象が遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）を有するかどうかを決定するステップであって、規定の参照値と比較して、前記ヒトの対象から得られた生体試料における上昇したレベルの切断されたＨＭＷＫが、前記ヒトの対象がＨＡＥを有することを表す、ステップ；または
    （ｉｖ）前記ヒトの対象にＨＡＥの発作のリスクがあるかどうかを決定するステップであって、規定の参照値と比較して、前記ヒトの対象から得られた生体試料における上昇したレベルの切断されたＨＭＷＫが、前記ヒトの対象にＨＡＥの発作のリスクがあることを表す、ステップ；
    をさらに含む、請求項６～９のいずれか１項に記載の方法。
12. 試料において完全長の高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）と切断されたＨＭＷＫとを区別するための方法であって、
    （ｉ）完全長のＨＭＷＫおよび／または切断されたＨＭＷＫを含む疑いのある試料をプロテアーゼと接触させて、複数の消化されたペプチドを産生させるステップと、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）から得た第１の消化されたペプチドのレベルを測定するステップであって、前記第１の消化されたペプチドが完全長のＨＭＷＫと比較して切断されたＨＭＷＫに固有である、ステップと、
    （ｉｉｉ）ステップ（ｉ）から得た第２の消化されたペプチドのレベルを測定するステップであって、前記第２の消化されたペプチドが、低分子量キニノーゲン（ＬＭＷＫ）と比較してＨＭＷＫに固有である、ステップと、
    （ｉｖ）前記第１の消化されたペプチドと前記第２の消化されたペプチドとの間の比率を決定するステップと、
    （ｖ）ステップ（ｉｖ）で決定した比率に基づき、前記試料において、切断されたＨＭＷＫを完全長のＨＭＷＫと区別するステップと、
    を含み、
    前記第１の消化されたペプチドがＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）であり、前記第２の消化されたペプチドがＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）であり、
    前記プロテアーゼは、前記試料においてＨＭＷＫから前記第１の消化されたペプチドおよび前記第２の消化されたペプチドを産生させることができるプロテアーゼである、
    方法。
13. 前記プロテアーゼが、グルタミン酸残基の後ろを切断する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記プロテアーゼが、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－ＣまたはカテプシンＧである、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 前記第１の消化されたペプチドおよび前記第２の消化されたペプチドを、ＬＣ－ＭＳにより測定する、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記試料が、ヒトの対象から得られた生体試料である、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記生体試料が、血液試料または血漿試料であり、任意選択で、前記生体試料は、正常な血漿試料、ＦＸＩＩａにより活性化された血漿試料、または活性化されていない血漿試料であってもよい、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ヒトの対象が、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）を有する、または有する疑いがある、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 前記生体試料が、プロテアーゼ阻害剤の混合物を含む液体製剤を含む、真空採血管に回収された血漿試料であり、任意選択で、前記真空採血管は、抗凝固剤を含むチューブであってもよい、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. ステップ（ｉ）が還元剤の存在下で行われ、任意選択で、前記生体試料は、９０℃で１時間、前記還元剤と共にインキュベートされる、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. ステップ（ｉ）が、プロテアーゼ阻害剤、抗凝固剤、またはプロテアーゼ阻害剤と抗凝固剤の両方、の非存在下で行われる、および／または
    ステップ（ｉ）において、プロテアーゼ／タンパク質の比率が１：２０である、
    請求項１２～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. （ｖｉ）前記ヒトの対象がＨＡＥを有するかどうかを決定するステップであって、規定の参照値と比較して、前記ヒトの対象から得られた生体試料における上昇したレベルの切断されたＨＭＷＫが、前記ヒトの対象がＨＡＥを有することを表す、ステップ；または
    （ｖｉ）前記ヒトの対象にＨＡＥの発作のリスクがあるかどうかを決定するステップであって、規定の参照値と比較して、前記ヒトの対象から得た生体試料における上昇したレベルの切断されたＨＭＷＫが、前記ヒトの対象にＨＡＥの発作のリスクがあることを表す、ステップ；
    をさらに含む、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の方法。
23. 遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）を有する、またはＨＡＥのリスクがある、対象を同定するための方法であって、
    （ｉ）対象の生体試料をプロテアーゼと接触させて複数の消化されたペプチドを産生させるステップと、
    （ｉｉ）前記複数の消化されたペプチドにおいて第１のシグネチャーペプチドのレベルを測定するステップであって、前記第１のシグネチャーペプチドが、切断されたＨＭＷＫを表す、ステップと、
    任意選択で（ｉｉｉ）前記複数の消化されたペプチドにおいて第２のシグネチャーペプチドのレベルを測定するステップであって、前記第２のシグネチャーペプチドが完全長のＨＭＷＫを表す、ステップと、
    任意選択で（ｉｖ）前記第１のシグネチャーペプチドと前記第２のシグネチャーペプチドとの間の比率を決定するステップと、
    （ｖ）前記切断されたＨＭＷＫのレベルまたは前記第１のシグネチャーペプチドと前記第２のシグネチャーペプチドとの間の比率に基づき、前記対象がＨＡＥを有する、またはＨＡＥの発作のリスクがあるかどうかを決定するステップであって、規定の参照値と比較して、前記生体試料における上昇したレベルの切断されたＨＭＷＫまたは上昇した前記第１のシグネチャーペプチドと前記第２のシグネチャーペプチドとの間の比率が、前記対象がＨＡＥを有する、またはＨＡＥの発作のリスクがあることを表す、ステップと、
    を含み、
    前記第１のシグネチャーペプチドがＫＨＮＬＧＨＧＨ（配列番号１）またはＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）であり、
    前記プロテアーゼは、前記試料においてＨＭＷＫから前記第１のシグネチャーペプチドおよび前記第２のシグネチャーペプチドを産生させることができるプロテアーゼである、
    方法。
24. 前記プロテアーゼがキモトリプシンであり、前記第１のシグネチャーペプチドがＫＨＮＬＧＨＧＨ（配列番号１）である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記プロテアーゼがエンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃまたはカテプシンであり、前記第１のシグネチャーペプチドがＳＳＲＩＧＥ（配列番号５）であり、前記第２のシグネチャーペプチドがＳＹＹＦＤＬＴＤＧＬＳ（配列番号１０）である、請求項２３に記載の方法。
26. （ｉ）前記第１のシグネチャーペプチド、前記第２のシグネチャーペプチド、またはその両方を、ＬＣ－ＭＳにより測定する；および／または
    （ｉｉ）前記生体試料が血液試料または血漿試料である、
    請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。

Images