CN106255885A - 监测炎症状态 - Google Patents

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Abstract

监测对象的炎症状态的方法，所述方法包括：测定在多个时间点取自所述对象的尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物或至少三种标志物的水平，其中尿样品中所述至少一种中性粒细胞活化标志物或所述标志物中至少一种的水平提高指示或预测炎症加剧和/或其中尿样品中所述至少一种中性粒细胞活化标志物或所述标志物中至少一种的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。提供了相应的系统、工具套装和计算机程序。

Description

监测炎症状态
发明领域
本发明涉及预测或鉴定炎症事件的标志物的鉴定。特别地，本发明涉及基于测量尿标志物来预测和鉴定加剧(exacerbation)事件，更特别地是肺加剧。本发明通过提供个体化家用检验从而允许由个人监测炎症状态。
发明背景
存在一些不同的呼吸道疾病，其中许多具有炎症组分。实例包括慢性阻塞性肺病(COPD)和囊性纤维化(CF)。
肺病的慢性感染和炎症可引起肺功能逐步下降，从而导致日常症状例如咳嗽和痰液产生。存在症状急性恶化的间歇发作，更常被称为肺加剧。肺加剧(Pulmonaryexacerbation，PEx)是发病、死亡和入院的主要原因。
发明描述
能够精确监测对象以在PEx事件发生之前预测该事件，或者鉴定PEx的早发将是有用的。这将允许早期干预以使由PEx引起的炎性损伤最小化。理想地，这能够以家庭自检方法实现。发明人已发现：尿样品是能够预测PEx事件的标志物的有用来源，从而使得用于预测PEx的家庭检验成为可能。该标志物可指示中性粒细胞活化，因此可被称为“中性粒细胞活化标志物”。
因此，在第一方面，本发明提供监测对象的炎症状态的方法，所述方法包括：测定在多个时间点取自对象的尿样品中至少一种(中性粒细胞活化)标志物的水平，其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高指示或预测炎症加剧。
该方法优选地在用于家用监测的工具套装或系统中实施。
因此，本发明还提供用于监测对象的炎症状态的检验工具套装或系统，其包含：
a.用于测定尿样品中至少一种(中性粒细胞活化)标志物的水平的一
个或多个检验装置；
b.处理器；和
c.包含计算机应用的存储介质，当所述处理器执行所述计算机应用
时，所述计算机应用被配置为：
i.取得和/或计算在一个或多个检验装置上的尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的测定水平；
ii.计算尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平是否提高或降低(或者水平是否保持相同)；和
iii.从所述处理器输出所述对象目前的炎症状态，其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高指示或预测炎症加剧。
本发明还涉及用于所述系统或检验工具套装中的相应计算机应用。
发明人已确定了，可通过组合多种尿标志物来获得特异且灵敏的结果以监测或预测PEx事件。因此，本发明还提供监测对象的炎症状态的方法，所述方法包括：测定在多个时间点取自对象的尿样品中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种标志物的水平，其中尿样品中至少一种所述标志物的水平提高指示或预测炎症加剧。
类似地，本发明还提供用于监测对象的炎症状态的检验工具套装或系统，其包含：
a.用于测定尿样品中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种标志物的水平的一个或多个检验装置；
b.处理器；和
c.包含计算机应用的存储介质，当所述处理器执行所述计算机应用时，所述计算机应用被配置为：
i.取得和/或计算在一个或多个检验装置上的尿样品中每种标志物的测定水平；
ii.计算尿样品中至少一种标志物的水平是否提高或降低(或者水平是否保持相同)；和
iii.从所述处理器输出所述对象目前的炎症状态，其中尿样品中至少一种所述标志物的水平提高指示或预测炎症加剧。
本发明还涉及用于所述系统或检验工具套装中的相应计算机应用。
根据本发明的所有方面，所述标志物可用于监测炎症。因此，所述标志物不但证明了对鉴定或预测炎症事件例如PEx有用，而且还可以用于指示从炎症事件恢复或者炎症事件的成功治疗。因此，在一些实施方式中，尿样品中至少一种标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。降低可降至加剧前的水平，然后可持续测量以确保它们此后被维持。因此，本发明可以与个体对象的治疗联合使用并指导个体对象的治疗。本发明可用于监测正在进行的治疗以及辅助确定是否应该改变治疗(例如，调整剂量、改变干预水平)、停止治疗或者用替选方案替代。类似地，对象的尿中标志物的水平稳定可指示病情得到控制且炎症状态稳定。
在一些实施方式中，本发明可适用于鉴定加剧的细菌原因或病毒原因。
在根据本发明所有方面的一些特定实施方式中，所监测的炎症状态是肺炎症状态。在另一些实施方式中，所指示和/或预测的炎症加剧是肺加剧。
所述对象是哺乳动物对象，通常是人。在某些实施方式中，对象患呼吸系统疾病。更特别地，呼吸系统疾病可以是慢性阻塞性肺病(COPD)或囊性纤维化(CF)。发明人已积累了显示这种方法在这些特定疾病病情中的有效性的数据。COPD代表一批肺病，包括慢性支气管炎、肺气肿和慢性阻塞性气道疾病，因此任何这些肺病均可根据本发明来监测。本发明还可适用于监测哮喘和间质性肺病(ILD)。本发明还可应用于支气管扩张症。
应该注意的是，本发明是基于经分离的尿样品在体外进行的。在一些实施方式中，尿样品可以是中段尿样品。在一些实施方式中，本发明的方法可包括获得用于检验的尿样品的步骤。类似地，在一些实施方式中，系统和检验工具套装包含用于接收尿样品的合适容器。这些容器可被特别调整为适合尿收集并且可因对象的性别而异。可商购的实例包括Peezy MSU尿收集装置(Williams Medical)。可对容器进行着色以保护任何光敏性分析物。
“标志物”表示指示炎症、通常指示中性粒细胞活化的分子。在一些实施方式中，至少一种标志物选自信号分子(signalling molecule)或效应物(effector)/效应物抑制剂分子(effector inhibitor molecule)。应该注意的是，在说明书全文中，术语“至少一种标志物”包括多种标志物的水平被检测的情况下的“至少一种标志物”。信号分子可负责招募引起炎症损伤的分子。效应物分子引起炎症损伤。它们可以是酶。效应物抑制剂分子抑制效应物分子的活性。它们可以是酶抑制剂。
在一些实施方式中，效应物分子选自蛋白酶活性、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、钙网蛋白或髓过氧化物酶(MPO)。效应物分子(尤其是NGAL活性)可以是游离的或者处于复合体中。在另一些实施方式中，蛋白酶活性选自基质金属蛋白酶(MMP)活性、人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)活性和组织蛋白酶G活性。存在可有用地被检测的多种MMP，如本文所更详细讨论的那样。在一些特定实施方式中，MMP活性包括MMP9和/或MMP8活性。
根据本发明，可额外地或者替代性地测定效应物抑制剂分子的水平。在一些特定实施方式中，效应物抑制剂分子包括蛋白酶抑制剂分子、基本上由蛋白酶抑制剂分子组成或者由蛋白酶抑制剂分子组成(即，为蛋白酶抑制剂分子)。在一些实施方式中，蛋白酶抑制剂分子选自金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、胱抑素c(cystatin c)、分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)和α-1抗胰蛋白酶(A1AT)。
根据本发明，可额外地或者替代性地测定信号分子的水平。在一些特定实施方式中，信号分子选自ICAM-1、IL-6、IL-1β、IL-8、N-甲酰基-Met-Leu-Phe(fMLP)、IL-6诱导的纤维蛋白原、细胞因子诱导的β-2-微球蛋白(B2M)和补体蛋白的片段。
在某些实施方式中，所述至少一种标志物包括或进一步包括由于炎症而产生的分子。在一些特定实施方式中，由于炎症而产生的分子包括蛋白酶活性的降解产物，例如细胞外基质分解产物和/或氧化损伤的产物例如氯化肽(chlorinated peptides)和/或代谢物例如乳酸和游离脂肪酸。细胞外基质分解产物的实例包括胶原分解产物例如Ac-PGP、弹性蛋白片段/肽、锁链素。然而，在一些特定实施方式中，不测量锁链素的水平。在一些实施方式中，可以测量大弹性蛋白片段(LEF)的水平。
在所述方法中有用的一些特定标志物包括TIMP1(一种金属蛋白酶组织抑制剂)和胱抑素c(一种溶酶体蛋白酶抑制剂)。可组合使用的另一些有用标志物包括MMP水平或活性和A1AT水平或活性。在一些实施方式中，标志物可选自图1中列出的那些。在某些实施方式中，一种或多种标志物选自TIMP(特别是TIMP2)、NGAL、A1AT、IL-6、FMLP、肌酸酐、胱抑素c、HSA、RBP4和β2微球蛋白。IL-8也可以是有用的标志物。通过ELISA测量时，锁链素可以是有用的标志物。这些标志物中的每一种均已显示出在指示炎症加剧中单独有用(参见本文中的表1和实施例2)。可用于本发明的另一些特定标志物组合包括：
B2M和钙网蛋白或IL-6
B2M和钙网蛋白和HNE(活性或表达水平)
B2M和钙网蛋白和HNE(活性或表达水平)和A1AT
B2M和IL-6和MMP(活性或表达水平)
B2M和IL-6和MMP(活性或表达水平)和锁链素(优选地通过ELISA测量)或HNE(活性或表达水平)
锁链素(优选地通过ELISA测量)和IL-8或IL-6或A1AT
锁链素(优选地通过ELISA测量)和A1AT和FMLP
TIMP2和锁链素(任选地通过侧向流测量)或MMP(活性或水平)或IL-1β或IL-6
TIMP2和锁链素(任选地通过侧向流测量)和IL-6
TIMP2和锁链素(任选地通过侧向流测量)和IL-6和MMP(活性或表达水平)
TIMP2和IL-6和锁链素(任选地通过ELISA测量)
TIMP2和IL-6和锁链素(任选地通过ELISA测量)和MMP(活性或表达水平)
TIMP2和MMP(活性或表达水平)和A1AT或IL-6
TIMP2和MMP(活性或表达水平)和A1AT和锁链素(任选地通过ELISA测量)
TIMP2和MMP(活性或表达水平)和IL-6和锁链素(任选地通过ELISA测量)
TIMP2和IL-1β和IL-6
TIMP2和IL-1β和IL-6和锁链素(任选地通过ELISA测量)或MMP(活性或表达水平)。
在本文中以实验方法显示在预测和鉴定加剧事件(和/或从加剧事件恢复，包括成功治疗)中单独有用的另一些标志物包括选自RBP4、肌酸酐、胱抑素C、LEF、CRP和CC16的标志物。C-反应蛋白(CRP)是在肝脏中合成且在血浆中发现的环状五聚体蛋白。其在血浆中的水平响应于炎症而升高。然而，以前没有观察到CRP能够通过肾脏屏障并因此在尿样品中检测到。克拉拉细胞蛋白(CC16)是15.8-kDa的蛋白，其沿着整个气管支气管树且尤其在克拉拉细胞所在的末端细支气管中分泌。这种蛋白以前未被用作炎症或炎症加剧的尿生物标志物。
在本文中以实验方法显示在预测和鉴定从加剧事件恢复(和/或这种事件的发生率)中单独有用的另一些标志物包括选自根据本文所述方法测量的MMP活性(最终ELTABA(ultimate ELTABA))、肌酸酐、LEF和CRP的标志物。
可用于预测或鉴定加剧事件(和/或从其恢复，包括成功治疗)的标志物组合包括CRP连同IL1B和/或锁链素(例如，通过侧向流测量时)。
可用于预测或鉴定加剧事件(和/或由其恢复，包括成功治疗)的另一些标志物组合包括CRP和A1AT中的至少一种。它们可以与Ac-PGP(例如，通过竞争性EIA测量)、fMLP、TIMP1、HSA和CC16中的至少一种直至所有一起使用。它们可以与Ac-PGP(例如，通过竞争性EIA测量)、fMLP和TIMP1中的至少一种直至所有一起使用。它们可以与fMLP、锁链素片段、锁链素和TIMP1中的至少一种直至所有一起使用。它们可以与Ac-PGP(例如，通过竞争性EIA测量)、fMLP和CC16中的至少一种直至所有一起使用。
本文中证明的另一些有用组合包括：
TIMP2、CRP和锁链素-TIMP2可通过侧向流试验(LF)测量。锁链素可通过例如如本文所述的酶免疫分析法测量。
TIMP1、CRP和CC16-在一些实施方式中，TIMP1和CC16可通过ELISA测量。
B2M、CRP和Ac-PGP。Ac-PGP可通过例如如本文所述的酶免疫分析法测量。
MMP活性、CRP和LEF。MMP活性可通过如本文所述的最终ELTABA测量。LEF可通过如本文所述的大弹性蛋白片段试验测量。
MMP活性、CRP和HSA。MMP活性可通过如本文所述的最终ELTABA测量。LEF可通过如本文所述的大弹性蛋白片段试验测量。人血清白蛋白可通过ELISA测量。
肌酸酐、CRP、Ac-PGP。Ac-PGP可通过例如如本文所述的酶免疫分析法测量。
fMLP、CRP和TIMP2。fMLP可通过例如如本文所述的酶免疫分析法测量。TIMP2可通过ELISA测量。
Ac-PGP、CRP、替代性Ac-PGP试验。Ac-PGP可通过酶免疫分析法(例如如本文所述的多种试验之一)测量。
如本文所述，可相对参照标志物(例如，肌酸酐)将标志物水平归一化。在这类实施方式中，以下特定标志物和标志物组合可以是特别有用的：
TIMP2和IL-6或FMLP或锁链素(任选地通过侧向流测量)或MMP(活性或表达水平)
TIMP2和IL-6和MMP(活性或表达水平)
TIMP2和IL-6和MMP(活性或表达水平)和HNE(活性或表达水平)或锁链素(任选地通过ELISA测量)或HSA
TIMP2和FMLP和IL-6或锁链素(任选地通过ELISA测量)
TIMP2和FMLP和IL-6和锁链素(任选地通过侧向流测量)或HSA
TIMP2和FMLP和锁链素(任选地通过ELISA测量)和MMP(活性或表达水平)
TIMP2和锁链素(任选地通过侧向流测量)和A1AT或MMP(活性或表达水平)
TIMP2和锁链素(任选地通过侧向流测量)和A1AT和HNE(活性或表达水平)
TIMP2和锁链素(任选地通过侧向流测量)和MMP(活性或表达水平)和HNE(活性或表达水平)
TIMP2和MMP(活性或表达水平)和IL-6或通过荧光底物试验测量的MMP
TIMP2和MMP(活性或表达水平)和IL-6和HNE(活性或水平)或锁链素(任选地通过ELISA测量)
TIMP2和MMP(活性或表达水平)和通过荧光底物试验测量的MMP和锁链素(任选地通过ELISA测量)。
在一些实施方式中，本发明可依赖于鉴定效应物分子和效应物抑制剂分子之间的相互关系。例如，作为加剧的早期指标，蛋白酶水平可提高。这可导致相应抑制剂相称地提高以抑制蛋白酶活性。这继而可使蛋白酶活性水平回到正常。取决于在什么时间点检验样品，可观察到抑制效应物分子和/或抑制剂分子的提高。在一些实施方式中，检测到效应物分子水平早期骤增可预测即将发生的加剧。在一些实施方式中，检测到抑制水平提高可鉴定加剧。本文中讨论了效应物分子的实例，其包括蛋白酶例如MMP。本文中还讨论了抑制剂分子的实例，其包括蛋白酶抑制剂例如TIMPs(比如，TIMP2)和A1AT。代表性个体实例示于图28中，其验证了在个体基础上测量多种标志物的重要性。在对象678和2023中，效应物分子的水平(MMP活性)提高以鉴定加剧事件。在对象2097和2505，效应物抑制剂分子(分别为A1AT和TIMP2)的水平提高以鉴定加剧事件。
存在多种已知的可测量标志物水平的技术。因此，标志物水平表示标志物的浓度和/或量和/或活性和/或表达的水平。可在尿中测量标志物的表达水平。表达水平可与活性相关，因此可被用作活性的替代物。可根据任何合适的方法在蛋白水平或mRNA水平上测量表达水平。蛋白修饰(例如，糖基化)也可是相关的，其可通过任何合适的方法来测量。许多此类方法在本领域众所周知，其包括使用质谱分析法(例如，MALDI-TOF质谱分析法)。也可以在尿样品中测量微RNA，所述微RNA作为基因表达的转录后调控因子。它们在尿中相对稳定。平台(例如由Exiqon提供的平台)可用于提供高通量微RNA谱。这类平台可以基于阵列和/或PCR。
标志物(例如，蛋白质)的表达水平和/或量和/或浓度可依赖于结合剂例如与目的标志物(例如，蛋白质)特异性结合的抗体或适配体。抗体可以为单克隆来源或多克隆来源。还可以利用片段和衍生抗体，包括但不限于，Fab片段、ScFv、单域抗体、纳米抗体、重链抗体、适配体等，其保留特异性结合功能并被包括在“抗体”的定义中。这类抗体在本发明的方法中是有用的。它们可用于测量特定标志物(例如蛋白质，或者在一些情况下，蛋白质的一种或多种特定亚型。本领域技术人员完全能够鉴定允许将特定亚型彼此区分开的表位)的水平。
生成特异性抗体的方法是本领域技术人员已知的。抗体可具有人类来源或非人类来源(例如，啮齿动物，例如大鼠或小鼠)并根据已知技术(Jones等人,Nature(1986)5月29日-6月4日；321(6069):522-5；Roguska等人,Protein Engineering,1996,9(10):895-904；和Studnicka等人,Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3–DStructure.Protein Engineering,1994,第7卷,第805页)被人源化等等。
在某些实施方式中，使用缀合到标签的抗体或适配体测定标志物的表达水平和/或量和/或浓度。标签表示允许直接或间接检测的组分。例如，标签可以是酶，任选地过氧化酶，或荧光团。可以利用金标签，例如胶体金形式的金标签。
标签是检测剂的一个实例。检测剂表示可用于辅助检测抗体-标志物(例如，蛋白质)复合体的试剂。当抗体缀合到酶时，检测剂可包含化学组合物以使得酶催化化学反应以产生可检测的产物。由合适酶催化的反应的产物可以是，但不限于，荧光、冷光或放射性物质或者它们可以吸收或反射可见光或紫外光。适合检测这类可检测标签的检测器的实例包括但不限于，x射线胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、比色计、荧光计、光度计、光检测器和光密度计。在某些实施方式中，检测剂可包含第二抗体。此时则使用与靶蛋白结合的未标记的第一抗体和缀合到标签的第二抗体测定表达水平，其中第二抗体与第一抗体结合。
在标志物的浓度和/或量和/或蛋白水平上测定表达水平的额外技术包括，例如，蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫细胞化学、质谱分析法、ELISA等(参见ImmunoAssay:APractical Guide,Brian Law编,由Taylor&Francis,Ltd.出版,2005版)。为了提高基于免疫反应性的试验方法的特异性和灵敏度，往往使用单克隆抗体，这是因为它们的特异性表位识别。多克隆抗体也已被成功用于多种免疫分析中，这是因为相较于单克隆抗体，它们对靶标的亲和性更高。在一些实施方式中，可使用侧向流试验检测蛋白水平(在本文中更详细地讨论)。
测量生物样品中的mRNA可被用作检测尿样品中相应蛋白水平的替代。因此，本文所述任何相关标志物的表达水平也可以通过检测合适的RNA来检测。
因此，在一些特定实施方式中，通过微阵列、northern印迹或核酸扩增来测定表达水平。核酸扩增包括PCR及其所有变体例如实时法和终点法以及qPCR。另一些核酸扩增技术在本领域众所周知，其包括以下方法例如NASBA、3SR和转录介导的扩增(TMA)。另一些适合的扩增方法包括连接酶链反应(LCR)、靶标多核苷酸序列的选择性扩增(美国专利No.6,410,276)、共有序列引物聚合酶链反应(美国专利No 4,437,975)、任意引物聚合酶链反应(WO 90/06995)、Invader技术、链置换技术、重组酶聚合酶扩增(RPA)、切口酶扩增反应(NEAR)和切口置换扩增(WO2004/067726)。该列表不打算表示穷举；可使用任何核酸扩增技术，只要特异性扩增合适的核酸产物即可。本领域技术人员能够设计合适引物和/或探针。多种引物设计工具可免费使用以辅助这种方法，所述工具例如NCBI引物-BLAST工具。引物和/或探针的长度可以为至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25(或者更多)个核苷酸。可通过反转录定量聚合酶链反应(RT-PCR，接着是qPCR)来测量mRNA表达水平。RT-PCR被用于由mRNA生成cDNA。cDNA可被用在qPCR试验中以随着DNA扩增过程进行而产生荧光。通过与标准曲线进行比较，qPCR能够产生绝对测量例如每个细胞的mRNA拷贝数。Northern印迹、微阵列、Invader试验和RT-PCR连同毛细管电泳均已被用于测量样品中mRNA的表达水平。参见Gene Expression Profiling:Methods and Protocols,Richard A.Shimkets编辑HumanaPress,2004。
可通过使RNA与一组探针杂交来测定RNA表达。探针可被排列在阵列中。微阵列平台包括由例如Affymetrix、Illumina和Agilent的公司制造的那些。还可以使用下一代测序方法(例如，RNA-seq)来测量RNA表达。
类似地，可以在尿样品中测量效应物分子的活性，例如酶活性。可例如通过检测样品中底物(其可带有标签)的处理来测量酶活性。例如，试验可以是荧光底物试验。可以使用合适的侧向流试验来检测酶活性。合适的试验方式的实例包括国际专利申请WO2009/024805、WO2009/063208、WO2007/128980、WO2007/096642、WO2007/096637、WO2013/156794和WO2013/156795(其中每个的内容均通过引用并入本文)中所述的试验。
在一些特定实施方式中，通过测量肽底物的切割来测定蛋白酶活性。例如，试验可以是荧光底物试验。在某些实施方式中，通过以下方法测定蛋白酶活性，所述方法包括：
a.使指示物分子与检验样品接触，所述指示物分子包含
i.包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述蛋白酶，若存在的话，切割；和
ii.捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生新结合位点；
b.向所述检验样品中加入能够结合到所述新结合位点的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合；
c.在捕获区通过所述捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合来捕获含有所述新结合位点的指示物分子部分；和
d.通过测定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示物分子的新结合位点的结合来检测至少一个切割位点的切割。
该试验在本文中可被称为“最终ELTABA”试验。
因此，本发明可包括用于检测检验样品中是否存在能够切割底物的酶的切割活性的酶检测装置，所述装置包括：
(i)用于加入到所述检验样品中的指示物分子，所述指示物分子包含
(a)包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述酶，若所述酶切割活性存在的话，切割；和
(b)捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生新结合位点；
(ii)用于接收所述检验样品的捕获区，其中所述捕获区包含能够与所述指示物分子的捕获位点结合的捕获分子以固定包含所述新结合位点的指示物分子；和
(iii)能够结合到所述新结合位点的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合。
类似地，本发明可包括用于检测检验样品中是否存在能够切割底物的酶的切割活性的酶检测装置，所述装置包括：
(i)用于加入到所述检验样品中的指示物分子，所述指示物分子包含
(a)包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述酶，若所述酶切割活性存在的话，切割；和
(b)捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生至少两部分切割区域，其中至少一部分保持与所述捕获位点相连接；
(ii)用于接收所述检验样品的捕获区，其中所述捕获区包含能够与所述指示物分子的捕获位点结合的捕获分子；和
(iii)结合分子，其能够与含有与所述捕获位点相连接的至少一部分切割区域的指示物分子部分结合，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合。
切割区域的两部分因此在切割位点彼此分离。在切割位点的切割事件产生新结合位点。这些装置可作为一个或多个检验装置包含在本发明的系统和检验工具套装中。
本发明可进一步依赖于检测检验样品中是否存在能够切割底物的酶的切割活性的方法，所述方法包括：
(i)使指示物分子与检验样品接触，所述指示物分子包含
(a)包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述酶，若所述酶切割活性存在的话，切割；和
(b)捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生新结合位点；
(ii)向所述检验样品中加入能够结合到所述新结合位点的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合；
(iii)在捕获区通过所述捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合来捕获含有所述新结合位点的指示物分子部分；和
(iv)通过测定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示物分子的新结合位点的结合来检测所述至少一个切割位点的切割。
类似地，本发明还包括检测检验样品中是否存在能够切割底物的酶的切割活性的方法，所述方法包括：
(i)使指示物分子与检验样品接触，所述指示物分子包含
(a)包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述酶，若所述酶切割活性存在的话，切割；和
(b)捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生至少两部分切割区域，其中至少一部分保持与所述捕获位点相连接；
(ii)向所述检验样品中加入结合分子，所述结合分子能够与含有与所述捕获位点相连接的至少一部分切割区域的指示物分子部分结合，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合；
(iii)在捕获区通过所述捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合来捕获含有与所述捕获位点相连接的至少一部分切割区域的指示物分子部分；和
(iv)通过测定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的指示物分子部分的结合来检测所述至少一个切割位点的切割。
发明人已展示了这些特定装置和方法非常灵敏。所以，它们通过测量尿样品中效应物分子的活性而特别用于监测炎症状态。因此，本发明还提供通过检测能够切割底物的酶的切割活性来监测尿样品中的炎症状态、特别是预测或鉴定PEx事件的方法，所述方法包括：
(i)使指示物分子与检验样品接触，所述指示物分子包含
(a)包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述酶，若所述酶切割活性存在的话，切割；和
(b)捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生新结合位点；
(ii)向所述检验样品中加入能够结合到所述新结合位点的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合；
(iii)在捕获区通过所述捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合来捕获含有所述新结合位点的指示物分子部分；和
(iv)通过测定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示物分子的新结合位点的结合来检测所述至少一个切割位点的切割，其中切割水平提高指示提高的炎症水平，特别地预测或鉴定PEx事件。
本发明还提供通过检测能够切割底物的酶的切割活性来监测尿样品中的炎症状态、特别是预测或鉴定PEx事件的方法，所述方法包括：
(i)使指示物分子与检验样品接触，所述指示物分子包含
(a)包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述酶，若所述酶切割活性存在的话，切割；和
(b)捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生至少两部分切割区域，其中至少一部分保持与所述捕获位点相连接；
(ii)向所述检验样品中加入结合分子，所述结合分子能够与含有与所述捕获位点相连接的至少一部分切割区域的指示物分子部分结合，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合；
(iii)在捕获区通过所述捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合来捕获含有与所述捕获位点相连接的至少一部分切割区域的指示物分子部分；和
(iv)通过测定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的指示物分子部分的结合来检测所述至少一个切割位点的切割，其中切割水平提高指示炎症水平提高，特别地预测或鉴定PEx事件。
如本文所述，酶是一种“效应物分子”。通常，酶是蛋白酶例如MMP、HNE或组织蛋白酶G。
在本发明中有用的酶检测装置可以以供立即使用的形式提供。或者，必要组分可被提供为一套部件，任选地连同合适的试剂/或用于组装酶检测装置的说明。因此，本文提供用于检测尿检验样品中是否存在能够切割底物的酶的切割活性的酶检测工具套装，所述工具套装包括：
(i)用于加入到所述检验样品中的指示物分子，所述指示物分子包含
(a)包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述酶，若所述酶切割活性存在的话，切割；和
(b)捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生新结合位点；
(ii)能够与所述指示物分子的捕获位点结合的捕获分子；
(iii)固体支持物，所述捕获分子能够附着于(即，可附着的或者已附着的)所述固体支持物以形成用于接收所述检验样品的捕获区；和
(iv)能够结合到所述新结合位点的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合。
在本发明中也有用的是用于检测尿检验样品中是否存在能够切割底物的酶的切割活性的酶检测工具套装，所述工具套装包括：
(i)用于加入到所述检验样品中的指示物分子，所述指示物分子包含
(a)包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述酶，若所述酶切割活性存在的话，切割；和
(b)捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生至少两部分切割区域，其中至少一部分保持与所述捕获位点相连接；
(ii)能够与所述指示物分子的捕获位点结合的捕获分子；
(iii)固体支持物，所述捕获分子能够附着于(即，可附着的或者已附着的)所述固体支持物以形成用于接收所述检验样品的捕获区；和
(iii)结合分子，其能够与含有与所述捕获位点相连接的至少一部分切割区域的指示物分子部分结合，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合。
在相关方面，本发明还提供本文所描述和限定的酶检测装置用于监测尿检验样品中的炎症状态、尤其是用于指示或预测尿检验样品中的炎症加剧的用途。类似地，本发明还提供本文所描述和限定的方法用于指示或预测尿检验样品中的炎症加剧的用途。本发明还提供本文所描述和限定的酶检测工具套装用于指示或预测尿检验样品中的炎症加剧的用途。在这些用途中的每种中，呼吸疾病可以是作为囊性纤维化结果的呼吸道炎症或者慢性阻塞性肺病。
本发明这些方面的中心是指示物分子。指示物分子包含切割区域，所述切割区域包含至少一个切割位点。切割位点在具有相关酶切割活性的尿检验样品中被效应物分子(通常是一种或多种酶)切割。如果样品中存在酶，则切割区域为切割位点提供合适的环境以保证切割有效。在一些特定实施方式中，切割区域是肽。除了代表蛋白酶切割位点的肽键之外，肽中的另外氨基酸可保证切割的特异性和灵敏性。在某些实施方式中，尤其是其中指示物分子结构受到限制、例如其还包含支架分子的一些实施方式中，切割区域可包含多个切割位点。
指示物分子还包含捕获位点(旨在涵盖至少一个捕获位点)。捕获位点是允许指示物分子(无论是否被切割)被固定在捕获区的指示物分子的分立区域(discrete region)。下文将详细讨论捕获位点。
指示物分子还任选地包含如下文所详细讨论的支架分子。
指示物分子的切割使指示物分子裂开以露出或形成至少一个新结合位点。切割区域的两部分因此在切割位点彼此分离。新结合位点通常包含由于切割而产生的构象表位。使用与新露出的一个或多个结合位点特异性结合但不与切割前的指示物分子特异性结合的结合分子使得能够特异性且灵敏地检测酶的切割活性。因此，在一些实施方式中，切割至少一个切割位点产生至少两部分指示物分子(或指示物分子的切割区域)，其中至少一部分包含捕获位点(或者保持与捕获位点相连接)且作为切割的结果，包含结合分子的结合位点，且其中直到切割发生，所述结合分子才能与结合位点结合。换言之，在位于切割位点的切割发生之前，切割位点是隐藏的或者未形成。
在一些实施方式中，切割至少一个切割位点产生至少两个分离的指示物分子(的切割区域)部分。因此，切割可产生至少两个部分或者片段：含有捕获位点或者与捕获位点相连接的一个部分或者片段，以及不含捕获位点或者不与捕获位点相连接的分离部分或者片段。结合分子结合到含有或者包括捕获位点的指示物分子的一个或多个部分上的新结合位点。这允许通过与捕获分子结合特异性检测在指示物分子捕获位点的切割(即，在捕获区检测结合分子的结合)。
然而，(在切割位点的)切割产生至少两个完全分离的分子不是必要的，条件是切割产生结合分子的新结合位点且其中直到切割发生结合分子才能与所述结合位点结合。因此，切割产生两部分切割区域，它们在切割位点分离。因此，在一些实施方式中，切割至少一个切割位点产生至少两部分切割区域，其中至少两部分保持与捕获位点直接或间接(对于每部分)连接。这示意性显示于图16A中。在一些特定实施方式中，指示物分子含有远离切割位点或者在切割区域之外的另外的键或联结以使得切割至少一个切割位点产生至少两部分指示物分子的切割区域，它们保持彼此相连接。这并不排除以下可能性：切割产生至少三个片段，其中至少一个不通过另外的键或联结保持相连接。当切割区域可包含多于一个切割位点时，情况尤其如此。这示意性显示于图16B中。在一些实施方式中，另外的键或联结可包括二硫键。已发现，使用与指示物分子相连的支架分子在指示物分子内提供另外的键或联结。这种支架分子可充当结构限制，所述结构限制对于开发仅在切割发生后与指示物分子结合的结合分子是有用的。不受理论束缚，结构限制被认为辅助产生直到在切割位点的切割发生才出现的特异性且可再生的结合位点。如本文所详细讨论的，支架分子可增加切割前的指示物分子和切割后的指示物分子之间的空间构象差异。支架还可以限制切割后处于特定空间构象的经切割的指示物分子。通过提供在切割后清楚限定且不同的分子(可针对这一点设计或建立结合分子)，就结合分子在经切割的指示物分子和未切割的指示物分子之间区分而言，这可辅助提高检测的特异性。因此，在一些实施方式中，结合分子与切割区域结合。在一些特定实施方式中，结合位点可因此包含切割后切割位点的两侧(即，至少两部分切割区域)。结合分子可与切割后指示物分子的两部分都结合。
因此，本发明还可依赖于指示物分子在检测尿检验样品中是否存在效应物分子(例如，能够切割底物的酶)的切割活性的用途，所述指示物分子包含：
(a)包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述酶，若所述酶切割活性存在的话，切割；
(b)捕获位点；和
(c)支架分子，其作用为在切割位点之外(例如，切割区域之外)连接至少两部分指示物分子，
其中所述支架还起在结构上限制指示物分子的作用，以使得所述至少一个切割位点的切割产生新结合位点，所述结合分子结合所述新结合位点，但其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合。
本发明还可包括指示物分子，所述指示物分子用于检测尿检验样品中是否存在效应物分子(特别是能够切割底物的酶)的切割活性的用途，所述指示物分子包含：
(a)包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述酶，若所述酶切割活性存在的话，切割从而产生至少两部分切割区域；
(b)捕获位点；和
(c)支架分子，其作用为连接至少两部分指示物分子以使得所述至少一个切割位点的切割产生至少两部分指示物分子的切割区域，它们保持彼此相连接，
其中所述支架还起在结构上限制指示物分子的作用，以使得所述至少一个切割位点的切割产生(新)结合位点，所述结合分子结合所述新结合位点，但其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合。
支架分子通常远离切割位点与指示物分子相连以使得酶的切割活性不被支架抑制。因此，切割区域与支架分子可被一个或多个连接子或间隔子区域隔开。在一些实施方式中，这些连接子或间隔子区域可包括捕获位点。支架分子通常通过两个键与指示物分子相连，但也可以使用额外的键例如3、4、5或6个等键，这取决于所用的支架分子和指示物分子的性质。还有可以的是，单个支架分子可与多个指示物分子相连。在支架分子含有多于两个卤素取代基(尤其是溴甲基取代基，例如4个或6个溴甲基取代基)的实施方式中，支架分子可为多个指示物分子提供结构限制。可使每对取代基相连以连接至少两部分切割区域。因此，支架有效连接(并在结构上限制)多个分离的切割区域。在一些特定实施方式中，指示物分子包含多于一个受限制的肽(切割区域)。切割区域也可以是不同的，从而产生含有不同可切割序列的单个分子。本文中可以使用两个或多个不同的结合分子(例如，针对其经切割底物建立的抗体)检测每个单独肽切割区域的切割。因此，在仅在存在两种或多种蛋白酶时才需要试验信号的情况下，可以在所有不同的切割位点均已被切割时结合分子(抗体)结合才发生。在这种情况下，必须针对指示物分子被两种或多种蛋白酶切割后的形式建立结合分子(抗体)。
支架分子辅助限制指示物分子(通常是肽)的经切割末端或部分以产生结合分子(通常是与新露出或产生的表位、尤其是构象表位结合的抗体)的新特异性结合位点。因此，结合分子可与指示物分子的任一经切割末端或部分特异性结合或者与切割位点的两侧(即，在切割区域内切割位点的任一侧)特异性结合。在一些特定实施方式中，支架还起着在结构上限制指示物分子的作用，以使得所述至少一个切割位点的切割产生含有指示物分子的两部分切割区域的结合位点，所述结合分子结合到所述结合位点，但其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合。在一些特定实施方式中，结合位点包括切割位点。在一些特定实施方式中，结合位点代表指示物分子的新结构构象。切割可产生至少一个新构象表位。结合分子的新结合位点可包含指示物分子的任何部分，条件是酶切割活性和捕获基本上不被阻碍。在某些实施方式中，结合位点包含至少部分切割区域。在一些特定实施方式中，结合位点包含至少部分支架分子。
在大部分实施方式中，切割位点对蛋白酶切割特异。然而，如本文所述，本发明的指示物分子可被在炎症加剧事件中充当效应物分子的另一些酶切割。根据本发明可检测一种或多种不同的蛋白酶。在某些实施方式中，切割位点对基质金属蛋白酶(MMP)切割特异。MMP是锌依赖型内肽酶。它们负责切割多种蛋白，包括细胞外基质蛋白。MMP包括MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27和MMP28。另一些相关的效应物分子包括HNE和组织蛋白酶G。
在一些实施方式中，至少一个切割位点可偏向被特异性蛋白酶切割。这允许利用本发明来检测检验样品中的特异性蛋白酶活性。许多蛋白酶是已知的且其优选切割位点被充分报告。在某些实施方式中，至少一个切割位点偏向被特异性基质金属蛋白酶切割。更特别地，在一些实施方式中，至少一个切割位点偏向被MMP-9和/或MMP-8或者MMP-13和/或MMP-9切割。至少一个切割位点可偏向被MMP-13、MMP-9、MMP-2、MMP-12和MMP-8切割。偏向可以是对于MMP组相等的或者可以为特定的优先次序。如本文所示，可以设计特定指示物分子和指示物分子内偏向被这些特定MMP以特定优先次序切割的切割位点。因此，在一些实施方式中，切割位点在氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)内。这可被视为指示物分子的“切割区域”的特定实例。在这些实施方式中，切割产生含有氨基酸序列GPQG的指示物分子的切割区域部分和含有氨基酸序列IFQG的指示物分子的切割区域部分。任一部分均可以是与捕获位点相连接的部分。在一些特定实施方式中，指示物分子包含氨基酸序列CGPQGIFGQC(SEQID NO:2)。包含半胱氨酸残基提供了巯基，巯基代表对于多种支架分子而言方便的连接点。在一些实施方式中，切割区域与支架分子的连接点可被一个或多个连接子或间隔子区域隔开。因此，指示物分子可包括以下结构：
在一些实施方式中，可在一个或两个间隔子内找到捕获位点。因此，本发明的指示物分子在N末端和C末端或者接近N末端和C末端处可包含合适的氨基酸以促进与支架分子相连。所述氨基酸可包含巯基。合适的残基包括半胱氨酸和硒。支架分子可以通过硫醚键与指示物分子相连。
WO2004/077062和WO2008/013454中讨论了一系列合适的支架分子和使支架分子与肽相连的方法，所述文献的相关公开内容通过引用并入本文中。本发明以新方式应用这些支架分子以展示切割位点并在切割后产生新结合位点，这允许检测检验样品中的酶切割活性(尤其是蛋白酶活性)作为炎症加剧的指示或预测。
在某些实施方式中，支架分子包含(杂)芳族分子。在一些更具体的实施方式中，(杂)芳族分子包含至少两个苄基卤素取代基。在一些实施方式中，支架分子是卤代甲基芳烃，例如选自双(溴甲基)苯、三(溴甲基)苯和四(溴甲基)苯或其衍生物的卤代甲基芳烃。在一些特定实施方式中，支架选自邻-二卤代二甲苯、间-二卤代二甲苯和对-二卤代二甲苯以及1,2,4,5四卤代四甲基苯，例如间-1,3-双(溴甲基)苯(m-T2)、邻-l,2-双(溴甲基)苯(o-T2)、对-l,4-双(溴甲基)苯(p-T2)、间-1,3-双(溴甲基)吡啶(m-P2)、2,4,6-三(溴甲基)三甲基苯(T3)、间-1,3-双(溴甲基)-5-叠氮苯(m-T3-N3)和/或1,2,4,5四溴四甲基苯(T4)。
合适的卤代甲基芳烃衍生物包括邻-双(溴甲基)苯、间-双(溴甲基)苯和对-双(溴甲基)苯。更特别地，1,2-双(溴甲基)苯、1,3-双(溴甲基)苯和1,4-双(溴甲基)苯。进一步取代的卤代甲基芳烃包括1,3,5-三(溴甲基)苯、1,2,4,5-四(溴甲基)苯和1,2,3,4,5,6-六(溴甲基)苯。多环卤代甲基芳烃包括2,7-双(溴甲基)-萘、1,4-双(溴甲基)-萘、1,8-双(溴甲基)-萘、1,3-双(溴甲基)-萘、1,2-双(溴甲基)-萘、2,3-双(溴甲基)-萘、2,6-双(溴甲基)-萘、1,2,3,4-四(溴甲基)-萘、9,10-双(溴甲基)-菲、5,10-双(溴甲基)-蒽和1-(溴甲基)-3-[3-(溴甲基)苄基]苯。甲基取代的卤代甲基芳烃包括1,3-双(溴甲基)-5-甲基苯、2,5-双(溴甲基)-1,3-二甲苯、2,5-双(溴甲基)-1,4-二甲苯、2,4-双(溴甲基)-1,3,5-三甲苯和3,6-双(溴甲基)四甲基苯。硝基取代的卤代甲基芳烃包括3,4-双(溴甲基)-硝基苯和2,3-双(溴甲基)-硝基苯。羟基取代的卤代甲基芳烃包括1,3-双(溴甲基)-5-羟基苯且氰基取代的卤代甲基芳烃包括2,6-双(溴甲基)-苄腈。甲氧基取代的卤代甲基芳烃包括1,3-双(溴甲基)-5-甲氧基苯、1,3-双(溴甲基)-2-甲氧基-5-甲基苯、1,3-双(溴甲基)-5-羟基苯、2,3-双(溴甲基)-1,4-二甲氧基苯和2,5-双(溴甲基)-1,4-二甲氧基苯。
图14中显示了一些适用于本发明的指示物分子中的支架分子。图15中也显示了一些具体的合适支架分子以及建议的命名。
由于卤代甲基芳烃衍生物的相对刚性和易于合成使用，它们是充当本发明中的支架分子的优选候选物。它们特别便于产生受限制的肽底物。然而，人们能够想到用来使指示物分子(例如，肽)“环化”的另一些合适化学方法。在肽含有巯基的情况下(例如：以半胱氨酸的形式)，可以使用简单的二硫键形成或二环氧化物衍生物来进行结构的共价闭合。另一种合适的化学方法包括“点击化学(click chemistry)”方法，所述方法涉及叠氮化物和炔烃之间的环加成反应从而形成稳定的三唑。此处例如带有两个叠氮基赖氨酸氨基酸的肽可通过二炔烃试剂在分子内交联。这类反应可被铜催化。然而，在一些实例(例如，使用张力烷烃(strained alkyne)的那些)中，不需要催化剂。另外的化学途径包括稳定形成腙的途径。含两个苯基肼部分的指示物分子(尤其是肽)可通过二醛试剂在分子内交联。另外的化学途径可通过含两个酪氨酸氨基酸的肽基指示物分子进行。可使用双(重氮)支架使这些肽在分子内交联以形成相应的重氮加合物。
支架分子还可以包含另外的官能团或反应基团以促进酶切切割位点后生成新结合位点。因此，在切割位点切割后，存在至少两部分指示物分子的切割区域，它们不再通过切割位点彼此连接。这些“游离”部分中的一个或多个可通过与支架分子相互作用而变得进一步受限制。这可引起整体分子的结构显著变化。这继而允许生成特异性结合分子，该结合分子不与切割之前的指示物分子交叉反应。因此，例如，在肽被支架分子限制的情况下，人们能够想象切割位点被切割后的特定构象变化。所提供的在肽链中的自由度可允许它通过非共价相互作用以新的稳定构象自组装，从而产生新构象表位，所述新构象表位对于分子是唯一的且被结合分子(例如，针对经切割底物建立的抗体)识别。这些非共价相互作用可包括支架分子中的芳环和氨基酸侧链之间的疏水相互作用。可利用扩展的取代模式进一步增强支架中的非共价相互作用以使得例如带负电荷的硝基取代基能够与切割区域内所含的带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)相互作用。甲氧基和/或羟基芳基取代基与一些氨基酸(包括丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)之间的氢键相互作用也是可以的。此外，切割后，切割区域的两个经切割肽部分可自由地互相自组装，从而引入二级结构例如螺旋或β链结构。在另一些实施方式中，如上所述的肽-支架相互作用和肽-肽相互作用二者的组合可产生被结合分子识别的新结合位点。这种相互作用起着区分未切割“闭合”形式的三维空间结构和切割后的“开放”形式的三维空间结构的作用并因此显著增强了经切割指示物分子和结合分子(例如，针对经切割肽产物建立的抗体)之间相互作用的特异性。所产生的高相互作用特异性有益于检测样品内酶切割活性的灵敏度，因为其方便了使用过量的指示物分子而没有结合分子与未切割指示物分子结合(例如，针对经切割肽建立的抗体与未切割肽结合)的风险。
支架不应该阻碍在一个或多个切割位点的切割。在一些实施方式中，支架可使指示物分子(的切割区域)定位以优化或提高切割位点的切割效率。支架可有效固定或限制切割区域以使得以对检测酶活性有利的方式呈现切割位点。支架分子对切割任何给定底物的影响可容易通过简单的时程实验来检验。检验可确定酶存在情况下在合理时间(例如，5-10分钟)内是否发生切割。该检验可被量化，例如通过质谱分析，任选地结合HPLC，因为它应该形成新水解的分子(具有不同分子质量)，所述新水解的分子在反相分析柱上也应该保持不同。包含支架分子的这些指示物分子可，例如，然后被制备为呈纯化的经切割形式的免疫原。这种免疫原可用来在合适动物(例如，绵羊)中建立抗体，所述抗体的形式是游离肽或者缀合到载体蛋白。然后可通过ELISA将抗血清表征到固定化抗原并可使用抗原柱来亲和纯化和精制与经切割指示物分子特异性反应的多克隆抗体。之后可根据本发明的方法检验完整的指示物分子。
本文公开了一系列适用于本发明的结合分子，该讨论原则上适用于此处。通常，结合分子包括抗体(再次如本文所限定)。
为免生疑问，这些指示物分子可用于本发明的任何方面(装置、工具套装、方法、用途等)。
在本发明的整体语境中，一个或多个切割位点可以是存在可酶促切割键的任何位点。例如，该键可存在于指示物分子的相邻残基之间。这类残基可选自核苷酸、单糖和氨基酸。指示物分子通常包含肽切割区域。因此，在一些实施方式中，切割区域包含氨基酸序列。在一个优选的本发明实施方式中，切割位点是位于两个氨基酸残基之间的特异性肽键。
在另一些的本发明实施方式中，至少一个切割位点位于肽、蛋白质、碳水化合物、脂质或核酸切割区域内。在某些实施方式中，可改造指示物分子以使得其包含酶的天然底物或其一部分，这样酶就被呈递有其天然切割位点(任选地在切割区域内处于其天然状态)。在某些另一些实施方式中，可改造指示物分子以使得其包含人工切割位点或非天然切割位点和/或底物区域。例如，可以改造或者突变指示物分子中的切割位点以使得酶所展示的切割活性速率或切割活性特异性相对于在可比较条件下针对酶的天然底物测量的酶的切割活性速率和/或切割活性特异性增加(或降低)。
在某些本发明实施方式中，切割区域可包含多个切割位点，其中在任何一个位点的切割产生至少两部分切割区域，其中至少一部分保持与捕获位点相连接。在本发明的语境中，术语“多个”表示至少两个、至少三个、至少四个等等。在某些实施方式中，指示物分子的切割区域包含介于2、3、4、5个和10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、100、500或1000个之间的切割位点。在一些实施方式中，指示物分子包含介于2个和5、6、7、8、9或10个之间的切割位点。
在一种实施方式中，多个切割位点可以全部相同。在这种构型中，重复的切割位点可以相对非特异或者可以对上文限定的一种或酶亚型高度特异。此外，使用这种类型的指示物分子可有助于提高酶检测装置的灵敏度，这是通过提供增加检验样品内存在的切割位点的浓度的方法实现的。
在另一些实施方式中，指示物分子的切割区域可包含多个切割位点，其中同一指示物分子内存在至少两个不同的切割位点。在一些优选的本发明实施方式中，指示物分子可包含至少三个、至少四个、至少五个、直至至少八个不同的切割位点。
在一个进一步优选的实施方式中，不同切割位点被不同酶或上文所限定的不同类别、子类别或亚型的酶识别，以使得本发明的装置可用于检测多种不同酶的活性。当根据本发明测量多种效应物分子时，情况尤其如此。可对活性进行分组，以使得酶活性的检测提供有用的结果。例如，MMP组(例如，MMP 8和MMP 9)可参与加剧事件，这样检测该酶组中的一个或多个的相关活性能用于预测或鉴定炎症加剧。
对于检验样品中要检测的酶活性水平极低的情况，使用多个切割位点(无论是否相同)可以是特别有用的。例如，上文所限定的具有多个切割位点的指示物分子可用于检测含低水平蛋白酶的尿样品中的酶活性。当指示物分子包含支架分子时，使用多个切割位点也可以是特别适用的。
除了含至少一个切割位点的切割区域之外，指示物分子还包含捕获位点。捕获位点介导指示物分子与捕获区内存在的捕获分子结合。因此，捕获位点是指示物分子的一部分，其负责将指示物分子保留或者定位在捕获区内。指示物分子被切割之后，捕获位点可保持完整或基本上完整，以使得该位点仍然被装置捕获区内存在的捕获分子识别并与其结合。在这些情况下，完整的指示物分子和切割后包含捕获位点的那部分指示物分子二者均将与捕获区内的捕获分子结合。捕获位点可包含任何合适的分子，例如生物素分子。支架分子也可以形成捕获位点的一部分或者全部以允许在捕获区固定指示物分子。例如，捕获区可包含针对支架分子建立的抗体，所述支架分子优选地呈与指示物分子相连的形式。在这些实施方式中，支架分子基本上不参与和结合分子结合。指示物分子效力的关键是：切割发生后，通过捕获位点和捕获分子之间的相互作用固定在捕获区并同时与结合分子结合来。在支架分子限定了切割后结合分子的一部分结合位点的那些实施方式中，捕获位点必须足够独特以避免结合事件之一或二者被阻止。
如上所述，切割位点可以在肽、蛋白质、碳水化合物、脂质或核酸切割区域内。在一些特定的本发明实施方式中，切割区域和捕获位点由肽或蛋白质内的分立的氨基酸组或氨基酸限定。在本文中使用时，术语“肽”旨在表示不多于(约)20、30、40或50个氨基酸的长度的氨基酸。
或者，捕获位点可存在于指示物分子的一个区域内，所述区域与切割位点所在的区域是分离的。因此，在某些本发明实施方式中，捕获位点可存在于指示物分子的捕获区域内，且切割位点可存在于分离的切割区域内。在捕获位点处于与切割位点分离的指示物分子区域内的实施方式中，捕获位点可包含与在含切割位点的分子区域内发现的物质或残基完全不同的物质或残基。例如，切割区域可包含氨基酸残基而捕获位点可包含生物素部分或由生物素部分组成。此外，在指示物分子包含带有切割位点和捕获位点的分离区域的实施方式中，可通过本领域技术人员已知的任何方法使所述区域相关联。在一个优选的实施方式中，可通过直接共价键使所述区域相关联。所述区域可紧邻或者可被连接子或间隔子(例如，聚乙二醇部分)隔开。
在尿中检测的效应物分子于别处讨论。待根据本发明检测的这些酶必须能够在切割位点切割指示物分子。对于待在切割位点切割的指示物分子，该活性是必需的以产生至少两部分指示物分子切割区域，其中至少一部分保持与捕获位点相连接。
在本发明的语境中，指示物分子可(通过捕获位点)与捕获分子以相对高的亲和力结合。在一些实施方式中，指示物分子的解离常数(kd)相对低且优选地介于1x 10-17M和1x10-7M之间(取决于试验所需的灵敏度)。在某些本发明实施方式中，指示物分子的解离常数介于1x 10-15M和1x10-9M之间。
在某些本发明实施方式中，这种相互结合作用可由于指示物分子的捕获位点与捕获区中存在的捕获分子的直接结合而被实现。在该语境中，直接结合表示指示物分子(通过捕获位点)与捕获分子结合而没有任何中间物。
在一些本发明实施方式中，指示物分子的捕获位点和捕获区中存在的捕获分子是结合对的两半。在该语境中，结合对由能够彼此结合的两个分子或实体组成。在某些本发明实施方式中，相互结合作用是特异的以使得结合对的每个成员只能与其各自的伴侣(partner)或者有限数量的结合伴侣结合。此外，如上文所详述，结合对优选展示出相对高的亲和力。结合对可以是在自然中发现的结合对或者人工生成的相互作用分子或实体对。
在一些本发明实施方式中，指示物分子的捕获位点和捕获分子是结合对的两半，其中结合对选自以下：抗原和抗体或抗体的抗原结合片段；生物素和亲和素、链霉亲和素、中性亲和素或captavidin；免疫球蛋白(或其合适结构域)和蛋白A或蛋白G；碳水化合物和凝集素；互补核苷酸序列；配体和受体分子；激素和激素结合蛋白；酶辅因子和酶；酶抑制剂和酶；纤维素结合结构域和纤维素纤维；固定化的氨苯基硼酸和顺式-二醇携带分子；以及木葡聚糖和纤维素纤维及其类似物、衍生物和片段。
在一些特定的本发明实施方式中，结合对由生物素和链霉亲和素组成。在一个另外的本发明实施方式中，指示物分子的捕获位点包括表位且捕获分子包括抗体，所述抗体与存在于第一捕获位点的表位特异性结合。在本发明的语境中，术语抗体包括来自任何物种的天然免疫球蛋白、嵌合抗体、人源化抗体、F(ab')2片段、Fab片段、Fv片段、sFv片段和高度相关分子例如基于保留特异性结合亲和力的抗体结构域的那些(例如，单结构域抗体)。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。因此，在一些特定实施方式中，捕获分子包括抗体。在另一些实施方式中，捕获位点包括生物素分子且捕获区包括链霉亲和素分子。
在某些本发明实施方式中，指示物分子的捕获位点与装置的捕获分子的结合可以是间接的。在本发明的语境中，“间接结合”表示由一些中间实体介导的结合，所述中间实体能够桥接指示物分子的捕获位点和捕获分子，例如能够同时结合指示物分子的捕获位点和捕获分子的“衔接子”。
当指示物分子和捕获分子的结合是间接的且由衔接子介导时，多个指示物分子可与每个捕获分子结合。在该语境中，多个表示至少两个、至少三个、至少四个等等。这可通过包含多价衔接子分子来实现，所述多价衔接子分子例如，除了由生物素组成或者包含生物素的捕获分子之外，能够同时与多个含生物素的指示物分子结合的链霉亲和素分子。
如本文中所详述的，其中多个指示物分子与每个捕获分子结合的装置的实施方式可用来实现提高的试验准确度。
本发明的这种实现方式的另一关键分子是结合分子。本发明依赖于能够与切割产生的新结合位点或者切割后含有捕获位点的那部分指示物分子结合的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合。因此，在一些特定实施方式中，结合分子包括抗体。为免生疑问，术语抗体包括来自任何物种的天然免疫球蛋白、嵌合抗体、人源化抗体、F(ab')2片段、Fab片段、Fv片段、sFv片段和高度相关分子例如基于保留特异性结合亲和力的抗体结构域的那些(例如，单结构域抗体)。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。发明人已生成了下述抗体，所述抗体仅在切割后识别切割区域，因此直到在切割位点的切割发生，所述抗体才能与指示物分子结合(达到任何显著程度)。可根据本领域已知的技术来生产抗体。这可依赖于利用切割产物对动物(例如绵羊、兔或山羊)进行免疫。例如，可使用切割后保持与捕获位点相连接的那部分切割区域(任选地包括捕获位点自身)进行免疫。可将多克隆抗体从血清中分离并进行亲和纯化。可使用众所周知的表征的杂交瘤技术生产单克隆抗体。在一些实施方式中，结合分子还可包含适配子。
因此，本发明还提供结合分子，通常是抗体，其在切割后与本文所限定的指示物分子结合。本发明提供结合分子，通常是抗体，其与指示物分子中作为切割结果产生的新结合位点结合，其中直到切割发生，结合分子才能与指示物分子结合。在一些实施方式中，结合分子在切割区域结合。在一些特定实施方式中，切割至少一个切割位点产生至少两部分指示物分子切割区域，其中至少一部分保持与捕获位点相连接且作为切割的结果含有结合分子的结合位点，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述结合位点结合。在一些实施方式中，切割至少一个切割位点产生指示物分子的两个分离部分，因此切割后，结合分子与分离部分之一或二者结合。与此相符，本发明提供结合分子，任选地是抗体，其与包含氨基酸序列GPQG的指示物分子结合但不与包含氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)(作为切割区域)的指示物分子结合。类似地，本发明提供结合分子，任选地是抗体，其与包含氨基酸序列IFGQ的指示物分子结合但不与包含氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)(作为切割区域)的指示物分子结合。
在其中指示物分子结构受到限制且其中切割至少一个切割位点产生至少两部分保持彼此相连的指示物分子切割区域的本发明实施方式中，切割后结合分子可与切割区域结合。在一些特定实施方式中，切割后，结合分子与指示物分子切割区域的两部分均结合。因此，切割后，结合分子可结合有效跨越切割位点的区域。切割后，指示物分子的结构限制(例如，使用本文所述的支架分子)提供良好限定且稳定的结合分子的结合位点。在一些特定实施方式中，结合分子所结合到的结合位点代表指示物分子的新结构构象。切割可产生至少一个新构象表位。结合分子的结合位点可包含指示物分子的任何部分。这可存在以下前提条件：指示物分子的酶切割活性和/或捕获基本上不被结合分子的结合所阻碍。在某些实施方式中，结合位点包含切割区域的至少一部分和/或与支架分子相连且将支架分子与切割区域分开的连接子或间隔子区域的至少一部分。在另一些实施方式中，结合分子可与包含至少部分支架分子的新结合位点结合。
可利用报告分子直接或间接标记结合分子以允许检测结合分子与指示物分子的结合。报告分子可以是适合通过本领域技术人员可用的任何方法检测的任何物质或部分。因此，报告分子通常能够生成或产生信号。在某些本发明实施方式中，报告分子选自以下：金颗粒；色原；发光化合物；荧光分子；放射性化合物；可见化合物；脂质体或包含信号生成物质的其他囊泡；电活性物质；或者酶和其底物的组合。适用作报告部分的酶-底物组合可以是碱性磷酸酶和硝基蓝四唑5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸底物。在一个特定的本发明实施方式中，报告部分是金颗粒。
本发明中还涵盖了利用报告分子间接标记结合分子。因此，报告分子可与另外的结合分子相连，而另外的结合分子转而与结合分子相结合以提供标签。这种间接结合可由能够同时结合结合分子和报告分子的衔接子介导。作为其中结合分子是抗体的示例性实施方式，间接标记可由以特异性方式与抗体结合分子结合的另外的抗体介导。可利用报告分子直接标记另外的抗体，所述报告分子例如金颗粒；色原；发光化合物；荧光分子；放射性化合物；可见化合物；脂质体或包含信号生成物质的其他囊泡；电活性物质；或者酶和其底物的组合。适用作报告部分的酶-底物组合可以是碱性磷酸酶和硝基蓝四唑5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸底物。在一个特定的本发明实施方式中，报告部分是金颗粒。
在报告分子凭借衔接子分子与结合分子结合的本发明实施方式中，可以在将检验样品加入指示物分子中之前，使衔接子与结合分子预复合，条件是：衔接子不妨碍结合分子与经切割指示物分子的结合。
衔接子可以是能够介导结合分子与报告分子的间接相互作用的任何物质或分子。在一些实施方式中，衔接子是链霉亲和素且结合分子包括生物素分子。衔接子也可以是“衔接子结合对”，其中所述结合对包括：
(i)能够与结合分子结合的第一成员；和
(ii)能够与结合对的第一成员和报告分子结合的第二成员。在某些本发明实施方式中，指示物分子的检测区域包括生物素，衔接子结合对的第一成员是亲和素或链霉亲和素，衔接子结合对的第二成员是生物素，且报告分子包括能够结合生物素的部分。
包含衔接子分子或者衔接子结合对可促进多个报告分子与每个结合分子的结合。例如，使用多价链霉亲和素作为衔接子将允许含生物素的结合分子和多个含生物素的报告分子的同时结合。
在某些实施方式中，可以在侧向流或纵向流装置中进行本发明。因此，一般而言，本发明(或者一个或多个检测装置)可依赖于某种形式的固体支持物。固体支持物可限定样品的液体流动路径。在一些特定实施方式中，固体支持物包括色谱介质或毛细流动装置。在一些实施方式中，可以以检验条形式提供本发明。代表性例子示于图2中并在本文中更详细地描述。
在一些特定的本发明实施方式中，捕获区形成于固体支持物上。旨在涵盖捕获分子可与其连接从而形成捕获区的任何支持物。固体支持物可为例如珠子(例如，sepharose或琼脂糖珠子)或孔(例如，在微孔板中)的形式。因此，在某些实施方式中，装置包含固体支持物，其中捕获分子与所述固体支持物连接从而形成捕获区。在本发明工具套装的情况下，可以提供未与捕获分子连接的固体支持物。在这些实施方式中，在使用带有检验样品的装置之前，工具套装的使用者可将捕获分子固定在固体支持物上以形成捕获区。因此，工具套装可还包含用于将捕获分子固定在固体支持物上的工具。固定化工具可包括允许形成捕获区的任何合适试剂。可利用合适的固定化工具预形成固体支持物。例如，固体支持物可包含生物素分子，所述生物素分子被排列为与形成(部分)捕获分子的亲和素(例如，链霉亲和素)分子相互作用。当然，如本文所述和如本领域技术人员所容易理解的，可以利用其他结合对相互作用将捕获分子固定在固体支持物上以形成捕获区。
捕获区可以通过在其中或之上固定化能够与指示物分子的捕获位点结合的捕获分子来限定。可通过任何合适的方法实现捕获分子的固定化。当装置是包含色谱介质的流动装置时，捕获分子可通过与介质直接结合而被固定化或者通过与和介质相连或关联的载体分子(例如，蛋白质)结合而被间接固定化。
在另一些实施方式中，固体支持物还包含样品施加区，样品施加在所述样品施加区上。样品施加区可预先加载有指示物分子，以使得当施加检验样品时，样品中的任何酶均作用于样品施加区内的指示物分子的切割位点。样品施加区可包含屏障，所述屏障保持样品在样品施加区中持续预定的时段。这允许样品与指示物分子相互作用持续足够的时期以达到可测量水平的切割。如本领域技术人员所容易理解的，取决于待检测的酶，所述时期可以是1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、60分钟或更长。该段时间后，屏障可被样品降解或者以其他方式被除去，从而允许样品继续流过装置。或者，可预混合或预孵育检验样品和指示物分子，然后将混合物加入装置(例如样品施加区)中。然而，当可预混合或预孵育检验样品和指示物分子时，可以省略样品施加区。此处，可以将混合物直接加入捕获区中以允许通过与捕获分子的相互作用来固定指示物分子。在一些实施方式中，可在位于捕获区上游的位点将检验样品施加到色谱介质中以使得检验样品通过例如毛细管作用穿过捕获区被拖动。色谱介质可由流体能够穿过的任何物质(例如，流体通道或多孔膜)制成。在某些本发明实施方式中，色谱介质包含条或膜，例如硝化纤维条或膜。
在装置中，结合分子必须以允许与指示物分子(如果在切割位点切割的话)相互作用的方式被提供。因此，可以将结合分子与指示物分子预混合，然后施加到装置。这可以在指示物分子已与检验样品混合之前或之后。优选在之后以避免结合分子可能对(检验样品中的)在指示物分子的切割位点的酶活性造成的任何影响。结合分子也可以被提供在装置上或装置中位于捕获区上游的任何点，以使得在指示物分子被固定(通过指示物分子的捕获位点和限定捕获区的捕获分子之间的相互作用)之前，结合分子遇到检验样品和指示物分子。或者，可以在已经将检验样品和指示物分子加到捕获区之后，将结合分子加到捕获区。这能够保证任何指示物分子均已被固定在捕获区，从而提供(在经切割指示物分子的情况下)结合分子的结合位点以产生信号。
取决于待检测的特定酶切割活性，在装置或方法中包含合适的酶抑制剂可以是有必要的。这对于防止酶作用于装置或方法的其他组分(例如，结合分子或捕获分子)可以是重要的。当检验样品与指示物分子一起预孵育时，在孵育阶段结束时添加酶活性抑制剂可以是有利的。这优选地在结合分子接触检验样品之前。或者，一种或多种酶活性抑制剂可被包含在装置中位于结合分子上游的任何点，其中结合分子被提供在装置上或装置中。这是在捕获区上游(根据上文所述)。抑制剂可被简单干燥或者被动吸附到装置上以使得当检验样品穿过装置时使抑制剂流通。应该注意的是，使用抑制剂不是必需的且在抑制剂将导致不能检测尿中的其他标志物时可被排除。例如，根据本发明检测的一些酶活性(例如，特异性蛋白酶活性)可足够特异，从而蛋白酶将不作用于装置或方法中除了底物之外的任何其他组分。特定酶的切割位点在本领域是众所周知的，其可用来设计装置和方法的多个组分。例如，可进行(例如，使用可免费获取的工具例如根据标准设置的BLAST)计算机筛选以确定待检测酶的切割位点不包含在任何相关分子(例如，结合分子和捕获分子)内。还可以通过将相关分子(例如，结合分子和捕获分子)与待检验的酶活性一起孵育并检测是否发生切割来检查交叉反应性。在一些实施方式中，由于待检测的酶切割活性的性质，待检测的酶切割活性将不作用于相关分子。例如，如果要检测核酸酶活性，则核酸酶活性不应该展示出与抗体结合分子或链霉亲和素或抗体捕获分子有关的任何切割活性。
固体支持物可进一步包含对照区，相对于样品流，所述对照区位于捕获区和样品施加区(若存在的话)的下游，其含有与结合分子结合的另外的结合分子以指示使用装置的试验成功完成。或者，另外的结合分子可以与加入到样品或装置中并与样品一起流过装置的另外的分子结合。可以用本文所限定的报告分子直接或间接标记另外的分子。优选地，报告分子与和结合分子相连的报告分子相同以易于检测，但也可以不同。对照区与捕获区在空间上分离，例如如果报告分子结合或固定在各个区中的话，以用来产生两条分离的检验线。这种对照区用来确认检验样品(包括结合分子)已穿过整个装置和确认装置正确运行。预期在对照区有阳性信号，这不依赖于样品中是否存在酶切割活性。基于与指示物分子的切割位点结合的结合分子的性质或者基于加入到样品中的另外的分子的性质来选择另外的结合分子。结合分子和另外的结合分子或另外的分子和另外的结合分子可形成本文所限定的结合对。例如，如果结合分子是物种特异性抗体(例如，绵羊抗体)，则另外的结合分子可以是抗物种抗体(例如，抗-绵羊抗体)。或者，如果另外的分子是来自不同物种(例如，鸡或山羊)的抗体，则另外的结合分子可以是合适的抗物种抗体。这允许凭借特异性相互作用将结合分子或另外的分子固定在对照区。可通过任何合适的方法(例如，通过共价相互作用或非共价相互作用)将另外的结合分子固定在对照区。
虽然这些实施方式主要是关于测定尿样品中效应物分子的水平描述的，但同样的技术也可用于测定其他标志物。特别地，可通过类似技术测定效应物抑制剂分子的水平。预期抑制剂分子将降低效应物分子的活性，因此能够例如通过竞争性试验来检测尿中效应物抑制剂分子的水平。例如，在存在已知量的加入到样品中的效应物分子的情况下，能够测定效应物抑制剂分子的水平。
下表和表2.1a中示出了适用于特定标志物的试验方式的一些实例：
因此，能够容易看出，ELISA和侧向流方式特别适用于本发明。酶谱法可用于某些标志物。
发明人已想到了多种试验来测定本文所述标志物的水平。
可用于本发明中的一种标志物是N-乙酰基Pro-Gly-Pro(Ac-PGP)，其是中性粒细胞趋化因子，来源于细胞外基质(ECM)的分解且在气道炎症期间生成。在炎症疾病例如慢性阻塞性肺病(COPD)中，Ac-PGP通过中性白细胞的蛋白水解作用从胶原上被切下。根据本发明，可通过酶免疫分析法(EIA)检测Ac-PGP。在某些实施方式中，EIA是竞争性试验。因此，本发明提供用于检测尿样品中Ac-PGP的竞争性酶免疫分析，其包括：
(a)使尿样品与其上为固定化PGP的免疫分析表面(例如，以AHX-PGP或Ac-PGP的形式)接触
(b)向样品中加入与PGP特异性结合的试剂(例如，抗体，如本文所限定，一个具体实例是CF1763)，所述试剂缀合到酶(例如碱性磷酸酶)
(c)移除未结合到免疫分析表面的试剂
(d)测量免疫分析表面酶活性的水平作为样品中Ac-PGP水平的指示。
在样品中缺乏Ac-PGP的情况下，固定在免疫捕获表面上的PGP将与所述试剂结合并因此检测酶活性。随着样品中的Ac-PGP水平提高，这些分子将竞争与所述试剂结合并因此降低免疫捕获表面的酶活性水平。一个优选的试剂是绵羊抗-Ac-PGP抗体CF1763。一种替代物是CF1764。在一些实施方式中，试剂可以缀合到碱性磷酸酶。图34中显示了合适试验方式的示意图。图35中显示了这种试验的代表性校准曲线。这种试验可被称为版本3。
一种替代性的试验利用固定化的Ac-PGP结合试剂，例如抗-Ac-PGP抗体(例如，CF1763–版本1或CF1764–版本2作为捕获抗体)。此处，竞争试剂可以是B-AHX-PGP(生物素化的AHX-PGP)，其与样品中的Ac-PGP竞争。然后，第三步利用链霉亲和素AP(链霉亲和素碱性磷酸酶)标记在样品中缺乏“游离”Ac-PGP的情况下结合到抗体捕获线的任何B-AHX-PGP。
在另一些实施方式(包括使用侧向流作为上文提及试验的方式)中，可以以侧向流方式检测Ac-PGP。
可用于本发明中的另一种标志物是N-甲酰化肽如fMLP(N-甲酰基-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-苯丙氨酸)。中性粒细胞通过产生和释放杀灭细菌的活性氧类和表达吸引其他免疫细胞至感染位点的趋化因子来响应细菌感染。N-甲酰化肽如fMLP(N-甲酰基-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-苯丙氨酸)作为有效的化学引诱物起着重要作用。fMLP源于多种细菌(作为细菌的蛋白加工机制的结果)和/或源于降解的细菌(PAMP)。fMLP也可以在真核细胞线粒体蛋白(例如，“DAMP”)中产生。N-甲酰基肽受体与G-蛋白偶联并引发/传播人中性粒细胞和其他细胞中的吞噬和促炎症反应，例如用fMLP刺激后产生活性氧中间体(例如，超氧化物；O2-·)。根据本发明，可通过酶免疫分析法(EIA)检测fMLP。在某些实施方式中，EIA是竞争性试验。因此，本发明提供用于检测尿样品中fMLP的竞争性酶免疫分析，其包括：(a)使尿样品与其上为固定化fMLP的免疫分析表面(例如，通过缀合到表面上的白蛋白分子例如卵清蛋白)接触
(b)向样品中加入与fMLP特异性结合的试剂(例如，抗体，如本文所限定，一个具体实例是CF1573)，所述试剂缀合到酶(例如碱性磷酸酶)
(c)移除未结合到免疫分析表面的试剂
(d)测量免疫分析表面酶活性的水平作为样品中fMLP水平的指示。
在样品中缺乏fMLP的情况下，固定在免疫捕获表面上的fMLP将与所述试剂结合并因此检测酶活性。随着样品中的fMLP水平提高，这些分子将竞争与所述试剂结合并因此降低免疫捕获表面的酶活性水平。一个优选的试剂是绵羊抗-Ac-fMLP抗体CF1573。在一些实施方式中，试剂可以缀合到碱性磷酸酶。图36中显示了合适试验方式的示意图。图37中显示了这种试验的代表性校准曲线。
在一些实施方式中，可以以侧向流方式检测fMLP。
炎症期间弹性蛋白纤维的降解由被称为弹性蛋白酶的酶引起。中性粒细胞弹性蛋白酶(由活化的中性粒细胞释放)和MMP 12(由肺巨噬细胞释放)是两种重要的炎性弹性蛋白酶。锁链素从弹性蛋白上被切下，其是降解过程的分子信号，指示白细胞活性提高或上升。分泌在尿中的锁链素的量与弹性蛋白降解程度直接相关，其继而指示组织损伤水平。锁链素小至足以穿过肾脏。过量中性粒细胞白细胞活性是加剧的关键驱动因素。发明人已研发了锁链素片段试验以及锁链素试验。本发明提供能够测量锁链素以及仍然附着于弹性蛋白纤维的锁链素的试验。这种形式依赖于使用针对不同大小的弹性蛋白片段建立的多种抗体，所述弹性蛋白片段来源于用人中性粒细胞弹性蛋白酶切割。根据本发明，可通过酶免疫分析法(EIA)检测锁链素片段。在某些实施方式中，EIA是竞争性试验。因此，本发明提供用于检测尿样品中锁链素片段的竞争性酶免疫分析，其包括：
(a)使尿样品与其上为固定化锁链素片段的免疫分析表面(例如，通过缀合到表面上的白蛋白分子例如卵清蛋白)接触
(b)加入与样品中的各锁链素片段特异性结合的一系列试剂(例如，抗体组，如本文所限定，一种具体实例是CF1673、CF1674和CF1675)，每种所述试剂均缀合到酶(例如碱性磷酸酶)
(c)移除未结合到免疫分析表面的试剂
(d)测量免疫分析表面酶活性的水平作为样品中锁链素片段水平的指示。
在样品中缺乏锁链素片段的情况下，固定在免疫捕获表面上的锁链素片段将与所述试剂结合并因此检测酶活性。随着样品中的锁链素片段水平提高，这些分子将竞争与所述试剂结合并因此降低免疫捕获表面的酶活性水平。一个优选的试剂系列是绵羊抗-锁链素片段抗体CF1673、CF1674和CF1675。在一些实施方式中，试剂可各自缀合到碱性磷酸酶。图38中显示了合适试验方式的示意图。在一些实施方式中，在分开的单独试验中使用系列中的各试剂，这在本文中被称为版本1、版本2和版本3。图39中显示了弹性蛋白降解产物的HPLC分析，所述降解产物可被用作免疫原以产生特异性抗体。弹性蛋白片段可以是小弹性蛋白片段。小弹性蛋白片段的分子量通常不大于30000Da，例如介于1000Da和30000Da之间。在一些实施方式中，可以还测量或者单独测量未与锁链素相连的小弹性蛋白片段。
类似地，本发明提供用于测量大弹性蛋白片段(LEF)的试验。大弹性蛋白片段表示分子量大于约30000Da的弹性蛋白片段。这种形式依赖于使用针对大弹性蛋白片段建立的多种抗体，所述大弹性蛋白片段来源于用人中性粒细胞弹性蛋白酶切割(也参见图39)。根据本发明，可通过酶免疫分析法(EIA)检测大弹性蛋白片段。在某些实施方式中，EIA是竞争性试验。因此，本发明提供用于检测尿样品中大弹性蛋白片段的竞争性酶免疫分析，其包括：
(a)使尿样品与其上为固定化大弹性蛋白片段的免疫分析表面(例如，通过缀合到表面上的白蛋白分子例如卵清蛋白)接触
(b)加入与样品中的各大弹性蛋白片段特异性结合的一系列试剂(例如，抗体组，如本文所限定，例如CF1669、CF1670和CF1673(均针对LEF纯化))，每种所述试剂均缀合到酶(例如碱性磷酸酶)
(c)移除未结合到免疫分析表面的试剂
(d)测量免疫分析表面酶活性的水平作为样品中大弹性蛋白片段水平的指示。
在样品中缺乏大弹性蛋白片段的情况下，固定在免疫捕获表面上的大弹性蛋白片段将与所述试剂结合并因此检测酶活性。随着样品中的大弹性蛋白片段水平提高，这些分子将竞争与所述试剂结合并因此降低免疫捕获表面的酶活性水平。在一些实施方式中，试剂可各自缀合到碱性磷酸酶。
在一些实施方式中，在分开的单独试验中使用系列中的各试剂，这在本文中被称为版本1、版本2和版本3。
本发明的方法依赖于确定尿样品中至少一种标志物的水平变化。因此，对检验样品和于更早时间点取自同一对象的至少一种尿样品中的水平进行比较。比较允许确定相较于更早的一种或多种尿样品，标志物水平是否提高、降低或者没有变化。本发明的一个关键方面是使炎症状态监测个体化以准确鉴定和/或预测加剧的能力。因此，根据本发明的所有方面，可参照针对对象调整的(或个体化的)的标志物阈值水平计算至少一种标志物的提高水平。因此，本发明可依赖于一种或多种相关标志物的个体化基线水平，阈值是针对该基线水平计算出的。计算可在持续进行以与检验一致。因此，阈值可以是源于波动基线的波动阈值。能够轻松收集尿样品极大促进了对逐个对象进行纵向测量的能力。通过利用易于收集的样品来提供家庭监测，预计依从性显著提高。因此，本发明依赖于通过随时间重复检验尿样品来监测个体的炎症状态。在该语境中，显然一种或多种标志物的水平不是必需按绝对方式测定，其可以以绝对方式或相对方式来测量。标志物仅仅必须以允许在不同时间点获取的尿样品中比较标志物水平的方式测量。因此，除非另有说明，在说明书全文中应该相应地解释“水平”。例如，可以相对于参照分析物来测量水平，其中无论加剧状态如何，所述参照分析物在尿样品中均以稳定浓度存在。
在一些实施方式中，通过测定在更早时间点取自对象的尿样品中标志物的水平来设置标志物的阈值水平。在其最简单的形式中，本发明可依赖于先前取得的尿样品(即，单个更早时间点)中标志物的水平和检验样品的简单比较。然而，更早时间点通常可包括在临近(immediately preceding)测定目前的尿样品中标志物水平时的至少两次，以及还可以的3、4、5、6、7、8、9、10次等更早测量。可经数天或数周(例如，1、2、3、4、5或6周或更长)取得这些更早测量。可在稳定疾病期间设置基线以确定起始阈值，进一步的变化是针对所述起始阈值测量的。最初可通过常规方法鉴定稳定疾病。替代性地或者额外地，可在加剧期间设置基线以确定起始阈值，进一步的变化是针对所述起始阈值测量的。最初可通过常规方法鉴定加剧。
当在多个时间点测量标志物水平时，可取这些水平的平均值以提供检验样品的阈值，高于该阈值便预测或鉴定加剧。在一些实施方式中，可参照滑动窗口设置阈值，在所述滑动窗口内，标志物水平已被测量以提供基线。阈值水平因此被系统“得知”。其不是固定的阈值，而是针对对象进行调整，从而考虑到了不预测或指示加剧事件的标志物水平从基线的不显著波动。因此，阈值可被设置在基线附近以指定允许的标志物水平范围，超过该范围即指示水平的统计学显著提高(或降低)。在存在标志物基线水平漂移的情况下，可以将参数界限变窄以使得标志物水平的进一步变化被视为显著。例如，如果基线标志物水平随时间向上漂移，则被视为已超过阈值(即，是显著的)可需要较小(相较于基线相对稳定的情况)的测量的提高和基线之间的差异。这旨在防止漏掉“缓慢发病的”加剧。例如，与基线至少5％、10％、15％、20％或更多的差异通常可被视为显著。在以下条件下可减小这种差异：已存在多次先前的测量展示出向上或向下的趋势，但每种情况中向上或向下的量均小于阈值差异。在基线向上或向下漂移的事件中，差异(为了被视为显著)可因此被减小至至少1％、2％、3％、4％、5％或酌情更多。
在一些实施方式中，通过测定在更早时间点(此时对象没有遭受炎症加剧)取自对象的尿样品中标志物的水平来设置标志物的阈值水平。可基于观察到统计学上显著偏离参照非加剧水平设置的基线来预测或鉴定加剧。因此，可在个体基础上测量稳定状态水平以提供未来监测中用于检测有意义变化的标准。
在另一些实施方式中，至少每周两次测定至少一种标志物的水平。在一些实施方式中，可至少每周1、2、3、4、5、6次或每天测定标志物水平。为免生疑问，在每种情况下，可在新收集的尿样品中检测标志物水平。
阈值旨在允许检测朝向加剧的“漂移”或逐渐移动以及朝向加剧的更突然的状况衰退二者(通过提高水平的一种或多种标志物反映)。因此，阈值可以是针对对象个体化的波动阈值。对于待检测的一种或多种标志物的水平，所述阈值允许与基线的任何显著(即，统计学显著)偏差，从而指示或预测加剧事件。可针对同一对象之前遭受的加剧事件调整或训练基线和计算出的阈值。可针对由对象获取的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次等先前测量设置基线和由其计算出的阈值。如本领域技术人员所充分理解的，可针对更近期的测量来加权阈值。
如本文中所详细讨论的，可针对多种标志物设置阈值。因此，可基于与基线的偏差来确定加剧的预测或鉴定，所述基线是根据测量的多种标志物累加的基线。然而，通常参照标志物特异性基线并针对标志物特异性阈值单独测量每种标志物。本文显示：使用多种单独标志物提高预测或鉴定加剧的能力。这看起来是因为，在不同个体中，利用不同标志物可更准确地预测或鉴定加剧。因此，取决于所应用的单独标志物(通常是三种或者更多种)，本发明可依赖于多个波动基线/阈值。所述方法和系统可加权多种标志物的贡献。因此，在预测或鉴定加剧方面，对于评估多于一种(为2、3、4、5种等)标志物，例如当在相同样品中测量时，可给予额外的权重。因此，例如，评估2种标志物可预测或鉴定加剧，而评估1种标志物可导致提高的检验频率以更密切地监测是否发生或将发生加剧。
阈值还可用来指导取样/检验频率。例如，在一些实施方式中，如果检测到至少一种标志物的水平提高，则提高测定取自对象的尿样品中至少一种标志物的水平的频率。这可用来提高预测或鉴定加剧的灵敏度或准确度。例如，频率可由每周一次或每周两次提高至每天一次或者从每天一次提高至每天两次。在某些实施方式中，维持测定取自对象的尿样品中至少一种标志物的水平的频率(在提高的水平)直至检测到至少一种标志物的水平降低。因此，可维持监测频率直至已鉴定或预测加剧。在治疗期间也可以维持监测频率(在提高的水平)以监测加剧事件的治疗效果。在一些实施方式中，在治疗期间可进一步提高监测频率(例如，每6小时、8小时或12小时检测一次)。
本发明可依赖于测定在多个时间点取自对象的尿样品中多种，例如至少两种或三种(或4、5、6、7、8、9、10个或更多种)标志物的水平。在一些特定实施方式中，尿样品中至少一种标志物的水平提高(相对于个体化基线，超过阈值)指示或预测炎症加剧。在一些实施方式中，尿样品中至少一种标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
当测定多种标志物的水平时，可利用合适的算法来解释数据并应用它来提供预测或鉴定。在一些实施方式中，标志物水平可以相互依赖，因此算法基于这种预测的关系(例如，效应物分子和效应物抑制剂分子之间)。在某些实施方式中，以预定顺序分析至少两种或三种(或更多种)标志物的测定水平以监测对象的炎症状态。如本文中进一步解释和图中所显示的，这可产生决策树以指导进一步的取样和对象的治疗。例如，图24显示了合适的检验流程，其基于测定效应物抑制剂(TIMP2)、随后是效应物(MMP活性)、接着是另外的效应物抑制剂标志物(A1AT)的水平。因此，在一些实施方式中，对于给定的样品，可以依次分析标志物水平直到发现标志物的水平提高(或者所有标志物已被检查)。如果检测到标志物的水平提高，则还可以评估或者可以不评估其他标志物以确定它们的水平是否也提高。在样品中多种标志物增加的事件中，加剧的可能性可更高，且在给出的结果中算法可对此有体现，例如通过加权观察结果。因此，可基于相较于阈值有多少标志物的水平提高来对样品进行“分级”。例如，等级1可指示样品中只有一种标志物增加，等级2可指示两种标志物增加等等。等级3或更高等级可预测或鉴定加剧。
在一些实施方式中，性别被包含在算法中。如本文中用实验方法所显示的，性别可影响使用的标志物和给定算法中应用的水平。
在一些实施方式中，效应物分子增加而相应抑制剂分子没有相应增加可指示加剧的早期预警信号。两种分子的水平提高可指示早期加剧。抑制剂水平提高且效应物水平降低可指示加剧后期或预测恢复期(的开始)。如果多种标志物增加，则不需要例如进一步取样即可预测或鉴定加剧(例如，等级3或更高等级)。一种标志物的水平提高可导致检验频率提高，但未必导致立即转诊/治疗。在一些实施方式中，至少两种或三种标志物的测定水平被加权。加权是向多种标志物应用一定程度的相对显著性的众所周知的方法。算法可以是本文所述的基于阈值的算法。
如已经讨论过的，在一些实施方式中，通过针对也在尿中测量的参照标志物的水平归一化来确定至少一种标志物的水平。适用于本发明中的参照标志物可包括尿肌酸酐或纤维蛋白原。另一些标志物可包括尿体积、传导率和白蛋白水平。比重和颜色可以是其他归一化标志物或参照标志物。
在一些示例性实施方式中，关于使用至少三种标志物，所述至少三种标志物中每种的水平均提高指示或预测炎症加剧。如本领域技术人员所容易理解的，这些实施方式原则上可适用于测量尿样品中2、4、5、6、7、8、9、10种等标志物的情况。
在一些特定实施方式中，当指示或预测加剧时，治疗对象的加剧。加剧的合适治疗在本领域是已知的。它们包括使用吸入剂，所述吸入剂可以是(短效或长效)支气管扩张剂吸入剂。短效支气管扩张剂包括β-2激动剂吸入剂，例如柳丁氨醇和特布他林和抗毒蕈碱吸入剂，例如异丙托铵。长效支气管扩张剂包括β-2激动剂吸入剂，例如沙美特罗和福莫特罗和抗毒蕈碱吸入剂，例如噻托溴铵。也可以使用类固醇或皮质类固醇吸入剂。另一些有用的治疗剂包括茶碱、粘液溶解剂例如羧甲司坦、抗体和类固醇。可以使用喷雾剂。当通过使用吸入剂不能控制或改善加剧时，可例如使用喷雾剂代替吸入剂。本发明包括这种监测。也可以使用氧疗法或无创通气。也可以酌情采用包含体育锻炼的康复程序。同样，本发明允许监测这种程序以确定它们是否在稳定病情(对抗加剧)方面具有期望的效果。
在一些实施方式中，如果测定到任何标志物的水平均没有提高，则认为炎症状态稳定。在这些情况下，可以维持检验频率(例如，在基线水平)。因此，监测包括检测标志物水平没有变化。类似地，一旦已鉴定或预测加剧，标志物水平没有变化可指示持续加剧。进一步提高可指示加剧恶化。
在某些实施方式中，如果测定到一种标志物的水平提高，但另外两种标志物的水平没有提高，则提高检验频率。在一些特定实施方式中，除非在设定数目的重复检验内一种标志物的提高水平回复到非提高水平，否则提高检验频率。所述设定数目可以是任何合适的数目。例如，其可以是1、2、3、4或5(或更多)。提高的频率可以是例如每天一次或每天两次。
在另外的实施方式中，如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平回复到非提高水平，则将检验频率回复到原始频率。原始频率可以是例如每周一到三次。在一些相关实施方式中，如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则进一步提高检验频率。所述设定数目可以是任何合适数目。例如，其可以是1、2、3、4或5(或更多)。进一步提高的检验频率可以例如基于6、8或12小时。
在某些实施方式中，如果在频率提高的另外设定数目的重复检验内，一种(或更多种)标志物的水平维持在提高的水平，则指示或预测炎症加剧。所述设定数目可以是任何合适的数目。例如，其可以是1、2、3、4或5(或更多)。在这些情况下，则可治疗患者的加剧。
在一些相关实施方式中，如果在频率提高的另外设定数目的重复检验内，一种(或更多种)标志物的水平回复到非提高水平，则将检验频率回复到提高的(而不是进一步提高的)检验频率。所述设定数目可以是任何合适的数目。例如，其可以是1、2、3、4或5(或更多)。因此，本发明可在一种或多种标志物的水平有翻转的情况下使得能够降低监测频率而不达到预测或鉴定加剧。更一般性来说，本发明允许根据针对单独对象生成的数据提高和降低检验频率以准确管理患者的炎症状态。
在一些特定实施方式中，如果在设定数目的重复检验内，一种(或多种)标志物的水平维持在非提高水平，则将检验频率回复到原始频率。因此，可存在第二次降低至原始检验的流程。
根据所有这些示例性实施方式，如果测定到两种标志物的水平提高，但另一种标志物(或者另外多种标志物，如果使用多于三种标志物的话)的水平没有提高，则可提高检验频率。在一些特定实施方式中，将检验频率提高至高于仅检测到一种标志物的水平提高的情况的频率。因此，算法可将多种标志物的水平提高归类为比一种标志物的水平提高潜在地更加危险并相应调整检验频率。这可以是检验频率的双重提高。
在一些实施方式中，如果在设定数目的重复检验内，至少一种标志物的水平回复到非提高水平，则将检验频率回复到指示一种标志物的水平测定为提高的检验频率。因此，监测可以是灵活的以允许频率降低至适合评估一种标志物或者与评估一种标志物相称的水平。然而，在一些实施方式中，如果在设定数目的重复检验(其可以是1、2、3、4或5或更多)内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则再次提高检验频率。这允许监测一种标志物的持续升高。在一些特定实施方式中，如果在频率提高的另外设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则指示或预测炎症加剧。在这些情况下，可治疗患者的加剧。
或者，如果在频率提高的另外设定数目的重复检验内，两种标志物的水平维持在提高的水平，则指示或预测炎症加剧。所述设定数目可以是任何合适的数目。例如，其可以是1、2、3、4或5或更多。在这些情况下，可治疗患者的加剧。
在治疗期间可继续监测对象以评价治疗加剧和/或从加剧恢复的效果。这种监测可以以提高的水平(例如，每6小时、8小时或12小时一次)继续或者可回复到单降低水平(例如，每天两次或每天一次)或双重降低水平(例如，每周一次、两次或三次)。如果观察到对于所给予的治疗没有响应(即，没有看到尿样品中标志物水平降低)，那么可以探索替代治疗。因此，本发明还涉及监测加剧事件的治疗。
因此，本发明还提供监测对象的炎症状态的方法，所述方法包括：测定在多个时间点取自对象的尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平，其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
该方法优选地在家用监测系统或工具套装中实施。
因此，本发明还提供用于监测对象的炎症状态的系统或检验工具套装，其包含：
a.用于测定尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平的一个或
多个检验装置；
b.处理器；和
c.包含计算机应用的存储介质，当所述处理器执行所述计算机应用时，所述计算机应用被配置为：
i.取得和/或计算在一个或多个检验装置上的尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的测定水平；
ii.计算尿样品中是否存在至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高或降低；和
iii.从所述处理器输出所述对象目前的炎症状态，其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
本发明还涉及用于所述系统或检验工具套装中的相应计算机应用。
发明人已确定了，可通过组合多种尿标志物来获得特异且灵敏的结果以监测或预测PEx事件。因此，本发明还提供监测对象的炎症状态的方法，所述方法包括：测定在多个时间点取自对象的尿样品中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种标志物的水平，其中尿样品中至少一种标志物的水平降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
类似地，本发明还提供用于监测对象的炎症状态的系统或检验工具套装，其包含：
a.用于测定尿样品中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种标志物的水平的一个或多个检验装置；
b.处理器；和
c.包含计算机应用的存储介质，当所述处理器执行所述计算机应用时，所述计算机应用被配置为：
i.取得和/或计算在一个或多个检验装置上的尿样品中每种标志物的测定水平；
ii.计算尿样品中是否存在至少一种标志物的水平提高或降低；和
iii.从所述处理器输出所述对象目前的炎症状态，其中尿样品中至少一种标志物的水平降低指示或预测炎症加剧。
本发明还涉及用于所述系统或检验工具套装中的相应计算机应用。
本文所讨论的所有实施方式也适用于本发明的治疗监测方面，其中降低指示加剧的成功治疗或者从加剧恢复。因此，在这些实施方式中，得出个人阈值的基线可以是在加剧时测量的基线，包括在加剧期间取得的至少一种尿样品中一种或多种标志物的水平测量。
关于进一步的监测，尿样品中至少一种标志物的水平在提高后降低可指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。算法也可以体现本文所讨论的效应物和效应物抑制剂分子之间的关系，其中最终通过所有两种类型的标志物均回到基线水平来指示恢复，但抑制剂增加作为对象对效应物水平提高的响应的一部分是被预期的。
在所有这些实施方式中，可以以预定顺序分析多种(例如，至少三种)标志物的测定水平以监测对象的炎症状态。可以加权至少两种或三种(或更多种)标志物的测定水平。
在一些特定的本发明实施方式中，例如上文所概述那些，第一标志物可以是TIMP2(水平/活性)，第二标志物可以是MMP(水平/活性)且第三标志物可以A1AT(水平/活性)。本文关于这三种标志物更详细描述了合适的算法，但显然可针对任何标志物组合来调整算法。
本发明的方法、系统和检验工具套装可以与监测炎症加剧的其他指示物联合使用。在一些特定实施方式中，炎症加剧的另一些指示物包含或选自下述一种或多种：呼吸短促、喘息增加、脉搏率增加、呼吸困难、痰脓增多、痰色加深、咽喉痛、咳嗽增加、感冒和发烧。类似地，可关于这些额外指示物监测治疗。可监测的另一种指示物是一秒内的用力呼气量(FEV1)。
由前所述，显然本发明方法的个体化性质需要大量计算输入以相对于基线在连续或半连续基础上限定相关阈值，和针对这些阈值解释标志物水平。因此，本发明的方法通常包含合适的软件以进行相关技术步骤。因此，可使用系统或检验工具套装进行本发明的方法。特别地，本发明提供用于监测对象的炎症状态的系统或检验工具套装，其包含：
a.用于测定尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平的一个或多个检验装置；
b.处理器；和
c.包含计算机应用的存储介质，当所述处理器执行所述计算机应用时，所述计算机应用被配置为：
i.取得和/或计算在一个或多个检验装置上的尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的测定水平；
ii.计算尿样品中是否存在至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高或降低；和
iii.从所述处理器输出所述对象目前的炎症状态，其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高指示或预测炎症加剧。
类似地，本发明提供用于监测对象的炎症状态的系统或检验工具套装，其包含：
a.用于测定尿样品中至少三种标志物的水平的一个或多个检验装置；
b.处理器；和
c.包含计算机应用的存储介质，当所述处理器执行所述计算机应用时，所述计算机应用被配置为：
i.取得和/或计算在一个或多个检验装置上的尿样品中每种标志物的测定水平；
ii.计算尿样品中是否存在至少一种标志物的水平提高或降低；和
iii.从所述处理器输出所述对象目前的炎症状态，其中尿样品中至少一种标志物的水平提高指示或预测炎症加剧。
本发明还涉及系统和检验工具套装中使用的计算机应用。因此，在某些实施方式中，例如在计算机的语境中，计算机实现的方法、系统和计算机程序产品可具体实现于例如在处理器上操作和执行的计算机应用中。当执行应用时，其进行相关分析以输出对象目前的炎症状态，其中尿样品中至少一种标志物的水平提高指示或预测炎症加剧。
在本文中使用时，处理器可包含在任何计算机、服务器、嵌入式系统或计算系统内。计算机可包括多种内部组件或附接的组件例如系统总线、系统内存、存储介质、输入/输出接口，和用于与网络通信的网络接口。
计算机可被实现为常规计算机系统、嵌入式控制器、笔记本电脑、服务器、定制化机器、任何其他硬件平台(例如，实验室计算机或装置)或者其任意组合。例如，计算机器可以是被配置为使用经由数据网络或总线系统互连的多个计算机器来工作的分布式系统。
处理器可被配置为执行代码或指令以进行本文所描述的操作和功能，管理请求流和地址映射，以及进行计算和生成命令。处理器可被配置为监测和控制计算机器中组件的操作。处理器可以是通用处理器、处理器核、多处理器、可重配置处理器、微控制器、数字信号处理器(“DSP”)、专用集成电路(“ASIC")、图形处理单元(“GPU”)、现场可编程门阵列(“FPGA”)、可编程逻辑器件(“PLD”)、控制器、状态机、门控逻辑、分立的硬件组件、任何其他处理单元或者其任意组合或重复。处理器可以是单个处理单元、多个处理单元、单个处理核、多个处理核、专用处理核、协同处理器或其任意组合。根据某些示例性实施方式，处理器连同计算机器的其他组件一起可以是在一个或多个其他计算机器内执行的虚拟化计算机器。
存储介质可选自硬盘、软盘、压缩盘只读存储器(“CD-ROM”)、数字多功能盘(“DVD”)、蓝光盘、磁带、闪存、其他非易失性存储器装置、固态驱动器(“SSD”)、任何磁存储装置、任何光学存储装置、任何电存储装置、任何半导体存储装置、任何基于物理的存储装置、任何其他数据存储装置或者其任意组合或重复。存储介质可存储一个或多个操作系统、应用程序和例如模块的程序模块、数据或任何其他信息。存储介质可以是计算机器的一部分或者连接到计算机器。存储介质还可以是与计算机器通信的例如服务器、数据库服务器、云存储、联网存储等的一个或多个其他计算机器的一部分。
因此存储介质可为在其上可存储用于处理器执行的指令或代码的机器或计算机可读介质的实例。机器或计算机可读介质通常可涉及用于向处理器提供指令的任何介质或媒体。与模块关联的这种机器或计算机可读介质可包括计算机软件产品。
输入/输出(“I/O”)接口可被配置为耦合至一个或多个外部装置，以从一个或多个外部装置接收数据以及向一个或多个外部装置发送数据。这种外部装置连同多种内部装置一起也可被称为外围装置。I/O接口可包括用于在操作上将多种外围装置耦合至计算机器或处理器的电连接和物理连接二者。I/O接口可被配置为在外围装置、计算机器或处理器之间通信数据、地址和控制信号。I/O接口可被配置为实现任何标准接口，诸如小型计算机系统接口(“SCSI”)、串行附接SCSI(“SAS”)、光纤通道、外围组件互连(“PCI”)、高速PCI(PCIe)、串行总线、并行总线、高级技术附件(“ΑΤΑ”)、串行ATA(“SATA”)、通用串行总线(“USB”)、雷电(Thunderbolt)、火线、多种视频总线等。I/O接口可被配置为仅实现一个接口或总线技术。
或者，I/O接口可被配置为实现多个接口或总线技术。I/O接口可被配置成系统总线的一部分、全部或者与其结合操作。I/O接口可包括一个或多个缓冲器，该缓冲器用于缓冲一个或多个外部装置、内部装置、计算机器或处理器之间的传输。
I/O接口可将计算机器耦合至多种输入装置，包括鼠标、触摸屏、扫描仪、电子数字化仪器、传感器、接收机、触摸板、轨迹球、相机、麦克风、键盘、任何其他指向装置或者其任意组合。I/O接口可将计算机器耦合至多种输出装置，包括视频显示器、扬声器、打印机、投影仪、触觉反馈装置、自动控制、机器人组件、致动器、电机、风扇、螺线管、阀、泵、发送机、信号发射器、灯等。
可在联网环境下使用通过网络接口至横跨网络的一个或多个其他系统或计算机器的逻辑连接操作计算机器。网络可包括广域网(WAN)、局域网(LAN)、内联网、互联网、无线接入网络、有线网络、移动网络、电话网络、光网络或其组合。网络可以是任何拓扑结构的分组交换、电路交换，并且可使用任何通信协议。网络内的通信链路可涉及多种数字或模拟通信介质，诸如光纤线缆、自由空间光学器件、波导、导电体、无线链路、天线、射频通信等。
处理器可通过系统总线连接至本文所讨论的计算机器的其他元件或者多种外设。应该理解，系统总线可在处理器之内、在处理器之外或者这二者。根据一些实施方式，本文所讨论的处理器、计算机器的其他元件或者多种外设中的任一个可被集成到诸如片上系统(“SOC”)、封装上系统(“SOP”)或ASIC装置的单个装置中。
一些实施方式可包括具体实现了本文所描述和示出的功能的计算机程序，其中，计算机程序被实现于计算机系统中，该计算机系统包括存储在机器可读介质中的指令以及执行所述指令的处理器。然而，应显而易见的是，可存在以计算机编程来实现实施方式的许多不同的方式，并且实施方式不应被解释为限于任何一种计算机程序指令集合。另外，有经验的程序员将能够编写这种计算机程序以实现本文所述的公开的实施方式中的一种或多种。因此，对具体程序代码指令集合的公开不被认为是对充分理解如何做出和使用实施方式所必须的。另外，本领域技术人员将理解，本文所述实施方式的一个或多个方面可由如可具体实现于一个或多个计算系统中的那样，通过硬件、软件或其组合来执行。此外，任何提及由计算机执行的行为不应被解释为将由单个计算机来执行，因为多于一个的计算机可执行该行为。
本文所述的一些示例性实施方式能够与执行先前所述方法和处理功能的计算机硬件和软件一起使用。本文所述系统、方法和过程能够被具体实现于可编程计算机、计算机可执行软件或数字电路中。软件能够被存储在计算机可读介质上。例如，计算机可读介质可包括软盘、RAM、ROM、硬盘、可移除介质、闪存、记忆棒、光学介质、磁光介质、CD-ROM等。数字电路可包括集成电路、门阵列、逻辑模块、现场可编程门阵列(FPGA)等。
所述方法、系统和检验工具套装可包含用于自动识别和数据捕获(AIDC)的工具，例如射频识别标签或卡(RIF)。
为免生疑问，上文的本发明讨论适用于本发明的系统和检验工具套装且可相应地适用于所有实施方式。然而，为了清楚起见和举例说明上述讨论如何直接适用于系统和检验工具套装，以下概述了另外的具体实施方式。
系统或检验工具套装可适合对象(尤其是本文所限定的需要监测的对象)家用。在一些实施方式中，检验系统或工具套装的形式为便携式系统。本发明的系统可基于其的一个示例性系统是AlereTM 2可移动检验系统。该系统包含分析仪，检验盒(testcartidge)被插入所述分析仪中。然后使用者还将样品收集装置插入所述分析仪中。分析仪包含全色屏幕以读取结果。因此，分析仪涵盖处理器和允许试验运行的存储介质。检验盒代表用于测定尿标志物水平的一个或多个检验装置。本发明的系统或检验工具套装可包含单独的样品收集装置或者其可被整合到一个或多个检验装置中。
在一些特定实施方式中，所述系统或检验工具套装进一步包含处理器输出显示器。这旨在给出针对尿样品进行的试验的简单视觉和/或听觉读出。显示器可与运行计算机应用的处理器可操作地连接。在一些实施方式中，输出或读出可以是对对象的指示。取决于所应用的算法，合适的读出可选自“提高/降低检验频率”，其可以达到例如指定的水平或频率或“访问专业人员”或等价用语。输出可以是由颜色编码的或用数字表示的以反映本文所讨论的监测的多种可能结果。显示器可提供在样品中测定的标志物水平并提供合适的训练和/或文件以辅助使用者解释数据。然而，由于对容易有人为误差的明显原因，这不是优选的。然而，在一些实施方式中，可存在两种类型信息的组合。因此，在一些实施方式中，显示器可呈现定量读出和定性读出二者。在一些实施方式中，与预测和鉴定结果有关的概率值也可以作为输出。
一个或多个检验装置可以具有适合家用的任何形式。本文讨论了检测标志物的多种方法且从这种讨论中，本领域技术人员将完全能够确定合适的相应家用装置的形式。
在一些特定实施方式中，一个或多个检验装置包括一次性使用装置，尿样品被施加到所述一次性使用装置上。一个或多个检验装置通常可包含样品施加区，样品被添加在所述样品施加区上。一般而言，样品施加区可接受相对大的样品体积，例如，10ml、20ml、30ml、40ml或50ml或更多。装置通常还包含固体支持物，所述固体支持物限定施加到样品施加区的样品的液体/毛细流动路径。样品施加区可以是固体支持物不可分割的部分。在一些实施方式中，固体支持物可包含色谱介质，例如膜材料(例如，硝化纤维素)。施加到样品施加区的尿样品通常使必需试剂再水化以检测标志物。所述试剂可包括与标志物特异性相互作用的结合试剂或测量活性的效应物分子的底物。另外的试剂可进一步沿着流动路径被固定化。该试剂可与标志物和结合试剂的复合体结合。结合试剂通常被标记以在标志物和结合试剂的复合体的固定化位点提供信号(通过与另外的试剂结合)。如本领域技术人员所容易理解的，合适的标签包括荧光标签、磁性标签、乳胶或金。
结合试剂和另外的试剂通常是(如本文所述的)抗体。因此，在一些特定实施方式中，一个或多个检验装置可包含侧流检验条。在一些实施方式中，使用单个侧流检验条以允许检测试验样品中待测定的所有标志物。在另一些实施方式中，对于测定的每种标志物，提供单独的侧流检验条。
所述装置还可包括对照区以确认样品已令人满意地穿过装置。如果情况并非如此，则系统或检验工具套装可例如通过显示器向使用者指示无效结果。如本文所讨论，装置可充当竞争性试验或夹心试验。ELISA(酶联免疫吸附试验)是可包含在本发明中所使用的检验装置中的合适试验方式的一个实例。同样，用于检测一种或多种标志物的水平的所有试剂通常被预加载在检验装置上以使得它们能够与添加到装置的尿样品相互作用。这使得干预最小化，因此使得由对象造成的误差最小化。因此，事实上，装置可仅需要使用者施加样品并随后观察试验输出。
所述系统和检验工具套装需要定量读出以允许随时间监测对象的炎症状态。因此，系统或检验工具套装可包含合适的读取器以提供定量输出(连同处理器和存储介质)。如已经提到的那样，这种输出可以是绝对输出或相对输出。合适的读取器可包含照明器以将装置暴露于特定的一种或多种波长的光；和适合反射光和发射光的检测器。装置还包含合适的处理器和计算机应用以基于检测的信号输出对象目前的炎症状态。因此，运行计算机应用的处理器与读取器可操作地连接。“可操作地连接”表示允许元件之间的信号或信息交换的功能连接。
检验装置可包含一种或多种特异性结合试剂以结合标志物，所述标志物的水平在尿样品中被检测。如上文所讨论的，当测量蛋白水平时，试剂可包含抗体(包括衍生物、片段和适配子)。当测量RNA水平时，合适的试剂可包含核酸扩增试剂例如引物、探针、dNTP、聚合酶等以允许扩增反应运行和由检验装置报告结果。
一个或多个检验装置可包括如上文较详细讨论的酶检测装置。这些装置对于研究(例如效应物分子例如MMP、组织蛋白酶G和HNE的)酶活性可特别有用。一个或多个检验装置可包括用于测量作为蛋白酶活性指示物的肽底物的切割的检验装置。
在一些特定实施方式中，检验装置包含：
a.用于加入到尿样品中的指示物分子，所述指示物分子包含
i.包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述蛋白酶活性，若存在的话，切割；和
ii.捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生新结合位点；
b.用于接收尿样品的捕获区，其中所述捕获区包含能够与所述指示物分子的捕获位点结合的捕获分子以固定包含所述新结合位点的指示物分子；和
c.能够结合到所述新结合位点的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合。
当测定样品中的多个标志物时，所述系统或检验工具套装可包括合适数量的检测装置以使得能够测定每种标志物。使用不同的平台检测标志物时尤其如此。因此，在一些实施方案中，用于测定效应物分子水平的一个或更多个检测装置包括一个或更多个侧向流活性试验、ELISAs、荧光底物试验等等。在一些实施方式中，用于测定效应物抑制剂分子水平的一个或更多个检测装置包括一个或更多个侧向流活性试验、ELISAs或竞争性试验。在一些实施方式中，用于测定信号分子水平的所述一个或更多个检测装置包括一个或更多个侧向流活性试验和ELISAs。
如上文所讨论的，本发明依赖于个体化的对象阈值，所述阈值可针对对象的基线(例如，基于标志物的对一个标志物的基线)进行计算。因此，在一些实施方式中，计算机应用导致处理器参照针对对象进行调整的标志物阈值水平计算至少一种标志物的水平。同样如上文所讨论的，基于在更早时间点取自对象的尿样品中标志物的测定水平来设置标志物阈值水平。这些更早时间点可包含靠近测定目前的尿样品中标志物水平之前的至少两次更早测量。因此，可参照滑动窗口设置阈值，在所述滑动窗口内，标志物水平已被测量以提供基线。阈值水平因此被系统“得知”。其不是固定的阈值，而是针对对象进行调整，从而考虑不预测或指示加剧事件的标志物水平偏离基线的不显著波动。因此，阈值可被设置在基线附近以指定允许的标志物水平范围，超过该范围即指示水平的统计学显著提高(或降低)。在存在标志物基线水平漂移的情况下，可以将参数界限变窄以使得标志物水平的进一步变化被视为显著。例如，如果基线标志物水平随时间向上漂移，则被视为已超过阈值(即，是显著的)可需要较小的测量的提高和基线之间的差异。这旨在防止漏掉“缓慢发病的”加剧。可基于在更早时间点(此时对象没有遭受炎症加剧)取自对象的尿样品中标志物的测定水平来设置标志物的阈值水平。这种分析可采用的合适方法在本领域是已知的，其包括波动分析，例如去趋势波动分析(DFA)或其他形式的线拟合。
在某些实施方式中，计算机应用导致处理器指示对象需要测定至少一种标志物的水平。在另一些实施方式中，计算机应用被进一步配置为：当计算出至少一种标志物的水平提高时，从处理器输出以下要求，所述要求是提高测定取自对象的尿样品中至少一种标志物的水平的频率。计算机应用可被进一步配置为：通过处理器输出以下要求，所述要求是维持提高的测定至少一种中性粒细胞活化标志物的水平的频率直到计算出至少一种标志物的水平降低。
在一些特定实施方式中，系统或检验工具套装包含一个或多个检验装置，所述检验装置用于测定在多个时间点取自对象的尿样品中至少两种或三种标志物的水平。在一些实施方式中，计算机应用被配置为计算至少一种标志物的水平提高和通过处理器提供以下输出：计算出的至少一种标志物的水平提高指示或预测炎症加剧。计算机应用可被配置为计算至少一种中性粒细胞活化标志物的水平降低和由处理器提供以下输出：计算出的至少一种标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。在另外的实施方式中，计算机应用可被配置为以预定顺序分析至少两种或三种标志物的计算水平以监测对象的炎症状态。正如上文所讨论的，可加权标志物。因此，计算机应用可被配置为酌情向至少两种或三种标志物的测定水平应用和/或计算权重。
在一些特定实施方式中，计算机应用被配置为通过针对参照标志物水平(通常也在同一尿样品中测量)归一化来计算至少一种标志物的水平。本文讨论了合适的参照标志物，其包括尿肌酸酐或纤维蛋白原。另一些标志物可包括例如通过葡糖苷酸睾酮测量的尿体积。比重和颜色可以是其他归一化标志物或参照标志物。
在某些实施方式中，计算机应用被进一步配置为将来自炎症加剧的另一些指示物的输入并入对象目前炎症状态的计算中。这些炎症加剧的另一些指示物可包括呼吸短促、喘息增加、脉搏率增加、呼吸困难、痰脓增多、痰色加深、咽喉痛、咳嗽增加、感冒和发烧。可监测的另一种指示物是一秒内的用力呼气量(FEV1)。
因此，计算机应用运行相关算法以能够监测个体，特别是相对于个体化的“波动”阈值。在某些实施方式中，计算机应用被配置为：如果计算出至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种标志物中每种的水平均提高，则从处理器输出炎症加剧的指示或预测。在一些特定实施方式中，输出指示对象应该接受治疗。在另一些实施方式中，计算机应用被配置为：如果测定到任何标志物的水平均未提高，则从处理器输出以下指示：炎症状态被视为稳定和/或维持检验频率。在一些实施方式中，计算机应用被配置为：如果计算出一种标志物的水平提高，但另外两种标志物的水平没有提高，则从处理器输出提高检验频率的指示。计算机应用可被配置为：除非在设定数目的重复检验内，一种标志物的提高水平回复到非提高水平，否则从处理器输出提高检验频率的指示。计算机应用可计算出：在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平是否回复到非提高水平。在一些特定实施方式中，如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平回复到非提高水平，则计算机应用产生以下处理器输出：将检验频率回复到原始频率。在另外的实施方式中，如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则计算机应用产生以下处理器输出：进一步提高检验频率。在另外的实施方式中，如果在频率已提高的另外设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则计算机应用产生以下处理器输出：指示或预测炎症加剧和/或应该治疗对象。
在一些实施方式中，如果在频率已提高的另外设定数目的重复检验内，一种标志物的水平回复到非提高水平，则计算机应用产生以下处理器输出：将检验频率回复到提高的(而不是进一步提高的)检验频率。在另外的实施方式中，如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在非提高水平，则计算机应用产生以下处理器输出：将检验频率回复到原始频率(即，检验的基线水平)。在一些特定实施方式中，如果测定到两种标志物的水平提高，但另一种标志物的水平没有提高，则计算机应用产生以下处理器输出：提高检验频率。在这类实施方式中，可将检验频率提高至高于仅检测到一种标志物的水平提高的情况的频率。在某些实施方式中，如果在设定数目的重复检验内，至少一种标志物的水平回复到非提高水平，则计算机应用产生以下处理器输出：将检验频率回复到指示一种标志物的水平测定为提高的检验频率。如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则计算机应用可产生以下处理器输出：再次提高检验频率。如果在频率已提高的另外设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则计算机应用可产生以下处理器输出：指示或预测炎症加剧和/或应该治疗对象。
在另一些实施方式中，如果在频率已提高的另外设定数目的重复检验内，两种标志物的水平维持在提高的水平，则计算机应用产生以下处理器输出：指示或预测炎症加剧和/或应该治疗对象。
在本发明中，计算机应用可被配置为：计算至少一种中性粒细胞活化标志物的水平降低和提供以下处理器输出：计算出至少一种标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。为免生疑问，可通过合适的显示模块显示所述所有输出，所述显示模块与处理器/计算机应用可操作地连接。
一般而言，计算机应用可被配置为：以预定顺序分析至少三种标志物的计算水平以监测对象的炎症状态。计算机应用可被配置为：向至少三种标志物的测定水平应用权重。在一些特定实施方式中，第一标志物是TIMP2，第二标志物是MMP活性且第三标志物是A1AT。上文描述了另一些优选标志物和活性。
附图描述
现在将参照附图通过例子来描述本发明，其中：
图1是可用于本发明中的试验的四种不同方式的示意图。每种方式均依赖于相同的基本组分：固体支持物(1)、捕获分子(2)、含捕获位点(3)和切割位点(4)的指示物分子以及结合分子(5)，其中仅在切割(6)发生后，结合分子(5)才能与指示物分子结合。
图2是可用于本发明中的酶检测装置的示意图，其显示了在缺乏(图2A)或存在(图2B)酶切割活性的情况下装置的操作。
图3显示了作为检验样品中MMP活性水平的(图2中所示的)试验的视觉读出提高。
图4是可用于本发明中的一种酶检测装置的示意图。该图示出了每个卡组件的准确纵向维度和位置。
图5显示了合成结构受限的指示物分子的实例。
在图5A中，首先，使用例如固相Fmoc化学方法合成线性肽(1)。该肽可例如通过高效液相色谱法(HPLC)被纯化。然后通过支架分子(3)和肽(2)上的巯基之间的反应限制所述肽或使其环化。该反应产生结构受限的“夹紧的(clipped)”肽(4)。
在图5B中，通过例如在预加载的生物素-PEG树脂上合成线性肽来合成包括捕获位点(1)的指示物分子。
图6示意性显示了本发明中所使用的结合分子专门与经切割的指示物分子结合的能力。在缺乏酶切割活性的情况下，结构受限的指示物分子(1)不与抗体结合分子(2)结合。这种抗体是使用经切割的指示物分子(3)作为抗原而生成的，因此其仅与分子的这种“开放”形式结合。
图7(图7A和7B)展示了：当利用添加了MMP-9的缓冲样品运行时，用于本发明中的试验的灵敏度。利用75μl样品体积时，MMP-9的检测极限为约4ng/ml。图7A显示了跨越MMP-9的整个浓度范围的读取器值，而图7B是MMP-9浓度在0-15ng/ml之间时的展开图。
图8展示了：可用于本发明中的一个试验的特定版本使用偏向MMP13、MMP12、MMP9、MMP8和MMP2的可切割序列。根据所需要的应用，本发明试验的其他版本可使用具有不同靶标的序列。
图9展示了：在尿样品中能够发现可测量量的活性蛋白酶(尤其是MMP，包括MMP-9)且获自患呼吸疾病的患者的样品中存在较高水平。相较于从健康对照收集的样品，利用COPD样品(P＝0.03)观察到显著差异，CF样品相对于健康对照观察到显著差异(P＝0.01)。
图10是这样的图表，其比较了存在或不存在EDTA时，所述试验检测MMP活性的能力。该图表显示了向伤口样品中加入EDTA抑制读出，从而验证了样品中MMP的存在并且还验证了该试验特异性测量活性MMP。
图11含有这样的图表(图11A和11B)，所述图表比较了市售活性MMP-9检验试剂盒和本发明所述试验检测MMP9活性的能力。图11A显示了跨越MMP-9的整个浓度范围的读取器值，而图11B是MMP-9浓度在0-50ng/ml之间时的展开图。这两个图表均展示了本发明的方法产生更陡的曲线。根据这两个试验，如通过吸光度值所示，在4ng/ml MMP9(所检测的最低标准)时看到显色。
图12显示了使用本发明的侧向流实施方式和ELISA时的MMP9标准曲线。
图13显示了可用于本文所述指示物分子中的一些支架分子。
图14显示了可用于本文所述指示物分子中的一些支架分子以及建议的命名。
图15显示了支架分子到指示物分子的一些连接选项。图15A显示了在单个切割位点切割的产物且图15B显示了在两个分离的切割位点切割的产物。
图16显示了MOL386肽的分析HPLC。
图17是MOL386肽的质谱。
图18是用PEG-生物素修饰的MOL386肽的质谱。
图19是环化MOL386肽的质谱分析。
图20是用PEG-生物素修饰的环化MOL386肽的质谱分析。
图21显示了图1中所示所有组合的MMP9标准曲线。
图22展示了来源于图21中所示结果的最佳组合的性能。
图23–可用于本发明中的炎症生物标志物(包括组合)的指示。标志物根据炎症通路被归类，其反映了表征肺加剧的中性粒细胞活化过程。
图24–基于标志物的MMP/TIMP/A1AT簇，对COPD患者管理而言可行算法。
图25–显示了在鉴定COPD加剧发病方面MMP/TIMP/A1AT簇的性能。
图26–显示了在鉴定从COPD加剧恢复方面MMP/TIMP/A1AT簇的性能。
图27–显示了在鉴定COPD加剧发病方面MMP/TIMP/A1AT簇的性能。
图28–显示了一些个人谱图的实例。将每个样品用曲线图表示为与第一基线(BL)样品的百分比差异(无标度)。
图29–显示了用于鉴定肺加剧的多种标志物组合的性能。如通过百分比值所示，额外标志物提高检测灵敏度。
图30–显示了用于鉴定肺加剧的多种标志物组合的性能。如通过百分比值所示，额外标志物提高检测灵敏度。
图31–显示了用于鉴定肺加剧的多种标志物组合的性能。如通过百分比值所示，额外标志物提高检测灵敏度。
图32–显示了当针对肌酸酐水平归一化从而给出比例时，用于鉴定肺加剧的多种标志物组合的性能。如通过百分比值所示，额外标志物提高检测灵敏度。
图33–显示了某些尿标志物在囊性纤维化中的重要性。加剧的特征为MMP和TIMP2水平之间的不平衡。
图34显示了一种Ac-PGP竞争性EIA试验的示意图。
图35展示了利用从1000ng/ml下至15.625ng/ml的标准品，使用Ac-PGP竞争性EIA试验结合方式获得的校准曲线。
图36显示了fMLP竞争性EIA试验方式的示意图。
图37展示了利用从50ng/ml下至0.78ng/ml的标准品，使用fMLP竞争性结合方式获得的校准曲线。
图38是锁链素片段竞争性EIA试验的示意图。
图39展示了HPLC分析以显示通过提高浓度的酶(HNE)分解的整个弹性蛋白(右侧峰)的谱图。
图40显示了稳定样品相对于加剧样品中的尿CRP水平。
图41A显示了CRP、锁链素和IL1β的组合在PEx预测中的性能。
图41B显示了CRP、锁链素和纤维蛋白原在PEx恢复中的性能。
图42显示了模型1a的逻辑回归和ROC曲线。
图43显示了模型1b的逻辑回归和ROC曲线。
图44显示了模型2a的逻辑回归图。
图45显示了模型2b的逻辑回归图。
图46显示了模型2c的逻辑回归图。
图47显示了模型2a、2b和2c的ROC曲线。
图48显示了组合1的决策树。
图49显示了组合2的决策树。
图50显示了组合3的决策树。
图51显示了组合4的决策树。
图52显示了组合5的决策树。
图53显示了组合6的决策树。
图54显示了组合7的决策树。
图55显示了组合8的决策树。
详细描述和实施例
图1是对于本发明的性能，特别是测定尿样品中的效应物分子(尤其是蛋白酶例如MMP)，有用的试验的四种不同方式的示意图。每种方式均依赖于相同的基本组分：固体支持物(1)、捕获分子(2)、含捕获位点(3)和切割位点(4)的指示物分子以及结合分子(5)，其中仅在切割(6)发生后，结合分子(5)才能与指示物分子结合。
在方式1和4中，捕获分子(2)是链霉亲和素。此时，捕获分子(2)与指示物分子内的生物素捕获位点(3)结合。在方式2和3中，捕获分子(2)是抗体。此时，捕获分子(2)与指示物分子内的表位捕获位点(3)结合。表位发现于源自人绒毛膜促性腺激素(hCG)的替代长肽(ALP)中。
一旦将指示物分子加入到检验样品中，存在的特异性识别切割位点(4)的任何酶均可切割指示物分子(6)。该切割事件(6)产生特异性抗体结合分子(5)的结合位点。直到切割(6)发生，结合分子(5)才能与指示物分子结合。因此，在方式1和3中，抗体结合分子(5)与作为切割GPQGIFGQ序列的结果产生的氨基酸序列GPQG结合。在方式2和4中，另一方面，抗体结合分子(5)与同样作为切割GPQGIFGQ序列的结果产生的氨基酸序列QGFI结合。在每种方式中，抗体结合分子(5)都不与切割前的GPQGIFGQ序列结合(未示出)。
图2是本发明中使用的酶检测装置的示意图，其显示了在尿样品中缺乏(图2A)或存在(图2B)酶切割活性的情况下装置的操作。检验条包括粘合衬垫(1)，装置的另一些组件组装在粘合衬垫(1)上。从右至左，样品施加区(2)呈吸收垫的形式。其被放置为与缀合物垫(3)部分重叠，缀合物垫(3)浸有标记的结合分子(7)。在一些替代性实施方式中，标记的结合分子可被浸在样品施加区中，这消除了对单独缀合物垫的需要。缀合物垫(3)与硝化纤维素膜(4)处于流动连接。硝化纤维素膜(4)含有限定捕获区的固定化的链霉亲和素分子(5)。膜(4)还包含在捕获区下游的固定化的另外的结合分子(6)，其与和样品一起穿过装置的另外的标记分子(11)结合从而形成单独的对照区。或者，固定化的另外的结合分子可以与标记的结合分子(7)结合。装置任选地还包含吸收垫(8)以吸收到达装置末端的任何检验样品和试剂。
在使用中，在检验样品与装置的样品施加区(8)接触之前，将指示物分子(9)加入检验样品中。如图2A中所示，在检验样品中缺乏酶切割活性时，指示物分子(9)保持切割位点不被切割。样品流到缀合物垫(3)之后，结合分子(7)不能与指示物分子(9)结合，因为未发生切割位点的切割。指示物分子通过链霉亲和素(5)和指示物分子(9)的生物素捕获位点(10)之间的相互作用结合在捕获区。标记的结合分子(7)未被固定在捕获区，因为它们不能与指示物分子(9)结合。因此，标记的结合分子穿过对照区流动并流出。另外的标记分子(11)也穿过装置达到对照区，在这里，它们通过与固定化的另外的结合分子(6)结合而被固定。因此，缺乏酶切割活性被展示为仅在对照区有信号，但在捕获区没有信号。可能含有标记的结合分子(7)的过量样品流到吸收垫(8)中。
如图2B中所示，在检验样品中存在酶切割活性时，指示物分子(9)在切割位点被切割。样品流到缀合物垫(3)之后，结合分子(7)能够与指示物分子(9)结合，因为已发生切割位点的切割。指示物分子通过链霉亲和素(5)和指示物分子(9)的生物素捕获位点(10)之间的相互作用结合在捕获区。标记的结合分子(7)由于在切割位点与指示物分子(9)结合而被固定在捕获区。由于标记的结合分子(7)相对于捕获区的结合位点相对过量，所以一些标记的结合分子(7)仍然穿过对照区流动并流出。另外的标记的分子(11)也穿过装置达到对照区，在这里，它们通过与固定化的另外的结合分子(6)结合而被固定。因此，可通过在捕获区的信号来测量酶切割活性水平(且对照区将也存在信号)。过量样品流到吸收垫(8)中，所述过量样品可能含有不含生物素捕获位点(10)的指示物分子的切割产物。
应该注意的是，对照区是任选的。尿样品中的酶切割活性水平可基于在捕获区的相应信号的测量来监测。
图3显示了作为检验样品中MMP活性水平的(图2中所示的)试验的视觉读出提高。容易看出，随着MMP量增加，在对照区(1)的信号不变。相反，随着MMP量增加，在捕获区(2)的信号也增加。这是由于通过MMP活性在切割位点切割指示物分子。这露出了结合位点，从而使得在捕获区(2)检测的结合分子能够通过限定捕获区的捕获分子和指示物分子的捕获位点之间的相互作用而结合。可以测量在捕获区的信号强度以提供尿样品中效应物分子的水平。这可利用合适的读取器。
图4是可用于本发明中的一种特定酶检测装置的示意图。下表提供了所述图的图例并指定了该特定实施方式中每个卡组件的纵向维度和位置。当然，如本领域技术人员所容易理解的，可以改变纵向维度和位置。
图5显示了合成结构受限的指示物分子的实例。应该注意的是，额外的连接子或间隔子区域可包含在切割区域和连接支架分子的位点之间。
在图5A中，首先，使用例如固相Fmoc化学方法合成线性肽(1)。该肽可例如通过高效液相色谱法(HPLC)被纯化。然后通过支架分子(3)和肽(2)上的巯基之间的反应限制所述肽或使其环化。该反应产生结构受限的“夹紧的”肽(4)。
在图5B中，通过例如在预加载的生物素-PEG树脂上合成线性肽来合成包括捕获位点(1)的指示物分子。
图6示意性显示了本发明的一些实施方式中所使用的结合分子专门与经切割的指示物分子结合的能力。在缺乏酶切割活性的情况下，结构受限的指示物分子(1)不与抗体结合分子(2)结合。这种抗体是使用经切割的指示物分子(3)作为抗原而生成的，因此其仅与分子的这种“开放”形式结合。
图13和14显示了适用于本发明中的一些支架分子。
图15以示意图的形式显示了支架分子到指示物分子的一些连接选项。图15A显示了在单个切割位点切割的产物且图15B显示了在两个分离的切割位点切割的产物。
图24展示了本发明中可使用的算法。这种特定的算法是基于在稳定疾病期间和加剧期间取得的尿样品中观察到的TIMP-2浓度、MMP活性和A1AT浓度而设计的。该算法还基于在加剧之前、期间和之后观察到的生物标志物谱和模式的变化。这种特定算法被设计用于理解中性粒细胞衍生蛋白酶和蛋白酶抑制剂保护物(shield)之间平衡的关键变化。然而，和这种算法一起应用和开发的原理明显适用于本文所述的其他尿标志物和组合。所述算法胜过简单、有顺序地搜索在加剧时分别提高的替代性生物标志物值的原始数据分析方法。这种简单程序是确定何种生物标志物适合被包含在算法中的有用方法，因为在绝大多数情况下，它们明显能被组合以通过它们中的一种或另一些在特定检验事件中提高来鉴定加剧。
在用作加剧指示物时，算法考虑其他一些重要因素，例如：-
-取样频率
-当多于一种生物标志物增加时，观察值的额外加权
-由单独标志物升高引发的取样频率提高
-波动的个人生物标志物阈值
-当某些限定条件占优势时，接入恰当的子程序。
图24中所示算法考虑了所有这些因素，以提供解释朝向引发治疗性干预的生物标志物变化的合理工具。算法包含通过稳定疾病状态下重复检验的个人阈值建立，以提供检测有意义的生物标志物谱变化的坚固标准。
可在下列编号项集合中进一步限定本发明：
1.监测对象的炎症状态的方法，所述方法包括：测定在多个时间点取自所述对象的尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平，其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高指示或预测炎症加剧和/或其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
2.根据项1所述的方法，其中至少一种中性粒细胞活化标志物选自信号分子或效应物/效应物抑制剂分子。
3.根据项2所述的方法，其中所述效应物分子选自蛋白酶活性、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)(游离的或在复合体中)、钙网蛋白或髓过氧化物酶(MPO)。
4.根据项3所述的方法，其中所述蛋白酶活性选自基质金属蛋白酶(MMP)活性、HNE活性和组织蛋白酶G活性。
5.根据项4所述的方法，其中MMP活性包括MMP9和/或MMP8活性。
6.根据项3-5中任一项所述的方法，其中通过测量肽底物的切割来测定蛋白酶活性。
7.根据项3-6中任一项所述的方法，其中通过下述方法测定蛋白酶活性，所述方法包括：
a.使指示物分子与检验样品接触，所述指示物分子包含
i.包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述蛋白酶，若存在的话，切割；和
ii.捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生新结合位点；
b.向所述检验样品中加入能够结合到所述新结合位点的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合；
c.在捕获区通过所述捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合来捕获含有所述新结合位点的指示物分子部分；和
d.通过测定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示物分子的新结合位点的结合来检测所述至少一个切割位点的切割。
8.根据项2-4中任一项所述的方法，其中所述效应物抑制剂分子是蛋白酶抑制剂分子。
9.根据项5所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂分子选自金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、胱抑素C和α-1抗胰蛋白酶(A1AT)。
10.根据项2所述的方法，其中所述信号分子选自ICAM-1、IL-6、IL-1β、IL-8、N-甲酰基-Met-Leu-Phe(fMLP)、IL-6诱导的纤维蛋白原和细胞因子诱导的β-2-微球蛋白(B2M)。
11.根据任何前项所述的方法，其中至少一种中性粒细胞活化标志物包括或进一步包括由于炎症而产生的分子。
12.根据项5所述的方法，其中所述由于炎症而产生的分子包括蛋白酶活性的降解产物，例如细胞外基质分解产物(例如，Ac-PGP、弹性蛋白片段/肽、锁链素)和/或氧化损伤的产物例如氯化肽和/或代谢物例如乳酸和游离脂肪酸。
13.根据任何前项所述的方法，其中所述炎症状态是肺炎症状态。
14.根据任何前项所述的方法，其中所述炎症加剧是肺加剧。
15.根据任何前项所述的方法，其中所述对象患有呼吸疾病。
16.根据项15所述的方法，其中所述呼吸疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)或囊性纤维化(CF)。
17.根据任何前项所述的方法，其中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高或降低是参照针对所述对象调整的所述标志物的阈值水平计算的。
18.根据项19所述的方法，其中所述标志物的阈值水平是通过测定在更早时间点取自所述对象的尿样品中所述标志物的水平来设置的。
19.根据项19所述的方法，其中所述更早时间点包括临近测定目前的尿样品中所述标志物水平时的至少两次更早测量。
20.根据项19或20所述的方法，其中所述标志物的阈值水平是通过测定在所述对象没有遭受炎症加剧的更早时间点取自所述对象的尿样品中所述标志物的水平来设置的，且提高到超过阈值预测或鉴定加剧。
21.根据项19或20所述的方法，其中所述标志物的阈值水平是通过测定在所述对象正遭受炎症加剧的更早时间点取自所述对象的尿样品中所述标志物的水平来设置的，且降低到低于阈值预测或鉴定从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
22.根据任何前项所述的方法，其中至少每周两次测定至少一种中性粒细胞活化标志物的水平。
23.根据任何前项所述的方法，其中如果检测到至少一种标志物的水平提高，则提高测定取自所述对象的尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平的频率。
24.根据项23所述的方法，其中维持测定取自所述对象的尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平的频率直至检测到至少一种标志物的水平降低。
25.根据任何前项所述的方法，所述方法包括：测定在多个时间点取自所述对象的尿样品中至少两种或三种中性粒细胞活化标志物的水平。
26.根据项25所述的方法，其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高指示或预测炎症加剧。
27.根据项25或26所述的方法，其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
28.根据项25-27中任一项所述的方法，其中以预定顺序分析所述至少两种或三种标志物的测定水平以监测所述对象的炎症状态。
29.根据项25-27中任一项所述的方法，其中加权所述至少两种或三种标志物的测定水平。
30.根据任何前项所述的方法，其中通过针对参照标志物的水平归一化来确定至少一种中性粒细胞活化标志物的水平。
31.根据项31所述的方法，其中所述参照标志物包括尿肌酸酐或纤维蛋白原。
32.根据任何前项所述的方法，所述方法还包括监测炎症加剧的其他指示物。
33.根据项32所述的方法，其中所述炎症加剧的其他指示物包括呼吸短促、喘息增加、脉搏率增加、呼吸困难、痰脓增多、痰色加深、咽喉痛、咳嗽增加、感冒和发烧。
34.用于监测对象的炎症状态的系统或检验工具套装，其包括：
a.用于测定尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平的一个或多个检验装置；
b.处理器；和
c.包含计算机应用的存储介质，当所述处理器执行所述计算机应用时，所述计算机应用被配置为：
i.取得和/或计算在一个或多个检验装置上的尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的测定水平；
ii.计算尿样品中是否存在至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高或降低；和
iii.从所述处理器输出所述对象目前的炎症状态，其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高指示或预测炎症加剧和/或其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
35.项34所述的系统或检验工具套装，其还包括处理器输出显示器。
36.项34或35所述的系统或检验工具套装，其中所述一个或多个检验装置是一次性使用装置。
37.项34-36中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述一个或多个检验装置包括侧向流检验条。
38.项37所述的系统或检验工具套装，其包括用于所测定的每种标志物的侧向流检验条。
39.项34-38中任一项所述的系统或检验工具套装，其中至少一种中性粒细胞活化标志物选自信号分子或效应物/效应物抑制剂分子。
40.项39所述的系统或检验工具套装，其中所述效应物分子选自蛋白酶活性、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)(游离的或在复合体中)、钙网蛋白或髓过氧化物酶(MPO)。
41.项40所述的系统或检验工具套装，其中所述蛋白酶活性选自基质金属蛋白酶(MMP)活性、HNE活性和组织蛋白酶G活性。
42.项41所述的系统或检验工具套装，其中MMP活性包括MMP9和/或MMP8活性。
43.项40-42中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述一个或多个检验装置包括测量作为蛋白酶活性指示物的肽底物的切割的检验装置。
44.项43所述的系统或检验工具套装，其中所述检验装置包括：
a.用于加入到尿样品中的指示物分子，所述指示物分子包含
i.包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述蛋白酶活性(若存在的话)切割；和
ii.捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生新结合位点；
b.用于接收尿样品的捕获区，其中所述捕获区包含能够与所述指示物分子的捕获位点结合的捕获分子以固定包含所述新结合位点的指示物分子；和
c.能够结合到所述新结合位点的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合。
45.项39-44中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述效应物抑制剂分子是蛋白酶抑制剂分子。
46.项45所述的系统或检验工具套装，其中所述蛋白酶抑制剂分子选自金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、胱抑素C和α-1抗胰蛋白酶(A1AT)。
47.项39所述的系统或检验工具套装，其中所述信号分子选自ICAM-1、IL-6、IL-1β、IL-8、N-甲酰基-Met-Leu-Phe(fMLP)、IL-6诱导的纤维蛋白原和细胞因子诱导的β-2-微球蛋白(B2M)。
48.项34-47中任一项所述的系统或检验工具套装，其中至少一种中性粒细胞活化标志物包括或进一步包括由于炎症而产生的分子。
49.项48所述的系统或检验工具套装，其中所述由于炎症而产生的分子包括蛋白酶活性的降解产物，例如细胞外基质分解产物(例如，Ac-PGP、弹性蛋白片段/肽、锁链素)和/或氧化损伤的产物例如氯化肽和/或代谢物例如乳酸和游离脂肪酸。
50.项34-49中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述炎症状态是肺炎症状态。
51.项34-50中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述炎症加剧是肺加剧。
52.项34-51中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述对象患有呼吸疾病。
53.项34-52中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述呼吸疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)或囊性纤维化(CF)。
54.项34-52中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用导致所述处理器参照针对所述对象进行调整的标志物阈值水平计算至少一种中性粒细胞活化标志物的水平。
55.项54所述的系统或检验工具套装，其中所述标志物的阈值水平是基于在更早时间点取自所述对象的尿样品中所述标志物的测定水平来设置的。
56.项55所述的系统或检验工具套装，其中所述更早时间点包括临近测定目前的尿样品中所述标志物水平时的至少两次更早测量。
57.项55或56所述的系统或检验工具套装，其中所述标志物的阈值水平是基于在所述对象没有遭受炎症加剧时的更早时间点取自所述对象的尿样品中所述标志物的测定水平来设置的，且提高到超过阈值预测或鉴定加剧。
58.项55或56所述的系统或检验工具套装，其中所述标志物的阈值水平是基于在所述对象正遭受炎症加剧时的更早时间点取自所述对象的尿样品中所述标志物的测定水平来设置的，且降低到低于阈值预测或鉴定从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
59.项34-58中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用导致所述处理器指示所述对象需要测定至少一种中性粒细胞活化标志物的水平。
60.项34-59中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被进一步配置为：当计算出至少一种标志物的水平提高时，从处理器输出以下要求，所述要求是提高测定取自所述对象的尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平的频率。
61.项60所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被进一步配置为：从处理器输出以下要求，所述要求是维持提高的测定至少一种中性粒细胞活化标志物的水平的频率直到计算出至少一种标志物的水平降低。
62.项34-61中任一项所述的系统或检验工具套装，其包括用于测定在多个时间点取自所述对象的尿样品中至少两种或三种中性粒细胞活化标志物的水平的一个或多个检验装置。
63.项62所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为计算至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高和由处理器提供以下输出：计算出的至少一种标志物的水平提高指示或预测炎症加剧。
64.项62或63所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为计算至少一种中性粒细胞活化标志物的水平降低和由处理器提供以下输出：计算出的至少一种标志物的水平增加后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
65.项62-64中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为以预定顺序分析至少两种或三种标志物的计算水平以监测对象的炎症状态。
66.项62-65中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为向至少两种或三种标志物的测定水平应用加权。
67.项34-66中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为通过针对参照标志物水平归一化来计算至少一种中性粒细胞活化标志物的水平。
68.项67所述的系统或检验工具套装，其中所述参照标志物包括尿肌酸酐或纤维蛋白原。
69.项34-67中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被进一步配置为将来自炎症加剧的其他指示物的输入并入对象目前炎症状态的计算中。
70.项69所述的系统或检验工具套装，其中所述炎症加剧的其他指示物包括呼吸短促、喘息增加、脉搏率增加、呼吸困难、痰脓增多、痰色加深、咽喉痛、咳嗽增加、感冒和发烧。
71.如项34-70中任一项所限定的计算机应用。
72.检测对象的炎症状态的方法，所述方法包括：测定在多个时间点取自所述对象的尿样品中至少三种标志物的水平，其中尿样品中至少一种标志物的水平提高指示或预测炎症加剧和/或其中尿样品中至少一种标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
73.根据项71或72所述的方法，其中至少一种标志物选自信号分子或效应物/效应物抑制剂分子。
74.根据项73所述的方法，其中所述效应物分子选自蛋白酶活性、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)(游离的或在复合体中)、钙网蛋白或髓过氧化物酶(MPO)。
75.根据项74所述的方法，其中所述蛋白酶活性选自基质金属蛋白酶(MMP)活性、HNE活性和组织蛋白酶G活性。
76.根据项75所述的方法，其中MMP活性包括MMP9和/或MMP8活性。
77.根据项74-76中任一项所述的方法，其中通过测量肽底物的切割来测定蛋白酶活性。
78.根据项74-77中任一项所述的方法，其中通过下述方法测定蛋白酶活性，所述方法包括：
a.使指示物分子与检验样品接触，所述指示物分子包含
i.包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述蛋白酶，若存在的话，切割；和
ii.捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生新结合位点；
b.向所述检验样品中加入能够结合到所述新结合位点的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合；
c.在捕获区通过所述捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合来捕获含有所述新结合位点的指示物分子部分；和
d.通过测定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示物分子的新结合位点的结合来检测所述至少一个切割位点的切割。
79.根据项73-78中任一项所述的方法，其中所述效应物抑制剂分子是蛋白酶抑制剂分子。
80.根据项79所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂分子选自金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、胱抑素C和α-1抗胰蛋白酶(A1AT)。
81.根据项73所述的方法，其中所述信号分子选自ICAM-1、IL-6、IL-1β、IL-8、N-甲酰基-Met-Leu-Phe(fMLP)、IL-6诱导的纤维蛋白原和细胞因子诱导的β-2-微球蛋白(B2M)。
82.根据项72-81中任一项所述的方法，其中至少一种标志物包括或进一步包括由于炎症而产生的分子。
83.根据项82所述的方法，其中所述由于炎症而产生的分子包括蛋白酶活性的降解产物，例如细胞外基质分解产物(例如，Ac-PGP、弹性蛋白片段/肽、锁链素)和/或氧化损伤的产物例如氯化肽和/或代谢物例如乳酸和游离脂肪酸。
84.根据项72-83中任一项所述的方法，其中所述炎症状态是肺炎症状态。
85.根据项72-84中任一项所述的方法，其中所述炎症加剧是肺加剧。
86.根据项72-85中任一项所述的方法，其中所述对象患有呼吸疾病。
87.根据项86所述的方法，其中所述呼吸疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)或囊性纤维化(CF)。
88.根据项72-87中任一项所述的方法，其中所述标志物的水平提高或降低是参照针对所述对象调整的每种标志物的阈值水平计算的。
89.根据项89所述的方法，其中每种标志物的阈值水平均是通过测定在更早时间点取自所述对象的尿样品中每种标志物的水平来设置的。
90.根据项90所述的方法，其中所述更早时间点包括临近测定目前的尿样品中所述标志物水平时的至少两次更早测量。
91.根据项90或91所述的方法，其中每种标志物的阈值水平均是通过测定在更早时间点(此时所述对象没有遭受炎症加剧)取自所述对象的尿样品中所述标志物的水平来设置的，且提高到超过阈值预测或鉴定加剧。
92.根据项90或91所述的方法，其中所述标志物的阈值水平是通过测定在更早时间点(此时所述对象正遭受炎症加剧)取自所述对象的尿样品中所述标志物的水平来设置的，且降低到低于阈值预测或鉴定从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
93.根据项72-92中任一项所述的方法，其中至少每周两次测定所述标志物的水平。
94.根据项72-93中任一项所述的方法，其中如果检测到至少一种标志物的水平提高，则提高测定标志物水平的频率。
95.根据项94所述的方法，其中维持测定标志物水平的频率直至检测到至少一种标志物的水平降低。
96.根据项72-93中任一项所述的方法，其中如果检测到所述至少三种标志物中每种的水平均提高，则指示或预测所述对象炎症加剧。
97.根据项96所述的方法，其中治疗所述对象的加剧。
98.根据项72-97中任一项所述的方法，其中如果测定到任何标志物的水平均没有提高，则炎症状态被视为稳定和/或维持检验频率。
99.根据项72-98中任一项所述的方法，其中如果测定到一种标志物的水平提高，但另外两种标志物的水平没有提高，则提高检验频率。
100.根据项99所述的方法，其中除非在设定数目的重复检验内，一种标志物的提高水平回复到非提高水平，否则提高检验频率。
101.根据项100所述的方法，其中如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平回复到非提高水平，则将检验频率回复到原始频率。
102.根据项100所述的方法，其中如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则进一步提高检验频率。
103.根据项102所述的方法，其中如果在频率已提高的另外设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则指示或预测炎症加剧。
104.根据项103所述的方法，其中治疗患者的加剧。
105.根据项102所述的方法，其中如果在频率已提高的另外设定数目的重复检验内，一种标志物的水平回复到非提高水平，则将检验频率回复到提高的(而不是进一步提高的)检验频率。
106.根据项105所述的方法，其中如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在非提高水平，则将检验频率回复到原始频率。
107.根据项72-106中任一项所述的方法，其中如果测定到两种标志物的水平提高，但另一种标志物的水平没有提高，则提高检验频率。
108.根据项107所述的方法，其中将检验频率提高至比仅检测到一种标志物的水平提高的情况更高的频率。
109.根据项108所述的方法，其中如果在设定数目的重复检验内，至少一种标志物的水平回复到非提高水平，则将检验频率回复到指示一种标志物的水平测定为提高的检验频率。
110.根据项109所述的方法，其中如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则再次提高检验频率。
111.根据项110所述的方法，其中如果在频率已提高的另外设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则指示或预测炎症加剧。
112.根据项111所述的方法，其中治疗患者的加剧。
113.根据项107或108所述的方法，其中如果在频率已提高的另外设定数目的重复检验内，两种标志物的水平维持在提高的水平，则指示或预测炎症加剧。
114.根据项113所述的方法，其中治疗患者的加剧。
115.根据项72-114中任一项所述的方法，其中尿样品中至少一种标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
116.根据项72-115中任一项所述的方法，其中以预定顺序分析至少三种标志物的测定水平以监测所述对象的炎症状态。
117.根据项72-116中任一项所述的方法，其中加权至少两种或三种标志物的测定水平。
118.根据项72-117中任一项所述的方法，其中第一标志物是TIMP2，第二标志物是MMP活性且第三标志物是A1AT。
119.根据任何前项所述的方法，其中通过针对参照标志物的水平归一化来确定至少一种标志物的水平。
120.根据项119所述的方法，其中所述参照标志物包括尿肌酸酐或纤维蛋白原。
121.根据项72-120中任一项所述的方法，所述方法还包括监测炎症加剧的其他指示物。
122.根据项121所述的方法，其中所述炎症加剧的其他指示物包括呼吸短促、喘息增加、脉搏率增加、呼吸困难、痰脓增多、痰色加深、咽喉痛、咳嗽增加、感冒和发烧。
123.用于监测对象的炎症状态的系统或检验工具套装，其包括：
a.用于测定尿样品中至少三种标志物的水平的一个或多个检验装置；
b.处理器；和
c.包含计算机应用的存储介质，当所述处理器执行所述计算机应用时，所述计算机应用被配置为：
i.取得和/或计算在一个或多个检验装置上的尿样品中每种标志物的测定水平；
ii.计算尿样品中是否存在至少一种标志物的水平提高或降低；和
iii.从所述处理器输出所述对象目前的炎症状态，其中尿样品中至少一种标志物的水平提高指示或预测炎症加剧和/或其中尿样品中至少一种标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
124.项123所述的系统或检验工具套装，其还包括处理器输出显示器。
125.项123或124所述的系统或检验工具套装，其中所述一个或多个检验装置是一次性使用装置。
126.项123-125中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述一个或多个检验装置包括侧向流检验条。
127.项126所述的系统或检验工具套装，其包括用于测定的每种标志物的侧向流检验条。
128.项123-127中任一项所述的系统或检验工具套装，其中至少一种标志物选自信号分子或效应物/效应物抑制剂分子。
129.项128所述的系统或检验工具套装，其中所述效应物分子选自蛋白酶活性、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)(游离的或在复合体中)、钙网蛋白或髓过氧化物酶(MPO)。
130.项129所述的系统或检验工具套装，其中所述蛋白酶活性选自基质金属蛋白酶(MMP)活性、HNE活性和组织蛋白酶G活性。
131.项130所述的系统或检验工具套装，其中MMP活性包括MMP9和/或MMP8活性。
132.项129-131中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述一个或多个检验装置包括测量作为蛋白酶活性指示物的肽底物的切割的检验装置。
133.项132所述的系统或检验工具套装，其中所述检验装置包括：
a.用于加入到尿样品中的指示物分子，所述指示物分子包含
i.包含至少一个切割位点的切割区域，所述切割位点能够被所述蛋白酶活性，若存在的话，切割；和
ii.捕获位点；
其中至少一个切割位点的切割产生新结合位点；
b.用于接收尿样品的捕获区，其中所述捕获区包含能够与所述指示物分子的捕获位点结合的捕获分子以固定包含所述新结合位点的指示物分子；和
c.能够结合到所述新结合位点的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合。
134.项128-133中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述效应物抑制剂分子是蛋白酶抑制剂分子。
135.项134所述的系统或检验工具套装，其中所述蛋白酶抑制剂分子选自金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、胱抑素C和α-1抗胰蛋白酶(A1AT)。
136.项128所述的系统或检验工具套装，其中所述信号分子选自ICAM-1、IL-6、IL-1β、IL-8、N-甲酰基-Met-Leu-Phe(fMLP)、IL-6诱导的纤维蛋白原和细胞因子诱导的β-2-微球蛋白(B2M)。
137.项123-136中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述标志物包括或进一步包括由于炎症而产生的分子。
138.项137所述的系统或检验工具套装，其中所述由于炎症而产生的分子包括蛋白酶活性的降解产物，例如细胞外基质分解产物(例如，Ac-PGP、弹性蛋白片段/肽、锁链素)和/或氧化损伤的产物例如氯化肽和/或代谢物例如乳酸和游离脂肪酸。
139.项123-138中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述炎症状态是肺炎症状态。
140.项123-139中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述炎症加剧是肺加剧。
141.项123-140中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述对象患有呼吸疾病。
142.项123-141中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述呼吸疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)或囊性纤维化(CF)。
143.项123-142中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用导致所述处理器参照针对所述对象进行调整的每种标志物的阈值水平计算所述标志物的水平。
144.项143所述的系统或检验工具套装，其中每种标志物的阈值水平均是基于在更早时间点取自所述对象的尿样品中所述标志物的测定水平来设置的。
145.项144所述的系统或检验工具套装，其中所述更早时间点包括临近测定目前的尿样品中所述标志物水平时的至少两次更早测量。
146.项144或145所述的系统或检验工具套装，其中每种标志物的阈值水平均是基于在更早时间点(此时所述对象没有遭受炎症加剧)取自所述对象的尿样品中所述标志物的测定水平来设置的。
147.项123-146中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用导致所述处理器指示所述对象需要测定所述标志物的水平，且提高到超过阈值预测或鉴定加剧。
148.项123-146所述的系统或检验工具套装，其中所述标志物的阈值水平是基于在更早时间点(此时所述对象正遭受炎症加剧)取自所述对象的尿样品中所述标志物的测定水平来设置的，且降低到低于阈值预测或鉴定从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
149.项123-148中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被进一步配置为：当计算出至少一种标志物的水平提高时，从处理器输出以下要求，所述要求是提高测定所述标志物水平的频率。
150.项149所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被进一步配置为：从处理器输出以下要求，所述要求是维持提高的测定所述标志物水平的频率直到计算出至少一种标志物的水平降低。
151.项123-150中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为：如果计算出所述至少三种标志物中每种的水平均提高，则从处理器输出炎症加剧的指示或预测。
152.项151所述的系统或检验工具套装，其中所述输出是所述对象应该接受治疗的指示。
153.项123-150中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为：如果测定到任何标志物的水平均未提高，则从处理器输出以下指示：炎症状态被视为稳定和/或维持检验频率。
154.项123-153中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为：如果计算出一种标志物的水平提高，但另外两种标志物的水平没有提高，则从处理器输出提高检验频率的指示。
155.项154所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为：除非在设定数目的重复检验内一种标志物的提高水平回复到非提高水平，否则从处理器输出提高检验频率的指示。
156.项154所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用计算在设定数目的重复检验内一种标志物的水平是否回复到非提高水平。
157.项156所述的系统或检验工具套装，其中如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平回复到非提高水平，则计算机应用产生以下处理器输出：将检验频率回复到原始频率。
158.项154-157中任一项所述的系统或检验工具套装，其中如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则计算机应用产生以下处理器输出：进一步提高检验频率。
159.项158所述的系统或检验工具套装，其中如果在频率已提高的另外设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则计算机应用产生以下处理器输出：指示或预测炎症加剧和/或应该治疗对象。
160.项158或159所述的系统或检验工具套装，其中如果在频率已提高的另外设定数目的重复检验内，一种标志物的水平回复到非提高水平，则计算机应用产生以下处理器输出：将检验频率回复到提高的(而不是进一步提高的)检验频率。
161.项160所述的系统或检验工具套装，其中如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在非提高水平，则计算机应用产生以下处理器输出：将检验频率回复到原始频率。
162.项123-161中任一项所述的系统或检验工具套装，其中如果测定到两种标志物的水平提高，但另一种标志物的水平没有提高，则计算机应用产生以下处理器输出：提高检验频率。
163.项162所述的系统或检验工具套装，其中将检验频率提高至高于仅检测到一种标志物的水平提高的情况下的频率。
164.项163所述的系统或检验工具套装，其中如果在设定数目的重复检验内，至少一种标志物的水平回复到非提高水平，则计算机应用产生以下处理器输出：将检验频率回复到指示一种标志物的水平测定为提高的检验频率。
165.项164所述的系统或检验工具套装，其中如果在设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则计算机应用可产生以下处理器输出：再次提高检验频率。
166.项165所述的系统或检验工具套装，其中如果在频率已提高的另外设定数目的重复检验内，一种标志物的水平维持在提高的水平，则计算机应用可产生以下处理器输出：指示或预测炎症加剧和/或应该治疗对象。
167.项162或163所述的系统或检验工具套装，其中如果在频率已提高的另外设定数目的重复检验内，两种标志物的水平维持在提高的水平，则计算机应用产生以下处理器输出：指示或预测炎症加剧和/或应该治疗对象。
168.项123-167中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为：计算至少一种中性粒细胞活化标志物的水平降低和提供以下处理器输出：计算出至少一种标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
169.项123-168中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为：以预定顺序分析至少三种标志物的计算水平以监测所述对象的炎症状态。
170.项123-169中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为：向至少三种标志物的测定水平应用加权。
171.项123-170中任一项所述的系统或检验工具套装，其中第一标志物是TIMP2，第二标志物是MMP活性且第三标志物是A1AT。
172.项123-171中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为：通过针对参照标志物的水平归一化来计算至少一种标志物的水平。
173.项172所述的系统或检验工具套装，其中所述参照标志物包括尿肌酸酐或纤维蛋白原。
174.项123-173中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被进一步配置为：将来自炎症加剧的其他指示物的输入并入对象目前炎症状态的计算中。
175.根据项174所述的方法，其中所述炎症加剧的其他指示物包括呼吸短促、喘息增加、脉搏率增加、呼吸困难、痰脓增多、痰色加深、咽喉痛、咳嗽增加、感冒和发烧。
176.如项123-175中任一项所限定的计算机应用。
这些项中所讨论的本发明也可应用于另外的标志物。实例包括CRP、LEF和CC16，其可与本文所述的任何其他特异性标志物组合应用。
参照以下实验实施例能够进一步理解本发明。
实施例
实施例1：本发明中用于检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的侧向流平台
工具套装包括以下组分：-
1)用于尿样品收集的装置
2)侧向流检验条，其安装在塑料盒中。检验条具有包含聚链霉亲和素的捕获区作为跨越检验条的流动路径的第一检验线。作为跨越检验条的流动路径的对照线，位于检验线下游的包含吸附的抗-鸡抗体的第二捕获区可作为对照线被包括。塑料盒中存在观察窗，通过所述观察窗观看检验线和对照线。在第一检验线上游还存在整合的样品接收垫。此外，检验条含有携带绵羊抗体(CF1522)的金颗粒，所述金颗粒被干燥进入所述检验条中样品接收垫的下游，其可通过添加样品而被重建。
3)管，其中可放置样品收集装置，和指示分子
4)含可切割序列的指示物分子，在该实施例中，所述可切割序列是(GPQGIFGQ)，所述指示物分子带有通过聚乙二醇间隔子/连接子连接的末端生物素基团，这允许其与捕获线聚链霉亲和素形成复合体。
检验条
如下文所述构建用于检测样品中蛋白酶活性的检验条。试验基于：在存在多种MMP的情况下切割指示物分子以将表位暴露，其对缀合到金颗粒的绵羊抗体(CF1522)可见。
使用的方法均依照本领域熟知的标准程序。
A.制备CF1522:40nm金缀合物
使亲和纯化的绵羊抗体CF1522(Ig Innovations,CF1522)以一定浓度缀合到40nm金颗粒上，所述浓度在520nm下产生OD＝5(BBI International,GC40)。在pH＝7.8的20mMBES缓冲液中以15μg/ml的浓度装载抗体。0.2％BSA(Sigma,A7906)被用作封闭液以使非特异性结合最小化。
B.制备浸渍金的缀合物垫
利用Isoflow分配器(喷射高度为15mm)以0.8μl/mm将于金干燥缓冲液(1M Tris，150mM氯化钠，20mM叠氮化钠，3％BSA,5％蔗糖，1％Tween 20，pH＝9.4)中稀释的OD＝4的CF1522:40nm金缀合物(Mologic)喷在玻璃纤维缀合物垫(Millipore,G041,17mm×300mm)上。在60℃、速度为5mm/秒的隧道式干燥机中干燥经处理的缀合物条带。在室温下，将经干燥的浸渍金缀合物的缀合物垫干燥储存在带有干燥剂的密封箔袋中。
C.制备浸渍抗体的硝化纤维素膜
以0.1μl/mm的分配速率将所有试剂划线(striped)在Unistart CN140膜(Sartorius,CN140,25mm×300mm)上。将浓度为1mg/ml的检验线聚链霉亲和素(BBI,Polystrep N 01041048K)置于距离膜基部7mm。在60℃、速度为10mm/秒的隧道式干燥机中干燥经处理的膜。在室温下，将经干燥的浸渍抗体的硝化纤维素膜储存在带有干燥剂的密封箔袋中。
D.卡组装
根据以下程序并依照图4组装检验卡，图4指定了每个卡组件的准确纵向维度和位置。
·1.将图4中标示为1的带有释放衬里保护的粘合剂的60×300mm透明塑料膜(充当背部层压材料)(G&L Precision Die Cutting,GL-48077)放置在工作台上。剥落释放衬里以暴露粘合剂。
·2.使反应膜(如在部分C中制备)附着在封底的粘合剂侧之上，距离下端20mm。
·3.使浸渍的缀合物垫(如在部分B中制备)附着在封底之上，在反应膜上重叠2mm。
·4.将样品垫(MDI,FR-1,10×300mm)放置在封底之上，在缀合物垫上重叠5mm。
·5.将吸收垫(凝胶印迹纸,Ahlstrom,等级为222,22×300mm)放置在封底上侧之上，在反应膜上重叠2mm。
使用自动化模压切割机(Kinematic,2360)将卡修剪成5mm宽的条并组装到塑料罩(Forsite)中。使用在Mologic为装置特别制造的气动装置夹具关闭这些装置。
下表列出了衬背卡上的条组件和各自的位置。
组件 尺寸 从基准点的位置
衬背卡(1) 60mm 0mm
硝化纤维素膜(2) 25mm 20mm
缀合物垫(3) 17mm 5mm
样品垫(4) 10mm 0mm
吸收垫(5) 22mm 38mm
制备含不同浓度(从1000ng/ml下至1ng/ml)的活性MMP-9(Alere San Diego)的缓冲标准品。
第一步：将每种标准品放置在含有确定量肽(25ng/检验)的收集装置中。剧烈旋转收集装置以使样品与底物溶液充分混合。在环境温度下孵育这种反应混合物持续确定的时间段(例如，10分钟)。
第二步：在孵育期结束时，将确定体积的液体滴到样品接收垫上，所述样品接收垫随后与缀合物垫接触并使经干燥的附着到金颗粒的CF1522抗体再水化。完整的指示物分子不被金缀合物识别并以未复合状态朝向聚链霉亲和素检验线迁移，在聚链霉亲和素检验线中，其通过与指示物分子相连的生物素被固定化。样品中存在的任何MMP-9在切割位点切割指示物分子，暴露可识别的表位，从而允许金缀合物与经切割的残余部分形成复合物。
通过所形成线的相对强度来评估这些线。检验线的存在指示检验样品中存在蛋白酶。无检验线指示蛋白酶的水平为0或者低于检测极限的低蛋白酶水平。这些极端情况之间的级别指示检验样品中不同水平的蛋白酶。通过视觉以及利用Forsite侧向流装置读取器测量形成的有色线的强度。等级为0-10的半定量评分系统被用于视觉读取，其中1是最低的可检测颜色强度且10是最高的观察的颜色强度。
图7(图7A和7B)展示了：利用添加了MMP-9的缓冲样品运行时试验的灵敏度。利用75μl样品体积时，MMP-9的检测极限为约4ng/ml。图7A显示了跨越MMP-9的整个浓度范围的读取器值，而图7B是MMP-9浓度在0-15ng/ml之间时的展开图。
读取器单位展示于下表，其中高于400的值被视为阳性结果：
实施例2：侧向流方式的本发明中所用试验的基质金属蛋白酶(MMP)特异性
如关于实施例1所述进行工具套装和检验条合成。
在缓冲液(pH＝8.0的50mM Tris、150mM氯化钠、20mM叠氮化钠、1％体积/体积Tween 20的水溶液)以0.5μg/ml制备多种MMP(Enzo)。
第一步：将每种MMP溶液放置在含有确定量肽(25ng/检验)的收集装置中。剧烈旋转收集装置以使样品与底物溶液充分混合。在环境温度下孵育这种反应混合物持续确定的时间段(例如，10分钟)。
第二步：在孵育期结束时，将确定体积的液体滴到样品接收垫上，所述样品接收垫随后与缀合物垫接触并使经干燥的附着到金颗粒的CF1522抗体再水化。完整的指示物分子不被金缀合物识别并以未复合状态朝向聚链霉亲和素检验线迁移，在聚链霉亲和素检验线中，其通过与指示物分子相连的生物素被固定化。样品中存在的任何MMP-9在切割位点切割指示物分子，暴露可识别的表位，从而允许金缀合物与经切割的残余部分形成复合物。
通过所形成线的相对强度来评估这些线。检验线的存在指示检验样品中存在蛋白酶。无检验线指示蛋白酶的水平为0或者低于检测极限的低蛋白酶水平。这些极端情况之间的级别指示检验样品中不同水平的蛋白酶。通过视觉以及利用Forsite侧向流装置读取器测量形成的有色线的强度。等级为0-10的半定量评分系统被用于视觉读取，其中1是最低的可检测颜色强度且10是最高的观察的颜色强度。
图8展示了：本发明的这种版本使用偏向MMP13、MMP12、MMP9、MMP8和MMP2的可切割序列。根据所需要的应用，本发明的另一些版本可使用具有不同靶标的序列。
下表显示了每种所检验MMP的读出值：
实施例3：检测尿中的酶活性
如对实施例1所述进行工具套装和检验条合成。
从健康志愿者(9)和患有呼吸疾病的患者收集样品。样品由9个患囊性纤维化(CF)的患者和7个患慢性阻塞性肺病(COPD)的患者捐献并储存在-80℃下直至使用。
第一步：将每种样品放置在含有确定量肽(25ng/检验)的收集装置中。剧烈旋转收集装置以使样品与底物溶液充分混合。在环境温度下孵育这种反应混合物持续确定的时间段(例如，10分钟)。
第二步：在孵育期结束时，将确定体积的液体滴到样品接收垫上，所述样品接收垫随后与缀合物垫接触并使经干燥的附着到金颗粒的CF1522抗体再水化。完整的指示物分子不被金缀合物识别并以未复合状态朝向聚链霉亲和素检验线迁移，在聚链霉亲和素检验线中，其通过与指示物分子相连的生物素被固定化。样品中存在的任何MMP-9在切割位点切割指示物分子，暴露可识别的表位，从而允许金缀合物与经切割的残余部分形成复合物。
通过所形成线的相对强度来评估这些线。检验线的存在指示检验样品中存在蛋白酶。无检验线指示蛋白酶的水平为0或者低于检测极限的低蛋白酶水平。这些极端情况之间的级别指示检验样品中不同水平的蛋白酶。通过视觉以及利用Forsite侧向流装置读取器测量形成的有色线的强度。等级为0-10的半定量评分系统被用于视觉读取，其中1是最低的可检测颜色强度且10是最高的观察的颜色强度。
图9展示了：在尿样品中能够发现可测量量的活性蛋白酶(尤其是MMP，包括MMP-9)且获自患呼吸疾病的患者的样品中存在更高水平。相较于从健康对照收集的样品，观察到COPD样品的显著差异(P＝0.03)，以及CF样品相对于健康对照的显著差异(P＝0.02)。
实施例4：检测伤口流液中的酶活性
如实施例1所述进行工具套装和检验条合成。
在最终ELTABA装置上检验来自18个患者的伤口样品以测量该生物基质中的活性MMP。在MMP缓冲液(pH＝8.0的50mM Tris、100mM氯化钠、10mM氯化钙、50μM 20mM氯化锌、0.025％Brij 35、0.05％叠氮化钠的水溶液)从棉签(Copan,552C.US)提取样品，然后冷冻在-20℃直至使用。螯合剂(5mM EDTA)的添加决定了装置对钙依赖型酶例如MMP的特异性。
第一步：在MMP缓冲液中以1:20稀释每种伤口样品，然后取75μl置于含有确定量肽(25ng/检验)的收集装置中。剧烈旋转收集装置以使样品与底物溶液充分混合。在环境温度下孵育这种反应混合物持续确定的时间段(例如，10分钟)。
第二步：在孵育期结束时，将确定体积的液体滴到样品接收垫上，所述样品接收垫随后与缀合物垫接触并使经干燥的附着到金颗粒的生物素再水化。完整的指示物分子不被金缀合物识别并以未复合状态朝向聚链霉亲和素检验线迁移，在聚链霉亲和素检验线中，其通过与指示物分子相连的生物素被固定化。样品中存在的任何MMP-9在切割位点切割指示物分子，暴露可识别的表位，从而允许金缀合物与经切割的残余部分形成复合物。
通过所形成线的相对强度来评估这些线。检验线的存在指示检验样品中存在蛋白酶。无检验线指示蛋白酶的水平为0或者低于检测极限的低蛋白酶水平。这些极端情况之间的级别指示检验样品中不同水平的蛋白酶。通过视觉以及利用Forsite侧向流装置读取器测量形成的有色线的强度。等级为0-10的半定量评分系统被用于视觉读取，其中1是最低的可检测颜色强度且10是最高的观察的颜色强度。
图10显示了：向伤口样品中加入EDTA抑制读出，从而验证了样品中MMP的存在并且还验证了该试验特异性测量活性MMP。
实施例5：比较本发明的灵敏度与商业MMP-9活性试验试剂盒的灵敏度
商业试剂盒被设计用于特异性检测生物样品中的MMP-9，所述生物样品例如培养基、血清、血浆、滑液和组织匀浆。首先使用单克隆抗-人MMP从混合物中拉下MMP的前形式和活性形式二者，然后利用荧光共振能量转移(FRET)肽对MMP9的活性进行定量。使AMPA内部活化的MMP-9标准品在试剂盒和侧向流方式二者上在250ng/ml–4ng/ml的范围中运行。对于商业试验，在试剂盒中所提供的MMP缓冲液中稀释MMP-9；对于侧向流装置，在Tris缓冲盐水1％Tween20中稀释MMP-9。
如实施例1所述进行侧向流工具套装和检验条合成。
在Tris缓冲盐水1％Tween(pH＝8.0的50mM Tris、150mM氯化钠、20mM叠氮化钠、1％体积/体积Tween 20的水溶液)中制备含不同浓度(从250ng/ml下至4ng/ml)的活性MMP-9(Alere San Diego)的缓冲标准品。
第一步：将每种标准品放置在含有确定量肽(25ng/检验)的收集装置中。剧烈旋转收集装置以使样品与底物溶液充分混合。在环境温度下孵育这种反应混合物持续确定的时间段(例如，10分钟)。
第二步：在孵育期结束时，将确定体积的液体滴到样品接收垫上，所述样品接收垫随后与缀合物垫接触并使经干燥的附着到金颗粒的CF1522抗体再水化。完整的指示物分子不被金缀合物识别并以未复合状态朝向聚链霉亲和素检验线迁移，在聚链霉亲和素检验线中，其通过与指示物分子相连的生物素被固定化。样品中存在的任何MMP-9在切割位点切割指示物分子，暴露可识别的表位，从而允许金缀合物与经切割的残余部分形成复合物。
通过所形成线的相对强度来评估这些线。检验线的存在指示检验样品中存在蛋白酶。无检验线指示蛋白酶的水平为0或者低于检测极限的低蛋白酶水平。这些极端情况之间的级别指示检验样品中不同水平的蛋白酶。通过视觉以及利用Forsite侧向流装置读取器测量形成的有色线的强度。等级为0-10的半定量评分系统被用于视觉读取，其中1是最低的可检测颜色强度且10是最高的观察的颜色强度。
图11(图11A和11B)是这样的图表，所述图表比较了市售活性MMP-9检验试剂盒和本发明所述试验检测MMP9的能力。图11A显示了跨越MMP-9的整个浓度范围的读取器值，而图11B是MMP-9浓度在0-50ng/ml之间时的展开图。这两个图表均证实了本文所述的侧向流试验对根据本发明的尿检验特别有用且产生更陡的曲线。根据这两个试验，通过吸光度值所示，在4ng/ml MMP9(最低检测标准)时看到显色。
下表显示了每个试验的数值读出：
实施例6：ELISA和LF两种方式的底物检验
ELISA方式
1)样品(例如，尿)收集装置
2)包被有聚链霉亲和素的96孔板
3)管，其中可放置样品收集装置，和指示分子
4)含可切割序列的指示物分子，在该实施例中，所述可切割序列是(GPQGIFGQ)，所述指示物分子带有通过聚乙二醇间隔子/连接子连接的末端生物素基团，这允许其与捕获线聚链霉亲和素形成复合体
5)缀合到碱性磷酸酶(AP)的绵羊抗体CF1522
6)碱性磷酸酶底物对硝苯磷酸(pNPP)，其使得能够产生可溶性黄色反应产物，所述反应产物可在405nm处读取。
从健康志愿者(9)和患有呼吸疾病的患者处收集样品。样品由9个患囊性纤维化(CF)的患者和7个患慢性阻塞性肺病(COPD)的患者捐献并储存在-80℃下直至使用。
第一步：将每种样品放置在含有确定量肽(25ng/检验)的收集装置中。剧烈旋转收集装置以使样品与底物溶液充分混合。在环境温度下孵育这种反应混合物持续确定的时间段(例如，10分钟)。
第二步：在孵育期结束时，将确定体积的样品添加到链霉亲和素板(Nunc，442404)上并在环境温度中孵育另外1小时，其中生物素标记的指示物分子通过结合到板上的链霉亲和素被固定化。
第三步：用洗涤缓冲液中100μl Tris缓冲盐水0.1％Tween(pH＝8.0的50mM Tris、150mM氯化钠、20mM叠氮化钠、0.1％体积/体积Tween 20的水溶液)洗涤板3次。
第四步：在PBST中的1％BSA中，以1:500稀释CF1522-AP(Mologic)，然后在周围环境中在板上孵育1小时。抗体将与经切割的残余部分形成复合体，所述经切割的残余部分是通过样品中所存在的任何MMP暴露的；当不存在经切割的残余部分时，将不存在抗体的结合。
第五步：用洗涤缓冲液中100μl Tris缓冲盐水0.1％Tween(pH＝8.0的50mM Tris、150mM氯化钠、20mM叠氮化钠、0.1％体积/体积Tween 20的水溶液)洗涤板3次。
第六步：将板与pNPP底物一起孵育，在37℃下孵育30分钟后，在405nm下读取。MMP9标准曲线被示于图14b中用作参照。孔的颜色指示检验样品中蛋白酶的不同水平，所述水平由图14b中的OD 405nm表示。
侧向流方式
如实施例1所述进行工具套装和检验条合成。
对于ELISA和侧向流装置，分别制备含不同浓度(从50ng/ml下至0.39ng/ml以及从62.5ng/ml下至0.97ng/ml)的活性MMP-9(Alere San Diego)的缓冲标准品。
第一步：将每种样品放置在含有确定量肽(25ng/检验)的收集装置中。剧烈旋转收集装置以使样品与底物溶液充分混合。在环境温度下孵育这种反应混合物持续确定的时间段(例如，10分钟)。
第二步：在孵育期结束时，将确定体积的液体滴到样品接收垫上，所述样品接收垫随后与缀合物垫接触并使经干燥的附着到金颗粒的CF1522抗体再水化。完整的指示物分子不被金缀合物识别并以未复合状态朝向聚链霉亲和素检验线迁移，在聚链霉亲和素检验线中，其通过与指示物分子相连的生物素被固定化。样品中存在的任何MMP-9在切割位点切割指示物分子，暴露可识别的表位，从而允许金缀合物与经切割的残余部分形成复合物。
通过所形成线的相对强度来评估这些线。检验线的存在指示检验样品中存在蛋白酶。无检验线指示蛋白酶的水平为0或者低于检测极限的低蛋白酶水平。这些极端情况之间的级别指示检验样品中不同水平的蛋白酶。通过视觉以及利用NES侧向流装置读取器测量形成的有色线的强度。
在图12中可看到MMP9标准曲线的结果。图12证明了：通过ELISA和侧向流产生的两种MMP9标准曲线相似，灵敏度下及4ng/ml。
下表显示了来自两个试验的数值读出：
实施例7：合成示例性指示物分子
使用Fmoc化学方法在固相上合成称为MOL386的肽(氨基酸序列CGPQGIFGQC)。简而言之，在微波辅助自动化合成仪(CEM Liberty)上进行合成。在DMF溶剂中，利用五倍过量的氨基酸结构单元、HBTU活化剂和十倍过量的DIPEA碱，在预装载Fmoc-Cys(Trt)的PEG-聚苯乙烯树脂上进行偶联步骤。在5％的哌嗪/DMF中进行去保护步骤。干燥完成的肽树脂，然后使用95％TFA、2.5％TIPS和2.5％水切割其2小时。将TFA液剂在真空中干燥并在醚中沉淀以提供无色的肽固体。将回收的肽从50％乙腈冷冻干燥并使用C18反相柱和从5％乙腈/水(0.1％TFA)到100％乙腈(0.1％TFA)的梯度通过HPLC(图16)纯化。将分离的级分合并并冷冻干燥，然后通过电喷雾质谱(图17)分析以鉴定靶标肽(预期MH+为1010.17，测量到1010.3)。从预装载的生物素-PEG-Nova标签树脂(Merck)合成生物素化形式(CGPQGIFGQC-PEG-生物素)(预期MH+为1438.76，测量到1439.7，图18)。生物素为指示物分子的固定化提供捕获位点。
连接支架分子(合成环化肽)
将肽(1mg)和1mg 1,3-二溴甲苯溶解在250ul PBS中并温和搅动过夜。然后将反应用1ml水稀释并直接注射到HPLC上用于纯化，其中使用C18反相柱和从5％乙腈/水(0.1％TFA)到100％乙腈(0.1％TFA)的梯度。将产物峰分离并冷冻干燥以提供无色固体(预期MH+为1112.30，测量到1112.8，图19)。对于生物素化的肽(预期MH+为1540.89，测量到1539.8，图20)，使用相同程序。
实施例8–生成检验方式
生成抗体以识别经切割的肽序列。在该实施方式中，在免疫分析中使用MMP消化的靶标(GPQGIFGQ)以测量临床样品中的酶活性。使用本领域技术人员已知的方法针对肽KLH缀合物建立抗体。生成绵羊抗体CF1522和CF1523以识别经切割的残余部分‘IFGQ’，生成绵羊抗体CF1524和CF1525以识别经切割的残余部分‘GPQG’。使用特异性肽亲和纯化抗体，其中抗体是针对所述特异性肽建立的，然后通过ELISA分析以确定给出最佳灵敏度的最合适试验方式。
利用附着在C-末端(分别为MOL038和PCL008-A2)或N-末端(分别为MOL310和MOL378)的聚乙二醇化生物素或生物素合成含可切割序列(GPQGIFGQ)的肽。
肽可通过生物素锚定到链霉亲和素捕获物或者通过ALP序列锚定到绵羊抗体CF1060捕获物。评估了图1中图示的建议方式。
ELISA方式
1)尿样品收集装置
2)96孔板，其用聚链霉亲和素(Nunc,442404)或CF1060包被并在周围环境中过夜(Nunc,Maxisorb)
3)管，其中可放置样品收集装置，和指示分子
4)含可切割序列的指示物分子，在该实施例中，所述可切割序列是(GPQGIFGQ)，所述指示物分子带有可通过聚乙二醇间隔子/连接子连接在N-末端或C-末端的末端生物素基团
5)缀合到碱性磷酸酶(AP)的绵羊抗体CF1522、CF1523、CF1524和CF1525
6)碱性磷酸酶底物对硝苯磷酸(pNPP)，其使得能够产生可溶性黄色反应产物，所述反应产物可在405nm处读取。
在MMP缓冲液(pH＝8.0的50mM Tris、100mM氯化钠、10mM氯化钙、50μM 20mM氯化锌、0.025％Brij 35、0.05％叠氮化钠的水溶液)中，将活性MMP9(Alere San Diego)稀释至2μg/ml、0.25μg/ml、0.062μg/ml、0.0156μg/ml和0.039μg/ml。
第一步：将每种MMP9标准品放置在含有确定量的每种肽(20ng/检验)的收集装置中。剧烈旋转收集装置以使样品与底物溶液充分混合。在环境温度下孵育这种反应混合物持续确定的时间段(例如，30分钟)。
第二步：在孵育期结束时，将确定体积的样品添加到链霉亲和素板和CF1060敏化板上并在周围环境中孵育另外1小时，其肽通过结合到板上的链霉亲和素或CF1060被固定化。
第三步：用洗涤缓冲液中100μl Tris缓冲盐水0.1％Tween(pH＝8.0的50mM Tris、150mM氯化钠、20mM叠氮化钠、0.1％体积/体积Tween 20的水溶液)洗涤板3次。
第四步：在PBST中的1％BSA中，以1:500稀释缀合到碱性磷酸酶的绵羊抗体(Mologic)，然后在周围环境中在板上孵育1小时。抗体将与经切割的残余部分形成复合体，所述经切割的残余部分是通过样品中所存在的任何MMP9暴露的；当不存在经切割的残余部分时，将不存在抗体的结合。
第五步：用洗涤缓冲液中100μl Tris缓冲盐水0.1％Tween(pH＝8.0的50mM Tris、150mM氯化钠、20mM叠氮化钠、0.1％体积/体积Tween 20的水溶液)洗涤板3次。
第六步：将板与pNPP底物一起孵育，在37℃下孵育30分钟后，在405nm下读取。所有组合的MMP9标准曲线被示于图21中。孔颜色差异指示检验样品中蛋白酶的不同水平，所述水平由OD 405nm表示。
图21显示了检验每种方式的结果。对于链霉亲和素捕获线，正如预测的那样，利用绵羊抗体CF1522时选择的肽是MOL378，利用绵羊抗体CF1525时选择的肽是PCL008-A2。这两种肽均含有减少任何空间位阻所需的PEG-Asp-AEEAc-AEEAc。对于CF1060捕获线，正如预测的那样，利用绵羊抗体CF1522时选择的肽是MOL038或PCL008-A2，利用绵羊抗体CF1525时选择的肽是MOL378。图22中显示了最佳组合的性能。此处，使用绵羊抗体CF1522和肽MOL378的方式4显示出最有潜力。
实施例9
基本原理
慢性阻塞性肺病急性加剧(AECOPD)涉及蛋白水解的肺泡破坏和全身炎症二者。炎性蛋白、蛋白酶及其分解产物已作为AECOPD的全身标志物被广泛研究，其中一些以可检测状态排放在尿中，从而提供了开发AECOPD的侵入性最小化的生物标志物检验的机会。
另一些小组已发现：相较于患有稳定COPD的患者，AECOPD患者中弹性蛋白酶分解产物的尿排放水平更高，但仅有很少小组群的研究调查了连续经历AECOPD和稳定期COPD二者的患者中的肾脏生物标志物排放。
我们旨在鉴定AECOPD的尿生物标志物。目标是：1)鉴定物学上可信的尿生物标志物和2)在收治的AECOPD患者的纵向研究中，比较加剧期和稳定期的生物标志物排放。
方法
因AECOPD收治的73位COPD患者被邀请参与研究并给出书面知情同意参与。在加剧时(第0天)和患者在临床上良好的第56天进行病史、检查和尿取样。
基于炎症生物化学和细胞学的示性分析以及最近的出版物选择AECOPD的候选尿生物标志物组。候选物包括蛋白酶、蛋白酶抑制剂和白介素。使用一系列ELISA和内部试验设计对第0天和第56天的生物标志物水平进行定量。
分析时，34位患者的第0天和第56天的数据可用。对于正常数据和非正常数据，分别利用配对t检验和Wilcoxon检验比较加剧和稳定状态的生物标志物水平。对所有显著性截止值均应用多重假设检验校正。
结果
相较于稳定状态，在加剧期间，TIMP1(金属蛋白酶组织抑制剂)和胱抑素c(溶酶体蛋白酶抑制剂)以显著更高水平分泌在尿中(n＝34,对于TIMP1和胱抑素c，Wilcoxo符号秩次检验分别为p＝0.005和p＝0.013)。
结论
AECOPD期间尿TIMP1和胱抑素c的水平超过在随后的稳定COPD期间观察到的水平的显著提高可反映对提高的肺蛋白酶活性的响应。这些发现保证了进一步研究作为AECOPD的生物标志物的这些蛋白。
实施例10–慢性阻塞性肺病加剧时的尿生物标志物
引言
存在未满足的对COPD加剧的可靠生物标志物的需要，所述生物标志物在临床试验期间能够警告患者寻求医疗护理、指导治疗性干预和验证这些事件。任何生物标志物的最低要求均是加剧时的变化。该研究的目的是确定一组在加剧时响应的候选尿生物标志物。
方法
从伦敦COPD组群招募50位患者(35位女性)。他们的年龄为73.2岁(SD 7.1)且具有预测为49.0％(SD 17.6)的FEV1(作为％)且FEV1/FVC比例＝47.7(13.7)。在加剧症状发作的3天内(IQR 2-5)收集65个尿样品。每一加剧具有单独的基线样品，其取的是发作前91天的中值(IQR＝39-132)。在每次临床访问时获取肺功能和血样品。
在内部试验(Mologic Ltd,Thurleigh,香港)和商业试验试剂盒的组合中测量尿生物标志物。试验系统、ELISA、侧向流、底物试验和酶谱法均被优化以保证高精度和准确度，同时还提供检测尿中每种生物标志物的生物学水平所需的灵敏度和特异性。
结果
在65个加剧中：45个用抗生素和口服皮质类固醇治疗；9个用单独的抗生素治疗；6个用单独的皮质类固醇治疗；4个用增加的皮质类固醇和/或β-2激动剂吸入剂使用治疗。
在基线和发作之间，FEV1从1.27l降至1.22l(t-检验p＝0.027；n＝57)且血浆中的c-反应蛋白从3mg/dl(1-7)升至5mg/dl(3-28)(p<0.001；n＝60)。红细胞压积没有变化(0.42相对于0.41；p＝0.337)，这暗示血浆体积没有变化。
表1显示了23种尿生物标志物，其中12种在加剧时显著变化(wilcoxon符号秩次检验；p<0.05)。
结论
尿是能够检测COPD加剧并且还可评价其严重性的生物标志物的潜在来源。这种方法可直接应用于家庭监测并控制COPD加剧。
表1.基线和加剧时的尿生物标志物
图25阐释了来自由28位COPD患者(来自伦敦COPD组群)捐献的尿样品的生物标志物检验结果的初步分析(或临时算法)。该表中包括三种生物标志物的结果，所述生物标志物与中性粒细胞衍生蛋白酶和蛋白酶抑制剂保护物(shield)之间的平衡有关–TIMP2、MMP底物(活性)和A1AT。结果是被用作图24中所示算法的基础的生物标志物选择过程的一部分。每个患者在稳定疾病期捐献第一样品并在他们经历临床上确认的肺加剧发作时的较晚日期捐献第二样品。表中的第一列以加剧发作开始前过去的天数来指示“稳定”样品的时间。对于三种生物标志物中的每种，均存在三列。标题为“BL”(基线)的第一列显示了在稳定疾病期间捐献的样品中该生物标志物的值。标题为“发作”的第二列显示了在加剧期间捐献的样品中该生物标志物的值。第三列显示了被表达为BL值的百分比的发作值。
这种临时算法的目的是回答以下问题：“28位患者中有多少是伴随三种生物标志物中至少一种的值上升的加剧？”。
接下来的过程是继续搜索在加剧时各自提高的替代性生物标志物值。这鉴定哪种生物标志物适合包括在用于对象监测的算法中。参照表格和在左手侧的三重组分流程图中的三个系列问题，每个患者可遵循该过程。以患者356为例，读取器能够跨越9个数值开始扫描，寻找第一个问题–“TIMP2提高了吗？”的答案。在第三列，以“是”回答该问题，就该临时算法而言，此时对患者356的搜索完成(即便MMP底物和A1AT二者也提高亦是如此)。在更复杂的算法中，检验结果将还考虑额外标志物的水平提高(例如，以参照图24所述的方式)。
对患者29重复该过程，关于TIMP2的答案是“否”，但关于MMP底物的答案为“是”。对于患者91，TIMP2和MMP底物二者均返回答案“否”，但A1AT返回“是”。只有三位患者(编号为24、92和192)对所有三种生物标志物均返回答案“否”，从而总体结果为：89％的样品中三种生物标志物中的至少一种在加剧中提高。这被视为包括某些附加因素(如关于图24所述)的完全算法的合适基础。
图26阐释了一种临时算法，其与图25中所示的算法非常相似。在这种情况下，两种样品覆盖相反临床事件-从加剧恢复以及回到稳定疾病状态。因此，应用于图25的推理和过程在此处同样适用，例外是：问题关于生物标志物值的降低而非提高。基础问题是：“28位患者中有多少是伴随三种生物标志物中至少一种的值降低的从加剧恢复？”。这被视为要回答的重要问题，因为其对生物标志物选择的可信度有主要影响。如果大部分患者样品在从加剧恢复时不显示三种生物标志物中的一种或多种减少，那么将不能确认它们与加剧的基本关联。
图26中所示结果确认了三种生物标志物的有效性，其中只有两位患者对所有三种生物标志物均返回答案“否”。这可被确定为总体93％的灵敏度。
图27基于的基本原理与图25的基本原理相同，但通过仅显示生物标志物值的百分比变化而不是包括百分比所源自的两个绝对值来简化数据。与图25一样：差异在一方面在稳定疾病期间获取的样品和另一方面在加剧时获取的样品之间。该图的目的是进一步阐释组合的三重(蛋白酶相关)生物标志物集合充当与加剧相关的诊断指标的坚固性。28位患者中在图25中追踪到其加剧事件的16位患者还提供了第二“稳定”和“加剧”样品对。这些第二样品是在出现在图25中的加剧发作之前或之后捐献的。在表中，标题为“自恢复以后的天数”的列中列出了先前研究的发作和该发作之间的时间间隔。负值指示样品是在图25中的发作之前获取的，且之后获取的样品没有负值。
每次加剧发作的数据均被成行包括，从样品对的识别号码开始。接下来3列列出了在图25中所报告的数据集合中先前观察到的百分比差异值。例如，在“ID 1”行，前三个百分比值与图25第一行中的那些(-51、116和22)相同，这表示这些值来自同一患者。在下一列中，值140表示恢复后140天，该患者发生下一次加剧。行的最后三列表示第二次加剧发作中稳定值和加剧值之间的百分比差异。对于ID 25的数据，能够看出，(在最后3列)分析的第二样品对是在图25中所报告的样品对之前320天捐献的(如通过负号所示)。
这些结果确认了组合的三重(蛋白酶相关)生物标志物集合的坚固性，因为在相同患者中的16位中的这组独立、重复的加剧事件中，计算出的灵敏度为94％。
图28显示了以不同方式展示的在图27中所示值背后的一些数据趋势，以通过重复加剧阐释生物标志物浓度曲线。该图的目的是强调个体化阈值和患者特异性基线值。展示了四种实例，其中每种均关于三种生物标志物中的每种显示5个数据点。为了清楚和简明，没有纵轴，因为没有具体的绝对值时能够最佳地提供关键点。该图表展示了波动和趋势。每个曲线中的值均针对(在基线1(BL)的)第一值进行归一化。
横轴上显示了以下缩略语，从而限定了获取尿样品的点(以这种次序)：-
-BL(基线1)
-OS(第一次发作)
-R(恢复)
-BL(基线2)
-ON(第二次发作)。
请注意，横轴没有在经过的时间方面校准，因为每次取样事件均给出距下一次取样事件相同的间隔，而不管它们之间的间距大小是多少。然而，间距由在横轴下方的数集限定。每个数字均限定了其位置和其之前的位置之间的天数。
因此，在标题678下方的图集中，能够看出，第一BL下方是数字0，因为没有在前事件。OS(第一次发作)取样事件发生在第一BL取样事件后29天，如通过其下方的数字所示。R(恢复)样品是在7天后获取的，以此类推。
2023图集的轴略微不同，体现在：第二BL下方的天数是负值(-499)。这表示：所谓的“第二次加剧”BL样品实际上是在第一BL前499天收集的。加剧样品“ON”是在-499天BL样品后24天收集的。虽然这可能看起来不必要地令人迷惑，但之所以以这种方式展示是因为这是生成数据的顺序，因此做出发现的顺序。
在每个图集中的曲线中，能够看出，对于患者678，最密切追踪加剧历史的生物标志物是MMP活性(MMP底物)，因为在两次加剧时均存在水平明显提高。对于患者2023同样如此。对于患者2097，全身性蛋白酶抑制剂A1AT能够显著有效地追踪加剧。对于患者2505，TIMP2是追踪加剧的最有效生物标志物。
这些结果合起来表明：
-在特定患者中，这三种生物标志物中的每种都能作为加剧追踪生物标志物单独起作用
-这三种生物标志物是包含到整合算法中的良好选择。
为了使该方法对所有对象的灵敏度最大化，有利的是，应用更频繁的取样以测定对象特异性基线(BL)值并利用这些值计算波动基线和阈值，由其确定加剧时离开基线的有意义趋势。本文中更详细讨论了这些方法。尽管如此，所观察到的趋势提供了采取该方法和选择特定标志物的理由。
图29阐释了可形成的多种生物标志物簇以获得最佳灵敏度。分析来自50位患者的65个匹配的基线和加剧发作样品并利用随后的方法来鉴定那些标志物能够被组合以鉴定多于90％的处于加剧的患者(假设加剧时生物标志物值提高)。基本原理与图25中的基本原理基本相同。
起始焦点在B2M，其在45个发作中浓度提高(从基线到加剧发作，水平提高)，从而给出69％的灵敏度。对于“漏掉的”20次发作，如图表上所示，可采取两种途径。
1.10次B2M阴性发作具有提高的钙网蛋白水平，从而将灵敏度提高至85％。在剩下的10次发作中，4次发作具有提高的活性HNE水平，从而使灵敏度达到91％。最后，另外的3位患者被鉴定为具有提高的A1AT水平。
2.10次B2M阴性发作具有提高的IL-6水平，从而将灵敏度提高至85％。在剩下的10次发作中，5次发作具有提高的活性MMP水平(如通过最终ELTABA所测量的)，从而使灵敏度达到92％。最后，另外的3位患者被鉴定为具有提高的锁链素水平或提高的活性HNE水平。
B2M、钙网蛋白、活性HNE和A1AT的组合给出95％的总灵敏度。或者，在途径2中鉴定的生物标志物组合给出97％的灵敏度。
图30以起始焦点在fMLP鉴定了形成的多种生物标志物簇以获得最佳灵敏度。该基本原理与图29中的基本原理基本相同。
1.通过鉴定从基线到加剧发作具有提高的fMLP浓度的42次发作，单独的fMLP给出65％的灵敏度。通过顺序添加A1AT、锁链素和IL-6，灵敏度可提高至97％。
2.通过鉴定从基线到加剧发作具有提高的fMLP浓度的42次发作，单独的fMLP给出65％的灵敏度。通过顺序添加A1AT、锁链素和IL-8，灵敏度可提高至97％。
图31以起始焦点在TIMP2鉴定了形成的多种生物标志物簇以获得最佳灵敏度。该基本原理与图29中的基本原理相同。通过鉴定从基线到加剧发作具有提高的TIMP2浓度的47次发作，单独的TIMP2给出72％的灵敏度。如图表所示，可采取以下途径。
1.通过顺序添加IL-6、锁链素(如通过ELISA所测量的)和活性MMP(如通过最终ELTABA所测量的)，灵敏度可提高至98％。
2.通过顺序添加锁链素(如通过侧向流所测量的)、IL-6和活性MMP(如通过最终ELTABA所测量的)，灵敏度可提高至93％。
3.通过顺序添加IL-1β、IL-6和锁链素(如通过ELISA所测量的)，灵敏度可提高至97％。
4.通过顺序添加IL-1β、IL-6和活性MMP(如通过最终ELTABA所测量的)，灵敏度可提高至97％。
5.通过顺序添加活性MMP(如通过底物试验所测量的)、IL-6和锁链素，灵敏度可提高至95％。
6.通过顺序添加活性MMP(如通过底物试验所测量的)、A1AT和锁链素(如通过ELISA所测量的)，灵敏度可提高至94％。
图32以起始焦点在TIMP2鉴定了形成的多种生物标志物簇以获得最佳灵敏度。此处的差别是：标志物基于肌酸酐比例。该基本原理与图29中的基本原理相同。通过鉴定从基线到加剧发作具有提高的TIMP2浓度的42次发作，单独的TIMP2给出65％的灵敏度。如图表所示，可采取以下途径。
1.通过顺序添加fMLP、锁链素(如通过ELISA所测量的)和活性MMP(如通过最终ELTABA所测量的)，灵敏度可提高至95％。
2.通过顺序添加fMLP、IL-6和锁链素(如通过侧向流所测量的)，灵敏度可提高至94％。
3.通过顺序添加fMLP、IL-6和HSA，灵敏度可提高至95％。
4.通过顺序添加IL-6、活性MMP(如通过最终ELTABA所测量的)和活性HNE等，灵敏度可提高至95％。
5.通过顺序添加活性MMP(如通过最终ELTABA和底物试验所测量的)和锁链素(如通过ELISA所测量的)，灵敏度可提高至95％。
6.通过顺序添加活性MMP(如通过最终ELTABA所测量的)、IL-6和活性HNE等，灵敏度可提高至95％。
7.通过顺序添加锁链素(如通过侧向流所测量的)、活性MMP(如通过底物试验所测量的)和活性HNE，灵敏度可提高至95％。
8.通过顺序添加锁链素(如通过侧向流所测量的)、A1AT和活性HNE，灵敏度可提高至95％。
这些数据显示：多种标志物可被有用地用于提供以高灵敏度水平鉴定加剧的算法。本领域技术人员基于本文所含的信息能够容易得到其他起始点和组合。本文中还提到，当标志物组合同时增加(或实际上减少时)，还可以给予额外加权，以指导未来的检验和预测或鉴定加剧和从其恢复或其治疗。
实施例9和10中分析标志物水平的方法
总MMP9、MMP8、NGAL、TIMP1、TIMP2、HSA、胱抑素C、RBP4、IL-6、IL-8、IL-1β和TNFα全部均使用商业ELISA试剂盒(R&D系统)测量。检验之前，利用尿验证这些DuoSet ELISA开发系统，所述系统含有开展用于测量生物流体中的分析物的夹心免疫分析所需的基本组分。将板过夜敏化并根据制造商指示运行。
使用基于夹心原理的即用型固相ELISA(Hycult HK325)测量钙网蛋白。分析物被夹在固定化的抗体和被链霉亲和素过氧化物酶缀合物识别的生物素化追踪抗体之间。洗掉所有未结合的物质，然后加入过氧化物酶底物，随后在450nm下测量颜色。
使用即用型固相ELISA测量纤维蛋白原(B2M ab108841)和β-2-微球蛋白(Abcamab108885)，所述固相ELISA应用定量夹心免疫分析技术。分析物被夹在固定化的多克隆抗体和被链霉亲和素过氧化物酶缀合物识别的生物素化多克隆抗体之间。洗掉所有未结合的物质，然后加入过氧化物酶底物，随后在450nm下测量颜色。
利用肌酸酐参数试验(R&D系统KGE005)实现肌酸酐测量。将经稀释的样品加入微孔板中，随后加入碱性苦味酸盐试剂以引发Jaffe反应。30分钟孵育期后，在490nm下读取板。
对于蛋白酶测量，使用三种不同方法，包括酶谱法(MMPs)、荧光底物试验(MMP’s和HNE)和最终ELTABA(MMPs)：
-使用来自Invitrogen的预制明胶凝胶进行酶谱法，使样品在变性条件下运行并在复性、显影和染色流程后显示为相对暗背景清晰的条带。使用图像J软件进行图像分析。在所有凝胶上运行已知浓度的活性MMP9以将样品数据归一化。
-对于底物试验，将10μm MMP荧光底物(R&D系统ES010)或20μm HNE荧光底物(EnzoP-224)加入5μl样品中，然后在BMG板读取器上读取荧光。读取条件正如制造商的指示：以1分钟的间隔持续30分钟。
-对于最终ELTABA(Mologic内部侧向流试验)，将12.5μl MMP底物(MologicMOL378)加入75μl样品中并孵育10分钟，然后加入盒(cassette)中。15分钟后，使用来自Forsite诊断的免疫色谱分析读取器读取装置。
使用基于夹心原理的内部开发的ELISA测量A1AT和HNE。分析物被夹在固定化的小鼠Fab和用碱性磷酸酶(AP)直接标记的小鼠Fab之间。洗涤后，加入碱性磷酸酶底物并随后在405nm下测量颜色。
使用基于竞争原理的内部开发的ELISA侧向流试验测量锁链素，其中样品中的游离锁链素与固相上的结合锁链素竞争缀合到碱性磷酸酶的绵羊多克隆抗体。洗涤后，加入碱性磷酸酶底物并随后在405nm下测量颜色。
使用基于竞争原理的内部开发的ELISA测量fMLP，其中样品中的游离fMLP与固相上的结合fMLP竞争缀合到碱性磷酸酶的绵羊多克隆抗体。洗涤后，加入碱性磷酸酶底物并随后在405nm下测量颜色。
实施例11-囊性纤维化患者中的加剧
图33从由囊性纤维化患者捐献的尿样品阐释了与收集时间有关的算法的一个重要方面。两种样品由患者在稳定疾病期间以及经历肺加剧(PEx)时捐献。每位患者的取样时间次序不同，一些具有在住院前收集的之前的“稳定”样品，而一些是首先住院并在不久之后收集“稳定”样品。预测TIMP2水平高时，MMP活性(如通过侧向流所测量的)应该低。这在除了患者4之外的所有患者中得到了证明。还预测MMP活性在加剧时应该提高，如5位患者(3、5、6、7、8)所观察到的那样。然而，对于2位患者(2、9)，活性MMP在PEx时比稳定状态更低，这表明样品是在蛋白酶保护物插入后捐献的，即，活性MMP9的存在将触发TIMP2响应。这具有极大的预测意义并强调了基于规律取样使用这些指示物追踪加剧发作的重要性。
实施例12-COPD患者中的加剧
1.引言
加剧的频繁发生是COPD的重要特征。从COPD对象亚组收集尿样品集合。对于35位患者，在研究的前12个月期间，由每次有计划的每月一次的临床访问提供尿样品。此外，提供对于COPD加剧，在每次计划外的临床访问时收集的尿样品。
2.生物标志物和试验
2.1.生物标志物选择
基于发明人在先前的肺部炎症研究(COPD和CF)中的工作，选择表2.1a中的生物标志物作为研究的检验菜单。使用内部试验和商业试验试剂盒的组合来测量生物标志物。在开始该项目中的检验之前，借助于来自其他项目的COPD样品对试验进行评价、选择和验证。
表2.1a：生物标志物和检验程序
2针对该研究开发的内部试验
2.2.1Ac-PGP试验
N-乙酰基Pro-Gly-Pro(Ac-PGP)是中性粒细胞趋化因子，其来源于细胞外基质(ECM)的分解且在气道炎症期间生成。AcPGP被选作生物标志物，因为在炎症疾病例如慢性阻塞性肺病(COPD)中，其通过中性白细胞的蛋白水解作用从胶原上被切下。
开发了三种Ac-PGP竞争性EIA试验。图34中显示了一种Ac-PGP竞争性EIA试验的示意图。
图35展示了利用从1000ng/ml下至15.625ng/ml的标准品，使用这种竞争性结合方式获得的校准曲线。
2.2.2fMLP试验
中性粒细胞通过产生和释放杀灭细菌的活性氧类和表达吸引其他免疫细胞至感染位点的趋化因子来响应细菌感染。N-甲酰化肽如fMLP(N-甲酰基-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-苯丙氨酸)作为有效的化学引诱物起着重要作用。fMLP源于多种细菌(作为细菌的蛋白加工机制的结果)和/或源于降解的细菌(PAMP)。fMLP也可以在真核细胞线粒体蛋白(例如，“DAMP”)中产生。N-甲酰基肽受体与G-蛋白偶联的并引发/传播人中性粒细胞和另一些细胞中的吞噬作用和促炎症反应，例如用fMLP刺激后产生活性氧中间体(例如，超氧化物；O2-·)。
开发了竞争性EIA试验。图36中显示了fMLP竞争性EIA试验的示意图。
图37展示了利用从50ng/ml下至0.78ng/ml的标准品，使用这种竞争性结合方式获得的校准曲线。
2.2.3锁链素片段试验
炎症期间弹性蛋白纤维的降解由被称为弹性蛋白酶的酶引起。中性粒细胞弹性蛋白酶(由活化的中性粒细胞释放)和MMP 12(由肺巨噬细胞释放)是两种最重要的炎性弹性蛋白酶。锁链素从弹性蛋白上被切下，其是降解过程的分子信号，指示白细胞活性提高或上升。分泌在尿中的锁链素的量与弹性蛋白降解程度直接相关，其继而指示组织损伤水平。锁链素小至足以穿过肾脏。过量中性白细胞活性是加剧的关键驱动因素。锁链素片段试验是我们已经研发和验证的锁链素试验的补充。这些试验被专门设计为能够测量锁链素以及仍然附着于弹性蛋白纤维的锁链素，这是通过生成针对不同大小的弹性蛋白片段建立的多种抗体实现的，所述弹性蛋白片段来源于用人中性粒细胞弹性蛋白酶切割。
图39展示了HPLC分析以显示通过提高浓度的酶(HNE)分解的整个弹性蛋白(右侧峰)的谱图。产生的不同片段被用于使绵羊免疫以产生特异性抗体。
图38是锁链素片段竞争性EIA试验的示意图。
2.2.4MMP活性试验(最终ELTABA)
通过添加专门设计的底物，所述底物能够被MMP切割然后被特异性标记的绵羊抗体CF1522识别，(在本文中更详细描述的)这种独特的试验能够测量某些基质金属蛋白酶(MMP)的活性。
3样品分析
选择71个加剧事件，每一事件具有稳定前样品和稳定后样品
·在加剧前3-66天之间收集加剧前的样品
·在加剧事件后6-73天之间收集加剧后的样品。
使用配对t检验分析，计算在加剧和加剧前和加剧后之间显著不同的标志物。还利用肌酸酐使标志物归一化。P值显示在下表中，其中<0.05的显著值被突出显示。
CRP不受归一化影响。在加剧之前和之后存在增加和降低。其他标志物因归一化而不同，特别地，6种额外标志物从稳定到加剧显著变化，胶原和弹性蛋白降解标志物Ac-PGP和锁链素样标志物中有4种降回到恢复。信号分子IL-1β、IL-6和fMLP在加剧前到加剧没有增加，但在恢复时降低，这表明在正确时间点捕捉样品的重要性。利用未归一化的样品时，MMP活性(最终ELTABA版本1和版本2)、钙网蛋白和CC16的降低显示为显著。
因为基线值因患者而异，所以个体阈值很重要。当考虑这一点时，三种标志物的组合能够共同将加剧事件的94％分组到不同于稳定的加剧组并将93％分组到加剧后的恢复组，即在PEx时增加且在恢复时降低。尿CRP和锁链素是常见的标志物。
聚焦于“预测加剧事件”，单独的CRP从基线到加剧在71个事件中有48个增加(等于68％)；与锁链素组合时，这增加至82％；添加IL1β时，增加至96％。这显示于图41A中。
聚焦于“预测恢复事件”，单独的CRP从加剧到恢复在71个事件中有46个增加(等于65％)；与锁链素组合时，这增加至89％；添加纤维蛋白原时，增加至93％。这显示于图41B中。
实施例13：加剧时尿生物标志物的变化
从与以上相同的组群中，基于血CRP测量选择样品子集。
基于血CRP测量的稳定/Pex
血生物标志物被用于使组分层(stratify)以确认样品的状态。血CRP测量对一些患者可获得。从稳定组中选择血CRP<10的样品；从PEx组中选择血CRP>10的样品，从而产生88个稳定样品和59个PEx样品。
模型1a和1b
对浓度值进行的逻辑回归分析将CRP、Ac-PGPv3、fMLP、TIMP1、HSA和CC16鉴定为能够区分两组的期望组合(模型1a)：
这使用截止值0.5，如果将截止值调整为0.38，则可提高灵敏度，其中稳定组中具有可接受的特异性91％。
图42显示了逻辑回归和ROC曲线。
对浓度值进行的逻辑回归分析将CRP、Ac-PGPv3、fMLP、TIMP1和A1AT鉴定为能够区分两组的期望组合(模型1b)。
这使用截止值0.5，如果将截止值调整为0.3146，则可提高灵敏度，其中稳定组中具有可接受的特异性86％和良好的灵敏度。
图43显示了逻辑回归和ROC曲线。
限定了另外一组，该组仅包含那年具有多于1次加剧的那些患者。PEx组由59个样品和47个稳定样品组成。生成的以下三个模型如下：
模型2a、2b和2c
对浓度值进行的逻辑回归分析将CRP、fMLP、Ac-PGP版本3、A1AT和TIMP1鉴定为能够区分两组的期望组合(模型2a)。
图44显示了逻辑回归图。
对浓度值进行的逻辑回归分析将CRP、fMLP、锁链素片段V4、锁链素侧向流试验V2、A1AT、TIMP1和GENDER鉴定为能够区分两组的期望组合(模型2b)。
图45显示了逻辑回归图。
对浓度值进行的逻辑回归分析将CRP、fMLP、Ac-PGP版本3、A1AT和CC16鉴定为能够区分两组的期望组合(模型2c)。
图46显示了逻辑回归图。
图47展示了模型2a、2b和2c中每一个的ROC曲线(分别为A、B和C)。
所有三个模型的共同标志物均为CRP和A1AT。所有模型均能检测大部分加剧。
实施例14：加剧时尿生物标志物的变化
决策树分析
使用由其得到算法21-2c的有限样品集合，利用决策树分析数据。决策树可被用作预测模型以基于自(预测物)变量的值预测因(靶标)变量的值。这种方法被用作例如逻辑回归的方法的替代物。
存在利于灵敏度或特异性的许多标志物组合，其中有8个组合是基于获得至少75％的灵敏度和特异性二者选择的。
组合1
TIMP2、CRP和锁链素(6:TIMP2LF 45:CRP 21:锁链素EIA V2)
类别
生长方法:CRT
因变量:VAR00001
决策树显示于图48中。
组合2
TIMP1、CRP和CC16(7:TIMP1ELISA 45:CRP 46:CC16ELISA)
类别
决策树显示于图49中。
组合3
B2M、CRP、Ac-PGP(17:B2M(Mologic)45:CRP 38:Ac-PGP EIA V3)
类别
决策树显示于图50中。
组合4
MMP活性、CRP和LEF(25:最终ELTABA V1 45:CRP 43:大弹性蛋白片段试验(LEF)V2)
类别
决策树显示于图51中。
组合5
MMP活性、CRP和HSA(26:最终ELTABA V2 45:CRP 15:人血清白蛋白ELISA)
类别
决策树显示于图52中。
组合6
肌酸酐、CRP、Ac-PGP(29:肌酸酐45:CRP 38:Ac-PGP V3)
类别
决策树显示于图53中。
组合7
fMLP、CRP和TIMP2(34:fMLP EIA 45:CRP 8:TIMP2ELISA)
类别
决策树显示于图54中。
组合8
Ac-PGP、CRP、替代性Ac-PGP试验(36:Ac-PGP EIA V1 45:CRP 38:Ac-PGP EIA V3)
类别
决策树显示于图55中。
实施例15：加剧时尿生物标志物的变化
49位患者提供在稳定和加剧时的样品。尿CRP中值从60.7pg/ml增加至317.3pg/ml(p＝0.0015)。稳定状态的四分间距为0-143.9；加剧状态的四分间距为23.6-2584。结果显示于图40中。
该组群中显著不同的另一些生物标志物是MMP底物(p＝0.0466)、TIMP2(p＝0.0095)、A1AT(p＝0.0035)、HSA(p＝0.0424)和RBP4(p＝0.0478)。
本发明的范围并不限于本文所述的具体实施方式。事实上，根据前面的描述和附图，除了本文所述那些以外，本发明的多种修改对本领域技术人员来说是显而易见的。这样的修改都将落入所附权利要求书的范围内。此外，本文所描述的本发明的所有方面和实施方式都被认为是广泛适用的，并可与任何且所有另一些兼容的实施方式合并，包括酌情取自本发明的其他方面(包括分离)的实施方案。本文引用了多种出版物，其公开内容通过引用整体并入。

Claims (41)

1.监测对象的炎症状态的方法，所述方法包括：测定在多个时间点取自所述对象的尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平，其中尿样品中所述至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高指示或预测炎症加剧和/或其中尿样品中所述至少一种中性粒细胞活化标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
2.监测对象的炎症状态的方法，所述方法包括：测定在多个时间点取自所述对象的尿样品中至少三种标志物的水平，其中尿样品中至少一种所述标志物的水平提高指示或预测炎症加剧和/或其中尿样品中至少一种所述标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
3.权利要求1或2所述的方法，其中至少一种所述标志物选自CRP、CC16和大弹性蛋白片段(LEF)。
4.监测对象的炎症状态的方法，所述方法包括：测定在多个时间点取自所述对象的尿样品中C-反应蛋白(CRP)的水平，其中尿样品中CRP的水平提高指示或预测炎症加剧和/或其中尿样品中CRP的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
5.权利要求3所述的方法，其还包括测定所述尿样品中至少一种其他标志物的水平。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种中性粒细胞活化标志物选自信号分子或效应物/效应物抑制剂分子；或根据权利要求2所述的方法，其中至少一种所述标志物选自信号分子或效应物/效应物抑制剂分子；或根据权利要求5所述的方法，其中至少一种其他标志物选自信号分子或效应物/效应物抑制剂分子。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述效应物分子选自蛋白酶活性、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)(游离的或在复合体中)、钙网蛋白或髓过氧化物酶(MPO)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白酶活性选自基质金属蛋白酶(MMP)活性、HNE活性和组织蛋白酶G活性，任选地其中MMP活性包括MMP9和/或MMP8活性。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中通过测量肽底物的切割来测定蛋白酶活性。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中通过下述方法测定蛋白酶活性，所述方法包括：
a.使指示物分子与检验样品接触，所述指示物分子包含
i.包含至少一个切割位点的切割区域，若存在所述蛋白酶的话，所述切割位点能够被所述蛋白酶切割；和
ii.捕获位点；
其中所述至少一个切割位点的切割产生新结合位点；
b.向所述检验样品中加入能够结合所述新结合位点的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合；
c.在捕获区通过所述捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合来捕获含有所述新结合位点的指示物分子部分；和
d.通过测定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示物分子的新结合位点的结合来检测所述至少一个切割位点的切割。
11.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述效应物抑制剂分子是蛋白酶抑制剂分子，任选地其中所述蛋白酶抑制剂分子选自金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、胱抑素C和α-1抗胰蛋白酶(A1AT)。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述信号分子选自ICAM-1、IL-6、IL-1β、IL-8、N-甲酰基-Met-Leu-Phe(fMLP)、IL-6诱导的纤维蛋白原和细胞因子诱导的β-2-微球蛋白(B2M)。
13.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种中性粒细胞活化标志物或至少一种标志物或至少一种其他标志物包括或进一步包括由于炎症而产生的分子，任选地其中所述由于炎症而产生的分子包括蛋白酶活性的降解产物，例如细胞外基质分解产物(例如，Ac-PGP、弹性蛋白片段/肽、锁链素)和/或氧化损伤的产物例如氯化肽和/或代谢物例如乳酸和游离脂肪酸。
14.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述炎症状态是肺炎症状态。
15.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述炎症加剧是肺加剧。
16.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述对象患有呼吸疾病，任选地其中所述呼吸疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)或囊性纤维化(CF)。
17.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种中性粒细胞活化标志物或至少一种标志物或至少一种其他标志物的水平提高或降低是参照针对所述对象调整的标志物的阈值水平计算的。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述标志物的阈值水平是通过测定在更早时间点取自所述对象的尿样品中所述标志物的水平来设置的，任选地其中所述更早时间点包括临近测定目前的尿样品中所述标志物水平时的至少两次更早测量。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述标志物的阈值水平是通过在当时所述对象没有遭受炎症加剧的更早时间点取自所述对象的尿样品中标志物的测定水平来设置的，且提高到超过阈值预测或鉴定加剧，或其中所述标志物的阈值水平是通过在当时所述对象正遭受炎症加剧的更早时间点取自所述对象的尿样品中标志物的测定水平来设置的，且降低到低于阈值预测或鉴定从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
20.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中至少每周两次测定标志物的水平。
21.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中如果检测到所述标志物的水平提高，则提高测定取自所述对象的尿样品中标志物水平的频率，任选地其中维持测定取自所述对象的尿样品中标志物水平的频率直至检测到所述标志物的水平降低。
22.根据在前权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括：测定在多个时间点取自所述对象的尿样品中至少两种或三种中性粒细胞活化标志物的水平。
23.根据在前权利要求中任一项所述的方法(其中测量多种标志物的水平)，其中尿样品中至少一种所述标志物的水平提高指示或预测炎症加剧和/或其中尿样品中至少一种所述标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗和/或其中以预定顺序分析至少两种或三种标志物的测定水平以监测所述对象的炎症状态和/或其中加权至少两种或三种标志物的测定水平。
24.根据在前权利要求中任一项所述的方法，其中通过针对参照标志物的水平归一化来确定至少一种标志物的水平，任选地其中所述参照标志物包括尿肌酸酐或纤维蛋白原。
25.用于监测对象的炎症状态的系统或检验工具套装，其包括：
a.用于测定尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平的一个或多个检验装置；
b.处理器；和
c.包含计算机应用的存储介质，当所述处理器执行所述计算机应用时，所述计算机应用被配置为：
i.取得和/或计算在所述一个或多个检验装置上的尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的测定水平；
ii.计算所述尿样品中是否存在至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高或降低；和
iii.从所述处理器输出所述对象目前的炎症状态，其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平提高指示或预测炎症加剧和/或其中尿样品中至少一种中性粒细胞活化标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
26.用于监测对象的炎症状态的系统或检验工具套装，其包括：
a.用于测定尿样品中至少三种标志物的水平的一个或多个检验装置；
b.处理器；和
c.包含计算机应用的存储介质，当所述处理器执行所述计算机应用时，所述计算机应用被配置为：
i.取得和/或计算在所述一个或多个检验装置上的尿样品中每种标志物的测定水平；
ii.计算所述尿样品中是否存在至少一种所述标志物的水平提高或降低；和
iii.从所述处理器输出所述对象目前的炎症状态，其中尿样品中至少一种所述标志物的水平提高指示或预测炎症加剧和/或其中尿样品中至少一种所述标志物的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
27.根据权利要求25或26所述的系统或检验工具套装，其中至少一种所述标志物选自CRP、CC16和大弹性蛋白片段(LEF)。
28.用于监测对象的炎症状态的系统或检验工具套装，其包括：
a.用于测定尿样品中C-反应蛋白(CRP)的水平的一个或多个检验装置；
b.处理器；和
c.包含计算机应用的存储介质，当所述处理器执行所述计算机应用时，所述计算机应用被配置为：
i.取得和/或计算在所述一个或多个检验装置上的尿样品中CRP的测定水平；
ii.计算所述尿样品中是否存在CRP的水平提高或降低；和
iii.从所述处理器输出所述对象目前的炎症状态，其中CRP的水平提高指示或预测炎症加剧和/或其中尿样品中CRP的水平在提高后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
29.根据权利要求28所述的系统或检验工具套装，其还测定所述尿样品中至少一种其他标志物的水平。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的系统或检验工具套装，其还包括处理器输出显示器和/或其中所述一个或多个检验装置是一次性使用装置和/或其中所述一个或多个检验装置包括侧向流检验条，任选地包括用于所测定的每种标志物的侧向流检验条。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的系统或检验工具套装，其中至少一种标志物选自信号分子或效应物/效应物抑制剂分子，任选地其中所述效应物分子选自蛋白酶活性、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)(游离的或在复合体中)、钙网蛋白或髓过氧化物酶(MPO)，任选地其中所述蛋白酶活性选自基质金属蛋白酶(MMP)活性、HNE活性和组织蛋白酶G活性，任选地其中MMP活性包括MMP9和/或MMP8活性，任选地其中所述一个或多个检验装置包括测量作为蛋白酶活性指示物的肽底物的切割的检验装置，任选地其中所述检验装置包括：
a.用于加入到所述尿样品中的指示物分子，所述指示物分子包含
i.包含至少一个切割位点的切割区域，若存在所述蛋白酶活性的话，所述切割位点能够被所述蛋白酶活性切割；和
ii.捕获位点；
其中所述至少一个切割位点的切割产生新结合位点；
b.用于接收所述尿样品的捕获区，其中所述捕获区包含能够与所述指示物分子的捕获位点结合的捕获分子以固定包含所述新结合位点的指示物分子；和
c.能够结合到所述新结合位点的结合分子，其中直到切割发生，所述结合分子才能与所述指示物分子结合。
32.根据权利要求31所述的系统或检验工具套装，其中所述效应物抑制剂分子是蛋白酶抑制剂分子，任选地其中所述蛋白酶抑制剂分子选自金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、胱抑素C和α-1抗胰蛋白酶(A1AT)，或其中所述信号分子选自ICAM-1、IL-6、IL-1β、IL-8、N-甲酰基-Met-Leu-Phe(fMLP)、IL-6诱导的纤维蛋白原和细胞因子诱导的β-2-微球蛋白(B2M)。
33.根据权利要求25-32中任一项所述的系统或检验工具套装，其中一种或多种所述标志物包括或进一步包括由于炎症而产生的分子，任选地其中所述由于炎症而产生的分子包括蛋白酶活性的降解产物，例如细胞外基质分解产物(例如，Ac-PGP、弹性蛋白片段/肽、锁链素)和/或氧化损伤的产物例如氯化肽和/或代谢物例如乳酸和游离脂肪酸。
34.根据权利要求25-33中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述炎症状态是肺炎症状态和/或其中所述炎症加剧是肺加剧和/或其中所述对象患有呼吸疾病，任选地其中所述呼吸疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)或囊性纤维化(CF)。
35.根据权利要求25-34中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用导致所述处理器参照针对所述对象进行调整的标志物的阈值水平计算一种或多种标志物的水平，任选地其中所述标志物的阈值水平是基于在更早时间点取自所述对象的尿样品中所述标志物的测定水平来设置的，任选地其中所述更早时间点包括临近测定目前的尿样品中所述标志物水平时的至少两次更早测量。
36.根据权利要求35所述的系统或检验工具套装，其中所述标志物的阈值水平是基于在当时所述对象没有遭受炎症加剧的更早时间点取自所述对象的尿样品中所述标志物的测定水平来设置的，且提高到超过阈值预测或鉴定加剧，和/或其中所述标志物的阈值水平是基于在当时所述对象正遭受炎症加剧的更早时间点取自所述对象的尿样品中所述标志物的测定水平来设置的，且降低到低于阈值预测或鉴定从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗。
37.根据权利要求25-36中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用导致所述处理器指示所述对象需要测定一种或多种标志物的水平和/或其中所述计算机应用被进一步配置为：当计算出至少一种标志物的水平提高时，从所述处理器输出以下要求，所述要求是提高测定取自所述对象的尿样品中一种或多种标志物的水平的频率，任选地其中所述计算机应用被进一步配置为：从处理器输出以下要求，所述要求是维持提高的测定至少一种中性粒细胞活化标志物的水平的频率直到计算出至少一种标志物的水平降低。
38.根据权利要求25-37中任一项所述的系统或检验工具套装，其包括用于测定在多个时间点取自所述对象的尿样品中至少两种或三种中性粒细胞活化标志物的水平的一个或多个检验装置。
39.根据权利要求25-38中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为计算至少一种所述标志物的水平提高和由处理器提供以下输出：计算出的至少一种所述标志物的水平提高指示或预测炎症加剧，和/或其中所述计算机应用被配置为计算至少一种中性粒细胞活化标志物的水平降低和由处理器提供以下输出：计算出的至少一种所述标志物的水平增加后降低指示或预测从炎症加剧恢复或者炎症加剧的成功治疗，和/或其中所述计算机应用被配置为以预定顺序分析至少两种或三种标志物的计算水平以监测对象的炎症状态，和/或其中所述计算机应用被配置为向至少两种或三种标志物的测定水平应用加权。
40.根据权利要求25-39中任一项所述的系统或检验工具套装，其中所述计算机应用被配置为通过针对参照标志物水平归一化来计算至少一种中性粒细胞活化标志物的水平，任选地其中所述参照标志物包括尿肌酸酐或纤维蛋白原，和/或其中所述计算机应用被进一步配置为将来自炎症加剧的其他指示物的输入并入对象目前炎症状态的计算中，任选地其中所述炎症加剧的其他指示物包括呼吸短促、喘息增加、脉搏率增加、呼吸困难、痰脓增多、痰色加深、咽喉痛、咳嗽增加、感冒和发烧。
41.如权利要求25-40中任一项所限定的计算机应用。
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