JP6541678B2 - 炎症状態のモニタリング - Google Patents
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Description
a. 尿検体中の少なくとも1つの(好中球活性化)マーカーレベルを測定するための1以上の試験デバイス;
b. プロセッサー;ならびに
c. プロセッサーによって実行されたとき:
i. 1以上の試験デバイス上の尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーの測定されたレベルにアクセスしおよび/またはそれを算出し;
ii. 尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加または減少があるか(またはレベルが同じままであるか)を算出し;そして
iii. プロセッサーから対象体の現在の炎症状態を出力し、ここで、尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加は、炎症の増悪を示すかまたは予測する
ように構成されたコンピューターアプリケーションを含む記録媒体
を含む、対象体において炎症状態をモニターするためのシステムまたは試験キットを提供する。
a. 尿検体中の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のマーカーレベルを測定するための1以上の試験デバイス
b. プロセッサー;ならびに
c. プロセッサーによって実行されたとき:
i. 1以上の試験デバイス上の尿検体中の各マーカーの測定されたレベルにアクセスしおよび/またはそれを算出し;
ii. 尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加または減少があるか(またはレベルが同じままであるか)を算出し;そして
iii. プロセッサーから対象体の現在の炎症状態を出力し、ここで、尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加は、炎症の増悪を示すかまたは予測する
ように構成されたコンピューターアプリケーションを含む記録媒体
を含む、対象体において炎症状態をモニターするためのシステムまたは試験キットを提供する。
B2MおよびカルプロテクチンまたはIL-6
B2M、カルプロテクチンおよびHNE(活性または発現レベル)
B2M、カルプロテクチン、HNE(活性または発現レベル)およびA1AT
B2M、IL-6およびMMP(活性または発現レベル)
B2M、IL-6、MMP(活性または発現レベル)およびデスモシン(好ましくはELISAにより測定される)またはHNE(活性または発現レベル)
デスモシン(好ましくはELISAにより測定される)およびIL-8、IL-6またはA1AT
デスモシン(好ましくはELISAにより測定される)、A1ATおよびFMLP
TIMP2およびデスモシン(適宜ラテラルフローにより測定されてもよい)、MMP(活性またはレベル)IL-1βまたはIL-6
TIMP2、デスモシン(適宜ラテラルフローにより測定されてもよい)およびIL-6
TIMP2、デスモシン(適宜ラテラルフローにより測定されてもよい)、IL-6およびMMP(活性または発現レベル)
TIMP2、IL-6およびデスモシン(適宜ELISAにより測定されてもよい)
TIMP2、IL-6、デスモシン(適宜ELISAにより測定されてもよい)およびMMP(活性または発現レベル)
TIMP2、MMP(活性または発現レベル)およびA1ATまたはIL-6
TIMP2、MMP(活性または発現レベル)、A1ATおよびデスモシン(適宜ELISAにより測定されてもよい)
TIMP2、MMP(活性または発現レベル)、IL-6およびデスモシン(適宜ELISAにより測定されてもよい)
TIMP2、IL-1βおよびIL-6
TIMP2、IL-1β、IL-6およびデスモシン(適宜ELISAにより測定されてもよい)またはMMP(活性または発現レベル)
TIMP2、CRPおよびデスモシン - TIMP2は、ラージエラスチンフラグメントアッセイ(LF)により測定され得る。デスモシンは、酵素免疫アッセイ、例えば本明細書に記載のものにより測定され得る。
TIMP1、CRPおよびCC16 - いくつかの実施態様においてTIMP1およびCC16は、ELISAにより測定され得る。
B2M、CRPおよびAc-PGP - Ac-PGPは、酵素免疫アッセイ、例えば本明細書に記載のものにより測定され得る。
MMP活性、CRPおよびLEF - MMP活性は、本明細書に記載のUltimate ELTABAにより測定され得る。LEFは、本明細書に記載のラージエラスチンフラグメントアッセイにより測定され得る。
MMP活性、CRPおよびHSA - MMP活性は、本明細書に記載のUltimate ELTABAにより測定され得る。LEFは、本明細書に記載のラージエラスチンフラグメントアッセイにより測定され得る。ヒト血清アルブミンは、ELISAにより測定され得る。
クレアチニン、CRPおよびAc-PGP - Ac-PGPは、酵素免疫アッセイ、例えば本明細書に記載のものにより測定され得る。
fMLP、CRPおよびTIMP2 - fMLPは、酵素免疫アッセイ、例えば本明細書に記載のものにより測定され得る。TIMP2は、ELISAにより測定され得る。
Ac-PGP、CRP、代替Ac-PGPアッセイ - Ac-PGPは、酵素免疫アッセイ、例えば本明細書に記載のアッセイの範囲の1つによって測定され得る。
TIMP2およびIL-6またはFMLPまたはデスモシン(適宜ラテラルフローにより測定されてもよい)またはMMP(活性または発現レベル)
TIMP2、IL-6およびMMP(活性または発現レベル)
TIMP2、IL-6、MMP(活性または発現レベル)およびHNE(活性または発現レベル)またはデスモシン(適宜ELISAにより測定されてもよい)またはHSA
TIMP2、FMLPおよびIL-6またはデスモシン(適宜ELISAにより測定されてもよい)
TIMP2、FMLP、IL-6およびデスモシン(適宜ラテラルフローにより測定されてもよい)またはHSA
TIMP2、FMLP、デスモシン(適宜ELISAにより測定されてもよい)およびMMP(活性または発現レベル)
TIMP2、デスモシン(適宜ラテラルフローにより測定されてもよい)およびA1ATまたはMMP(活性または発現レベル)
TIMP2、デスモシン(適宜ラテラルフローにより測定されてもよい)、A1ATおよびHNE(活性または発現レベル)
TIMP2、デスモシン(適宜ラテラルフローにより測定されてもよい)、MMP(活性または発現レベル)およびHNE(活性または発現レベル)
TIMP2、MMP(活性または発現レベル)およびIL-6またはMMP(蛍光原基質アッセイにより測定される)
TIMP2、MMP(活性または発現レベル)、IL-6およびHNE(活性またはレベル)またはデスモシン(適宜ELISAにより測定されてもよい)
TIMP2、MMP(活性または発現レベル)、MMP(蛍光原基質アッセイにより測定される)およびデスモシン(適宜ELISAにより測定されてもよい)
a. 指示薬分子を試験検体と接触させること(ここで、該指示薬分子は、
i. 存在する場合に該プロテアーゼにより切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
ii. 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる);
b. 試験検体に新しい結合部位に結合できる結合分子を加えること(ここで該結合分子は、切断が生じない限りかつ切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない);
c. 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて新しい結合部位を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること;ならびに
d. 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の新しい結合部位への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること
を含む方法によって測定される。
(i) 試験検体に加えるための指示薬分子であって、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
(b) 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断が、新しい結合部位を生じる、指示薬分子;
(ii) 試験検体を受け取る捕捉ゾーンであって、新しい結合部位を含む指示薬分子を固定するために指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子を含む捕捉ゾーン;ならびに
(iii) 新しい結合部位に結合できる結合分子であって、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含む、デバイスを組み入れ得る。
(i) 試験検体に加えるための指示薬分子であって、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
(b) 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断が、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである切断領域の少なくとも2つの部分を生じる、指示薬分子;
(ii) 試験検体を受け取る捕捉ゾーンであって、指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子を含む捕捉ゾーン;ならびに
(iii) 捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分に結合できる結合分子であって、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含む、デバイスを組み入れ得る。
(i) 指示薬分子を試験検体と接触させること(ここで、該指示薬分子は、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
(b) 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる);
(ii) 試験検体に新しい結合部位に結合できる結合分子を加えること(ここで該結合分子は、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない);
(iii) 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて新しい結合部位を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること;ならびに
(iv) 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の新しい結合部位への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること
を含む、方法により得る。
(i) 指示薬分子を試験検体と接触させること(ここで、該指示薬分子は、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
(b) 捕捉部位
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである切断領域の少なくとも2つの部分を生じる);
(ii) 捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分に結合できる結合分子を試験検体に加えること(ここで該結合分子は、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない);
(iii) 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること;ならびに
(iv) 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の該部分への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること
を含む、方法を組み入れ得る。
(i) 指示薬分子を試験検体と接触させること(ここで、該指示薬分子は、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
(b) 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる);
(ii) 試験検体に新しい結合部位に結合できる結合分子を加えること(ここで該結合分子は、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない);
(iii) 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて新しい結合部位を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること;ならびに
(iv) 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の新しい結合部位への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること(ここで、切断のレベル増加は、炎症のレベル増加を示し、特にPEx事象を予測または特定する)
を含む、方法を提供する。
(i) 指示薬分子を試験検体と接触させること(ここで、該指示薬分子は、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
(b) 捕捉部位
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである切断領域の少なくとも2つの部分を生じる);
(ii) 捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分に結合できる結合分子を試験検体に加えること(ここで該結合分子は、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない);
(iii) 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること;ならびに
(iv) 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の該部分への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること(ここで切断のレベル増加は、炎症のレベル増加を示し、特にPEx事象を予測または特定する)
を含む、方法を提供する。
(i) 試験検体に加えるための指示薬分子であって、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
(b) 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断が、新しい結合部位を生じる、指示薬分子;
(ii) 指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子;
(iii) 試験検体を受け取る捕捉ゾーンを形成するために捕捉分子が結合し得る(すなわち結合することができるかまたは結合している)固体支持体;ならびに
(iv) 新しい結合部位に結合できる結合分子であって、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含む、キットを提供する。
(i) 試験検体に加えるための指示薬分子であって、
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
(b) 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断が、少なくとも1つの部分が捕捉部位につながったままである切断領域の少なくとも2つの部分を生じる、指示薬分子;
(ii) 指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子;
(iii) 試験検体を受け取る捕捉ゾーンを形成するために捕捉分子が結合し得る(すなわち結合することができるかまたは結合している)固体支持体;ならびに
(iii) 捕捉部位とつながった切断領域の少なくとも1つの部分を含む指示薬分子の該部分に結合できる結合分子であって、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含む、キットである。
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;
(b) 捕捉部位;および
(c) 切断部位の外側で、例えば切断領域の外側で指示薬分子の少なくとも2つの部分をつなぐために作用する足場分子
を含む指示薬分子であり、該足場が、さらに、少なくとも1つの切断部位の切断が結合分子と結合するが、結合分子が切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない(新しい)結合部位を生じるように構造上指示薬分子を拘束するために作用する、指示薬分子の使用により得る。
(a) 該酵素切断活性が存在する場合に該酵素により切断されて切断領域の少なくとも2つの部分を生じ得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;
(b) 捕捉部位;および
(c) 少なくとも1つの切断部位の切断が互いにつながったままである指示薬分子の切断領域の少なくとも2つの部分を生じるように、指示薬分子の少なくとも2つの部分をつなぐために作用する足場分子
を含む指示薬分子であり、該足場が、さらに、少なくとも1つの切断部位の切断が結合分子と結合するが、結合分子が、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない(新しい)結合部位を生じるように構造上指示薬分子を拘束するために作用する、指示薬分子を組み入れ得る。
(i) 結合分子に結合できる第1の構成要素;および
(ii) ペアの第1の構成要素およびレポーター分子に結合できる第2の構成要素
を含む結合ペアであり得る。本発明のある特定の実施態様において、指示薬分子の検出領域は、ビオチンを含み、アダプター結合ペアの第1の構成要素は、アビジンまたはストレプトアビジンであり、アダプター結合ペアの第2の構成要素は、ビオチンであり、そしてレポーター分子は、ビオチンを結合できる部分を含む。
(a) PGPが(例えばAHX-PGPまたはAc-PGPの形態で)固定化された免疫アッセイ表面と尿検体を接触させること
(b) 検体中のPGPと特異的に結合する試薬(例えば本明細書で定義される酵素、一の具体的な例は、CF1763である)であって、酵素(例えばアルカリホスファターゼ)に結合する試薬を加えること
(c) 免疫アッセイ表面と結合しない試薬を除去すること
(d) 検体中のAc-PGPのレベルの指示として免疫アッセイ表面において酵素活性レベルを測定すること
を含む、尿検体中のAc-PGPを検出するための競合的酵素免疫アッセイを提供する。Ac-PGPが検体中に存在しない場合、免疫捕捉表面に固定化されたPGPは試薬に結合され、それ故に酵素活性が検出されるだろう。検体中のAc-PGPレベルが増加するにつれて、これらの分子は試薬への結合に競合し、それ故に免疫捕捉表面における酵素活性レベルは低下するだろう。好ましい試薬は、ヒツジ抗Ac-PGP抗体CF1763である。他の選択肢はCF1764である。いくつかの実施態様において、試薬はアルカリホスファターゼに結合し得る。適当なアッセイ形式の略図を図34に示す。このアッセイ用の代表的な検量線を図35に示す。このアッセイは、バージョン3と称し得る。
代替アッセイは、固定化Ac-PGP結合試薬、例えば抗Ac-PGP抗体を利用する(例えば、捕捉抗体としてCF1763-バージョン1またはCF1764-バージョン2)。ここで競合試薬は、検体中のAc-PGPと競合するB-AHX-PGP(ビオチニル化AHX-PGP)であり得る。その後、第3の工程は、検体中に「遊離」Ac-PGPが存在しない場合、ストレプトアビジンAP(ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ)を利用して、抗体捕捉ラインに結合するB-AHX-PGPいずれかを標識する。
(a) fMLPが(例えば、表面上でのアルブミン分子、例えばオバルブミンとの結合により)固定化された免疫アッセイ表面と尿検体を接触させること
(b) 検体中のfMLPと特異的に結合する試薬(例えば本明細書で定義される酵素、一の具体的な例は、CF1573である)であって、酵素(例えばアルカリホスファターゼ)に結合する試薬を加えること
(c) 免疫アッセイ表面と結合しない試薬を除去すること
(d) 検体中のfMLPのレベルの指示として免疫アッセイ表面において酵素活性レベルを測定すること
を含む、尿検体中のfMLPを検出するための競合的酵素免疫アッセイを提供する。fMLPが検体中に存在しない場合、免疫捕捉表面に固定化されたfMLPは試薬に結合され、それ故に酵素活性が検出されるだろう。検体中のfMLPレベルが増加するにつれて、これらの分子は試薬への結合に競合し、それ故に免疫捕捉表面における酵素活性レベルは低下するだろう。好ましい試薬は、ヒツジ抗Ac-fMLP抗体CF1573である。いくつかの実施態様において、試薬はアルカリホスファターゼに結合し得る。適当なアッセイ形式の略図を図36に示す。このアッセイ用の代表的な検量線を図37に示す。
(a) デスモシン断片が(例えば、表面上でのアルブミン分子、例えばオバルブミンとの結合により)固定化された免疫アッセイ表面と尿検体を接触させること
(b) 検体中のそれぞれのデスモシン断片と特異的に結合する一連の試薬(例えば本明細書で定義される酵素群、一の具体的な例は、CF1673、CF1674およびCF1675である)であって、試薬の各々が酵素(例えばアルカリホスファターゼ)に結合する試薬を加えること
(c) 免疫アッセイ表面と結合しない試薬を除去すること
(d) 検体中のデスモシン断片のレベルの指示として免疫アッセイ表面において酵素活性レベルを測定すること
を含む、尿検体中のデスモシン断片を検出するための競合的酵素免疫アッセイを提供する。デスモシン断片が検体中に存在しない場合、免疫捕捉表面に固定化されたデスモシン断片は試薬に結合され、それ故に酵素活性が検出されるだろう。検体中のデスモシン断片レベルが増加するにつれて、これらの分子は試薬への結合に競合し、それ故に免疫捕捉表面における酵素活性レベルは低下するだろう。好ましい試薬シリーズは、ヒツジ抗デスモシン断片抗体CF1673、CF1674およびCF1675である。いくつかの実施態様において、各試薬はアルカリホスファターゼに結合し得る。適当なアッセイ形式の略図を図38に示す。いくつかの実施態様において、一連の代表的な試薬は、本明細書でバージョン1、2および3と称する別個のアッセイにおいて利用される。エラスチン分解産物のHPLC分析を図39に示し、ここで分解産物は、特定の抗体を生成するために免疫源としで用いられ得る。エラスチン断片は、スモールエラスチンフラグメントであり得る。スモールエラスチンフラグメントは、典型的に30,000 Da以下、例えば1000〜30,000 Daの分子量を有する。いくつかの実施態様において、デスモシンに結合しないスモールエラスチンフラグメントはまた、別々に測定され得る。
(a) ラージエラスチンフラグメントが(例えば、表面上でのアルブミン分子、例えばオバルブミンとの結合により)固定化された免疫アッセイ表面と尿検体を接触させること
(b) 検体中のそれぞれのラージエラスチンフラグメントと特異的に結合する一連の試薬(例えば本明細書で定義される酵素群、例えばCF1669、CF1670およびCF1673(LEFに対して精製されたすべて))であって、試薬の各々が酵素(例えばアルカリホスファターゼ)に結合する試薬を加えること
(c) 免疫アッセイ表面と結合しない試薬を除去すること
(d) 検体中のラージエラスチンフラグメントのレベルの指示として免疫アッセイ表面において酵素活性レベルを測定すること
を含む、尿検体中のラージエラスチンフラグメントを検出するための競合的酵素免疫アッセイを提供する。ラージエラスチンフラグメントが検体中に存在しない場合、免疫捕捉表面に固定化されたラージエラスチンフラグメントは試薬に結合され、それ故に酵素活性が検出されるだろう。検体中のラージエラスチンフラグメントレベルが増加するにつれて、これらの分子は試薬への結合に競合し、それ故に免疫捕捉表面における酵素活性レベルは低下するだろう。いくつかの実施態様において、各試薬はアルカリホスファターゼに結合し得る。
いくつかの実施態様において、一連の代表的な試薬は、本明細書でバージョン1、2および3と称する別個のアッセイにおいて利用される。
a. 尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルを測定するための1以上の試験デバイス
b. プロセッサー;ならびに
c. プロセッサーによって実行されたとき:
i. 1以上の試験デバイス上の尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーの測定されたレベルにアクセスしおよび/またはそれを算出し;
ii. 尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加または減少があるか否かを算出し;そして
iii. プロセッサーから対象体の現在の炎症状態を出力し、ここで、尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの減少は、炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかまたは予測する
ように構成されたコンピューターアプリケーションを含む記録媒体
を含む、対象体において炎症状態をモニターするためのシステムまたは試験キットを提供する。
a. 尿検体中の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のマーカーレベルを測定するための1以上の試験デバイス
b. プロセッサー;ならびに
c. プロセッサーによって実行されたとき:
i. 1以上の試験デバイス上の尿検体中の各マーカーの測定されたレベルにアクセスしおよび/またはそれを算出し;
ii. 尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加または減少があるか否かを算出し;そして
iii. プロセッサーから対象体の現在の炎症状態を出力し、ここで、尿検体中の少なくとも1つのマーカーレベルの減少は、炎症の増悪を示すかまたは予測する
ように構成されたコンピューターアプリケーションを含む記録媒体
を含む、対象体において炎症状態をモニターするためのシステムまたは試験キットを提供する。
a. 尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルを測定するための1以上の試験デバイス
b. プロセッサー;ならびに
c. プロセッサーによって実行されたとき:
i. 1以上の試験デバイス上の尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーの測定されたレベルにアクセスしおよび/またはそれを算出し;
ii. 尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加または減少があるか否かを算出し;そして
iii. プロセッサーから対象体の現在の炎症状態を出力し、ここで、尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加は、炎症の増悪を示すかまたは予測する
ように構成されたコンピューターアプリケーションを含む記録媒体
を含む、対象体において炎症状態をモニターするためのシステムまたは試験キットを提供する。
a. 尿検体中の少なくとも3つのマーカーレベルを測定するための1以上の試験デバイス
b. プロセッサー;ならびに
c. プロセッサーによって実行されたとき:
i. 1以上の試験デバイス上の尿検体中の各マーカーの測定されたレベルにアクセスしおよび/またはそれを算出し;
ii. 尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加または減少があるか否かを算出し;そして
iii. プロセッサーから対象体の現在の炎症状態を出力し、ここで、尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加は、炎症の増悪を示すかまたは予測する
ように構成されたコンピューターアプリケーションを含む記録媒体
を含む、対象体において炎症状態をモニターするためのシステムまたは試験キットを提供する。
プロセッサーは、システムバスを介して、計算機の他の要素または本明細書で述べられる様々な周辺デバイスに接続され得る。システムバスは、プロセッサーの内部、プロセッサーの外部、または両方にあり得ると理解されるべきである。いくつかの実施態様によれば、プロセッサーのいずれか、計算機の他の要素、または本明細書で述べられる様々な周辺デバイスは、単一のデバイス、例えばシステムオンチップ(SOC)、システムオンパッケージ(SOP)、またはASIC装置などに統合され得る。
a. 尿検体へ加えるための指示薬分子であって、
i. 該プロテアーゼ活性が存在する場合に該プロテアーゼ活性により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
ii. 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる、指示薬分子;
b. 尿検体を受け取るための捕捉ゾーンであって、新しい結合部位を含む指示薬分子を固定するために指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子を含む捕捉ゾーン;ならびに
c. 新しい結合部位に結合できる結合分子であって、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含む。
図1は、本発明の実施、特にエフェクター分子(特にプロテアーゼ、例えばMMP)の検出に有用なアッセイの4つの異なる型の概略図である。各型は、固体支持体(1)、捕捉分子(2)、捕捉部位(3)および切断部位(4)を含む指示薬分子、ならびに切断(6)が生じた後のみ指示薬分子に結合する結合分子(5)の同じ基本構成要素による。
- サンプリング頻度
- 2以上のバイオマーカーが増加するとき実測に追加のウェイトを与えること
- 個々のマーカー増加に誘発されるサンプリング頻度を増加すること
- 個人のバイオマーカー閾値を変動すること
- 特定の定義される状態が優勢であるとき切り替える適切なサブルーチン
を考える。
a. 指示薬分子を試験検体と接触させること(ここで、該指示薬分子は、
i. 存在する場合に該プロテアーゼにより切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
ii. 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる);
b. 試験検体に新しい結合部位に結合できる結合分子を加えること(ここで該結合分子は、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない);
c. 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて新しい結合部位を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること;ならびに
d. 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の新しい結合部位への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること
を含む方法によって測定される、条項3〜6のいずれかに記載の方法。
b. プロセッサー;ならびに
c. プロセッサーによって実行されたとき:
i. 1以上の試験デバイス上の尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーの測定されたレベルにアクセスしおよび/またはそれを算出し;
ii. 尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加または減少があるか否かを算出し;そして
iii. プロセッサーから対象体の現在の炎症状態を出力し、ここで、尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加は、炎症の増悪を示すかもしくは予測し、および/または尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加後の減少は、炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測する
ように構成されたコンピューターアプリケーションを含む記録媒体
を含む、対象体において炎症状態をモニターするためのシステムまたは試験キット。
a. 尿検体へ加えるための指示薬分子であって、
i. 該プロテアーゼ活性が存在する場合に該プロテアーゼ活性により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
ii. 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる、指示薬分子;
b. 尿検体を受け取るための捕捉ゾーンであって、新しい結合部位を含む指示薬分子を固定するために指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子を含む捕捉ゾーン;ならびに
c. 新しい結合部位に結合できる結合分子であって、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含む、条項43に記載のシステムまたは試験キット。
a. 指示薬分子を試験検体と接触させること(ここで、該指示薬分子は、
i. 存在する場合に該プロテアーゼにより切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
ii. 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる);
b. 試験検体に新しい結合部位に結合できる結合分子を加えること(ここで該結合分子は、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない);
c. 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて新しい結合部位を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること;ならびに
d. 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の新しい結合部位への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること
を含む方法によって測定される、条項74〜77のいずれかに記載の方法。
b. プロセッサー;ならびに
c. プロセッサーによって実行されたとき:
i. 1以上の試験デバイス上の尿検体中の各マーカーの測定されたレベルにアクセスしおよび/またはそれを算出し;
ii. 尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加または減少があるか否かを算出し;そして
iii. プロセッサーから対象体の現在の炎症状態を出力し、ここで、尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加は、炎症の増悪を示すかもしくは予測し、および/または尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加後の減少は、炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測する
ように構成されたコンピューターアプリケーションを含む記録媒体
を含む、対象体において炎症状態をモニターするためのシステムまたは試験キット。
a. 尿検体へ加えるための指示薬分子であって、
i. 該プロテアーゼ活性が存在する場合に該プロテアーゼ活性により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
ii. 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる、指示薬分子;
b. 尿検体を受け取るための捕捉ゾーンであって、新しい結合部位を含む指示薬分子を固定するために指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子を含む捕捉ゾーン;ならびに
c. 新しい結合部位に結合できる結合分子であって、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含む、条項132に記載のシステムまたは試験キット。
本発明は、さらに以下の番号づけられた条項群でも定義され得る。
[1]
対象体の炎症状態をモニターするための方法であって、該方法が、複数の時点で対象体から採取した尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルを測定することを含み、ここで、尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加は、炎症の増悪を示すかまたは予測し、および/または尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加後の減少は、炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測する方法。
[2]
対象体の炎症状態をモニターするための方法であって、該方法が、複数の時点で対象体から採取した尿検体中の少なくとも3つのマーカーレベルを測定することを含み、ここで、尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加は、炎症の増悪を示すかもしくは予測し、および/または尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加後の減少は、炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測する方法。
[3]
マーカーの少なくとも1つが、CRP、CC16およびラージエラスチンフラグメント(LEF)より選択される、条項[1]または[2]に記載の方法。
[4]
対象体の炎症状態をモニターするための方法であって、該方法が、複数の時点で対象体から採取した尿検体中のC反応性タンパク質(CRP)のレベルを測定することを含み、ここで、尿検体中のCRPのレベルの増加は、炎症の増悪を示すかもしくは予測し、および/または尿検体中のCRPのレベルの増加後の減少は、炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測する方法。
[5]
尿検体中の少なくとも1つの更なるマーカーレベルを測定することをさらに含む、条項[3]に記載の方法。
[6]
少なくとも1つの好中球活性化マーカーが、シグナル分子もしくはエフェクター/エフェクター阻害分子より選択される条項[1]に記載の方法、マーカーの少なくとも1つが、シグナル分子もしくはエフェクター/エフェクター阻害分子より選択される条項[2]に記載の方法、または少なくとも1つの更なるマーカーが、シグナル分子もしくはエフェクター/エフェクター阻害分子より選択される条項[5]に記載の方法。
[7]
エフェクター分子が、プロテアーゼ活性、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)(遊離型もしくは複合体中のいずれか)、カルプロテクチンまたはミエロペルオキシダーゼ(MPO)より選択される、条項[6]に記載の方法。
[8]
プロテアーゼ活性が、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)活性、HNE活性およびカテプシンG活性より選択され、該MMP活性がMMP9および/またはMMP8活性を含んでもよい、条項[7]に記載の方法。
[9]
プロテアーゼ活性が、ペプチド基質の切断の測定により決定される、条項[7]または[8]に記載の方法。
[10]
プロテアーゼ活性が、
a. 指示薬分子を試験検体と接触させること(ここで、該指示薬分子は、
i. 存在する場合に該プロテアーゼにより切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
ii. 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる);
b. 試験検体に新しい結合部位に結合できる結合分子を加えること(ここで該結合分子は、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない);
c. 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて新しい結合部位を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること;ならびに
d. 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の新しい結合部位への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること
を含む方法によって測定される、条項[7]〜[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11]
エフェクター阻害分子が、プロテアーゼ阻害分子であり、該プロテアーゼ阻害分子が、組織メタロプロテアーゼ阻害物質(TIMP)、シスタチンCおよびα1アンチトリプシン(A1AT)より選択されてもよい、条項[6]〜[8]のいずれか一項に記載の方法。
[12]
シグナル分子が、ICAM-1、IL-6、IL-1β、IL-8、N-ホルミル-Met-Leu-Phe(fMLP)、IL-6誘導フィブリノゲンおよびサイトカイン誘導β2ミクログロブリン(B2M)より選択される、条項[6]に記載の方法。
[13]
少なくとも1つの好中球活性化マーカー、マーカーの少なくとも1つまたは少なくとも1つの更なるマーカーが、炎症の結果として産生される分子を含むかまたはそれをさらに含み、該炎症の結果として産生される分子が、プロテアーゼ活性の分解産物、例えば細胞外マトリックス分解産物(例えばAc-PGP、エラスチン断片/ペプチド、デスモシン)および/または酸化損傷の産物、例えば塩素化ペプチドおよび/または代謝物、例えば乳酸および遊離脂肪酸を含んでもよい、条項[1]〜[12]のいずれか一項に記載の方法。
[14]
炎症状態が、肺炎症状態である、条項[1]〜[13]のいずれか一項に記載の方法。
[15]
炎症の増悪が、肺増悪である、条項[1]〜[14]のいずれか一項に記載の方法。
[16]
対象体が、呼吸器障害を患っており、該呼吸器障害が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)または嚢胞性線維症(CF)であってもよい、条項[1]〜[15]のいずれか一項に記載の方法。
[17]
少なくとも1つの好中球活性化マーカー、マーカーの少なくとも1つもしくは少なくとも1つの更なるマーカーのレベルの増加または減少が、対象体に適したマーカーの閾値レベルを参照して算出される、条項[1]〜[16]のいずれか一項に記載の方法。
[18]
マーカーの閾値レベルが、早期の時点で対象体から採取した尿検体中のマーカーレベルを測定することにより設定され、該早期の時点が、現在の尿検体中のマーカーレベルを決定する直前の少なくとも2回の早期の測定を含んでもよい、条項[17]に記載の方法。
[19]
対象体が炎症の増悪を患っておらず、閾値を超える増加が増悪を予測または特定する早期の時点で対象体から採取した尿検体中のマーカーレベルを測定することにより、マーカーの閾値レベルが設定されるか、または対象体が炎症の増悪を患っており、閾値を下回る減少が炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を予測または特定する早期の時点で対象体から採取した尿検体中のマーカーレベルを測定することにより、マーカーの閾値レベルが設定される、条項[17]または[18]に記載の方法。
[20]
マーカーレベルを少なくとも週に2回測定する、条項[1]〜[19]のいずれか一項に記載の方法。
[21]
マーカーレベルの増加が検出される場合に対象体から採取した尿検体中のマーカーレベルを測定する頻度が増加され、マーカーレベルの減少が検出されるまで対象体から採取した尿検体中のマーカーレベルを測定する頻度が維持されてもよい、条項[1]〜[20]のいずれか一項に記載の方法。
[22]
複数の時点で対象体から採取した尿検体中の少なくとも2つまたは3つの好中球活性化マーカーのレベルを測定することを含む、条項[1]〜[21]のいずれか一項に記載の方法。
[23]
(複数のレベルが測定され、)尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加が、炎症の増悪を示すかもしくは予測し、および/または尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加後の減少が、炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測し、および/または少なくとも2つまたは3つのマーカーの測定されたレベルが、対象体の炎症状態をモニターするために所定の順序で分析され、および/または少なくとも2つまたは3つのマーカーの測定されたレベルが、ウェイトを与えられる、条項[1]〜[22]のいずれか一項に記載の方法。
[24]
基準マーカーのレベルに対して標準化することにより少なくとも1つのマーカーレベルを決定し、該基準マーカーが、尿中クレアチニンまたはフィブリノゲンを含んでもよい、条項[1]〜[23]のいずれか一項に記載の方法。
[25]
a. 尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルを測定するための1以上の試験デバイス
b. プロセッサー;ならびに
c. プロセッサーによって実行されたとき:
i. 1以上の試験デバイス上の尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーの測定されたレベルにアクセスしおよび/またはそれを算出し;
ii. 尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加または減少があるか否かを算出し;そして
iii. プロセッサーから対象体の現在の炎症状態を出力し、ここで、尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加は、炎症の増悪を示すかもしくは予測し、および/または尿検体中の少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルの増加後の減少は、炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測する
ように構成されたコンピューターアプリケーションを含む記録媒体
を含む、対象体において炎症状態をモニターするためのシステムまたは試験キット。
[26]
a. 尿検体中の少なくとも3つのマーカーレベルを測定するための1以上の試験デバイス
b. プロセッサー;ならびに
c. プロセッサーによって実行されたとき:
i. 1以上の試験デバイス上の尿検体中の各マーカーの測定されたレベルにアクセスしおよび/またはそれを算出し;
ii. 尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加または減少があるか否かを算出し;そして
iii. プロセッサーから対象体の現在の炎症状態を出力し、ここで、尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加は、炎症の増悪を示すかもしくは予測し、および/または尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加後の減少は、炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測する
ように構成されたコンピューターアプリケーションを含む記録媒体
を含む、対象体において炎症状態をモニターするためのシステムまたは試験キット。
[27]
マーカーの少なくとも1つが、CRP、CC16およびラージエラスチンフラグメント(LEF)より選択される、条項[25]または[26]に記載のシステムまたは試験キット。
[28]
a. 尿検体中のC反応性タンパク質(CRP)のレベルを測定するための1以上の試験デバイス
b. プロセッサー;ならびに
c. プロセッサーによって実行されたとき:
i. 1以上の試験デバイス上の尿検体中のCRPの測定されたレベルにアクセスしおよび/またはそれを算出し;
ii. 尿検体中のCRPのレベルの増加または減少があるか否かを算出し;そして
iii. プロセッサーから対象体の現在の炎症状態を出力し、ここで、CRPのレベルの増加は、炎症の増悪を示すかもしくは予測し、および/または尿検体中のCRPのレベルの増加後の減少は、炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測する
ように構成されたコンピューターアプリケーションを含む記録媒体
を含む、対象体において炎症状態をモニターするためのシステムまたは試験キット。
[29]
尿検体中の少なくとも1つの更なるマーカーレベルをさらに測定する、条項[28]に記載のシステムまたは試験キット。
[30]
プロセッサーから出力するためのディスプレイをさらに含み、および/または1以上の試験デバイスが、使い捨ての単回使用デバイスを含み、および/または1以上の試験デバイスが、ラテラルフロー試験ストリップを含み、測定される各マーカーのためのラテラルフロー試験ストリップを含んでもよい、条項[25]〜[29]のいずれか一項に記載のシステムまたは試験キット。
[31]
少なくとも1つのマーカーが、シグナル分子またはエフェクター/エフェクター阻害分子より選択され、該エフェクター分子が、プロテアーゼ活性、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)(遊離型もしくは複合体中のいずれか)、カルプロテクチンまたはミエロペルオキシダーゼ(MPO)より選択されてもよく、該プロテアーゼ活性が、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)活性、HNE活性およびカテプシンG活性より選択されてもよく、該MMP活性が、MMP9および/またはMMP8活性を含んでもよく、該1以上の試験デバイスが、プロテアーゼ活性の指示薬としてペプチド基質を測定するための試験デバイスを含んでもよく、該試験デバイスが、
a. 尿検体へ加えるための指示薬分子であって、
i. 該プロテアーゼ活性が存在する場合に該プロテアーゼ活性により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
ii. 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる、指示薬分子;
b. 尿検体を受け取るための捕捉ゾーンであって、新しい結合部位を含む指示薬分子を固定するために指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子を含む捕捉ゾーン;ならびに
c. 新しい結合部位に結合できる結合分子であって、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含んでもよい、条項[25]〜[30]のいずれか一項に記載のシステムまたは試験キット。
[32]
エフェクター阻害分子が、プロテアーゼ阻害分子であり、該プロテアーゼ阻害分子が、組織メタロプロテアーゼ阻害物質(TIMP)、シスタチンCおよびα1アンチトリプシン(A1AT)より選択されてもよいか、またはシグナル分子が、ICAM-1、IL-6、IL-1β、IL-8、N-ホルミル-Met-Leu-Phe(fMLP)、IL-6誘導フィブリノゲンおよびサイトカイン誘導β2ミクログロブリン(B2M)より選択される、条項[31]に記載のシステムまたは試験キット。
[33]
1または複数のマーカーが、炎症の結果として産生される分子を含むかまたはそれをさらに含み、該炎症の結果として産生される分子が、プロテアーゼ活性の分解産物、例えば細胞外マトリックス分解産物(例えばAc-PGP、エラスチン断片/ペプチド、デスモシン)および/または酸化損傷の産物、例えば塩素化ペプチドおよび/または代謝物、例えば乳酸および遊離脂肪酸を含んでもよい、条項[25]〜[32]のいずれか一項に記載のシステムまたは試験キット。
[34]
炎症状態が、肺炎症状態であり、および/または炎症の増悪が、肺増悪であり、および/または対象体が、呼吸器障害を患っており、該呼吸器障害が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)または嚢胞性線維症(CF)であってもよい、条項[25]〜[33]のいずれか一項に記載のシステムまたは試験キット。
[35]
コンピューターアプリケーションが、対象体に適したマーカーの閾値レベルを参照して1または複数のマーカーのレベルをプロセッサーに算出させ、該マーカーの閾値レベルが、早期の時点で対象体から採取した尿検体中のマーカーの測定されたレベルに基づいて設定されてもよく、該早期の時点が、現在の尿検体中のマーカーレベルを決定する直前の少なくとも2回の早期の測定を含んでもよい、条項[25]〜[34]のいずれか一項に記載のシステムまたは試験キット。
[36]
対象体が炎症の増悪を患っておらず、閾値を超える増加が増悪を予測または特定する早期の時点で対象体から採取した尿検体中のマーカーの測定されたレベルに基づいて、マーカーの閾値レベルが設定され、および/または対象体が炎症の増悪を患っており、閾値を下回る減少が炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を予測または特定する早期の時点で対象体から採取した尿検体中のマーカーの測定されたレベルに基づいて、マーカーの閾値レベルが設定される、条項[35]に記載のシステムまたは試験キット。
[37]
コンピューターアプリケーションが、対象体に対して1または複数のマーカーレベルを測定する要求をプロセッサーに指示させ、および/またはコンピューターアプリケーションが、さらに、少なくとも1つのマーカーレベルの増加が算出される場合に対象体から採取した尿検体中の1または複数のマーカーレベルを測定する頻度を増加させる要求をプロセッサーから出力するよう構成され、該コンピューターアプリケーションが、さらに、少なくとも1つのマーカーレベルの減少が算出されるまで少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルを測定する頻度を増加させたまま維持する要求をプロセッサーから出力するよう構成されてもよい、条項[25]〜[36]のいずれか一項に記載のシステムまたは試験キット。
[38]
複数の時点で対象体から採取した尿検体中の少なくとも2つまたは3つの好中球活性化マーカーレベルを測定するための1以上の試験デバイスを含む、条項[25]〜[37]のいずれか一項に記載のシステムまたは試験キット。
[39]
コンピューターアプリケーションは、マーカーの少なくとも1つのレベルの増加を算出し、マーカーの少なくとも1つのレベルの算出された増加が炎症の増悪を示すもしくは予測するというプロセッサーのから出力を提供するよう構成され、および/またはコンピューターアプリケーションは、好中球活性化マーカーの少なくとも1つのレベルの減少を算出し、マーカーの少なくとも1つのレベルの増加後の算出された減少が炎症の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測するというプロセッサーからの出力を提供するよう構成され、および/またはコンピューターアプリケーションが、対象体の炎症状態をモニターするために少なくとも2つまたは3つのマーカーの算出されたレベルを所定の順序で分析するように構成され、および/またはコンピューターアプリケーションが、少なくとも2つまたは3つのマーカーの測定されたレベルにウェイト付けるよう構成される、条項[25]〜[38]のいずれか一項に記載のシステムまたは試験キット。
[40]
コンピューターアプリケーションが、基準マーカーのレベルに対して標準化することにより少なくとも1つの好中球活性化マーカーレベルを算出するよう構成され、該基準マーカーが、尿中クレアチニンまたはフィブリノゲンを含んでもよく、および/またはコンピューターアプリケーションが、さらに、対象体の現在の炎症状態の算出に炎症の増悪の他の指標を組み込むように構成され、該炎症の増悪の他の指標が、息切れ、喘鳴の増加、脈拍数の増加、呼吸困難、膿性痰の増加、喀痰の色の濃化、咽頭痛、咳の増加、悪寒および発熱を含んでもよい、条項[25]〜[39]のいずれか一項に記載のシステムまたは試験キット。
[41]
条項[25]〜[40]のいずれか一項に記載のコンピューターアプリケーション。
キットは次の構成要素を含む:
1) 尿検体採取のためのデバイス
2) プラスチックケースに載せられたラテラルフロー試験ストリップ。試験ストリップは、試験ストリップの流路を横切る第1の判定ラインとしてポリストレプトアビジンを含む捕捉ゾーンを有する。判定ラインの下流に試験ストリップの流路を横切るコントロールラインとして吸着された抗ニワトリ抗体を含む第2の捕捉ゾーンは、コントロールラインとして含まれ得る。プラスチックケースには、判定およびコントロールラインを見るための観察窓がある。第1の判定ラインの上流に統合検体受入パッドもある。さらに、試験ストリップは、検体の添加により再構成されることができる検体受入パッドの下流に、試験ストリップに乾燥させたヒツジ抗体(CF1522)を支持する金粒子を有する。
3) 検体採取デバイスが指示薬分子と一緒に配置され得るチューブ。
4) 捕捉ライン、ポリストレプトアビジンとの複合体を形成できるポリエチレングリコールスペーサー/リンカーによりつながる末端ビオチン基を担持する切断可能な配列、この実施例では(GPQGIFGQ)、を含む指示薬分子。
検体中のプロテアーゼ活性の検出のための試験ストリップを、以下に記載するように構築した。アッセイは、様々なMMPの存在下での指示薬分子の切断に基づいており、可視性のエピトープを金粒子に結合したヒツジ抗体(CF1522)に曝露させた。
用いられる方法は、当該技術分野において周知の標準的な手順にすべて従った。
アフィニティー精製したヒツジ抗体CF1522(Ig Innovations、CF1522)を、520nmにおけるODが5となる濃度において40nm 金粒子(BBI International、GC40)に結合した。抗体を、20 mM BES緩衝液 pH 7.8中15μg/mlの濃度で負荷した。0.2%BSA(Sigma、A7906)を、非特異的結合を最小限にするためにブロッキング溶液として用いた。
ガラスファイバーコンジュゲートパッド(Millipore、G041、17 mm x 300 mm)に、0.8μl/mmの金乾燥緩衝液(1M Tris、150 mM 塩化ナトリウム、20 mM アジ化ナトリウム、3%BSA、5%スクロース、1%ツイーン20、pH 9.4)で希釈したOD4のCF1522:40nm 金コンジュゲート(Mologic)をIsoflowディスペンサーによりスプレーした(スプレー高さ15 mm)。処理されたコンジュゲートバンドを、60℃において5 mm/secの速度のトンネル乾燥機中で乾燥した。乾燥した金コンジュゲート-含浸コンジュゲートパッドを、室温において乾燥剤を入れた密封したホイルパウチ中で保管した。
すべての試薬を、0.1μl/mmの分注率でUnistart CN140メンブレン(Sartorius、CN140、25 mm x 300 mm)上にストリップした。判定ラインの1 mg/mlの濃度のポリストレプトアビジン(BBI、Polystrep N 01041048K)を、メンブレンの基準から7 mmの位置に置いた。加工したメンブレンを、60℃において10 mm/secの速度のトンネル乾燥機中で乾燥した。乾燥した抗体-含浸ニトロセルロースメンブレンを、室温において乾燥剤を入れた密封したホイルパウチ中で保管した。
試験カードを、以下の手順に従い、そして各カード構成要素の正確な長手寸法および位置を規定する図4に従って組み立てた。
1. 背面ラミネートとしての役割を果たし、図4中1で示され、剥離ライナーで保護された粘着剤を有する、60 x 300 mm片の透明なプラスチックフィルム(G&L Precision Die Cutting、GL-48077)を、ワークテーブルの上に配置した。剥離ライナーを剥がして、粘着剤を露出した。
2. 反応メンブレン(セクションCにおいて製造した)を、背面カバーの粘着剤側の上で下方末端から20 mmに結合した。
3. 含浸コンジュゲートパッド(セクションBにおいて製造した)を、背面カバーの上で反応メンブレンの上に2 mm重ねて結合した。
4. サンプルパッド(MDI、FR-1、10 x 300 mm)を、背面カバーの上でコンジュゲートパッドの上に5 mm重ねて配置した。
5. 吸収パッド(ゲルブロッティングペーパー、Ahlstrom、グレード222、22 x 300 mm)を、背面カバーの表側の上で反応メンブレンの上に2 mm重ねて配置した。
カードを、自動化ダイカッター(Kinematic、2360)を用いて5 mm幅のストリップに切り取り、プラスチックハウジング(Forsite)へ組み立てた。デバイスを、このデバイス用にMologicで特別に製造された空気圧式デバイスクランプを用いて閉じた。
工程2:インキュベート時間の終わりに、規定量の液体を、検体受入パッドに滴下し、続いてコンジュゲートパッドと接触させ、金粒子に結合している乾燥CF1522抗体を再度水和させた。そのままの指示薬分子は、金コンジュゲートにより認識されず、複合体でない状態では指示薬分子に結合したビオチンにより固定化されたポリストレプトアビジン判定ラインへ移動しなかった。検体中に存在するMMP-9いずれかが切断部位において指示薬分子を切断し、認識可能なエピトープを露出して、金コンジュゲートが切断されたスタブ(stub)と複合体を形成した。
キットおよび試験ストリップの合成を実施例1と同様に実施した。
工程2:インキュベート時間の終わりに、規定量の液体を、検体受入パッドに滴下し、続いてコンジュゲートパッドと接触させ、金粒子に結合している乾燥CF1522抗体を再度水和させた。そのままの指示薬分子は、金コンジュゲートにより認識されず、複合体でない状態では指示薬分子に結合したビオチンにより固定化されたポリストレプトアビジン判定ラインへ移動しなかった。検体中に存在するMMP-9いずれかが切断部位において指示薬分子を切断し、認識可能なエピトープを露出して、金コンジュゲートが切断されたスタブと複合体を形成した。
キットおよび試験ストリップの合成を実施例1と同様に実施した。
工程2:インキュベート時間の終わりに、規定量の液体を、検体受入パッドに滴下し、続いてコンジュゲートパッドと接触させ、金粒子に結合している乾燥CF1522抗体を再度水和させた。そのままの指示薬分子は、金コンジュゲートにより認識されず、複合体でない状態では指示薬分子に結合したビオチンにより固定化されたポリストレプトアビジン判定ラインへ移動しなかった。検体中に存在するMMP-9いずれかが切断部位において指示薬分子を切断し、認識可能なエピトープを露出して、金コンジュゲートが切断されたスタブと複合体を形成した。
キットおよび試験ストリップの合成を実施例1と同様に実施した。
工程2:インキュベート時間の終わりに、規定量の液体を、続いてコンジュゲートパッドを接触させ、金粒子に結合している乾燥ビオチンを再度水和した検体受入パッドに滴下した。そのままの指示薬分子は、金コンジュゲートにより認識されず、複合体でない状態では指示薬分子に結合したビオチンにより固定化されたポリストレプトアビジン判定ラインへ移動しなかった。検体中に存在するMMP-9いずれかが切断部位において指示薬分子を切断し、認識可能なエピトープを露出して、金コンジュゲートが切断されたスタブと複合体を形成した。
商業キットは、生物検体、例えば培地、血清、血漿、滑液、および組織ホモジネートにおけるMMP-9を特異的に検出するために設計されている。モノクローナル抗-ヒトMMPは、最初に混合物からプロおよび活性な形態両方のMMPを選択するために用いられ、その後、MMP-9の活性を、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ペプチドを用いて定量する。内製で活性化されたMMP-9標準のAMPAを、250 ng/ml〜4 ng/mlの範囲において該キットおよびラテラルフロー型の両方で実施した。MMP-9を、商業アッセイについてキットで与えられたMMP緩衝液で、およびラテラルフローデバイスについてはTris緩衝生理食塩水中1%ツイーン20で希釈した。
工程2:インキュベート時間の終わりに、規定量の液体を、検体受入パッドに滴下し、続いてコンジュゲートパッドと接触させ、金粒子に結合している乾燥CF1522抗体を再度水和させた。そのままの指示薬分子は、金コンジュゲートにより認識されず、複合体でない状態では指示薬分子に結合したビオチンにより固定化されたポリストレプトアビジン判定ラインへ移動しなかった。検体中に存在するMMP-9いずれかが切断部位において指示薬分子を切断し、認識可能なエピトープを露出して、金コンジュゲートが切断されたスタブと複合体を形成した。
ELISA型
1) 検体採取(例えば尿)のためのデバイス
2) ポリストレプトアビジンで被覆した96ウェルプレート
3) 検体採取デバイスが指示薬分子と一緒に配置され得るチューブ。
4) この実施例において、捕捉ライン、ポリストレプトアビジンとの複合体を形成できるポリエチレングリコールスペーサー/リンカーによりつながる末端ビオチン基を運ぶ断可能な配列(GPQGIFGQ)を含む指示薬分子。
5) アルカリホスファターゼ(AP)に結合したヒツジ抗体CF1522
6) 405nmにおいて読み取られ得る可溶性の黄色の反応生成物の形成を可能にする、アルカリホスファターゼの基質p-ニトロフェニルホスフェート(pNPP)。
検体を、健常なボランティア(9)および呼吸器疾患を患う患者から採取した。検体は、嚢胞性線維症(CF)の9人の患者および慢性閉塞性肺疾患(COPD)の7人の患者から提供され、使用するまで-80℃で保管した。
工程2:インキュベート時間の終わりに、規定量の検体をストレプトアビジンプレート(Nunc、442404)に加え、さらに1時間周囲環境においてインキュベートしてビオチン標識指示薬分子が、プレートに結合したストレプトアビジンにより固定化された。
工程3:プレートを、100μlの洗浄緩衝液、Tris緩衝生理食塩水中0.1%ツイーン(50 mM Tris、150 mM 塩化ナトリウム、20 mM アジ化ナトリウム、0.1%vol/vol ツイーン20の水溶液、pH 8.0)で3回洗浄した。
工程4:CF1522-AP(Mologic)を、PBST中1%BSAで1/500に希釈し、周囲環境において1時間プレート上にてインキュベートした。抗体は、検体中に存在するMMPのいずれかに露出される切断されたスタブと複合体を形成し、切断されたスタブが存在しないとき、抗体の結合は無いだろう。
工程5:プレートを、100μlの洗浄緩衝液、Tris緩衝生理食塩水中0.1%ツイーン(50 mM Tris、150 mM 塩化ナトリウム、20 mM アジ化ナトリウム、0.1%vol/vol ツイーン20の水溶液、pH 8.0)で3回洗浄した。
工程6:プレートを、pNPP基質とインキュベートし、その後、37℃で30分間インキュベート後405nmにおいて読み取った。MMP9標準曲線を、参照として図14bに示した。ウェルの色は、図14bにOD 405nmによって表される試験検体中における様々なレベルのプロテアーゼを示す。
キットおよび試験ストリップの合成を実施例1と同様に実施した。
工程2:インキュベート時間の終わりに、規定量の液体を、検体受入パッドに滴下し、続いてコンジュゲートパッドと接触させ、金粒子に結合している乾燥CF1522抗体を再度水和させた。そのままの指示薬分子は、金コンジュゲートにより認識されず、複合体でない状態では指示薬分子に結合したビオチンにより固定化されたポリストレプトアビジン判定ラインへ移動しなかった。検体中に存在するMMP-9いずれかが切断部位において指示薬分子を切断し、認識可能なエピトープを露出して、金コンジュゲートが切断されたスタブと複合体を形成した。
MOL386と呼ばれるペプチド(アミノ酸配列:CGPQGIFGQC)を、Fmoc-chemistryを用いて 固相上に合成した。要するに、合成をマイクロ波アシスト自動合成(CEM Liberty)で実施した。カップリング工程を、5倍過剰なアミノ酸構成要素、HBTUアクティベーターおよび10倍過剰なDIPEA塩基を含むDMF溶媒中で、Fmoc-Cys(Trt)を予め組み込んだPEG-ポリスチレン残基に実施した。脱保護工程を5%ピペラジン/DMF中で実施した。完成したペプチド樹脂を乾燥し、その後、2時間95%TFA、2.5%TIPSおよび2.5%水を用いて切断した。TFA水溶液を真空乾燥し、エーテル中沈殿させて、無色のペプチド固体を得た。回収されたペプチドを、50%アセトニトリルから凍結乾燥し、C18逆相カラムおよび5%アセトニトリル/水(0.1%TFA)から100%アセトニトリル(0.1%TFA)のグラジェントを用いてHPLC(図16)により精製した。単離したフラクションを合わせ、凍結乾燥し、エレクトロスプレイ質量分析(図17)によって分析して、目的ペプチドを同定した(予測MH+ 1010.17、実測値 1010.3)。ビオチニル化形態(CGPQGIFGQC-PEG-ビオチン)を、ビオチン-PEG-NovaTag Resin(Merck)から合成した(予測MH+ 1438.76、実測値 1439.7、図18)。ビオチンは、指示薬分子の固定化のための捕捉部位を提供する。
ペプチド(1 mg)を、1,3-ジブロモメチルベンゼン1 mgと一緒にPBS 250μlに溶解し、穏やかに一晩撹拌した。その後、反応物を水1 mlで希釈し、精製のためにC18逆相カラムおよび5%アセトニトリル/水(0.1%TFA)から100%アセトニトリル(0.1%TFA)のグラジェントを用いてHPLCに直接注入した。生成物ピークを単離し、凍結乾燥して、無色の固体を得た(予測MH+ 1112.30、実測値 1112.8、図19)。同じ手順をビオチニル化ペプチドに用いた(予測MH+ 1540.89、実測値 1539.8、図20)。
抗体を、切断されたペプチド配列を認識するために生成した。この実施例では、MMP消化の標的(GPQGIFGQ)は、免疫アッセイにおいて用いられ、臨床検体中における酵素活性を測定する。抗体は、当業者に公知の方法を用いてペプチドKLHコンジュゲートを生じる。ヒツジ抗体CF1522およびCF1523を、切断されたスタブ「IFGQ」を認識するために生成し、一方ヒツジ抗体CF1524およびCF1525を、切断されたスタブ「GPQG」を認識するために生成した。抗体を、生成された特定のペプチドを用いてアフィニティー精製し、その後、最も適切なアッセイ型を決定するためにELISAによって分析して、最も良い感度を得た。
1) 尿検体採取のためのデバイス
2) ポリストレプトアビジンで被覆した96ウェルプレート(Nunc、442404)またはCF1060、周囲環境において一晩(Nunc、Maxisorb)
3) 検体採取デバイスが指示薬分子と一緒に配置され得るチューブ。
4) この実施例において、NまたはC-末端にポリエチレングリコールスペーサー/リンカーによりつながり得る末端ビオチン基を運ぶ切断可能な配列(GPQGIFGQ)を含む指示薬分子。
5) アルカリホスファターゼ(AP)に結合したヒツジ抗体CF1522、CF1523、CF1524およびCF1525
6) 405nmにおいて読み取られ得る可溶性の黄色の反応生成物の形成を可能にする、アルカリホスファターゼの基質p-ニトロフェニルホスフェート(pNPP)。
活性MMP9(Alere San Diego)を、 in MMP緩衝液(50 mM Tris、100 mM 塩化ナトリウム、10 mM 塩化カルシウム、50μM 20 mM 塩化亜鉛、0.025%Brij 35、0.05%アジ化ナトリウムの水溶液、pH 8.0)で2、0.25、0.062、0.0156および0.039μg/mlに希釈した。
工程2:インキュベート時間の終わりに、規定量の検体をストレプトアビジンプレートおよびCF1060感光プレートに加え、さらに1時間周囲環境においてインキュベートし、ペプチドが、プレートに結合したストレプトアビジンまたはCF1060により固定化された。
工程3:プレートを、100μlの洗浄緩衝液、Tris緩衝生理食塩水中0.1%ツイーン(50 mM Tris、150 mM 塩化ナトリウム、20 mM アジ化ナトリウム、0.1%vol/vol ツイーン20の水溶液、pH 8.0)で3回洗浄した。
工程4:アルカリホスファターゼに結合したヒツジ抗体(Mologic)を、PBST中1%BSAで1/500に希釈し、周囲環境において1時間プレート上にてインキュベートした。抗体は、検体中に存在するMMP9のいずれかに露出される切断されたスタブと複合体を形成し、切断されたスタブが存在しないとき、抗体の結合は無いだろう。
工程5:プレートを、100μlの洗浄緩衝液、Tris緩衝生理食塩水中0.1%ツイーン(50 mM Tris、150 mM 塩化ナトリウム、20 mM アジ化ナトリウム、0.1%vol/vol ツイーン20の水溶液、pH 8.0)で3回洗浄した。
工程6:プレートを、pNPP基質とインキュベートし、その後、37℃で30分間インキュベート後405nmにおいて読み取った。MMP9標準曲線を、すべての組合せに対して図21に示した。ウェルの色差は、OD 405nmによって表される試験検体中における様々なレベルのプロテアーゼを示す。
論理的根拠
慢性閉塞性肺疾患の急性増悪(AECOPD)は、タンパク質分解性肺胞破壊および全身性炎症の両方を含む。炎症性タンパク質、プロテイナーゼ、およびそれらの分解産物は、AECOPDの全身マーカーとして広範囲に調べられており、いくつかは尿中で検出可能な状態で排泄され、AECOPDの最小限の侵襲性バイオマーカー試験を開発する機会を提供する。
AECOPDで入院する73人のCOPD患者に研究への参加を依頼し、参加するために書面のインフォームドコンセントを得た。患者が臨床的に健康だったとき、増悪(0日目)および56日目の時点で病歴、検査および尿サンプリングを行った。
TIMP1、組織メタロプロテアーゼ阻害物質、およびシスタチンC、リソソームプロテイナーゼ阻害剤が、安定な状態と比較して増悪の間有意により高いレベルで尿中に排泄された(n=34、TIMP1およびシスタチンCそれぞれについてウィルコクソン符号順位検定p=0.005およびp=0.013)。
AECOPDの間の尿中TIMP1およびシスタチンCの、それに続く安定なCOPDの間に観察されるレベルを超えるレベルの有意な増加は、肺プロテイナーゼ活性の増加に対する反応を反映し得る。これらの結果は、AECOPDのバイオマーカーとしてこれらのタンパク質の更なる調査を必要とする。
序論
臨床試験の間に医療的ケアを求めて、治療介入を誘導し、これらの事象を検証するよう患者に警告し得るCOPD増悪の信頼できるバイオマーカーの満たされない要求が存在する。任意のバイオマーカーの最小限の要求は、増悪における変化である。この研究の目的は、増悪で反応する一連の候補尿中バイオマーカーを測定することであった。
50人の患者(35人の男性)をロンドンCOPDコホートから募集した。彼らは73.2歳(SD 7.1)であり、予測%として49.0%(SD 17.6)のFEV1およびFEV1/FVC比 = 47.7(13.7)を有する。65個の尿検体を増悪の症候性オンセットの3日(IQR 2-5)以内に採取した。各増悪は、オンセットより91日(IQR=39-132)前の中央値をとった別のベースライン検体を有する。来診ごとに肺機能および血液検体を採取した。
65の増悪うち:45は、抗生物質および経口コルチコステロイドで;9は、抗生物質のみで;6は、経口コルチコステロイドのみで;4は、増加させたコルチコステロイドおよび/またはβ2アゴニスト吸入剤の使用で処置された。
尿は、COPD増悪を検出でき、場合によりそれらの重症度をまた評価し得るバイオマーカーの潜在的なソースである。この方法は、COPD増悪のホームモニタリングおよび管理への直接適用であり得る。
- BL(ベースライン1(BaseLine 1))
- OS(オンセット1(OnSet 1))
- R(回復(Recovery))
- BL(ベースライン2(BaseLine 2))
- ON(オンセット2(Onset 2))
が横軸に示され、(この順番で)尿検体が採取されたポイントを定義する。
点でわずかに異なる。このことは、いわゆる「第2増悪」のBL検体が、第1のBLの499日後に実際に採取されたことを示す。増悪検体「ON」は、-499日のBL検体の24日後に採取された。これは不要に混乱させるように見え得るが、これがデータが生じた順序であり、それ故に発見された順番であるため、この方法で示す
- 3つのバイオマーカーの各々は単独で特定の患者において増悪追跡バイオマーカーとして機能し得ること
- 3つのバイオマーカーが統合アルゴリズムへの包含に適した選択であること
を示す。
1. B2M陰性エピソードのうちの10は、増加したカルプロテクチンレベルを有し、感度を85%に上昇させた。残りの10のエピソードから、4のエピソードは増加した活性HNEレベルを有し、感度を91%にした。最後に、更なる3人の患者が増加したA1ATレベルで特定された。
2. B2M陰性エピソードのうちの10は、増加したIL-6レベルを有し、感度を85%に上昇させた。残りの10のエピソードから、5のエピソードは増加した活性MMPレベル(Ultimate ELTABAにより測定される)を有し、感度を92%にした。最後に、更なる3人の患者が増加したデスモシンまたは増加した活性HNEレベルで特定された。
1. fMLPだけが、ベースラインから増悪オンセットへのfMLP濃度の増加を有する42のエピソードを特定して、65%の感度を与える。A1AT、デスモシンおよびIL-6を逐次付加して、感度を97%に上昇させ得る。
2. fMLPだけが、ベースラインから増悪オンセットへのfMLP濃度の増加を有する42のエピソードを特定して、65%の感度を与える。A1AT、デスモシンおよびIL-8を逐次付加して、感度を97%に上昇させ得る。
1. IL-6、デスモシン(ELISAにより測定される)および活性MMP(Ultimate ELTABAにより測定される)を逐次付加して、感度を98%に上昇させ得る。
2. デスモシン(ラテラルフローにより測定される)、IL-6および活性MMP(Ultimate ELTABAにより測定される)を逐次付加して、感度を93%に上昇させ得る。
3. IL-1β、IL-6およびデスモシン(ELISAにより測定される)を逐次付加して、感度を97%に上昇させ得る。
4. IL-1β、IL-6および活性MMP(Ultimate ELTABAにより測定される)を逐次付加して、感度を97%に上昇させ得る。
5. 活性MMP(基質アッセイにより測定される)、IL-6およびデスモシンを逐次付加して、感度を95%に上昇させ得る。
6. 活性MMP(基質アッセイにより測定される)、A1ATおよびデスモシン(ELISAにより測定される)を逐次付加して、感度を94%に上昇させ得る。
1. fMLP、デスモシン(ELISAにより測定される)および活性MMP(Ultimate ELTABAにより測定される)を逐次付加して、感度を95%に上昇させ得る。
2. fMLP、IL-6およびデスモシン(ラテラルフローにより測定される)を逐次付加して、感度を94%に上昇させ得る。
3. fMLP、IL-6およびHSAを逐次付加して、感度を95%に上昇させ得る。
4. IL-6、活性MMP(Ultimate ELTABAにより測定される)および活性HNEなどを逐次付加して、感度を95%に上昇させ得る。
5. 活性MMP(Ultimate ELTABAおよび基質アッセイにより測定される)およびデスモシン(ELISAにより測定される)を逐次付加して、感度を95%に上昇させ得る。
6. 活性MMP(Ultimate ELTABAにより測定される)、IL-6および活性HNEなどを逐次付加して、感度を95%に上昇させ得る。
7. デスモシン(ラテラルフローにより測定される)、活性MMP(基質アッセイにより測定される)および活性HNEを逐次付加して、感度を95%に上昇させ得る。
8. デスモシン(ラテラルフローにより測定される)、A1ATおよび活性HNEを逐次付加して、感度を95%に上昇させ得る。
総MMP9、MMP8、NGAL、TIMP1、TIMP2、HSA、シスタチンC、RBP4、IL-6、IL-8、IL-1βおよびTNFαは、すべて市販ELISAキット(R&D systems)を用いて測定された。生体液中の分析物を測定するためのサンドイッチ免疫アッセイを開発するのに必要とされる基本的な構成要素を含む、これらのDuoSet ELISA development Systemsを試験前に尿でバリデードした。プレートを一晩増感し、製造業者の説明書に従い行った。
Creatinine Parameter Assay(R&D systems KGE005)を用いてクレアチニン測定を達成した。希釈検体をマイクロプレートに加え、続いてアルカリ性ピクリン酸を加え、Jaffe反応を開始した。30分間のインキュベーションの後、プレートを490nmにおいて読み取った。
- Invitrogen製のプレキャストゼラチンゲルを用いてザイモグラフィーを実施し、検体を変性条件にかけ、復元し、生じさせ、染色する手順の後に、暗いバックグランドに対してはっきりしたバンドとして可視化した。image Jソフトウェアを用いてイメージ分析を実施した。公知の濃度における活性MMP9をすべてのゲルでかけ、検体データを標準化した。
-基質アッセイについて、10μmのMMP蛍光発生基質(R&D systems ES010)または20μmのHNE蛍光発生基質(Enzo P-224)を検体5μlに加え、蛍光をBMGプレートリーダーで読み取った。読み取るための条件は、製造業者の説明書のとおり1分間隔で30分間であった。
- Ultimate ELTABA(Mologic自家ラテラルフローアッセイ)について、MMP基質(Mologic MOL378)12.5μlを検体75μlに加え、カセットに加える前に10分間インキュベートした。15分後、Forsite diagnostics製のイムノリーダーを用いてデバイスを読み取った。
図33は、採取時間に関して嚢胞性線維症患者から提供された尿検体からのアルゴリズムの重要な態様を例示する。安定した疾患期間の間および肺増悪(PEx)を感じていたときの2つの検体が患者から提供された。
検体を採取したときの順番は、各患者によって異なり、何人かは、入院前に先の「安定した」検体を採取し、何人かは最初に入院し、すぐ後に「安定した」検体を採取した。TIMP2レベルが高いとき、MMP活性(ラテラルフローにより測定される)は低くあるべきであることが予測される。患者4を例外として、すべての患者においてこのことが実証された。患者のうち5人(3、5、6、7、8)について見られるようにMMP活性は増悪において高まるべきであることもまた予測される。しかしながら、患者のうち2人(2、9)について、活性MMPが安定な状態よりPExにおいて低く、プロテアーゼシールドが切断した、活性MMP9の存在がTIMP2応答を誘発した後に検体が提供されたことを示した。
これは、重大な予測に役立つ意味を有し、規則的なサンプリングに基づいて増悪エピソードを追跡するためのこれらの指標の使用の重要性を強調する。
1. 序論
増悪の発生頻度はCOPDの重要な特徴である。尿の検体セットをCOPD対象体のサブグループから採取した。尿検体は、35人の患者について研究の最初の12ヵ月の間各々計画された毎月の来院から提供される。さらに、COPD増悪のために各々計画されていない来院の時に採取された尿検体が提供された。
2.1 バイオマーカーの選択
従来の肺炎症研究(COPDおよびCF)において本発明者らが行った作業に基づいて、表2.1a中のバイオマーカーが、研究のための試験メニューとして選択された。バイオマーカーを測定するために自家アッセイおよび市販アッセイキットの組合せを用いた。他のプロジェクトからのCOPD検体によってこのプロジェクトにおける試験の開始前にアッセイを評価、選択およびバリデートした。
2.2.1 Ac-PGPアッセイ
好中球化学誘引物質であるN-アセチルPro-Gly-Pro(Ac-PGP)は、細胞外マトリックス(ECM)の破壊に由来し、気道炎症の間中生じる。AcPGPは炎症性疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患(COPD)において好中球性白血球のタンパク質分解作用によりコラーゲンから開裂されるため、AcPGPをバイオマーカーとして選択した。
好中球は、細菌を殺す活性酸素種を産生し放出すること、および感染部位へ他の免疫細胞を引き付けるケモカインを発現することにより細菌感染に応答する。fMLP(N-ホルミル-L-メチオニル-L-ロイシル-フェニルアラニン)と同様なN-ホルミル化ペプチドは、強力な化学誘引物質として主要な役割を果たす。fMLPは、タンパク質プロセシング機構の結果として様々な細菌からおよび/または分解された細菌(PAMP)から生じる。それはまた、真核細胞タンパク質のミトコンドリア(例えば「DAMP」)において生成され得る。N-ホルミルペプチド受容体は共役したG-タンパク質であり、fMLPで刺激されたときヒト好中球および他の細胞における食作用および炎症後反応、例えば活性酸素中間体(例えばスーパーオキシド;O2 -)の産生を開始/伝搬する。
炎症中のエラスチン繊維の分解は、エラスターゼと呼ばれる酵素により生じる。2つの重要な炎症性エラスターゼは、好中球エラスターゼ(活性化好中球により放出される)およびMMP12(肺マクロファージにより放出される)である。デスモシンは、エラスチンから切断され、白血球活性が増加したまたは増加していることを示す分解過程の分子署名である。尿中に直接排泄されるデスモシンの量は、順番に組織損傷レベルを示すエラスチン分解の程度と相関する。デスモシンは、腎臓を通過できるほど十分小さい。過剰な好中球性白血球活性は、増悪の重要な原動力である。デスモシン断片アッセイは、本願発明者らがすでに開発し、バリデートしたデスモシンアッセイへの追加である。当該アッセイは、特に、ヒト好中球エラスターゼによる切断によって生じる異なる大きさであるエラスチン断片にされた複数の抗体の生成によって、デスモシン、およびエラスチン繊維にまだ結合するデスモシンを測定できるようにデザインされた。
この独自のアッセイ(本明細書にさらに詳細に記載)は、MMPにより切断されることができ、その後特異的な標識ヒツジ抗体CF1522により認識される、特別にデザインされた基質を加えることにより、特定のマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の活性を測定できる。
71の増悪事象が選択され、各事象は、安定前および安定後の検体を有した。
・増悪前の検体を増悪の3〜66日間前に採取した
・増悪後の検体を増悪事象の6〜73日前に採取した
上記と同じコホートから、血中CRP測定に基づいて検体のサブセットを選択した。
検体の状態を確認する群を階層化するために血中バイオマーカーを用いた。血中CRP測定は何人かの患者に利用可能であった。安定群から血中CRP<10で検体を選択し、PExからCRP>10で検体を選択して、88の安定検体および59のPEx検体生じさせた。
2群を区別できるときに有望な組合せとしてCRP,Ac-PGPv3、fMLP、TIMP1、HSAおよびCC16を特定した濃度値上で実施したロジスティック回帰分析(モデル1a):
2群を区別できるときに有望な組合せとしてCRP、fMLP、Ac-PGPバージョン3、A1ATおよびTIMP1を特定した濃度値上で実施したロジスティック回帰分析(モデル2a)
決定木分析
アルゴリズム21〜2cが由来する限られた検体セットを用い、データを決定木を用いて分析した。決定木は、独立(予測因子)変数値に基づく独立(標的)変数値を予測する予測モデルとして用いられ得る。この方法は、代替としてロジスティック回帰などの方法に適用される。
TIMP2、CRPおよびデスモシン(6:TIMP2 LF 45:CRP 21:デスモシンEIA V2)
TIMP1、CRPおよびCC16(7:TIMP1 ELISA 45:CRP 46:CC16 ELISA)
B2M、CRP、Ac-PGP(17:B2M(Mologic)45:CRP 38:Ac-PGP EIA V3)
MMP活性、CRPおよびLEF(25:Ultimate ELTABA V1 45:CRP 43:ラージエラスチンフラグメントアッセイ(LEF)V2)
MMP活性、CRPおよびHSA(26:Ultimate ELTABA V2 45:CRP 15:ヒト血清アルブミン ELISA)
クレアチニン、CRP、Ac-PGP(29:クレアチニン 45:CRP 38:Ac-PGP V3)
fMLP、CRPおよびTIMP2(34:fMLP EIA 45:CRP 8:TIMP2 ELISA)
Ac-PGP、CRP、代替Ac-PGPアッセイ(36:Ac-PGP EIA V1 45:CRP 38:Ac-PGP EIA V3)。
49人の患者が安定および増悪検体を提供した。尿中CRPは、中央値60.7 pg/mlから317.3 pg/mlへ増加した(p=0.0015)。四分位範囲(interquartile range)は、安定状態については0〜143.9であり、増悪状態では23.6〜2584であった。結果を図40に示す。
Claims (15)
- 呼吸器障害を患う対象体の肺炎症状態をモニターするための方法であって、該方法が、複数の時点で対象体から採取した尿検体中の少なくとも3つのマーカーレベルを測定することを含み、ここで、尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加は、肺状態の増悪を示すかもしくは予測し、および/または尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加後の減少は、肺状態の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測し、少なくとも3つのマーカーが、C反応性タンパク質(CRP)、クララ細胞タンパク質(CC16)、ラージエラスチンフラグメント(LEF)、組織メタロプロテアーゼ阻害物質(TIMP)、シスタチンC、α1アンチトリプシン(A1AT)、細胞間接着分子-1(ICAM-1)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-1β(IL-1β)、インターロイキン-8(IL-8)、N-ホルミル-Met-Leu-Phe(fMLP)、IL-6誘導フィブリノゲン、サイトカイン誘導β2ミクログロブリン(B2M)、レチノール結合タンパク質4(RBP4)、カルプロテクチン、プロテアーゼ活性(ここで、プロテアーゼ活性は、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)活性、ヒト好中球エラスターゼ(HNE)活性およびカテプシンG活性より選択される)、N-アセチルPro-Gly-Pro(Ac-PGP)、デスモシンおよびヒト血清アルブミン(HSA)より選択される、方法。
- 尿検体中の少なくとも1つの更なるマーカーレベルを測定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの更なるマーカーが、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)(遊離型もしくは複合体中のいずれか)またはミエロペルオキシダーゼ(MPO)より選択される、請求項2に記載の方法。
- (1)MMP活性がMMP9および/またはMMP8活性を含み;および/または
(2)プロテアーゼ活性が、ペプチド基質の切断の測定により決定され;および/または
(3)プロテアーゼ活性が、
a. 指示薬分子を試験検体と接触させること(ここで、該指示薬分子は、
i. 該プロテアーゼが存在する場合に該プロテアーゼにより切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
ii. 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、ここで少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる);
b. 試験検体に新しい結合部位に結合できる結合分子を加えること(ここで該結合分子は、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない);
c. 捕捉部位への捕捉ゾーン中の捕捉分子の結合によって捕捉ゾーンにおいて新しい結合部位を含む指示薬分子の該部分を捕捉すること;ならびに
d. 捕捉ゾーンにおいて捕捉された指示薬分子の新しい結合部位への結合分子の結合を測定することにより少なくとも1つの切断部位の切断を検出すること
を含む方法によって測定される、
請求項に3記載の方法。 - 少なくとも3つのマーカーの少なくとも1つが、CRP、CC16およびラージエラスチンフラグメント(LEF)より選択され、少なくとも3つのマーカーの別の少なくとも1つが、組織メタロプロテアーゼ阻害物質(TIMP)、シスタチンCおよびα1アンチトリプシン(A1AT)より選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも3つのマーカーの少なくとも1つが、CRP、CC16およびラージエラスチンフラグメント(LEF)より選択され、少なくとも3つのマーカーの別の少なくとも1つが、ICAM-1、IL-6、IL-1β、IL-8、N-ホルミル-Met-Leu-Phe(fMLP)、IL-6誘導フィブリノゲンおよびサイトカイン誘導β2ミクログロブリン(B2M)より選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- プロテアーゼ活性の分解産物である少なくとも1つの更なるマーカーのレベルを測定することをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- (1)呼吸器障害が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)または嚢胞性線維症(CF)であり;および/または
(2)少なくとも3つのマーカーの少なくとも1つ、または少なくとも1つの更なるマーカーのレベルの増加または減少が、対象体に適したマーカーの閾値レベルを参照して算出され、ここで、マーカーの閾値レベルが、早期の時点で対象体から採取した尿検体中のマーカーレベルを測定することにより設定されてもよく、該早期の時点が、現在の尿検体中のマーカーレベルを決定する直前の少なくとも2回の早期の測定を含んでもよい、
請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。 - マーカーの閾値レベルが、対象体が肺状態の増悪を患っていない早期の時点で対象体から採取した尿検体中のマーカーレベルを測定することにより設定され、閾値を超える増加が肺状態の増悪を予測または特定するか、またはマーカーの閾値レベルが、対象体が肺状態の増悪を患っている早期の時点で対象体から採取した尿検体中のマーカーレベルを測定することにより設定され、閾値を下回る減少が肺状態の増悪からの回復、またはその処置の成功を予測または特定する、請求項8に記載の方法。
- (1)マーカーレベルを少なくとも週に2回測定し;および/または
(2)マーカーレベルの増加が検出される場合に対象体から採取した尿検体中のマーカーレベルを測定する頻度が増加され、マーカーレベルの減少が検出されるまで対象体から採取した尿検体中のマーカーレベルを測定する頻度が維持されてもよく;および/または
(3)少なくとも3つのマーカーの測定されたレベルが、対象体の肺炎症状態をモニターするために所定の順序で分析され、および/または少なくとも3つのマーカーの測定されたレベルが、ウェイトを与えられ;および/または
(4)基準マーカーのレベルに対して標準化することにより少なくとも1つのマーカーレベルを決定し、該基準マーカーが、尿中クレアチニンまたはフィブリノゲンを含んでもよい、
請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 - a. 尿検体中の少なくとも3つのマーカーレベルを測定するための1以上の試験デバイス
b. プロセッサー;ならびに
c. プロセッサーによって実行されたとき:
i. 1以上の試験デバイス上の尿検体中の各マーカーの測定されたレベルにアクセスしおよび/またはそれを算出し;
ii. 尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルに、早期の時点で同じ対象体から採取された尿検体中の該マーカーの測定されたレベルと比較して、増加または減少があるか否かを算出し;そして
iii. プロセッサーから対象体の現在の肺炎症状態を出力し、ここで、尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加は、肺状態の増悪を示すかもしくは予測し、および/または尿検体中のマーカーの少なくとも1つのレベルの増加後の減少は、肺状態の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測する
ように構成されたコンピューターアプリケーションを含む記録媒体
を含み、少なくとも3つのマーカーが、CRP、CC16、ラージエラスチンフラグメント(LEF)、TIMP、シスタチンC、A1AT、ICAM-1、IL-6、IL-1β、IL-8、fMLP、IL-6誘導フィブリノゲン、B2M、RBP4、カルプロテクチン、プロテアーゼ活性(ここで、プロテアーゼ活性は、MMP活性、HNE活性およびカテプシンG活性より選択される)、Ac-PGP、デスモシンおよびHSAより選択される、呼吸器障害を患う対象体において肺炎症状態をモニターするためのシステムまたは試験キット。 - プロセッサーから出力するためのディスプレイをさらに含み、および/または1以上の試験デバイスが、使い捨ての単回使用デバイスを含み、および/または1以上の試験デバイスが、ラテラルフロー試験ストリップを含み、測定される各マーカーのためのラテラルフロー試験ストリップを含んでもよい、請求項11に記載のシステムまたは試験キット。
- マーカーに、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)(遊離型もしくは複合体中のいずれか)またはミエロペルオキシダーゼ(MPO)より選択される少なくとも1つの更なるマーカーが追加され、および/またはMMP活性が、MMP9および/またはMMP8活性を含み、該1以上の試験デバイスが、プロテアーゼ活性の指標としてペプチド基質の分解を測定するための試験デバイスを含んでもよく、該試験デバイスが、
a. 尿検体へ加えるための指示薬分子であって、
i. 該プロテアーゼ活性が存在する場合に該プロテアーゼ活性により切断され得る少なくとも1つの切断部位を含む切断領域;および
ii. 捕捉部位;
を含む指示薬分子であり、少なくとも1つの切断部位の切断は、新しい結合部位を生じる、指示薬分子;
b. 尿検体を受け取るための捕捉ゾーンであって、新しい結合部位を含む指示薬分子を固定するために指示薬分子の捕捉部位に結合できる捕捉分子を含む捕捉ゾーン;ならびに
c. 新しい結合部位に結合できる結合分子であって、切断が生じない限りかつ切断が生じるまで指示薬分子に結合できない結合分子
を含んでもよい、請求項11または12に記載のシステムまたは試験キット。 - (1)マーカーに、エラスチン断片/ペプチド、塩素化ペプチド、乳酸および/または遊離脂肪酸から選択される少なくとも1つの更なるマーカーが追加され;および/または
(2)対象体が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)または嚢胞性線維症(CF)を患っており;および/または
(3)コンピューターアプリケーションが、対象体に適したマーカーの閾値レベルを参照して1または複数のマーカーのレベルをプロセッサーに算出させ、該マーカーの閾値レベルが、早期の時点で対象体から採取した尿検体中のマーカーの測定されたレベルに基づいて設定されてもよく、該早期の時点が、現在の尿検体中のマーカーレベルを決定する直前の少なくとも2回の早期の測定を含んでもよく、該マーカーの閾値レベルが、対象体が肺状態の増悪を患っていない早期の時点で対象体から採取した尿検体中のマーカーの測定されたレベルに基づいて設定され、閾値を超える増加が肺状態の増悪を予測または特定し、および/または対象体が肺状態の増悪を患っている早期の時点で対象体から採取した尿検体中のマーカーの測定されたレベルに基づいて設定され、閾値を下回る減少が肺状態の増悪からの回復、またはその処置の成功を予測または特定してもよく;および/または
(4)コンピューターアプリケーションが、対象体に対して1または複数のマーカーレベルを測定する要求をプロセッサーに指示させ、および/またはコンピューターアプリケーションが、さらに、少なくとも1つのマーカーレベルの増加が算出される場合に対象体から採取した尿検体中の1または複数のマーカーレベルを測定する頻度を増加させる要求をプロセッサーから出力するよう構成され、該コンピューターアプリケーションが、さらに、少なくとも1つのマーカーレベルの減少が算出されるまで少なくとも1つのマーカーレベルを測定する頻度を増加させたまま維持する要求をプロセッサーから出力するよう構成されてもよく;および/または
(5)コンピューターアプリケーションが、マーカーの少なくとも1つのレベルの増加を算出し、マーカーの少なくとも1つのレベルの算出された増加が肺状態の増悪を示すもしくは予測するというプロセッサーのから出力を提供するよう構成され、および/またはコンピューターアプリケーションが、マーカーの少なくとも1つのレベルの減少を算出し、マーカーの少なくとも1つのレベルの増加後の算出された減少が肺状態の増悪からの回復、またはその処置の成功を示すかもしくは予測するというプロセッサーからの出力を提供するよう構成され、および/またはコンピューターアプリケーションが、対象体の肺炎症状態をモニターするために少なくとも3つのマーカーの算出されたレベルを所定の順序で分析するように構成され、および/またはコンピューターアプリケーションが、少なくとも3つのマーカーの測定されたレベルにウェイト付けるよう構成され;および/または
(6)コンピューターアプリケーションが、基準マーカーのレベルに対して標準化することにより少なくとも1つのマーカーレベルを算出するよう構成され、該基準マーカーが、尿中クレアチニンまたはフィブリノゲンを含んでもよく、および/またはコンピューターアプリケーションが、さらに、対象体の現在の肺炎症状態の算出に肺状態の増悪の他の指標の情報を組み込むように構成され、該肺状態の増悪の他の指標が、息切れ、喘鳴の増加、脈拍数の増加、呼吸困難、膿性痰の増加、喀痰の色の濃化、咽頭痛、咳の増加、悪寒および発熱を含んでもよい、
請求項11〜13のいずれか一項に記載のシステムまたは試験キット。 - 請求項11〜14のいずれか一項に記載のコンピューターアプリケーション。
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