CN108602877A

CN108602877A - 区分全长高分子量激肽原（hmwk）和裂解的hmwk的肽定量测定法

Info

Publication number: CN108602877A
Application number: CN201680079865.9A
Authority: CN
Inventors: 吴江; 张国栋; 丹尼尔·J·塞克斯顿; R·福塞特; G·M·穆斯塔法; M·塞韦克
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2016-12-15
Publication date: 2018-09-28
Also published as: IL259995B2; JP2024026847A; US20210025898A1; WO2017106504A1; KR20180134838A; AU2016372159B2; IL259995A; JP7425117B2; BR112018012165A2; US20230408528A1; JP2022141640A; EP3390439A1; IL297850A; EA201891414A1; AU2016372159A1; JP2019505185A; JP7092669B2; CA3008621A1; US11668718B2; NZ743482A

Abstract

本文提供了用于区分样品中全长高分子量激肽原(HMWK)和裂解的HMWK的方法。这种方法可包括用蛋白酶处理生物样品以产生多种消化肽和测量一种或多种标签肽，所述标签肽指示裂解的HMWK和/或全长HMWK。

Description

区分全长高分子量激肽原(HMWK)和裂解的HMWK的肽定量测定法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年12月15日递交的美国临时申请第62/267，743号的权益，其全部内容通过引用纳入本文。

背景技术

激肽原(kininogen)是激肽如缓激肽和胰激肽的前体。存在两种类型的人激肽原，即高分子量激肽原(HMWK)和低分子量激肽原(LMWK)，它们是剪接变体。HMWK主要作为凝血和炎症的辅因子，并且是用于血浆激肽释放酶(pKal)介导的缓激肽生成的优选底物。HMWK和LMWK都是半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

HMWK是循环的血浆蛋白质，它参与引发血液凝固。HMWK也能通过血管舒缓素激肽系统产生血管扩张缓激肽。HMWK粘附在内皮、单核细胞和血小板的细胞表面受体上，从而导致局部化凝血和缓激肽产生。从HMWK释放的活性肽缓激肽表现出多种生理效应。如平滑肌收缩、血压过低、多尿、血糖水平降低，它是炎症的调节剂且具有心脏防护作用，直接地通过缓激肽作用、间接地通过源自内皮细胞的舒血管因子作用。缓激肽是疼痛、炎症、水肿和血管生成的主要调节剂。

血浆激肽释放酶(pKal)是循环中主要的缓激肽生成酶。pKal的激活通过与疾病病理学相关的接触系统发生，所述疾病病理学与遗传性血管性水肿(HAE)相关。pKal裂解HMWK(单链多肽)以产生缓激肽和裂解形式的HMWK，其含有通过二硫键保持在一起的两条多肽链(重链和轻链)。Cugno等，Blood(1997)89：3213-3218。初始裂解的HMWK中的轻链为约56kDa，它可以进一步被裂解以形成46kDa更短的形式。

在遗传性血管性水肿(HAE)发作期间，裂解的HMWK增加至总激肽原的约47％，使其成为监测HAE发作的生物标志物(Cugno等，1997)。因此，开发灵敏和可靠的用于检测生物样品中裂解HMWK的水平的测定法是有意义的。

发明内容

本公开至少部分地基于灵敏和选择性的测定方法的开发，所述方法可以涉及液相色谱-质谱分析(LC-MS)，例如使用多反应监测(MRM)来区分全长HMWK和裂解的HMWK。这种测定方法利用指示裂解的HMWK(例如，来自重链的C-末端肽或来自轻链的N-末端肽)和/或全长HMWK(例如，相对于低分子量激肽原)的标签肽。

因此，本公开的一个方面提供用于检测样品中裂解的高分子量激肽原(HMWK)的方法，所述方法包括：(i)提供疑似含有HMWK的样品；(ii)使样品与蛋白酶接触以产生多种消化肽；和(iii)测量多种消化肽中标签肽的水平，其中所述标签肽指示裂解的HMWK。

在一些实施方案中，标签肽指示裂解的HMWK的46kDa轻链，包括但不限于：KHNLGHGH(SEQ ID NO:1)、KHNLGHGHKHE(SEQ ID NO:2)、KHNLGHGHK(SEQ ID NO:3)或KHNLGHGHKHER(SEQ ID NO:4)。

在一些实施方案中，标签肽指示裂解的HMWK的56kDa轻链，例如，SSRIGE(SEQ IDNO:5)。

本文描述的方法可进一步包括测量指示全长HMWK的标签肽的水平，该标签肽包括但不限于：GHEKQRKH(SEQ ID NO:6)、KQRKHNLGHGHKHE(SEQ ID NO:7)、DWGHKQRKHNLGHGHKHER(SEQ ID NO:8)、HNLGHGHK(SEQ ID NO:9)或SYYFDLTDGLS(SEQ IDNO:10)。

在另一方面，本公开特征为区分样品中全长高分子量激肽原(HMWK)和裂解的HMWK的方法。所述方法包括：(i)提供疑似含有全长HMWK和/或裂解的HMWK的样品；(ii)使样品与蛋白酶接触以生成多种消化肽；(iii)测量从步骤(ii)中获得的第一消化肽(例如，SSRIGE：SEQ ID NO:5)的水平，其中与全长HMWK相比，所述第一消化肽是裂解的HMWK特有的(例如，裂解的HMWK的标签肽)；(iv)测量从步骤(ii)中获得的第二消化肽的水平，其中与低分子量激肽原(LMWK)相比，所述第二消化肽(例如，SYYFDLTDGLS：SEQ ID NO:10)是HMWK特有的(例如，HMWK的标签肽)；(v)确定第一消化肽与第二消化肽之间的比值；及(vi)基于步骤(v)中确定的比值区分样品中裂解的HMWK和全长HMWK。

在本文所描述的任何测定方法中，用于消化样品中HMWK的蛋白酶可以是胞内蛋白酶胰凝乳蛋白酶、胞内蛋白酶Glu-C、胞内蛋白酶Asp-N、组织蛋白酶G、或者胞内蛋白酶Lys-C。在一些实施方案中，可以通过液相色谱-质谱分析(LC-MS)例如MRM-MS测量任何标签肽。

待通过本文所描述的任何测定方法分析的样品是从人类受试者、例如患有或疑似患有遗传性血管性水肿(HAE)的人类患者获得的生物样品(例如，血液样品或血浆样品或血清样品)。在一些实例中，生物样品可以是正常的血浆样品、FXIIa激活的血浆样品、或未激活的血浆样品。当生物样品是血浆样品时，生物样品可以被收集在抽真空的血液收集管中(例如，样品收集抗凝管、“SCAT管”)，其包括含有蛋白酶抑制剂混合物的液体制剂。

在一些实施方案中，本文所描述的任何测定方法的蛋白酶消化步骤可以在还原剂的存在下进行，该还原剂例如为DTT、BME或TCEP。例如，生物样品可以与还原剂一起在90℃孵育1小时。在一些实例中，蛋白酶消化步骤可以在缺少蛋白酶抑制剂、抗凝剂(例如，柠檬酸盐)或蛋白酶抑制剂和抗凝剂两者的情况下进行。在一些实例中，蛋白酶/蛋白质的比值为约1:20，例如Glu C/蛋白质是1:20。

任何所述测定方法可以被应用于HAE的诊断和/或预后。相应地，本公开也提供用于鉴定患有HAE的人类受试者或者为处于HAE发作风险中的HAE患者的人类受试者的方法。在一些实施方案中，可以凭借通过本文描述的测定方法而测定的裂解的HMWK(例如，重链-轻链二聚体、重链或轻链，如46kDa轻链或56kDa轻链)的水平来确定人类受试者是否患有HAE或处于HAE发作的风险中，其中，升高水平的裂解的HMWK指示HAE或HAE发作的风险。在其他实施方案中，凭借通过本文描述的测定方法而确定的裂解的HMWK的标签肽和HMWK的标签肽之间的比值来确定人类受试者是否患有HAE或处于HAE发作的风险中，其中，升高水平的这种比值指示HAE或HAE发作。

在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据以下附图和数个实施方案的详细描述以及所附权利要求，本发明的其他特征或优点将是显而易见的。

附图说明

图1为示出在优化的温度通过MRM分析在血浆和商业上可获得的HMWK(HK)样品中发现的裂解的HMWK的酶消化获得的示例性肽(例如，56kDa轻链)的图。这个图从顶部到底部分别重复描述了SEQ ID NO:5、19、24和21。

图2为示出通过在25℃和37℃Glu C消化HMWK标准品而产生的肽的图，该标准品从Sigma(HK_Sigma)或Enzyme Research(HK_Enzyme Research)获得。这个图从顶部到底部分别描述了SEQ ID NO:5、19、24、30、29和7。

图3包括示出使用靶向测定MRM定量源自蛋白酶消化正常的血浆样品和HAE血浆样品中的56kDa轻链的肽SSRIGE(SEQ ID NO:5)的图表。

图4包括示出使用靶向测定MRM定量正常的血浆样品和HAE血浆样品中的HMWK长肽的图表。

图5为示出在Glu C-消化的HMWK和血浆样品中SSRIGE(SEQ ID NO:5)/SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)的比值的图表。

图6为示出使用曲线峰值下面积的SSRIGE(SEQ ID NO:5)/SYYFDLTDGLS(SEQ IDNO:10)的平均比值的图表。

图7示出用于区分HAE患者与健康个体的裂解的HMWK(以46kDa轻链表示)的浓度的图表。

具体实施方案

血浆激肽释放酶(PKal)是接触系统的丝氨酸蛋白酶组分，并且是循环中主要的缓激肽生成酶。在暴露于外来的或带负电荷的表面时通过因子XIIa(因子XII或FXII的活性形式)或者在内皮细胞表面上通过脯氨酰羧肽酶，接触系统被激活(Sainz I.M.等，ThrombHaemost 98，77-83，2007)。血浆激肽释放酶的激活通过其因子XII的反馈激活而放大内在凝固，并且蛋白水解裂解激肽原前体、高分子量激肽原(HMWK)，释放促炎性九肽缓激肽和裂解的HMWK，其含有通过二硫键连接的两条多肽链(也称为2-链HMWK)。

作为循环中的主要激肽原酶，血浆激肽释放酶主要负责脉管系统中缓激肽的生成。C1-抑制蛋白(C1-INH)的遗传缺陷导致遗传性血管性水肿(HAE)。具有HAE的患者遭受通常由未知触发物引发的疼痛性水肿的急性发作(Zuraw B.L.等，N Engl J Med 359，1027-1036，2008)。通过在动物模型中使用药理学试剂或基因研究，血浆激肽释放酶-激肽系统(血浆KKS)已经涉及多种疾病。

高分子量激肽原(HMWK)作为分子量约110kDa的单个多肽(1-链)多结构域(结构域1-6)蛋白质存在于血浆中。HMWK在结构域4内被pKal裂解以释放9个氨基酸的促炎性肽-缓激肽和HMWK的2-链形式(裂解的激肽原)。HMWK的两个链是包含HMWK的结构域1-3的重链，以及包含HMWK的结构域5和6的轻链。该重链的分子量为大约65kDa，而轻链以分子量大约56kDa和46kDa的两个种类存在。

发现裂解的HMWK(例如，2-链HMWK)的水平在HAE发作以及其他pKal相关疾病中升高。因此，裂解的HMWK可以充当用于监测疾病发展和/或治疗功效的生物标志物。然而，本领域缺乏可以有效区分完整的HMWK与其裂解形式的合适的试剂和/或合适的测定法。

本公开至少部分地基于指示裂解的HMWK，例如2-链HMWK的轻链(例如，46kDa轻链)的标签肽和指示HMWK(例如，全长HMWK)的标签肽的发现。除非另外指明，否则术语“裂解的HMWK”指本文所描述的2-链二聚体、二聚体的重链、或二聚体的轻链(包括56kDa轻链和46kDa轻链)。根据这类标签肽的发现，开发灵敏和选择性的测定方法来测量相对于HMWK的裂解的HMWK。本文所描述测定方法可以用于临床的应用(例如HAE的诊断或预后)和非临床的应用，例如用于研究和临床前药物开发目的。

I.测量裂解的HMWK的方法

在一些方面，本文描述了用于测量样品中裂解的HMWK的方法，例如，区分样品中裂解的HMWK和全长HMWK。这种方法可以涉及用适当的蛋白酶处理疑似含有全长HMWK、裂解的HMWK或全长HMWK和裂解的HMWK两者的适当的样品以产生多种消化肽，和测量指示裂解的HMWK和/或全长HMWK的一种或多种标签肽的水平。裂解的HMWK的水平、或者裂解的HMWK和全长HMWK之间的比值可以用于指示样品中pKal的活性，该活性与HAE或HAE发作风险相关。

(i)全长HMWK和裂解的HMWK

编码HMWK的人类基因是激肽原1(KNG1)。KNG1被转录和可替选地剪接以形成编码HMWK或低分子量激肽原(LMWK)的mRNA。下面提供了HMWK和LMWK的示例性蛋白质序列(缓激肽的区域被突出和加粗表示)：

>gi|156231037|ref|NP_001095886.1|激肽原-1同种型1前体[智人(Homosapiens)]

>gi|4504893|ref|NP_000884|激肽原-1同种型2前体[智人]

下面提供了裂解的激肽原的重链和轻链的示例性序列：

>裂解的激肽原-1重链(在上文SEQ ID NO:11中斜体区域)

>裂解的激肽原-1轻链(56kDa)(在上文中SEQ ID NO:11加粗区域)

>裂解的激肽原-1轻链(46KD)(在上文SEQ ID NO:11中斜体和加粗区域)

(ii)样品制备

可以通过本文所描述的方法分析可能含有HMWK(例如，全长HMWK、裂解的HMWK或它们两者)的任何样品。如本文所用，“样品”是指可以包含感兴趣的分析物(在本申请中HMWK)的组合物。样品可以包含来自受试者的组织，例如，血液、血浆或蛋白质。样品可以包括取自受试者的初始未处理样品以及随后处理的样品，例如，部分的纯化或保存的形式，例如通过免疫沉淀反应。示例性样品包括血液、血浆、眼泪或粘液。在其他实例中，样品可以是体外分析的组合物。

在一些实施方案中，样品是体液样品，例如血清样品或血浆样品。这样的样品可以是从需要分析的受试者获得的生物样品。待通过本公开方法治疗的“患者”、“受试者”或“宿主”(这些术语可交换使用)可指人或非人动物。在一些例子中，受试者是可以具有与接触系统相关的疾病、疑似具有与接触系统相关的疾病或处于与接触系统相关的疾病的风险的人类患者。例如，人类患者可以具有在先的HAE发生或可以处于HAE的风险中。这样的人类患者可以被预先治疗或处于药物治疗的过程中，该药物靶向接触系统的组分(例如，pKal或FXIIa或高分子量激肽原)。

生物样品可以是体液样品，例如血液样品或血浆样品。用在本文所描述的方法中的血浆样品可以在抽真空的血液收集管(例如，样品收集抗凝管或SCAT管)中收集和处理，其通常用于医疗实践中来收集用于各种用途的血液样品。本文所述的管可以是非玻璃管，其包括含有蛋白酶抑制剂混合物(蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail))的液体制剂。

在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂混合物可以包含至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂和至少一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂。至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂可以是血浆激肽释放酶抑制剂。这样的蛋白酶抑制剂混合物可以包含多种(例如2、3、4或5)丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中至少一种可以是胰蛋白酶抑制剂或人血纤维蛋白溶酶抑制剂。优选地，本文所描述的蛋白酶抑制剂混合物基本不含有在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂，也就是，在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂的活性相对于蛋白酶混合物的总体抑制活性是非实质性的。在一些例子中，在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂的数量可以少于混合物中总的蛋白酶抑制剂的5％(w/w)，例如少于2％、少于1％或少于0.5％。在一些例子中，蛋白酶抑制剂混合物完全不含在水溶液(例如，pH4-6的水溶液)中不稳定的蛋白酶抑制剂。在水溶液中不稳定的蛋白酶抑制剂的一个实例是PPACK II，也称为H-D-Phe-Phe-Arg-氯甲基酮。

下面的表格列出了示例性丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂，它们可以用于制备本文所描述的蛋白酶抑制剂混合物。

在一些实例中，容纳在抽真空的血液收集管中的蛋白酶抑制剂混合物包含至少一种(例如1、2或3种)丝氨酸蛋白酶抑制剂，其可以包括至少一种(例如1、2或3种)胰蛋白酶/血纤维蛋白溶酶抑制剂，或至少一种(例如1、2或3种)半胱氨酸蛋白酶抑制剂。这样的蛋白酶抑制剂混合物可以包含三种丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如，苄脒、AEBSF和如大豆胰蛋白酶抑制的胰蛋白酶/血纤维蛋白溶酶抑制剂)和一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂(例如，亮抑酶肽)。

在其他实例中，蛋白酶抑制剂混合物可以包含至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如，血浆激肽释放酶抑制剂)和至少一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂(例如，亮抑酶肽)。血浆激肽释放酶抑制剂可以是EPI-KAL2(Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp GlyPro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys GluGlu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu GluCys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp；SEQ ID NO:16)，EPI-KAL2是一种特殊的血浆激肽释放酶、重组型蛋白酶抑制剂，其使得所述管能够含有允许使用如免疫测定法测定激活的血浆激肽释放酶的试剂。

任何蛋白酶抑制剂混合物可以溶入适当的溶液中以形成液体制剂。这样适当的溶液可以是酸-柠檬酸盐-右旋糖溶液，其包含柠檬酸三钠、柠檬酸和右旋糖。溶液可以具有约4-6的pH值，例如，pH4.5。液体制剂可进一步包含如海美溴铵分子的阳离子聚合物其通过与带负电荷的表面相互作用降低接触系统激活；和螯合剂(例如，EDTA)，其可以抑制金属蛋白酶。

在混合物中每一种蛋白酶抑制剂的浓度可以是这种抑制剂用来抑制相应的蛋白酶的最终浓度的5X或10X，实践中取决于稀释的倍数。特定的商业化蛋白酶抑制剂的最终浓度在本领域中是已知的，且可以根据生产商的方案获得。在一些实例中，EPI-KAL2的浓度范围可以为5μM-15μM(例如，5μM-10μM或10μM-15μM)，亮抑酶肽的浓度范围可以为200μM-300μM(例如，200μM-250μM、240μM-270μM或250μM-300μM)；大豆胰蛋白酶抑制剂的浓度范围可以是1mg/ml-3mg/ml(例如，1mg/ml-2mg/ml或2mg/ml-3mg/ml)；苄脒的浓度范围可以是80mM-120mM(例如，80mM-100mM或者100mM-120mM)；和/或AEBSF的浓度范围可以是10mM-30mM(例如，10mM-20mM或20mM-30mM)。

当使用基于肽的蛋白酶抑制剂(例如，EPI-KAL2)时，该抑制剂可以根据传统的方法论进行生物素化。例如，肽抑制剂可以如下生物素化。简要来说，肽抑制剂可溶解在适当的溶液如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。新鲜配制的磺基-NHS-LC-生物素可被加入到肽抑制剂溶液中并在冰上孵育合适的时间段。过量的未反应的和水解的生物素可用旋转脱盐柱去除。肽抑制剂的标记可以通过ELISA确认，且蛋白质浓度可以通过Bradford测定法测定。

本文所描述的任何一种液体制剂可以通过常规方法准备，例如将合适的组分溶解到适当的溶液中，并且放置于抽真空的血液收集管中，优选地，收集管为非玻璃的。在使用之前适当的时段内，该收集管可以在-20℃储存且可以在冰上解冻(thawed)或者在冰箱中解冻。

在具体的实例中，本文所描述的方法中所使用的抽真空的血液收集管是SCAT管，包括如下详述的SCAT 169和SCAT 153：

●SCAT169：抽真空的总体积5mL的塑料管，其包含(0.5ml)：溶解在酸-柠檬酸盐-右旋糖(100mM柠檬酸三钠、67mM柠檬酸和2％右旋糖，pH4.5)中的100mM苄脒、400μg/mL2mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂、20mM EDTA、263μM亮抑酶肽、和20mMAEBSF(4-(2-氨乙基)苯磺酰基氟化物盐酸盐)。

●SCAT153：抽真空的总体积5mL的塑料管，其包含(0.5ml)：溶解在酸-柠檬酸盐-右旋糖(100mM柠檬酸三钠、67mM柠檬酸和2％右旋糖，pH4.5)中的10μM生物素化的EPI-KAL2、400μg/mL 20mM EDTA和263μM亮抑酶肽。

血液收集后，在适当的时段内(例如，不超过1小时)处理血液样品以制备血浆样品。血浆样品可以进行进一步分析来评估与受试者的接触系统相关的特征，从所述受试者获得最初的血液样品。

(iii)蛋白酶消化

本文所描述的生物样品，例如按照本文所描述的方法制备的全血浆样品，可以用适当的蛋白酶处理来产生多种消化肽。可替选地，包括全长和裂解形式的HMWK蛋白质可在蛋白酶消化之前例如通过如免疫沉淀反应从样品中富集，或通过甲醇崩解(methanolcrash)变性。

任何适当的蛋白酶可用于本文所描述的方法。优选地，蛋白酶在特定的基序/残基处裂解蛋白质，使得消化肽可依据蛋白质的氨基酸序列被识别。在一些实例中，在该方法中使用的蛋白酶在谷氨酸残基后裂解。示例性蛋白酶包括但不限于胞内蛋白酶Glu-C或组织蛋白酶G。在其他实例中，在本文所描述的测定方法中使用的蛋白酶在天冬氨酸残基前裂解，如核酸内切酶Asp-N；或在赖氨酸残基后裂解，如核酸内切酶Lys-C。在另一个实例中，在本文所描述的测定方法中使用的蛋白酶在携带大的疏水性侧链的氨基酸残基(例如，酪氨酸、色氨酸或苯基丙氨酸)后裂解。这样的蛋白酶的一个例子是胰凝乳蛋白酶。

蛋白酶裂解反应可在允许完全消化样品中的全长和裂解的HMWK蛋白质的适当条件下执行。在一些实施方案中，蛋白酶裂解反应混合物可含有合适浓度(例如，1mM、0.5mM、0.1mM或0.05mM)的还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)、b-巯基乙醇(BME)或三(羧乙基)膦(TCEP)。举例来说，当使用DTT时，其浓度可以是0.1mM或0.05mM。蛋白酶裂解反应可以在适当的温度(例如，25℃、37℃、50℃、55℃或90℃)进行适当的时段(例如，30min、60min、-90min或180min)。

在一些实例中，含有还原剂的混合物可以在高温孵育适当的时段(例如，在55℃孵育30’或60’；或在90℃孵育30’或60’)，以允许样品中的蛋白质完全变性。然后可以将蛋白酶添加到该混合物中，且在适当的温度执行消化反应适当的时段。精确的消化温度/时间将取决于在本方法中使用的特定的蛋白酶，这在本领域技术人员掌握的知识范围之内。在一个实例中，使用Glu C酶且可以在25℃或37℃进行消化反应过夜(例如，12小时、14小时、17小时或19小时)。在另一实例中，使用胰凝乳蛋白酶且可以在40℃-60℃(例如，50℃)进行消化反应适当的时段，如2-5小时(例如，3小时)。

反应混合物可以不含蛋白酶抑制剂、抗凝剂(如柠檬酸盐)或它们两者。在反应中酶/蛋白质比值范围可以在1:5-1:30的范围内，例如，1:5、1:10、1:20、1:25或1:30。特定的反应条件包括温度、反应时间段、酶/蛋白质比值、蛋白酶抑制剂的存在/不存在、抗凝剂的存在/不存在、以及还原剂的存在/不存在的选择，可以取决于所使用的蛋白酶类型和待处理的样品，其可以通过本领域已知的方法或本文所描述的方法来确定。

(vi)标签肽的测量

标签肽指从蛋白酶反应产生的消化肽，与其他类型的激肽原相比，标签肽对于一种类型的激肽原是特有的。这样的肽可基于在本文所描述的方法中使用的蛋白酶的特异性和不同类型激肽原的氨基酸序列来识别。参见，如本文公开的内容。相对于第二类型的激肽原(如裂解的激肽原)，对于第一类型的激肽原(如全长激肽原)特有的肽(标签肽)，指仅可通过使用蛋白酶裂解第一类型的激肽原产生而不可通过使用相同的蛋白酶裂解第二类型的激肽原产生的肽。例如，裂解的HMWK的标签肽(例如，裂解的HMWK的重链或轻链，如46kDa轻链)指仅可从蛋白酶消化裂解的HMWK(例如，裂解的HMWK的重链或轻链)产生而不可通过相同的蛋白酶消化全长HMWK产生的肽。类似地，全长HMWK的标签肽是仅可通过蛋白酶消化单链HMWK产生而不可通过使用相同的蛋白酶消化裂解的HMWK产生的肽。HMWK的标签肽指通过蛋白酶消化HMWK(单链HMWK、双链HMWK或它们两者)产生而不可通过使用相同的蛋白酶消化LMWK产生的肽。

用于裂解的HMWK的示例性标签肽包括：(a)56kDa轻链的标签肽，如SSRIGE(SEQ IDNO:5)，其可以通过Glu-C消化产生，和(b)46kDa轻链的标签肽，如KHNLGHGH(SEQ ID NO:1)、KHNLGHGHKHE(SEQ ID NO:2)、KHNLGHGHKHER(SEQ ID NO:4)或KHNLGHGHK(SEQ ID NO:3)，其分别可以通过胰凝乳蛋白酶消化、Glu-C消化、Asp-N消化和Lys-C消化产生。

下表1列出通过不同蛋白酶产生的用于裂解的HMWK的46kDa轻链的示例性标签肽：

表1:来源于以多种酶消化HMWK的标签肽：

HMWK(如全长HMWK)的示例性标签肽包括但不限于：GHEKQRKH(SEQ ID NO:6)，其可以通过胰凝乳蛋白酶消化产生；KQRKHNLGHGHKHE(SEQ ID NO:7)和SYYFDLTDGLS(SEQ IDNO:10)，其可通过Glu-C消化产生；DWGHKQRKHNLGHGHKHER(SEQ ID NO:8)，其可以通过Asp-N消化产生和HNLGHGHK(SEQ ID NO:9)，其可以通过Lys-C消化产生。

感兴趣的消化肽的水平可以使用如本领域已知的或本文所描述的适当的方法来测量。在一些实施方案中，这种感兴趣的肽可以通过免疫测定法使用对于感兴趣的肽特异性的抗体测定，如对于KHNLGHGH(SEQ ID NO:1)、SSRIGE(SEQ ID NO:5)和/或SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)特异性的抗体。可用来评估本文所描述的感兴趣的肽的水平的免疫测定法，包括Western印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)(如，夹心ELISA)、放射性免疫测定、基于电化学发光的检测测定和相关技术。例如Western印迹测定法的测定法可以进一步涉及使用定量成像系统，例如可商购的LICOR成像技术(参见，例如来自LI-COR Biosciences的CLx红外线成像系统)。在一些实施方案中，使用电化学发光检测测定法或依赖于电化学发光和图案化阵列技术的组合的测定法(例如来自Meso Scale Discovery(MSD)的ECL或MULTI-ARRAY技术测定法)。

如本文所用，术语“测量(measuring)”或“测量(measurement)”或可替选地“检测(detecting)”或“检测(detection)”意思是评估样品中物质的存在、缺少、数量或量(其可以是有效量)，包括推导这样的物质的定性或定量的浓度水平，或以其他方式评估受试者的值或分类。

“特异性结合”感兴趣的肽的抗体是本领域公知的术语，并且确定此类特异性结合的方法在本领域中也是众所周知的。如果抗体与特定的靶肽比其与替代肽更频繁、更快速地以更长持续时间和/或更高亲和力反应或缔合，则该抗体被认为是表现出“特异性结合”。通过阅读该定义也可以理解，例如，特异性结合至第一靶肽的抗体可以特异性或优先结合至第二靶肽或可以不特异性或优先结合至第二靶肽。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定要求(尽管它可以包括)独占结合。通常但不一定，提及结合意味着优先结合。在一些实例中，“特异性结合”至靶肽或其表位的抗体可不结合相同抗原中的其他肽或其他表位。

如本文所用的，术语“抗体”指包括至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质。例如，抗体可包括重(H)链可变区(本文缩写为V_H)和轻(L)链可变区(本文缩写为V_L)。在另一实例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab和sFab片段、F(ab')₂、Fd片段、Fv片段、scFv和结构域抗体(dAb)片段(de Wildt等，Eur J Immunol.1996；26(3):629-39.))以及完整抗体。抗体能够具有IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(同其亚类)的结构特征。抗体可来自任何来源，但优选的是灵长类动物(人或非人灵长类动物)和灵长类动物源化的(primatized)抗体。

在一些实施方案中，本文所描述的抗体可缀合至可检测的标记，以及可以基于从可检测的标记中释放的信号的强度确定检测试剂与感兴趣的肽的结合。可替选地，可以使用对于检测试剂特异的二级抗体。一种或更多种抗体可结合成可检测的标记。本领域中已知的任何适当的标记可用在本文所描述的测定方法中。在一些实施方案中，可检测的标记包含荧光团。如本文所用，术语“荧光团”(也称为“荧光标记”或“荧光染料”)指以限定的激发波长吸收光能并以不同波长发射光能的部分(moiety)。在一些实施方案中，检测部分是酶或包含酶。在一些实施方案中，酶是由无色的底物制造有色的产物的酶(例如，β-半乳糖苷酶)。

在其他实施方案中，如本文所描述的感兴趣的肽可通过液相色谱-质谱分析(LC-MS)方法来测量，液相色谱-质谱分析(LC-MS)方法是将液相色谱的物理分离能力与质谱(MS)的质量分析能力结合的一种分析技术。

多反应监测(MRM)-质谱法是用于复杂的生物样品中蛋白质/肽丰度的靶向定量的高度灵敏和选择性的方法。MRM-质谱法通常用于小分子的分析。在此，MRM使得能够量化复杂混合物中的蛋白质，从而提供了一种灵敏的且选择性的工具来验证在疾病过程中的候选生物标志物。对于这种方法，可以使用诸如ABSciex 5500或6500QTrap质谱仪的适当的仪器，并且在方法优化后评估各种类型的血浆样品之间的差异性。单独的血浆样品用适当的蛋白酶如胰凝乳蛋白酶或Glu-C消化，以获得如本文所描述的用于裂解的HWMK或HWMK的标签肽。

每一种标签肽的水平(例如，浓度)(例如，用AUC表示)可以通过常规方法确定。必要时，相对于全长HMWK的裂解的HMWK的标签肽与相对于LMWK的HMWK的标签肽的比值可以相应地进行计算。这样的比值可以用来区分裂解的HMWK与全长HMWK的存在。

例如，已发现相对于来自健康人类受试者的血浆样品，来自HAE患者的血浆样品中的通过胰凝乳蛋白酶消化产生的2-链HMWK的46kDa轻链的标签肽，KHNLGHGH(SEQ ID NO:1)的浓度高得多。这些结果表明由这种标签肽表示的2-链HMWK的46kDa轻链是用于HAE的诊断和预后的可靠的生物标志物。

在另一实例中，由于通过MRM针对Glu C消化的HMWK标准品和样品证实所有包括HMWK和LMWK标签肽(SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10))的肽，发现在本研究中在血浆中出现的靶肽归因于HMWK。当与正常的SCAT血浆相比时，观察到在HAE SCAT血浆中的SSRIGE(SEQ IDNO:5)肽的显著增加，并且，在FXIIa激活的血浆与未激活的血浆之间相比，也观察到增加，其中HMWK肽没有变化。还发现当与正常的SCAT血浆样品相比时，在HAE SCAT血浆样品中SSRIGE(SEQ ID NO:5)/SYYFDLTDGLS(SEQID NO:10)之间的比值较高，并且相对于未激活的血浆，在激活的血浆中该比值也较高。使用SSRIGE(SEQ ID NO:5)和SYYFDLTDGLS(SEQ IDNO:10)的比值的相对丰度比，对于正常SCAT血浆和HAE SCAT血浆分别是4.4和8.9，且相对于正常柠檬酸盐化的血浆和FXIIa激活的柠檬酸盐血浆分别是19.02和48.63。

缺乏激肽原的血浆(阴性对照)样品示出靠近SSRIGE(SEQ ID NO:5)肽的检测极限的低强度峰值，其预计可能是由于LMWK的存在。在血浆样品中，HMWK长肽KKIYPTVNCQPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGE(SEQ ID NO:18)也使用靶向测定法(MRM)测定。在正常SCAT血浆样品和HAE SCAT血浆样品之间以及在激活样品和未激活样品之间，HMWK长肽几乎没有变化。

II.试剂盒

本公开也提供了用于测量裂解的HMWK的标签肽的水平和/或用于区分样品中裂解的HMWK和全长HMWK的试剂盒，该样品例如是来自人类患者的生物样品。这样的试剂盒可以包含由一种或更多种适当的蛋白酶(例如，胰凝乳蛋白酶或Glu C)；对标签肽特异性的检测试剂，该标签肽可通过适当的蛋白酶消化产生；抽真空的血液收集管；和，任选的作为对照的裂解的激肽原标准品和/或完整的激肽原标准品。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含二级抗体和/或用于检测检测试剂与感兴趣的肽的结合的试剂。

在一些实施方案中，试剂盒可以包含依照本文所描述的任意方法使用的使用说明。包括的使用说明可以包含如何使用用于测量蛋白酶处理的样品中标签肽的水平的试剂盒所容纳的组分的描述。

关于试剂盒的使用的使用说明通常包括关于用于执行本文所描述的测定方法的各个组分的量和适当的条件的信息。在本发明试剂盒中提供的使用说明通常为在标签或包装说明书(例如，在试剂盒中包括的纸张)上的文字说明，但是机器可读的使用说明(例如，磁性和光存储盘上携带的使用说明)也是可接受的。

标签或包装说明书指示试剂盒用来测量裂解的HMWK的标签肽的水平和/或用来区分裂解的HMWK和全长HMWK。使用说明可提供用于实践本文所描述的任何方法。

本发明的试剂盒在适当的包装中。适当的包装包括但不限于小瓶(vial)、瓶、罐、柔性包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等等。

试剂盒可任选地提供附加组分诸如缓冲剂和解释信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或一份或多份包装说明书。在一些实施方案中，本公开提供包含上文所述试剂盒的内容物的制品。

III.测定方法的应用

(i)临床应用：疾病的诊断和预后

通过非活性位点和HMWK的结构域6相互作用，大约75-90％的循环的前激肽释放酶结合至HMWK。游离的以及HMWK-结合的活性pKal产生裂解的HMWK和缓激肽。生物标志物的适用性可以通过跟踪在存在或不存在急性HAE发作的情况下生物标志物的水平来证明。这些生物标志物的水平也可在缓激肽介导的水肿或pKal活性介导的其他疾病的发作期间被改变。

本文所描述的测定方法和试剂盒可以应用于疾病的评估，例如，疾病的诊断或预后。评估可包括识别处于如本文所描述的疾病风险或患有如本文所描述的疾病的受试者，例如，pKal-介导的紊乱，如HAE的受试者。评估也包括监测疾病的治疗，如评估pKal-介导的紊乱(如HAE)治疗的有效性。另外，评估可包括识别可通过pKal抑制剂治疗的疾病。

A.诊断

在一些实施方案中，执行测定方法和试剂盒以测定从候选的受试者(例如，疑似患有PKal-介导的紊乱、如HAE的人类患者)采集的生物样品(例如，血液样品或血浆样品)中裂解的激肽原和/或完整的激肽原的水平。裂解的HMWK(例如，2-链HMWK或其重链和/或轻链，包括56kDa轻链和46kDa轻链)的水平和/或裂解的HMWK的水平与完整的HMWK的水平之间的比值可以基于如本文所描述的裂解的HMWK的标签肽的水平和/或本文所描述的裂解的HMWK的标签肽和HMWK(例如，相对于LMWK)的标签肽之间的比值确定。这样标签肽的浓度或比值可以与预定的参考值或参考比值相比较，以确定受试者是否患有PKal-介导的紊乱(如HAE)或处于PKal-介导的紊乱(如HAE)的风险中。例如，如果候选受试者的样品中标签肽浓度或两种标签肽的比值是参考值/参考比值或高于参考值/参考比值，则受试者可被鉴定为患有PKal-介导的紊乱(如HAE)或处于PKal-介导的紊乱(如HAE)的风险中。

参考值/参考比值可以是如本文所描述的标签肽的对照水平或两种标签肽的比值。在一些实施方案中，对照值/对照比值表示在对照样品中标签肽的值/比值，对照样品诸如是从一个健康受试者或健康受试者群体(其优选地与候选受试者相同的物种)获得的样品(例如，血液或血浆样品)。如本文所用的，健康的受试者是在测量裂解的和/或完整的激肽原的水平时显然没有目标疾病(例如，PKal-介导的紊乱如HAE)的受试者或没有所述疾病病史的受试者。

在一些实施方案中，对照样品可从疾病静息期的人类HAE患者获得。相对于从这类对照样品获得的参考值/参考比值，升高的裂解的HMWK的标签肽的水平、或升高的裂解的HMWK的标签肽和HMWK的标签肽之间的比值，可以指示HAE发作的风险。

参考值/参考比值也可以是预定的值或比值。这类预定的值/比值可以表示在未患有目标疾病或者未处于目标疾病风险的受试者群体中的裂解的HMWK的标签肽(例如，2-链HMWK的46kDa轻链的标签肽)的值或如本文所描述的两种标签肽的比值。它也可表示在患有目标疾病(例如，处于疾病静息期)的受试者群体中的裂解的HMWK(例如，46kDa轻链)的标签肽的值(例如，浓度)或如本文所描述的两种标签肽的比值。

预定的值/比值可以采用多种形式。例如，它可以是单一的截止值，如中间值或平均值。在一些实施方案中，这种预定的水平可以基于比较组来建立，如一个确定的组已知患有目标疾病并且另一个确定的组已知不患有目标疾病。可替选地，预定的水平可以是一个范围，例如，表示在预定的百分比范围内的对照群体中感兴趣的两种肽的比值的范围。

如本文所描述的对照值/比值可通过常规技术确定。在一些实例中，对照值/比值可以通过对也如本文描述的对照样品执行常规的方法获得(例如，相同的用于获得如本文所描述的测试样品中两种感兴趣的肽的水平的测定法)。在其他实例中，感兴趣的标签肽的水平可以从对照群体的成员获得，并且结果可以通过如计算程序分析，以获得表示对照群体中裂解的激肽原和/或完整的激肽原的水平的对照水平(预定的水平)。

通过将从候选受试者获得的样品中如本文所描述的裂解的HMWK的标签肽的浓度或也如本文所描述的两种感兴趣的标签肽的比值与如本文所描述的参考比值进行比较，可以确定候选受试者是否患有PKal-介导的疾病(例如，HAE)或处于PKal-介导的疾病的风险中，或者确定HAE患者是否处于HAE发作的风险中。例如，如果候选受试者样品中裂解的HMWK的标签肽的值或两种感兴趣的标签肽的比值偏离参考值或参考比值(例如，与参考值或参考比值相比较增加)，则候选受试者可能被鉴定为患有疾病或处于疾病风险中，或HAE患者处于HAE发作的风险中。当参考值或参考比值表示在患有目标疾病的受试者群体中如本文描述的感兴趣的标签肽的值或比值范围时，候选者的样品中感兴趣的标签肽的落入该范围内的值或比值指示候选受试者患有目标疾病或处于目标疾病风险中。

如本文所用的，“升高的值/比值或在参考值/参考比值以上的值/比值”意味着标签肽的值或两种标签肽的比值比参考值或参考比值高，该参考值或参考比值如在对照样品中的相同标签肽或相同的两种标签肽的预定的临界比值。本文详细描述了对照水平。升高的感兴趣的标签肽的值或升高的感兴趣的两种标签肽的比值包括如下的值/比值，例如在参考值/参考比值的1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％以上或更高。

如本文所用的，“在参考值/参考比值以下的降低的值/比值”是指感兴趣的标签肽的水平或感兴趣的两种标签肽的比值低于参考值/参考比值，如在对照样品中感兴趣的相同标签肽或感兴趣的相同两种标签肽的预定的临界值。本文详细描述了对照水平。降低的标签肽的值或或两种标签肽的比值包括如下的值/比值，例如，比感兴趣的两种标签肽的参考比值低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。

在一些实施方案中，候选受试者是有pKal-介导的紊乱(例如，如HAE)症状的人类患者。例如，受试者具有水肿、肿胀，其中所述肿胀完全或主要是外周的；荨麻疹；发红、疼痛和没有感染迹象的肿胀；非组胺介导的水肿，肿胀的复发性发作或其组合。在其他实施方案中，受试者在收集样品时没有pKal介导的紊乱的症状、没有pKal介导的紊乱症状的历史或没有pKal介导的紊乱、例如HAE的病史。在其他实施方案中，受试者抵抗抗组胺疗法、皮质类固醇疗法、或抗组胺疗法和皮质类固醇疗法二者。

B.评估治疗效果

本文所描述的测定方法也可应用于评估治疗pKal介导的紊乱(例如，HAE)的效果。例如，多种生物样品(例如，血液或血浆样品)可以从受试者处收集，其中在治疗前和治疗后或者在治疗过程期间对受试者进行处理。标签肽的水平可通过如本文所述的任何测定方法测定，并且裂解的HMWK(例如，46kDa轻链)的标签肽的水平或裂解的-HMWK-特异性的肽和HMWK-特异性的肽的比值可以相应地被确定。如果裂解的HMWK(例如，对于46kDa轻链)的标签肽的值或两种标签肽的比值在治疗后或治疗期间减少(在后来收集的样品中裂解的HMWK(例如，46kDa轻链)的标签肽的水平或感兴趣的两种标签肽的比值相比于其在之前收集的样品中)，则指示这种治疗是有效的。在一些实例中，治疗涉及治疗剂，如本文所描述的激肽释放酶结合剂、如本文所描述的缓激肽B2受体拮抗剂或如本文所描述的C1-INH取代剂。治疗剂的例子包括但不限于DX-2930、SHP643或DX88。

如果受试者被鉴定为不响应治疗，则更高剂量和/或更高给药频率的治疗剂被施用至经鉴定的受试者。在一些实施方案中，在被鉴定为响应治疗或不需要进一步治疗的受试者中保持、降低或终止治疗剂的剂量或给药频率。可替选地，不同的治疗可被应用至被发现不响应第一治疗的受试者。

(ii)非临床应用

此外，本文所描述的测定方法具有非临床应用，例如，用于研究目的和/或临床前的药物开发目的。尽管与pKal相关的许多疾病已经被鉴定，但其他疾病通过类似的机制介导或涉及类似的成分是有可能的。在一些实施方案中，本文所描述的方法可用于鉴定与pKal相关的疾病。在一些实施方案中，本文所描述的方法可用于研究疾病的机制(例如发现疾病的发展中新的生物途径或过程)或疾病进展。

在一些实施方案中，在与pKal相关的疾病新的治疗药物(therapeutic)的研发中，可依赖通过本文所描述的测定方法测定的标签肽的水平或比值。例如，如本文所描述的标签肽的水平或比值可以从已施用新治疗药物(例如，临床试验)的受试者获得的样品测量，或从离体试验获得的样品测量。在一些实施方案中，标签肽的水平或比值可以指示在离体试验中新治疗药物的活性或在临床试验设置中新治疗药物的疗效。

不需进一步阐释，相信本领域技术人员可基于上述描述充分使用本公开。因此，下述具体实施方案仅仅解释为示意性的，并且不以任何方式限制本公开的其它部分。本文引用的所有公开出版物为了文中所提及的主题的目的通过引用并入本文。

实施例

实施例1：区分裂解的高分子量激肽原(HMWK)与全长HMWK的方法

本实施例的总体目标是开发一种用于基于LC-MS的肽定量测定的稳健方法，以区分全长激肽原(HK；单链或1-链HK)和激肽释放酶裂解的激肽原(两条链产物或2-链HK，以及两条链产物的重链和/或轻链)。在一些实施例中，这种半定量测定法测量2-链HK产物和1-链HK底物的比值以确定与患有与血浆激肽释放酶相关的疾病、如HAE的患者相比健康的志愿者的生物样品(例如，血浆)中2-链HK的分割点(cut-point)。

单链HMWK(1-链HK)和两条链HMWK(2HK)(Enzyme Research Laboratories andSigma)用作下文描述的实施例的标准品。不同类型的血浆样品(柠檬酸盐、柠檬酸盐+蛋白酶抑制剂(PI)、正常的SCAT血浆(收集在SCAT管中的健康受试者的血浆样品)，以及HAESCAT血浆(收集在SCAT管中的HAE患者的血浆样品))在下文描述的实施例中使用。参见，例如，PCT/US2016/046681，其相关的公开内容通过引用并入文中。在运行(run)之间进行质量控制并且进行重现性检查以处理在不同的天数和不同的运行上的可变性。EDTA-血浆(Biochem Services)用做方法优化的对照。

本实施例中所描述的和开发的测定法提供了一种灵敏的和选择性的方法以验证在疾病过程中的候选生物标志物。对于该方法，使用ABSciex 5500或6500Qtrap质谱仪并且在方法优化后评估不同类型的血浆样品之间的差异性。单独的血浆样品(包括正常SCAT血浆和HAE SCAT血浆、缺乏激肽原的血浆、正常的柠檬酸盐化血浆、因子XIIa激活的正常的柠檬酸盐化血浆和HK标准品)用Glu C进行消化，并且对感兴趣的肽进行多反应监测(MRM)分析。Glu C被用作示例性的蛋白酶以获得区分1-链HK和2-链HK(标签肽)特有的肽。简要来说，初始实验被设计成使用MRM模式校验用于特定的肽的蛋白质标准品的质量。含有10μg蛋白质的10μl样品加样到C18柱中。选择通过天际线软件(Skyline software)预测的Glu C消化的血浆激肽原特有的前体和蛋白酶消化产物离子。对于血浆激肽原，通过经验验证目标候选肽SSRIGE(SEQ ID NO:5)、SSRIGEIKE mis 2(SEQ ID NO:19)、KKIYPTVNCQPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGE(SEQ ID NO:20)、KKIYPTVNCQPLGMISLMK(SEQ IDNO:21)和SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)以及3-5种产物离子。肽在使用天际线指导执行MRM之后，断裂能量和碰撞能量可单独优化。使用Analyst Software(ABSciex)分析数据。本方法的开发关注于优化样品的制备、对于不同类型的血浆样品和HK标准品的酶消化、色谱分析法和质谱分析参数。

(i)免疫沉淀反应样品与全血浆样品

为了验证校验概念的研究，通过免疫沉淀反应获得的4种蛋白质样品(IP样品)和4种全血浆样品(非-IP样品)用作研究。样品使用SDS洗脱，之后用清洁剂排除塔去除。在ABSciex 5500Qtrap三重四极质谱仪中进行靶向测定以检查样品中感兴趣的肽。

感兴趣的全部4种肽，SSRIGE(SEQ ID NO:5)、SSRIGEIKE(SEQ ID NO:19)、KKIYPTVNC QPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGE(SEQ ID NO:18)和KKIYPTVNCQPLGMISLMK(SEQ IDNO:21)，被发现在非-IP样品中，但在IP血浆样品中没有检出。在激活的血浆样品(通过FXIIa处理的)和未激活的血浆样品之间没有发现峰值差异。下面表2示出IP样品和非-IP样品中肽的峰值强度。在激活的或未激活的样品中，SSRRIGE(2HK轻链通过Glu C消化产生的特有的肽；SEQ ID NO:22)或KKIYPTVNC QPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGE(HK长肽通过Glu C消化产生的特有的肽；SEQ ID NO:18)的峰值强度没有差异(在框中的行表示)。

EDTA血浆作为阳性对照与IP/非-IP样品一起运行，且在两种类型的样品中发现全部感兴趣的肽。

表2：在IP样品和非-IP样品中5种感兴趣的肽的峰值强度

结果显示用Glu C消化的全血浆样品提供了足够灵敏度以检测1-链HK肽和2-链HK肽两者。因此，通过示例性的Glu C蛋白酶消化的全血浆样品被用在下文所述的实验中。

(ii)样品制备优化

(a)消化方案

为了优化血浆Glu C消化，各种方案被用来优化Glu C消化。方案的不同参数被修改总结如下：

-方案1：在消化前增加变性的步骤(存在如0.1M的DTT)

-方案2：使用不同浓度的还原剂(0.05M DTT)

-方案3：消化前样品稀释10倍；和

-方法4：增加酶的孵育时间到19小时。

基于峰值强度和峰形，方法2可以更好地检测到SSRIGE(SEQ IDNO:5)和KKIYPTVNCQPLGMISLMK(SEQ ID NO:21)。因此，方法2的消化方法用于随后的实验。

(b)还原温度和孵育时间

还优化还原温度和孵育时间。简要来说，HK标准品和EDTA-血浆用于评估温度(55℃与90℃)和孵育时间(30mins与60mins)，以在消化期间还原样品。

-HK：90℃持续1小时

-HK：55℃持续30分钟

-血浆EDTA(Biochem)：90℃持续1小时

-血浆EDTA(Biochem)：55℃持续30分钟

通过使用多反应监测(MRM)分析来分析样品，检测SSRIGE(SEQ ID NO:5)和KKIYPTVNCQPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGE(SEQ ID NO:20)肽。发现与样品(HK标准样品和血浆样品两者)在55℃还原30分钟相比，该样品在90℃还原1小时的峰值强度更高。包括在90℃孵育1hr的反应条件用于在随后的实验中还原样品。

(c)血浆中蛋白酶抑制剂(PI)和抗凝剂

还评估了血浆中PI和抗凝剂的存在对消化效率的影响。对于具有PI以及没有PI的血浆、以及也在含有柠檬酸盐作为抗凝剂的血浆与含有EDTA的血浆之间评估消化效率。样品通过MRM分析用AB Sciex5500Qtrap LC-MS/MS系统进行评估，并且对于SSRIGE(SEQ IDNO:5)比较峰值强度，如图3中箭头所指示。这些结果表明：

不含有PI的EDTA血浆>含有PI的EDTA血浆>不含有PI的柠檬酸盐化血浆>含有PI的柠檬酸盐化血浆。

这些结果也表明柠檬酸盐和蛋白酶抑制剂对于Glu C消化具有负面影响，因为在含有柠檬酸盐、PI或它们两者的样品中观察到肽响应的降低。

(iii)用于检查序列覆盖的不同酶消化

为了检查序列覆盖是否是酶依赖性的，使用不同的酶、胰蛋白酶。来自Sigma的HK标准样品和来自Biochem的EDTA-血浆样品用胰蛋白酶消化且在高分辨率精准质量仪器(HRAM)上运行，并且使用蛋白质组发现者(proteome discover)分析。使用ProteomeDiscoverer^TM软件分析结果。

用胰蛋白酶消化的HK样品和血浆样品两者都检测到全长激肽原具有良好的序列覆盖。

(iv)EDTA-血浆和HK样品的单离子监测(SIM)

具有较高浓度的HK和血浆样品被用于SIM，并且使用高分辨率精准质量(HRAM)仪器检测感兴趣的肽。对EDTA血浆和HK的sigma样品进行SIM-MS²数据分析。

在HRAM仪器上分析Glu C消化的EDTA血浆样品结果是检测到全部四种肽，SSRIGE(SEQ ID NO:5)、KKIYPTVNCQPLGMISLMK(SEQ ID NO:21)、HK长肽和缓激肽。关于HK标准样品，发现肽SSRIGE(SEQ ID NO:5)、KKIYPTVNCQPLGMISLMK(SEQ ID NO:21)和缓激肽，但没有发现HK长肽。

为了确认标准的同一性，使用两种不同来源的HK(EnzymeResearch和Sigma)。然而，本实验中在两个标准品之间没有观察到可检测的差异，并且HK长肽没有在任一个标准样品中检测到。

(v)不同类型的血浆、不同的Glu C和不同的酶与蛋白质比值

为了进一步优化Glu C的消化，对不同类型的血浆样品(EDTA、柠檬酸盐化、含有PI和不含有PI)、不同Glu C来源(Protea&Promega)和不同的酶：蛋白质比值(1:20和1:10)进行评估。此外，使用各种检测平台，包括全扫描、SIM-MS2(在HRAM上)、MRM(QQQ；三元四极仪器)检测不同样品中感兴趣的肽。表3示出用于本实验的样品类型、酶和稀释的各种组合的汇总。

表3：测试条件的汇总

样品类型	用于消化的酶	酶：蛋白质
			EDTA血浆(Biochem)	Protea Glu C和Promega Glu C	1:20和1:10
柠檬酸盐化的血浆(Sponsor)	Protea Glu C和Promega Glu C	1:20和1:10
			HK Sigma	Protea·Glu C和Promega Glu C	1:20和1:10
EDTA血浆(Biochem)+PI	Protea Glu C和Promega Glu C	1:20
			柠檬酸盐化血浆(Sponsor)+PI	Protea Glu C和Promega Glu C	1:20

(a)全扫描和SIM-MS²(HRAM)

用Glu C消化如上所述的不同类型的血浆和标准样品，并且在HRAM仪器上运行消化产物以用于全扫描和SIM-MS²。样品信息如彩色图例的右手侧所示。使用ProteomeDiscoverer^TM软件和Xcalibur^TM软件进行分析以确定每种感兴趣的肽的峰值强度。对于血浆样品，观察到以下对于SSRIGE(SEQ ID NO:5)的肽强度的响应：

确定了1：20(酶：蛋白质)比值比1：10(酶：蛋白质)比值可导致更好的响应。对于HK长肽，强度仅仅最小化地受到血浆类型或者酶：蛋白质比值的影响。在任何标准样品中没有观察到HK长肽；然而KKYIPTVNCQPLGMISLMK肽(SEQ ID NO:23)和缓激肽在全部标准品中都检测到，表明HK长肽可能被降解。不受任何特定理论的约束，这可以解释观察到HK长肽的各种片段，包括KKIYPTVNCQPLGMISLMK(SEQ ID NO:21)、RPPGFSPFR(SEQ ID NO:24)和SSRIGE(SEQ ID NO:5)。

下面表4示出在HRAM仪器上使用全扫描和SIM-MS²的数据的感兴趣的肽的强度(通过样品种类分类)。

表4：感兴趣的肽的强度

++++：高丰度

+++：中丰度

++：低丰度

+：非常低的丰度

+/-：可忽略的丰度

-：不存在

(b)多反应监测(MRM)靶向测定

使用如上所述的相同系列的样品，用靶向测定法(MRM)检测感兴趣的肽。使用ABSciex Qtrap 5500仪器检测之后，用AB SciexAnalyst软件分析样品。样品信息展示在彩色图的右手侧。

不管样品的类型和条件如何，一致地观察SSRIGE肽(SEQ ID NO:5)的检测。通过优化的样品制备，没有检测到SSRIGEKE(SEQ ID NO:25)肽。然而，HK长肽只在血浆样品中存在，在HK标准样品中不存在。KKYIPTVNCQPLGMISLMK(SEQ ID NO:23)肽和缓激肽在全部HK标准样品中存在，但没有检测到HK长肽。这些结果与上文所述的来自全扫描和MS²的数据集相似，并且暗示HK长肽可能被降解，进一步解释观察到上文所示的HK长肽片段。

下面表5示出使用AB Sciex Qtrap 5500仪器的MRM数据的感兴趣的肽的强度(通过样品列表分类)。

表5：感兴趣的肽的强度

++++：高丰度

+++：中丰度

++：低丰度

+：非常低的丰度

+/-：可忽略的丰度

-：不存在

(c)使用HRAM和Proteome DiscovererTM软件的序列覆盖

为了确定最佳的用于蛋白质消化的Glu C浓度，在来自不同来源的Glu C(Protea和Promega)和不同的酶：蛋白质浓度(1:20和1:10)消化后，通过在HRAM仪器上全扫描评估HK标准样品的序列覆盖。由于序列覆盖在感兴趣的区域更高，故1:20稀释任意来源的Glu C实现最佳消化。如以下提供，1:10稀释也提供在感兴趣的区域中的覆盖，但是肽有低的置信度分数。

在上述1-链HMWK的氨基酸序列中，以粗体显示的源自Glu-C的肽利用单离子鉴定，然而下划线表示的肽利用多离子鉴定。缓激肽用斜体加粗表示。

(vi)高分子量缓激肽(HMWK)和低分子量缓激肽(LMWK)的序列比对

为了鉴定与LMWK相比的HMWK特有的肽，这两种类型缓激肽的序列比对使用下文提供的UniProt软件进行(hHMWK:SEQ ID NO:11；hLMWK:SEQ ID NO:12)：

与LMWK相比，发现有四种肽对于HMWK是特有的：

1.SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)

2.INPTTQMKE(SEQ ID NO:26)

3.KQRKHNLGHGHKHE(SEQ ID NO:7)

4.EDSTTPSAQTQE(SEQ ID NO:27)

a.在HRAM上使用全扫描和MS²检测HK样品中HMWK特有的肽

从特有的肽SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)开始，使用Glu C-消化的HK标准品运行全扫描和MS²。全扫描和MS²在HRAM仪器上运行并且用Proteome Discoverer^TM软件分析。如下文示出，在HK标准品中检测到HMWK特有的肽，暗示HK标准品包含HMWK。

上面示出的HMWK的氨基酸序列中，HMWK特异性肽的位置用加粗和下划线表示。

b.通过MRM检测HK样品和EDTA血浆中HMWK特有的肽

为了确定标准品中HMWK的存在并且将其与血浆样品比较，在用于靶向分析的ABSciex 5500Qtrap上运行Glu C-消化的HK和Glu C-消化的血浆。使用MRM测定法在两种样品中都检测到HMWK特有的肽(SYYFDLTDGLS；SEQ ID NO:10)，然而肽的峰值强度在血浆中与HK标准品中相比较低。由于血浆的复杂性和高背景噪音，可以预测到这点。这些结果证实这些肽来自HMWK。

(vii)消化条件

a.在25℃和37℃用Glu C消化HK和血浆

评价在25℃而不是37℃用Glu C消化HK样品和血浆样品的效果。在HK标准品中检测到HMWK特有的肽，但是在标准品中没有检测到HK长肽。为了测试是否存在不完全消化或高温是否将HK标准品降解成缓激肽和KKYIPTVNCQPLGMISLMK(对于2HK重肽特异性的；SEQID NO:23)，在25℃而不是37℃用Glu C消化血浆和HK样品。使用MRM分析，靶向并且检测感兴趣的肽，包括HMWK特有的肽。峰值强度如下：

HK Sigma Glu C 25℃：

●SSRIGE(SEQ ID NO:5)：5960

●KKIYPTVNCQPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGE(SEQ ID NO:20)：4000

●SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10):7.6e4

HK酶研究(Enzyme Research)Glu C 25℃：

●SSRIGE(SEQ ID NO:5)：4.5e5

●SSRIGEIKE mis²(SEQ ID NO:19)：1.5e5

●KKIYPTVNCQPLGMISLMKRPPGFSPFRSSRIGE(SEQ ID NO:20)：2.3e5

●SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)：4.6e5

发现在25℃ Glu C消化的HK标准品(来自Enzyme Research和Sigma)导致检测到包括HK长肽的全部三种感兴趣的肽，表明高温降解标准品并且因此在37℃消化时没有观察到HK长肽。与从Sigma获得的标准品相比，从Enzyme Research获得的标准品产生更高的峰值强度。仅在Enzyme Research标准品中发现mis2裂解的肽SSRIGEIKE(SEQ ID NO:19)。关于血浆样品，结果表明在37℃的Glu C消化比在25℃的Glu C消化引起更好的消化效果。图1，在25℃使用标准品确认长肽和其他HMWK特有的肽表明在血浆样品中观察到的肽来自HK。

在25℃时在血浆样品中除了SSRIGE(SEQ ID NO:5)外没有检测到肽；然而正如所预计的在37℃消化的血浆样品中观察到全部感兴趣的肽(图1)。在25℃而不是在37℃时，在两种标准品中观察到HK长肽。

这些结果暗示对于标准样品在25℃时用Glu C消化较好，而对于血浆在37℃时消化效果更好。

a.使用高分辨率精准质量(HRAM)仪器的优化消化方法

25℃和37℃ Glu C-消化的样品(HK和血浆两者)也在HRAM仪器上全扫描评估以检测感兴趣的肽，包括HK长肽和HMWK特有的肽，进而确定另一检测平台是否可以用来检测在25℃消化的血浆样品中感兴趣的肽。

在25℃消化的HK标准样品和在37℃消化的血浆样品中检测到全部感兴趣的肽和HMWK特有的肽。该数据集与上文所述的MRM数据一致，除了mis 2裂解的肽SSRIGEIKE(SEQID NO:19)之外，该肽通常在来自Enzyme Research的HK标准品中看到。LMWK特有的肽YKGRPPKAGAE(SEQ ID NO:28)也包括该测定中并且在血浆样品而不是HK标准品中发现该肽，这与所预期的一致(图2、3)。

b.25℃时HK–全扫描的序列覆盖

HK标准品的序列覆盖使用优化的HK Glu C消化、Glu C来源和酶与蛋白质的比值进行评估。简要来说，在25℃时以1:20的酶：蛋白质比值进行的Glu C消化导致HK(源自Enzyme Research和Sigma两者)的显著改善的具有高置信度分数的序列覆盖，尤其在感兴趣的区域(HK长肽)。

在上面示出的HMWK的氨基酸序列中，HK长肽的位置用加粗和下划线表示。

c.在HRAM仪器上的全扫描和SIM

为了检测HK长肽，对在25℃消化的HK标准品使用HRAM仪器进行SIM和全扫描。在25℃消化后，在HRAM仪器上通过全扫描和SIM在HK标准品中观察到HK长肽。

(viii)对于在25℃Glu C消化，HMWK和LMWK-特有的肽

添加两种另外的HMWK特有的肽(相对于LMWK)INPTQMKE(SEQ ID NO:29)和SYYDDGLS(SEQ ID NO:30)，进行MRM分析以检测那些特有的肽。在25℃消化HK标准品(HKSigma和HK EnzymeResearch)后，观察到另外的HMWK特有的肽，证实HK的存在。

(ix)用优化的方法评估不同类型的样品之间的差异

a.使用靶向测定法(MRM)定量血浆样品中的SSRIGE(SEQ ID NO:5)

用Glu C消化单独的血浆样品，进行MRM分析以检测感兴趣的肽SSRIGE(SEQ IDNO:5)。样品类型包括正常的SCAT血浆样品和HAESCAT血浆样品、缺乏激肽原的血浆样品、正常的柠檬酸盐化血浆样品、因子XIIa激活的正常的柠檬酸盐化血浆样品和HK标准样品。

如图3示出，使用Analyst软件的定量程序量化SSRIGE(SEQ ID NO:5)肽。与正常的SCAT血浆样品相比，在HAE SCAT血浆样品中检测到SSRIGE(SEQ ID NO:5)肽的显著增加。与未激活的血浆样品相比，在激活的血浆中也存在SSRIGE(SEQ ID NO:5)肽的明显增加。缺乏激肽原的血浆样品显示最小量的SSRIGE(SEQ ID NO:5)肽，这是因为HMWK不存在而预计的。

b.使用靶向测定法(MRM)定量血浆样品中的HK长肽

用Glu C消化血浆样品，并且进行MRM分析以检测HK长肽。样品类型包括正常的SCAT血浆样品和HAE SCAT血浆样品、缺乏激肽原的血浆样品、正常的柠檬酸盐化血浆样品、因子XIIa激活的正常的柠檬酸盐化血浆样品和HK标准品。在正常的SCAT血浆样品和HAESCAT血浆样品之间所检测到的HK长肽存在极其最小量的变化。此外，在激活和未激活的样品之间未观察到区别。图4。

(x)评估Glu C消化的一致性和重现性

为了评估日复一日的Glu C消化的重现性，连续三天对HK标准品和血浆(血浆柠檬酸盐+PI)样品消化，并且进行MRM分析以检测感兴趣的肽(参见下面的表6A和表6B)。在HK标准品和血浆样品中存在全部感兴趣的肽，其具有指出的峰值强度。表6A和表6B。三天中每一天的对于HK标准品和血浆(血浆柠檬酸盐+PI)的Glu C消化数据具有一致性的结果。

表6A：连续三天HK与Glu C一起消化

表6B：连续三天血浆柠檬酸盐+PI和Glu C一起消化

(xi)SSRIGE(SEQ ID NO:5)和SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)之间的比值

a.计算SSRIGE(SEQ ID NO:5)与SYYFDLTDGLS肽(SEQ ID NO:10)的比值

通过在正常的血浆和患有HAE的个体的血浆中的靶向测定(MRM)，使用Glu C-消化的HK和血浆样品计算SSRIGE(SEQ ID NO:5)和SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)肽之间的比值。测量SSRIGE(SEQ ID NO:5)肽相对于HMWK特有的肽的比值，可以例如用在诊断测定中。通过使用软件量化肽的峰值下的面积计算全部比值和平均比值。

当与正常的SCAT血浆样品相比时，在HAE SCAT血浆样品中观察到SRIGE(SEQ IDNO:5)/SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)的比值整体增加。对于未激活的血浆，激活的血浆中SSRIGE(SEQ ID NO:5)/SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)的比值也有显著的增加(图5)。

b.SSRIGE(SEQ ID NO:5)和SYYFDLTDGLS肽(SEQ ID NO:10)之间的平均比值

使用MRM靶向测定法，在不同样品类型中计算的SSRIGE(SEQ ID NO:5)/SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)的平均比值为峰值下的面积(图6)。与正常的SCAT血浆样品相比，发现在HAE SCAT血浆样品中SSRIGE(SEQ ID NO:5)/SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)之间的平均比值较高。SSRIGE(SEQ ID NO:5)肽相对于HMWK和LMWK特有的肽SYYFDLTDGLS(SEQID NO:10)的该比值具有被用在测定中的潜能，该测定例如用于诊断与裂解的激肽原相关的疾病或紊乱或在来自健康个体和患病个体的样品之间进行区分。

(xii)使用HK标准品的LC-MS运行优化

为了增加方法的效果，通过优化梯度和缩短运行时间优化LC-MS运行。主要使用HK标准品进行LC-MS优化。如图6所示，从使用的各种LC-梯度和运行时间里给出了数个方法的结果。LC-MS方法成功地缩短运行时间至10min。当SYYFDLTDGLS肽(SEQ ID NO:10)作为单个峰而不是分裂峰出现时，左下方的色谱图呈现了“优化的方法”。发现对于比值计算必需的两种肽SSRIGE(SEQ ID NO:5)和SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)具有显著减少的运行时间。

(xiii)使用血浆样品的LC-MS运行优化

使用血浆样品验证上文所述的更短的LC-MS运行，其中检测到感兴趣的肽(SSRIGE(SEQ ID NO:5)和SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10))。使用16.5min运行的方法在HK标准品和血浆样品两者中检测到感兴趣的肽，所述方法比原始的方法(42min)有显著的改善。随着血浆样品复杂度的增加，两种肽的强度减少：EDTA血浆>柠檬酸盐化血浆>SCAT血浆。

实施例2：使用标签肽和LC-MS/MS定量HAE血浆中裂解的HWMK的46kDa轻链

在本实施例中所描述的示例性方法设计成测定在人类血浆中内源2-链HMWK(其可以通过46kDa轻链的水平表示)的浓度。所述方法包括捣碎25μL的血浆之后粒状消化(pellet digestion)、使用MCX SPE进一步纯化、并且用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。二维HPLC(Agilent Metasil AQ C18柱，5.0μm，2.1mm x 100mm(C/N A0530100X020)和AB Sciex QTrap 6500质谱仪在选择反应监测(SRM)模式在优化的条件下操作，以使用通过电喷雾电离形成的阳离子检测2-链HMWK的标签肽H₂N-KHNLGHGH-OH(SEQ ID NO:1)和稳定的标记的内标准品(SLIS)(KHNL[¹³C₆]GHGH)。

25μL人类血浆的等分试样与2.5μL的10％SDS、5μL的DTT(500mM)和蛋白质混合在37℃下还原60分钟。向该溶液中依次加入75μL和600μL甲醇以沉淀蛋白质。弃掉上清液并且再用700μL甲醇冲洗蛋白质颗粒。离心后，所述颗粒复溶在500μL碳酸氢铵缓冲液(100mM)中，强烈涡旋10分钟。加入25μL内标准品(KHNL[¹³C₆]GHGH，30ng/mL)的等分试样和5.0μL的碘乙酰胺溶液(500mM)并且使混合物在暗处保持30分钟。伴随着轻柔涡旋，蛋白质随后通过添加10μL的胰凝乳蛋白酶(8mg/mL)并且在50℃保持3小时进行消化。

所得到的混合物被酸化并且装入MCX 96-孔萃取柱(30μm，10mg)以进行脱盐。萃取柱分别用900μL的2.0％甲酸溶液、900μL水和900μL的甲醇冲洗，以及所得到的肽用600μL的-5.0％甲醇中的氢氧化铵洗脱。洗脱后的溶液在氮气中干燥并且复溶在100μL的含有1.0％HFBA的甲醇：水(10:90；v/v)中。

对于样品分析，将肽装入在MRM模式下操作的LC-MS/MS仪器中，其中，记录标签肽KHNLGHGH(SEQ ID NO:1)及其内标准品KHNL[¹³C₆]GHGH的离子强度。相应地计算血浆样品中2-链HMWK的46kDa轻链的相对含量。

(i)测定验证(精度和准确度)：

用本文所述的方法确定用于量化人类血浆(SCAT169)中46kDa轻链的日内(n＝6)和日间(n＝18)的精度(％R.S.D.)和准确度(％RE)。如下面表7示出，使用本文所述的方法在日内和日间测定中确定的46kD的水平非常接近测试样品中的46kD的理论浓度。这些结果表明本文所述的测定方法、使用上文所述的46kDa轻链的标签肽作为生物标志物的精确度。

表7：用于量化人类血浆(SCAT169)中的46kDa轻链的日内(n＝6)和日间(n＝18)的精度(％R.S.D.)和准确度(％RE)

(ii)稳定性评估

按照本文所述的方法将人类血浆样品收集在SCAT169管中。样品经历四次冷冻-解冻循环或在工作台上(4℃)保持8小时。进行本文所述的测定方法(使用46kD轻链标签肽)，以测量46kD轻链在两种样品中的水平。因此获得的结果表明2-链HMWK(由46kDa轻链表示)在人类血浆样品中是稳定的。表8。

表8：人类血浆(SCAT169)中2-链HMWK的稳定性测试(n＝3)

(iii)测定方法在疾病诊断和预后中的应用

将来自健康人类受试者和HAE患者的血浆样品收集到SCAT169管中。进行上文所述的测定方法以测量在这些人类血浆样品中2-链HMWK的水平。如在图7中所示，HAE患者的2-链HMWK水平显著高于健康人类受试者的2-链HMWK水平。结果表明2-链HMWK及其任何组分(如46kDa轻链)可用作用于HAE诊断和/或预后的可靠的生物标志物。

其他实施方案

本说明书中公开的所有特征可以任何组合方式进行结合。本说明书中公开的每个特征可被用于相同、等同的或类似的目的的替代特征替换。因此，除非另外明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是一般系列的等同或类似特征的一个例子。

根据上面的描述，本领域技术人员可以容易地确定本公开的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可对本发明作出各种改变和变型，以使其适应各种使用和条件。因此，其他实施方案也在权利要求的范围内。

等同内容

尽管本文已经描述和说明了几个创造性的实施方式，但是本领域普通技术人员将易于设想到多种其他的装置和/或结构来执行所述功能和/或获得本文描述的结果和/或一个或多个优点，并且这种改变和/或变型中的每一者被认为在文中描述的创造性实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将易于理解本文描述的全部参数、尺寸、材料和构造意指示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的具体的一个应用或多个应用。本领域技术人员将认识到或者仅仅利用常规实验就能够确定对于文中所描述的具体创造性实施方案的许多等同内容。因此，可以理解的是，前述的实施方案仅仅作为举例而呈现，且在所附的权利要求及其等同内容的范围内，除了具体描述和要求保护的实施方案外可以实践创造性的实施方案。本公开的创造性的实施方案旨在本文所描述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这种特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法并非相互矛盾，则两个或更多个这种特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合包括在本公开的创造性范围内。

如本文中限定的和使用的所有定义均应理解为优先于所定义术语的字典定义、通过引用并入的文件中的定义、和/或通常意义。

除非明确指出与此相反，否则说明书和权利要求中使用的不定冠词“一(a)”和“一(an)”应理解为指“至少一”。

在本文的说明书和权利要求书中使用的表述“和/或”应理解为指这样结合起来的要素中的“任一个或二者”，即在一些情况下联合性地存在而在一些情况下分离性地存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式理解，即这样结合起来的要素中的“一个或多个”。与通过“和/或”从句明确指出的要素不同，其他要素可任选地存在，不管其与明确指出的这些要素相关或不相关。因此，作为非限定性例子，提及“A和/或B”，当其与开放式语言、例如“包含”联用时，在一个实施方案中可以指仅有A(任选包括除B之外的要素)；在另一实施方案中指仅有B(任选包括除A之外的要素)；在又一实施方案中指A和B两者(任选包括其它要素)等等。

如本文在说明书和权利要求书中所用的，“或”应该理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分开列表中的项目时，“或”或“和/或”应该理解为包括的，即包括许多要素或一列要素中的至少一个，而且包括大于一个，以及任选地另外的未列出的项目。只有明确表示相反含义的术语，如“仅仅之一”或“恰好之一”或当在权利要求中使用“由...组成”时，将指包括许多要素或一列要素中中的恰好一个要素。通常，当前面有排它术语如“两者之一”、“其一”、“仅有其一”或“恰好其一”时，本文使用的术语“或”应该解释为表示排它的替代方案(即“一个或另一个，但非两者”)。“基本上由...组成”用在权利要求中时应具有其在专利法领域中所用的通常含义。

关于一个或多个要素的列表，如在本说明书和权利要求书中用到的表述“至少一个”应理解为指选自所述要素列表中的任意一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包含所述要素列表内明确列举的每个要素中的至少一个，也不排除所述要素列表中要素的任意组合。该定义还允许除了在词语“至少一个”所指的要素列表内的具体确定的要素之外，可任选存在其它要素，而无论与具体确定的那些要素相关或无关。因此，作为非限制性的例子，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”，或等同地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可表示至少一个A，任选地包括多于一个A，但不存在B(并且任选地包括除了B以外的要素)；在另一个实施方案中，可表示至少一个B，任选地包括多于一个B，但不存在A(并且任选地包括除了A以外的要素)；在又一个实施方案中，可表示至少一个A，任选地包括多于一个A，以及至少一B，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其它的要素)等。

还应该理解的是，除非另有相反的解释说明，否则在本文所要求保护的包括多于一个步骤或行为的任何方法中，所述方法的步骤或行为的顺序不一定限于所列举的方法的步骤或行为中的顺序。

在权利要求书中，以及上面的说明书中，所有连接词、例如“包含(comprising)”、“包括(including)”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“保持”、“包括(composed of)”及类似的词语可理解为开放式的，例如，指包括但不限于。只有连接词“由…组成(consistingof)”和“基本由…组成(consisting essentially of)”应该分别是封闭式或半封闭式的连接词，如在美国专利局专利审查手册章节2111.03中所提出的。

序列表

<110> 戴埃克斯有限公司

<120> 区分全长高分子量激肽原（HMWK）和裂解的HMWK的肽定量测定法

<130> D0617.70114WO00

<140> 尚未分配

<141> 2016-12-15

<150> US 62/267,734

<151> 2015-12-15

<160> 30

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

Lys His Asn Leu Gly His Gly His

1 5

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 2

Lys His Asn Leu Gly His Gly His Lys His Glu

1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 3

Lys His Asn Leu Gly His Gly His Lys

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

Lys His Asn Leu Gly His Gly His Lys His Glu Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 5

Ser Ser Arg Ile Gly Glu

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 6

Gly His Glu Lys Gln Arg Lys His

1 5

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 7

Lys Gln Arg Lys His Asn Leu Gly His Gly His Lys His Glu

1 5 10

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 8

Asp Trp Gly His Lys Gln Arg Lys His Asn Leu Gly His Gly His Lys

1 5 10 15

His Glu Arg

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 9

His Asn Leu Gly His Gly His Lys

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 10

Ser Tyr Tyr Phe Asp Leu Thr Asp Gly Leu Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 644

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 11

Met Lys Leu Ile Thr Ile Leu Phe Leu Cys Ser Arg Leu Leu Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Gln Glu Ser Gln Ser Glu Glu Ile Asp Cys Asn Asp Lys Asp

20 25 30

Leu Phe Lys Ala Val Asp Ala Ala Leu Lys Lys Tyr Asn Ser Gln Asn

35 40 45

Gln Ser Asn Asn Gln Phe Val Leu Tyr Arg Ile Thr Glu Ala Thr Lys

50 55 60

Thr Val Gly Ser Asp Thr Phe Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Ile Lys Glu

65 70 75 80

Gly Asp Cys Pro Val Gln Ser Gly Lys Thr Trp Gln Asp Cys Glu Tyr

85 90 95

Lys Asp Ala Ala Lys Ala Ala Thr Gly Glu Cys Thr Ala Thr Val Gly

100 105 110

Lys Arg Ser Ser Thr Lys Phe Ser Val Ala Thr Gln Thr Cys Gln Ile

115 120 125

Thr Pro Ala Glu Gly Pro Val Val Thr Ala Gln Tyr Asp Cys Leu Gly

130 135 140

Cys Val His Pro Ile Ser Thr Gln Ser Pro Asp Leu Glu Pro Ile Leu

145 150 155 160

Arg His Gly Ile Gln Tyr Phe Asn Asn Asn Thr Gln His Ser Ser Leu

165 170 175

Phe Met Leu Asn Glu Val Lys Arg Ala Gln Arg Gln Val Val Ala Gly

180 185 190

Leu Asn Phe Arg Ile Thr Tyr Ser Ile Val Gln Thr Asn Cys Ser Lys

195 200 205

Glu Asn Phe Leu Phe Leu Thr Pro Asp Cys Lys Ser Leu Trp Asn Gly

210 215 220

Asp Thr Gly Glu Cys Thr Asp Asn Ala Tyr Ile Asp Ile Gln Leu Arg

225 230 235 240

Ile Ala Ser Phe Ser Gln Asn Cys Asp Ile Tyr Pro Gly Lys Asp Phe

245 250 255

Val Gln Pro Pro Thr Lys Ile Cys Val Gly Cys Pro Arg Asp Ile Pro

260 265 270

Thr Asn Ser Pro Glu Leu Glu Glu Thr Leu Thr His Thr Ile Thr Lys

275 280 285

Leu Asn Ala Glu Asn Asn Ala Thr Phe Tyr Phe Lys Ile Asp Asn Val

290 295 300

Lys Lys Ala Arg Val Gln Val Val Ala Gly Lys Lys Tyr Phe Ile Asp

305 310 315 320

Phe Val Ala Arg Glu Thr Thr Cys Ser Lys Glu Ser Asn Glu Glu Leu

325 330 335

Thr Glu Ser Cys Glu Thr Lys Lys Leu Gly Gln Ser Leu Asp Cys Asn

340 345 350

Ala Glu Val Tyr Val Val Pro Trp Glu Lys Lys Ile Tyr Pro Thr Val

355 360 365

Asn Cys Gln Pro Leu Gly Met Ile Ser Leu Met Lys Arg Pro Pro Gly

370 375 380

Phe Ser Pro Phe Arg Ser Ser Arg Ile Gly Glu Ile Lys Glu Glu Thr

385 390 395 400

Thr Val Ser Pro Pro His Thr Ser Met Ala Pro Ala Gln Asp Glu Glu

405 410 415

Arg Asp Ser Gly Lys Glu Gln Gly His Thr Arg Arg His Asp Trp Gly

420 425 430

His Glu Lys Gln Arg Lys His Asn Leu Gly His Gly His Lys His Glu

435 440 445

Arg Asp Gln Gly His Gly His Gln Arg Gly His Gly Leu Gly His Gly

450 455 460

His Glu Gln Gln His Gly Leu Gly His Gly His Lys Phe Lys Leu Asp

465 470 475 480

Asp Asp Leu Glu His Gln Gly Gly His Val Leu Asp His Gly His Lys

485 490 495

His Lys His Gly His Gly His Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys

500 505 510

Asn Gly Lys His Asn Gly Trp Lys Thr Glu His Leu Ala Ser Ser Ser

515 520 525

Glu Asp Ser Thr Thr Pro Ser Ala Gln Thr Gln Glu Lys Thr Glu Gly

530 535 540

Pro Thr Pro Ile Pro Ser Leu Ala Lys Pro Gly Val Thr Val Thr Phe

545 550 555 560

Ser Asp Phe Gln Asp Ser Asp Leu Ile Ala Thr Met Met Pro Pro Ile

565 570 575

Ser Pro Ala Pro Ile Gln Ser Asp Asp Asp Trp Ile Pro Asp Ile Gln

580 585 590

Ile Asp Pro Asn Gly Leu Ser Phe Asn Pro Ile Ser Asp Phe Pro Asp

595 600 605

Thr Thr Ser Pro Lys Cys Pro Gly Arg Pro Trp Lys Ser Val Ser Glu

610 615 620

Ile Asn Pro Thr Thr Gln Met Lys Glu Ser Tyr Tyr Phe Asp Leu Thr

625 630 635 640

Asp Gly Leu Ser

<210> 12

<211> 427

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Met Lys Leu Ile Thr Ile Leu Phe Leu Cys Ser Arg Leu Leu Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Gln Glu Ser Gln Ser Glu Glu Ile Asp Cys Asn Asp Lys Asp

20 25 30

Leu Phe Lys Ala Val Asp Ala Ala Leu Lys Lys Tyr Asn Ser Gln Asn

35 40 45

Gln Ser Asn Asn Gln Phe Val Leu Tyr Arg Ile Thr Glu Ala Thr Lys

50 55 60

Thr Val Gly Ser Asp Thr Phe Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Ile Lys Glu

65 70 75 80

Gly Asp Cys Pro Val Gln Ser Gly Lys Thr Trp Gln Asp Cys Glu Tyr

85 90 95

Lys Asp Ala Ala Lys Ala Ala Thr Gly Glu Cys Thr Ala Thr Val Gly

100 105 110

Lys Arg Ser Ser Thr Lys Phe Ser Val Ala Thr Gln Thr Cys Gln Ile

115 120 125

Thr Pro Ala Glu Gly Pro Val Val Thr Ala Gln Tyr Asp Cys Leu Gly

130 135 140

Cys Val His Pro Ile Ser Thr Gln Ser Pro Asp Leu Glu Pro Ile Leu

145 150 155 160

Arg His Gly Ile Gln Tyr Phe Asn Asn Asn Thr Gln His Ser Ser Leu

165 170 175

Phe Met Leu Asn Glu Val Lys Arg Ala Gln Arg Gln Val Val Ala Gly

180 185 190

Leu Asn Phe Arg Ile Thr Tyr Ser Ile Val Gln Thr Asn Cys Ser Lys

195 200 205

Glu Asn Phe Leu Phe Leu Thr Pro Asp Cys Lys Ser Leu Trp Asn Gly

210 215 220

Asp Thr Gly Glu Cys Thr Asp Asn Ala Tyr Ile Asp Ile Gln Leu Arg

225 230 235 240

Ile Ala Ser Phe Ser Gln Asn Cys Asp Ile Tyr Pro Gly Lys Asp Phe

245 250 255

Val Gln Pro Pro Thr Lys Ile Cys Val Gly Cys Pro Arg Asp Ile Pro

260 265 270

Thr Asn Ser Pro Glu Leu Glu Glu Thr Leu Thr His Thr Ile Thr Lys

275 280 285

Leu Asn Ala Glu Asn Asn Ala Thr Phe Tyr Phe Lys Ile Asp Asn Val

290 295 300

Lys Lys Ala Arg Val Gln Val Val Ala Gly Lys Lys Tyr Phe Ile Asp

305 310 315 320

Phe Val Ala Arg Glu Thr Thr Cys Ser Lys Glu Ser Asn Glu Glu Leu

325 330 335

Thr Glu Ser Cys Glu Thr Lys Lys Leu Gly Gln Ser Leu Asp Cys Asn

340 345 350

Ala Glu Val Tyr Val Val Pro Trp Glu Lys Lys Ile Tyr Pro Thr Val

355 360 365

Asn Cys Gln Pro Leu Gly Met Ile Ser Leu Met Lys Arg Pro Pro Gly

370 375 380

Phe Ser Pro Phe Arg Ser Ser Arg Ile Gly Glu Ile Lys Glu Glu Thr

385 390 395 400

Thr Ser His Leu Arg Ser Cys Glu Tyr Lys Gly Arg Pro Pro Lys Ala

405 410 415

Gly Ala Glu Pro Ala Ser Glu Arg Glu Val Ser

420 425

<210> 13

<211> 362

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Gln Glu Ser Gln Ser Glu Glu Ile Asp Cys Asn Asp Lys Asp Leu Phe

1 5 10 15

Lys Ala Val Asp Ala Ala Leu Lys Lys Tyr Asn Ser Gln Asn Gln Ser

20 25 30

Asn Asn Gln Phe Val Leu Tyr Arg Ile Thr Glu Ala Thr Lys Thr Val

35 40 45

Gly Ser Asp Thr Phe Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Ile Lys Glu Gly Asp

50 55 60

Cys Pro Val Gln Ser Gly Lys Thr Trp Gln Asp Cys Glu Tyr Lys Asp

65 70 75 80

Ala Ala Lys Ala Ala Thr Gly Glu Cys Thr Ala Thr Val Gly Lys Arg

85 90 95

Ser Ser Thr Lys Phe Ser Val Ala Thr Gln Thr Cys Gln Ile Thr Pro

100 105 110

Ala Glu Gly Pro Val Val Thr Ala Gln Tyr Asp Cys Leu Gly Cys Val

115 120 125

His Pro Ile Ser Thr Gln Ser Pro Asp Leu Glu Pro Ile Leu Arg His

130 135 140

Gly Ile Gln Tyr Phe Asn Asn Asn Thr Gln His Ser Ser Leu Phe Met

145 150 155 160

Leu Asn Glu Val Lys Arg Ala Gln Arg Gln Val Val Ala Gly Leu Asn

165 170 175

Phe Arg Ile Thr Tyr Ser Ile Val Gln Thr Asn Cys Ser Lys Glu Asn

180 185 190

Phe Leu Phe Leu Thr Pro Asp Cys Lys Ser Leu Trp Asn Gly Asp Thr

195 200 205

Gly Glu Cys Thr Asp Asn Ala Tyr Ile Asp Ile Gln Leu Arg Ile Ala

210 215 220

Ser Phe Ser Gln Asn Cys Asp Ile Tyr Pro Gly Lys Asp Phe Val Gln

225 230 235 240

Pro Pro Thr Lys Ile Cys Val Gly Cys Pro Arg Asp Ile Pro Thr Asn

245 250 255

Ser Pro Glu Leu Glu Glu Thr Leu Thr His Thr Ile Thr Lys Leu Asn

260 265 270

Ala Glu Asn Asn Ala Thr Phe Tyr Phe Lys Ile Asp Asn Val Lys Lys

275 280 285

Ala Arg Val Gln Val Val Ala Gly Lys Lys Tyr Phe Ile Asp Phe Val

290 295 300

Ala Arg Glu Thr Thr Cys Ser Lys Glu Ser Asn Glu Glu Leu Thr Glu

305 310 315 320

Ser Cys Glu Thr Lys Lys Leu Gly Gln Ser Leu Asp Cys Asn Ala Glu

325 330 335

Val Tyr Val Val Pro Trp Glu Lys Lys Ile Tyr Pro Thr Val Asn Cys

340 345 350

Gln Pro Leu Gly Met Ile Ser Leu Met Lys

355 360

<210> 14

<211> 255

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Ser Ser Arg Ile Gly Glu Ile Lys Glu Glu Thr Thr Val Ser Pro Pro

1 5 10 15

His Thr Ser Met Ala Pro Ala Gln Asp Glu Glu Arg Asp Ser Gly Lys

20 25 30

Glu Gln Gly His Thr Arg Arg His Asp Trp Gly His Glu Lys Gln Arg

35 40 45

Lys His Asn Leu Gly His Gly His Lys His Glu Arg Asp Gln Gly His

50 55 60

Gly His Gln Arg Gly His Gly Leu Gly His Gly His Glu Gln Gln His

65 70 75 80

Gly Leu Gly His Gly His Lys Phe Lys Leu Asp Asp Asp Leu Glu His

85 90 95

Gln Gly Gly His Val Leu Asp His Gly His Lys His Lys His Gly His

100 105 110

Gly His Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys Asn Gly Lys His Asn

115 120 125

Gly Trp Lys Thr Glu His Leu Ala Ser Ser Ser Glu Asp Ser Thr Thr

130 135 140

Pro Ser Ala Gln Thr Gln Glu Lys Thr Glu Gly Pro Thr Pro Ile Pro

145 150 155 160

Ser Leu Ala Lys Pro Gly Val Thr Val Thr Phe Ser Asp Phe Gln Asp

165 170 175

Ser Asp Leu Ile Ala Thr Met Met Pro Pro Ile Ser Pro Ala Pro Ile

180 185 190

Gln Ser Asp Asp Asp Trp Ile Pro Asp Ile Gln Ile Asp Pro Asn Gly

195 200 205

Leu Ser Phe Asn Pro Ile Ser Asp Phe Pro Asp Thr Thr Ser Pro Lys

210 215 220

Cys Pro Gly Arg Pro Trp Lys Ser Val Ser Glu Ile Asn Pro Thr Thr

225 230 235 240

Gln Met Lys Glu Ser Tyr Tyr Phe Asp Leu Thr Asp Gly Leu Ser

245 250 255

<210> 15

<211> 207

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Lys His Asn Leu Gly His Gly His Lys His Glu Arg Asp Gln Gly His

1 5 10 15

Gly His Gln Arg Gly His Gly Leu Gly His Gly His Glu Gln Gln His

20 25 30

Gly Leu Gly His Gly His Lys Phe Lys Leu Asp Asp Asp Leu Glu His

35 40 45

Gln Gly Gly His Val Leu Asp His Gly His Lys His Lys His Gly His

50 55 60

Gly His Gly Lys His Lys Asn Lys Gly Lys Lys Asn Gly Lys His Asn

65 70 75 80

Gly Trp Lys Thr Glu His Leu Ala Ser Ser Ser Glu Asp Ser Thr Thr

85 90 95

Pro Ser Ala Gln Thr Gln Glu Lys Thr Glu Gly Pro Thr Pro Ile Pro

100 105 110

Ser Leu Ala Lys Pro Gly Val Thr Val Thr Phe Ser Asp Phe Gln Asp

115 120 125

Ser Asp Leu Ile Ala Thr Met Met Pro Pro Ile Ser Pro Ala Pro Ile

130 135 140

Gln Ser Asp Asp Asp Trp Ile Pro Asp Ile Gln Ile Asp Pro Asn Gly

145 150 155 160

Leu Ser Phe Asn Pro Ile Ser Asp Phe Pro Asp Thr Thr Ser Pro Lys

165 170 175

Cys Pro Gly Arg Pro Trp Lys Ser Val Ser Glu Ile Asn Pro Thr Thr

180 185 190

Gln Met Lys Glu Ser Tyr Tyr Phe Asp Leu Thr Asp Gly Leu Ser

195 200 205

<210> 16

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 16

Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala

1 5 10 15

Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu

20 25 30

Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu

35 40 45

Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp

50 55

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 17

Asp Trp Gly His Glu Lys Gln Arg Lys His Asn Leu Gly His Gly His

1 5 10 15

Lys His Glu Arg

20

<210> 18

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 18

Lys Lys Ile Tyr Pro Thr Val Asn Cys Gln Pro Leu Gly Met Ile Ser

1 5 10 15

Leu Met Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Ser Ser Arg Ile

20 25 30

Gly Glu

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 19

Ser Ser Arg Ile Gly Glu Ile Lys Glu

1 5

<210> 20

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 20

Lys Lys Ile Tyr Pro Thr Val Asn Cys Gln Pro Leu Gly Met Ile Ser

1 5 10 15

Leu Met Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg Ser Ser Arg Ile

20 25 30

Gly Glu

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 21

Lys Lys Ile Tyr Pro Thr Val Asn Cys Gln Pro Leu Gly Met Ile Ser

1 5 10 15

Leu Met Lys

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 22

Ser Ser Arg Arg Ile Gly Glu

1 5

<210> 23

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 23

Lys Lys Tyr Ile Pro Thr Val Asn Cys Gln Pro Leu Gly Met Ile Ser

1 5 10 15

Leu Met Lys

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 24

Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg

1 5

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 25

Ser Ser Arg Ile Gly Glu Lys Glu

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 26

Ile Asn Pro Thr Thr Gln Met Lys Glu

1 5

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 27

Glu Asp Ser Thr Thr Pro Ser Ala Gln Thr Gln Glu

1 5 10

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 28

Tyr Lys Gly Arg Pro Pro Lys Ala Gly Ala Glu

1 5 10

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 29

Ile Asn Pro Thr Gln Met Lys Glu

1 5

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 30

Ser Tyr Tyr Asp Asp Gly Leu Ser

1 5

Claims

1.一种用于检测样品中裂解的高分子量激肽原(HMWK)的方法，所述方法包括：

(i)提供疑似含有HMWK的样品；

(ii)使所述样品与蛋白酶接触以产生多种消化肽；和

(iii)测量在所述多种消化肽中标签肽的水平，其中所述标签肽指示裂解的HMWK。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述标签肽指示裂解的HMWK的46kDa轻链。

3.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中指示裂解的HMWK的46kDa轻链的所述标签肽是：

KHNLGHGH(SEQ ID NO:1)；

KHNLGHGHKHE(SEQ ID NO:2)；

KHNLGHGHK(SEQ ID NO:3)；或

KHNLGHGHKHER(SEQ ID NO:4)。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述标签肽指示裂解的HMWK的56kDa轻链。

5.如权利要求4所述的方法，其中指示裂解的HMWK的56kDa轻链的所述标签肽是SSRIGE(SEQ ID NO:5)。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶选自由以下组成的组：胰凝乳蛋白酶、胞内蛋白酶Glu-C、胞内蛋白酶Asp-N、组织蛋白酶G和胞内蛋白酶Lys-C。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，进一步包括测量指示全长HMWK的标签肽的水平。

8.如权利要求7所述的方法，其中指示全长HMWK的所述标签肽是：

GHEKQRKH(SEQ ID NO:6)；

KQRKHNLGHGHKHE(SEQ ID NO:7)；

DWGHKQRKHNLGHGHKHER(SEQ ID NO:8)；

HNLGHGHK(SEQ ID NO:9)；或

SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中通过液相色谱-质谱分析(LC-MS)测量指示裂解的HMWK的标签肽的水平、指示全长HMWK的标签肽的水平、或指示裂解的HMWK的标签肽的水平和指示全长HMWK的标签肽的水平两者。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述样品是从人类受试者获得的生物样品。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述生物样品是血液样品或血浆样品。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述生物样品是正常的血浆样品、通过FXIIa激活的血浆样品或者未激活的血浆样品。

13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述人类受试者患有遗传性血管性水肿(HAE)或疑似患有遗传性血管性水肿(HAE)。

14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述生物样品是收集在抽真空的血液收集管中的血浆样品，所述抽真空的血液收集管含有包含蛋白酶抑制剂混合物的液体制剂。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述抽真空的血液收集管是SCAT管。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中在存在还原剂的情况下进行步骤(ii)。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述生物样品与所述还原剂一起在90℃孵育1小时。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在不存在蛋白酶抑制剂、抗凝剂或蛋白酶抑制剂和抗凝剂两者的情况下进行步骤(ii)。

19.如权利要求10-18中任一项所述的方法，进一步包括确定所述人类受试者是否患有HAE，其中与预定的参考值相比，从所述人类受试者获得的生物样品中升高水平的裂解的HMWK指示所述人类受试者患有HAE。

20.如权利要求10-18中任一项所述的方法，进一步包括确定所述人类受试者是否处于HAE发作的风险中，其中与预定的参考值相比，从所述人类受试者获得的生物样品中升高水平的裂解的HMWK指示所述人类受试者处于HAE发作的风险中。

21.一种用于区分样品中全长高分子量激肽原(HMWK)和裂解的HMWK的方法，所述方法包括：

(i)提供疑似含有全长HMWK和/或裂解的HMWK的样品；

(ii)使所述样品与蛋白酶接触以产生多种消化肽；

(iii)测量从步骤(ii)中获得的第一消化肽的水平，其中与全长HMWK相比，所述第一消化肽是裂解的HMWK特有的；

(iv)测量从步骤(ii)中获得的第二消化肽的水平，其中与低分子量激肽原(LMWK)相比，所述第二消化肽是HMWK特有的；

(v)确定所述第一消化肽与所述第二消化肽之间的比值；和

(vi)基于在步骤(v)中确定的所述比值，区分裂解的HMWK和全长HMWK。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述蛋白酶在谷氨酸残基后裂解。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述蛋白酶是胞内蛋白酶Glu-C或组织蛋白酶G。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述蛋白酶是胞内蛋白酶Glu-C。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述第一消化肽是SSRIGE(SEQ ID NO:5)和所述第二消化肽是SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)。

26.如权利要求21-25中任一项所述的方法，其中所述第一消化肽和所述第二消化肽通过LC-MS测量。

27.如权利要求21-26中任一项所述的方法，其中所述样品是从人类受试者获得的生物样品。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述生物样品是血液样品或血浆样品。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述生物样品是正常的血浆样品、通过FXIIa激活的血浆样品或者未激活的血浆样品。

30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述人类受试者患有遗传性血管性水肿(HAE)或疑似患有遗传性血管性水肿(HAE)。

31.如权利要求27-30中任一项所述的方法，其中所述生物样品是收集在抽真空的血液收集管中的血浆样品，所述抽真空的血液收集管含有包含蛋白酶抑制剂混合物的液体制剂。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述抽真空的血液收集管是SCAT管。

33.如权利要求21-32中任一项所述的方法，其中在存在还原剂的情况下进行步骤(ii)。

34.如权利要求33任一项所述的方法，其中所述生物样品与所述还原剂一起在90℃孵育1小时。

35.如权利要求21-34中任一项所述的方法，其中在不存在蛋白酶抑制剂、抗凝剂或蛋白酶抑制剂和抗凝剂两者的情况下进行步骤(ii)。

36.如权利要求21-35中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中蛋白酶/蛋白质的比值是约1:20。

37.如权利要求21-36中任一项所述的方法，进一步包括确定所述人类受试者是否患有HAE，其中与预定的参考值相比，从所述人类受试者获得的生物样品中升高水平的裂解的HMWK指示所述人类受试者患有HAE。

38.如权利要求21-36中任一项所述的方法，进一步包括确定所述人类受试者是否处于HAE发作的风险中，其中与预定的参考值相比，从所述人类受试者获得的生物样品中升高水平的裂解的HMWK指示所述人类受试者处于HAE发作的风险中。

39.一种用于鉴定患有遗传性血管性水肿(HAE)或处于遗传性血管性水肿(HAE)风险中的受试者的方法，所述方法包括：

(i)提供受试者的生物样品；

(ii)使所述样品与蛋白酶接触以产生多种消化肽；

(iii)测量所述多种消化肽中第一标签肽的水平，其中所述第一标签肽指示裂解的HMWK；和

(iv)基于裂解的HMWK的水平确定所述受试者是否患有HAE或处于HAE发作的风险中，其中与预定的参考值相比，在所述生物样品中升高水平的裂解的HMWK指示所述受试者患有HAE或处于HAE发作的风险中。

40.如权利要求38所述的方法，其中所述蛋白酶是胰凝乳蛋白酶。

41.如权利要求39所述的方法，其中所述第一标签肽是KHNLGHGH(SEQ ID NO:1)。

42.如权利要求38所述的方法，进一步包括测量所述多种消化肽中第二标签肽的水平，其中所述第二标签肽指示HMWK。

43.如权利要求41所述的方法，进一步包括确定所述第一标签肽和第二标签肽之间的比值，其中基于所述第一标签肽和所述第二标签肽之间的比值鉴定患有HAE或处于HAE发作的风险中的受试者。

44.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述蛋白酶是胞内蛋白酶Glu-C或组织蛋白酶。

45.如权利要求43所述的方法，其中所述第一标签肽是SSRIGE(SEQ ID NO:5)和所述第二标签肽是SYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:10)。

46.如权利要求38-44中任一项所述的方法，其中第一标签肽、第二标签肽或第一标签肽和第二标签肽两者通过LC-MS测量。

47.如权利要求38-45中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血液样品或血浆样品。