BRPI0712222B1

BRPI0712222B1 - Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (hgf), seu uso e método de produção, ácido nucléico, vetor de expressão, célula hospedeira, e métodos para produzir um polipeptídeo que compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e para produzir um polipeptídeo que compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina

Info

Publication number: BRPI0712222B1
Application number: BRPI0712222-5A
Authority: BR
Inventors: May Han; Christine Knuehl; Arnold Horwitz; Jeno Gyuris; William M. Winston; S. Kirk Wright; Lyne Breault; Jie Lin; Bijan Etemad-Gilbertson
Original assignee: Aveo Pharmaceuticals, Inc.; Xoma Technology Ltd
Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2007-06-01
Publication date: 2021-10-13
Also published as: JP5735476B2; EP2027156B9; MX2008014829A; IL195037A0; BRPI0712222A2; JP2009539347A; PL2027156T3; US20140178935A1; NO20085421L; US7943344B2; JP2013090632A; WO2007143090A3; CY1111714T1; AU2007254942A1; AR061171A1; AU2007254942A2; IL195037A; JP2011072318A; EP2027156B1; EP2361934A2

Abstract

proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (hgf), ácido nucléico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição compreendendo a referida proteína bem como seus usos. a presente invenção refere-se uma família de proteínas de ligação que se ligam e neutralizam a atividade do fator de crescimento de hepatócito (hgf), em particular, hgf humano. as proteínas de ligação podem ser usadas como agentes de diagnóstico ou terapêuticos. com relação a sua atividade terapêutica, as proteínas de ligação podem ser usadas para tratar certas desordens responsivas a hgf, por exemplo, certos tumores responsivos a hgf.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Esse pedido reivindica o benefício e prioridade dos Pedidos Provisórios US 60/810,714, depositado em 2 de junho de 2006 e US 60/860,509, depositado em 21 de novembro de 2006, cujas descrições estão incorporadas aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] O campo da invenção é de biologia molecular, imunologia e oncologia. Mais particularmente, o campo é de proteínas ligantes baseadas em anticorpo que se ligam ao fator de crescimento do hepatócito humano (HGF).

ANTECEDENTES

[0003] O Fator de Crescimento de Hepatócito (HGF), também conhecido como Fator de Dispersão (SF), é uma proteína heterodimérica multifuncional produzida predominantemente por células mesenquimais e é um efetor de células que expressam o receptor Met de tirosina quinase (Bottaro et al. (1991) SCIENCE 251: 802-804, Rubin et al. (1993) BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA 1155: 357-371). O receptor Met humano também é conhecido como "c-Met". HGF maduro contém duas cadeias de polipeptídeos, a cadeia α e a cadeia β. Estudos publicados sugerem que é a cadeia α que contem o domínio de ligação do receptor c-Met de HGF.

[0004] Quando se liga ao seu receptor cognato, HGF medeia várias atividades celulares. A via de sinalização HGF-Met desempenha um papel na regeneração hepática, cicatrização de lesão, regeneração neural, angiogênese e malignidades. Veja, por exemplo, Cao et al. (2001) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 98: 7443-7448, Burgess et al. (2006) CANCER RES. 66: 1721-1729, e Patentes US 5.997.868 e US 5.707.624. Pesquisadores têm desenvolvido vários moduladores de HGF, incluindo anticorpos para tratar vá-rias desordens que envolvem atividade de HGF, por exemplo, certos cânceres responsivos a HGF. Veja, por exemplo, Publicação de Pedido Internacional N° WO 2005/017107.

[0005] A estrutura básica comum para todos os anticorpos é mostrada esquematicamente na Figura 1. Anticorpos são proteínas multiméricas que contêm quatro cadeias de polipeptídeos. Duas das cadeias de polipeptídeo são chamadas de cadeias pesadas ou H e duas das cadeias de polipeptídeos são chamadas de cadeias leves ou L. As cadeias pesada e leve de imunoglobulina são conectadas por uma ligação de dissulfeto entre as cadeias. As cadeias pesadas de imunoglobulina são conectadas por várias pontes de dissulfeto entre as cadeias. Uma cadeia leve é composta de uma região variável (VL na Figura 1) e uma região constante (CL na Figura 1), enquanto que a cadeia pesada é composta de uma região variável (VH na Figura 1) e pelo menos três regiões constantes (CH1, CH2 e CH3 na Figura 1). As regiões variáveis determinam a especificidade do anticorpo e as regiões constantes têm outras funções.

[0006] A informação estrutural e dos aminoácidos indica que cada região variável compreende três regiões hipervariáveis (também conhecidas como regiões de determinação de complementaridade ou CDRs) flanqueadas por quatro regiões de arcabouço relativamente conservadas ou FRs. As três CDRs, referidas como CDR1, CDR2, e CDR3, são responsáveis pela especificidade de ligação de anticorpos individuais. Quando os anticorpos são para serem usados como agentes de diagnóstico e terapêuticos, tipicamente é desejável criar anticorpos que tem a maior especificidade de ligação e afinidade com a molécula alvo. Acredita-se que diferenças nas regiões variáveis possam ter efeitos profundos sobre a especificidade e a afinidade do anticorpo.

[0007] Patente US 5.707.624 descreve o uso de anticorpos anti- HGF no tratamento do sarcoma de Kaposi. Similarmente, a Patente US 5.997.868 descreve o tratamento de um tumor pela administração de um anticorpo anti-HGF ao paciente a ser tratado a fim de bloquear a habilidade de HGF endógeno de promover angiogênese no tumor. Mais recentemente, pesquisadores propuseram que anticorpos que se ligam a cadeia β de HGF podem ter potencial como agentes terapêuticos em pacientes com tumores dependentes de HGF (Burgess (2006) supra).

[0008] Apesar disso, ainda há uma necessidade de moduladores adicionais de HGF que possam ser usados como agente terapêutico e diagnóstico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A invenção é baseada, em parte, na constatação de uma família de proteínas de ligação que se ligam especificamente a HGF, em particular, a HGF humano. As proteínas de ligação são baseadas em anticorpo à medida que elas contêm sítios de ligação de antígeno (isto é, HGF) baseados nas CDRs de uma família de anticorpos que se ligam especificamente a HGF. As proteínas de ligação podem ser usadas como agentes de diagnóstico e terapêuticos. Quando usadas como agente terapêutico, as proteínas de ligação são manipuladas (por exemplo, humanizadas) a fim de reduzir ou eliminar o risco de indução de resposta imune contra a proteína de ligação quando administrada ao receptor (por exemplo, um ser humano).

[00010] As proteínas de ligação neutralizam a atividade de HGF e, portanto, podem ser usadas como um agente terapêutico. Em certas modalidades, as proteínas de ligação impedem que HGF se ligue ao seu receptor cognato, c-Met, neutralizando dessa forma a atividade de HGF. Em outras modalidades, as proteínas de ligação se ligam a HGF e neutralizam sua atividade biológica, mas sem evitar que HGF se ligue ao receptor c-Met. Como HGF tem sido implicado no crescimento e proliferação de células cancerosas, as proteínas de ligação podem ser usadas para inibir a proliferação de células cancerosas. Além disso, quando administradas a um mamífero, as proteínas de ligação podem inibir ou reduzir o crescimento do tumor no mamífero.

[00011] Esses e outros aspectos e vantagens da invenção se tornarão claros após a consideração das seguintes figuras, descrição detalhada e reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00012] A invenção pode ser mais completamente compreendida com referência as seguintes figuras.

[00013] Figura 1 é uma representação esquemática de um anticorpo típico.

[00014] Figura 2 é um diagrama esquemático mostrando a sequência de aminoácidos que define a região variável da cadeia pesada da imunoglobulina completa dos anticorpos indicados como 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 e 3D11. As sequências de aminoácidos de cada anticorpo estão alinhadas uma contra outra e as regiões que definem o peptídeo de sinal, CDR1, CDR2, e CDR3 estão identificadas em retângulos. As sequências fora dos retângulos representam sequências de FR.

[00015] Figura 3 é um diagrama esquemático que mostra as sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cada uma das sequências da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina apresentadas na Figura 2.

[00016] Figura 4 é um diagrama esquemático que mostra a sequência de aminoácidos que define a região variável da cadeia leve de imunoglobulina completa dos anticorpos 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6, e 3D11. As sequências de aminoácidos de cada anticorpo estão alinhadas uma contra outra e as regiões que definem o peptídeo de sinal, CDR1, CDR2, e CDR3 estão identificadas em retângulos. As sequências fora dos retângulos representam sequências FR.

[00017] Figura 5 é um diagrama esquemático que mostra as sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cada uma das sequências da região variável da cadeia leve de imunoglobulina apresentadas na Figura 4.

[00018] Figura 6 é um gráfico que resume os resultados de um experimento para medir a atividade inibitória de tumor de anticorpos anti-HGF 1D3, 1F3, 1A3 e 2B8 em um modelo de xenoenxerto de U87MG. Losangos correspondem a PBS; triângulos correspondem ao anticorpo 1A3 anti-HGF; X corresponde ao anticorpo 1D3 anti-HGF; quadrados correspondem ao anticorpo 1F3 anti-HGF e círculos correspondem ao anticorpo 2B8 anti-HGF.

[00019] Figura 7 é um gráfico que resume os resultados de um experimento para medir a atividade inibitória de tumor de anticorpos anti-HGF 1D3, 1F3, 1A3 e 2B8 em um modelo de xenoenxerto de U118. Losangos correspondem a IgG; quadrados correspondem ao anticorpo 1F3 anti-HGF, triângulos ao anticorpo 1D3 anti-HGF; X corresponde ao anticorpo 1A3 anti-HGF; e círculos correspondem ao anticorpo 2B8 anti-HGF.

[00020] Figura 8 é uma tabela que resume os dados de ressonância de plásmon de superfície sobre a afinidade de ligação ao antígeno e a cinética de interação entre HGF humano e anticorpos 2B8 quimérico, quimérico/humanizado ou humanizado. A tabela lista os pares de cadeia leve Capa e cadeia pesada de IgG1 testados. Aqueles anticorpos com desvios-padrão (STDEV) listados foram analisados em três experimentos independentes.

[00021] Figura 9 é um gráfico de barras que resume dados experimentais que indicam que Hu2B8 se liga a um epítopo mutuamente exclusivo para o anticorpo monoclonal 2B8 de murino. 2B8 humanizado ou quimérico foi capturado sobre um chip de Fc anti- humano. Então, HGF estava ligado a 2B8 quimérico ou humanizado. A habilidade de 2B8 de camundongo ou do anticorpo de controle (anticorpo policlonal anti-HGF de cabra) se ligar a HGF capturado foi medida. Ambos os anticorpos 2B8 humanizado e 2B8 quimérico impedem que 2B8 de murino se ligue a HGF. As barras brancas correspondem ao anticorpo 2B8 quimérico; as barras cinzas correspondem ao anticorpo Hu2B8 humanizado (região variável capa Kv 1-39.1 e região variável de cadeia pesada Hv5-51.1); as barras pretas correspondem ao anticorpo Hu2B8 humanizado (região variável capa Kv 3-15.1 e região variável de cadeia pesada Hv5-51.1).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00022] A invenção é baseada, em parte, na contatação de uma família de proteínas de ligação que se ligam especificamente e neutralizam a atividade de HGF, em particular, HGF humano. As proteínas de ligação podem ser usadas em uma variedade de aplicações de diagnóstico e terapêuticas. As proteínas de ligação são baseadas nos sítios de ligação a antígeno de certos anticorpos monoclonais que foram selecionados por sua habilidade de se ligar e neutralizar a atividade de HGF. Em particular, as proteínas de ligação contêm sequências de região variável de CDR de imunoglobulina que juntas definem um sítio de ligação para HGF.

[00023] Em vista da atividade neutralizante desses anticorpos, eles são particularmente úteis em modular o crescimento e/ou proliferação de células responsivas a HGF, por exemplo, células cancerosas. Quando usadas como um agente terapêutico, as proteínas de ligação podem ser manipuladas a fim de minimizar ou eliminar o risco de indução de resposta imune contra a proteína de ligação quando administrada ao receptor. Além disso, dependendo da aplicação particular, considera-se que as proteínas de ligação podem ser conjugadas com outras porções, por exemplo, marcadores detectáveis, por exemplo, radiomarcadores e moléculas efetoras, por exemplo, outra proteína e terapêuticos baseados em moléculas pequenas. Cada uma dessas características e aspectos da invenção é discutida em mais detalhes abaixo.

I - Proteínas de Ligação que se Ligam a HGF

[00024] Em um aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDR L1-CDR L2-CDR L3 e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende três regiões de determinação de complementaridade (CDRs), em que a região variável de cadeia leve de imunoglobulina e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para a ligação de HGF humano. CDRL1 compreende a sequência de aminoácidos X1 X2 Ser X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15, em que o aminoácido X1 é Arg, Lys, ou Ser, X2 é Ala ou Thr, X4 é Glu, Gln, ou Ser, X5 é Asn, Asp, ou Ser, X6 é Ile ou Val, X7 é Asp, Lys, Ser, Val, ou Tyr, X8 é uma ligação peptídica ou Tyr, X9 é uma ligação peptídica ou Asp, X10 é uma ligação peptídica ou Gly, X11 é uma ligação peptídica ou Asn, X12 é uma ligação peptídica, Ile, ou Ser, X13 é Asn ou Tyr, X14 é Ile, Leu, Met, ou Val, X15 é Ala, Asn, His, ou Ser. CDRL2 compreende a sequência de aminoácidos X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22, em que o aminoácido X16 é Ala, Asp, Arg, Gly, ou Val, X17 é Ala, Thr, ou Val, X18 é Asn, Ser, ou Thr, X19 é Arg, Asn, Lys, ou He, X20 é Leu ou Arg, X21 é Ala, Asn, Glu, Val, ou Pro, X22 é Asp, Ser, ou Thr. CDRL3 compreende a sequência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, em que o aminoácido X23 é Leu, Gly, ou Gln, X24 é His ou Gln, X25 é Phe, Ser, Trp, ou Tyr, X26 é Asp, Ile, Ser, Trp, ou Tyr, X27 é Gly, Glu, Asn, ou Ser, X28 é Asp, Asn, Phe, Thr, ou Tyr, X30 é Leu, Phe, Pro, ou Tyr.

[00025] Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano que compreende (i) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a estrutura CDR H1-CDR H2-CDR H3 e (ii) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende três regiões de determinação de complementaridade (CDRs), em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e a região variável de cadeia leve de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para a ligação de HGF humano. CDRH1 compreende a sequência de aminoácidos X1 Tyr X3 X4 X5 em que o aminoácido X1 é Asp, Asn, Ser, ou Thr, X3 é Phe, Ser, Trp, ou Tyr, X4 é Ile, Leu, ou Met, X5 é Asn, His, ou Ser. CDRH2 compreende a sequência de aminoácidos X6 Ile X8 X9 X10 X11 Gly X13 X14 X15 Tyr X17 X18 X19 X20 X21 X22, em que o aminoácido X6 é Lys, Gln, Glu, Val, ou Tyr, X8 é Asn, Gly, Ser, Trp, ou Tyr, X9 é Ala, Pro ou Ser, X10 é Gly ou Thr, X11 é uma ligação peptídica, Asp, Asn, Gly, ou Ser, X13 é Asp, Asn, His, ou Ser, X14 é Ser ou Thr, X15 é Asn ou Tyr, X17 é Asn ou Pro, X18 é Ala, Asp, Gly, Gln, Glu, Pro, ou Ser, X19 é Asn, Lys, Met, ou Ser, X20 é Leu, Phe ou Val, X21 é Lys, Met, ou Gln, X22 is Asp, Gly ou Ser. CDRH3 compreende a sequência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 Tyr, em que o aminoácido X23 é Arg, Asn, Gln, ou Glu, X24 é Gly, Leu, Arg, ou Tyr, X25 é uma ligação peptídica, Asp, ou Gly, X26 é uma ligação peptídica ou Gly, X27 é uma ligação peptídica ou Tyr, X28 é uma ligação peptídica, Leu, ou Tyr, X29 é uma ligação peptídica, Gly, Leu, Arg, ou Val, X30 é uma ligação peptídica, Asp, Gly, ou Glu, X31 é uma ligação peptídica, Asn, Arg, Ser, ou Tyr, X32 é uma ligação peptídica, Ala, Gly, Ile, ou Tyr, X33 is Met ou Phe, X34 é Ala ou Asp.

[00026] Compreende-se que a proteína de ligação pode compreender tanto a sequências da cadeia leve de imunoglobulina quanto a cadeia pesada da imunoglobulina ou fragmentos destas, registrados acima. Além disso, compreende-se que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto ou um fragmento de ligação ao antígeno deste ou um sítio de anticorpo biossintético.

[00027] Em certas modalidades, as sequências de CDR da cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada de imunoglobulina são interpostas com regiões de arcabouço (FR).

[00028] Em certas outras modalidades, as sequências de CDR da cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada de imunoglobulina são interpostas entre regiões de arcabouço humanas ou humanizadas.

[00029] Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga especificamente a HGF humano. A proteína de ligação compreende: (a) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRL1-CDRL2-CDRL3 e (b) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina, em que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para a ligação de HGF humano. A CDRL1 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 8 (1A3), SEQ ID NO. 18 (2B8), SEQ ID NO. 28 (2F8), SEQ ID NO. 38 (3B6), SEQ ID NO. 48 (3D11), SEQ ID NO. 58 (1D3), SEQ ID NO. 68 (1F3), e SEQ ID NO. 78 (3A12). A CDRL2 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 9 (1A3), SEQ ID NO. 19 (2B8), SEQ ID NO. 29 (2F8), SEQ ID NO. 39 (3B6), SEQ ID NO. 49 (3D11), SEQ ID NO. 59 (1D3), SEQ ID NO. 69 (1F3), SEQ ID NO. 79 (3A12) e SEQ ID NO. 206 (LRMR2B8LC). A CDRL3 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 10 (1A3), SEQ ID NO. 20 (2B8), SEQ ID NO. 30 (2F8), SEQ ID NO. 40 (3B6), SEQ ID NO. 50 (3D11), SEQ ID NO. 60 (1D3), SEQ ID NO. 70 (1F3), e SEQ ID NO. 80 (3A12). Ao longo do pedido e das reivindicações, as sequências caracterizadas por uma SEQ ID NO. particular, são acompanhadas em parênteses pelo anticorpo que foi a origem da sequência particular. Como exemplo, SEQ ID NO. 8 (1A3) indica que a SEQ ID NO: 8 é baseada na sequência presente no anticorpo 1A3.

[00030] Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma CDRL1 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 8 (1A3), uma CDRL2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 9 (1A3) e uma CDRL3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 10 (1A3).

[00031] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma CDRL1 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 18 (2B8), uma CDRL2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 19 (2B8) ou SEQ ID NO. 206 (LRMR2B8LC) e uma CDRL3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 20 (2B8).

[00032] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma CDRL1 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 28 (2F8), uma CDRL2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 29 (2F8) e uma CDRL3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 30 (2F8).

[00033] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma CDRL1 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 38 (3B6), uma CDRL2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 39 (3B6) e uma CDRL3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 40 (3B6).

[00034] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma CDRL1 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 48 (3D11), uma CDRL2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 49 (3D11) e uma CDRL3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 50 (3D11).

[00035] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma CDRL1 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 58 (1D3), uma CDRL2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 59 (1D3) e uma CDRL3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 60 (1D3).

[00036] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma CDRL1 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 68 (1F3), uma CDRL2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 69 (1F3) e uma CDRL3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 70 (1F3).

[00037] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma CDRL1 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 78 (3A12), uma CDRL2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 79 (3A12) e uma CDRL3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 80 (3A12).

[00038] Em cada uma das modalidades anteriores, as sequências de CDRL1, CDRL2, e CDRL3 preferivelmente são interpostas entre FRs de imunoglobulina humanas ou humanizadas. É compreendido que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento deste que se liga a antígeno ou um sítio de anticorpo biossintético.

[00039] Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRH1-CDRH2-CDRH3e (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e a região variável da cadeia leve de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para a ligação de HGF humano. A CDRH1 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 5 (1A3), SEQ ID NO. 15 (2B8), SEQ ID NO. 25 (2F8), SEQ ID NO. 35 (3B6), SEQ ID NO. 45 (3D11), SEQ ID NO. 55 (1D3), SEQ ID NO. 65 (1F3), e SEQ ID NO. 75 (3A12); a CDRH2 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 6 (1A3), SEQ ID NO. 16 (2B8), SEQ ID NO. 26 (2F8), SEQ ID NO. 36 (3B6), SEQ ID NO. 46 (3D11), SEQ ID NO. 56 (1D3), SEQ ID NO. 66 (1F3), SEQ ID NO. 76 (3A12), SEQ ID NO. 202 (Hu2B8 Hv1f.1), SEQ ID NO. 203 (Hu2B8 Hv5a.1 ou Hu2B8 Hv5-51.1), SEQ ID NO. 204 (LR2B8HC) e SEQ ID NO. 205 (LRMR2B8HC); a CDRH3 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 7 (1A3), SEQ ID NO. 17 (2B8), SEQ ID NO. 27 (2F8), SEQ ID NO. 37 (3B6), SEQ ID NO. 47 (3D11), SEQ ID NO. 57 (1D3), SEQ ID NO. 67 (1F3), e SEQ ID NO. 77 (3A12).

[00040] Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRH1 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 5 (1A3); uma CDRH2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 6 (1A3); e uma CDRH3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 7 (1A3).

[00041] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRH1 que compreende a sequência de SEQ ID NO.15 (2B8); uma CDRH2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 16 (2B8), SEQ ID NO. 202 (Hu2B8 Hv1f.1), SEQ ID NO. 203 (Hu2B8 Hv5a.1 ou Hu2B8 Hv5-51.1), SEQ ID NO. 204 (LR2B8HC) ou SEQ ID NO. 205 (LRMR2B8HC); e uma CDRH3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 17 (2B8).

[00042] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRH1 que compreende a sequência de SEQ ID NO.25 (2F8); uma CDRH2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 26 (2B8), e uma CDRH3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 27 (2F8).

[00043] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRH1 que compreende a sequência de SEQ ID NO.35 (3B6); uma CDRH2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 36 (3B6), e uma CDRH3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 37 (3B6).

[00044] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRH1 que compreende a sequência de SEQ ID NO.45 (3D11); uma CDRH2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 46 (3D11), e uma CDRH3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 47 (3D11).

[00045] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRH1 que compreende a sequência de SEQ ID NO.55 (1D3); uma CDRH2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 56 (1D3), e uma CDRH3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 57 (1D3).

[00046] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRH1 que compreende a sequência de SEQ ID NO.65 (1F3); uma CDRH2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 66 (1F3), e uma CDRH3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 67 (1F3).

[00047] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende: uma CDRH1 que compreende a sequência de SEQ ID NO.75 (3A12); uma CDRH2 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 76 (3A12), e uma CDRH3 que compreende a sequência de SEQ ID NO. 77 (3A12).

[00048] Em cada uma das modalidades anteriores, as sequências de CDRH1, CDRH2, e CDRH3 preferivelmente são interpostas entre FRs de imunoglobulina humanas ou humanizadas. É compreendido que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento de ligação ao antígeno deste ou um sítio de anticorpo biossintético.

[00049] Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada selecionada do grupo que consiste nos resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 2 (1A3), resíduos 20-137 de SEQ ID NO. 12 (2B8), resíduos 20-137 de SEQ ID NO. 22 (2F8), resíduos 20-139 de SEQ ID NO. 32 (3B6), resíduos 20132 de SEQ ID NO. 42 (3D11), resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 52 (1D3), resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 62 (1F3), e resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 72 (3A12) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste nos resíduos 21127 de SEQ ID NO. 4 (1A3), resíduos 21-127 de SEQ ID NO. 14 (2B8), resíduos 20-131 de SEQ ID NO. 24 (2F8), resíduos 23-129 de SEQ ID NO. 34 (3B6), resíduos 23-128 de SEQ ID NO. 44 (3D11), resíduos 21-127 de SEQ ID NO. 54 (1D3), resíduos 21-127 de SEQ ID NO. 64 (1F3), e resíduos 21-127 de SEQ ID NO. 74 (3A12).

[00050] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 2 (1A3) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4 (1A3).

[00051] Em uma modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 20-137 de SEQ ID NO: 12 (2B8) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 4 (2B8).

[00052] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 20-137 de SEQ ID NO: 22 (2F8) e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 20-131 de SEQ ID NO: 24 (2F8).

[00053] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 20-139 de SEQ ID NO: 32 (3B6) e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 23-129 de SEQ ID NO: 34 (3B6).

[00054] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 20-132 de SEQ ID NO: 42 (3D11) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 23-128 de SEQ ID NO: 44 (3D11).

[00055] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 52 (1D3) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 54 (1D3).

[00056] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 62 (1F3) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 64 (1F3).

[00057] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 20-141 de SEQ ID NO: 72 (3A12) e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos dos resíduos 21-127 de SEQ ID NO: 74 (3A12).

[00058] Em qualquer uma das modalidades anteriores, a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento deste que se liga a antígeno ou um sítio de anticorpo biossintético.

[00059] Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende (i) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 173 (região variável da cadeia leve de Hu2B8 Kv1-39.1), SEQ ID NO. 179 (região variável da cadeia leve de Hu2B8 Kv3-15.1), SEQ ID NO. 193 (região variável da cadeia leve de LR2B8LC), e SEQ ID NO. 199 (região variável da cadeia leve de LRMR2B8LC); e (ii) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 159 (região variável da cadeia pesada de Hu2B8 Hv1f.1), SEQ ID NO. 165 (região variável da cadeia pesada de Hu2B8 Hv5a.1), SEQ ID NO. 169 (região variável da cadeia pesada de Hu2B8 Hv5-51.1), SEQ ID NO. 183 (região variável da cadeia pesada de LR2B8HC), e SEQ ID NO. 189 (região variável da cadeia pesada de LRMR2B8LC). A proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento de ligação ao antígeno deste ou um sítio de anticorpo biossintético.

[00060] Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano. A proteína de ligação compreende (i) uma cadeia leve de imunoglobulina selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 177 (Hu2B8 Kv1-39.1 + constante capa (alótipo Km(3) (alelo 2)), SEQ ID NO. 181 (Hu2B8 Kv3-15.1 + constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 2)), SEQ ID NO. 197 (LR2B8LC + constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1)), e SEQ ID NO. 201 (LRMR2B8LC + constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1)); e (ii) uma imunoglobulina da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 163 (Hu2B8 Hv1f.1 + constante de IgG1 (alótipo G1m(17,1))), SEQ ID NO. 167 (Hu2B8 Hv5a.1 + constante de IgG1 (alótipo G1m(17,1))), SEQ ID NO. 171 (Hu2B8 Hv5-51.1 + Constante de IgG1 (alótipo G1m(17,1))), SEQ ID NO. 187 (LR2B8HC + constante de IgG1 (alótipo G1m(3)) (alelo 1)), e SEQ ID NO. 191 (LRMR2B8HC + constante de IgG1 (alótipo G1m(3)) (alelo 1)). A proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto, um fragmento de ligação ao antígeno deste ou um sítio de anticorpo biossintético.

[00061] Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano reduzido. A proteína de ligação compreende (i) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende três CDRs e (ii) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende três CDRs. As CDRs estão tipicamente interpostas entre FRs. As CDRs da cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação que se liga a HGF humano reduzido, por exemplo, a cadeia α de HGF reduzido. HGF reduzido se refere a HGF tratado com uma quantidade de agente redutor, por exemplo, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol ou glutationa suficiente para reduzir a ligação dissulfeto entre a cadeia α e a cadeia β. Concentrações exemplares incluem, por exemplo, DTT 100 mM e 2- mercaptoetanol 5%.

[00062] Em certas modalidades, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende pelo menos uma CDR selecionada do grupo que consiste em CDRL1, CDRL2 e CDRL3. Opcionalmente, a proteína de ligação compreende duas CDRs, por exemplo, CDRL1 e CDRL2, ou CDRL1 e CDRL3, ou CDRL1 e CDRL3. Opcionalmente, a proteína de ligação compreende todas as três CDRs, isto é, CDRL1, CDRL2 e CDRL3. CDRL1 compreende a sequência de aminoácidos X1 X2 Ser X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15, em que o aminoácido X1 é Arg ou Lys, X2 é Ala ou Thr, X4 é Glu ou Gln, X5 é Asn, Ser, ou Asp, X6 é Ile ou Val, X7 é Tyr, Asp, ou Lys, X8 é uma ligação peptídica ou Tyr, X9 é uma ligação peptídica ou Asp, X10 é uma ligação peptídica ou Gly, X11 é uma ligação peptídica ou Asn, X12 é uma ligação peptídica ou Ser, X13 é Asn ou Tyr, X14 é Ile ou Leu, X15 é Ala, Asn, ou Ser. CDRL2 compreende a sequência de aminoácidos X16 X17 X18 X19 Leu X21 X22, em que o aminoácido X16 é Ala, Asp, Val, ou Arg, X17 é Ala ou Val, X18 é Asn, Ser, ou Thr, X19 é Arg, Asn, ou He, X21 é Ala, Glu, Val, ou Pro, X22 é Asp ou Ser. CDRL3 compreende a sequência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 Pro X30 Thr, em que o aminoácido X23 é Leu ou Gln, X24 é H ou Gln, X25 é Phe, Ser, ou Tyr, X26 é Asp, Ile, ou Trp, X27 é Gly ou Glu, X28 é Asp, Phe, ou Thr, X30 é Phe, Pro, ou Tyr.

[00063] Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende pelo menos uma CDR selecionada do grupo que consiste em CDRH1, CDRH2, e CDRH3. Opcionalmente, a proteína de ligação compreende duas CDRs, por exemplo, CDRH1 e CDRH2, ou CDRH1 e CDRH3, ou CDRH1 e CDRH3. Opcionalmente, a proteína de ligação compreende todas as três CDRs, isto é, CDRH1, CDRH2 e CDRH3. CDRH1 compreende a sequência de aminoácidos X1 Tyr X3 X4 X5, em que o aminoácido X1 é Asp, Asn, Ser, ou Thr, X3 é Phe, Trp, ou Tyr, X4 é Ile ou Met, X5 é Asn, Hé, ou Ser. CDRH2 compreende a sequência de aminoácidos X6 Ile X8 X9 Gly X11 Gly X13 X14 X15 Tyr X17 X18 X19 X20 Lys X22, em que o aminoácido X6 é Lys, Gln, ou Tyr, X8 é Gly, Ser, ou Tyr, X9 é Pro ou Ser, X11 é Asp, Gly, ou Ser, X13 é Asp ou Ser, X14 é Ser ou Thr, X15 é Asn ou Tyr, X17 é Asn ou Pro, X18 é Ala, Asp, Gly, ou Glu, X19 é Asn, Met, ou Ser, X20 é Phe ou Val, X22 é Asp ou Gly. CDRH3 compreende a sequência de aminoácidos X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 Asp Tyr, em que o aminoácido X23 é Arg ou Gln, X24 é Gly ou Leu, X25 é Asp, Gly, ou uma ligação peptídica, X26 é Gly ou uma ligação peptídica, X27 é uma ligação peptídica ou Tyr, X28 é Leu, uma ligação peptídica ou Tyr, X29 é a Gly, Arg ou Leu, X30 é Asp, Gly ou Glu, X31 é a Tyr, Arg ou Asn, X32 é Ala, Gly ou Tyr, X33 é Met ou Phe.

[00064] Compreende-se que a proteína de ligação pode compreender ambas as sequências de cadeia leve de imunoglobulina e cadeia pesada de imunoglobulina ou fragmentos dessas, registrados acima. Além disso, é compreendido que a proteína de ligação pode ser um anticorpo intacto ou um fragmento deste que se liga a antígeno ou um sítio de anticorpo biossintético.

[00065] Em certas modalidades, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende (i) uma CDRL1 que tem uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 8 (1A3), SEQ ID NO. 28 (2F8), SEQ ID NO. 38 (3B6), SEQ ID NO. 58 (1D3), e SEQ ID NO. 68 (1F3), (ii) uma CDRL2 que tem uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 9 (1A3), SEQ ID NO. 29 (2F8), SEQ ID NO. 39 (3B6), SEQ ID NO. 59 (1D3), e SEQ ID NO. 69 (1F3), e (iii) uma CDRL3 que tem uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 10 (1A3), SEQ ID NO. 30 (2F8), SEQ ID NO. 40 (3B6), SEQ ID NO. 60 (1D3), e SEQ ID NO. 70 (1F3). As sequências de CDR podem ser interpostas entre FRs humanas ou humanizadas.

[00066] Em outras modalidades, a proteína de ligação compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos resíduos 21-127 de SEQ ID NO. 4 (1A3), resíduos 20-131 de SEQ ID NO. 24 (2F8), resíduos 23-129 de SEQ ID NO. 34 (3B6), resíduos 21-127 de SEQ ID NO. 54 (1D3), e resíduos 21-127 de SEQ ID NO. 64 (1F3).

[00067] Em certas outras modalidades, a proteína de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende (i) uma CDRH1 que tem uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 5 (1A3), SEQ ID NO. 25 (2F8), SEQ ID NO. 35 (3B6), SEQ ID NO. 55 (1D3), e SEQ ID NO. 65 (1F3), (ii) uma CDRH2 que tem uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 6 (1A3), SEQ ID NO. 26 (2F8), SEQ ID NO. 36 (3B6), SEQ ID NO. 56 (1D3), e SEQ ID NO. 66 (1F3),e (iii) uma CDRH3 que tem uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 7 (1A3), SEQ ID NO. 27 (2F8), SEQ ID NO. 37 (3B6), SEQ ID NO. 57 (1D3), e SEQ ID NO. 67 (1F3). As sequências de CDR podem ser interpostas entre FRs humanas ou humanizadas.

[00068] Em outra modalidade, a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nos resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 2 (1A3), resíduos 20-137 de SEQ ID NO. 22 (2F8), resíduos 20139 de SEQ ID NO. 32 (3B6), resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 52 (1D3), e resíduos 20-141 de SEQ ID NO. 62 (1F3).

[00069] Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano e compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina. A proteína de ligação isolada compete pela ligação a HGF com pelo menos um anticorpo de referência selecionado do grupo que consiste em (i) um anticorpo que tem uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com resíduos 20-131 de SEQ ID NO. 24 (2F8) e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com resíduos 20-137 de SEQ ID NO. 22 (2F8), (ii) um anticorpo que tem uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com resíduos 23-129 de SEQ ID NO. 34 (3B6), e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com resíduos 20-139 de SEQ ID NO. 32 (3B6) e (iii) um anticorpo que tem uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina com resíduos 23-128 de SEQ ID NO. 44 (3D11) e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina com resíduos 20-132 de SEQ ID NO. 42 (3D11). Sob certas circunstancias, a proteína de ligação se liga ao mesmo epítopo de HGF como um dos anticorpos de referência.

[00070] É compreendido que cada uma das proteínas de ligação discutidas acima pode ser um anticorpo intacto, por exemplo, um anticorpo monoclonal. Alternativamente, a proteína de ligação pode ser um fragmento de um anticorpo que se liga a antígeno ou pode ser um sítio de ligação de anticorpo biossintético. Fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab’, (Fab’)2 ou Fv. Técnicas para fazer tais fragmentos de anticorpo são conhecidas por aqueles versados na técnica. Vários sítios de ligação de anticorpo biossintético são conhecidos na técnica, por exemplo, moléculas de Fv único ou sFv, descritas, por exemplo, na Patente US 5.476.786. Outros sítios de ligação de anticorpo biossintético incluem proteínas de ligação biespecíficas ou bifuncionais que são anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se ligam a pelo menos dois antígenos diferentes. Por exemplo, proteínas de ligação biespecíficas podem se ligar a HGF, por exemplo, HGF humano e outro antígeno de interesse. Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab’. Veja, por exemplo, Songsivilai et al. (1990) CLIN. EXP. IMMUNOL. 79: 315-325; Kostelny et al. (1992) J. IMMUNOL. 148: 1547-1553.

[00071] As proteínas de ligação da invenção podem se ligar a hHGF que contém uma substituição de cisteína por arginina na posição 561 ou uma substituição de glicina por glutamato na posição 555.

[00072] Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano com uma kd de 4,0 x 10-5s-1 ou menor, 3,0 x 10-5s-1ou menor, ou 2,0 x 10-5s-1ou menor. As proteínas de ligação isoladas podem se ligar a HGF humano com kd de 5,0 x 10-5s-1a 0,5 x 10-5s-1, ou de 4,0 x 10-5s-1a 1,0 x 10-5s-1, ou de 3,0 x 10-5s-1a 1,5 x 10-5s-1. Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano com Kd de 100 pM ou menor, ou 20 pM ou menor, ou 10 pM ou menor ou 5 pM ou menor. As proteínas de ligação isoladas podem se ligar a HGF humano com KD de 100 pM a 5 pM, ou de 20 pM a 5 pM, ou de 15 pM a 10 pM, ou de 20 pM a 10 pM, ou de 15 pM a 5 pM. A menos que especificado de outra maneira, valores de KD são determinados pelos métodos e sob as condições descritas no Exemplo 6.

[00073] Em outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de ligação isolada que se liga a HGF humano, em que o anticorpo se liga a HGF humano com KDmenor a 37°C do que a 25°C. A proteína de ligação opcionalmente se liga a HGF humano com KD menor do que 5 pM a 37°C.

[00074] Em outros aspectos e modalidades, as proteínas de ligação podem inibir a ligação de hHGF a c-Met. Por exemplo, as proteínas de ligação podem ter uma IC50 (concentração a 50% da inibição máxima) de pelo menos cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, e 7,0 nM quando testadas usando o protocolo descrito no Exemplo 7(a). Em certas outras modalidades, as proteínas de ligação podem neutralizar a incorporação de BrdU mediada por HGF em células 4 MBr-5 (ATCC, N° de catálogo CCL208) usando o método descrito no Exemplo 7(b).

[00075] As proteínas de ligação podem ter uma IC50 de 50 nM ou menor, preferivelmente 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 1, 0.5 nM ou menor, quando ensaiadas usando o protocolo descrito no Exemplo 7(b). Em certas outras modalidades, as proteínas de ligação podem ser usadas para inibir a fosforilação de c-Met estimulada por HGF em células PC-3 (ATCC, Manassus, VA N° de catálogo. CRL-1435) usando o ensaio descrito no Exemplo 9.

II - Produção de Proteínas de Ligação

[00076] Proteínas de ligação da invenção podem ser produzidas de várias maneiras usando abordagens conhecidas na técnica. Por exemplo, moléculas de DNA que codificam regiões variáveis de cadeia leve e regiões variáveis de cadeia pesada podem ser sintetizadas quimicamente, usando um sintetizador comercial e a informação de sequência fornecida nesse. Tais moléculas sintéticas de DNA podem ser ligadas a outras sequências de nucleotídeo apropriadas, incluindo, por exemplo, sequências que codificam região constante e sequências de controle da expressão, para produzir construtos de expressão de gene convencionais que codificam as proteínas de ligação desejadas. A produção de construtos de genes definidos está dentro da técnica de rotina. Alternativamente, as sequências fornecidas aqui podem ser clonadas de hibridomas por técnicas de hibridização convencionais ou técnicas de PCR, usando sondas de ácido nucléico sintético cujas sequências são baseadas na informação de sequência fornecida aqui ou na informação de sequência da técnica anterior com relação a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino em células de hibridoma. A produção e uso de tais sondas está dentro da técnica ordinária.

[00077] Os ácidos nucléicos que codificam as proteínas de ligação desejadas podem ser introduzidos (ligados) em vetores de expressão, que podem ser introduzidos em uma célula hospedeira através de técnicas usuais de transfecção ou de transformação conhecidas na técnica. Células hospedeiras exemplares incluem, por exemplo, células de E. coli, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim de filhote de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2) e células de mieloma que não produzem proteína imunoglobulina de outra maneira. Células hospedeiras transfectadas podem ser cultivadas sob condições que permitem as células hospedeiras expressar os genes de interesse, por exemplo, os genes que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de imunoglobulina. Os produtos de expressão resultantes podem ser coletados usando técnicas conhecidas.

[00078] As condições de expressão e purificação particulares variarão dependendo de qual sistema de expressão é empregado. Por exemplo, se o gene for expresso em E. coli, ele é clonado primeiro em um vetor de expressão. Isso é obtido pelo posicionamento do gene manipulado a jusante do promotor bacteriano adequado, por exemplo, TrP ou Tac, e uma sequência de sinal, por exemplo, uma sequência que codifica um fragmento B da proteína A (FB). A proteína de fusão expressa resultante se acumula tipicamente em corpos refrativos ou de inclusão no citoplasma das células e podem ser coletadas após a ruptura das células por prensa francesa ou sonicação. Os corpos refrativos são então solubilizados e as proteínas expressas reenoveladas e clivadas por métodos já estabelecidos para muitas outras proteínas recombinantes.

[00079] Se o gene manipulado for expresso em células hospedeiras eucarióticas, por exemplo, células de mieloma ou células CHO, ele é inserido primeiro em um vetor de expressão que contem um promotor eucariótico adequado, um sinal de secreção, intensificadores de imunoglobulina e vários íntrons. Esse vetor de expressão pode conter opcionalmente sequências que codificam toda ou uma parte de uma região constante, possibilitando que uma cadeia pesada ou leve inteira ou uma parte seja expressa. O construto de gene pode ser transfectado em células de mieloma ou células CHO usando protocolos de transfecção estabelecidos. Tais células transfectadas podem expressar fragmentos de VL ou VH, heterodímeros de VL-VH, polipeptídeos de cadeia simples de VH-VL ou VL-VH, cadeias pesadas ou leves completas de imunoglobulina ou porções desses, cada um dos quais podendo ser acoplados a um domínio de proteína que tem outra função (por exemplo, citotoxicidade).

III - Modificações das Proteínas de Ligação

[00080] É compreendido que as proteínas de ligação podem ser modificadas para otimizar o desempenho dependendo do uso pretendido das proteínas de ligação. Por exemplo, a proteína de ligação está sendo usada como um agente terapêutico, a proteína de ligação pode ser modificada para reduzir sua imunogenicidade no receptor pretendido. Alternativamente ou, adicionalmente, a proteína de ligação pode ser fundida ou acoplada à outra proteína ou peptídeo, por exemplo, um fator de crescimento, citocina ou citotoxina. Tais modificações podem ser obtidas usando técnicas de manipulação de gene de rotina conhecidas na técnica.

[00081] Várias técnicas para reduzir a antigenicidade de anticorpos ou fragmentos de anticorpo são conhecidas na técnica. Essas técnicas podem ser usadas para reduzir ou eliminar a antigenicidade das proteínas de ligação da invenção. Por exemplo, quando as proteínas de ligação são para ser administradas a um ser humano, as proteínas de ligação são preferivelmente manipuladas para reduzir sua antigenicidade em seres humanos. Esse processo é geralmente referido como humanização. Preferivelmente, as proteínas de ligação humanizadas têm a mesma ou substancialmente a mesma afinidade pelo antígeno que a proteína de ligação não humanizada original da qual ela é derivada.

[00082] Em uma abordagem de humanização bem conhecida, proteínas quiméricas são criadas nas quais as regiões constantes de imunoglobulina de anticorpos de uma espécie, por exemplo, camundongo, são substituídas por regiões constantes de imunoglobulina de uma segunda espécie diferente, por exemplo, um humano. Nesse exemplo, o anticorpo resultante é uma quimera de camundongo-humano, onde as sequências da região constante humana, em princípio, são menos imunogênicas do que as sequências de murino correspondentes. Esse tipo de manipulação de anticorpo é descrito, por exemplo, em Morrison, et al. (1984) PROC. NAT. ACAD. SCI. 81: 6851-6855, Neuberger et al. (1984) NATURE 312: 604-608; Patente US 6.893.625 (Robinson); 5.500.362 (Robinson); e 4.816.567 (Cabilly).

[00083] Em outra abordagem, conhecida como enxerto de CDR, as CDRs das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo de interesse são enxertadas em regiões de arcabouço (FRs) de outra espécie. Por exemplo, CDRs de murino podem ser enxertadas em sequências de FR humanas. Em algumas modalidades, as CDRs das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo anti-HGF são enxertadas em FRs humanas ou FRs humanas de consenso. A fim de criar FRs humanas de consenso, FRs de várias sequências de aminoácidos de cadeia pesada ou cadeia leve humanas são alinhadas para identificar a sequência de aminoácidos de consenso. O enxerto de CDR está descrito, por exemplo, em Patente US 7.022.500 (Queen); 6.982.321 (Winter); 6.180.370 (Queen); 6.054.297 (Carter); 5.693.762 (Queen); 5.859.205 (Adair); 5.693.761 (Queen); 5.565.332 (Hoogenboom); 5.585.089 (Queen); 5.530.101 (Queen); Jones et al. (1986) NATURE 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) NATURE 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) SCIENCE 239: 1534-1536; e Winter (1998) FEBS LETT 430: 92-94.

[00084] Em uma abordagem chamada "super-humanização", anticorpos nos quais a imunogenicidade humana está reduzida ou eliminada são criados por uma forma alternativa de enxerto. Na super- humanização, sequências de FR são escolhidas de um grupo de genes de linhagem germinativa humana com base na similaridade estrutural das CDRs humanas com aquelas do anticorpo de camundongo a ser humanizado. Essa abordagem é descrita, por exemplo, na Patente US 6.881.557 (Foote) e em Tan et al. (2002) J. IMMUNOL 169:1119-1125.

[00085] Outras abordagens para reduzir a imunogenicidade incluem técnicas que são conhecidas como "transformação", "hiperquimerização"ou "recapeamento/revestimento" para produzir anticorpos humanizados. Veja, por exemplo, Vaswami et al. (1998) ANNALS OF ALLERGY, ASTHMA,&IMMUNOL. 81: 105; Roguska et al. (1996) PROT. ENGINEER 9: 895-904; e Patente US 6.072.035 (Hardman). Na abordagem de recapeamento/revestimento, os resíduos de aminoácidos de superfície acessível no anticorpo de murino são substituídos por resíduos de aminoácidos mais frequentemente encontrados nas mesmas posições em um anticorpo humano. Esse tipo de revestimento de anticorpo está descrito, por exemplo, na Patente US 5.639.641 (Pedersen).

[00086] Uma abordagem exemplar para conversão de um anticorpo de camundongo em uma forma adequada para uso médico em seres humanos é conhecida como tecnologia ACTIVMAB® (Vaccinex, Inc., Rochester, NY), que envolve um vetor baseado no vírus da vacínia para expressar anticorpos em células de mamífero. Altos níveis de diversidade combinatória das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina são ditos serem produzidos. Veja, por exemplo, Patente US 6.706.477 (Zauderer); US 6.800.442 (Zauderer); e US 6.872.518 (Zauderer).

[00087] Outra abordagem exemplar para conversão de um anticorpo de camundongo em uma forma adequada para uso em seres humanos é a tecnologia praticada comercialmente por KaloBios Pharmaceuticals, Inc. (Palo Alto, CA). Essa tecnologia envolve o uso de uma biblioteca "aceptora" de propriedade humana para produzir uma biblioteca "focalizada no epítopo" para seleção de anticorpo.

[00088] Outra abordagem exemplar para modificação de um anticorpo de camundongo em uma forma adequada para uso médico em humanos é a tecnologia HUMAN ENGINEERING® (HE®), que é praticada comercialmente por XOMA (US) LLC. Veja, por exemplo, Pedido de Publicação Internacional N° WO 93/11794 e Patente US 5.766.886; US 5.770.196; US 5.821.123; e US 5.869.619.

[00089] Qualquer abordagem adequada, incluindo qualquer uma das abordagens acima, pode ser utilizada para reduzir ou eliminar a imunogenicidade humana de uma proteína de ligação de interesse.

[00090] Além disso, é possível criar anticorpos totalmente humanos em camundongos. Nessa abordagem, anticorpos humanos são preparados usando um camundongo transgênico no qual os genes que produzem anticorpo de camundongo foram substituídos por uma porção substancial de genes que produzem anticorpo humano. Tais camundongos produzem imunoglobulina humana ao invés de moléculas de imunoglobulina de murino. Veja, por exemplo, WO 98/24893 (Jacobovitz et al.) e Mendez et al. (1997) NATURE GENETICS 15: 146-156. Anticorpos monoclonais anti-HGF totalmente humanos podem ser produzidos usando a seguinte abordagem. Camundongos transgênicos que contêm genes de imunoglobulina humana são imunizados com o antígeno de interesse, por exemplo, HGF. Células linfáticas dos camundongos são então obtidas dos camundongos, que são então fundidas com uma linhagem celular de tipo mielóide para preparar linhagens celulares de hibridoma imortalizado. As linhagens celulares de hibridoma são rastreadas e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos para HGF.

[00091] Proteínas de ligação da invenção podem ser conjugadas com outras moléculas, dependendo do uso pretendido. Por exemplo, se a proteína de ligação for usada como um terapêutico, então a proteína de ligação pode ser conjugada com outro agente, por exemplo, uma molécula efetora que modula ou, promove a terapia de outra forma. À medida que o efetor é um agente baseado em uma não proteína, por exemplo, um fármaco de molécula pequena, um radiomarcador ou toxina, então o agente pode ser quimicamente acoplado usando químicas de acoplamento in vitro padronizadas. Se, por outro lado, a molécula efetora é uma proteína ou peptídeo, por exemplo, uma enzima, receptor, toxina, fator de crescimento, citocina ou outro imunomodulador, então a proteína de ligação pode ser quimicamente acoplada ao efetor usando químicas de acoplamento in vitro ou podem ser acopladas ao efetor como uma proteína de fusão. Proteínas de fusão podem ser construídas e expressas usando técnicas similares àquelas discutidas na seção II.

IV - Uso de Proteínas de Ligação

[00092] As proteínas de ligação descritas aqui podem ser usadas como um agente de diagnóstico ou um agente terapêutico.

(1) Aplicações Terapêuticas

[00093] Como as proteínas de ligação da invenção neutralizam a atividade de HGF, elas podem ser usadas em várias aplicações terapêuticas. Por exemplo, certas proteínas de ligação da invenção são úteis na prevenção ou tratamento de doenças ou desordens hiperproliferativas, por exemplo, várias formas de câncer.

[00094] As proteínas de ligação podem ser usadas para inibir ou reduzir a proliferação de células tumorais. Em tal abordagem, as células tumorais são expostas a uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação a fim de inibir ou reduzir a proliferação da célula tumoral. Em certas modalidades, as proteínas de ligação inibem a proliferação de célula tumoral em pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100%.

[00095] Em certas modalidades, a proteína de ligação é usada para inibir ou reduzir a proliferação de uma célula de tumor, na qual a proteína de ligação reduz a habilidade de hHGF de se ligar a c-Met. Em outras modalidades, a proteína de ligação é usada para inibir ou reduzir a proliferação de uma célula de tumor mesmo quando a proteína de ligação se liga a hHGF mas não inibe substancialmente a ligação de hHGF a c-Met, como demonstrado pelo anticorpo 3B6 nas Tabelas 5 e 6.

[00096] Além disso, a proteína de ligação pode ser usada para inibir ou reduzir o crescimento ou desenvolvimento do tumor em um mamífero. Em tal método, uma quantidade eficaz de proteína de ligação é administrada ao mamífero a fim de inibir ou reduzir o crescimento do tumor em um mamífero. Consequentemente, as proteínas de ligação podem ser usadas para tratar tumores, por exemplo, em um mamífero. O método compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação. A proteína de ligação pode ser administrada sozinha ou em combinação com outra molécula farmaceuticamente ativa a fim de tratar o tumor.

[00097] Considera-se que as proteínas de ligação da invenção podem ser usadas no tratamento de uma variedade de distúrbios responsivas a HGF, incluindo, por exemplo, células tumorais responsivas a HGF no câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de colo, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer de cabeça e pescoço, câncer ovariano, mieloma múltiplo, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de rim, câncer de nasofaringe, câncer pancreático, mesotelioma, melanoma e glioblastoma.

[00098] Conforme usado aqui "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se ao tratamento de um estado de doença em um mamífero, particularmente em um ser humano, e incluem: (a) impedir que o estado de doença ocorra em um mamífero, em particular quando tal mamífero está predisposto ao estado de doença, mas ainda não foi diagnosticado como o tendo; (b) inibir o estado de doença, isto é, parar seu desenvolvimento; e/ou (c) aliviar o estado de doença, isto é, causar a regressão do estado de doença.

[00099] Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz do componente ativo estará na faixa entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/ kg, opcionalmente de cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, opcionalmente de cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. A quantidade administrada dependerá de variáveis tais como o tipo e extensão da doença ou indicação a ser tratada, do estado de saúde do paciente em particular, da eficácia biológica relativa da proteína de ligação liberada, da formulação da proteína de ligação, da presença e dos tipos de excipientes na formulação e da via de administração. A dosagem inicial administrada pode ser aumentada além do nível superior a fim de se obter rapidamente o nível sanguíneo ou nível tecidual desejados ou a dosagem inicial pode ser menor do que o ótimo e a dosagem diária pode ser progressivamente aumentada durante o curso do tratamento dependendo da situação particular. A dosagem humana pode ser otimizada, por exemplo, em um estudo de intensificação de dosagem convencional de Fase I planejado para correr entre 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. A frequência de dosagem pode variar, dependendo de fatores tais como a via de administração, quantidade dosada e a condição da doença a ser tratada. Frequências de dosagem exemplares são uma vez por dia, uma vez por semana e uma vez a cada duas semanas. A via de administração preferida é parenteral, por exemplo, infusão intravenosa. A formulação de fármacos baseados em anticorpos monoclonais está dentro da técnica comum. Em algumas modalidades da invenção, a proteína de ligação, por exemplo, um anticorpo monoclonal, é liofilizada e reconstituída em salina tamponada no momento da administração.

[000100] As proteínas de ligação podem ser administradas tanto sozinhas quanto em combinação com outros ingredientes farmaceuticamente ativos. Os outros ingredientes ativos, por exemplo, imunomoduladores, podem ser administrados junto com a proteína de ligação ou podem ser administrados antes ou depois da proteína de ligação.

[000101] Formulações contendo as proteínas de ligação para uso terapêutico, incluem tipicamente as proteínas de ligação combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável. Conforme usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável"significa tampões, veículos e excipientes que são, dentro do escopo do julgamento clínico, adequados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, correspondente a uma proporção benefício/risco razoável. O(s) veículo(s) deve(m) ser "aceitável(eis)"no sentido de serem compatíveis com outros ingredientes das formulações e não deletérios para o receptor. Veículos farmaceuticamente aceitáveis, nesse aspecto, pretendem incluir qualquer um e todos os tampões, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes isotônicos e prolongadores da absorção e semelhantes, compatíveis com administração farmacêutica. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica.

[000102] As formulações podem ser convenientemente apresentadas em uma forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer método adequado, incluindo quaisquer métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. Uma composição farmacêutica da invenção deve ser formulada para ser compatível com sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem administração parenteral ou administração não parenteral, por exemplo, intravenosa, intradérmica, inalação, transdérmica (tópica), transmucosa e administração retal. Soluções úteis para administração oral ou parenteral podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica, descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ad. (Mack Publishing Company, 1990).

[000103] Formulações adequadas para administração oral podem estar na forma de: unidades individuais tais como injeções, cápsulas, cápsulas gelatinosas, sachês, comprimidos, pastilhas ou drágeas, cada uma contendo uma quantidade predeterminada da proteína de ligação; uma composição em pó ou granulada; uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso; ou uma emulsão de óleo em água ou uma emulsão de água em óleo.

[000104] Formulações adequadas para administração parenteral incluem, por exemplo, os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfeto de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetraacético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser acondicionada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou plástico.

[000105] Em geral, composições adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas (quando solúveis em água) ou dispersões e pós para preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Para administração intravenosa, veículos adequados incluem salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou salina tamponada com fosfato (PBS). Ela deve ser estável sob as condições de produção e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de microorganismos tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou um meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido) e misturas adequadas desses.

[000106] As formulações farmacêuticas preferivelmente são estéreis, A esterilização pode ser obtida, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. Onde as composições são liofilizadas, a esterilização usando esse método pode ser conduzida antes ou após a liofilização e reconstituição. Uma vez que a composição farmacêutica tenha sido formulada, ela pode ser armazenada, por exemplo, em frascos como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou como um pó desidratado ou liofilizado.

(2) Aplicações Diagnósticas

[000107] Sempre que as proteínas de ligação forem usadas com propósitos de diagnóstico, tanto in vitro quanto in vivo, as proteínas de ligação são marcadas tanto diretamente quanto indiretamente com uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualquer porção que á capaz de produzir, tanto diretamente quanto indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3Hidrogênio (3H), 14Carbono (14C), 32Fósforo (32P), 35Enxofre (35S), ou 125Iodo (125I); um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; uma enzima, tal como fosfatase alcalina, betagalactosidase ou peroxidase de rábano silvestre; uma sonda paramagnética, tal como um marcador de spin; ou uma partícula colorida, por exemplo, uma partícula de látex ou ouro. É compreendido que a proteína de ligação pode ser conjugada com a porção detectável usando várias abordagens conhecidas na técnica, por exemplo, como descrito em Hunter et al. (1962) NATURE 144: 945; David et al. (1974) BIOCHEMISTRY 13: 1014; Pain et al. (1981) J. IMMUNOL. METH. 40: 219; and Nygren (1982) J. HISTOCHEM. AND CYTOCHEM. 30: 407. Os marcadores podem ser detectados, por exemplo, visualmente ou com a ajuda de um espectrofotômetro ou outro detector.

[000108] As proteínas de ligação podem ser empregadas em uma ampla faixa de técnicas de imunoensaio disponíveis na técnica. Imunoensaios exemplares incluem, por exemplo, imunoensaios sanduíche, imunoensaios competitivos e procedimentos imuno- histoquímicos.

[000109] Em um imunoensaio intercalado, dois anticorpos que se ligam a um analito ou antígeno de interesse são usados, por exemplo, um imobilizado sobre um suporte sólido e um livre em solução e marcado com uma porção detectável. Quando uma amostra que contém o antígeno é introduzida nesse sistema, o antígeno se liga ao anticorpo imobilizado e ao anticorpo marcado, para formar uma "intercalação"de complexo imune sobre a superfície do suporte. A proteína complexada é detectada pela lavagem dos componentes não ligados da amostra e do excesso de anticorpo marcado e pela medida de anticorpo marcado complexado à proteína sobre a superfície do suporte. Alternativamente, o anticorpo livre em solução pode ser detectado por um terceiro anticorpo marcado com uma porção detectável que se liga ao anticorpo livre. Uma revisão detalhada do planejamento de ensaio imunológico, teoria e protocolos podem ser encontrados em vários textos, incluindo Butt, ed., (1984) PRACTICAL IMMUNOLOGY, Marcel Dekker, New York; Harlow et al. eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY APPROACH, Cold Spring Harbor Laboratory; and Diamandis et al., eds. (1996) IMMUNOASSAY, Academic Press, Boston.

[000110] É considerado que as proteínas de ligação marcadas são úteis como agentes de imagem in vivo, através do que as proteínas de ligação podem direcionar os agentes de imagem para os tecidos particulares de interesse do receptor. Uma porção remotamente detectável preferida para imagem in vivo inclui o átomo radioativo Tecnécio99m(99mTc), um emissor gama com uma meia-vida de cerca de seis horas. Porções não radioativas também úteis em imagem in vivo incluem marcadores de spin de nitróxido assim como lantanídeo e íons de metal de transição, todos os quais induzem atenuação de próton in situ.Além de imunoimagem, as porções radioativas complexadas podem ser usadas em protocolos padronizados de rádio- imunoterapia para destruir as células-alvo. Nucleotídeos preferidos para radioimunoterapia em altas doses incluem os átomos radioativos 90Ítrio (90Yt), 131Iodo (131I) e 111Índio (111In). A proteína de ligação pode ser marcada com 131I, 111In e 99mTc usando técnicas de acoplamento conhecidas nas técnicas de imagem. Similarmente, procedimentos para preparar e administrar o agente de imagem assim como capturar e processar imagens são bem conhecidas na técnica de imagem e, portanto, não são discutidos em detalhes nesse. Similarmente, métodos para realizar imunoterapias baseadas em anticorpo são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Patente US 5.543.254.

[000111] Ao longo de toda a descrição, onde as composições são descritas como tendo, incluindo ou compreendendo componentes específicos, é contemplado que as composições também consistem essencialmente, ou consistem nos componentes listados. Similarmente, onde os processos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas específicas do processo, os processos também consistem essencialmente ou consistem nas etapas de processamento listadas. Exceto onde indicado de outra maneira, a ordem das etapas ou ordem de realização de certas ações são irrelevantes com a condição de que a invenção permaneça operativa. Além disso, a menos que observado de outra maneira, duas ou mais etapas ou ações podem ser conduzidas simultaneamente.

EXEMPLOS

[000112] Os seguintes exemplos discutem a produção e caracterização e vários anticorpos monoclonais anti-hHGF.

Exemplo 1 - Produção de Anticorpos Monoclonais Anti-hHGF

[000113] Este Exemplo descreve a produção de vários anticorpos monoclonais anti-hHGF.

[000114] As imunizações, fusões e rastreamentos primários foram conduzidos em MBS Inc. (Portland, ME), após o protocolo de Múltiplos Locais de Imunização Repetitiva (Repetitive Immunization Multiple Sites (RIMMS)). Cinco camundongos AJ e cinco camundongos Balb/c foram imunizados com HGF humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN; N° de catálogo 294-HGN-025). Dois camundongos com soros apresentando as maiores atividades anti-HGF por Ensaio Imunoabsorvente Ligado a Enzima (ELISA) foram escolhidos para fusão subsequente. Os baços e nodos linfáticos dos camundongos apropriados foram coletados. As células B foram então colhidas e fundidas com uma linhagem de mieloma. Os produtos de fusão foram diluídos seriadamente em uma ou mais placas até próximo da clonalidade. Os sobrenadantes das fusões resultantes foram examinados quanto a sua ligação a hHGF por ELISA. Os sobrenadantes identificados como contendo anticorpos para HGF foram caracterizados posteriormente por um teste funcional in vitro discutido nos exemplos seguintes. Um painel de hibridomas foi selecionado e os hibridomas foram subclonados e expandidos. Os anticorpos monoclonais foram então purificados por cromatografia de afinidade sobre resina de Proteína A/G sob condições usuais.

Exemplo 2 - Análise de Sequência de Anticorpos Monoclonais anti- hHGF

[000115] Este exemplo descreve as análises de isótipo e sequência dos anticorpos monoclonais anti-hHGF produzidos no Exemplo 1.

a. Determinação dos Isótipos dos Anticorpos Monoclonais Murinos de HGF

[000116] O tipo de cadeia leve e o isótipo de cadeia pesada de cada anticorpo monoclonal foram determinados usando o kit IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping de acordo com as instruções do fabricante (Roche Applied Science).

[000117] Foi determinado que todos os anticorpos continham uma cadeia leve capa de imunoglobulina e uma cadeia pesada de imunoglobulina de IgG1.

b. Determinação das Sequências de Nucleotídeo que Codificam as Regiões Variáveis de Cadeia Pesada e Leve

[000118] O RNA total foi extraído de cada linhagem celular de hibridoma monoclonal usando o kit RNeasy Miniprep de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen Venlo, Holanda). A primeira fita de cDNA de extensão completa foi gerada usando o kit de amplificação de cDNA BD SMART® RACE de acordo com as instruções do fabricante (Clontech) usando os iniciadores de oligonucleotídeo BD SMART II A (5’ aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg 3’) (SEQ ID NO. 85) e o iniciador 5’-RACE CDS (5’ ttttttttttttttttttt ttttttvn 3’, onde v = a, g, ou c e n = a, g, c, ou t) (SEQ ID NO. 86) com a finalidade de 5’ RACE (Rápida Amplificação das Extremidades do cDNA).

[000119] As regiões variáveis das cadeias de imunoglobulina Pesada (IgG1) e Capa foram amplificadas por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) usando o Sistema Expand High-Fidelity PCR System (Roche Applied Science) de acordo com as instruções do fabricante. As regiões variáveis de cadeia pesada foram amplificadas com a mistura de iniciadores de oligonucleotídeo 5’ Universal Primer Mix A (mistura de 5’ ctaatacgactcactatagggca agcagtggtatcaacgcagagt 3’ (SEQ ID NO. 87) e 5’ ctaatacgactcactatagggc 3’(SEQ ID NO. 88)) e um 3’ iniciador específico para a região constante de IgG1, ou 5’ tatgcaaggcttacaaccaca 3’ (SEQ ID NO. 89) ou 5’ gccagtggataga cagatgggggtgtcg 3’ (SEQ ID NO. 90). As regiões variáveis de cadeia Capa foram amplificadas com a mistura de iniciador de oligonucleotídeo 5’ Universal Primer Mix A e um iniciador específico para a Região Constante Capa 3’, ou 5’ ctcattcctgttgaagctcttgacaat 3’ (SEQ ID NO. 91) ou 5’ cgactgaggcacctccagatgtt 3’ (SEQ ID NO. 92).

[000120] Os produtos de PCR individuais foram fracionados por eletroforese em gel de agarose e purificados usando o kit Qiaquick Gel Purification de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). Os produtos de PCR foram subsequentemente clonados no plasmídeo pCR2.1 TOPO usando o kit de clonagem baseado em topoisomerase TOPO TA Cloning® Kit (com o vetor pCR®2.1-TOPO®) de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) e transformados em bactérias DH5 usando técnicas de transformação usuais. O DNA de plasmídeo isolado dos clones bacterianos transformados foi sequenciado usando os iniciadores de T7 (5’ TAATACG ACTCACTATAGGG 3’) (SEQ ID NO. 93), de M13 de sentido direto (5’ GTA AAACGACGGCCAGT 3’) (SEQ ID NO. 94), e de M13 de sentido reverso (5’ CAGGAAACAGCTATGACC 3’) (SEQ ID NO. 95) por Agencourt Bioscience usando métodos de sequenciamento de didesoxi DNA usuais para identificar a sequência das sequências da região variável. As sequências foram analisadas usando o programa Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o servidor da internet IMGT/V- Quest (http://imgt.cines.fr/textes/vquest) para identificar e confirmar as sequências da região variável.

c. Determinação das sequências de nucleotídeo que codificam as sequências da região constante da cadeia pesada e leve de imunoglobulina para as cadeias capa e de IgG1 de 1A3, 1D3, 1F3, e 2B8

[000121] cDNAs de extensão completa para as cadeias de IgG1 de 1A3, 1D3, e 1F3 foram amplificados por PCR a partir do cDNA criado acima usando o seguinte iniciador de sentido direto 5’ ggggacaagtttgtacaaaaaag caggctgccaccatgaactttgggctcagattgattttcc 3’ (códon de início sublinhado) (SEQ ID NO. 96) e o iniciador de sentido reverso 5’ ggggaccactttgtacaagaa agctgggttcatttaccaggagagtgggagagg 3’ (códon de parada sublinhado) (SEQ ID NO. 97). cDNA de extensão completa para a cadeia de IgG1 de 2B8 foi amplificada a partir do cDNA criado acima usando o seguinte iniciador de sentido direto 5’ ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgggatggagctatatc atcctcttt 3’ (códon de início sublinhado) (SEQ ID NO. 98) e iniciador de sentido reverso 5’ ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagag 3’ (códon de parada sublinhado) (SEQ ID NO. 99).

[000122] cDNA de extensão completa para a cadeia Capa de 2B8 foi amplificado usando o seguinte iniciador de sentido direto 5’ ggggacaagtttgtaca aaaaagcaggctgccaccatggaatcacagactctggtcttcata 3’ (códon de início sublinhado) (SEQ ID NO. 100) e o iniciador de sentido reverso 5’ ggggaccactttg tacaagaaagctgggtctaacactcattcctgttgaagctc 3’ (códon de parada sublinhado) (SEQ ID NO. 101). Os fragmentos de PCR foram subclonados em pDONR221 (Invitrogen, Carlsbad, CA) por reação de recombinação Gateway BP (Invitrogen, Carlsbad, CA) e sequenciados por Agencourt Bioscience usando métodos de sequenciamento de didesoxi DNA usuais para identificar a sequência da região constante e confirmar adicionalmente as sequências da região variável.

d. Análise de sequência

[000123] As regiões variáveis (texto normal) foram identificadas usando o servidor da internet IMGT/V-QUEST (http://imgt.cines.fr/textes/vquest/). As sequências de Peptídeo de Sinal foram previstas com base na identificação do códon de início in frame (ATG) que estava à montante da Região Variável identificada. As sequências de peptídeo de sinal foram identificadas e estão sublinhadas abaixo.

[000124] O último nucleotídeo de cada região variável é a primeira base do próximo códon gerado pela junção da região variável/constante. Este nucleotídeo está incluído na região variável porque ele é parte deste éxon. As sequências de aminoácido das regiões constantes listadas abaixo incluem a tradução deste códon de junção.

[000125] A fim de criar as sequências do anticorpo da cadeia pesada ou capa completas, as sequências da região variável observadas abaixo são combinadas com suas respectivas sequências da região constante (as sequências de sinal estão sublinhadas). (1) Região Variável da Cadeia Pesada de 1A3 (SEQ ID NO. 1) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gagggtccct gaaactctcc gggaggctta gtgcagcctg 121 tgtgcagcct ctgaattcac cttgggttcg ccagactcca tttcagtaac tattacatgt 181 gagaagaggc tgcagtgggt gtggtagctc ctactatcca cgcatacatt agtcctggtg 241 gccagtgtga agggtcgatt ccaagaacac cctgtacctg caccatctcc agagacaatg 301 caaatgagca gtctgaagtc actgtgcaag acaaggggat tgaggacaca gccatgtatt 361 ggttactacg gggactatgc gaacctcagt caccgtctcc tatggactac tggggtcaag 421 tcag (2) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 1A3 (SEQ ID NO. 3) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaagc tggaaataaa ac (3) Região Variável da Cadeia Pesada de 2B8 (SEQ ID NO. 11) 1 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 61 gtccaactgc agcagcctgg ggacttcagt gaagctgtcc ggctgaactg gtgaagcctg 121 tgcaaggctt ctggctacac actgggtgaa tcagaggcct cttcaccacc tactggatgc 181 ggacaaggcc ttgagtggat acggtcatac taactacaat tggagagatt aatcctacca 241 gagaagttca agagcaaggc cctccagcac agcctacatg cacactgact gtagacaaat 301 caactcagca gcctgacatc actgtgcaag aaactatgtt tgaggactct gcggtctatt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag (4) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 2B8 (SEQ ID NO. 13) 1 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa ac (5) Região Variável da Cadeia Pesada de 2F8 (SEQ ID NO. 21) 1 atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag 61 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 241 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 301 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 361 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc ag (6) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 2F8 (SEQ ID NO. 23) 1 atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 61 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 121 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggta atagttatat caactggtac 181 caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctatg ttgcatccaa tctagaatct 241 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 301 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtattga ggatcctccc 361 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaac (7) Região Variável da Cadeia Pesada de 3B6 (SEQ ID NO. 31) 1 atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag 61 gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc 121 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 181 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat 241 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg 301 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg 361 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcag (8) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 3B6 (2 possíveis códons de início ATG (letras maiúsculas)) (SEQ ID NO. 33) 1 ATGgacATGa ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 61 aaatgtgaca tcaagatgac atgcatctct aggagagaga ccagtctcca tcttccatgt 121 gtcacaatca cttgcaaggc atttaagctg gttccagcag gagtcaggac attaaaagct 181 aaaccaggga aatctcctaa acagattggt agatggggtc gaccctgatc tatcgtgtaa 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg 301 gagaatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gttcacgttc 361 ggagggggga ccaagctgga aataaagc (9) 3D11 Região Variável da Cadeia Pesada (SEQ ID NO. 41) 1 atggctgtcc cggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag 61 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 121 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 181 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 241 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 301 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 361 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcag (10) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 3D11 (SEQ ID NO. 43) 1 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc 61 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 181 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 241 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 361 gctgggacca agctggagct gaaac (11) Região Variável da Cadeia Pesada de 1D3 (SEQ ID NO. 51) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat 361 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 421 tcag (12) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 1D3 (SEQ ID NO. 53) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tggaaataaa ac (13) Região Variável da Cadeia Pesada de 1F3 (SEQ ID NO. 61) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgag 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctct agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag (14) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 1F3 (SEQ ID NO. 63) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 361 gggaccagac tggaaattaa ac (15) Região Variável da Cadeia Pesada de 3A12 (SEQ ID NO. 71) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc 121 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 361 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcag (16) Região Variável da Cadeia Leve Capa de 3A12 _(SEQ ID NO. 73) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tagaaataaa ac (17) Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 de Camundongo de Referência (J00453) (SEQ ID NO. 81) 1 ccaaaacgac acccccatct atctgctgcc caaactaact gtctatccac tggcccctgg 61 ccatggtgac cctgggatgc tgagccagtg acagtgacct ctggtcaagg gctatttccc 121 ggaactctgg atccctgtcc agctgtcctg gagtctgacc agcggtgtgc acaccttccc 181 tctacactct gagcagctca tcggcccagc gagaccgtca gtgactgtcc cctccagccc 241 cctgcaacgt tgcccacccg caagaaaatt gtgcccaggg gccagcagca ccaaggtgga 301 attgtggttg taagccttgc atcatctgtc ttcatcttcc atatgtacag tcccagaagt 361 ccccaaagcc caaggatgtg taaggtcacg tgtgttgtgg ctcaccatta ctctgactcc 421 tagacatcag caaggatgat gtttgtagat gatgtggagg cccgaggtcc agttcagctg 481 tgcacacagc tcagacgcaa cagcactttc cgctcagtca ccccgggagg agcagttcaa 541 gtgaacttcc catcatgcac ggagttcaaa tgcagggtca caggactggc tcaatggcaa 601 acagtgcagc tttccctgcc caaaaccaaa ggcagaccga cccatcgaga aaaccatctc 661 aggctccaca ggtgtacacc gatggccaag gataaagtca attccacctc ccaaggagca 721 gtctgacctg catgataaca tactgtggag tggcagtgga gacttcttcc ctgaagacat 781 atgggcagcc agcggagaac catgaacacg aatggctctt tacaagaaca ctcagcccat 841 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 901 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 961 ctcctggtaa atga (18) Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 de Camundongo Determinada para 1A3, 1D3, 1F3, e 2B8 (derivada de camundongo da cepa AJ) (SEQ ID NO. 82) 1 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 61 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct 121 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg cagtctgacc 181 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc gagaccgtca 241 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 301 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc 361 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 421 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 481 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 541 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 601 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 661 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 721 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 781 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca gatggctctt 841 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 901 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 961 ctcctggtaa atga (19) Região Constante da Cadeia Leve Capa de Camundongo de Referência (V00807) e Região Constante da Cadeia Leve Capa de Camundongo Determinada para 1D3, 1F3, e 2B8 (derivada de camundongo da cepa AJ) (SEQ ID NO. 83) 1 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 61 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 121 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 181 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac 241 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 301 gcttcaacag gaatgagtgt tag (20) Região Constante da Cadeia Leve Capa de Camundongo Determinada para 1A3 contendo um nucleotídeo alterado em comparação com 1D3, 1F3, e 2B8 (sublinhados) (SEQ ID NO. 84) 1 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 61 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 121 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 181 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcatgtt gaccaaggac gagtatgaac 241 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 301 gcttcaacag gaatgagtgt tag

[000126] Cada uma das sequências de aminoácido que define as regiões variáveis da cadeia pesada de imunoglobulina para os anticorpos produzidos no Exemplo 1 é descrita na Figura 2. Cada uma das sequências é alinhada com as outras e as sequências que definem o peptídeo de sinal, CDR1, CDR2 e CDR3 são identificadas por quadrados. A Figura 3 mostra um alinhamento das sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 separadas para cada um dos anticorpos.

[000127] Cada uma das sequências de aminoácido que define as regiões variáveis da cadeia leve de imunoglobulina para cada um dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 é descrita na Figura 4. Cada uma das sequências é alinhada com as outras e as sequências que definem o peptídeo de sinal, CDR1, CDR2 e CDR3 são identificadas por quadrados. A Figura 5 mostra um alinhamento das sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 separadas para cada um dos anticorpos.

[000128] Por conveniência, a Tabela 1 fornece um quadro de concordância que mostra a correspondência entre as sequências de anticorpo discutidas neste Exemplo com aquelas apresentadas na Listagem de Sequência. TABELA 1

[000129] Também, por conveniência, as seguintes sequências representam as sequências de cadeia pesada e leve de extensão completa reais ou contempladas (isto é, contendo ambas as sequências da região variável e constante) para cada um dos anticorpos descritos neste Exemplo. Observa-se que as regiões constantes dos anticorpos murinos 2F8, 3A12, 3B6, e 3D11 não foram sequenciadas, mas supõe-se que tenham as mesmas sequências de região constante que os anticorpos 1D3, 1F3, e 2B8, os quais foram sequenciados, já que eles todos foram derivados do camundongo da cepa AJ. É observado, entretanto, que as sequências da região variável descritas aqui podem ser ligadas a cada uma de várias sequências de região constante conhecidas daqueles versados na técnica para produzir cadeias pesadas e leves ativas de imunoglobulina de extensão completa. (1) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1A3 (Região Variável da Cadeia Pesada de 1A3 e Região Constante de IgG1) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 122) 1 atgaactttgggctcagattgattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctgaattcac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tgcagtgggt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca 241 gccagtgtga agggtcgatt agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt gggaggctta tttcagtaac cgcatacatt caccatctcc tgaggacaca tatggactac atctgtctat atgcctggtc gtccagcggt ctcagtgact cccggccagc ttgcatatgt tgtgctcacc 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (2) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1A3 (Região Variável da Cadeia Pesada de 1A3 e Região Constante de IgG1) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 123) 1 evqlvesggg lvqpggslkl scaaseftfs nyymswvrqt pekrlqwvay ispgggssyy 61 pasvkgrfti srdnakntly lqmsslksed tamyycarqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk (3) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1A3 (Região Variável Capa e Região Constante de 1A3) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 124) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgttt ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttat agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggacttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcatg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (4) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1A3 (Região Variável Capa e Região Constante) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 125) 1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcraseniy snlawyqqkq gkspqllvya atnladgvps 61 rfsgsgsgtq fslkinslqs edfgtyycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlm 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (5) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 2B8 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 2B8) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 126) 1 atgggatggagctatatcatcctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 61 gtccaactgc agcagcctgg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttca agagcaaggc gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg accactctca cagtctcctc agccaaaacg ggctgaactg cttcaccacc tggagagatt cacactgact tgaggactct gggccaaggc 421 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 481 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 541 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 601 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 661 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 721 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 781 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 841 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 901 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 961 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1021 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1081 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1141 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1201 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1261 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1321 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1381 aaatga (6) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 2B8 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 2B8) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 127) 1 qvqlqqpgae lvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqr pgqglewige inptnghtny 61 nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarny vgsifdywgq gttltvssak 121 ttppsvypla pgsaaqtnsm vtlgclvkgy fpepvtvtwn sgslssgvht fpavlqsdly 181 tlsssvtvps stwpsetvtc nvahpasstk vdkkivprdc gckpcictvp evssvfifpp 241 kpkdvltitl tpkvtcvvvd iskddpevqf swfvddvevh taqtqpreeq fnstfrsvse 301 lpimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka pqvytipppk eqmakdkvsl 361 tcmitdffpe ditvewqwng qpaenykntq pimdtdgsyf vysklnvqks nweagntftc 421 svlheglhnh htekslshsp gk (7) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 2B8 (Região Variável Capa e Região Constante de 2B8) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 128) 1 atggaatcacagactctggtcttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (8) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 2B8 (Região Variável Capa e Região Constante de 2B8) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 129) 1 nivmtqspks msmsvgervt lsckasenvv syvswyqqkp aqspklliyg asnrntgvpd 61 rftgsgsatd ftltissvra edladyhcgq synypytfgg gtrleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (9) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 2F8 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 2F8) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 130) 1 atggaatgga gctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactgccag 61 gtccagctga agcagtctgg agctgagctg gtgaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcactacc tactatatac actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacagggcc ttgagtggat tggaaagatt ggtcctggaa gtggtagtac ttactacaat 241 gagatgttca aagacaaggc cacattgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 301 cagctcagca gcctgacatc tgacgactct gcggtctatt tctgtgcaag aaggggactg 361 ggacgtggct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccaaaacg 421 acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 481 accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 541 ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 601 ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 661 gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 721 tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 781 cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 841 agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 901 gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 961 cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1021 gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1081 caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1141 tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1201 ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1261 tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1321 gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1381 aaatga (10) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 2F8 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 2F8) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 131) 1 qvqlkqsgae lvrpgtsvkm sckasgytft tyyihwvnqr pgqglewigk igpgsgstyy 61 nemfkdkatl tvdtssstay mqlssltsdd savyfcarrg lgrgfdywgq gttltvssak 121 ttppsvypla pgsaaqtnsm vtlgclvkgy fpepvtvtwn sgslssgvht fpavlqsdly 181 tlsssvtvps stwpsetvtc nvahpasstk vdkkivprdc gckpcictvp evssvfifpp 241 kpkdvltitl tpkvtcvvvd iskddpevqf swfvddvevh taqtqpreeq fnstfrsvse 301 lpimhqdwln gkefkcrvns aafpapiekt isktkgrpka pqvytipppk eqmakdkvsl 361 tcmitdffpe ditvewqwng pimdtdgsyf vysklnvqks nweagntftc 421 svlheglhnh htekslshsp gk (11) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 2F8 (Região Variável Capa e Região Constante de 2F8) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 132) 1 atggagacagacacaatcctgctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 61 ttggctgtgt gacattgtgc tgacccaatc ctctagggca gagggccacc tccagcttct 121 tatgatggta atctcctgca aggccagcca atagttatat caactggtac aagtgttgat 181 ctcatctatg caacagaaac caggacagcc ttgcatccaa tctagaatct acccaaagtc 241 tctgggacag gggatcccag ccaggtttag acttcaccct caacatccat tggcagtggg 301 tactgtcagc cctgtggagg aggaggatgc aaagtattga ggatcctccc tgcaacctat 361 aaacgggctg acgttcggtg ctgggaccaa atgctgcacc aactgtatcc gctggagctg 421 tctggaggtg atcttcccac catccagtga cctcagtcgt gtgcttcttg gcagttaaca 481 aagtggaaga aacaacttct accccaaaga ttgatggcag tgaacgacaa catcaatgtc 541 gacagcaaag aatggcgtcc tgaacagttg acagcaccta cagcatgagc gactgatcag 601 gaacgacata agcaccctca cgttgaccaa acagctatac ctgtgaggcc ggacgagtat 661 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag (12) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 2F8 (Região Variável Capa e Região Constante de 2F8) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 133) 1 divltqspas lavslgqrat isckasqsvd ydgnsyinwy qqkpgqppkv liyvasnles 61 giparfsgsg sgtdftlnih pveeedaaty ycqqsiedpp tfgagtklel kradaaptvs 121 ifppsseqlt sggasvvcfl nnfypkdinv kwkidgserq ngvlnswtdq dskdstysms 181 stltltkdey erhnsytcea thktstspiv ksfnrnec (13) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3B6 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 3B6) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 134) 1 atggaatggc cttgtatctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgaaggtgt ccactcccag 61 gttcagctgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc 121 tgcaaggctt ctggctatgt attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 181 ggacagggtc ttgagtggat tggacagatt tatcctggag atggtgatag taactacaat 241 ggaaacttca agggtaaagc cacactgact gcagacaaat cctccagtac agcctacatg 301 cagctcagca gcctaacatc tgaggactct gcggtctatt tctgtgcatc ccagctcggg 361 ctacgtgaga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 421 aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 481 atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 541 aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 601 tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 661 tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 721 tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 781 ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 841 gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 901 cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 961 gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1021 agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1081 gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1141 ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1201 gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1261 ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1321 tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1381 cctggtaaat ga (14) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3B6 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 3B6) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 135) 1 qvqlqqsgae lvrpgssvki sckasgyvfs sywmnwvkqr pgqglewigq iypgdgdsny 61 ngnfkgkatl tadkssstay mqlssltsed savyfcasql glrenyfdyw gqgttltvss 121 akttppsvyp lapgsaaqtn smvtlgclvk gyfpepvtvt wnsgslssgv htfpavlqsd 181 lytlsssvtv psstwpsetv tcnvahpass tkvdkkivpr dcgckpcict vpevssvfif 241 ppkpkdvlti tltpkvtcvv vdiskddpev qfswfvddve vhtaqtqpre eqfnstfrsv 301 selpimhqdw lngkefkcrv nsaafpapie ktisktkgrp kapqvytipp pkeqmakdkv 361 sltcmitdff peditvewqw ngqpaenykn tqpimdtdgs yfvysklnvq ksnweagntf 421 tcsvlheglh nhhtekslsh spgk (15) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3B6 (Região Variável Capa e Região Constante de 3B6) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 136) 1 ATGgacATGaggacccctgctcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 61 aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 121 gtcacaatca cttgcaaggc gagtcaggac attaaaagct atttaagctg gttccagcag 181 aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa acagattggt agatggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattctt ctctcaccat caccagcctg ttcaacagga atgagtgtta g (16) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3B6 (Região Variável Capa e Região Constante de 3B6) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 137) 1 dikmtqspss myaslgervt itckasqdik sylswfqqkp gkspktliyr vnrlvdgvps 61 rfsgsgsgqd ssltitslen edmgiyyclq ydefpftfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (17) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3D11 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 3D11) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 138) 1 atggctgtcc cggtgctgtt cctctgcctg gttgcatttc caagctgtgt cctgtcccag 61 gtacagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcact 121 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 181 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 241 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 301 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 361 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcagcca aaacgacacc cccatctgtc 421 tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa actaactcca tggtgaccct gggatgcctg 481 gtcaagggct atttccctga gccagtgaca gtgacctgga actctggatc cctgtccagc 541 ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag tctgacctct acactctgag cagctcagtg 601 actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc 661 agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata 721 tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc 781 accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc 841 gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc 901 cgggaggagc agttcaacag cactttccgc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag 961 gactggctca atggcaagga gttcaaatgc agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc 1021 atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt 1081 ccacctccca aggagcagat ggccaaggat aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac 1141 ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac 1201 aagaacactc agcccatcat ggacacagat ggctcttact tcgtctacag caagctcaat 1261 gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat actttcacct gctctgtgtt acatgagggc 1321 ctgcacaacc accatactga gaagagcctc tcccactctc ctggtaaatg a (18) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3D11 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 3D11) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 139) 1 qvqlkesgpg lvapsqslsi tctvsgfslt syslhwvrqp pgkglewlgv iwaggntnyn 61 sslmsrltir kdnsksqvfl kmnslqtddt amyycarerf aywgqgtlvt vsaakttpps 121 vyplapgsaa qtnsmvtlgc lvkgyfpepv tvtwnsgsls sgvhtfpavl qsdlytlsss 181 vtvpsstwps etvtcnvahp asstkvdkki vprdcgckpc ictvpevssv fifppkpkdv 241 ltitltpkvt cvvvdiskdd pevqfswfvd dvevhtaqtq preeqfnstf rsvselpimh 301 qdwlngkefk crvnsaafpa piektisktk grpkapqvyt ipppkeqmak dkvsltcmit 361 dffpeditve wqwngqpaen ykntqpimdt dgsyfvyskl nvqksnweag ntftcsvlhe 421 glhnhhteks lshspgk (19) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3D11 (Região Variável Capa e Região Constante de 3D11) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 140) 1 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt caaaatatcc 61 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatatcc aggggagaag 121 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 181 tcaggcacct cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct 241 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactccc tcacaatcag tagtatggag 301 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccact cacgttcggt 361 gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 421 ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 481 taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 541 ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 601 acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 661 acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag (20) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3D11 (Região Variável Capa e Região Constante de 3D11) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 141) 1 qivltqspai msaypgekvt mtcsasssvs ymhwyqqksg tspkrwiydt sklasgvpar 61 fsgsgsgtsy sltissmeae daatyycqqw ssnpltfgag tklelkrada aptvsifpps 121 seqltsggas vvcflnnfyp kdinvkwkid gserqngvln swtdqdskds tysmsstltl 181 tkdeyerhns ytceathkts tspivksfnr nec (21) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1D3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 1D3) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 142) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtgac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtgtgag acaaggggat 361 ggttattacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt catcgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (22) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1D3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 1D3) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 143) 1 evqlvesggg lvqpggslkl scaasgftfs dyymswvrqt pekrlewvay issgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnakntly lqmsslksed taiyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsviv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk (23) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1D3 (Região Variável Capa e Região Constante de 1D3) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 144) 1 atgagtgtgcccactcaggtcctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgtcagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agtaatttag cgtggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (24) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1D3 (Região Variável Capa e Região Constante de 1D3) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 145) 1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcrtseniy snlawyqqkq gkspqlliya atnladgvps 61 rfsgsgsgtq fslrinslqs edfgryycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (25) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1F3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 1F3) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 146) 1 atgaactttgggctcagattgattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgag 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagtctg gagggtccct gaaactctcc 121 tgtgcggcct ctggattcac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgagca gtctgaagtc gccatgtatt actgtgtaag acaaggggat 361 ggttactacg gggactatgc tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (26) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 1F3 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 1F3) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 147) 1 evqlvesggg lvqsggslkl scaasgftfs nyfmswvrqt pekrlewvay issgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnakntly lqmsslksed tamyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk (27) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1F3 (Região Variável Capa e Região Constante de 1F3) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 148) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgat gcaacacact taccagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gtttggaggg 361 gggaccagac tggaaattaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (28) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 1F3 (Região Variável Capa e Região Constante de 1F3) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 149) 1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcraseniy snlawyqqkq gkspqllvyd athlpdgvps 61 rfsgsgsgtq fslkinslqs edfgsyycqh fwgtpytfgg gtrleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec (29) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3A12 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 3A12) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 150) 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 61 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaaatctcc 121 tgtgcagcct ctggatttac tttcagtaac tatttcatgt cttgggttcg ccagactcca 181 gagaagaggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggtg gtggtagcac ctactatcca 241 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 301 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 361 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 421 tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact 481 aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg 541 acctggaact ctggatccct gtccagcggt gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct 601 gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc 661 gtcacctgca acgttgccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc 721 agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 781 ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 841 gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 901 gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 961 gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 1021 gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 1081 ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 1141 gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 1201 tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 1261 tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 1321 ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 1381 cactctcctg gtaaatga (30) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Pesada de Extensão Completa de 3A12 (Região Variável da Cadeia Pesada e Região Constante de IgG1 de 3A12) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 151) 1 evqlvesggg lvqpggslki scaasgftfs nyfmswvrqt pekrlewvay issgggstyy 61 pdsvkgrfti srdnakntly lqmnslksed tamyycvrqg dgyygdyamd ywgqgtsvtv 121 ssakttppsv yplapgsaaq tnsmvtlgcl vkgyfpepvt vtwnsgslss gvhtfpavlq 181 sdlytlsssv tvpsstwpse tvtcnvahpa sstkvdkkiv prdcgckpci ctvpevssvf 241 ifppkpkdvl titltpkvtc vvvdiskddp evqfswfvdd vevhtaqtqp reeqfnstfr 301 svselpimhq dwlngkefkc rvnsaafpap iektisktkg rpkapqvyti pppkeqmakd 361 kvsltcmitd ffpeditvew qwngqpaeny kntqpimdtd gsyfvyskln vqksnweagn 421 tftcsvlheg lhnhhteksl shspgk (31) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3A12 (Região Variável Capa e Região Constante de 3A12) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 152) 1 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 61 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 121 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 181 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 241 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 301 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaaac tagaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 421 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 481 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 541 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 601 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 661 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag (32) Sequência de Proteína que Define a Sequência da Cadeia Leve de Extensão Completa de 3A12 (Região Variável Capa e Região Constante de 3A12) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 153) 1 diqmtqspas lsvsvgetvt itcraseniy inlawyqqkq gkspqllvha atkladgvps 61 rfsgsgsgtq yslkinslqs edfgsyycqh fwgtpytfgg gtkleikrad aaptvsifpp 121 sseqltsgga svvcflnnfy pkdinvkwki dgserqngvl nswtdqdskd stysmsstlt 181 ltkdeyerhn sytceathkt stspivksfn rnec

[000130] Por conveniência, a Tabela 2 fornece um quadro de concordância que mostra a correspondência entre as sequências de extensão completa dos anticorpos discutidos neste Exemplo com aqueles apresentados na Listagem de Sequência. TABELA 2

Exemplo 3 - Produção de Várias Proteínas hHGF Recombinantes

[000131] Este Exemplo descreve a clonagem e expressão de várias proteínas recombinantes usadas para caracterizar os anticorpos criados no Exemplo 1 e no Exemplo 14. Em particular, este Exemplo descreve a clonagem e expressão da proteína hHGF recombinante, uma proteína hHGF recombinante que contém uma substituição de glicina para glutamato na posição 555 (G555E), uma proteína hHGF recombinante que contém uma substituição de cisteína para arginina na posição 561 (C561R), uma proteína HGF quimérica camundongo- humano-camundongo (mhm) recombinante contendo a sequência de HGF V495-L585 humana disposta dentro da sequência de HGF de camundongo, uma proteína de HGF quimérica mhm recombinante contendo a sequência de HGF I499-R566 humana disposta dentro da sequência de HGF de camundongo, e uma proteína de HGF quimérica mhm recombinante contendo a sequência de HGF W507-L585 humana disposta dentro da sequência de HGF de camundongo.

[000132] Os seguintes construtos de expressão foram gerados usando técnicas moleculares usuais e as sequências de cDNA resultantes foram confirmadas por sequenciamento de DNA:

a. hHGF-Fc

[000133] Em um primeiro ciclo de PCR, dois fragmentos de PCR sobreponíveis foram gerados introduzindo um sítio de Not I e codificando um sinalizador 6xHis entre hHGF e hIgFc. Os fragmentos de PCR sobreponíveis serviram como molde em um segundo ciclo para amplificar hHGF-his-IgFc. O fragmento resultante foi digerido por NheI e BamHI e clonado em pcDNA5/FRT (Invitrogen, #35-3014). Então, hHGF foi amplificado a partir do clone ID: IOH29794 (cDNA de HGF humano) da Invitrogen. A sequência correspondeu à sequência depositada no NCBI sob o número de acesso NM_000601.4. (1) Iniciador de Nhel de hHGF5’ ACTGGCTAGCATGTGGGTGACCAAACTCCT (SEQ ID NO. 102) (2) Iniciador de His Tag de Notl hHGF 3’ GTGATGGTGATGGTGATGGCGGCCGCATGACTGTGGTACCTTATA TG (SEQ ID NO. 103) (3) Iniciador de HisIgFc 5’ ACTGGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC (SEQ ID NO. 104) (4) Iniciador de BamHI de IgFc 3’ ACTGGGATCCTCACTATTTACCCGGGGACAG (SEQ ID NO. 105) b. G555E de hHGF-Fc e C561R de hHGF-Fc

[000134] Os mutantes de hHGF-Fc, G555E e C561R, foram gerados por mutagênese sítio-dirigida usando o kit de mutagênese sítio- dirigida QuikChange II XL (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. (1) Iniciador senso de hHGF-Fc (G555E) CATGATGTCCACGAAAGAGGAGATGAG (SEQ ID NO. 106) (2) Iniciador anti-senso de hHGF-Fc (G555E) CTCATCTCCTCTTTCGTGGACATCATG (SEQ ID NO. 107) (3) Iniciador senso de hHGF-Fc (C561R) GGAAGAGGAGATGAGAAACGCAAACAGGTTCTCAATG (SEQ ID NO. 108) (4) Iniciador anti-senso de hHGF-Fc (C561R) CATTGAGAACCTGTTTGCGTTTCTCATCTCCTCTTCC (SEQ ID NO. 109) c. Fc quimérico camundogno-humano-camundongo

[000135] O construto de IgFc quimérico camundongo-humano- camundongo contém uma cadeia-alfa de mHGF, aminoácidos da cadeia β Val 495-Leu 585 de HGF humano, e a cadeia beta C-terminal de mHGF seguido por sinalizador 6xHis e IgG-Fc.

[000136] cDNA de HGF humano que codifica os aminoácidos V495- L585 foi amplificado a partir do clone ID: IOH29794 (cDNA de HGF humano) da Invitrogen. A sequência corresponde à sequência depositada no NCBI sob o número de acesso NM_000601.4. Sequências de HGF de camundongo foram amplificadas por RT-PCR a partir de RNA total de fígado de camundongo (Clontech, # 636603) usando o kit de RT-PCR Super Script One Step da Invitrogen (#10928- 034) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência de cDNA de mHGF corresponde à sequência depositada no NCBI sob o número de acesso D10213.1.

[000137] Três fragmentos, referidos como 1, 2 e 3 foram gerados usando iniciadores de PCR sobreponíveis e anelados em ciclos consecutivos de amplificação por PCR. O produto final foi clivado com NheI e NotI e clonado em pcDNA5/FRT IgGFc. (1) Iniciadores do fragmento 1 para NheI 5’ da cadeia alfa de mHGF 5’ATCGGCTAGCATGATGTGGGGGACCAAAC (SEQ ID NO. 110) 3’ GAATCCCATTTACAACCCGCAGTTGTTTTGTTTTGG (SEQ ID NO. 111) (2) Iniciadores do fragmento 2 para aa V495-L585 da cadeia alfa de hHGF 5’ CCAAAACAAAACAACTGCGGGTTGTAAATGGGATTC (SEQ ID NO. 112) 3’ CAGGATTGCAGGTCGAGCAAGCTTCATTAAAACCAGATCT (SEQ ID NO. 113) (3) Iniciadores do fragmento 3 para NotI3’ C-terminal da cadeia beta de mHGF 5’ AGATCTGGTTTTAATGAAGCTTGCTCGACCTGCAATCCTG (SEQ ID NO. 114) 3’ GTAATTTTGACATACAAGTTGTGCGGCCGCCATCACCATCACCATCA C (SEQ ID NO. 115) d. Construção de quimeras de hHGF e mhm

[000138] Os vetores que codificam as quimeras de hHGF e mhm (V495-L585), pcDNA5/FRT hHGF e quimera pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585), sem Fc-tag foram gerados por mutagênese sítio-dirigida. Um códon de parada foi introduzido a 3’ de 6xHis usando o kit de mutagênese sítio-dirigida QuikChange II XL (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores da mutagênese incluíram o iniciador 1: CATCACCATCACCATCACTAAGCGGGTCTGGTGCCACG (SEQ ID NO. 116), e o Iniciador 2: CGTGGCACCAGACCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATG (SEQ ID NO. 117).

[000139] Além disso, duas quimeras de mhm adicionais foram criadas a partir do construto de pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585) por mutagênese sítio-dirigida usando o kit de mutagênese sítio-dirigida QuikChange II XL (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Um construto de mhm continha a região de I499-R556 de hHGF disposta entre as sequências murinas. O outro construto de mhm continha a região de W507-L585 de hHGF disposta entre as sequências murinas.

[000140] Para a quimera de mhm (I499-R556), as seguintes mutações pontuais foram feitas em ordem no construto molde da quimera pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585): D558E, C561R, V564I, V567I e M583L, usando as sequências de oligonucleotídeo apropriadas. Para a quimera de mhm (W507-L585), as seguintes mutações pontuais foram introduzidas em uma etapa na quimera molde pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585): Q502R, N504T e I505V, usando as sequências de oligonucleotídeo apropriadas.

[000141] A sequência de nucleotídeo resultante da proteína hHGF- Fc é descrita como SEQ ID NO. 118, incluindo a sequência de sinal (nucleotídeos 1-93) e pró-domínio (nucleotídeos 94 a 162). A sequência de aminoácido da proteína hHGF-Fc é descrita como SEQ ID NO. 119.

[000142] A sequência de nucleotídeo resultante que codifica a proteína mhm (V495-L585)-Fc quimérica é descrita em SEQ ID NO. 120, incluindo a sequência de sinal (nucleotídeos 1 a 96) e o pró- domínio (nucleotídeos 97 a 165). A sequência de aminoácido da proteína quimérica mhm (V495-L585)-Fc é descrita em SEQ ID NO. 121.

[000143] A sequência de nucleotídeo resultante que codifica e a sequência de proteína que define o construto de mhm (V495-L585) são descritas em SEQ ID NOS. 211 e 212, respectivamente. A sequência de ácido nucléico descrita em SEQ ID NO. 211 inclui a sequência de sinal (nucleotídeos 1 a 96) e o pró-domínio (nucleotídeos 97 a 165), e a sequência de proteína descrita em SEQ ID NO. 212 inclui a sequência de proteína ativa (sem a sequência de sinal ou o pró-domínio). A sequência de nucleotídeo resultante que codifica e a sequência de proteína que define o construto de mhm (I499-R556) são descritas em SEQ ID NOS. 213 e 214, respectivamente. A sequência de ácido nucléico descrita em SEQ ID NO. 213 inclui a sequência de sinal (nucleotídeos 1 a 96) e o pró-domínio (nucleotídeos 97-165), e a sequência de proteína descrita em SEQ ID NO. 214 inclui a sequência de proteína ativa (sem a sequência de sinal ou o pró-domínio). A sequência de nucleotídeo resultante que codifica e a sequência de proteína que define mhm (W507-L585) são descritas em SEQ ID NOS. 215 e 216, respectivamente. A sequência de ácido nucléico descrita em SEQ ID NO. 215 inclui a sequência de sinal (nucleotídeos 1 a 96) e o pró-domínio (nucleotídeos 97 a 165), e a sequência de proteína descrita em SEQ ID NO. 216 inclui a sequência de proteína ativa (sem a sequência de sinal ou o pró-domínio).

e. Expressão de Proteína (1) Cultura celular

[000144] Células CHO FlpIn (Invitrogen, N° de catálogo R758-07)) foram cultivadas em meio F12K (ATCC, N° de catálogo 30-2004), 10% de FCS (Invitrogen, N° de catálogo 10438026), 1% de Penicilina (10000 unidades/mL)/ estreptomicina (10.000 Qg/mL) (Invitrogen, N° de catálogo 15140-122) a 37°C, 5% de CO2, 100 μg/mL de Zeocina (Invitrogen, N° de catálogo R250-01).

(2) Geração de Linhagens Celulares CHO estáveis

[000145] As células hospedeiras CHO FlpIn foram transfectadas com uma proporção 9:1 de DNA de plasmídeo de expressão pOG44:pcDNA5/FRT usando lipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, N° de catálogo 11668-027). Como controles, as células foram transfectadas com o vetor vazio pcDNA5/FRT vetor/pOG44 e plasmídeo pOG44 (Invitrogen, N° de catálogo 35-3018) apenas. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram repicadas, e após quarenta e oito horas 0,5 mg/mL de Higromicina B (Sigma, N° de catálogo H0654-SPEC) foi adicionado às células. A seleção policlonal de células estáveis foi realizada em F12K, 10% de FCS, 1% de Penicilina/Estreptomicina, 0,5 mg/mL de Higromicina B.

(3) Expressão de proteína em linhagens celulares CHO FlpIn estáveis

[000146] Aproximadamente 2x106células foram semeadas em placas de 15 cm e cultivadas em F12K (ATCC, N° de catálogo 30- 2004)/DMEM com alto teor de glicose (Invitrogen, N° de catálogo 11995065) 1:1, 5% de ultra low IgG FCS (Invitrogen, #16250-78) a 37°C, 5% de CO2 por 5 a 6 dias. Os sobrenadantes foram colhidos e as proteínas resultantes analisadas por ELISA e por ressonância de plásmon de superfície.

Exemplo 4 - Características de ligação de Anticorpos Monoclonais Anti-hHGF

[000147] Os anticorpos monoclonais produzidos no Exemplo 1 foram caracterizados por sua habilidade de se ligar a hHGF, e algumas das proteínas HGF recombinantes produzidas no Exemplo 3.

[000148] Os anticorpos foram analisados por ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento BIAcore T100 para avaliar sua habilidade de se ligar a HGF e algumas das proteínas de fusão discutidas no Exemplo 3. Cada anticorpo foi imobilizado sobre um chip sensor CM5 de dextrano carboxilado (BIAcore, N° de catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N° de catálogo BR- 1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as instruções do fabricante.

[000149] As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, N° de catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, N° de catálogo R-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, N° de catálogo 2930) e 10 mg/mL de Sal de Sódio CM-Dextran (Fluka, N° de catálogo 86524) como tampão de corrida. Sobrenadantes contendo diferentes proteínas de fusão de HGF ou sobrenadante de células transfectadas com o vetor vazio foram injetados sobre cada anticorpo em uma taxa de fluxo de 30 μL/min por 3 minutos. A ligação resultante foi determinada como unidades de ressonância (RU) sobre o basal 30 segundos após o final da injeção. A ligação foi comparada com HGF humano (R&D Systems, N° de catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida. Ligação inespecífica foi monitorada por comparar a ligação a uma superfície de controle onde IgG de camundongo (Rockland, N° de catálogo 010-0102) foi imobilizada usando o mesmo procedimento de acoplamento de amina.

[000150] Os resultados estão resumidos na Tabela 3. TABELA 3

[000151] Os resultados na Tabela 3 demonstram que cada um dos anticorpos se liga a rHGF e HGF humano purificado. Além disso, todos os anticorpos se ligam a hHGF contendo as mutações pontuais G555E e C561R. Em geral, todos os anticorpos exceto 1F3 e 2F8 não se ligam a murino demonstrando que os anticorpos 1A3, 1D3, 2B8, 3A12, 3B6, e 3D11 se ligam especificamente a HGF humano. Os anticorpos 1D3, 1F3, e 2B8 se ligam à quimera de camundongo-humano- camundongo, enquanto que os anticorpos restantes não se ligaram. Os resultados sugerem que os anticorpos 1D3 e 2B8 se ligam pelo menos em parte aos resíduos 495 a 585 de HGF humano. Os anticorpos 1A3, 3A12, 3B6, e 3D11 parecem se ligar a porções de hHGF humano com exceção dos resíduos 495 a 585. No momento é não se sabe o motivo de 2F8 não se ligar à quimera de mhm já que ele parece se ligar tanto a hHGF quanto mHGF.

Exemplo 5 - Habilidade dos Anticorpos Monoclonais Anti-hHGF se Ligarem a HGF Reduzido e Não-Reduzido

[000152] Neste Exemplo, os anticorpos monoclonais anti-hHGF produzidos no Exemplo 1 foram analisados quanto a sua habilidade de se ligar a HGF reduzido e não reduzido.

[000153] A reatividade dos soros anti-HGF com o hHGF recombinante foi avaliada por immunoblotting. Oito μg de proteína hHGF recombinante em tampão de corrida NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen) com ou sem tampão redutor de amostra NuPAGE (Invitrogen) foram fracionados em um gel de Bis-Tris 4 a 12% com cavidades de 1,0mm X 2D (Invitrogen, Carlsbad, CA). As proteínas fracionadas foram então transferidas para uma membrana de nitrocelulose usando procedimentos usuais. As membranas de nitrocelulose foram bloqueadas com solução de leite em pó desnatado a 5% em Salina Tamponada com Tris com 0,1% de Tween-20® (TBST), e então colocadas em um equipamento Mini Protean II MultiScreen (BioRad) para bloqueio adicional.

[000154] As membranas resultantes foram marcadas com os anticorpos purificados em um equipamento Multi-Screen. Os anticorpos purificados foram diluídos para 5 μg/mL em tampão de bloqueio. A membrana de nitrocelulose foi então removida do equipamento, e incubada com anticorpos anti-IgG de camundongo marcada com peroxidase de rábano silvestre. Os resultados estão resumidos na Tabela 4, onde os números refletem a extensão de ligação com - representando a ligação mínina (pouca ou nenhuma ligação) e 3+ representando a ligação máxima. TABELA 4

[000155] Os dados na Tabela 4 demonstram que todos os anticorpos se ligam a rhHGF não-reduzido. Em oposição, os anticorpos monoclonais 1A3, 1D3, 1F3, 2F8, 3B6 se ligaram a rhHGF reduzido mas os anticorpos 2B8, 3A12, e 3D11 não se ligaram a rhHGF.

Exemplo 6 - Afinidades de Ligação

[000156] As afinidades de ligação e cinéticas de interação de cada um dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 contra hHGF foram medidas por ressonância de plásmon de superfície.

[000157] Imunoglobulinas de coelho anti-camundongo (BIAcore, N° de catálogo BR-1005-14) foram imobilizadas sobre chips sensores CM5 de dextran carboxilado (BIAcore, N° de catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N° de catálogo BR-1000-50) usando um protocolo usual de acordo com as instruções do fabricante. As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, N° de catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, N° de catálogo BR-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, N° de catálogo 2930), e 10 mg/mL de Sal de Sódio CM-Dextran (Fluka, N° de catálogo 86524) como tampão de corrida.

[000158] Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo individual em uma taxa de fluxo de 10 μL/min. O tempo de injeção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, N° de catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida foi injetado sequencialmente sobre uma superfície de referência (nenhum anticorpo capturado) e sobre a superfície ativa (anticorpo a ser testado) por 2 minutos a 60 μL/min. A fase de dissociação foi monitorada por 15 ou 90 minutos, dependendo da concentração. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl, pH 1,7 (BIAcore, N° de catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μL/min antes de outro ciclo ser iniciado. As concentrações de HGF testadas foram 0,46 nM a 7,5 nM.

[000159] Os parâmetros de cinética foram determinados usando a função de cinética do programa BIAevalutation com subtração da referência. Os parâmetros de cinética para cada anticorpo ka (constante da taxa de associação), kd (constante da taxa de dissociação) e KD (constante de dissociação de equilíbrio) estão resumidos na Tabela 5. TABELA 5

[000160] Os dados na Tabela 5 demonstram que os anticorpos se ligam a hHGF com um KD de cerca de 100 pM ou menos, cerca de 50 pM ou menos, ou 20 pM ou menos.

Exemplo 7 - Atividade de Neutralização de Anticorpos Anti-hHGF

[000161] Neste exemplo, os anticorpos produzidos no Exemplo 1 foram caracterizados quanto a sua habilidade de (a) inibir a ligação de hHGF a c-Met, e (b) inibir a incorporação de BrdU estimulada por HGF em células 4MBr-5.

a. Ensaio de Inibição de Ligação de HGF-Met (Ensaio de Neutralização)

[000162] Os anticorpos foram testados por ELISA quanto a sua habilidade de inibir a ligação de hHGF a c-Met.

[000163] Especificamente, placas de ensaio DELFIA de 96 cavidades Wallac (Wallac Inc., N° de catálogo AAAND-0001) foram revestidas com 100 μL de HGF a 6,25 μg/mL (R&D Systems, N° de catálogo 294-HGN-025) em tampão de revestimento de carbonato (15 mM de Na2CO3 e 34 mM de NaHCO3, pH 9,0) por 16 horas a 4°C. As placas foram então bloqueadas com 200 μL de leite em pó desnatado a 5% em PBS por 1 hora em temperatura ambiente. Os anticorpos foram preparados em uma placa separada por adicionar concentrações crescentes dos anticorpos sob investigação (0,033 a 667 nM, diluição seriada de 3 vezes) a 2 nM de c-Met (R&D Systems, N° de catálogo 358-MT/CF) em leite em pó desnatado a 5% em PBS. 100 μL de amostra por cavidade foram transferidos para a placa de ensaio e incubados durante a noite a 4°C. As placas de ensaio foram então lavadas três vezes com PBS-0,1% de Tween 20, e incubados por 2 horas em temperatura ambiente com 100 μL/cavidade de anticorpo anti-c-Met humano biotinilado a 2 μg/mL (R&D Systems, N° de catálogo BAF358) preparado em leite em pó desnatado a 5% em PBS.

[000164] As placas resultantes foram então lavadas três vezes com PBS-0,1% de Tween 20, e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente com Estreptavidina marcada com Eu (Wallac, N° de catálogo 1244-360) diluída 1:1000 em tampão de ensaio DELFIA (Wallac, N° de catálogo 4002-0010). As placas resultantes foram lavadas 3 vezes com solução de lavagem DELFIA (Wallac, N° de catálogo 4010-0010) e incubadas com 100 μL/cavidade de solução de intensificação DELFIA (Wallac #4001-0010) por 15 minutos em temperatura ambiente com agitação.

[000165] As placas foram lidas em um instrumento Victor3V (Perkin Elmer) usando o método de Európio. Os valores de IC50 foram calculados e estão resumidos na Tabela 6. TABELA 6

[000166] Os resultados demonstram que tod os os anticorpos (isto é, 1D3, 1A3, 2B8, 3A12, 1F3, 3D11, e 2F8) com exceção de 3B6 neutralizam eficazmente a ligação de HGF a c-Met.

b. Neutralização da Incorporação de BrdU Estimulada por HGF em células 4MBr-5

[000167] Dez μL de 12,5 nM de hHGF foram dispensados em cavidades individuais de uma placa de microtitulação de cultura de tecido de 96 cavidades (Costar, N° de catálogo 3903). Dez μL de anticorpos foram diluídos seriadamente em concentrações de 6667; 2222; 740; 247; 82; 27; 9,1; 3,0; 1,0; 0,33 nM foram adicionados a cada cavidade. A mistura de anticorpo de HGF foi então incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. Células epiteliais brônquicas de macaco 4MBr-5 (ATCC, CCL208) cultivadas em F-12K (ATCC, 302004), 15% de FBS (Gibco 10438-026), 30 ng/mL de EGF (Sigma E9644), 1% de penicilina/estreptomicina (PS, Gibco N° de catálogo 15140-122) foram dissociadas com Tripsina (Gibco, N° de catálogo 25200-056), ressuspensas em meio de ensaio (F-12K, 2,5% de FBS, 1% de PS) a 75.000 células/mL, e 80 μL da suspensão celular foi dispensada à mistura de anticorpo de HGF.

[000168] As células resultantes foram incubadas a 37°C, 5% de CO2. Quarenta e oito horas depois, 10 μL de BrdU a 100 μM (Roche, N° de catálogo 1669915) foram adicionados. Setenta e duas horas depois, o meio foi removido, as placas foram secas com secador de cabelo e foram processadas com ELISA de BrdU de acordo com as instruções do fabricante (Roche N° de catálogo 1669915).

[000169] O sinal luminescente foi quantificado por um leitor de placas Synergy HT (Bio-Tek). Os dados foram ajustados para uma dose- resposta sigmóide com inclinação variável com a equação y = inferior + (superior-inferior)/(1+10A(log(EC50-x)*inclinação)) em GraphPad Prism (GraphPad Software). Cada experimento foi repetido pelo menos 3 vezes em duplicatas e os valores de EC50 médios são apresentados na Tabela 7. TABELA 7

[000170] Os resultados na Tabela 7 demonstram que todos os anticorpos 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6, e 3D11 inibem a proliferação induzida por HGF em células 4MBr-5.

Exemplo 8 - Atividade Antidisperão de Anticorpos Anti-hHGF

[000171] Este Exemplo descreve uma caracterização dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 quanto a sua habilidade de inibir a atividade de dispersão induzida por HGF. HGF induz "dispersão" (motilidade) de aglomerados em células MDCK (ATCC, Manassas, VA, N° de catálogo CCL-34).

[000172] Células MDCK foram semeadas em placas de cultura de tecido de 96 cavidades Costar (Corning Incorporated, Corning, NY, N° de catálogo 3595) em uma densidade de 4x103células por cavidade em 80 μL de MEM (ATCC, Manassas, VA, N° de catálogo 30-2003) contendo 10% de Soro Fetal Bovino (Invitrogen N° de catálogo 10438026), e 1% de penicilina-estreptomcina (Invitrogen, N° de catálogo 15140122). Cada um dos anticorpos a ser investigado foi diluído para 6.667 nM em MEM contendo 10% de Soro Fetal Bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. Cada uma das diferentes diluições de anticorpo, assim como MEM contendo 10% de Soro Fetal Bovino e 1% de penicilina-estreptomicina sem anticorpo, foi então combinada separadamente com um volume igual de MEM contendo 10% de Soro Fetal Bovino e 1% de penicilina-estreptomicina, e 100 ng/ml de HGF (R&D Systems N° de catálogo 294-HGN-025). As diluições de anticorpo/HGF foram incubadas por 30 minutos a 25°C. Vinte μL de cada diluição de anticorpo/HGF foi adicionada separadamente à cavidades individuais, gerando uma concentração final de anticorpo de 666,7 nM, e uma concentração final de HGF de 10 ng/ml. As células MDCK foram então incubadas por 24 horas a 37oC com 5% de CO2.

[000173] Após 24 horas de incubação, as células MDCK foram cuidadosamente lavadas uma vez com 100 μL por cavidade de PBS gelado (Invitrogen N° de catálogo 14190144), e fixadas com 100 μL por cavidade de metanol gelado durante agitação por 10 minutos a 25°C. As placas foram então lavadas cuidadosamente uma vez com água destilada. Um volume de 100 μL de solução de cristal violeta, consistindo em 0,5% de cristal violeta (Sigma, St. Louis, MO, N° de catálogo C3886) e etanol a 50% em água destilada, foi adicionado a cada cavidade, e as células foram incubadas por 20 minutos a 25°C com agitação.

[000174] Após a marcação com solução de cristal violeta, as células foram lavadas cuidadosamente três vezes com água destilada. A seguir, PBS foi adicionado a cada cavidade para evitar o ressecamento das amostras. As células foram visualizadas usando o microscópio Leica DMIRB (Leica Microsystems GmbH, Wetzler, Alemanha), a câmera DC500 (Leica Microsystems GmbH, Wetzler, Germany), e o programa MagnaFire 2.1C (Optronics, Goleta, CA), e as amostras foram quantificadas quanto ao nível de dispersão. Os resultados estão resumidos na Tabela 8. TABELA 8

- Nenhuma inibição +++ Inibição muito grande, quase completa ++ Inibição forte + Inibição detectável

[000175] Os resultados na Tabela 8 demonstram que o anticorpo 2B8 inibiu a dispersão induzida por HGF mais do que os outros anticorpos. Os anticorpos 1D3 e 3B6 apresentaram um nível de inibição intermediário; o anticorpo 1A3 apresentou um nível de inibição baixo a intermediário. Os anticorpos 1F3 e 2F8 apresentaram um nível de inibição baixo; e os anticorpos 3A12 e 3D11 forneceram pouca ou nenhuma inibição detectável.

Exemplo 9 - Inibição de Fosforilação de c-Met estimulada por HGF

[000176] Este Exemplo descreve uma caracterização dos anticorpos produzidos no Exemplo 1 quanto a sua habilidade de inibir a fosforilação de c-Met estimulada por HGF em células PC-3. HGF induz a fosforilação de Met em células PC-3 (ATCC No. CRL-1435).

[000177] As células PC-3 foram semeadas em cavidades individuais de placas de cultura de tecido de 96 cavidades Costar (Corning N° de catálogo 3595) em uma densidade de 4,5 x 104células por cavidade em 100 μL de F-12K (ATCC, Manassas, VA, N° de catálogo 30-2004) contendo 10% de Soro Fetal Bovino (Invitrogen, N° de catálogo 10438026) e 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, N° de catálogo 15140122). Após 24 horas a 37°C com 5% de CO2, o meio foi removido, e as células foram enxaguadas uma vez com F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram então incubadas por 24 horas em 100 μL de F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina.

[000178] As 10 diferentes diluições a seguir de cada um dos anticorpos sendo investigados foram preparadas em F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina: 6667 nM, 2222 nM, 741 nM; 247 nM; 82,3 nM; 27,4 nM; 9,1 nM; 3,0 nM; 1,0 nM; e 0,3 nM. Cada diluição de anticorpo, e F-12K sem soro contendo 1% de penicilina- estreptomicina sem anticorpo, foram combinadas separadamente com um volume igual de F-12K sem soro contendo 1% de penicilina- estreptomicina e 500 ng/mL de HGF (R&D Systems N° de catálogo 294-HGN-025). Estas diluições de anticorpo/HGF foram incubadas por 30 minutos a 25oC. Isto resultou em uma concentração final de 1,25 nM de HGF.

[000179] As células PC-3 foram lavadas uma vez com F-12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina. A seguir, 70 μL de F- 12K sem soro contendo 1% de penicilina-estreptomicina foi adicionado às células, seguido por 10 μL de NaaVO4 a 10 mM (Sigma, N° de catálogo S6508) em F-12K sem soro contendo 1% de penicilina- estreptomicina. As células foram então incubadas por 60 minutos a 37oC com 5% de CO2. Após esta incubação, 20 μL de cada diluição de anticorpo/HGF foi adicionada aos separadamente a cavidades separados, produzindo uma concentração final de HGF de 50 ng/mL, e as seguintes concentrações finais de cada anticorpo 666,7 nM; 222,2 nM; 74,1 nM; 24,7 nM; 8,23 nM; 2,74 nM; 0,91 nM; 0,30 nM; 0,10 nM; 0,03 nM. As células foram então incubadas por 10 minutos a 37oC com 5% de CO2, e após isto, a mistura de meio/anticorpo/HGF foi removida, as placas foram plaqueadas em gelo. As células foram então lavadas uma vez com 100 μL por cavidade de PBS gelado (Invitrogen, N° de catálogo 14190144) contendo 1 mM de Na3VO4. As células foram então incubadas por 30 minutos a 4oC em 100 μL por cavidade de tampão de lise gelado consistindo em 1% de OmniPur Triton X-100 (MERCK KGaA, Darmstadt, Alemanha, N° de catálogo 9410), 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 100 mM de NaCl, 0,3 mM de Na3VO4, coquetel de inibidor de protease a 1x (Sigma, N° de catálogo P8340), e coquetel de inibidor de protease 2 a 1x (Sigma, N° de catálogo 5726).

[000180] Anticorpo anti-HGF-R humano biotinilado (c-met) (R&D Systems, N° de catálogo BAF358) foi diluído para uma concentração de 2 μg/mL em tampão de ensaio DELFIA Assay Buffer (PerkinElmer, Turku, Finland, N° de catálogo 4002-0010) contendo 1% de albumina sérica bovina (Sigma N° de catálogo A2153), e 50 μL por cavidade desta diluição foram adicionados de placas de microtitulação de estreptavidina amarela (PerkinElmer, N° de catálogo AAAND-0005). As placas foram então incubadas com anticorpo por 30 minutos a 25oC com agitação. Após a incubação, as placas foram lavadas com solução de lavagem DELFIA (PerkinElmer, N° de catálogo 4010-0010), e 80 μL de cada um dos diferentes lisados de células PC-3 foram adicionados a cavidades individuais das placas de microtitulação de estreptavidina lavadas.

[000181] As placas de microtitulação de estreptavidina contendo lisados de células PC-3 foram incubadas por 60 minutos a 25oC com agitação, e então lavadas com solução de lavagem DELFIA. 100 μL de 600 ng/mL de anticorpo DELFIA Eu-N1 P-Tyr-100 (PerkinElmer, N° de catálogo AD0159) diluído em DELFIA Assay Buffer contendo 1% de albumina sérica bovina foi adicionada a cada cavidade das placas de microtitulação de estreptavidina lavadas incubadas previamente com lisados de células PC-3. As placas foram incubadas por 60 minutos a 25oC, com agitação. As placas foram lavadas mais uma vez com solução de lavagem DELFIA. Então, 200 μL de DELFIA Enhancement Solution (PerkinElmer N° de catálogo 4001-0010) foram adicionados a cada cavidade das placas de microtitulação de estreptavina lavadas, e as placas foram incubadas no escuro por 5 minutos e 25oC, com agitação.

[000182] O sinal foi então medido usando o protocolo de Európio no leitor Victor3V (PerkinElmer). Os valores de EC50 foram calculados usando Prism 4 para Windows (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) e a equação dose-resposta sigmóide.

[000183] Os resultados resumidos como EC50s em nM estão tabulados na Tabela 9. TABELA 9

[000184] Os dados na Tabela 9 demonstram que todos os oito anticorpos são potentes inibidores da fosforilação de c-Met induzida por HGF em celilas PC-3.

Exemplo 10 - Inibição de Tumor em Modelo de Xenoenxerto de U87MG

[000185] A habilidade de anticorpos monoclonais murinos da invenção inibirem o crescimento tumoral foi testada em um modelo de xenoenxerto de U87MG. Células U87MG (ATCC) foram expandidas em cultura a 37°C em uma atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% de ar, usando um meio que compreende meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. As células foram subcultivadas e mantidas por desprender as células da parede da placa de cultura usando tripsina-EDTA.

[000186] Células quase confluentes foram coletadas por tripsinização e então 5 x 106 células em Matrigel 50% (BD Biosciences; N° de catálogo 356237) foram injetadas subcutaneamente na área dorsal superior entre a escápula de camundongos ICR SCID fêmeas de 7 semanas de idade (Taconic Labs). Os diâmetros (mm) mais longos (L) e mais curtos (W) dos tumores foram medidos com um compasso de calibre. O volume tumoral (vol) foi calculado como: (mm3) = L x W2 / 2. Quando os tumores cresceram para aproximadamente 200 mm3, os camundongos que possuíam os tumores foram randomizados em 5 grupos de 10 camundongos cada. Um grupo recebeu PBS. Cada um dos outros 4 grupos recebeu um dos anticorpos 1A3, 1D3, 1F3 ou 2B8. Todos os anticorpos foram administrados em doses de 1 mg/kg de peso corporal, duas vezes por semana, por injeções intraperitoneais de 5 doses. Os volumes tumorais e os pesos corporais dos camundongos foram registrados duas vezes por semana. A inibição do crescimento tumoral foi analisada usando o teste de t- Student. Os resultados estão resumidos na Figura 6 e na Tabela 10. TABELA 10

[000187] Regressão parcial foi obtida no grupo tratado com 2B8 (Figura 6). Inibição estatisticamente significativa do crescimento foi observada nos grupos tratados com 1A3 e nos tratados com 1F3 (Tabela 10). Houve uma inibição de crescimento do tumor de 51% para 1D3 com um valor de p de 0,075. Nenhuma perda corporal significativa foi observada.

Exemplo 11 - Inibição de Tumor em Modelo de Xenoenxerto de U118

[000188] A habilidade dos anticorpos 1A3, 1D3, 1F3 e 2B8 em inibir o crescimento tumoral foi testado em um modelo de xenoenxerto de U118. Células U118 (ATCC) foram expandidas como descrito no Exemplo 10 (acima) com relação às células U87MG.

[000189] Tumores subcutâneos foram estabelecidos como descrito no Exemplo 10 acima, exceto que os camundongos usados eram camundongos nude NCr fêmeas de 7 semanas de idade (Taconic), e o tratamento foi iniciado quando os tumores atingiram aproximadamente 80 mm3. Como no modelo de U87MG, todos os anticorpos foram administrados em doses de 1 mg/kg de peso corporal duas vezes por semana por injeções intraperitoneais por 4 doses. Os volumes tumorais o os pesos corporais dos camundongos foram registrados duas vezes por semana. A inibição do crescimento do tumor foi analisada usando o teste de t-Student. Os resultados estão resumidos na Figura 7 e na Tabela 11. Tabela 11

[000190] Inibição do tumor estatisticamente significativa foi observada nos grupos tratados com 2B8 e 1A3 (Figura 7). Houve uma modesta inibição do crescimento do tumor nos grupos de 1F3 e 1D3 com valores de p menores do que 0,05, o qual foi definido como significância estatística neste estudo (Tabela 11). Nenhuma perda de peso corporal significativa foi observada.

Exemplo 12 - Humanização de Anticorpos Monoclonais Murinos

[000191] Este Exemplo descreve a humanização do anticorpo murino 2B8, junto com uma caracterização dos anticorpos humanizados resultantes, as regiões Variáveis de Cadeia Pesada e Leve de 2B8 foram "humanizadas" por dois métodos.

A. Procedimento de Humanização 1

[000192] No primeiro método, três regiões variáveis de cadeia pesada humanizadas e duas regiões variáveis de cadeia lave capa humanizadas foram desenhadas com base no método de "super- humanização" descrito em Hwang et al. (2005) METHODS 36:35-42; Tan et al. (2002) J. IMMUNOL. 169:1119-1125; Patente US 6.881,557.

[000193] A classe estrutural canônica de Chothia foi determinada para cada CDR de 2B8 de camundongo com base o comprimento e na composição de aminoácidos da CDR. As regiões variáveis de linhagem germinativa humanas que consistem em regiões variáveis leves e pesadas da mesma classe estrutural canônica de Chothia foram identificadas com base em alelos de referência da região variável de linhagem germinativa humana conhecidos descritos no site da internet do International Immunogentics Information System (IMGT) (disponível na rede de alcance mundial em imgt.cines.fr e biochem.unizh.ch/antibody/Sequences/index.html). Estas regiões variáveis de linhagem germinativa humana da mesma classe estrutural foram comparadas a regiões variáveis de 2B8 de murino por calcular o percentual de identidade ou similaridade entre os resíduos de aminoácido da CDR. As regiões variáveis de linhagem germinativa humanas com a maior identidade e/ou similaridade com os resíduos da CDR de 2B8 de camundongo foram preservadas, enquanto que os resíduos da CDR de 2B8 foram usados para substituir os resíduos correspondentes da região variável de linhagem germinativa humana que eram diferentes entre as CDRs de linhagem germinativa humana e CDR de 2B8 de camundongo. A região J humana que era a mais semelhante à região J de camundongo de 2B8 foi então adicionada à terminação carboxila das regiões variáveis "super-humanizadas" e estas sequências de aminoácido foram convertidas em sequências de ácido nucléico.

[000194] A sequência de ácido nucléico da região variável completa foi construída usando métodos de síntese de gene por PCR (Young et al. (2004) NUCL. ACIDS RES. 32:e59) e clonadas em um vetor de expressão em mamífero (baseado em pcDNA3.2 DEST (Invitrogen)) contendo regiões constantes humanas (a jusante das regiões variáveis) de IgG1 (alótipo G1m(17,1)) ou Capa (alótipo Km(3) (alelo 2)) usando técnicas de biologia molecular usuais. Todos os quatro anticorpos de IgG1 de cadeia pesada (de 2B8 quimérico a 3 cadeias pesadas humanizadas (Hu2B8 Hv1-f.1, Hu2B8 Hv5-a.1, Hu2B8 Hv5- 51.1) foram expressos nas combinações possíveis com todos os 3 anticorpos de cadeia capa (quimera de 2B8 e 2 cadeias leves humanizadas (Hu2B8 Kv1-39.1 e Hu2B8 Kv3-15.1) criando 12 proteínas de anticorpo diferentes. A ligação dos anticorpos quiméricos, quiméricos/humanizados e humanizados a HGF humano foi então medida como descrito abaixo e os resultados estão resumidos na Figura 8. Cada uma das possíveis combinações de cadeia pesada de imunoglobulina e cadeia leve de imunoglobulina são descritas abaixo na Tabela 12A. Tabela 12A

[000195] Cada uma das combinações possíveis das cadeias pesadas de imunoglobulina e cadeias leves de imunoglobulinas é descrita abaixo na Tabela 12B. Tabela 12B

[000196] Dois dos possíveis construtos de anticorpo que contêm as cadeias pesadas e leves de imunoglobulina de extensão completa contendo as regiões variáveis humanizadas são designados abaixo. sh2B8-9 (G1m(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ região constante de IgG1 (alótipo G1m(17,1)) (SEQ ID NO. 171) mais hu2B8 Kv 1-39.1 (+ região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 2))) (SEQ ID NO. 177) sh2B8-12 (G1m(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ região constante de IgG1 (alótipo G1m(17,1))) (SEQ ID NO. 171) mais hu2B8 Kv 3-15.1 (+ região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 2))) (SEQ ID NO. 181).

[000197] As sequências de ácido nucléico codificantes e as sequências de proteína que definem cada um dos anticorpos humanizados estão resumidas abaixo. Nesta seção, o último nucleotídeo de cada região variável é a primeira base do próximo códon gerado pela junção da região variável/constante. Este nucleotídeo está incluído na Região Variável porque ele faz parte deste éxon. Sequências de aminoácido de Regiões Constantes listadas abaixo incluem a tradução deste códon de junção. (1) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Cadeia Pesada de 2B8 Quimérico de Extensão Completa (Região Variável de Camundongo e Região Constante de IgG1 humana) (alótipo G1m(17,1)) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 154) 1 atgggatggagctatatcatcctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag 61 gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg ggacttcagt gaagctgtcc 121 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgaa tcagaggcct 181 ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 301 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaaggc accactctca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (2) Sequência de Proteína que Define a Cadeia Pesada de 2B8 Quimérico de Extensão Completa (IgG1 de 2B8 Quimérico (alótipo G1m (17,1)) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 155) 1 qvqlqqpgae lvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqr pgqglewige inptnghtny 61 nekfkskatl tvdkssstay mqlssltsed savyycarny vgsifdywgq gttltvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (3) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Cadeia Leve de Extensão Completa de 2B8 Quimérico (Região Variável de Camundongo e Região Constante Humana) (Capa de 2B8 Quimérico (Km(3))) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 156) 1 atggaatcacagactctggtcttcatatcc atactgctct ggttatatgg tgctgatggg 61 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 121 ttgagctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtatca acagaaacca 181 gcgcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggaacactgg ggtccccgat 241 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcgggct 301 gaagaccttg cagattatca ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gttcggaggg 361 gggaccaggc tggaaataaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga (4) Sequência de Proteína que Define a Cadeia Leve de Extensão Completa de 2B8 Quimérico (Capa de 2B8 Quimérico (Km(3))) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 157) 1 nivmtqspks msmsvgervt lsckasenvv syvswyqqkp aqspklliyg asnrntgvpd 61 rftgsgsatd ftltissvra edladyhcgq synypytfgg gtrleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec (5) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv1-f.1 Humanizado (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 158) 1 atggactgca cctggaggat cctcctcttg gtggcagcag ctacaggcac ccacgccgag 61 gtccagctgg tacagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 121 tgcaaggttt ctggatacac cttcaccacc tactggatgc actgggtgca acaggcccct 181 ggaaaagggc ttgagtggat gggagagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttcc agggcagagt caccataacc gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 301 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag (6) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv1-f.1 Humanizado (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 159) 1 evqlvqsgae vkkpgatvki sckvsgytft tywmhwvqqa pgkglewmge inptnghtny 61 nekfqgrvti tadtstdtay melsslrsed tavyycatny vgsifdywgq gtlvtvss (7) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (alótipo G1m(17,1)) (SEQ ID NO.160) 1 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 721 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 781 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga (8) Sequência de Proteína que Define a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (alótipo G1m(17,1)) (SEQ ID NO. 161). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da sequência da Cadeia Pesada de IgG1. 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkkvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsrde 241 ltknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk (9) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv1f.1 Humanizado de Extensão Completa e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 humana (alótipo G1m(17,1)) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 162) 1 atggactgcacctggaggatcctcctcttg gtggcagcag ctacaggcac ccacgccgag 61 gtccagctgg tacagtctgg aagaagcctg gggctacagt gaaaatctcc 121 tgcaaggttt ctggatacac tactggatgc actgggtgca acaggcccct 181 ggaaaagggc ttgagtggat aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 gagaagttcc agggcagagt gcggacacgt ctacagacac agcctacatg 301 gagctgagca gcctgagatc gccgtgtatt actgtgcaac aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (10) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv1f.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (alótipo G1m(17,1)) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 163) 1 evqlvqsgae vkkpgatvki sckvsgytft tywmhwvqqa pgkglewmge inptnghtny 61 nekfqgrvti tadtstdtay melsslrsed tavyycatny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (11) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5a.1 Humanizado (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 164) 1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag (12) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5a.1 Humanizado (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 165) 1 evqlvqsgae vkkpgeslri sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqghvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvss (13) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv5a.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (alótipo G1m(17,1)) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 166) 1 atggggtcaaccgccatcctcgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccacgt gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (14) Sequência de Proteína que Define a Região variável da cadeia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv5a.1 Humanizado e (G1m(17,1) alótipo) a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 167) 1 evqlvqsgae vkkpgeslri sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqghvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (15) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região variável da cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 168) 1 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag (16) Sequência de Proteína que Define a Sequência Variável de Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 169) 1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvss (17) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região variável da cadeia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (G1m(17,1) alótipo) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 170) 1 atggggtcaaccgccatcctcgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (18) Sequência de Proteína que Define a Região variável da cadeia Pesada de Extensão Completa de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (alótipo G1m(17,1)) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 171) 1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (19) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Capa de Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizado (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 172). Dois possíveis ATGs de início são mostrados em letras maiúsculas. 1 ATGgacATGa gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 61 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 121 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 181 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 241 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 301 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 361 ggccagggga ccaagctgga gatcaaac (20) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Capa de Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizado (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 173) 1 diqmtqspss lsasvgdrvt itckasenvv syvswyqqkp gkapklliyg asnrntgvps 61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycgq synypytfgq gtkleik (21) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID NO. 174) 1 gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 61 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 121 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 181 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 241 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 301 gcttcaacag gggagagtgt tga (22) Sequência de Proteína que Define a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 2) (SEQ ID NO. 175). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da Sequência da Cadeia Leve Capa. 1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd 61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec (23) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 2) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 176) 1 atggacatgagggtccccgctcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 61 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 121 gtggtttctt gtcaccatca cttgcaaggc atgtatcctg gtatcagcag cagtgagaat 181 tatggggcat aaaccaggga aagcccctaa ccaaccggaa cactggggtc gctcctgatc 241 acagatttca ccatcaaggt tcagtggcag ctctcaccat cagcagtctg tggatctggg 301 gggcagagtt caacctgaag attttgcaac acaactatcc gtacacgttt ttactactgt 361 actgtggctg ggccagggga ccaagctgga caccatctgt cttcatcttc gatcaaacga 421 actgcctctg ccgccatctg atgagcagtt ttgtgtgcct gctgaataac gaaatctgga 481 aaggtggata ttctatccca gagaggccaa acgccctcca atcgggtaac agtacagtgg 541 aaggacagca tcccaggaga gtgtcacaga cctacagcct cagcagcacc gcaggacagc 601 cacaaagtct ctgacgctga gcaaagcaga acgcctgcga agtcacccat ctacgagaaa 661 ttcaacaggg cagggcctga gctcgcccgt gagagtgttg a cacaaagagc (24) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de Hu2B8 Kv1-39.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 177) 1 diqmtqspss lsasvgdrvt itckasenvv syvswyqqkp gkapklliyg asnrntgvps 61 rfsgsgsgtd ftltisslqp edfatyycgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec (25) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizado (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 178) 1 atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 61 ctgtctgtgt gaaatagtga tgacgcagtc ctccagggga aagagccacc tccagccacc 121 tcttatgtat ctctcctgca aggccagtga cctggtacca gcagaaacct gaatgtggtt 181 gcatccaacc ggccaggctc ccaggctcct ggaacactgg tatcccagcc catctatggg 241 ttcactctca aggttcagtg gcagtgggtc ccatcagcag cctgcagtct tgggacagag 301 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 361 gaagattttg cagtttatta atccgtacac (26) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizado (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 179) 1 eivmtqspat lsvspgerat lsckasenvv syvswyqqkp gqaprlliyg asnrntgipa 61 rfsgsgsgte ftltisslqs edfavyycgq synypytfgq gtkleik (27) Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável de Cadeia Leve de Extensão Completa de Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 2) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 180) 1 atggaagccccagcgcagcttctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 61 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 121 ctctcctgca aggccagtga gaatgtggtt tcttatgtat cctggtacca gcagaaacct 181 ggccaggctc ccaggctcct catctatggg gcatccaacc ggaacactgg tatcccagcc 241 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 301 gaagattttg cagtttatta ctgtgggcag agttacaact atccgtacac gtttggccag 361 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttga (28) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de Hu2B8 Kv3-15.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (Km(3) alótipo) (alelo 2) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 181) 1 eivmtqspat lsvspgerat lsckasenvv syvswyqqkp gqaprlliyg asnrntgipa 61 rfsgsgsgte ftltisslqs edfavyycgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

[000198] Para conveniência, a Tabela 13 fornece um quadro de concordância mostrando uma correspondência entre as sequências de extensão completa e os anticorpos discutidos nesta seção com aqueles apresentados na Listagem de Sequência. TABELA 13

B. Procedimento de Humanização 2

[000199] O Segundo método de humanização empregado para reduzir a imunogenicidade do anticorpo 2B8 de camundongo se baseia no método descrito por Studnicka et al. (1994) PROTEIN ENG. 7:805814. As regiões variáveis de linhagem germinativa pesada e capa humanas mais idênticas (em aminoácidos) àquelas de 2B8 de camundongo foram identificadas. Os resíduos que diferiram entre camundongo e humano foram convertidos na sequência humana dependendo da probabilidade do risco de que tal alteração afetasse a ligação ou imunogenicidade. Resíduos de baixo risco (isto é, resíduos que quando trocados provavelmente não afetariam a ligação de antígeno e também reduziriam potencial imunogenicidade) foram trocados para o aminoácido humano na região variável pesada (criando LR2B8HC) e a região variável capa (criando LR2B8LC). Adicionalmente, os resíduos de baixo risco e médio risco (isto é., resíduos que quando trocados têm alguma probabilidade de ter um efeito sobre a ligação e também reduziriam potencial imunogenicidade) foram trocados para o aminoácido humano na região variável pesada (criando LRMR2B8HC) e a região variável capa (criando LRMR2B8LC). A região constante de cadeia pesada de IgG1 (alótipo G1m(3) (alelo 1)) foi adicionada à terminação carboxila de duas regiões variáveis pesadas manipuladas humanas e a região constante capa humana (alótipo Km(3) (alelo 1)) foi adicionada à terminação carboxila de duas regiões variáveis leves manipuladas, criando assim quatro cadeias de anticorpo humanas manipuladas. Sequências de ácido nucléico da região variável foram primeiro sintetizadas por métodos de síntese gênica e então adicionadas às sequências da região constante humana. Estes anticorpos manipulados foram clonados em vetores de expressão de proteína de mamífero, e a proteína foi expressa nas quatro combinações possíveis de cadeia pesada mais cadeia leve. A ligação dos anticorpos quiméricos, quiméricos/humanizados, ou humanizados a HGF humano foi medida usando técnicas convencionais, conforme descrito abaixo.

[000200] As sequências de ácido nucléico codificantes e as sequências de proteína que definem cada um dos anticorpos humanizados estão resumidas abaixo. Nesta seção, o último nucleotídeo de cada região variável é a primeira base do próximo códon gerado pela junção da região variável/constante. Este nucleotídeo está incluído na Região Variável porque ele faz parte deste éxon. As sequências de aminoácido das Regiões Constantes listadas abaixo incluem a tradução deste códon de junção. (1) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de LR2B8HC Humanizado (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 182) 1 atgggctggt catatattat tctctttctt gttgctaccg ctaccgatgt gcactctcaa 61 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 121 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 181 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 241 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat caacctctac agcttatatg 301 gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact attgcgccag aaactacgta 361 ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca cagtcagctc ag (2) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de LR2B8HC Humanizado (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 183) 1 qvqlvqpgae vvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqa pgqglewige inptnghtny 61 nekfkgkatl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvss (3) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 184) 1 ccagcacaaa gggcccatcg tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 541 gcacgtaccg tgtggtcagc tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 601 agtacaagtg caaggtctcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 661 aagccaaagg gcagccccga tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 721 tgaccaagaa ccaggtcagc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 781 ccgtggagtg ggagagcaat agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 841 tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 901 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 961 agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga (4) Sequência de Proteína que Define a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1 ou 2) (SEQ ID NO. 185). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da sequência da Cadeia Pesada de IgG1. 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs 61 wnsgaltsgv htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep 121 kscdkthtcp pcpapellgg psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw 181 yvdgvevhna ktkpreeqyn styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis 241 kakgqprepq vytlppsree mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk (5) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de de Extensão Completa de LR2B8HC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 186) 1 atgggctggtcatatattattctctttctt gttgctaccg ctaccgatgt gcactctcaa 61 gtccaactcg tacaaccagg cgctgaagtc gtaaaacccg gaacatctgt taaactctca 121 tgcaaagcct caggatacac tttcacaact tactggatgc attgggtcaa tcaagccccc 181 ggacaaggcc tcgaatggat tggcgaaatt aacccaacta acggacatac taattataat 241 gaaaaattta agggcaaagc tacactcacc gtcgataaat 301 caacctctac agcttatatg gaactttcat ccctgagatc agaagataca gccgtctact 361 attgcgccag aaactacgta ggatcaatat tcgattactg gggtcaaggc actctcctca 421 cagtcagctc agccagcaca aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga 481 gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg 541 tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc 601 tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg 661 gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga 721 gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac 781 tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct 841 cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca 901 agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg 961 agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc 1021 tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 1081 aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ccccgggtaa atga (6) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de Extensão Completa de LR2B8HC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 187) 1 qvqlvqpgae vvkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvnqa pgqglewige inptnghtny 61 nekfkgkatl tvdkststay melsslrsed tavyycarny 121 vgsifdywgq gtlltvssas tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn 181 sgaltsgvht fpavlqssgl yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks 241 cdkthtcppc papellggps vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv 301 dgvevhnakt kpreeqynst yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska 361 kgqprepqvy tlppsreemt knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (7) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de LRMR2B8HC Humanizado (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 188) 1 atgggttggtcatatattatactctttctc gtagccaccg ccaccgacgt acactctcag 61 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca 121 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 181 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta atggacatac aaattataat 241 caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat caacctcaac cgcatacatg 301 gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt attgtgccag aaactatgta 361 ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca ccgtaagctc ag (8) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de LRMR2B8HC Humanizado (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 189) 1 qvqlvqpgae vkkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvrqa pgqglewige inptnghtny 61 nqkfqgratl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvss (9) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Pesada de de Extensão Completa de LRMR2B8HC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 190) 1 atgggttggtcatatattatactctttctc gtagccaccg ccaccgacgt acactctcag 61 gttcaactcg tacaacccgg cgccgaagtc aagaaaccag gaacatcagt caaactctca 121 tgtaaagcaa gcggatacac ctttactact tattggatgc attgggtaag acaagccccc 181 ggacaaggac tcgaatggat aggcgaaata aatcccacta 241 atggacatac aaattataat caaaaatttc aaggacgcgc tacactcacc gtcgataaat 301 caacctcaac cgcatacatg gaactcagct ccctccgatc cgaagacact gccgtttatt 361 attgtgccag aaactatgta ggatctattt tcgattactg gggacaagga acacttctca 421 ccgtaagctc agccagcaca aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga 481 gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg 541 tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc 601 tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg 661 gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga 721 gagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgtcc accgtgccca gcacctgaac 781 tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct 841 cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca 901 agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg 961 agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc 1021 tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ccccgggtaa atga (10) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Pesada de Extensão Completa de LRMR2B8HC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (Alótipo G1m(3)) (alelo 1) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 191) 1 qvqlvqpgae vkkpgtsvkl sckasgytft tywmhwvrqa pgqglewige inptnghtny 61 nqkfqgratl tvdkststay melsslrsed tavyycarny vgsifdywgq gtlltvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk (11) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de LR2B8LC Humanizado (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 192) 1 atggaaagtcagacccttgtattcatctct attcttcttt ggttgtatgg agcagacggc 61 gacattgtga tgacccaatc ccccgatagt atggccatga gtgtaggaga aagagtcacc 121 cttaattgca aagcctccga aaatgtcgtt tcatatgtgt cttggtatca acaaaaaccc 181 ggccaatcac ccaaacttct catatacggc gcttcaaaca gaaacacagg cgttcccgac 241 agatttagtg gatccggatc agctacagat ttcaccctta ccatcagttc agttcaagca 301 gaagacgttg cagactatca ttgcggacaa tcttataact acccttacac attcggacaa (12) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de LR2B8LC Humanizado (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 193) 1 divmtqspds mamsvgervt lnckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnrntgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleik (13) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 194) 1 gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 61 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 121 ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 181 gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 241 aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 301 gcttcaacag gggagagtgt tag (14) Sequência de Proteína que Define a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 195). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da sequência da Cadeia Leve Capa. 1 rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd 61 skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec (15) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de LR2B8LC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 196) 1 atggaaagtcagacccttgtattcatctct tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag (16) Sequência de Proteína que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de LR2B8LC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 197) 1 divmtqspds mamsvgervt lnckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnrntgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec (17) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de LRMR2B8LC Humanizado (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 198) 1 atggaatcccaaacccttgttttcatctct atccttctct ggctttatgg cgccgacgga 61 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca 121 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct 181 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac 241 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc 301 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa 361 ggcactaaac ttgaaattaa ac (18) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de LRMR2B8LC Humanizado (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 199) 1 divmtqspds lamslgervt lnckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnresgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleik (19) Sequência de Ácido Nucléico que Codifica a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de LRMR2B8LC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 200) 1 atggaatcccaaacccttgttttcatctct atccttctct ggctttatgg cgccgacgga 61 gacatcgtaa tgacacaatc ccctgactct cttgctatga gcttgggcga acgagtaaca 121 cttaactgca aagcatccga aaatgtcgta tcttacgtat cctggtatca gcaaaaacct 181 ggtcaaagtc ctaaacttct tatatatggt gcaagtaatc gtgaaagtgg cgtcccagac 241 agatttagcg gttcaggttc agcaactgac tttacactta caatttctag cgttcaggcc 301 gaagacgttg cagactatca ttgtggacaa tcttataact atccttatac tttcggacaa 361 ggcactaaac ttgaaattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 421 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 481 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 541 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 601 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 661 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag (20) Sequência de Proteína que Define a Região Variável da Cadeia Leve de Extensão Completa de LRMR2B8LC Humanizado e a Região Constante da Cadeia Capa Humana (alótipo Km(3)) (alelo 1) (SEQ ID NO. 201) 1 divmtqspds lamslgervt lnckasenvv syvswyqqkp gqspklliyg asnresgvpd 61 rfsgsgsatd ftltissvqa edvadyhcgq synypytfgq gtkleikrtv aapsvfifpp 121 sdeqlksgta svvcllnnfy preakvqwkv dnalqsgnsq esvteqdskd styslsstlt 181 lskadyekhk vyacevthqg lsspvtksfn rgec

[000201] Para conveniência, a Tabela 14 fornece um quadro de concordância mostrando a correspondência entre as sequências de extensão completa e os anticorpos discutidos nesta seção com aqueles apresentados na Listagem de Sequência. TABELA 14

[000202] A Tabela 15 resume as sequências de CDR da cadeia pesada (definição de Kabat) dos anticorpos 2B8 humanizados preparados pelo procedimento de humanização 1 e pelo procedimento de humanização 2 descritos acima neste Exemplo. TABELA 15

A Tabela 16 resume as sequências de CDR da cadeia leve (definição de Kabat) dos anticorpos 2B8 humanizados preparados pelo procedimento de humanização 1 e pelo procedimento de humanização 2 descritos acima neste Exemplo TABELA 16

C. Afinidade de Ligação de Anticorpos 2B8 Humanizados

[000203] A afinidade de ligação ao antígeno e a cinética de interação foram analisadas por tecnologia de ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento BIAcore T100. Imunoglobulinas anti- humano de camundongo (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005098) foram imobilizadas em chips sensores de dextran carboximetilado CM4 (BIAcore, N° de catálogo BR-1005-34) por acoplamento de amina (BIAcore, N° de catálogo BR-1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as recomendações do fabricante. As análises foram executadas a 25°C usando PBS (GIBCO, N° de catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, N° de catálogo BR-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, N° de catálogo 2930) e 10 mg/mL de Sal de Sódio CM-Dextrano (Fluka, N° de catálogo 86524) como tampão de corrida.

[000204] Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo individual em uma taxa de fluxo de 10 μL/min. O tempo de injeção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, N° de catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida foi injetado sequencialmente sobre uma superfície de referência (nenhum anticorpo capturado) e sobre a superfície ativa (anticorpo a ser testado) por 2 minutos a 60 μL/min. A fase de dissociação foi monitorada por 15 ou 90 minutos, dependendo da concentração. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl, pH 1,7 (BIAcore, N° de catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μL/min antes de outro ciclo ser iniciado. As concentrações de HGF testadas foram 1,88; 3,75 e 7,5 nM. A determinação dos parâmetros de cinética foi obtida usando a função de cinética do programa BIAevalutation com subtração da referência. Os parâmetros de cinética para cada anticorpo ka (constante da taxa de associação), kd (constante da taxa de dissociação) e KD (constante de dissociação de equilíbrio) estão resumidos na Tabela 8.

[000205] Os resultados resumidos na Figura 8 mostram que certas combinações de cadeias pesadas super-humanizadas (Hu2B8 Hv5a.1, Hu2B8 Hv5-51.1 ou Hu2B8 Hv1-f.1) e cadeias leves (Hu2B8 Kv1-39.1 ou Hu2B8 Kv3-15.1) retêm afinidade de ligação (KD) a HGF semelhante a 2B8 quimérico (regiões variáveis de camundongo com regiões constantes humanas) e 2B8 (Tabela 5).

D. Ensaio de ligação mutuamente exclusiva

[000206] A ligação mutuamente exclusiva a HGF foi avaliada por tecnologia de ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento BIAcore T100. Imunoglobulinas anti-humanas de camundongo (Jackson ImmunoResearch Labs, 209-005-098) foram imobilizadas sobre chips sensores CM5 de dextran carboxiladometilado (BIAcore, N° de catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N° de catálogo BR-1000-50) usando um protocolo usual de acoplamento de acordo com as recomendações do fabricante. As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, N° de catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, No. BR-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, N° de catálogo 2930), e 10 mg/mL de Sal de Sódio CM-Dextrano (Fluka, N° de catálogo 86524) como tampão de corrida.

[000207] Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo individual em uma taxa de fluxo de 30 μL/min. O tempo de injeção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 150 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. HGF (R&D Systems, N° de catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida em uma concentração final de 7,5 μg/mL foi injetado por 90 segundos a 30 μL/min sobre os anticorpos humanizados capturados. A ligação de HGF foi monitorada antes da injeção subsequente de anticorpo 2B8 de camundongo ou anticorpo policlonal anti-HGF de cabra (R & D Systems, AF294) por 3 min a 30 μL/min. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl pH 2,0 (BIAcore, N° de catálogo BR-1003-55) injetada por 3 min em uma taxa de fluxo de 60 μL/min antes de outro anticorpo ser testado. Os resultados estão resumidos na Figura 9.

[000208] Os resultados resumidos na Figura 9 mostram que tanto os anticorpos 2B8 humanizados quanto os anticorpos 2B8 quiméricos impedem 2B8 de se ligar a HGF. Estes resultados demonstram que os anticorpos humanizados ainda se ligam ao mesmo epítopo de HGF que o anticorpo 2B8 original.

Exemplo 13 - Produção de Variantes Humanizadas de 2B8 a. ANTICORPOS HUMAN ENGINEERED®

[000209] Cadeias manipuladas leves (LR2B8LC e LRMR2B8LC, respectivamente) e pesadas (LR2B8HC and LRMR2B8HC, respectivamente) de baixo risco e de risco baixo-mais-moderado com otimização de códon e de expressão foram clonadas in phase em vetores de expressão de anticorpo transitório de XOMA, os quais contêm módulos de regiões constantes humanas Capa e Gama-1. As quatro variantes de 2B8 Human Engineered foram produzidas por transfecção transitória em células HEK293E. Os quatro anticorpos a seguir foram produzidos: HE2B8-1 = LR2B8HC (+ região constante de IgG1 (alótipo G1m(3) (alelo 1)) (SEQ ID NO. 187) mais LR2B8LC (+ região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID NO. 197) HE2B8-2 = LR2B8HC (+região constante de IgG1 (alótipo G1m(3) (alelo 1)) (SEQ ID NO. 187) mais LRMR2B8LC (+ Região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID NO. 201) HE2B8-3 = LRMR2B8HC (+ região constante de IgG1 (alótipo G1m(3) (alelo 1)) (SEQ ID NO. 191) mais LR2B8LC (+ Região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID NO. 197) HE2B8-4 = LRMR2B8HC (+ região constante de IgG1 (alótipo G1m(3) (alelo 1)) (SEQ ID NO. 191) mais LRMR2B8LC (+ Região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 1))) (SEQ ID NO. 201)

[000210] As cadeias leves e pesadas foram co-transfectadas em células HEK293E adaptadas para suspensão de XOMA cultivadas em meio IS293 (Irvine Scientific, Irvine, CA) usando frascos de agitação de 2 litros. Após 24 horas nos frascos de agitação, 200 mL das células transfectadas foram centrifugadas, ressuspensas em 40 mL de meio fresco e transferidas para frascos Integra (Wilson Wolf Manufacturing Inc., MN) para produção. Após a incubação por sete dias, as suspensões celulares foram removidas dos fracos Integra, centrifugadas e os sobrenadantes das culturas retidos. Os anticorpos nos sobrenadantes das culturas foram purificados em colunas de rotação (spin) de proteína A (Pro-Chem), dialisados contra PBS, concentrados e esterilizados por filtração.

b. Anticorpos SUPERHUMANIZED®

[000211] cDNA de Hu2B8_Hv5-51.1 de extensão completa + domínio constante de IgG1 humana (alótipo G1m(3)) foi clonado em pEE6.4 (Lonza Biologics, Berkshire, UK) usando sítios de restrição de HindIII e EcoRI. cDNA da região variável de Hu2B8_Kv1-39.1 de extensão completa + domínio constante Capa humano e cDNA da região variável de Hu2B8_Kv3-15.1 de extensão completa + domínio constante Capa humano foram clonados cada, em pEE14.4 (Lonza Biologics) usando sítios de restrição de HindIII e EcoRI. cDNA do promotor de hCMV-MIE + Hu2B8_Hv5-51.1 de extensão completa + domínio constante de IgG1 humana (alótipo G1m(3)) + fragmento poli A de SV40 (em pEE6.4) foi removido por digestão com NotI/SalI e inserido no vetor pEE14.4 da cadeia Capa através dos sítios de NotI/SalI, criando assim 2 diferentes vetores de expressão que expressam cada, simultaneamente, a cadeia pesada e a cadeia leve para fazer os seguintes anticorpos: sh2B8-9 (G1m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ Região constante de IgG1 (alótipo G1m(3)) (alelo 2)) (SEQ ID NO. 210) mais hu2B8 Kv 1-39.1 (+ Região constante Capa (alótipo Km(3) (alelo 2))) (SEQ ID NO: 177) sh2B8-12 (G1m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ Região constante de IgG1 (alótipo G1m(3)) (alelo 2)) (SEQ ID NO. 210) mais hu2B8 Kv 3-15.1 (+ Região constante Capa (Km(3) alótipo (alelo 2))) (SEQ ID No. 181)

[000212] As sequências de ácido nucléico codificantes e as sequências de proteína que definem a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana alótipo G1m(3) (alelo 2) e cada uma das sequência da cadeia pesada de extensão completa são descritas abaixo. As sequências da cadeia leve foram as mesmas que as descritas no Exemplo 12. (1)).Sequência de Ácido Codificante da Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (alótipo G1m(3)) (alelo 2) (SEQ ID NO. 207) 1 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 61 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 121 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 181 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 241 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca 301 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 361 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 421 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 481 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc 541 gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca 601 ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc 661 catcgagaag accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct 721 gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg 781 cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta 841 caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac 901 cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc 961 tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga (2) Sequência de Proteína que Define a da Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana (alótipo G1m(3)) (alelo 1 ou 2) (SEQ ID NO. 208). O primeiro aminoácido é derivado da tradução do último nucleotídeo da região variável e dos dois nucleotídeos do início da Sequência da Cadeira Pesada de IgG1. 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss 61 glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg 121 psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn 181 styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree 241 mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk (3) Sequência de Ácido Codificante da Cadeia de Extensão Completa que contém a Região Variável da Cadeia Pesada de Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana G1m(3) alótipo (alelo 2) (sequência de sinal sublinhada) (SEQ ID NO. 209) 1 atggggtcaaccgccatcctcgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 61 gtgcagctgg tgcagtctgg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 121 tgtaagggtt ctggatacag tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 181 gggaaaggcc tggagtggat aatcctacca acggtcatac taactacaat 241 ccgtccttcc aaggccaggt gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 301 cagtggagca gcctgaaggc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 361 ggtagcatct ttgactactg accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 421 aagggcccat cggtcttccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 481 gccctgggct gcctggtcaa cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 541 ggcgccctga ccagcggcgt ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 601 tccctcagca gcgtggtgac agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 661 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 721 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 781 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 841 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 901 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 961 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1021 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga agaccatctc caaagccaaa 1081 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1141 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1201 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1261 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1321 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1381 ctctccctgt ctccgggtaa atga (4) Sequência de Proteína que Define a Cadeia de Extensão Completa que contém Hu2B8 Hv5-51.1 Humanizado e a Região Constante da Cadeia Pesada de IgG1 Humana G1m(3) alótipo (alelo 2) (sem sequência de sinal) (SEQ ID NO. 210) 1 evqlvqsgae vkkpgeslki sckgsgysft tywmhwvrqm pgkglewmge inptnghtny 61 npsfqgqvti sadksistay lqwsslkasd tamyycarny vgsifdywgq gtlvtvssas 121 tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl 181 yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkrvepks cdkthtcppc papellggps 241 vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst 301 yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsreemt 361 knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq 421 gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk

[000213] Cada vetor de expressão duplo foi transfectado em células 293T para expressão transitória usando DMEM com 10% de soro fetal bovino. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lavadas com, e então substituídas por, meio livre de soro, IS GRO® (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo 4mM de L-Glutamina. O sobrenadante foi coletado diariamente e substituído por meio fresco por 10 dias. Os sobrenadantes da cultura foram centrifugados, filtrados (0,45 μm) e concentrados 10 a 100 vezes. Os anticorpos foram purificados em resina ProSep vA (Millipore), dialisados contra PBS, concentrados e esterilizados por filtração.

Exemplo 14 - Características de Ligação de Variantes Humanizadas de 2B8

[000214] Os anticorpos humanizados produzidos no Exemplo 13 foram caracterizados quanto a sua habilidade de se ligar a hHGF e às proteínas HGF recombinantes produzidos na Exemplo 13.

[000215] Os anticorpos foram analisados por ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento BIAcore T100 para avaliar sua habilidade de se ligar a hHGF e às proteínas de fusão discutidas no Exemplo 3. Cada anticorpo foi imobilizado sobre um chip sensor de dextran carboximetilado CM5 (BIAcore, N° de catálogo BR- 1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N° de catálogo BR- 1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as instruções do fabricante.

[000216] As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, N° de catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, N° de catálogo R-1000-54), 2 mg/mL de BSA (EMD, N° de catálogo 2930) e 10 mg/mL de sal de sódio CM-Dextrano (Fluka, N° de catálogo 86524) como tampão de corrida. O sobrenadante contendo diferentes proteínas de fusão de HGF ou o sobrenadante de células transfectadas com o vetor vazio foi injetado sobre cada anticorpo em uma taxa de fluxo de 30 μL/min por 3 minutos. A ligação resultante foi determinada como unidades de ressonância (RU) sobre o limite basal 30 segundos após o final da injeção. A ligação foi comparada a HGF humano (R&D Systems, N° de catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida. As ligações inespecíficas foram monitoradas por comparar a ligação a uma superfície de controle. Os resultados estão resumidos na Tabela 17. TABELA 17

[000217] Os resultados na Tabela 17 demonstram que cada um dos anticorpos humanizados baseados em 2B8 se liga a rhHGF e a todas as três quimeras camundongo-humano-camundongo.

Exemplo 15 - Afinidades de Ligação de Variantes Humanizadas de 2B8

[000218] As afinidades de ligação e a cinética de interação dos anticorpos listados na Tabela 15 foram medidas por ressonância de plásmon de superfície.

[000219] Imunoglobulinas anti-humano de camundongo (Jackson Labs, N° de catálogo 209-005) foram imobilizadas em chips sensores de dextran carboximetilado CM4 (BIAcore, N° de catálogo BR-1006- 68) por acoplamento de amina (BIAcore, N° de catálogo BR-1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as instruções do fabricante. As análises foram realizadas a 25°C usando PBS (GIBCO, N° de catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, N° de catálogo BR-1000-54), e 2 mg/mL de BSA (EMD, N° de catálogo 2930).

[000220] Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo individual em uma taxa de fluxo de 10 μL/min. O tempo de injeção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, N° de catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida foi injetado sequencialmente sobre uma superfície de referência (nenhum anticorpo capturado) e sobre a superfície ativa (anticorpo a ser testado) por 2 minutos a 60 μL/min. A fase de dissociação foi monitorada por 15 ou 90 minutos, dependendo da concentração. A superfície foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl, pH 1,7 (BIAcore, N° de catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μL/min antes de outro ciclo ser iniciado. As concentrações de HGF testadas foram 0,46 nM a 7,5 nM.

[000221] Os parâmetros de cinética foram determinados usando a função de cinética do programa BIAevalutation® com subtração da referência. Os parâmetros de cinética para cada anticorpo ka (constante da taxa de associação), kd (constante da taxa de dissociação) e KD (constante de dissociação de equilíbrio) estão resumidos na Tabela 18. TABELA 18

[000222] Estes dados mostram que os anticorpos humanizados têm taxas de associação rápidas (ka), taxas de dissociação muito lentas (kd), e afinidades muito altas (KD). Em particular, os anticorpos têm afinidades que variam de 2,0 a 12 pM.

Exemplo 16 - Comparação das Afinidades de Ligação a 25°C e 37°C

[000223] As afinidades de ligação e a cinética de interação dos anticorpos HE2B8-4, sh2B8-9, sh2B8-12, e 2B8 murino foram medidas por ressonância de plásmon de superfície sob diferentes condições.

[000224] Imunoglobulinas anti-humano de camundongo (Jackson Labs, N° de catálogo 209-005) ou imunoglobulinas anti-camundongo de coelho (BIAcore, N° de catálogo BR-1005-14) foram imobilizadas em chips sensores de dextran carboximetilado CM4 (BIAcore, N° de catálogo BR-1006-68) por acoplamento de amina (BIAcore, N° de catálogo BR-1000-50) usando um protocolo de acoplamento usual de acordo com as instruções do fabricante. No caso de medidas a 25°C para sh2b8-9 e sh2B8-12, um chip sensor CM5 (BIAcore, N° de catálogo BR-1006-68) foi usado. As análises foram realizadas a 25°C e 37°C usando PBS (GIBCO, N° de catálogo 14040-133) contendo 0,05% de tensoativo P20 (BIAcore, N° de catálogo BR-1000-54), e 2 mg/mL de BSA (EMD, N° de catálogo 2930) como tampão de corrida.

[000225] Os anticorpos foram capturados em uma célula de fluxo individual em uma taxa de fluxo de 10 μL/min. O tempo de injeção foi variável para cada anticorpo para produzir aproximadamente 20 RU de anticorpo capturado para cada ciclo. Tampão ou HGF (R&D Systems, N° de catálogo 294-HGN-025) diluído em tampão de corrida foi injetado sequencialmente sobre uma superfície de referência (nenhum anticorpo capturado) e sobre a superfície ativa (anticorpo a ser testado) por 2 minutos a 60 μL/min. A fase de dissociação foi monitorada por 15 ou 90 minutos, dependendo da concentração. A superfície dos chips sensores de imunoglobulinas de camundongo anti-humano foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl, pH 2,2 (BIAcore, N° de catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μL/min antes de outro ciclo ser iniciado. A superfície dos chips sensores de imunoglobulinas de coelho anti- camundongo foi então regenerada com 10 mM de Glicina-HCl, pH 1,7 (BIAcore, N° de catálogo BR-1003-54) injetada por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 60 μL/min antes de outro ciclo ser iniciado. As concentrações de HGF testadas foram 0,46 nM a 7,5 nM.

[000226] Os parâmetros de cinética foram determinados usando a função de cinética do programa BIAevalutation com subtração da referência. Os parâmetros de cinética para cada anticorpo, ka (constante da taxa de associação), kd (constante da taxa de dissociação) e KD (constante de dissociação de equilíbrio) estão resumidos na Tabela 19. TABELA 19

[000227] Conforme esperado, as constantes da taxa de associação aumentaram com um aumento na temperatura. De forma surpreendente, as constantes de dissociação não mudaram significativamente com um aumento correspondente na temperatura. Consequentemente, as constantes de dissociação de equilíbrio gerais (KD) foram aproximadamente 1,4 a 3 vezes menores (maior afinidade) em temperatura fisiológica (37°C).

Exemplo 17 - Atividade de Neutralização de Variantes Humanizadas de 2B8

[000228] Os anticorpos descritos no Exemplo 14 foram caracterizados quanto a sua habilidade de (a) inibir a ligação de hHGF a c-Met, e (b) inibir a incorporação de BrdU estimulada por HGF em células 4MBr-5.

[000229] O Ensaio de Inibição da Ligação HGF-Met (Ensaio de Neutralização) foi realizado como descrito a seguir. Os anticorpos foram testados por ELISA quanto a sua habilidade de inibir a ligação de hHGF a c-Met. Especificamente, placas de ensaio DELFIA de 96 cavidades Wallac (Wallac Inc., N° de catálogo AAAND-0001) foram revestidas com 100 μL de HGF a 6,25 μg/mL (R&D Systems, N° de catálogo 294-HGN-025) em tampão de revestimento de carbonato (15 mM de Na2CO3 e 34 mM de NaHCO3, pH 9,0) por 16 horas a 4°C. As placas foram então bloqueadas com 200 μL de leite em pó desnatado a 5% em PBS por 1 hora em temperatura ambiente. Os anticorpos foram preparados em uma placa separada por adicionar concentrações crescentes dos anticorpos sob investigação (0,033 a 250 nM, diluição seriada de 2 vezes) a 2 nM de c-Met biotinilado em leite em pó desnatado a 5% em PBS. C-Met (R&D Systems, N° de catálogo 358-MT/CF) é biotinilado de acordo com as instruções do fabricante em uma proporção de biotina para c-Met de10:1. 100 μL de amostra por cavidade foram transferidos para a placa de ensaio e incubados por 2 horas em temperatura ambiente. As placas resultantes foram lavadas três vezes com PBS-0,1% de Tween 20, e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com Estreptavidina marcada com Eu (Wallac, N° de catálogo 1244-360) diluída 1:1000 em tampão de ensaio DELFIA (Wallac, N° de catálogo 4002-0010). As placas resultantes foram lavadas 3 vezes com solução de lavagem DELFIA (Wallac, N° de catálogo 4010-0010) e incubadas com 100 μL/cavidade de solução de intensificação DELFIA (Wallac #4001-0010) por 15 minutos em temperatura ambiente com agitação. As placas foram lidas em um instrumento Victor3V (Perkin Elmer) usando o método de Európio. Os valores de IC50 foram calculados e estão resumidos na Tabela 6. Os valores de IC50 obtidos são mostrados na Tabela 20. TABELA 20

[000230] Estes resu tados da Tabela 20 demonstram que os anticorpos humanizados testados neutralizaram eficazmente a ligação de HGF a c-Met.

[000231] Os anticorpos na Tabela 17 também foram testados no ensaio de proliferação celular descrito no Exemplo 7(b). Os resultados estão resumidos na Tabela 21. TABELA 21

[000232] Os resultados da Tabela 21 demonstram que todos os anticorpos humanizados testados inibiram a proliferação induzida por HGF em células 4MBr-5.

Exemplo 18 - Atividade Anti-Dispersão de Variantes Humanizadas de 2B8

[000233] Os anticorpos na Tabela 17 foram testados no ensaio antidispersão descrito no Exemplo 8. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 22. TABELA 22

Nenhuma Inibição +++ Inibição muito forte, quase completa inhibition ++ Inibição forte + Inibição detectável

[000234] Os resultados na Tabela 22 demonstram que todos os anticorpos humanizados testados inibiram a dispersão induzida por HGF na mesma extensão que o anticorpo monoclonal murino 2B8.

Exemplo 19 - Inibição de Fosforilação de c-Met estimulada por HGF

[000235] Os anticorpos na Tabela 17 foram testados no ensaio de fosforilação de c-Met descrito no Exemplo 9. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 23. TABELA 23

[000236] Os resultados na Tabela 23 demonstram que todos os anticorpos humanizados testados são potentes inibidores da fosforilação de c-Met induzida por HGF em células PC-3.

Exemplo 20 - Inibição tumoral em Modelo de Xenoenxerto de U87MG

[000237] A habilidade dos anticorpos monoclonais humanizados da invenção inibirem o crescimento tumoral foi testada em um modelo de xenoenxerto de U87MG. Células U87MG (ATCC) foram expandidas em cultura a 37°C em uma atmosfera contendo 5% de CO2 e 95% de ar, usando um meio que compreende meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. As células foram subcultivadas e mantidas por desprender as células da parede da placa de cultura usando tripsina-EDTA.

[000238] Células quase confluentes foram coletadas por tripsinização e então 5 x 106 células em Matrigel 50% (BD Biosciences; N° de catálogo 356237) foram injetadas subcutaneamente na área dorsal superior entre a escápula de camundongos ICR SCID fêmeas de 7 semanas de idade (Taconic Labs). Os diâmetros (mm) mais longos (L) e mais curtos (W) dos tumores foram medidos com um compasso de calibre. O volume tumoral (vol) foi calculado como: (mm3) = L x W2/ 2. Quando os tumores cresceram para aproximadamente 200 mm3, os camundongos que possuíam os tumores foram randomizados em 5 grupos de 10 camundongos cada. Um grupo recebeu PBS e um grupo recebeu controle com IgG. Cada um dos outros 4 grupos recebeu um dos anticorpos humanizados (HE2B8-1, HE2B8-2, HE2B8-3, e HE2B8- 4). Todos os anticorpos foram administrados em doses de 0,25 mg/kg de peso corporal, duas vezes por semana, por injeções intraperitoneais de 5 doses. Os volumes tumorais e os pesos corporais dos camundongos foram registrados duas vezes por semana. A inibição do crescimento tumoral foi analisada usando o teste de t- Student.

[000239] Os anticorpos humanizados testados eram ativos in vivo. Houve uma inibição do crescimento do tumor de 57% tumor para HE2B8-1 com um valor de p de 0,02, 61% de inibição do crescimento do tumor para HE2B8-2 com um valor de p de 0,02, 85% de inibição do crescimento do tumor para HE2B8-3, com um valor de p de 0,0004, e 74% de inibição do crescimento do tumor para HE2B8-4 com um valor d p de 0,001. Nenhuma perda corporal significativa foi observada.

[000240] Um estudo subsequente foi realizado como descrito acima em camundongos nude NCR fêmeas com tumores de U87MG subcutâneos inoculados no flanco. Cada (10 camundongos cada) recebeu um dos seguintes tratamentos a 0,5 mg/kg: controle com veículo de PBS, controle de huIgG, HE2B8-4, ou sh2B8-9. O tratamento foi dado intra-peritonealmente duas vezes por semana por um mínimo de 5 semanas. Cada grupo de tratamento demonstrou regressão tumoral similar com inibição do crescimento do tumor de 113% para sh2B8-9 e 115% para HE2B8-4, e um retardo mínimo do crescimento do tumor de 30 dias. Ambos os tratamentos foram bem tolerados sem perdas corporais significativas.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[000241] A descrição completa de cada um dos documentos de patente e artigos científicos referidos aqui está incorporada por referência para todos os propósitos.

EQUIVALENTES

[000242] A invenção ser concretizada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou características essenciais desta. As modalidades anteriores são, portanto para serem consideradas, em todos os aspectos, como ilustrativas ao invés de limitantes da invenção aqui descrita. O escopo da invenção é indicado assim pelas reivindicações anexas e não pela descrição anterior, e todas as alterações que se encontram dentro do significado e amplitude de equivalência das reivindicações são pretendidas para serem abrangidas nela.

Claims

1. Proteína de ligação isolada que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF), caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a estrutura CDRHI-CDR H2-CDR H3, em que (i) CDRHI compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 15 , (ii) CDRH2 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 204 e SEQ ID NO: 205e (iii) CDRH3 compreende uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 17; e (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a estrutura CDRLI-CDR L2-CDR L3, em que (i) CDRLI compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 18, (ii) CDRL2 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO: 206 e (iii) CDRL3 compreende uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 20, em que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e a região variável da cadeia leve de imunoglobulina juntas definem um sítio de ligação único para ligação a HGF humano.

2. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende a estrutura CDRH1-CDRH2-CDRH3, em que (i) CDRH1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO. 15, (ii) CDRH2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO. 205, e (iii) CDRH3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO. 17, e a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende a estrutura CDRL1-CDRL2-CDRL3, em que (iv) CDRL1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO. 18, (v) ) CDRL2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO. 206, e (vi) ) CDRL3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO. 20.

3. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que as sequências da região de determinação de complementaridade (CDR) estão interpostas entre regiões estruturais da imunoglobulina humana ou humanizada.

4. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

5. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é um anticorpo monoclonal.

6. Ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 5.

7. Ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

8. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de ácido nucléico como definida na reivindicação 6 e/ou 7.

9. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um vetor de expressão que codifica uma região variável da cadeia pesada e/ou leve de imunoglobulina como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 5, em que a célula hospedeira é um microrganismo transgênico ou um hibridoma.

10. Método para produzir um polipeptídeo que compreende uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 9 sob condições tais que a célula hospedeira expresse o polipeptídeo que compreende a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina; e (ii) purificar o polipeptídeo que compreende a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina.

11. Método para produzir um polipeptídeo compreendendo uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 9 sob condições tais que a célula hospedeira expresse o polipeptídeo compreendendo a região variável da cadeia leve de imunoglobulina; e (ii) purificar o polipeptídeo compreendendo a região variável da cadeia leve de imunoglobulina.

12. Proteína de ligação isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano com um kd de 4,0x10-5 s-1 ou menos.

13. Proteína de ligação isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano com um KD de 20 pM ou menos.

14. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF) e compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 193, e uma variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 183; (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 193, e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 189; (c) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 199, e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 183; e (d) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 199, e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 189.

15. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.199, e a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 189.

16. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF) e compreende uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina e uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 197, e uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 187; (b) uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 197, e uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 191; (c) uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 201, e uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 187; e (d) uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 201, e uma sequência de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 191.

17. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a cadeia leve da imunoglobulina compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 201, e a cadeia pesada de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO. 191.

18. Uso da proteína de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 14 a 17, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para uso na inibição ou redução da proliferação de uma célula tumoral, e/ou inibição do crescimento de tumor em um mamífero, e/ou tratamento de um tumor em um mamífero.

19. Método de produzir uma proteína de ligação que se liga ao fator de crescimento de hepatócito humano (HGF), que é um anticorpo intacto, tal como um anticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 9 sob condições tais que a célula hospedeira expressa um polipeptídeo que compreende a região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e um polipeptídeo que compreende a região variável da cadeia leve de imunoglobulina; e (ii) purificar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo.