MX2007015056A - Metodos para el tratamiento de tumores de cerebro con anticuerpos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion es concerniente con un metodo para el tratamiento de un cerebro de tumor en un paciente, que comprende administrar sistemicamente un anticuerpo monoclonal.

Description

MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES D? CEREBRO CON ANTICUERPOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente en general con el tratamiento de tumores del cerebro con anticuerpos y más en particular, por ejemplo, con el tratamiento de tumores del cerebro con anticuerpos monoclonales que se enlazan a y neutralizan el factor de crecimiento de hepatocito ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor de crecimiento de hepatocito humano (HGF) es un polipéptido heterodimérico multifuncional producido por células mesenquimales . Se ha demostrado que HGF estimula la angiogénesis, morfogénesis y mitogénesis, también como el crecimiento y dispersión de varios tipos de células (Bussolino et al., J. Cell. Biol. 119: 629, 1992; Zarnegar y Michalopoulos, J. Cell. Biol. 129:1177, 1995; Matsumoto et al., Ciba. Found. Symp. 212:198, 1997; Birchmeier y Gherardi, Trends Cell. Biol. 8:404, 1998; Xin et al., Am. J. Pathol. 158:1111, 2001). Las actividades pleiotrópicas de HGF son moderadas por medio de su receptor, una cinasa de tirosina de transmembrana codificada por el proto-oncógeno cMet . Además, de regular una variedad de funciones calores normales, HGF y su receptor c-Met han mostrado estar involucrados en el inicio, invasión y metástasis de tumores (Jeffers et al., J. Mol. Med. 74:505, 1996; Comoglio y Trusolino, J. Clin. Invest. 109:857, 2002). HGF/cMet son co-expresados, frecuentemente sobre-expresados, sobre varios tumores sólidos humanos en los que se incluyen tumores derivados de pulmón, colon, recto, estómago, riñon, ovario, piel, mieloma múltiple y tejido de tiroide (Prat et al., Int. J. Cáncer 49:323, 1991; Chan et al., Oncogene 2:593, 1988; eidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993; Derksen et al., Blood 99:1405, 2002). HGF actúa como un factor de crecimiento autócrino (Rong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4731, 1994; Koochekpour et al., Cáncer Res. 57:5391, 1997) y parácrino (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993) y regulador anti-apoptótico (Gao et al., J. Biol. Chem. 276:47257, 2001) para estos tumores. Así, moléculas antagonistas, por ejemplo anticuerpos, que bloquean la ruta HGF-cMet tienen potencialmente potencial terapéutico anti-cáncer amplio. HGF es una proteína de 102 kDa con secuencia y similaridad estructural a plasminógeno y otras enzimas de coagulación de la sangre (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993, cada uno de los cuales es incorporado en la presente por referencia) . El HGF humano es sintetizado como un precursor del aminoácido 728 (preproHGF) , que sufre escisión intracelular a una forma de una sola cadena inactiva (proHGF) (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Rosen et al., J. Cell. Biol. 127:1783, 1994). Después de la secreción extracelular, el proHGF es escindido para producir la molécula heterodimérica disulfuro-enlazada biológicamente activa compuesta de una subunidad a y subunidad ß (Nakamura et al., Nature 342:440, 1989; Naldini et al., EMBO J. 11:4825, 1992). La subunidad a contiene 440 residuos (69 kDa con glicosilación) , que consiste del dominio de hairpin de N-terminal y cuatro dominios kringle . La subunidad ß contiene 234 residuos (34 kDa) y tiene un dominio semejante a proteasa de serina, que carece actividad proteolítica. La escisión de HGF es requerida para la activación de receptor, pero no para el enlace de receptor (Hartmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11574, 1992; Lokker et al., J. Biol. Chem. 268:17145, 1992). HGF contiene 4 sitios de N-glicosilación supuestos, 1 en la subunidad a. y 3 en la subunidad ß. HGF tiene 2 sitios de enlace específicos de célula: un sitio de enlace de alta afinidad (Kd = 2 x 10-10 M) por el receptor cMet y un sitio de enlace de baja afinidad (Kd = 10-9 M) para proteoglicanas de sulfato de heparina (HSPG) , que están presentes sobre la superficie celular y matriz extracellular (Naldini et al., Oncogene 6:501, 1991; Bardelli et al., J.

Biotechnol. 37:109, 1994; Sakata et al., J. Biol. Chem., 272:9457, 1997). NK2 (una proteína que abarca del término N y primeros dos dominios kringle de la subunidad ) es suficiente para el enlace a cMet y activación de la cascada de señal por movilidad, sin embargo se requiere la proteína de plena longitud para la respuesta mitogénica (Weidner et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 8:229, 1993). HSPG se enlaza a HGF al interactuar con el término N de HGF (Aoyama, et al., Biochem. 36:10286, 1997; Sakata, et al., J. Biol. Chem. 272:9457, 1997). Los papeles postulados para la interacción de HSPG-HGF incluyen la mejora de biodisponibilidad de HGF, actividad biológica y oligomerización (Bardelli, et al., J. Biotechnol. 37:109,1994; Zioncheck et al., J. Biol. Chem. 270:16871, 1995) . cMet es un miembro de la familia del receptor de cinasa de tirosina de proteína clase IV. El gen de cMet de plena longitud fue clonado e identificado como el proto-oncógeno de cMet (Cooper et al., Nature 311:29, 1984; Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6379, 1987). El receptor cMet es sintetizado inicialmente como un precursor parcialmente glicosilado de una sola cadena, pl70 (MET) (figura 1) (Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6379, 1987; Giordano et al., Nature 339:155, 1989; Giordano et al., Oncogene 4:1383, 1989; Bardelli et al., J. Biotechnol. 37:109, 1994). Después de a glicosilación adicional, la proteína es escindida proteolíticamente a una proteína madura de 190 kDa heterodimérica (1385 aminoácidos) , que consiste de la subunidad a de 50 kDa (residuos 1-307) y la subunidad ß de 145 kDa. El dominio de cinasa de tirosina citoplásmico de la subunidad ß está involucrado en la transcripción de señal . Se han investigado varios procedimientos diferentes para intentar obtener una molécula antagonista efectiva de HGF/cMET: proteínas HGF truncadas tales como NKl (dominio N terminal más dominio kringle 1; Lokker et al., J. Biol. Chem. 268:17145, 1993), NK2 (dominio N terminal más dominios kringle 1 y 2 ; Chan et al., Science 254:1382, 1991) y NK4 (dominio N-terminal más cuatro dominio kringle; Kuba et al., Cáncer Res. 60:6737, 2000) y mAbs anti-cMet (Dodge, Master 's Thesis, San Francisco State University, 1998) . Más recientemente, Cao et al. (Proc. Natl Acad. Sci. USA. 98: 7443, 2001, que es incorporado en la presente por referencia) reportaron que la administración de una combinación de 3 mAbs a HGF inhibía el crecimiento de xenoinjertos de gliomas subcutáneos en ratones. WO 2005/017107 A2 , que es incorporado en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos, reportó que el tratamiento con un solo mAb anti-HGF podría inhibir el crecimiento de xenoinjertos de glioma subcutáneos en ratones. Sin embargo, estas publicaciones no tratan la cuestión de si la administración sistémica de un anti-HGF u otro mAb puede inhibir el crecimiento de un tumor en el cerebro, en donde la barrera de sangre-cerebro presenta obstáculos (Rich et al., Nat. Rev. Drug Discov. 3: 430, 2004). Por supuesto, la ineficacia previamente observada por las terapias de anticuerpo sistémicas contra tumores del sistema nervioso central (CNS) ha sido atribuida a la permeabilidad vascular restringida aún para metástasis de CNS (Bendell et al., Cáncer 97: 2972, 2003) . Así, hay necesidad de un método para tratar tumores de cerebro mediante la administración sistémica de un mAb. La presente invención satisface estas y otras necesidades.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la invención proporciona un método de tratamiento de tumor de cerebro en un paciente mediante la administración sistémica de un mAb. El tumor de cerebro puede ser a glioma tal como un astrocitoma, por ejemplo, un glioblastoma. La administración puede ser, por ejemplo, mediante rutas intravenosa, intramuscular o subcutánea. En una modalidad preferida, el mAb es un mAb neutralizante al Factor de crecimiento de hepatocito (HGF) tal como un mAb L2G7 humanizado. En otra modalidad preferida, la administración sistémica de un mAb tal como un mAb anti-HGF neutralizante es usada para inducir la regresión de un tumor de cerebro.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Actividades de enlace y bloqueo de mAbs anti-HGF medidas mediante ELISA. A. Para el enlace, mAbs fueron capturados sobre una placa de ELISA recubierta con IgG anti-ratón de cabra, bloqueado con BSA e incubado con HGF-Flag (1 µg/ml) , seguido por mAb anti-bandera HRP-M2 (Invitrogen). B. Para el bloqueo de HGF-bandera al enlace de Met-Fc, las placas fueron recubiertas con IgG-Fc anti-humano de cabra, bloqueado con BSA, incubado con Met-Fc (2 µg/ml) y luego con HGF-Flag (1 µg/ml) +/- mAbs anti -HGF. El HGF-Flag enlazado fue detectado con HRP-M2 anti-Flag mAb. Figura 2. Efectos de bloqueo de Ab L2G7 sobre las actividades de dispersión, mitogénicas, angiogénicas y anti-apoptóticas de HGF. A. Células MDCK (ATCC) fueron estimuladas con 50 ng/ml de HGF +/- 10 µg/ml L2G7 durante 2 días como se describe (Cao et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 98: 7443, 2001) . Se tomaron fotografías a una amplificación de lOOx después que las células fueron teñidas con violeta cristal. B. Células epiteliales de pulmón de mink Mv 1 Lu (ATCC; 5 x 104 células/ml) fueron incubadas en DMEM libre de suero con o sin HGF (50 ng/ml) y L2G7 o mAb de control de isotipo apareado (mlgG) durante 24 horas y el nivel de proliferación celular fue determinado mediante adición de 3H-timidina por 6 horas. C. Como se describe (Xin et al. Am. J. Pathol. 158, 1111, 2001), HUYEC (CAMBREX; 104 células/100 µl/cavidad) fueron incubadas en EBM-2/0.1% FCS con o sin HGF (50 ng/ml) y L2G7 o mAb de control por 72 horas y el nivel de proliferación fue determinado mediante la adición de WST-I. D. como se describe (Xin et al. Am. J. Pathol. 158, 1111, 2001) , HUVEC (6 x 104 células/100 µl/cavidad) en DMEM/gel fueron superpuestas con 100 µl/cavidad de EMB-2/0.1% FCS/0.1% BSA con o sin 200 ng/ml de HGF +/- 20 µg/ml de L2G7. Después de una incubación de 48 horas, las células fueron fijadas y teñidas utilizando azul de toluidina y se tomaron fotografías una amplificación de 40X. E. Como se describe (Fan et al. Oncogene 24: 1749, 2005), células de tumor U87 en DMEM libre de suero fueron tratadas con o sin HGF (20 ng/ml) +/- mAb L2G7 (20 µg/ml) o anticuerpo de control de isotipo (mlgG) por 48 horas y luego con anticuerpo anti-Fas mAb CH-11 (Upstate Biotechnology, 40 ng/ml) durante 24 horas y la viabilidad celular fue determinada mediante la adición de WST- I. En b, c y e, los valores son la media +/- desviación estándar.

Figura 3. Inhibición o regresión de xenoinjertos de tumor de glioma mediante L2G7. Células tumor de glioma U118 (A) o U87 (B) fueron implantadas subcutáneamente a ratones Beige/Desnudos NIH III y el tamaño de tumor fue monitoreado como se describe (Kim et al., Nature 362: 841, 1993). Después que el tamaño del tumor había alcanzado -50 mm3 , grupos de ratones (n = 6 ó 7) fueron tratados dos veces a la semana i.p. con 50 ó 100 µg de L2G7 ó 100 µg de anticuerpo monoclonal de control de isotipo apareado (mlgG) o PBS como se indica; las flechas muestran el primer día de tratamiento. Los valores son el volumen de tumor medio +/- s.e.m. C. Células de tumor U87 (105 por ratón) fueron inyectadas intracranealmente al caudate/ putamen de ratones Scid/beige como se describe (Abounader et al. FASEB J. 16, 108, 2002). Empezando y finalizando respectivamente en el día 5 y día 52 como se indica por las flechas, los grupos de ratones (n = 10) fueron administrados i.p. con 100 µg de L2G7 o PBS dos veces a la semana y la sobrevivencia fue monitoreada. Los estudios de supervivencia fueron analizados mediante gráficas de Kaplan-Meier. D. Secciones de cerebro preparadas como se describe (Abounader et al. FASEB J. 16, 108, 2002) de ratones representativos sacrificados en el día 21, después de 3 dosis de tratamiento i.p. dos veces a la semanas con 100 µg de L2G7 o PBS, que muestran el tamaño de xenoinjertos intracraneales U87. E. Volúmenes de tumor U87 intracraneales en ratones individuales en el día 18 antes del inicio de tratamiento y en el día 29 después de tratamiento 3 veces con L2G7. F. Secciones de cerebro de ratones representativos en el día 18 antes del tratamiento y en el día 29 después de tratamiento con L2G7 o anticuerpo monoclonal de control. Figura 4. Análisis histológicos de secciones de cerebro de ratones con xenoinjertos intracraneales U87. Los ratones fueron sacrificados después de tratamiento de tumores pre-establecidos con tres dosis dos veces a la semana de L2G7 o control. Secciones de cryostat fijados por perfusión fueron teñidas con H&E y el anticuerpo indicado y los índices cuantificados utilizando análisis de imagen auxiliada por computadora. A. Anti-Ki67 (DAKO) para detectar células proliferantes. B. Anti-laminina (Life Technologies) para detectar vasos sanguíneos. C. Anticuerpo a caspasa-3 escindida (Cell Signaling Technology) para detectar respuestas de células de tumor apoptóticas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un método para el tratamiento de tumores de cerebro mediante la administración sistémica de anticuerpo monoclonal neutralizante a HGF o anticuerpos contra otras citocinas tales como factores de crecimiento o contra proteínas de superficie celular tales como receptores de citocina. Aunque no se requiere un entendimiento del mecanismo para la práctica de la invención, se cree que el éxito de la invención reside por lo menos en parte debido al paso de anticuerpo de la sangre a tumores de cerebro debido a una barrera de sangre-cerebro defectuosa dentro de los tumores. 1„ Anticuerpos Los anticuerpos con moléculas complejas muy grandes (peso molecular de -150,000 o aproximadamente 1320 aminoácidos) con estructura interna intrincada. Una molécula de anticuerpo natural contiene dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada. Cada cadena ligera y cada cadena pesada a su vez consiste de dos regiones: una región variable ("V") involucrada en el enlace del anticuerpo objetivo y una región constante ("C") que interactúa con otros componentes del sistema inmune. Las regiones variables de cadena ligera y pesada se pliegan conjuntamente en el espacio tridimensional para formar una región variable que se enlaza al antígeno (por ejemplo, un receptor sobre la superficie de una célula) .

Dentro de cada región variable de cadena ligera o cadena pesada, hay 3 segmentos cortos (en promedio de 10 aminoácidos de longitud) llamados las regiones que determinan la complementareidad ("CDR") . Las seis CDR en un dominio variable de anticuerpo (tres de la cadena ligera y tres de la cadena pesada) se pliegan conjuntamente en el espacio tridimensional para formar el sitio de enlace de anticuerpo real que se bloquea sobre el antígeno objetivo. La posición y longitud de las CDR se han definido de manera precisa. Kabat, E. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health an Human Services, 1983, 1987. La parte de una región variable no contenida en las CDR es llamada la estructura, que forma el medio ambiente para las CDR. Un anticuerpo monoclonal (mAb) es una sola especie molecular de anticuerpo y por consiguiente no abarca anticuerpos policlonales producidos al inyectar un animal (tal como un roedor, conejo o cabra) con un antígeno y extraer suero del animal. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo diseñado genéticamente (monoclonal) el cual las CDR de un anticuerpo de ratón ("anticuerpo donador", que puede también ser de una especie de rata, hámster u otra especie similar) son injertados sobre un anticuerpo humano ("anticuerpo aceptor"). Los anticuerpos humanizados pueden también ser elaborados con menos de las CDR completas de un anticuerpo de ratón (por ejemplo, Pascalis et al., J.

Immunol . 169:3076, 2002). Así, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene CDR de un anticuerpo donador y estructura de región variable y regiones constantes de un anticuerpo humano. Además, con el fin de retener alta afinidad de enlace, por lo menos uno de los dos elementos estructurales adicionales pueden ser empleados. Véase, patente estadounidense No. 5,530,101 y 5,585,089, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia, que proporcionan instrucciones detalladas para la construcción de anticuerpos humanizados. En el primer elemento estructural, la estructura de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado es escogida para tener máxima identidad de secuencia (entre 65% y 95%) con la estructura de la región variable de cadena pesada del anticuerpo donador, al seleccionar apropiadamente el anticuerpo aceptor de entre los muchos anticuerpos humanos conocidos. En el segundo elemento estructural, al construir el anticuerpo humanizado, aminoácidos seleccionados en la estructura del anticuerpo aceptor humano (al exterior de las CDR) son reemplazados con aminoácidos correspondientes del anticuerpo donador, de acuerdo con reglas especificadas. Específicamente, los aminoácidos a ser reemplazados en la estructura son escogidos en base de su habilidad para interactuar con las CDR. Por ejemplo, los aminoácidos reemplazados pueden estar adyacentes a una CDR en la secuencia de anticuerpo donador o dentro de 4-6 ángstroms de una CDR en el anticuerpo humanizado tal como se mide en el espacio tridimensional. Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo en el cual la región variable de un anticuerpo de ratón (u otro roedor) es combinada con la región constante de un anticuerpo humano; su construcción por medio de ingeniería genética es bien conocida. Tales anticuerpos retienen la especificidad de enlace del anticuerpo de ratón, en tanto que son aproximadamente dos-tercios humanos. La proporción de secuencia no humana presente en anticuerpos de ratón, quiméricos y humanizados sugiere que la inmunogenicidad de anticuerpos quiméricos es intermedia entre anticuerpos de ratón y humanizados. Otros tipos de anticuerpos diseñados genéticamente pueden tener inmunogenicidad reducida en relación con anticuerpos de ratón incluyen anticuerpos humanos elaborados utilizando métodos de despliegue de fago (Dower et al., W091/17271; McCafferty et al., WO92/001047 ; Winter, WO92/20791; y Winter, FEBS Lett. 23:92, 1998, cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia) o usando animales transgénicos (Lonberg et al., W093/12227; Kucherlapati WO91/10741, cada uno de los cuales es incorporado en la presente por referencia) .

Como se usa en la presente, el término anticuerpo "semejante a humano" se refiere a un anticuerpo monoclonal en el cual una porción sustancial de la secuencia de aminoácidos de una o ambas cadenas (por ejemplo, aproximadamente 50% o más) se origina de genes de inmunoglobulina humanos. De aquí, los anticuerpos semejantes a humano abarcan pero no están limitados a anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos. Como se usa en la presente, un anticuerpo de "inmunogenicidad reducida" es uno que se espera que tenga significativamente menos inmunogenicidad que un anticuerpo de ratón cuando es administrado a pacientes humanos. Tales anticuerpos abarcan anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos, también como anticuerpos elaborados al reemplazar aminoácidos específicos en anticuerpos de ratón que pueden contribuir a epítopos de célula B o células T, por ejemplo residuos expuestos (Padlan, Mol. Immunol . 28:489, 1991). Como se usa en la presente, un anticuerpo "diseñado genéticamente" es uno para el cual los genes han sido construidos o puestos en un medio ambiente no natural (por ejemplo, genes humanos en un ratón o sobre un bacteriófago) con la ayuda de técnicas de ADN recombinantes y por consiguiente, no abarcaría un anticuerpo monoclonal de ratón elaborado con tecnología de hibridoma convencional . El epítopo de un anticuerpo monoclonal es la región de su antígeno al cual el anticuerpo monoclonal se enlaza.

Dos anticuerpos se enlazan al mismo o al epítopo superpuesto si cada uno inhibe competitivamente (bloquea) el enlace del otro al antígeno. Esto es, un exceso de lx, 5x, lOx, 20x o lOOx de un anticuerpo inhibe el enlace del otro por al menos 50% pero preferiblemente 75%, 90% o aún 99%, tal como se mide en un análisis de enlace competitivo (véase, por ejemplo, Junghans et ' al., Cáncer Res. 50:1495, 1990, que es incorporado en la presente por referencia) . Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan el enlace de un anticuerpo reducen o eliminan el enlace del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos translapantes o superpuestos si algunas mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan el enlace de un anticuerpo, reducen o eliminan el enlace del otro. 2. Anticuerpos anti-HGF neutralizantes Un anticuerpo monoclonal (mAb) que se enlaza a HGF (esto es, un anticuerpo monoclonal anti-HGF) se dice que neutraliza HGF o es neutralizante, si el enlace inhibe parcial o completamente una o más actividades biológicas de HGF (esto es, cuando el anticuerpo monoclonal es usado como un solo agente) . De entre las propiedades biológicas de HGF que un anticuerpo neutralizante puede inhibir están la habilidad del HGF para enlazarse a su receptor cMet, para provocar la dispersión de ciertas líneas celulares tales como células de riñon canino Madin-Darby (MDCK) ; estimular la proliferación de (esto es, ser mitogénicas para) ciertas células en las que se incluyen hepatocitos, células epiteliales de mono 4MBr-5 y varias células de tumor humano; o estimular la angiogénesis, por ejemplo tal como se mide mediante estimulación de proliferación de célula endotelial vascular humana (HUVEC) o formación de tubo o mediante inducción de vasos sanguíneos cuando es aplicado a la membrana corioalantoica de embrión de pollo (CAM) . Los anticuerpos usados en la invención se enlazan preferiblemente a HGF, esto es, a la proteína codificada por la secuencia de GenBank con el número de Acceso D90334. Similarmente, un anticuerpo neutralizante, esto es, antagonista contra cualquier citocina o receptor de citocina puede inhibir el enlace de la citocina al receptor y/o inhibir la transmisión de una señal a la célula mediante la citocina. Si la citocina es un factor de crecimiento, tal anticuerpo puede inhibir la proliferación de células inducidas por la citocina. Un anticuerpo monoclonal neutralizante usado en la invención inhibe comúnmente a una concentración de, por ejemplo 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 ó 50 µg/ml de una función biológica de una citocina, por ejemplo, HGF (por ejemplo, estimulación de proliferación o angiogénesis) por aproximadamente por lo menos 50% pero preferiblemente 75%, más preferiblemente por 90% o 95% o aún 99% y más preferiblemente aproximadamente 100% (esencialmente por completo) tal como se analiza mediante métodos descritos bajo ejemplos o conocidos en el arte. Comúnmente, la extensión de inhibición es medida cuando la cantidad de citocina usada es solo suficiente para estimular plenamente la actividad biológica o es 0.05, 0.1, 0.5, 1, 3 ó 10 µg/ml. Preferiblemente, por lo menos 50%, 75%, 90% o 95% o esencialmente una inhibición completa es obtenida cuando la proporción molar de anticuerpo a citocina es 0.5x, lx, 2x, 3x, 5x ó lOx. Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal es neutralizante, esto es, inhibe la actividad biológica, cuando usado como un solo agente, pero en algunos métodos, dos anticuerpos monoclonales son usados conjuntamente para dar inhibición. Más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal neutraliza no solo una sino varias de las actividades biológicas listadas anteriormente; por propósitos en la presente, un anticuerpo monoclonal anti-HGF que usado como un solo agente neutraliza todas las actividades biológicas de HGF es llamado "plenamente neutralizante" y tales anticuerpos monoclonales son más preferibles. Los anticuerpos monoclonales usados en la invención son preferiblemente para ser específicos para HGF, esto es no se enlazan o solamente se enlazan a una extensión mucho menor, a proteínas que están relacionadas con HGF tales como factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . Los anticuerpos monoclonales tienen comúnmente una afinidad de enlace (Ka) de por lo menos 107 M"1 pero preferiblemente 108 M"1 o más alta y más preferiblemente 109 M"1 o más alta o aún 1010 M"1 ó más alta. Los anticuerpos monoclonales usados en la invención incluyen anticuerpos en su forma tetramérica natural (2 cadenas ligeras y 2 cadenas pesadas) y puede ser de cualquiera de los isotipos conocidos IgG, IgA, IgM, IgD e IgE y sus subtipos, esto es, IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4 humanos y IgGl, IgG2a, IgG2b y IgG3 de ratón. Los anticuerpos monoclonales también se proponen incluir fragmentos de anticuerpos tales como Fv, Fab y F(ab')2; anticuerpos híbridos bifuncionales (por ejemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol . 17:105, 1987), anticuerpos de una sola cadena (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988); y anticuerpos con regiones constantes alteradas (por ejemplo, patente estadounidense No. 5,624,821). Los anticuerpos monoclonales pueden ser de origen animal (por ejemplo, ratón, rata, hámster o pollo) o pueden ser diseñados genéticamente. Los anticuerpos monoclonales de roedor son fabricados mediante métodos estándar bien conocidos en el arte, que comprendes inmunización múltiple con HGF en adyuvante i.p. apropiado, i.v. o al cuarto trasero, seguido por extracción de células de bazo o células de nodo linfático y fusión con una línea celular inmortalizada apropiada y luego selección de hibridomas que producen enlace de anticuerpo a HGF, por ejemplo, véase bajo la sección de ejemplos. Los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, elaborados mediante métodos conocidos en arte mencionados supra, son usados en modalidades preferidas de la invención. Los anticuerpos humanos elaborados, por ejemplo, mediante despliegue de fago o métodos de ratón transgénicos son también preferidos (véase por ejemplo, Dower et al., McCafferty et al., Winter, Lonberg et al., Kucherlapati, supra). Más en general, anticuerpos de inmunogenicidad reducida, semejantes a humanos y diseñados genéticamente como se define en la presente son todos preferidos . El anticuerpo monoclonal anti-HGF neutralizante L2G7 (depositado a la American Type Culture Collection bajo el número de ATCC PTA-5162 de acuerdo con el tratado de Budapest) es un ejemplo preferido de un anticuerpo monoclonal para uso en la invención. El depósito será mantenido en un depósito autorizado y reemplazado en el caso de mutación, no biodisponibilidad o destrucción por un período de por lo menos cinco años después de la petición más reciente por liberación de una muestra fue recibida por el depósito, por un período de por lo menos treinta años después de la fecha de depósito o durante la vida aplicable de la patente relacionada, en período que sea más largo. Todas las restricciones en cuanto a la disponibilidad al público de estas líneas celulares serán removidas irrevocablemente después de la expedición de una patente de la solicitud. Los anticuerpos monoclonales neutralizantes con el mismo epítopo o epítopo traslapante como L2G7 proporcionan otros ejemplos. Variantes de L2G7 tales como una forma quimérica o humanizada de L2G7 son especialmente preferidas. Un anticuerpo monoclonal que compite con L2G7 por el enlace a HGF y neutraliza HGF en análisis in vitro o in vivo descritos en la presente es también preferido. Otras variantes de L2G7 tales como anticuerpos monoclonales que son 90%, 95% o 99% idénticos a L2G7 en secuencia de aminoácidos de región variable (por ejemplo, cuando son alineados por el Sistema de numeración de Kabat; Kabat et al., op. cit)., por lo menos en las CDR y mantiene su propiedades funcionales o que difieren de la misma por número pequeño de sustituciones de aminoácido inconsecuenciales funcionalmente (por ejemplo, sustituciones conservadoras) , cancelaciones o inserciones pueden también ser usados en la invención. Otros anticuerpos monoclonales preferidos incluyen anticuerpos monoclonales semejantes a humanos, de inmunogenicidad reducida y diseñados genéticamente como se define en la presente. Cualesquier sustituciones de aminoácido de inmunoglobulinas ejemplificadas son preferiblemente sustituciones de aminoácido conservadoras. Por propósitos de clasificar sustituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos pueden ser agrupados como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofílicas neutras) : cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales acidas) : asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas) : asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influencian la orientación de cadena) : gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras involucran sustituciones entre aminoácidos en la misma Clase. Las sustituciones no conservadoras constituyen intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de otra . Todavía otros anticuerpos menos preferidos para uso en la presente invención incluyen todos los anticuerpos menos anti-HGF descritos en US 2005/0019327 Al o WO 2005/017107 A2 , ya sea explícitamente por nombre o secuencia o implícitamente por descripción o relación con anticuerpos monoclonales descritos explícitamente (ambas solicitudes citadas son incorporadas en la presente por referencia por su revelación de anticuerpos y todos los otro propósitos) . Anticuerpos menos especialmente preferidos son aquellos producidos por los hibridomas designados en la presente como 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 y 3.10.1 y definido respectivamente por sus secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera proporcionadas por SEQ ID Nos. 24-43 de WO2005/017107 A2 ; los anticuerpos monoclonales que poseen las mismas CDR respectivas como cualquiera de estos anticuerpos monoclonales enlistados; anticuerpos monoclonales que tienen regiones variables de cadena ligera y cadena pesada que son por lo menos 90%, 95% o 99% idénticas a las regiones variables respectivas de estos anticuerpos monoclonales enlistados o que difieren de ellos solamente por sustituciones de aminoácido inconsecueciales, cancelación o inserciones; anticuerpos monoclonales que se enlazan al mismo epítopo de HGF como cualquiera de estos anticuerpos monoclonales enlistados y todos los anticuerpos monoclonales abarcados por las reivindicaciones 1 a 94 en la misma. Las identidades de secuencia son determinadas entre secuencias de región variable de inmunoglobulina alineadas utilizando la convención de numeración de Kabat .

En otras modalidades, un anticuerpo monoclonal para uso en la invención, esto es, para tratamiento de un tumor de cerebro mediante administración sistémica del anticuerpo monoclonal, se enlaza a uno o más de los siguientes factores de crecimiento: factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF) ; una neurotrofina tal como factor de crecimiento de nervio (NGF) , factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) o NT-3; un factor de crecimiento transformante tal como TGF-alfa o TGF-beta (TGF-ßl y/o TGF-ß2) ; factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) ; factor de crecimiento epidérmico (EGF) ; heregulina; epiregulina; enfiregulina; una neuregulina (NRG-la. y/o NRG-l , NRG-2a y/o NRG-2 ß , NRG-3 ó NRG-4) , factor de crecimiento semejante a insulina (IGF-1 y IGF-2) ; o en una modalidad preferida un factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) especialmente FGF ácido (FGF-1) o más preferiblemente FGF básico (FGF-2) , pero alternativamente FGF-n, en donde n es cualquier número de 3 a 23. En general, tal anticuerpo monoclonal es neutralizante. En todavía otras modalidades, el anticuerpo monoclonal para uso en la invención se enlaza a un receptor celular para cualquiera de uno o más de los factores de crecimiento mencionados anteriormente. Los anticuerpos monoclonales naturales para uso en la invención pueden ser producidos a partir de sus hibridomas. Los anticuerpos monoclonales diseñados genéticamente, por ejemplo, anticuerpos menos quiméricos o humanizados, pueden ser expresados mediante una variedad de métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, genes que codifican sus regiones de cadena V ligera y pesada pueden ser sintetizado a partir de oligonucleótidos trasplantes e insertados conjuntamente con regiones C disponibles a vectores de expresión (por ejemplo, disponibles comercialmente de Invitrogen) que proporcionan las regiones reguladoras necesarias, por ejemplo promotores, mejoradores, sitios poly A, etc. El uso del promotor-mej orador de CMV es preferido. Luego los vectores de expresión pueden ser transfectado utilizando varios métodos bien conocidos tales como lipofección o electroporación a una variedad de líneas celulares mamíferas tales como CHO o mielomas no productoras que incluyen Sp2/0 y NSO y células que expresan los anticuerpos seleccionados mediante selección de antibióticos apropiada. Véase, por ejemplo, patente estadounidense No. 5,530,101. Cantidades más grandes de anticuerpos pueden ser producidas al cultivar las células en bioreactores disponibles comercialmente. Una vez expresados, los anticuerpos monoclonales u otros anticuerpos para uso en la invención pueden ser purificados de acuerdo con procedimientos estándar del arte tales como microfiltración, ultrafiltración, cromatografía de afinidad de proteína A o G, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico y/u otra formas de cromatografía de afinidad a base de tintes orgánicos o los semejantes. Los anticuerpos sustancialmente puros de por lo menos aproximadamente 90 ó 95% de homogeneidad son preferidos y 98% o 99% o más homogeneidad más preferido, para usos farmacéuticos . 3. Métodos Terapéuticos En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un método de tratamiento con una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal descrito en la presente. Formulaciones farmacéuticas de los anticuerpos contienen el anticuerpo monoclonal en un portador aceptable fisiológicamente, opcionalmente con excipientes o estabilizadores, en la forma de soluciones liofilizadas o acuosas. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato o acetato a un pH comúnmente de 5.0 a 8.0, más frecuentemente 6.0 a 7.0; sales tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, etc. para fabricar isotónicas; antioxidantes, conservadores, polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas, polímeros hidrofílicos tales como polysorbate 80, aminoácidos, carbohidratos, agentes quelantes, azúcares y otros ingredientes estándares conocidos para aquellos experimentados en el arte (Remington's Pharmaceutical Science 16a edición, Osol, A. Ed. 1980). El anticuerpo está comúnmente presente a una concentración de 1 - 100 mg/ml, por ejemplo, 10 mg/ml. El anticuerpo monoclonal puede también estar encapsulado en agentes portadores tales como liposomas. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un método de tratamiento de un paciente con un tumor de cerebro mediante administración sistémica de un anticuerpo monoclonal, tal como anticuerpo monoclonal anti-HGF neutralizante o un anticuerpo contra una citocina o su receptor. El paciente es preferiblemente humano pero puede ser cualquier mamífero. Administración sistémica significa una ruta de administración en la cual el anticuerpo monoclonal tiene acceso general al sistema circulatorio y por consiguiente a los órganos del cuerpo, en los que se incluyen los vasos sanguíneos del cerebro. En otras palabras, el anticuerpo monoclonal es administrado en el lado periférico de la barrera de sangre-cerebro. Ejemplos de administración sistémica incluyen infusión intravenosa o inyección de bolo o intramuscular o subcutánea o intraperitonealmente. Sin embargo, la administración sistémica no abarca inyección directamente al tumor o a un órgano tal como el cerebro o sus membranas circundantes o fluido cerebrospinal . La intravenosa infusión puede ser dada en tanto como 15 minutos, pero más frecuentemente por 30 minutos o durante 1, 2, 3 o aún 4 o más horas. La dosis dada es suficiente para curar, para aliviar por lo menos parcialmente o inhibir el desarrollo adicional de la condición que es tratada ("dosis terapéuticamente efectiva"). Una dosis terapéuticamente efectiva preferiblemente provoca la regresión o más preferiblemente eliminación del tumor. Una dosificación terapéuticamente efectiva es usualmente de 0.1 a 5 mg/Kg de peso corporal, por ejemplo 1, 2, 3 ó 4 mg/Kg, pero puede ser tan alta como 10 mg/Kg o aún 15 ó 20 mg/Kg. Una dosis unitaria fija puede también ser dada, por ejemplo, 50, 100, 200, 500 ó 1000 mg o la dosis puede estar basada en el área superficial de paciente, por ejemplo 100 mg/m2. Una dosificación terapéuticamente efectiva administrada a una frecuencia suficiente para curar, aliviar por lo menos parcialmente o inhibir el desarrollo adicional de la condición que es tratada es denominada como un régimen terapéuticamente efectivo. Tal régimen provoca preferiblemente la regresión o más preferiblemente eliminación del tumor. Usualmente entre 1 y 8 dosis, (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) son administrados para tratar el cáncer, pero 10, 20 o más dosis pueden ser dadas. El anticuerpo monoclonal puede ser administrado diariamente, bisemanalmente, semanalmente, una semana si y otra no, mensualmente o algún otro intervalo, dependiendo, por ejemplo de la vida media del anticuerpo monoclonal, por 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 3-6 meses o más. Cursos repetidos de tratamiento son también posibles, como es la administración crónica. Los métodos de esta invención, por ejemplo, administración sistémica de un anticuerpo monoclonal tal como anticuerpo monoclonal anti-HGF, especialmente L2G7 y sus variantes en los que se incluyen L2G7 humanizado, pueden ser usados para tratar todos los tumores de cerebro en los que se incluyen meningiomas; gliomas en los que se incluyen ependimomas, oligodendrogliomas y todos los tipos de astrcitomas (bajo grado, anaplásico o glioblastoma multiforme o simplemente glioblastoma) ; medulablastomas, gangliogliomas, schwannomas, cordomas; y tumores de cerebro principalmente de niños en los que se incluyen tumores neuroectodérmicos primitivos. Tanto tumores de cerebro primarios (esto es, que surgen en el cerebro) y tumores de cerebro secundarios o metastáticos pueden ser tratados mediante los métodos de la invención. Los tumores de cerebro que expresan Met y/o HGF, especialmente a niveles elevados, son particularmente apropiados para tratamiento mediante administración sistémica de un anticuerpo anti-HGF nautralizante tal como L2G7 o sus variantes . En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal es administrado conjuntamente en combinación con (esto es, antes, durante o después) otra terapia anti-cáncer. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal, por ejemplo, un anticuerpo m anti-HGF tal como L2G7 y sus variantes, puede ser administrado conjuntamente con uno o más de los otros fármacos quimioterapéuticos conocidos para aquellos de habilidad en el arte de oncología, por ejemplo agentes alquilantes tales como carmustina, clorambucilo, cisplatina, carboplatina, oxiplatina, procarbazina y ciclofosfamida; antimetabolitos tales como fluorouracilo, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, metotrexate e hidroxiurea; productos naturales en los que se incluyen alcaloides de planta y antibióticos tales como bleomicina, doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, etopósido, mitomicina, mitoxantrona, vinblastina, vincristina y taxol (paclitaxel) o compuestos relacionados tales como Taxotere®; agentes aprobados específicamente para tumores de cerebro en los que se incluyen temozolomida y plaqueta de Gliadel® que contiene carmustina; y otros fármacos en los que se incluyen irinotecana y Gleevec® y todos los agentes anti-cáncer aprobados y experimentales enlistados en WO 2005/017107 A2 (que es incorporado en la presente por referencia) . El anticuerpo monoclonal puede ser administrado en combinación con 1, 2, 3 o más de estos agentes, por ejemplo, en un régimen quimioterapéutico estándar. Otros agentes con los cuales un anticuerpo monoclonal anti-HGF puede ser administrado incluyen biológicos tales como anticuerpos monoclonales, en los que se incluyen Herceptina™ contra el antígeno HER2 , Avastin™ contra VEGF, anticuerpos al receptor de EGF tales como Erbitux® o un anticuerpo monoclonal anti-FGF, también como fármacos anti-angiogénicos de molécula pequeña o antagonistas de receptor de EGF tales como Iressa® y Tarceva® . Además, el anticuerpo monoclonal puede ser administrado junto con cualquier forma de terapia de radiación en las que se incluyen radiación de haz externo, terapia de radiación de intensidad modulada (IMRT) y cualquier forma de radiocirugía en las que se incluyen Gamma Knife, Cyberknife, Linac y radiación intersticial (por ejemplo, semillas radioactivas implantadas, globo de GliaSite) . Aunque en una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo monoclonal no está enlazado o conjugado a algún otro agente, en otras modalidades el anticuerpo monoclonal puede ser conjugado a un radioisótopo, fármaco o profármaco quimioterapéutico o una toxina. Por ejemplo, puede ser enlazado a un radioisótopo que emite rayos alfa, beta y/o gamma, por ejemplo, 90Y, isótopos de yodo tales como 1311 o isótopos de bismuto tales como 212BÍ o 214BÍ; a una toxina de proteína de planta o bacteriana tal como exotoxina de ricina o pseudomonas o sus fragmentos tales como PE40; a una toxina de molécula pequeña tales como compuestos relacionados con o derivados de calicheamicina, auristatina o maitansina; o a un fármaco quimioterapéutico tal como doxorubina o cualquiera de los otros fármaco quimioterapéuticos enlistados anteriores. Métodos de enlace de tales agentes a un anticuerpo monoclonal son bien conocidos para aquellos experimentados en el arte. La administración sistémica de un anticuerpo monoclonal, por ejemplo un anticuerpo monoclonal anti-HGF neutralizante tal como L2G7 o sus variantes, opcionalmente más otro tratamiento (por ejemplo, quimioterapia o terapia de radiación) , puede incrementar la supervivencia libre de avance medio o tiempo de sobrevivencia global de pacientes con ciertos tumores de cerebro (por ejemplo, glioblastomas) mediante por lo menos 30% o 40%, pero preferiblemente 50%, 60% a 70% o aún 100% o más largo, en comparación con un régimen de control sin la administración del anticuerpo monoclonal. Si la administración del anticuerpo monoclonal anti-HGF es acompañada por otro tratamiento tal como quimioterapia o radiación, el otro tratamiento es también incluido en el régimen de control. Si el anticuerpo monoclonal anti-HGF mAb es administrado sin otro tratamiento, el régimen de control es un placebo o tratamiento no específico. Además o alternativamente, la administración sistémica de un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-HGF neutralizante tal como L2G7 o sus variantes, más otro tratamiento (por ejemplo, quimioterapia o terapia de radiación) , puede incrementar la proporción de respuesta completa (regresión completa del tumor, esto es remisión) , proporción de respuesta parcial (una respuesta parcial en un paciente significa encogimiento parcial del tamaño del tumor, por ejemplo por al menos 30% o 50%) o proporción de respuesta objetivo (completa + parcial) de pacientes con ciertos tumores de cerebro por lo menos 30% o 40% de los pacientes pero preferiblemente 50%, 60% a 70% o aún 90% o más en comparación con un régimen de control sin la administración del anticuerpo monoclonal como se describe anteriormente. Los cambios en el tamaño de un tumor en respuesta al tratamiento pueden ser determinados mediante MRI, exploración de CT y los semejantes. Similarmente, cuando son administrados sistémicamente a animales (por ejemplo ratones inmunodeficientes tales como ratones desnudos o ratones SCID) que llevan xenoinjertos intracraneales de tumores de glioma humanos, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2 a continuación, el anticuerpo monoclonal anti-HGF neutralizante o anticuerpo monoclonal anti -FGF u otro anticuerpo monoclonal prolongar la supervivencia media de los animales por al menos 25 ó 30 ó 40 días, pero preferiblemente 50, 60 ó 70 días o aún más tiempo y tal extensión será estadísticamente significativa. Esto será cierto aún si el inicio del tratamiento es retardado hasta por lo menos 5 ó 18 días o más después de la implantación de la célula de tumor. Además, tal tratamiento en promedio encogerá los tumores por el menos 25% pero preferiblemente 50% o aún 75%; y el volumen de tumor promedio en los animales tratados con el anticuerpo monoclonal será menor de 50% o aún 25% o 10% del volumen de tumor promedio en los animales tratados por control . El tamaño de tumor será comúnmente medido 21 ó 29 días después del implante de célula de tumor. Comúnmente, en un estudio clínico (por ejemplo, estudio de fase II, fase II/III o fase III), los incrementos mencionados anteriormente en proporción de sobrevivencia y/o respuesta libre de avance medio de los pacientes tratados mediante la administración de un anticuerpo monoclonal, por ejemplo un anticuerpo monoclonal anti-HGF, opcionalmente más otro tratamiento en relación con los paciente que reciben un régimen de control sin el anticuerpo, son estadísticamente significativas, por ejemplo a la p = 0.05 ó 0.01 o aún a nivel de 0.001. Las proporciones respuesta completa y parcial son determinadas mediante criterios objetivos usados comúnmente en pruebas clínicas para cáncer, por ejemplo como se enlista o está aceptado por el Instituto Nacional de Cáncer y/o Administración de Alimentos y Fármacos.

EJEMPLOS 1. Generación y de propiedades in vitro de anticuerpos m anti-HGF El desarrollo de un anticuerpo monoclonal anti-HGF plenamente neutralizante L2G7 se ha descrito en la solicitud de patente estadounidense publicada No. US 2005/0019327 Al, que es incorporada en la presente por referencia. En resumen, ratones Balb/c fueron inmunizados extensamente con HGF humano recombinante mediante inyecciones en cuartos traseros y se generaron hibridomas a partir de ellos mediante medios convencionales. Proteínas de fusión quiméricas que consisten de HGF fusionadas a péptido de Flag (HGF-Flag) y el dominio extracelular de Met fusionado a la región Fc de IgGl humano (Met-Fc) , fueron producidas mediante técnicas recombinantes convencionales y usadas para determinar la habilidad de los anticuerpos monoclonales anti-HGF para inhibir el enlace de HGF a su receptor de Met. La figura la demuestra la habilidad de tres anticuerpos monoclonales anti-HGF separados, cada uno reconocen un epítopo diferente para capturar HGF en solución. Aunque el anticuerpo monoclonal IgG2a L2G7 tiene afinidad intermedia por HGF tal como se juzga por la habilidad de enlace, es el único anticuerpo monoclonal identificado que bloque completamente el enlace de HGF-Flag a Met-Fc en un ELISA (figura lb) . El anticuerpo monoclonal L2G7 es específico por HGF, como se demuestra al no enlazarse a otros factores de crecimiento tales como VEGF, FGF o EGF. La habilidad del anticuerpo monoclonal L2G7 para bloquear el enlace de HGF a Met sugiere que inhibiría todas las respuestas celulares inducidas por HGF, pero esta suposición requiere verificación debido a que las subunidades a y ß de HGF moderan actividades diferentes (Lokker et al., EMBO J. 11: 2503, 1992; Hartmann et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 11574, 1992). Una bioactividad importante de HGF moderada por medio de su subunidad a , del cual su nombre alternativo "factor de dispersión" se deriva, es la capacidad para inducir dispersión celular. La figura 2a muestra que L2G7 es apto para inhibir completamente la dispersión inducida por HGF de células epiteliales MDCK, un análisis biológico usado ampliamente para cuantificar la actividad de dispersión de HGF. Una actividad biológica clave de HGF moderada por medio de su subunidad ß es mitogénesis de ciertos tipos de células. La figura 2b muestra que L2G7 a una proporción molar 1:1 de anticuerpo monoclonal a HGF inhibe completamente la incorporación de 3H-timidina inducida por HGF en células epiteliales de pulmón de mink Mv 1 Lu. Así, el anticuerpo monoclonal L2G7 bloquea las actividades biológicas inducidas por HGF atribuibles a ambas de las subunidades de HGF a y ß. La angiogénesis es requerida para el crecimiento de tumores sólidos. HGF es un factor angiogénico potente (Grant et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 1937, 1993) y los niveles de tumor de HGF se correlacionan con la densidad vascular de malignidades humanas en las que se incluyen gliomas (Schmidt, et al. Int. J. Cáncer 84: 10, 1999). HGF puede también estimular la producción de otros factores angiogénicos tales como VEGF y puede potenciar la angiogénesis inducida por VEGF (Xin et al. Am. J. Pathol. 158, 1111, 2001). Dos etapas prematuras involucradas en la angiogénesis son la proliferación de célula endotelial y formación de túbulo. El efecto de L2G7 sobre la proliferación inducida por HGF de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y formación de túbulos semejantes a bazo en geles de colágeno tridimensional fue por consiguiente determinada. La estimulación de proliferación de HUVEC mediante HGF (50 ng/ml, 72 horas) fue completamente inhibida por L2G7 a una proporción molar de 1.5:1 de anticuerpo monoclonal a HGF (figura 2c) . HUVEC suspendidos en geles de colágeno 3-D desarrollaron una red de túbulo de ramificación interconectada después de estimulación con HGF (200 ng/ml, 48 horas) , en tanto que las células tratadas con HGF más L2G7 mostraron poca o ninguna de tal formación de túbulo (figura 2d) . De aquí, L2G7 bloquea los aspectos proliferativos inducidos para HGF y aspectos morfogénicos de la angiogénesis . HGF protege a las células de tumor de la muerte apoptótica inducida por numerosas modalidades en las que se incluyen agentes dañinos de 7ADN usados común en terapia de cáncer (Bowers et al. Cáncer Res. 60: 4277, 2000; Fan et al. Oncogene 24: 1749, 2005) . La mayoría de células de glioma malignos humanos expresan el receptor de muerte FAS, haciéndolas susceptibles a apóptosis inducida por anticuerpo anti-FAS in vitro (Weller et al. J. Clin. Invest. 94: 954, 1994) . Así, los efectos de L2G7 sobre la citoprotección moderada por HGF de células de glioma U87 tratadas con anticuerpo monoclonal anti-FAS apopotótico CH-11 fue determinado. La viabilidad de célula de U87 después de tratamiento con CH-11 (24 horas) fue reducida a -45% de aquella en controles sin tratar, un efecto que fue completamente invertido mediante pre-incubación de células con HGF de un anticuerpo de control de isotipo irrelevante pero no por HGF en presencia de L2G7 (figura 2e) . 2. Efectos de un anticuerpo monoclonal anti-HGF en modelos de tumor de xenoinjerto de glioma La habilidad de L2G7 para bloquear múltiples actividades promotoras de tumor de HGF sugirieron que este anticuerpo monoclonal tendría actividad anti-tumor contra por lo menos tumores humanos HGF+/Met+. La mayoría de gliomas parecen expresar Met y HGF (Rosen et al. Int. J. Cáncer 67: 248, 1996) . Para las líneas celulares de glioma U87 y U118, la expresión de Met fue confirmada mediante análisis citométrico de flujo y -20-35 ng/ml HGF en sobrenadantes de cultivos de confluente de 7 días utilizando un ELISA HGF-específico fue detectado. El efecto anti-tumor de L2G7 en modelos de ratón desnudos de xenoinjertos subcutáneos U118 y U87 preestablecidos fue determinado. L2G7 fue administrado i.p. dos veces a la semana después que los tamaños de tumor habían llegado a -50 mm3 como se describe (Kim et al., Nature 362: 841, 1993, que es incorporado en la presente por referencia) . A 100 µg (-5 mg/Kg) por inyección, L2G7 inhibió completamente el crecimiento de tumores U118 (figura 3a) . En modelo de xenoinjerto U87, ya sea 50 µg o 100 µg de L2G7 por inyección no solamente inhibió el crecimiento del tumor sino provocó realmente regresión del tumor (figura 3b) . El anticuerpo monoclonal de control (100 µg por inyección) solamente inhibió ligeramente el crecimiento de tumor en comparación con el control de PBS. L2G7 no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumor de glioma U251, que expresa Met pero no segrega HGF. Estos resultados in vivo demuestran que L2G7 como un solo agente impide el crecimiento de tumor al bloquear específicamente la actividad de HGF. Enseguida, la eficacia de L2G7 fue examinada en ratones que llevan xenoinjertos de glioma U87 intracraneales preestablecidos. Los ratones fueron implantados con células de glioma maligno humano U87 (100,000 células/animal) mediante inyección estereotáctica al caudato derecho/putamen. L2G7 (100 µg/inyección, i.p., dos veces a la semana) administrado desde el día de post-implante 5 al día 52 prolongó significativamente la sobrevivencia del animal (figura 3c) . En ratones de control, la supervivencia media fue de 39 días y todos los ratones murieron de tumores progresivos por el día 41. En contraste, todos los ratones tratados con L2G7 sobrevivieron al 70 y 80% sobrevivieron al día 90, siete semanas después de cese del tratamiento del anticuerpo monoclonal (figura 3c) . En los ratones sacrificados, en el día 21 después de tres dosis de L2G7, los tumores de control fueron más de 10 veces más grandes que los tumores tratados con L2G7 (6.6 + 2.7 mm3 vs . 0.54 + 0.17 mm3) (figura 3d) . Para probar la eficacia del anticuerpo monoclonal aún bajo condiciones más severas, en un inicio de experimento similar de tratamiento de L2G7 fue retardado hasta el día 18. Un subconjunto de ratones (n = 5 por grupo) fue sacrificado prematuramente en el curso del tratamiento y los volúmenes de tumor fueron cuantificados al medir las áreas de sección transversal de tumor de secciones de cerebro teñidas con H&E utilizando análisis de imagen auxiliada por computadora. L2G7 indujo regresión de tumor sustancial (figura 3e,f). Específicamente, los volúmenes de tumor de pre-tratamiento en el día 18 fueron 26.7 + 2.5 mm3 (intervalo 19.5-54 mm3, media 27.9 mm3) . En el día 29, después de 3 dosis de L2G7, los tumores fueron de solamente 11.7 + 5.0 mm3 (intervalo 0-26.2 mm3, media 7.5 mm3) , de tal manera que los tumores habían realmente cedido o encogido de tamaño en promedio por 50% o más. Los volúmenes de tumor en el día 29 de ratones tratados con anticuerpo monoclonal de control de isotipo apareado fueron de 134.3 + 22.0 mm3 (intervalo 71.2-196.8 mm3, media 128 mm3) . De aquí, los tumores tratados con el anticuerpo monoclonal de control crecieron casi 5 veces con un volumen medio '12 veces más grande que los tumores tratados con L2G7.

En los ratones que no fueron sacrificados (n = 10 por grupo) , la supervivencia media en los ratones de control fue de 32 días y todos murieron al día 42, en tanto que ninguno de los ratones tratados con L2G7 murieron hasta el día 46 y L2G7 extendió la supervivencia media al día 61. Así, L2G7 indujo la regresión de tumor en ratones con cargas de tumor muy altas . Un análisis más detallado de secciones histológicas de tumores intracraneales fue efectuado para investigar mecanismos potenciales de los efectos anti-tumor de L2G7 (figura 4) . Enseguida de tres dosis de L2G7, la proliferación de célula de tumor (índice Ki-67) y angiogénesis (densidad de vasos, esto es, área de vasos de tumor teñidos con anti-laminina como por ciento de área de tumor) fue reducida por 51% y 62%, respectivamente, en tanto que el índice apoptótico de células de tumor cuantificadas por el número de células positivas de caspasa-3 activadas fue incrementada 6 veces. La regresión de tumor pronunciada que ocurrió pronto después del inicio de terapia de L2G7 es indicadora de una respuesta de muestra celular similar a aquella observada en xenoinjertos Coló 205 de tumor de colon humano tratados con un anticuerpo m receptor 4 anti-muerte (TRAILl) agonista (Chuntharapai et al. J. Immunol. 166: 4891, 2001).

Los resultados reportados en la presente son ejemplos sorprendentes de respuestas de tumor de cerebro de un anticuerpo monoclonal no enlazado a una toxina o radionúclido. Como comparación, en modelos de xenoinjerto subcutáneos el anticuerpo monoclonal murino anti-VEGF A4.6.1 , que fue más tarde inmunizado para crear el fármaco Avastin®, inhibió el crecimiento del glioma humano G55 por solamente -50-60% (Kim et al., Nature 362: 841, 1993), contrastó con la inhibición de crecimiento esencialmente completa de los gliomas U87 y U118 por el anticuerpo monoclonal L2G7. En un modelo de tumor intracraneal ortotópico, el anticuerpo monoclonal anti-VEGF sistémico administrado simultáneamente con implante de célula de glioma G55 prolongó la supervivencia del animal por solamente 2-3 semanas (Rubenstein et al. Neoplasia 2: 306, 2000). Similarmente, la administración sistémica de un anticuerpo monoclonal a una variante del receptor de EGF prolongó la supervivencia media de ratones con xenoinjertos intracraneales de células de glioma transfectadas con el receptor de EGF variante, en general modestamente (de 13 a 21 días o de 13 a 19 días, pero no en caso de 19 días a 58 días; Mishima et al., Cáncer Res. 61: 4349, 2001). Sin embargo, estos efectos modestos fueron obtenidos cuando la administración del anticuerpo monoclonal comenzó simultáneamente con o brevemente después de la implantación del xenoinjerto y de aquí fue provocada probablemente, por lo menos en parte, al retardar el inicio de la vascularización del xenoinjerto, un evento que no puede ser apuntado en pacientes con tumores de cerebro preexistentes. En contraste, la administración sistémica del anticuerpo monoclonal anti-HGF L2G7 prolongó la sobrevivencia y provocó la regresión del tumor aún cuando es administrado el día 5 o aún día 18 después del implante cuando los tumores estaban bien establecidos y así corresponde a la situación en pacientes humanos. Los efectos anti-tumor pronunciados del anticuerpo monoclonal L2G7 son probablemente debidos a la propiedades multifuncionales únicas de su HGF objetivo molecular, esto es, mitogénico, angiogénico y citoprotector (Birchmeier et al. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 915, 2003; Trusolino et al. Nat. Rev. Cáncer 4: 289, 2002). La habilidad de L2G7 para inducir la regresión de glioma implica una respuesta de muerte celular que podría resultar en la apóptosis moderada por Fas, que es bloqueada el enlace de HGF a Met (Wang et al. Cell. 9: 411, 2002) o de la desactivación de las rutas citoprotectoras inducidas por HGF que involucran los intermediarios de fosfatidil inositol 3-cinasa, Akt y NFkappaB (Fan et al. Oncogene 24: 1749, 2005). La habilidad de L2G7 para bloquear los efectos citoprotectores y angiogénicos de HGF predice que L2G7 administrado sistémicamente potencia modalidades citotóxicas tales como radiación ? y quimioterapia usada actualmente para tratar tumores de cerebro malignos. Aunque la invención se ha sido descrito con referencia a las modalidades actualmente preferidas, se debe entender que varias modificaciones se pueden efectuar sin desviarse de la invención. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente son incorporadas por referencia en su totalidad para todos los propósitos a la misma extensión como si cada publicación individual, patente y solicitud de patente fuera indicada específica e individualmente para ser incorporada por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para el tratamiento de un tumor de cerebro en un paciente, caracterizado porque comprende administrar un anticuerpo monoclonal (mAb) a un paciente que tiene un tumor de cerebro y mediante esto tratar el tumor de cerebro.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es quimérico, humanizado o humano.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal anti-HGF neutralizante.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal L2G7 humanizado.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es administrado intravenosamente.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tumor del cerebro es un glioma.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el tumor de cerebro es un glioblastoma.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente es humano.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paciente es también tratado con terapia de radiación.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es administrado junto con uno o más otros fármacos anti-cáncer activos .
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se enlaza a un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste de: factor de crecimiento de célula endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento de nervio (NGF) , factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) , NT-3, factor de crecimiento transformante (TGF) -alfa (TGF-a), TGF-/31, TGF-.2, factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , heregulina, epiregulina, enfiregulina, neuregulina (NRG) -lalfa (NRG-lev) , NRG-lß, NRG-2o. , NRG-2ß, NRG-3, NRG-4, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF)-l (IGF-1) , IGF-2, factor de crecimiento de fibroblasto ácido (FGF) (FGF-1), FGF básico (FGF-2) y FGF-n, en donde n es cualquier número de 3 a 23.
12. 12. Un método para provocar la regresión de un tumor de cerebro en un paciente, caracterizado porque comprende administrar sistémicamente un anticuerpo monoclonal (mAb) a un paciente que tiene un tumor de cerebro y provocar mediante esto regresión del tumor de cerebro.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo monoclal es quimérico, humanizado o humano.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal anti-HGF neutralizante.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal L2G7 humanizado.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es administrado intravenosamente.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el tumor del cerebro es un glioma.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el tumor de cerebro es un glioblastoma.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el paciente es humano.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el paciente es también tratado con terapia de radiación.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es administrado junto con uno o más otros fármacos anti-cáncer activos .
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se enlaza a un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste de: factor de crecimiento de célula endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento de nervio (NGF) , factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) , NT-3, factor de crecimiento transformante (TGF) -alfa (TGF-a), TGF-/S1, TGF-/52, factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , heregulina, epiregulina, enfiregulina, neuregulina (NRG) -lalfa (NRG-lc.) , NRG-lß, NRG-2ot , NRG-2ß, NRG-3, NRG-4, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF) -1 (IGF-1) , IGF-2, factor de crecimiento de fibroblasto ácido (FGF) (FGF-1), FGF básico (FGF-2) y FGF-n, en donde n es cualquier número de 3 a
23. 23. 23. El anticuerpo anti-HGF neutralizante, caracterizado porque se usa en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de un tumor de cerebro mediante administración sistémica.