KR20090027226A

KR20090027226A - 간세포 성장 인자 (ｈｇｆ) 결합 단백질

Info

Publication number: KR20090027226A
Application number: KR1020087032083A
Authority: KR
Inventors: 윌리암 엠. 윈스턴; 에스. 커크 라이트; 메이 한; 린 브레울트; 지에 린; 비잔 에테마드-길버트슨; 크리스틴 크누엘; 제노 규리스; 아놀드 호르위츠
Original assignee: 아베오 파마슈티컬즈, 인크.; 조마 테크놀로지 리미티드
Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2007-06-01
Publication date: 2009-03-16
Also published as: KR101196060B1; IL219654A0; US20100173362A1; EP2361934A2; US20130203963A1; JP2009539347A; AR061171A1; AU2007254942A2; WO2007143090A2; BRPI0712222A2; HK1129395A1; EP2027156B9; EP2027156A2; BRPI0712222B1; PT2027156E; JP2011072318A; EP2027156B1; US20110229462A1; US20140178935A1; NO345476B1

Abstract

본 발명은 간세포 성장 인자(HGF), 특히 인간 HGF에 결합하여 그의 활성을 무력화시키는 결합 단백질 부류를 제공한다. 상기 결합 단백질은 진단제 및/또는 치료제로 사용될 수 있다. 상기 결합 단백질은 이들의 치료적 활성과 관련하여 특정 HGF 반응성 장애, 예를 들면 특정 HGF 반응성 종양의 치료에 사용될 수 있다.

간세포 성장 인자, 결합 단백질, HGF 반응성 장애

Description

간세포 성장 인자 (ＨＧＦ) 결합 단백질{HEPATOCYTE GROWTH FACTOR (HGF) BINDING PROTEINS}

관련 출원

본 출원은 미국 가출원 제60/810,714호 (2006년 6월 2일 출원) 및 제60/860,509호 (2006년 11월 21일 출원) (이들의 개시문은 상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)의 이점 및 우선권을 주장한다.

본 발명의 분야는 분자 생물학, 면역학 및 종양학 분야이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 분야는 인간 간세포 성장 인자 (HGF)에 결합하는 항체-기재의 결합 단백질에 대한 것이다.

간세포 성장 인자(HGF) (산란 인자 (SF)로도 알려져 있음)는 중간엽 세포에 의해 우세하게 생성되는 다기능성 이종이량체 단백질이며, Met 티로신 키나제 수용체를 발현시키는 세포의 이펙터(effector)이다 (문헌 [Bottaro et al. (1991) Science 251: 802-804], [Rubin et al. (1993) Biochim. Biophys. Acta 1155: 357-371]). 인간 Met 수용체는 또한 "c-Met"로도 알려져 있다. 성숙한 HGF는 2개의 폴리펩티드 쇄인 α-쇄 및 β-쇄를 함유한다. 공개된 연구 결과는 HGF의 c-Met 수 용체 결합 도메인을 함유하는 것이 α-쇄임을 시사한다.

HGF는 그의 동족 수용체에 결합하는 경우에 다수의 세포 활성을 매개한다. HGF-Met 신호전달 경로는 간 재생, 창상 치유, 신경 재생, 혈관신생 및 종양발생에서 소정의 역할을 수행한다. 예를 들면, 문헌 [Cao et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 7443-7448], [Burgess et al. (2006) CANCER Res. 66: 1721-1729], 및 미국 특허 제5,997,868호 및 제5,707,624호를 참조한다. 연구원들은 HGF 활성과 관련된 다양한 장애, 예를 들면 특정 HGF 반응성 암을 치료하기 위한, 항체를 비롯한 다수의 HGF 조절제를 개발하였다. 예를 들면, 국제 출원 공개공보 WO 2005/017107을 참조한다.

모든 항체에 공통적인 기본 구조가 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 항체는 4개의 폴리펩티드 쇄를 함유하는 다량체성 단백질이다. 이 중 2개의 폴리펩티드 쇄는 중쇄 또는 H 쇄로 지칭되고, 다른 2개의 폴리펩티드 쇄는 경쇄 또는 L 쇄로 지칭된다. 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄는 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결된다. 이뮤노글로불린 중쇄는 다수의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결된다. 경쇄는 하나의 가변 영역 (도 1의 V_L) 및 하나의 불변 영역 (도 1의 C_L)으로 구성되는 반면, 중쇄는 하나의 가변 영역 (도 1의 V_H) 및 적어도 3개의 불변 영역 (도 1의 CH₁, CH₂ 및 CH₃)으로 구성된다. 가변 영역은 항체의 특이성을 결정하고, 불변 영역은 다른 기능을 갖는다.

아미노산 및 구조 정보는 각각의 가변 영역이 비교적 보존되어 있는 4개의 프레임워크 영역 또는 FR에 의해 측면에 위치하는 3개의 초가변 영역 (또한, 상보성 결정 영역 또는 CDR로 알려져 있음)을 포함하고 있음을 나타낸다. CDR₁, CDR₂ 및 CDR₃으로 지칭되는 3개의 CDR은 개별 항체의 결합 특이성을 결정한다. 항체가 진단제 및 치료제로 사용되는 경우, 통상적으로는 표적 분자에 대해 최고의 결합 특이성 및 친화도를 갖는 항체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 가변 영역에서의 차이는 항체의 특이성 및 친화도에 큰 영향을 미칠 수 있을 것으로 여겨진다.

미국 특허 제5,707,624호는 카포시 육종의 치료에 항-HGF 항체를 사용하는 것에 대해 기재하고 있다. 이와 유사하게, 미국 특허 제5,997,868호는 치료될 환자에게 항-HGF 항체를 투여하여 내생 HGF가 종양에서 혈관신생을 촉진하는 능력을 차단시킴으로써 종양을 치료하는 것에 대해 기재하고 있다. 보다 최근에, 연구원들은 HGF의 β-쇄에 결합하는 항체가 HGF-의존성 종양을 갖고 있는 환자의 치료제로서의 가능성을 가질 수 있다고 제안하고 있다 (Burgess (2006), 상기 문헌).

그럼에도 불구하고, 치료제 및 진단제로 사용될 수 있는 추가의 HGF 조절제가 계속 요망되고 있다.

<발명의 요약>

본 발명은 부분적으로 HGF, 특히 인간 HGF에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 부류의 발견에 기초한다. 상기 결합 단백질은 HGF에 특이적으로 결합하는 항체 부류의 CDR에 기초한 항원 (즉, HGF) 결합 부위를 함유하는 한 항체-기재의 단백질이다. CDR은 HGF에 대한 결합 단백질의 결합 특이성을 부여한다. 상기 결합 단백 질은 진단제 및 치료제로 사용될 수 있다. 상기 결합 단백질은 치료제로 사용되는 경우, 수혜자 (예를 들면, 인간)에게 투여되었을 때 결합 단백질에 대한 면역 반응이 유도될 위험을 감소 또는 제거하도록 조작 (예를 들면, 인간화)된다.

상기 결합 단백질은 HGF의 활성을 무력화시키므로, 치료제로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 HGF가 그의 동족 수용체 c-Met에 결합하지 못하도록 하여 HGF 활성을 무력화시킨다. 다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 HGF에 결합하여, HGF가 c-Met 수용체에 결합하는 것을 방해하지는 않으면서 그의 생물학적 활성을 무력화시킨다. HGF는 암 세포의 성장 및 증식과 관련되어 있으므로, 상기 결합 단백질은 암 세포의 증식을 억제하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 결합 단백질은 포유동물에게 투여되었을 때 포유동물에서 종양 성장을 억제 또는 감소시킬 수 있다.

본 발명의 상기 및 다른 측면 및 이점은 아래 도면, 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위를 고려하여 명백해질 것이다.

본 발명은 아래 도면을 참조하여 보다 완전하게 이해될 수 있다.

도 1은 전형적인 항체의 개략도이다.

도 2는 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 및 3D11로 표시된 항체의 완전한 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 정하는 아미노산 서열을 보여주는 개략도이다. 각각의 항체에 대한 아미노산 서열을 서로에 대해 정렬하고, 신호 펩티드, CDR₁, CDR₂ 및 CDR₃을 정하는 영역은 상자 기호로 구분하였다. 상자 기호로 구분되지 않은 서열은 FR 서열을 나타낸다.

도 3은 도 2에 제시된 각각의 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 서열에 대한 CDR₁, CDR₂ 및 CDR₃ 서열을 보여주는 개략도이다.

도 4는 항체 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 및 3D11의 완전한 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 정하는 아미노산 서열을 보여주는 개략도이다. 각각의 항체에 대한 아미노산 서열을 서로에 대해 정렬하고, 신호 펩티드, CDR₁, CDR₂ 및 CDR₃을 정하는 영역은 상자 기호로 구분하였다. 상자 기호로 구분되지 않은 서열은 FR 서열을 나타낸다.

도 5는 도 4에 제시된 각각의 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 서열에 대한 CDR₁, CDR₂ 및 CDR₃ 서열을 보여주는 개략도이다.

도 6은 U87MG 이종이식 모델에서 항-HGF 항체 1D3, 1F3, 1A3 및 2B8의 종양 억제 활성을 측정하는 실험의 결과를 요약한 그래프이다. 다이아몬드형은 PBS에 해당하고; 삼각형은 항-HGF 항체 1A3에 해당하고; X는 항-HGF 항체 1D3에 해당하고; 사각형은 항-HGF 항체 1F3에 해당하고; 원형은 항-HGF 항체 2B8에 해당한다.

도 7은 U118 이종이식 모델에서 항-HGF 항체 1D3, 1F3, 1A3 및 2B8의 종양 억제 활성을 측정하는 실험의 결과를 요약한 그래프이다. 다이아몬드형은 IgG에 해당하고; 사각형은 항-HGF 항체 1F3에 해당하고, 삼각형은 항-HGF 항체 1D3에 해 당하고; X는 항-HGF 항체 1A3에 해당하고; 원형은 항-HGF 항체 2B8에 해당한다.

도 8은 인간 HGF 및 키메라, 키메라/인간화 또는 인간화 2B8 항체 사이의 상호작용의 동역학 및 항원-결합 친화도에 대한 표면 플라스몬 공명 데이타를 요약한 표이다. 상기 표는 시험된 κ 경쇄 및 IgG1 중쇄의 쌍을 열거하고 있다. 항체를 열거된 표준 편차 (STDEV)에서 3가지 독립적인 실험으로 분석한다.

도 9는 Hu2B8이 쥐과동물 모노클로날 항체 2B8에 상호 배타적인 에피토프에 결합한다는 것을 나타내는 실험 데이타를 요약한 막대 차트이다. 인간화 또는 키메라 2B8을 항-인간 Fc 칩 상에 포획시킨다. 이어서, HGF를 인간화 또는 키메라 2B8에 결합시킨다. 마우스 2B8 또는 대조군 항체 (폴리클로날 염소 항-HGF 항체)가 포획된 HGF에 결합하는 능력을 측정한다. 인간화 2B8 항체 및 키메라 2B8은 모두 쥐과동물 2B8이 HGF에 결합하지 못하도록 하였다. 백색 막대는 키메라 2B8 항체에 해당하고; 회색 막대는 인간화 Hu2B8 항체 (κ 가변 영역 Kv1-39.1 및 중쇄 가변 영역 Hv5-51.1)에 해당하고; 흑색 막대는 인간화 Hu2B8 항체 (κ 가변 영역 Kv3-15.1 및 중쇄 가변 영역 Hv5-51.1)에 해당한다.

본 발명은 부분적으로 HGF, 특히 인간 HGF에 특이적으로 결합하여 그의 활성을 무력화시키는 결합 단백질 부류의 발견에 기초한다. 상기 결합 단백질은 다양한 진단적 및 치료적 적용에 사용될 수 있다. 상기 결합 단백질은 HGF에 결합하여 그의 활성을 무력화시키는 능력에 대해 선별된 특정 모노클로날 항체의 항원 결합 부위에 기초한다. 특히, 상기 결합 단백질은 함께 HGF에 대한 결합 부위를 정하는 이뮤노글로불린 가변 영역 CDR 서열을 함유한다.

이들 항체의 활성의 무력화 측면에서, 이들은 특히 HGF 반응성 세포, 예를 들면 암 세포의 성장 및/또는 증식을 조절하는데 유용하다. 상기 결합 단백질은 치료제로 사용되는 경우, 수혜자에게 투여되었을 때 결합 단백질에 대한 면역 반응이 유도될 위험을 최소화시키거나 제거하도록 조작될 수 있다. 또한, 특정한 적용에 있어, 상기 결합 단백질은 다른 잔기, 예를 들면 검출가능한 표지, 예를 들면 방사성표지, 및 이펙터 분자, 예를 들면 다른 단백질 및 소분자-기재의 치료제에 컨쥬게이션될 수 있는 것으로 여겨진다. 이러한 본 발명의 특징 및 측면은 각각 아래에서 보다 상세하게 논의된다.

I - HGF 에 결합하는 결합 단백질

한 측면에서, 본 발명은 인간 HGF에 결합하는 단리된 결합 단백질을 제공한다. 상기 결합 단백질은 (i) 구조 CDR_L1-CDR_L2-CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역, 및 (ii) 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하며, 이 때 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 및 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역은 함께 인간 HGF에 대한 결합을 위한 단일 결합 부위를 정한다. CDR_L1은 아미노산 서열 X₁ X₂ Ser X₄ X₅ X₆ X₇ X₈ X₉ X₁₀ X₁₁ X₁₂ X₁₃ X₁₄ X₁₅를 포함하며, 이 때 아미노산 X₁은 Arg, Lys 또는 Ser이고, X₂는 Ala 또는 Thr이고, X₄는 Glu, Gln 또는 Ser이고, X₅는 Asn, Asp 또는 Ser이고, X₆은 Ile 또는 Val이고, X₇은 Asp, Lys, Ser, Val 또는 Tyr이고, X₈은 펩티드 결합 또는 Tyr이고, X₉는 펩티드 결합 또는 Asp이고, X₁₀은 펩티드 결합 또는 Gly이고, X₁₁은 펩티드 결합 또는 Asn이고, X₁₂는 펩티드 결합, Ile 또는 Ser이고, X₁₃은 Asn 또는 Tyr이고, X₁₄는 Ile, Leu, Met 또는 Val이고, X₁₅는 Ala, Asn, His 또는 Ser이다. CDR_L2는 아미노산 서열 X₁₆ X₁₇ X₁₈ X₁₉ X₂₀ X₂₁ X₂₂를 포함하며, 이 때 아미노산 X₁₆은 Ala, Asp, Arg, Gly 또는 Val이고, X₁₇은 Ala, Thr 또는 Val이고, X₁₈은 Asn, Ser 또는 Thr이고, X₁₉는 Arg, Asn, Lys 또는 His이고, X₂₀은 Leu 또는 Arg이고, X₂₁은 Ala, Asn, Glu, Val 또는 Pro이고, X₂₂는 Asp, Ser 또는 Thr이다. CDR_L3은 아미노산 서열 X₂₃ X₂₄ X₂₅ X₂₆ X₂₇ X₂₈ Pro X₃₀ Thr을 포함하며, 이 때 아미노산 X₂₃은 Leu, Gly 또는 Gln이고, X₂₄는 His 또는 Gln이고, X₂₅는 Phe, Ser, Trp 또는 Tyr이고, X₂₆은 Asp, Ile, Ser, Trp 또는 Tyr이고, X₂₇은 Gly, Glu, Asn 또는 Ser이고, X₂₈은 Asp, Asn, Phe, Thr 또는 Tyr이고, X₃₀은 Leu, Phe, Pro 또는 Tyr이다.

다른 측면에서, 본 발명은 (i) 구조 CDR_H1-CDR_H2-CDR_H3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 (ii) 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이 때 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역은 함께 인간 HGF에 대한 결합을 위한 단일 결합 부위를 정하는 것인, 인간 HGF에 결합하는 단리된 결합 단백질을 제공한다. CDR_H1은 아미노산 서열 X₁ Tyr X₃ X₄ X₅를 포함하며, 이 때 아미노산 X₁은 Asp, Asn, Ser 또는 Thr이고, X₃은 Phe, Ser, Trp 또는 Tyr이고, X₄는 Ile, Leu 또는 Met이고, X₅는 Asn, His 또는 Ser이다. CDR_H2는 아미노산 서열 X₆ Ile X₈ X₉ X₁₀ X₁₁ Gly X₁₃ X₁₄ X₁₅ Tyr X₁₇ X₁₈ X₁₉ X₂₀ X₂₁ X₂₂를 포함하며, 이 때 아미노산 X₆은 Lys, Gln, Glu, Val 또는 Tyr이고, X₈은 Asn, Gly, Ser, Trp 또는 Tyr이고, X₉는 Ala, Pro 또는 Ser이고, X₁₀은 Gly 또는 Thr이고, X₁₁은 펩티드 결합, Asp, Asn, Gly 또는 Ser이고, X₁₃은 Asp, Asn, His 또는 Ser이고, X₁₄는 Ser 또는 Thr이고, X₁₅는 Asn 또는 Tyr이고, X₁₇은 Asn 또는 Pro이고, X₁₈은 Ala, Asp, Gly, Gln, Glu, Pro 또는 Ser이고, X₁₉는 Asn, Lys, Met 또는 Ser이고, X₂₀은 Leu, Phe 또는 Val이고, X₂₁은 Lys, Met 또는 Gln이고, X₂₂는 Asp, Gly 또는 Ser이다. CDR_H3은 아미노산 서열 X₂₃ X₂₄ X₂₅ X₂₆ X₂₇ X₂₈ X₂₉ X₃₀ X₃₁ X₃₂ X₃₃ X₃₄ Tyr을 포함하며, 이 때 아미노산 X₂₃은 Arg, Asn, Gln 또는 Glu이고, X₂₄는 Gly, Leu, Arg 또는 Tyr이고, X₂₅는 펩티드 결합, Asp 또는 Gly이고, X₂₆은 펩티드 결합 또는 Gly이고, X₂₇은 펩티드 결합 또는 Tyr이고, X₂₈은 펩티드 결합, Leu 또는 Tyr이고, X₂₉는 펩티드 결합, Gly, Leu, Arg 또는 Val이고, X₃₀은 펩티드 결합, Asp, Gly 또는 Glu이고, X₃₁은 펩티드 결합, Asn, Arg, Ser 또는 Tyr이고, X₃₂는 펩티드 결합, Ala, Gly, Ile 또는 Tyr이고, X₃₃은 Met 또는 Phe이고, X₃₄는 Ala 또는 Asp이다.

상기 결합 단백질은 상기 언급된 이뮤노글로불린 경쇄 및 이뮤노글로불린 중쇄 서열 둘 모두 또는 이들의 단편을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 상기 결합 단백질은 온전한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 생합성 항체 부위일 수 있는 것으로 이해된다.

특정 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄 및 이뮤노글로불린 중쇄의 CDR 서열은 프레임워크 영역 (FR)과 삽입된다.

다른 특정 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄 및 이뮤노글로불린 중쇄의 CDR 서열은 인간 또는 인간화 프레임워크 영역 사이에 삽입된다.

다른 측면에서, 본 발명은 인간 HGF에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 단백질을 제공한다. 상기 결합 단백질은 (a) 구조 CDR_L1-CDR_L2-CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역, 및 (b) 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하며, 이 때 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 및 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역은 함께 인간 HGF에 대한 결합을 위한 단일 결합 부위를 정한다. CDR_L1은 서열 8 (1A3), 서열 18 (2B8), 서열 28 (2F8), 서열 38 (3B6), 서열 48 (3D11), 서열 58 (1D3), 서열 68 (1F3) 및 서열 78 (3A12)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. CDR_L2는 서열 9 (1A3), 서열 19 (2B8), 서열 29 (2F8), 서열 39 (3B6), 서열 49 (3D11), 서열 59 (1D3), 서열 69 (1F3), 서열 79 (3A12) 및 서열 206 (LRMR2B8LC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. CDR_L3은 서열 10 (1A3), 서열 20 (2B8), 서열 30 (2F8), 서열 40 (3B6), 서열 50 (3D11), 서열 60 (1D3), 서열 70 (1F3) 및 서열 80 (3A12)으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐, 특정 서열 번호로 표시된 서열은 그 뒤에 그 특정 서열의 기원이 되었는 항체를 괄호 안에 기재하여 표시한다. 예를 들면, 서열 8 (1A3)은 서열 8의 서열이 항체 1A3에 존재하는 서열에 기초하였음을 나타낸다.

한 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 8 (1A3)의 서열을 포함하는 CDR_L1, 서열 9 (1A3)의 서열을 포함하는 CDR_L2, 및서열 10 (1A3)의 서열을 포함하는 CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 18 (2B8)의 서열을 포함하는 CDR_L1, 서열 19 (2B8) 또는 서열 206 (LRMR2B8LC)의 서열을 포함하는 CDR_L2, 및서열 20 (2B8)의 서열을 포함하는 CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 28 (2F8)의 서열을 포함하는 CDR_L1, 서열 29 (2F8)의 서열을 포함하는 CDR_L2, 및 서열 30 (2F8)의 서열을 포함하는 CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 38 (3B6)의 서열을 포함하는 CDR_L1, 서열 39 (3B6)의 서열을 포함하는 CDR_L2, 및 서열 40 (3B6)의 서열을 포함하는 CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 48 (3D11)의 서열을 포함하는 CDR_L1, 서열 49 (3D11)의 서열을 포함하는 CDR_L2, 및 서열 50 (3D11)의 서열을 포함하는 CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 58 (1D3)의 서열을 포함하는 CDR_L1, 서열 59 (1D3)의 서열을 포함하는 CDR_L2, 및 서열 60 (1D3)의 서열을 포함하는 CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 68 (1F3)의 서열을 포함하는 CDR_L1, 서열 69 (1F3)의 서열을 포함하는 CDR_L2, 및 서열 70 (1F3)의 서열을 포함하는 CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 78 (3A12)의 서열을 포함하는 CDR_L1, 서열 79 (3A12)의 서열을 포함하는 CDR_L2, 및 서열 80 (3A12)의 서열을 포함하는 CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

상기 각각의 실시양태에서, CDR_L1, CDR_L2 및 CDR_L3 서열은 바람직하게는 인간 또는 인간화 이뮤노글로불린 FR 사이에 삽입된다. 상기 결합 단백질은 온전한 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 생합성 항체 부위일 수 있는 것으로 이해된다.

다른 측면에서, 본 발명은 인간 HGF에 결합하는 단리된 결합 단백질을 제공한다. 상기 결합 단백질은 (a) 구조 CDR_H1-CDR_H2-CDR_H3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 (b) 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이 때 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역은 함께 인간 HGF에 대한 결합을 위한 단일 결합 부위를 정한다. CDR_H1은 서열 5 (1A3), 서열 15 (2B8), 서열 25 (2F8), 서열 35 (3B6), 서열 45 (3D11), 서열 55 (1D3), 서열 65 (1F3) 및 서열 75 (3A12)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하고; CDR_H2는 서열 6 (1A3), 서열 16 (2B8), 서열 26 (2F8), 서열 36 (3B6), 서열 46 (3D11), 서열 56 (1D3), 서열 66 (1F3), 서열 76 (3A12), 서열 202 (Hu2B8 Hv1f.1), 서열 203 (Hu2B8 Hv5a.1 또는 Hu2B8 Hv5-51.1), 서열 204 (LR2B8HC) 및 서열 205 (LRMR2B8HC)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하고; CDR_H3은 서열 7 (1A3), 서열 17 (2B8), 서열 27 (2F8), 서열 37 (3B6), 서열 47 (3D11), 서열 57 (1D3), 서열 67 (1F3) 및 서열 77 (3A12)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 5 (1A3)의 서열을 포함하는 CDR_H1; 서열 6 (1A3)의 서열을 포함하는 CDR_H2; 및 서열 7 (1A3)의 서열을 포함하는 CDR_H3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 15 (2B8)의 서열을 포함하는 CDR_H1; 서열 16 (2B8), 서열 202 (Hu2B8 Hv1f.1), 서열 203 (Hu2B8 Hv5a.1 또는 Hu2B8 Hv5-51.1), 서열 204 (LR2B8HC) 또는 서열 205 (LRMR2B8HC)의 서열을 포함하는 CDR_H2; 및 서열 17 (2B8)의 서열을 포함하는 CDR_H3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 25 (2F8)의 서열을 포함하는 CDR_H1; 서열 26 (2F8)의 서열을 포함하는 CDR_H2; 및 서열 27 (2F8)의 서열을 포함하는 CDR_H3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 35 (3B6)의 서열을 포함하는 CDR_H1; 서열 36 (3B6)의 서열을 포함하는 CDR_H2; 및 서열 37 (3B6)의 서열을 포함하는 CDR_H3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 45 (3D11)의 서열을 포함하는 CDR_H1; 서열 46 (3D11)의 서열을 포함하는 CDR_H2; 및 서열 47 (3D11)의 서열을 포함하는 CDR_H3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 55 (1D3)의 서열을 포함하는 CDR_H1; 서열 56 (1D3)의 서열을 포함하는 CDR_H2; 및 서열 57 (1D3)의 서열을 포함하는 CDR_H3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 65 (1F3)의 서열을 포함하는 CDR_H1; 서열 66 (1F3)의 서열을 포함하는 CDR_H2; 및 서열 67 (1F3)의 서열을 포함하는 CDR_H3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 75 (3A12)의 서열을 포함하는 CDR_H1; 서열 76 (3A12)의 서열을 포함하는 CDR_H2; 및 서열 77 (3A12)의 서열을 포함하는 CDR_H3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다.

상기 각각의 실시양태에서, CDR_H1, CDR_H2 및 CDR_H3 서열은 바람직하게는 인간 또는 인간화 이뮤노글로불린 FR 사이에 삽입된다. 결합 단백질은 온전한 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 생합성 항체 부위일 수 있는 것으로 이해된다.

다른 측면에서, 본 발명은 인간 HGF에 결합하는 결합 단백질을 제공한다. 상기 결합 단백질은 서열 2 (1A3)의 잔기 20-141, 서열 12 (2B8)의 잔기 20-137, 서열 22 (2F8)의 잔기 20-137, 서열 32 (3B6)의 잔기 20-139, 서열 42 (3D11)의 잔기 20-132, 서열 52 (1D3)의 잔기 20-141, 서열 62 (1F3)의 잔기 20-141 및 서열 72 (3A12)의 잔기 20-141로 이루어진 군으로부터 선택된 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 4 (1A3)의 잔기 21-127, 서열 14 (2B8)의 잔기 21-127, 서열 24 (2F8)의 잔기 20-131, 서열 34 (3B6)의 잔기 23-129, 서열 44 (3D11)의 잔기 23-128, 서열 54 (1D3)의 잔기 21-127, 서열 64 (1F3)의 잔기 21-127 및 서열 74 (3A12)의 잔기 21-127로 이루어진 군으로부터 선택된 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 2 (1A3)의 잔기 20-141의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열 4 (1A3)의 잔기 21-127의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 12 (2B8)의 잔기 20-137의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열 14 (2B8)의 잔기 21-127의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 22 (2F8)의 잔기 20-137의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열 24 (2F8)의 잔기 20-131의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 32 (3B6)의 잔기 20-139의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열 34 (3B6)의 잔기 23-129의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 42 (3D11)의 잔기 20-132의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열 44 (3D11)의 잔기 23-128의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 52 (1D3)의 잔기 20-141의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열 54 (1D3)의 잔기 21-127의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 62 (1F3)의 잔기 20-141의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열 64 (1F3)의 잔기 21-127의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 72 (3A12)의 잔기 20-141의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역, 및 서열 74 (3A12)의 잔기 21-127의 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

상기 각각의 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 온전한 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 생합성 항체 부위일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 인간 HGF에 결합하는 단리된 결합 단백질을 제공한다. 상기 결합 단백질은 (i) 서열 173 (Hu2B8 Kv1-39.1 경쇄 가변 영역), 서열 179 (Hu2B8 Kv3-15.1 경쇄 가변 영역), 서열 193 (LR2B8LC 경쇄 가변 영역) 및 서열 199 (LRMR2B8LC 경쇄 가변 영역)로 이루어진 군으로부터 선택된 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역; 및 (ii) 서열 159 (Hu2B8 Hv1f.1 중쇄 가변 영역), 서열 165 (Hu2B8 Hv5a.1 중쇄 가변 영역), 서열 169 (Hu2B8 Hv5-51.1 중쇄 가변 영역), 서열 183 (LR2B8HC 중쇄 가변 영역) 및 서열 189 (LRMR2B8LC 경쇄 가변 영역)로 이루어진 군으로부터 선택된 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 결합 단백질은 온전한 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 생합성 항체 부위일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 인간 HGF에 결합하는 단리된 결합 단백질을 제공한다. 상기 결합 단백질은 (i) 서열 177 (Hu2B8 Kv1-39.1 + κ 불변 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 2)), 서열 181 (Hu2B8 Kv3-15.1 + κ 불변 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 2)), 서열 197 (LR2B8LC + κ 불변 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 1)) 및 서열 201 (LRMR2B8LC + κ 불변 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 1))로 이루어진 군으로부터 선택된 이뮤노글로불린 경쇄; 및 (ii) 서열 163 (Hu2B8 Hv1f.1 + IgG1 불변 (G1m(17,1) 알로타입)), 서열 167 (Hu2B8 Hv5a.1 + IgG1 불변 (G1m(17,1) 알로타입)), 서열 171 (Hu2B8 Hv5-51.1 + IgG1 불변 (G1m(17,1) 알로타입)), 서열 187 (LR2B8HC + IgG1 불변 (G1m(3) 알로타입) (대립유전자 1)) 및 서열 191 (LRMR2B8HC + IgG1 불변 (G1m(3) 알로타입) (대립유전자 1))로 이루어진 군으로부터 선택된 이뮤노글로불린 중쇄를 포함한다. 상기 결합 단백질은 온전한 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 생합성 항체 부위일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 환원된 인간 HGF에 결합하는 단리된 결합 단백질을 제공한다. 상기 결합 단백질은 (i) 3개의 CDR을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역, 및 (ii) 3개의 CDR을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다. CDR은 통상적으로 FR 사이에 삽입된다. 이뮤노글로불린 경쇄 및 이뮤노글로불린 중쇄의 CDR은 함께 환원된 인간 HGF, 예를 들면 환원된 HGF의 α-쇄에 결합하는 결합 부위를 정한다. 환원된 HGF는 α-쇄 및 β-쇄 사이의 디술피드 연결을 환원시키기에 충분한 양의 환원제, 예를 들면 디티오트레이톨 (DTT), 2-머캅토에탄올 또는 글루타티온으로 처리한 HGF를 나타낸다. 예시 농도는, 예를 들면 100 mM DTT 및 5％ 2-머캅토에탄올을 포함한다.

특정 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 CDR_L1, CDR_L2 및 CDR_L3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. 임의로는, 상기 결합 단백질은 2개의 CDR, 예를 들면 CDR_L1 및 CDR_L2, 또는 CDR_L1 및 CDR_L3, 또는 CDR_L1 및 CDR_L3을 포함한다. 임의로는, 상기 결합 단백질은 3개의 CDR, 즉 CDR_L1 _, CDR_L2 및 CDR_L3을 모두 포함한다. CDR_L1은 아미노산 서열 X₁ X₂ Ser X₄ X₅ X₆ X₇ X₈ X₉ X₁₀ X₁₁ X₁₂ X₁₃ X₁₄ X₁₅를 포함하며, 이 때 아미노산 X₁은 Arg 또는 Lys이고, X₂는 Ala 또는 Thr이고, X₄는 Glu 또는 Gln이고, X₅는 Asn, Ser 또는 Asp이고, X₆은 Ile 또는 Val이고, X₇은 Tyr, Asp 또는 Lys이고, X₈은 펩티드 결합 또는 Tyr이고, X₉는 펩티드 결합 또는 Asp이고, X₁₀은 펩티드 결합 또는 Gly이고, X₁₁은 펩티드 결합 또는 Asn이고, X₁₂는 펩티드 결합 또는 Ser이고, X₁₃은 Asn 또는 Tyr이고, X₁₄는 Ile 또는 Leu이고, X₁₅는 Ala, Asn 또는 Ser이다. CDR_L2는 아미노산 서열 X₁₆ X₁₇ X₁₈ X₁₉ Leu X₂₁ X₂₂를 포함하며, 이 때 아미노산 X₁₆은 Ala, Asp, Val 또는 Arg이고, X₁₇은 Ala 또는 Val이고, X₁₈은 Asn, Ser 또는 Thr이고, X₁₉는 Arg, Asn 또는 His이고, X₂₁은 Ala, Glu, Val 또는 Pro이고, X₂₂는 Asp 또는 Ser이다. CDR_L3은 아미노산 서열 X₂₃ X₂₄ X₂₅ X₂₆ X₂₇ X₂₈ Pro X₃₀ Thr을 포함하며, 이 때 아미노산 X₂₃은 Leu 또는 Gln이고, X₂₄는 His 또는 Gln이고, X₂₅는 Phe, Ser 또는 Tyr이고, X₂₆은 Asp, Ile 또는 Trp이고, X₂₇은 Gly 또는 Glu이고, X₂₈은 Asp, Phe 또는 Thr이고, X₃₀은 Phe, Pro 또는 Tyr이다.

다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 CDR_H1, CDR_H2 및 CDR_H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다. 임의로는, 상기 결합 단백질은 2개의 CDR, 예를 들면 CDR_H1 및 CDR_H2, 또는 CDR_H1 및 CDR_H3, 또는 CDR_H1 및 CDR_H3을 포함한다. 임의로는, 상기 결합 단백질은 3개의 CDR, 즉 CDR_H1 _, CDR_H2 및 CDR_H3을 모두 포함한다. CDR_H1은 아미노산 서열 X₁ Tyr X₃ X₄ X₅를 포함하며, 이 때 아미노산 X₁은 Asp, Asn, Ser 또는 Thr이고, X₃은 Phe, Trp 또는 Tyr이고, X₄는 Ile 또는 Met이고, X₅는 Asn, His 또는 Ser이다. CDR_H2는 아미노산 서열 X₆ Ile X₈ X₉ Gly X₁₁ Gly X₁₃ X₁₄ X₁₅ Tyr X₁₇ X₁₈ X₁₉ X₂₀ Lys X₂₂를 포함하며, 이 때 아미노산 X₆은 Lys, Gln 또는 Tyr이고, X₈은 Gly, Ser 또는 Tyr이고, X₉는 Pro 또는 Ser이고, X₁₁은 Asp, Gly 또는 Ser이고, X₁₃은 Asp 또는 Ser이고, X₁₄는 Ser 또는 Thr이고, X₁₅는 Asn 또는 Tyr이고, X₁₇은 Asn 또는 Pro이고, X₁₈은 Ala, Asp, Gly 또는 Glu이고, X₁₉는 Asn, Met 또는 Ser이고, X₂₀은 Phe 또는 Val이고, X₂₂는 Asp 또는 Gly이다. CDR_H3은 아미노산 서열 X₂₃ X₂₄ X₂₅ X₂₆ X₂₇ X₂₈ X₂₉ X₃₀ X₃₁ X₃₂ X₃₃ Asp Tyr을 포함하며, 이 때 아미노산 X₂₃은 Arg 또는 Gln이고, X₂₄는 Gly 또는 Leu이고, X₂₅는 Asp, Gly 또는 펩티드 결합이고, X₂₆은 Gly 또는 펩티드 결합이고, X₂₇은 펩티드 결합 또는 Tyr이고, X₂₈은 Leu, 펩티드 결합 또는 Tyr이고, X₂₉는 Gly, Arg 또는 Leu이고, X₃₀은 Asp, Gly 또는 Glu이고, X₃₁은 Tyr, Arg 또는 Asn이고, X₃₂는 Ala, Gly 또는 Tyr이고, X₃₃은 Met 또는 Phe이다.

상기 결합 단백질은 상기 언급된 이뮤노글로불린 중쇄 및 이뮤노글로불린 경쇄 서열 둘 모두 또는 이들의 단편을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 상기 결합 단백질은 온전한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 생합성 항체 부위일 수 있는 것으로 이해된다.

특정 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 (i) 서열 8 (1A3), 서열 28 (2F8), 서열 38 (3B6), 서열 58 (1D3) 및 서열 68 (1F3)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDR_L1, (ii) 서열 9 (1A3), 서열 29 (2F8), 서열 39 (3B6), 서열 59 (1D3) 및 서열 69 (1F3)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDR_L2, 및 (iii) 서열 10 (1A3), 서열 30 (2F8), 서열 40 (3B6), 서열 60 (1D3) 및 서열 70 (1F3)으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다. CDR 서열은 인간 또는 인간화 FR 사이에 삽입될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 서열 4 (1A3)의 잔기 21-127, 서열 24 (2F8)의 잔기 20-131, 서열 34 (3B6)의 잔기 23-129, 서열 54 (1D3)의 잔기 21-127 및 서열 64 (1F3)의 잔기 21-127로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 특정 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 (i) 서열 5 (1A3), 서열 25 (2F8), 서열 35 (3B6), 서열 55 (1D3) 및 서열 65 (1F3)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDR_H1, (ii) 서열 6 (1A3), 서열 26 (2F8), 서열 36 (3B6), 서열 56 (1D3) 및 서열 66 (1F3)으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDR_H2, 및 (iii) 서열 7 (1A3), 서열 27 (2F8), 서열 37 (3B6), 서열 57 (1D3) 및 서열 67 (1F3)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 CDR_H3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다. CDR 서열은 인간 또는 인간화 FR 사이에 삽입될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역은 서열 2 (1A3)의 잔기 20-141, 서열 22 (2F8)의 잔기 20-137, 서열 32 (3B6)의 잔기 20-139, 서열 52 (1D3)의 잔기 20-141 및 서열 62 (1F3)의 잔기 20-141로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 인간 HGF에 결합하는 단리된 결합 단백질을 제공하며, 이는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 및 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 단리된 결합 단백질은 (i) 서열 24 (2F8)의 잔기 20-131의 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 및 서열 22 (2F8)의 잔기 20-137의 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 갖는 항체, (ii) 서열 34 (3B6)의 잔기 23-129의 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 및 서열 32 (3B6)의 잔기 20-139의 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 갖는 항체, 및 (iii) 서열 44 (3D11)의 잔기 23-128의 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 및 서열 42 (3D11)의 잔기 20-132의 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 갖는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 참조 항체와 HGF에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 특정 상황 하에서, 상기 결합 단백질은 상기 참조 항체들 중 하나와 동일한 HGF의 에피토프에 결합한다.

상기 논의된 결합 단백질은 각각 온전한 항체, 예를 들면 모노클로날 항체일 수 있는 것으로 이해된다. 다르게는, 상기 결합 단백질은 항체의 항원 결합 단편 또는 생합성 항체 결합 부위일 수 있다. 항체 단편은 Fab, Fab', (Fab')₂ 또는 Fv 단편을 포함한다. 이러한 항체 단편의 제조 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 다수의 생합성 항체 결합 부위는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 미국 특허 제5,476,786호에 기재된 단일 Fv 또는 sFv 분자를 포함한다. 다른 생합성 항체 결합 부위는 이중특이적 또는 이관능성 결합 단백질, 예를 들면 이중특이적 또는 이관능성 항체를 포함하며, 이들은 2개 이상의 상이한 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 예를 들면, 이중특이적 결합 단백질은 HGF, 예를 들면 인간 HGF, 및 다른 관심있는 항원에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결에 의한 방법을 포함한다. 예를 들면, 문헌 [Songsivilai et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315-325]; [Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148: 1547-1553]을 참조한다.

본 발명의 결합 단백질은 위치 561에서의 시스테인의 아르기닌으로의 치환 또는 위치 555에서의 글리신의 글루타메이트로의 치환을 함유하는 hHGF에 결합할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 4.0×10^-5 s^-1 이하, 3.0×10^-5 s^-1 이하, 또는 2.0×10^-5 s^-1 이하의 k_d로 인간 HGF에 결합하는 단리된 결합 단백질을 제공한다. 단리된 결합 단백질은 5.0×10^-5 s^-1 내지 0.5×10^-5s^-1, 또는 4.0×10^-5 s^-1 내지 1.0×10^-5s^-1, 또는 3.0×10^-5 s^-1 내지 1.5×10^-5 s^-1의 k_d로 인간 HGF에 결합할 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명은 100 pM 이하, 또는 20 pM 이하, 또는 10 pM 이하, 또는 5 pM 이하의 K_D로 인간 HGF에 결합하는 단리된 결합 단백질을 제공한다. 단리된 결합 단백질은 100 pM 내지 5 pM, 또는 20 pM 내지 5 pM, 또는 15 pM 내지 10 pM, 또는 20 pM 내지 10 pM, 또는 15 pM 내지 5 pM의 K_D로 인간 HGF에 결합할 수 있다. 달리 특정되지 않는 한, K_D 값은 실시예 6에 기재된 방법 및 조건으로 결정한다.

다른 측면에서, 본 발명은 인간 HGF에 결합하는 단리된 결합 단백질을 제공하며, 여기서 항체는 25℃에서보다 낮은 K_D로 37℃에서 인간 HGF에 결합한다. 결합 단백질은 임의로는 37℃에서 5 pM 미만의 K_D로 인간 HGF에 결합한다.

다른 측면 및 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 hHGF의 c-Met에 대한 결합을 억제할 수 있다. 예를 들면, 상기 결합 단백질은 실시예 7(a)에 기재된 프로토콜을 사용하여 분석된 경우, 적어도 약 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 및 7.0 nM의 IC₅₀ (최대 억제의 50％에서의 농도)을 가질 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, 결합 단백질은 실시예 7(b)에 기재된 방법을 이용하여 4 MBr-5 세포 (ATCC, 카달로그 번호 CCL208)에서 HGF BrdU 혼입을 무력화시킬 수 있다.

상기 결합 단백질은 실시예 7(b)에 기재된 프로토콜을 사용하여 분석된 경우, 50 nM 이하, 바람직하게는 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 1, 0.5 nM 이하의 IC₅₀을 갖는다. 다른 특정 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 실시예 9에 기재된 분석을 이용하여 PC-3 세포 (ATCC, 미국 버지니아주 매나서스 소재, 카달로그 번호 CRL-1435)에서 HGF 자극된 c-Met 인산화를 억제하는데 사용될 수 있다. 상기 결합 단백질은 실시예 9에 기재된 분석을 이용하여 PC-3 세포에서 HGF-자극된 (1.25 nM) c-Met 인산화를 2 nM 이하의 IC₅₀ (표 8)으로 억제한다.

II - 결합 단백질의 생성

본 발명의 결합 단백질은 당업계에 공지된 접근법을 이용하여 다양한 방식으로 생성될 수 있다. 예를 들면, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 분자는 통상적인 합성 장치 및 본원에 제공된 서열 정보를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 합성 DNA 분자는 다른 적절한 뉴클레오티드 서열, 예를 들면 불변 영역 코딩 서열, 및 발현 제어 서열에 라이게이션되어 원하는 결합 단백질을 코딩하는 통상적인 유전자 발현 구축물을 생성할 수 있다. 지정된 유전자 구축물의 생성은 당업계의 통상적인 기술 범위에 속한다. 다르게는, 본원에 제공된 서열은 하이브리도마 세포에서 쥐과동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 관련된 선행 기술의 서열 정보 또는 본원에 제공된 서열 정보에 기초한 서열을 갖는 합성 핵산 프로브를 사용하여, 통상적인 혼성화 기술 또는 PCR 기술에 의해 하이브리도마에 클로닝될 수 있다. 이러한 프로브의 생성 및 용도는 당업계의 통상적인 기술 범위에 속한다.

원하는 결합 단백질을 코딩하는 핵산은 발현 벡터에 도입 (라이게이션)될 수 있고, 이는 당업계에 공지된 표준 형질감염 또는 형질전환 기술을 통해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 숙주 세포의 예로는, 예를 들면 이. 콜라이(E. coli) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들면, Hep G2), 및 골수종 세포 (달리 이뮤노글로불린 단백질을 생성하지 않음)가 있다. 형질감염된 숙주 세포는 숙주 세포가 관심있는 유전자, 예를 들면 이뮤노글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자를 발현하도록 하는 조건하에 성장시킬 수 있다. 생성된 발현 생성물은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 회수할 수 있다.

특정 발현 및 정제 조건은 어떤 발현 시스템이 이용되는지에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 유전자가 이. 콜라이에서 발현되는 경우, 이는 우선 발현 벡터에 클로닝한다. 이는 적합한 박테리아 프로모터, 예를 들면 Trp 또는 Tac, 및 신호 서열, 예를 들면 단백질 A의 단편 B (FB)를 코딩하는 서열로부터 하류에 조작된 유전자를 배치하여 달성된다. 생성된 발현된 융합 단백질은 통상적으로 세포의 세포질의 굴절소체 또는 봉입체에 축적되며, 프렌치 프레스(French press) 또는 초음파처리에 의해 세포를 파괴한 후에 회수할 수 있다. 이어서, 굴절소체를 가용화시키고, 다른 다수의 재조합 단백질에 대해 이미 확립된 방법으로 발현된 단백질을 폴딩시켜 절단하였다.

조작된 유전자가 진핵생물 숙주 세포, 예를 들면 골수종 세포 또는 CHO 세포에서 발현되는 경우, 이는 우선 적합한 진핵생물 프로모터, 분비 신호, 이뮤노글로불린 인핸서 및 다양한 인트론을 함유하는 발현 벡터에 삽입된다. 상기 발현 벡터는 임의로는 중쇄 또는 경쇄의 전부 또는 일부를 발현시킬 수 있는 불변 영역의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 유전자 구축물은 확립된 형질감염 프로토콜을 사용하여 골수종 세포 또는 CHO 세포를 형질감염시킬 수 있다. 이러한 형질감염된 세포는 V_L 또는 V_H 단편, V_L-V_H 이종이량체, V_H-V_L 또는 V_L-V_H 단일 쇄 폴리펩티드, 완전한 이뮤노글로불린 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들의 일부를 발현시킬 수 있으며, 이들은 각각 다른 기능 (예를 들면, 세포독성)을 갖는 단백질 도메인에 부착될 수 있다.

III - 결합 단백질에 대한 변형

결합 단백질은 결합 단백질의 목적하는 용도에 따라 성능을 최적화시키도록 변형될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 결합 단백질이 치료제로 사용되는 경우, 결합 단백질은 목적하는 수혜자에서 그의 면역원성이 감소되도록 변형될 수 있다. 다르게는, 또한, 결합 단백질은 다른 단백질 또는 펩티드, 예를 들면 성장 인자, 사이토킨 또는 세포독소에 융합 또는 커플링될 수 있다. 이러한 변형은 당업계에 공지된 통상적인 유전자 조작 기술을 이용하여 수행할 수 있다.

항체 및 항체 단편의 항원성을 감소시키는 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 기술은 본 발명의 결합 단백질의 항원성을 감소 또는 제거하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 결합 단백질이 인간에게 투여되는 경우, 결합 단백질은 바람직하게는 인간에서 그의 항원성이 감소되도록 조작된다. 이러한 과정이 인간화로 지칭되기도 한다. 바람직하게는, 인간화 결합 단백질은 항원에 대해 이것이 유래된 본래의 비-인간화 결합 단백질과 동일하거나 실질적으로 동일한 친화도를 갖는다.

한 공지된 인간화 접근법에서, 하나의 종, 예를 들면, 마우스로부터의 항체의 이뮤노글로불린 불변 영역이 제2의 다른 종, 예를 들면 인간으로부터 이뮤노글로불린 불변 영역으로 대체된 키메라 단백질이 생성된다. 이러한 예에서, 생성된 항체는 인간 불변 영역 서열이 대체로 상대 쥐과동물 서열보다 낮은 면역원성을 갖는 마우스-인간 키메라이다. 이러한 유형의 항체 조작은, 예를 들면 문헌 [Morrison, et al. (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851-6855], [Neuberger et al. (1984) Nature 312: 604-608]; 미국 특허 제6,893,625호 (로빈손; Robinson); 제5,500,362호 (로빈손); 및 제4,816,567호 (카빌리; Cabilly)에 기재되어 있다.

CDR 이식으로 공지된 다른 접근법에서, 관심있는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR은 다른 종으로부터의 프레임워크 (FR)에 이식된다. 예를 들면, 쥐과동물 CDR은 인간 FR 서열에 이식될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항-HGF 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDR은 인간 FR 또는 컨센서스 인간 FR에 이식된다. 컨센서스 인간 FR을 생성하기 위해, 여러 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 FR을 정렬하여 컨센서스 아미노산 서열을 확인한다. CDR 이식은, 예를 들면 미국 특허 제7,022,500호 (퀸; Queen); 제6,982,321호 (윈터; Winter); 제6,180,370호 (퀸); 제6,054,297호 (카터; Carter); 제5,693,762호 (퀸); 제5,859,205호 (아데어; Adair); 제5,693,761호 (퀸); 제5,565,332호 (후겐붐; Hoogenboom); 제5,585,089호 (퀸); 제5,530,101호 (퀸); 문헌 [Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327]; [Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536]; 및 [Winter (1998) FEBS Lett 430: 92-94]에 기재되어 있다.

"초인간화"로 지칭되는 접근법에서, 인간 면역원성이 감소 또는 제거된 항체가 다른 형태의 이식에 의해 생성된다. 초인간화에서, 인간 FR 서열은 인간화된 마우스 항체의 CDR에 대한 인간 CDR의 구조적 유사성이 기초하여 인간 생식선 유전자 세트로부터 선택된다. 이 접근법은, 예를 들면 미국 특허 제6,881,557호 (푸테; Foote) 및 문헌 [Tan et al. (2002) J. IMMUNOL 169:1119-1125]에 기재되어 있다.

면역원성을 감소시키는 다른 접근법은 인간화 항체를 생성하기 위한 "재형성(reshaping)", "초키메라화(hyperchimerization)" 및 "버니어링(veneering)/표면 개조(resurfacing)"로 공지된 기술을 포함한다. 예를 들면, 문헌 [Vaswami et al. (1998) Annals of Allergy, Asthma, ＆ Immunol. 81: 105]; [Roguska et al. (1996) Prot. Engineer 9: 895-904]; 및 미국 특허 제6,072,035호 (하드만; Hardman)를 참조한다. 버니어링/표면 개조 접근법에서, 쥐과동물 항체의 표면 접근성 아미노산 잔기는 인간 항체의 동일한 위치에서 보다 빈번하게 나타나는 아미노산 잔기로 대체한다. 이러한 유형의 항체 표면 개조는, 예를 들면 미국 특허 제5,639,641호 (페더센; Pedersen)에 기재되어 있다.

마우스 항체를 인간에서 의학적 용도에 적합한 형태로 전환시키는 접근법의 한 예는 ACTIVMAB(상표명) 기술 (백시넥스 인크.(Vaccinex, Inc.), 미국 뉴욕주 로체스터 소재)로 알려진 것으로, 포유동물 세포에서 항체를 발현시키는 백시니아 바이러스-기재의 벡터를 포함한다. 높은 수준의 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 조합 다양성이 생성되는 것으로 언급된다. 예를 들면, 미국 특허 제6,706,477호 (자우데러; Zauderer); 제6,800,442호 (자우데러); 및 제6,872,518호 (자우데러)를 참조한다.

마우스 항체를 인간에서 사용하기 적합한 형태로 전환시키는 접근법의 다른 예는 칼로바이오스 파마슈티칼스 인크 (KaloBios Pharmaceuticals, Inc.; 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)에서 상업적으로 실시되는 기술이다. 이 기술은 항체 선별을 위한 "에피토프 포커싱" 라이브러리를 생성하기 위해 단독 인간 "수용자" 라이브러리를 사용하는 것을 포함한다.

마우스 항체를 인간에서 의학적 용도에 적합한 형태로 변형시키는 접근법의 다른 예는 HUMAN ENGINEERING(상표명) (HE; 상표명) 기술로, XOMA (US) LLC에서 상업적으로 실시된다. 예를 들면, 국제 출원 공개공보 WO 93/11794 및 미국 특허 제5,766,886호; 제5,770,196호; 제5,821,123호; 및 제5,869,619호를 참조한다.

임의의 상기 접근법을 비롯한 임의의 적합한 접근법을 이용하여 관심있는 결합 단백질의 인간 면역원성을 감소 또는 제거할 수 있다.

또한, 마우스에서 완전한 인간 항체를 생성할 수 있다. 이 접근법에서, 인간 항체는 마우스의 항체-생성 유전자가 인간 항체 생성 유전자의 실재 부분으로 대체된 트랜스제닉 마우스를 사용하여 제조된다. 이러한 마우스는 쥐과동물 이뮤노글로불린 분자 대신 인간 이뮤노글로불린을 생성한다. 예를 들면, WO 98/24893 (자코보비츠(Jacobovitz) 등) 및 문헌 [Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15: 146-156]을 참조한다. 완전한 인간 항-HGF 모노클로날 항체는 다음과 같은 접근법을 이용하여 생성할 수 있다. 인간 이뮤노글로불린 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스를 관심있는 항원, 예를 들면 HGF로 면역화시킨다. 이어서, 마우스로부터의 림프 세포를 상기 마우스로부터 얻은 다음, 이를 골수형 세포주와 융합시켜 영구 하이브리도마 세포주를 제조한다. 이 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여, HGF에 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 확인한다.

본 발명의 결합 단백질은 이들의 목적하는 용도에 따라 다른 분자와 컨쥬게이션시킬 수 있다. 예를 들면, 결합 단백질이 치료제로 사용되는 경우, 결합 단백질은 다른 제제, 예를 들면 치료를 조절하거나 또 다르게는 촉진하는 이펙터 분자와 컨쥬게이션될 수 있다. 이펙터가 비-단백질 기재의 제제, 예를 들어 소분자 약물, 방사성표지 또는 독소인 경우에, 상기 제제는 표준 시험관내 커플링 화학을 이용하여 결합 단백질에 화학적으로 커플링시킬 수 있다. 반면, 이펙터 분자가 단백질 또는 펩티드, 예를 들어 효소, 수용체, 독소, 성장 인자, 사이토킨 또는 다른 면역조절제인 경우, 결합 단백질은 시험관내 커플링 화학을 이용하여 이펙터에 화학적으로 커플링시키거나 또는 융합 단백질로서 이펙터에 커플링시킬 수 있다. 융합 단백질은 섹션 II에 논의된 것과 유사한 기술을 이용하여 구축 및 발현시킬 수 있다.

IV - 결합 단백질의 사용

본원에 기재된 결합 단백질은 진단제 또는 치료제로 사용될 수 있다.

(1) 치료적 적용

본 발명의 결합 단백질은 HGF의 활성을 무력화시키므로, 이들은 다양한 치료적 적용에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 특정 결합 단백질은 과다증식성 질환 또는 장애, 예를 들면 다양한 형태의 암의 예방 또는 치료에 유용하다.

상기 결합 단백질은 종양 세포의 증식을 억제 또는 감소시키는데 사용될 수 있다. 이러한 접근법에서는, 종양 세포를 치료상 유효량의 결합 단백질에 노출시켜 종양 세포의 증식을 억제 또는 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 종양 세포 증식을 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 100％ 억제한다.

특정 실시양태에서, 결합 단백질은 종양 세포의 증식을 억제 또는 감소시키는데 사용되며, 이 때 상기 결합 단백질은 hHGF가 c-Met에 결합하는 능력을 감소시킨다. 다른 실시양태에서, 결합 단백질은 표 5 및 6의 항체 3B6에 의해 밝혀진 바와 같이, 결합 단백질이 hHGF에 결합하지만 hHGF가 c-Met에 결합하는 것을 실질적으로 억제하지는 않는 경우에도 종양 세포의 증식을 억제 또는 감소시키는데 사용된다.

또한, 결합 단백질은 포유동물에서 종양 성장 또는 발생을 억제 또는 지연시키는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에서는, 유효량의 결합 단백질을 포유동물에게 투여하여 포유동물에서 종양 성장을 억제 또는 지연시킨다. 따라서, 결합 단백질은, 예를 들면 포유동물에서, 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 포유동물에게 치료상 유효량의 결합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 결합 단백질은 종양을 치료하기 위해 단독으로 또는 다른 제약상 활성인 분자와 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 결합 단백질은 다양한 HGF 반응성 장애, 예를 들면 폐암, 유방암, 결장암, 전립선암, 난소암, 두경부암, 난소암, 다발성 골수종, 간암, 위암, 식도암, 신장암, 비인두암, 췌장암, 중피종, 흑색종 및 교아세포종에서의 HGF 반응성 종양 세포의 치료에 사용될 수 있는 것으로 여겨진다.

본원에 사용된 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환-상태를 치료하는 것을 나타내며, (a) 포유동물에서, 특히 이 포유동물이 질환-상태에 걸리기 쉬운 상태이나 아직 질환-상태를 나타내는 것으로 진단되지 않은 경우에, 질환-상태가 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환-상태를 억제하는 것, 즉 그의 발생을 중단시키는 것; 및/또는 (c) 질환-상태를 완화시키는 것, 즉 질환 상태를 퇴화시키는 것을 포함한다.

일반적으로, 활성 성분의 치료상 유효량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 임의로는 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 임의로는 약 1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 범위일 것이다. 투여되는 양은 치료되는 질환 또는 징후의 유형 및 정도, 특정 환자의 전반적인 건강 상태, 전달되는 결합 단백질의 상대적인 생물학적 효능, 결합 단백질의 제제, 제제 내의 부형제의 존재 여부 및 유형, 및 투여 경로와 같은 요인에 따라 달라질 것이다. 투여되는 초기 투여량은 원하는 혈중 수준 또는 조직 수준에 빨리 도달하기 위해 상한 수준을 넘어 증가시킬 수 있거나, 또는 초기 투여량은 최적의 투여량보다 적을 수 있고, 일일 투여량은 특정 상황에 따라 치료 과정 동안 점진적으로 증가시킬 수 있다. 인간 투여량은, 예를 들면 0.5 mg/kg 내지 20 mg/kg에서 진행되도록 설계된 통상적인 제I 단계 투여량 상승 연구에서 최적화될 수 있다. 투여 횟수는 투여 경로, 투여량 및 치료되는 질환 증상과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 투여 횟수의 예는 하루에 1회, 1주일에 1회 및 2주일에 1회이다. 바람직한 투여 경로는 비경구 투여 경로, 예를 들면 정맥내 주입 경로이다. 모노클로날 항체-기재의 약물의 제제화는 당업계의 통상적인 기술 범위에 속한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 결합 단백질, 예를 들면 모노클로날 항체는 동결건조되고, 투여 시점에 완충 염수로 재구성된다.

결합 단백질은 단독으로 또는 다른 제약상 활성 성분과 함께 투여될 수 있다. 다른 활성 성분, 예를 들면 면역조절제는 결합 단백질과 함께 투여될 수 있거나, 또는 결합 단백질 투여 이전 또는 이후에 투여될 수 있다.

치료적 용도를 위한 결합 단백질을 함유하는 제제는 통상적으로 제약상 허용되는 담체와 조합된 결합 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 완충제, 담체 및 부형제를 의미하며, 이들은 음파 의학적 판단의 범위에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉시키는데 사용하기 적합하고, 합당한 이점/위험 비율을 갖는다. 담체(들)은 제제의 다른 성분과 상용성이어야 하고 수혜자에게 유해하지 않아야 한다는 점에서 "허용되는" 것이어야 한다. 이와 관련하여, 제약상 허용되는 담체는 제약 투여와 상용성인 임의의 모든 완충제, 용매, 분산 매질, 코팅제, 등장성 및 흡수 지연 제제 등을 포함한다. 제약상 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다.

제제는 편리하게 투여량 단위 형태로 존재할 수 있고, 제약 업계에 공지된 임의의 방법을 비롯한 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 목적하는 투여 경로와 상용성이 되도록 제제화되어야 한다. 투여 경로의 예로는 비경구 투여 또는 비-비경구 투여 경로, 예를 들면 정맥내, 피내, 흡입, 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여 경로가 있다. 경구 또는 비경구 투여에 유용한 용액은, 예를 들면 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)]에 기재된 바와 같은, 제약 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다.

경구 투여에 적합한 제제는 별도의 유닛, 예컨대 주사제, 캡슐, 젤라틴 캡슐, 샤세, 정제, 트로키 또는 로젠지 (이들은 각각 이미 정해진 양의 결합 단백질을 함유함); 분말 또는 과립 조성물; 수성 액체 또는 비-수성 액제 중 용액 또는 현탁액; 또는 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼의 형태일 수 있다.

비경구 투여에 적합한 제제는, 예를 들면 다음과 같은 성분을 포함한다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정된 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 장성 조정에 사용되는 제제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정할 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰풀, 1회용 주사기 또는 다중 투여 바이알에 포함시킬 수 있다.

일반적으로, 주사용 용도에 적합한 조성물은 수성 용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉각적인 제조에 사용되는 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, 크레모포르 ELTM (바스프(BASF), 미국 뉴저지주 파시파니 소재) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 이는 제조 및 보관 조건하에 안정해야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 맞서 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다.

제약 제제는 바람직하게는 멸균된다. 멸균은, 예를 들면 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 수행될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 상기 방법을 이용하는 멸균은 동결건조 및 재구성 이전에 또는 이후에 수행될 수 있다. 제약 조성물이 제제화되면, 이는 예를 들면 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼 또는 고체로, 또는 탈수 또는 동결건조된 분말로 바이알에 보관할 수 있다.

(2) 진단적 적용

결합 단백질이 시험관내 또는 생체내에서 진단 목적으로 사용되는 경우, 결합 단백질은 통상적으로 검출가능한 잔기로 직접 또는 간접적으로 표지한다. 검출가능한 잔기는 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 잔기일 수 있다. 예를 들면, 검출가능한 잔기는 방사성동위원소, 예컨대 ³수소 (³H), ¹⁴탄소 (¹⁴C), ³²인 (³²P), ³⁵황 (³⁵S), 또는 ¹²⁵요오드 (¹²⁵I); 형광 또는 화학발광 화합물, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린; 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼록시다제; 스핀 프로브, 예컨대 스핀 표지; 또는 착색 입자, 예를 들면 라텍스 또는 금 입자일 수 있다. 결합 단백질은, 예를 들면 문헌 [Hunter et al. (1962) Nature 144: 945]; [David et al. (1974) Biochemistry 13: 1014]; [Pain et al. (1981) J. Immunol. Meth. 40: 219]; 및 [Nygren (1982) J. Histochem. and Cytochem. 30: 407]에 기재된 바와 같은, 당업계에 공지된 다수의 접근법을 이용하여 검출가능한 잔기에 컨쥬게이션시킬 수 있는 것으로 이해된다. 표지는, 예를 들면 육안으로 또는 분광광도계 또는 다른 검출기의 도움으로 검출될 수 있다.

결합 단백질은 당업계에서 이용가능한 광범위한 면역검정 기술에 사용될 수 있다. 면역검정의 예로는, 예를 들면 샌드위치 면역검정, 경쟁 면역검정, 면역조직화학 절차가 있다.

샌드위치 면역검정에서, 분석물질 또는 관심있는 항원에 결합하는 2가지 항체가 사용되며, 예를 들면 하나의 항체는 고체 지지체이 고정되어 있고, 다른 하나는 용액 중에 유리되어 있으며 검출가능한 잔기로 표지되어 있다. 항원을 함유하는 샘플이 이 시스템에 도입되면, 항원은 고정된 항체 및 표지된 항체 둘 모두에 결합하여 지지체의 표면 상에 "샌드위치" 면역 복합체를 형성한다. 복합체화된 단백질은 결합되지 않은 샘플 성분 및 잉여량의 표지된 항체를 세척하여 제거하고, 고체의 표면 상에서 단백질에 복합체화된 표지된 항체의 양을 측정하여 검출한다. 다르게는, 용액 중에 유리된 항체를 유리 항체에 결합하는 검출가능한 잔기로 표지된 제3의 항체로 검출할 수 있다. 면역학적 검정 설계, 이론 및 프로토콜에 대한 상세한 검토는 다수의 문헌, 예컨대 문헌 [Butt, ed., (1984) Practical Immunology, Marcel Dekker, New York]; [Harlow et al. eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Laboratory]; 및 [Diamandis et al., eds. (1996) Immunoassay, Academic Press, Boston]에서 찾아볼 수 있다.

표지된 결합 단백질은 수혜자에서 관심있는 특정 조직에 영상화제를 표적화시킬 수 있어 생체내 영상화제로서 유용한 것으로 여겨진다. 생체내 영상화에 바람직한 원거리 검출가능한 잔기는 방사성 원자 테크네튬^-99m (⁹⁹ ^mTc) (약 6시간의 반감기를 갖는 감마 방출체)을 포함한다. 또한 생체내 영상화에 유용한 비-방사성 잔기는 니트록시드 스핀 표지 뿐만 아니라 란탄족 및 전이 금속 이온을 포함하며, 이들은 모두 계내에서 양자 이완을 유도한다. 면역영상화 이외에도, 복합체화된 방사성 잔기는 표적화된 세포를 파괴하는 표준 방사선면역요법 프로토콜에 사용될 수 있다. 고투여량 방사선면역요법에 바람직한 뉴클레오티드는 방사성 원자 ⁹⁰이트륨 (⁹⁰Yt), ¹³¹요오드 (¹³¹I) 및 ¹¹¹인듐 (¹¹¹In)을 포함한다. 결합 단백질은 영상화 분야에 공지된 커플링 기술을 이용하여 ¹³¹I, ¹¹¹In 및 ⁹⁹ ^mTC로 표지할 수 있다. 이와 유사하게, 영상화제의 제조 및 투여 절차 뿐만 아니라 영상의 포착 및 처리 절차가 영상화 분야에 공지되어 있으며, 이에 따라 본원에서는 상세하게 논의하지 않는다. 이와 유사하게, 항체-기재의 면역요법의 수행 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,534,254호를 참조한다.

명세서 전반에 걸쳐, 조성물이 특정 성분을 갖거나, 함유하거나 또는 포함하는 것으로 기재된 경우, 조성물은 또한 본질적으로 언급된 성분으로 구성되거나 또는 이들로 구성되는 것으로 여겨진다. 이와 유사하게, 공정이 특정 공정 단계를 갖거나, 함유하거나 또는 포함하는 것으로 기재된 경우, 공정은 또한 본질적으로 언급된 공정 단계로 구성되거나 또는 이들로 구성된다. 달리 지시된 경우를 제외하고, 단계의 순서 또는 특정 활동을 수행하는 순서는 본 발명이 실시가능한 경우라면 중요하지 않다. 또한, 달리 언급되지 않는 한, 둘 이상의 단계 또는 활동이 동시에 수행될 수 있다.

하기 실시예에서는 다수의 항-hHGF 모노클로날 항체의 생성 및 특성화에 대해 논의한다.

실시예 1 - 항- hHGF 모노클로날 항체의 생성

본 실시예는 다수의 항-hHGF 모노클로날 항체의 생성에 대해 기재하고 있다.

반복적 면역화 다중 부위 (RIMMS) 프로토콜에 따라 MBS사(MBS Inc., 미국 메인주 포틀랜드 소재)에서 면역화, 융합 및 일차 스크리닝을 수행하였다. 5마리의 AJ 마우스 및 5마리의 Balb/c 마우스를 재조합 인간 HGF (R＆D 시스템즈(R＆D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재; 카달로그 번호 294-HGN-025)로 면역화시켰다. 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 최고 항-HGF 활성을 나타내는 혈청을 갖는 2마리의 마우스를 선택하여 이후의 융합에 사용하였다. 적절한 마우스로부터 비장 및 림프절을 회수하였다. 이어서, B-세포를 회수하고, 골수종 종과 융합시켰다. 융합 생성물을 하나 이상의 플레이트 상에서 연속적으로 클론형성 농도에 가까이 희석하였다. 생성된 융합물로부터의 상층액을 이들의 hHGF로의 결합에 대해 ELISA로 스크리닝하였다. HGF에 대한 항체를 함유하는 것으로 확인된 상층액을 아래 실시예에 논의된 바와 같은 시험관내 기능 시험에 의해 추가로 특성화하였다. 하이브리도마의 패널을 선별하고, 하이브리도마를 서브클로닝하여 증식시켰다. 이어서, 모노클로날 항체를 단백질 A/G 수지 상에서 표준 조건하에 친화 도 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

실시예 2 - 항- hHGF 모노클로날 항체의 서열 분석

본 실시예는 실시예 1에서 생성된 항-hHGF 모노클로날 항체의 이소타입 및 서열 분석에 대해 기재하고 있다.

a. HGF 쥐과동물 모노클로날 항체 이소타입의 결정

이소스트립(IsoStrip) 마우스 모노클로날 항체 이소타이핑(Isotyping) 키트를 제조자 (로쉐 어플라이드 사이언스; Roche Applied Science)의 지시에 따라 사용하여 각각의 모노클로날 항체의 경쇄 유형 및 중쇄 이소타입을 결정하였다.

모든 항체는 κ 이뮤노글로불린 경쇄 및 IgG1 이뮤노글로불린 중쇄를 함유하는 것으로 결정되었다.

b. 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결정

RNeasy 미니프렙(Miniprep) 키트를 제조자 (키아젠 벤로(Qiagen Venlo), 네덜란드 소재)의 지시에 따라 사용하여 각각의 모노클로날 하이브리도마 세포주로부터 총 RNA를 추출하였다. 5' RACE (cDNA 말단의 고속 증폭)의 목적을 위해 올리고뉴클레오티드 프라이머 BD SMART II A (5' aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg 3' (서열 85) 및 5' RACE CDS 프라이머 (5' tttttttttttttttttttttttttvn 3', 여기서 v = a, g 또는 c 및 n = a, g, c 또는 t) (서열 86)를 사용하고, BD SMART(상표명) RACE cDNA 증폭 키트를 제조자 (클론텍; Clontech)의 지시에 따라 사용하여 전장 제1 가닥 cDNA를 생성하였다.

확장 고성능 PCR 시스템 (로쉐 어플라이드 사이언스)을 제조자의 지시에 따라 사용하여 PCR (중합효소 연쇄 반응)에 의해 이뮤노글로불린 κ쇄 및 중쇄 (IgG1)의 가변 영역을 증폭시켰다. 중쇄 가변 영역은 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머 믹스인 유니버셜 프라이머 믹스 A (5' ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt 3' (서열 87) 및 5' ctaatacgactcactatagggc 3' (서열 88)의 믹스) 및 3' IgG1 불변 영역 특이적 프라이머인 5' tatgcaaggcttacaaccaca 3' (서열 89) 또는 5' gccagtggatagacagatgggggtgtcg 3' (서열 90)를 사용하여 증폭시켰다. κ 쇄 가변 영역은 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머 믹스인 유니버셜 프라이머 믹스 A 및 3' κ 불변 영역 특이적 프라이머인 5' ctcattcctgttgaagctcttgacaat 3' (서열 91) 또는 5' cgactgaggcacctccagatgtt 3' (서열 92)를 사용하여 증폭시켰다.

개별 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분획화하고, 키아퀵(Qiaquick) 겔 정제 키트를 제조자 (키아젠; Qiagen)의 지시에 따라 사용하여 정제하였다. 이후에 토포이소머라제 기재의 클로닝 키트 TOPO TA 클로닝(등록상표) 키트 (pCR(등록상표)2.1-TOPO(등록상표) 벡터 포함)를 제조자 (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)의 지시에 따라 사용하여 PCR 생성물을 pCR2.1 TOPO 플라스미드에 클로닝하고, 표준 형질전환 기술을 이용하여 DH5 박테리아에 형질전환시켰다. 아젠커트 바이오사이언스(Agencourt Bioscience)에서 T7 (5' TAATACGACTCACTATAGGG 3') (서열 93), M13 정방향 프라이머 (5' GTAAAACGACGGCCAGT 3') (서열 94) 및 M13 역방향 프라이머 (5'CAGGAAACAGCTATGACC 3') (서열 95)를 사용하여 표준 디데옥시 DNA 서열분석 방법에 의해 형질전환된 박테리아 클론으로부터 단리된 플라스미드 DNA의 서열을 분석하여 가변 영역 서열의 서열을 확인하였다. 서열을 벡터 NTI 소프트웨어 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 및 IMGT/V-Quest 웹서버 (http://imgt.cines.fr/textes/vquest)를 사용하여 분석하여 가변 영역 서열을 확인 및 확정하였다.

c. 1A3, 1 D3 , 1F3 및 2B8 κ 및 IgG1 쇄에 대한 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결정

1A3, 1D3 및 1F3 IgG1 쇄에 대한 전장 cDNA는 정방향 프라이머 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgaactttgggctcagattgattttcc 3' (출발 코돈 - 밑줄) (서열 96) 및 역방향 프라이머 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagagg 3' (정지 코돈 - 밑줄) (서열 97)를 사용하여 상기 생성된 cDNA로부터 PCR로 증폭시켰다. 2B8 IgG1 쇄에 대한 전장 cDNA는 정방향 프라이머 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgggatggagctatatcatcctcttt 3' (출발 코돈 - 밑줄) (서열 98) 및 역방향 프라이머 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagag 3' (정지 코돈 - 밑줄) (서열 99)를 사용하여 상기 생성된 cDNA로부터 증폭시켰다.

2B8 κ 쇄에 대한 전장 cDNA는 정방향 프라이머 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatggaatcacagactctggtcttcata 3' (출발 코돈 - 밑줄) (서열 100) 및 역방향 프라이머 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctaacactcattcctgttgaagctc 3' (정지 코돈 - 밑줄) (서열 101)를 사용하여 증폭시켰다. PCR 단편을 게이트웨이(Gateway) BP 재조합 반응 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에 의해 pDONR221 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에 서브클로닝하고, 아젠커트 바이오사이언스에서 표준 디데옥시 DNA 서열분석 방법에 의해 서열을 분석하여 불변 영역의 서열을 확인하고, 가변 영역 서열을 추가로 확정하였다.

d. 서열 분석

IMGT/V-QUEST 웹서버 소프트웨어 (http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)를 사용하여 가변 영역 (정상 텍스트)을 확인하였다. 신호 펩티드 서열은 확인된 가변 영역의 상류에 위치한 인-프레임(in frame) 출발 코돈 (ATG)의 확인에 기초하여 예측하였다. 신호 펩티드 서열을 확인하고, 밑줄로 표시하였다.

각각의 가변 영역의 마지막 뉴클레오티드는 가변/불변 영역 연결에 의해 생성된 다음 코돈의 제1 염기이다. 이 뉴클레오티드는 그 엑손의 일부이므로 가변 영역에 포함된다. 아래 열거된 불변 영역의 아미노산 서열은 상기 연결 코돈의 번역물을 포함한다.

완전한 중쇄 또는 κ쇄 항체 서열을 생성하기 위해, 아래 언급된 가변 영역 서열을 이들의 각 불변 영역 서열과 합하였다 (신호 서열 - 밑줄).

(1) 1A3 중쇄 가변 영역 (서열 1)

(2) 1A3 κ 경쇄 가변 영역 (서열 3)

(3) 2B8 중쇄 가변 영역 (서열 11)

(4) 2B8 κ 경쇄 가변 영역 (서열 13)

(5) 2F8 중쇄 가변 영역 (서열 21)

(6) 2F8 κ 경쇄 가변 영역 (서열 23)

(7) 3B6 중쇄 가변 영역 (서열 31)

(8) 3B6 κ 경쇄 가변 영역 (2개의 가능한 ATG 출발 코돈 (대문자)) (서열 33)

(9) 3 D11 중쇄 가변 영역 (서열 41)

(10) 3 D11 κ 경쇄 가변 영역 (서열 43)

(11) 1 D3 중쇄 가변 영역 (서열 51)

(12) 1 D3 κ 경쇄 가변 영역 (서열 53)

(13) 1F3 중쇄 가변 영역 (서열 61)

(14) 1F3 κ 경쇄 가변 영역 (서열 63)

(15) 3A12 중쇄 가변 영역 (서열 71)

(16) 3A12 κ 경쇄 가변 영역 (서열 73)

(17) 참조 마우스 IgG1 중쇄 불변 영역 ( J00453 ) (서열 81)

(18) 1A3, 1 D3 , 1F3 및 2B8에 대해 결정된 마우스 IgG1 중쇄 불변 영역 ( AJ 종 마우스로부터 유래됨 ) (서열 82)

(19) 1 D3 , 1F3 및 2B8에 대해 결정된 참조 마우스 κ 경쇄 불변 영역 (V00807) 및 마우스 κ 경쇄 불변 영역 ( AJ 종 마우스로부터 유래됨 ) (서열 83)

(20) 1 D3 , 1F3 및 2B8에 비해 하나의 변형된 뉴클레오티드 (밑줄)를 함유하는 1A3에 대해 결정된 마우스 κ 경쇄 불변 영역 (서열 84)

실시예 1에서 생성된 항체에 대한 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 정하는 아미노산 서열은 각각 도 2에 열거되어 있다. 이들 서열은 각각 서로 정렬되어 있으며, 신호 펩티드, CDR₁, CDR₂ 및 CDR₃을 정하는 서열은 상자 기호로 구분한다. 도 3은 각 항체에 대한 별도의 CDR₁, CDR₂ 및 CDR₃ 서열의 정렬을 보여준다.

실시예 1에서 생성된 각각의 항체에 대한 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 정하는 아미노산 서열은 각각 도 4에 열거되어 있다. 이들 서열은 각각 서로 정렬되어 있으며, 신호 펩티드, CDR₁, CDR₂ 및 CDR₃을 정하는 서열은 상자 기호로 구분한다. 도 5는 각 항체에 대한 별도의 CDR₁, CDR₂ 및 CDR₃ 서열의 정렬을 보여준다.

편의상, 표 1은 상기 본 실시예에서 논의된 항체 서열과 서열 목록에 제시된 것 사이의 대응을 보여주는 색인 차트를 제공한다.

또한, 편의상, 하기 서열은 본 실시예에 기재된 각 항체에 대해 실재 또는 고려되는 전장 중쇄 및 경쇄 서열 (즉, 가변 및 불변 영역 서열을 모두 함유)을 나타낸다. 쥐과동물 항체 2F8, 3A12, 3B6 및 3D11의 불변 영역의 서열은 분석되어 있지 않으나, 이들은 모두 AJ 종 마우스로부터 유래되었으므로 1D3, 1F3 및 2B8 항체와 동일한 불변 영역 서열 (서열 분석되어 있음)을 가질 것으로 가정함을 유의한다. 그러나, 본원에 기재된 가변 영역 서열은 당업자에게 공지된 다수의 다른 불변 영역 서열에 각각 라이게이션되어 활성 전장 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄를 생성할 수 있을 것으로 이해된다.

(1) 전장 1A3 중쇄 서열 (1A3 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 122)

(2) 전장 1A3 중쇄 서열 (1A3 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 123)

(3) 전장 1A3 경쇄 서열 (1A3 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 124)

(4) 전장 1A3 경쇄 서열 (1A3 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 125)

(5) 전장 2B8 중쇄 서열 (2B8 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 126)

(6) 전장 2B8 중쇄 서열 (2B8 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 127)

(7) 전장 2B8 경쇄 서열 (2B8 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 128)

(8) 전장 2B8 경쇄 서열 (2B8 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 129)

(9) 전장 2F8 중쇄 서열 (2F8 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 130)

(10) 전장 2F8 중쇄 서열 (2F8 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 131)

(11) 전장 2F8 경쇄 서열 (2F8 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 132)

(12) 전장 2F8 경쇄 서열 (2F8 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 133)

(13) 전장 3B6 중쇄 서열 (3B6 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 134)

(14) 전장 3B6 중쇄 서열 (3B6 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 135)

(15) 전장 3B6 경쇄 서열 (3B6 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 136)

(16) 전장 3B6 경쇄 서열 (3B6 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 137)

(17) 전장 3 D11 중쇄 서열 (3 D11 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 138)

(18) 전장 3 D11 중쇄 서열 (3 D11 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 139)

(19) 전장 3 D11 경쇄 서열 (3 D11 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 140)

(20) 전장 3 D11 경쇄 서열 (3 D11 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 141)

(21) 전장 1 D3 중쇄 서열 (1 D3 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 142)

(22) 전장 1 D3 중쇄 서열 (1 D3 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 143)

(23) 전장 1 D3 경쇄 서열 (1 D3 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 144)

(24) 전장 1 D3 경쇄 서열 (1 D3 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 145)

(25) 전장 1F3 중쇄 서열 (1F3 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 146)

(26) 전장 1F3 중쇄 서열 (1F3 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 147)

(27) 전장 1F3 경쇄 서열 (1F3 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 148)

(28) 전장 1F3 경쇄 서열 (1F3 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 149)

(29) 전장 3A12 중쇄 서열 (3A12 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 150)

(30) 전장 3A12 중쇄 서열 (3A12 중쇄 가변 영역 및 IgG1 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 151)

(31) 전장 3A12 경쇄 서열 (3A12 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 152)

(32) 전장 3A12 경쇄 서열 (3A12 κ 가변 영역 및 불변 영역)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 153)

편의상, 표 2는 본 실시예에 논의된 항체의 전장 서열과 서열 목록에 제시된 것 사이의 대응을 보여주는 색인 차트를 제공한다.

실시예 3 - 다양한 재조합 hHGF 단백질의 생성

본 실시예는 다수의 재조합 단백질의 클로닝 및 발현을 이용하여 실시예 1 및 실시예 14에서 생성된 항체를 특성화하는 것에 대해 기재하고 있다. 특히, 본 실시예는 재조합 hHGF 단백질, 위치 555에서의 글리신의 글루타메이트로의 치환 (G555E)을 함유하는 재조합 hHGF 단백질, 위치 561에서의 시스테인의 아르기닌으로의 치환 (C561R)을 함유하는 재조합 hHGF 단백질, 마우스 HGF 서열 내에 배치된 인간 V495-L585 HGF 서열을 함유하는 재조합 마우스-인간-마우스 (mhm) 키메라 HGF 단백질, 마우스 HGF 서열 내에 배치된 인간 I499-R566 HGF 서열을 함유하는 재조합 mhm 키메라 HGF 단백질, 및 마우스 HGF 서열 내에 배치된 인간 W507-L585 HGF 서열을 함유하는 재조합 mhm 키메라 HGF 단백질의 클로닝 및 발현에 대해 기재하고 있다.

아래 발현 구축물은 표준 분자 기술을 이용하여 생성하고, 생성된 cDNA 서열은 DNA 서열분석으로 확인한다.

a. hHGF - Fc

일차 PCR에서, Not I 부위를 도입하고, hHGF 및 hIgFc 사이에 6xHis 태그를 코딩하여 2개의 중복되는 PCR 단편을 생성하였다. 이차 PCR에서 이 중복되는 PCR 단편을 주형으로 사용하여 hHGF-his-IgFc를 증폭시켰다. 생성된 단편을 NheI 및 BamHI으로 분해하고, pcDNA5/FRT (인비트로젠, #35-3014)에 클로닝하였다. 이어서, hHGF를 인비트로젠 클론 ID: IOH29794 (인간 HGF cDNA)로부터 증폭시켰다. 이 서열은 등록 번호 NM_000601.4로 NCBI에 기탁된 서열에 상응하는 것으로 밝혀졌다.

(1) 5' hHGF NheI 프라이머

(2) 3' hHGF NotI His 태그 프라이머

(3) 5' HisIgFc 프라이머

(4) 3' IgFc BamHI 프라이머

b. hHGF - Fc G555E 및 hHGF - Fc C561R

hHGF-Fc 돌연변이 G555E 및 C561R은 퀵체인지(QuikChange) II XL 부위-지정 돌연변이유발 키트 (스트라타진; Stratagene)를 제조자의 지시에 따라 사용하는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 생성되었다 .

(1) hHGF - Fc ( G555E ) 센스 프라이머

(2) hHGF - Fc ( G555E ) 안티센스 프라이머

(3) hHGF - Fc ( C561R ) 센스 프라이머

(4) hHGF - Fc ( C561R ) 안티센스 프라이머

c. 마우스-인간-마우스 키메라 Fc

마우스-인간-마우스 키메라 IgFc 구축물은 mHGF α 쇄-hHGF, 인간 HGF의 β 쇄 아미노산 Val 495-Leu 585, 및 6xHis 태그 및 IgG-Fc가 연결되어 있는 mHGF C-말단 β 쇄를 함유한다.

아미노산 V495-L585를 코딩하는 인간 HGF cDNA를 인비트로젠 클론 ID: IOH29794 (인간 HGF cDNA)로부터 증폭시켰다. 이 서열은 등록 번호 NM_000601.4로 NCBI에 기탁된 서열에 상응한다. 마우스 HGF 서열은 수퍼 스크립트 1 단계 (Super Script One Step) RT-PCR 키트 (인비트로젠, #10928-034)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 마우스 간의 총 RNA (클론텍, #636603)로부터 RT-PCR로 증폭시켰다. mHGF cDNA 서열은 등록 번호 D10213.1로 NCBI에 기탁된 서열에 상응한다.

단편 1, 2 및 3으로 지칭되는 3개의 단편을 중복되는 PCR 프라이머를 사용하여 생성하고, 연속되는 PCR 증폭에서 어닐링시켰다. 최종 생성물을 NheI 및 NotI으로 절단하고, pcDNA5/FRT IgGFc에 클로닝하였다.

(1) 단편 1 mHGF α 쇄 5' NheI 에 대한 프라이머

(2) 단편 2 hHGF β 쇄 aa V495 - L585 에 대한 프라이머

(3) 단편 3 mHGF β 쇄 C-말단 3' NotI 에 대한 프라이머

d. hHGF 및 mhm 키메라의 구축

hHGF 및 mhm 키메라 (V495-L585), pcDNA5/FRT hHGF 및 pcDNA5/FRT-mhm 키메라 (V495-L585) (Fc-태그 없음)를 코딩하는 벡터를 부위 지정 돌연변이유발에 의해 생성하였다. 퀵체인지 II XL 부위-지정 돌연변이유발 키트 (스트라타진)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 정지 코돈을 6xHis 태그의 3'에 도입하였다. 돌연변이유발 프라이머는

프라이머 1:

, 및

프라이머 2:

를 포함한다.

또한, pcDNA5/FRT-mhm (V495-L585) 구축물로부터 퀵체인지 II XL 부위-지정 돌연변이유발 키트 (스트라타진)를 제조자의 지시에 따라 사용하는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 2개의 mhm 키메라를 더 생성하였다. 하나의 mhm 구축물은 쥐과동물 서열 사이에 배치된 hHGF의 I499-R556의 영역을 함유한다. 다른 mhm 구축물은 쥐과동물 서열 사이에 배치된 hHGF의 W507-L585의 영역을 함유한다.

mhm 키메라 (I499-R556)의 경우, 적절한 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 주형 pcDNA5/FRT-mhm 키메라 (V495-L585) 구축물에서 다음과 같은 점 돌연변이를 순서대로 만들었다: D558E, C561R, V564I, V567I 및 M583L. mhm 키메라 (W507-L585)의 경우, 적절한 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 주형 pcDNA5/FRT-mhm 키메라 (V495-L585) 구축물에 다음과 같은 점 돌연변이를 한 단계로 도입시켰다: Q502R, N504T 및 I505V.

신호 서열 (뉴클레오티드 1-93) 및 프로도메인 (뉴클레오티드 94-162)을 포함하는, 생성된 hHGF-Fc 단백질의 뉴클레오티드 서열이 서열 118로 열거되어 있다. hHGF-Fc 단백질의 아미노산 서열은 서열 119로 열거되어 있다.

신호 서열 (뉴클레오티드 1-96) 및 프로도메인 (뉴클레오티드 97-165)을 포함하는, mhm (V495-L585)-Fc 키메라 단백질을 코딩하는 생성된 뉴클레오티드 서열은 서열 120에 열거되어 있다. mhm (V495-L585)-Fc 키메라 단백질의 아미노산 서열은 서열 121에 열거되어 있다.

mhm (V495-L585) 구축물을 코딩하는 생성된 뉴클레오티드 서열 및 mhm (V495-L585) 구축물을 정하는 단백질 서열은 각각 서열 211 및 212에 열거되어 있다. 서열 211에 열거된 핵산 서열은 신호 서열 (뉴클레오티드 1-96) 및 프로도메인 (뉴클레오티드 97-165)을 포함하고, 서열 212에 열거된 단백질 서열은 활성 단백질 서열 (신호 서열 또는 프로도메인이 없음)을 포함한다. mhm (I499-R556) 구축물을 코딩하는 생성된 뉴클레오티드 서열 및 mhm (I499-R556) 구축물을 정하는 단백질 서열은 각각 서열 213 및 214에 열거되어 있다. 서열 213에 열거된 핵산 서열은 신호 서열 (뉴클레오티드 1-96) 및 프로도메인 (뉴클레오티드 97-165)을 함유하고, 서열 214에 열거된 단백질 서열은 활성 단백질 서열 (신호 서열 또는 프로도메인이 없음)을 포함한다. mhm (W507-L585)을 코딩하는 생성된 뉴클레오티드 서열 및 mhm (W507-L585)을 정하는 단백질 서열은 각각 서열 215 및 216에 열거되어 있다. 서열 215에 열거된 핵산 서열은 신호 서열 (뉴클레오티드 1-96) 및 프로도메인 (뉴클레오티드 97-165)을 포함하고, 서열 216에 열거된 단백질 서열은 활성 단백질 서열 (신호 서열 또는 프로도메인이 없음)을 포함한다.

e. 단백질 발현

(1) 세포 배양

CHO FlpIn 세포 (인비트로젠, 카달로그 번호 R758-07))를 F12K 배지 (ATCC, 카달로그 번호 30-2004), 10％ FCS (인비트로젠, 카달로그 번호 10438026), 1％ 페니실린 (10000 유닛/mL) /스트렙토마이신 (10,000 mg/mL) (인비트로젠, 카달로그 번호 15140-122) 중에서 37℃, 5％ CO₂, 100 mg/mL 제오신 (인비트로젠, 카달로그 번호 R250-01)에서 성장시켰다.

(2) 안정한 CHO FlpIn 세포주의 생성

리포펙타민 2000 (인비트로젠, 카달로그 번호 11668-027)을 제조자의 지시에 따라 사용하여 9:1 비의 pOG44:pcDNA5/FRT 발현 플라스미드 DNA로 CHO FlpIn 숙주 세포를 형질감염시켰다. 대조군으로, 세포를 pcDNA5/FRT 공벡터/pOG44 및 pOG44 플라스미드 (인비트로젠, 카달로그 번호 35-3018) 단독으로 형질감염시켰다. 형질감염시키고 24시간 후에, 세포를 분리하고, 48시간 후에 0.5 mg/mL 하이그로마이신 B (시그마(Sigma), 카달로그 번호 H0654-SPEC)를 세포에 첨가하였다. 안정한 세포의 폴리클로날 선별은 F12K, 10％ FCS, 1％ 페니실린/스트렙토마이신, 0.5 mg/mL 하이그로마이신 B에서 수행하였다.

(3) 안정한 CHO FlpIn 세포주에서의 단백질 발현

대략 2×10⁶개의 세포를 15 cm 플레이트에 시딩하고, F12K (ATCC, 카달로그 번호 30-2004)/DMEM 고글루코스 (인비트로젠, 카달로그 번호 11995065) (1:1), 5％ 초저 IgG FCS (인비트로젠, #16250-78) 중에서 5 내지 6일 동안 37℃, 5％ CO₂에서 성장시켰다. 상층액을 회수하고, 생성된 단백질을 ELISA 및 표면 플라스몬 공명으로 분석하였다.

실시예 4 - 항- hHGF 모노클로날 항체의 결합 특성

실시예 1에서 생성된 모노클로날 항체를 이들이 hHGF에 결합하는 능력, 및 실시예 3에서 생성된 특정 재조합 HGF 단백질에 결합하는 능력으로 특성화하였다.

항체를 비아코어(BIAcore) T100 기기를 사용하는 표면-플라스몬 공명에 의해 분석하여 이들이 HGF 및 실시예 3에서 논의된 특정 융합 단백질에 결합하는 능력을 평가하였다. 제조자의 지시에 따라 표준 커플링 프로토콜을 사용하는 아민 커플링 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-50)에 의해 각각의 항체를 카르복시메틸화된 덱스트란 CM5 센서칩 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1006-68) 상에 고정시켰다.

0.05％ 계면활성제 P20 (비아코어, 카달로그 번호 R-1000-54), 2 mg/mL BSA (EMD, 카달로그 번호 2930) 및 10 mg/mL CM-덱스트란 나트륨 염 (플루카(Fluka), 카달로그 번호 86524)을 함유하는 PBS (깁코, 카달로그 번호 14040-133)를 러닝 완충액으로 사용하여 25℃에서 분석을 수행하였다. 상이한 HGF 융합 단백질을 함유하는 상층액 또는 공벡터로 형질감염된 세포로부터의 상층액을 각각의 항체 상에 30 ㎕/분의 유속으로 3분 동안 주사하였다. 주사가 종결되고 30초 후에 생성된 결합을 기저선 상의 공명 유닛 (RU)으로 결정하였다. 결합을 러닝 완충액에 희석시킨 인간 HGF (R＆D 시스템즈, 카달로그 번호 294-HGN-025)와 비교하였다. 비-특이적 결합은 동일한 아민 커플링 절차를 사용하여 마우스 IgG (로클랜드(Rockland), 카달로그 번호 010-0102)를 고정시킨 대조군 표면에 대한 결합과 비교하여 모니터링하였다.

그 결과를 표 3에 요약하였다.

표 3의 결과는 각각의 항체가 rHGF 및 정제된 인간 HGF에 결합한다는 것을 입증한다. 또한, 모든 항체는 점 돌연변이 G555E 및 C561R을 함유하는 hHGF에 결합하였다. 일반적으로, 1F3 및 2F8을 제외한 항체는 모두 쥐과동물 HGF에 결합하지 않으며, 이는 항체 1A3, 1D3, 2B8, 3A12, 3B6 및 3D11이 인간 HGF에 특이적으로 결합한다는 것을 입증한다. 항체 1D3, 1F3 및 2B8은 마우스-인간-마우스 키메라에 결합하는 반면, 나머지 항체는 결합하지 않았다. 이러한 결과는 항체 1D3 및 2B8이 적어도 부분적으로 인간 HGF의 잔기 495-585에 결합한다는 것을 시사한다. 항체 1A3, 3A12, 3B6 및 3D11은 잔기 495-585 이외의 인간 hHGF의 일부에 결합하는 것으로 나타났다. 현재, 2F8은 hHGF 및 mHGF 둘 모두에 결합하는 것으로 나타났으나 2F8이 mhm 키메라에 결합하지 않는 이유는 확실하지 않다.

실시예 5 - 항- hHGF 모노클로날 항체가 환원된 HGF 및 환원되지 않은 HGF 에 결합하는 능력

본 실시예에서는, 실시예 1에서 생성된 항-hHGF 모노클로날 항체를 이들이 환원된 HGF 및 환원되지 않은 HGF에 결합하는 능력에 대해 분석하였다.

항-HGF 혈청의 재조합 hHGF와의 반응성은 이뮤노블랏팅으로 평가하였다. NuPAGE 샘플 환원 완충액 (인비트로젠)이 포함되거나 포함되지 않은 NuPAGE MOPS SDS 러닝 완충액 (인비트로젠) 중 재조합 hHGF 단백질 8 ㎍을 4-12％ Bis-Tris 1.0mmX2D 웰 겔 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 상에서 분획화하였다. 이어서, 분획화된 단백질을 표준 절차를 이용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이 니트로셀룰로스 막을 0.1％ Tween-20(등록상표)이 포함된 Tris 완충 염수 (TBST) 중 5％ 탈지 분유 용액으로 차단한 후에, 추가의 차단을 위해 미니 프로틴 II 다중-스크리닝(Mini Protean II Multi-Screen) 장치 (바이오라드; BioRad)에 올렸다.

생성된 막을 다중-스크리닝 장치 상에서 정제된 항체로 프로빙하였다. 정제된 항체를 차단 완충액으로 5 ㎍/mL로 희석하였다. 이어서, 니트로세룰로스 막을 장치로부터 분리하고, 양고추냉이 퍼록시다제-표지된 항-마우스IgG 항체와 인큐베이션하였다. 그 결과를 표 4에 요약하였으며, 여기서 숫자는 결합의 정도를 반영한 것으로, "-" 는 최소 결합 (결합이 거의 없거나 완전히 없음)을 나타내고, "3+"는 최대 결합을 나타낸다.

표 4의 데이타는 모든 항체가 환원되지 않은 rhHGF에 결합한다는 것을 입증한다. 이에 반해, 모노클로날 항체 1A3, 1D3, 1F3, 2F8, 3B6은 환원된 rhHGF에 결합하였으나, 항체 2B8, 3A12 및 3D11은 환원에 rhHGF에 결합하지 않았다.

실시예 6 - 결합 친화도

hHGF에 대해 실시예 1에서 생성된 각 항체의 상호작용의 동역학 및 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명으로 측정하였다.

제조자의 지시에 따라 표준 커플링 프로토콜을 사용하는 아민 커플링 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-50)에 의해 토끼 항-마우스 이뮤노글로불린 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1005-14)을 카르복시메틸화된 덱스트란 CM5 센서칩 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1006-68) 상에 고정시켰다. 0.05％ 계면활성제 P20 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-54), 2 mg/mL BSA (EMD, 카달로그 번호 2930) 및 10 mg/mL CM-덱스트란 나트륨 염 (플루카, 카달로그 번호 86524)을 함유하는 PBS (깁코, 카달로그 번호 14040-133)를 러닝 완충액으로 사용하여 25℃에서 분석을 수행하였다.

항체를 10 ㎕/분의 유속으로 유동하는 개별 세포에 포획시켰다. 주사 시간은 각각의 항체에 대해 각각의 주기 동안 대략 20 RU의 항체가 포획되도록 변화시킬 수 있다. 러닝 완충액으로 희석시킨 완충액 또는 HGF (R＆D 시스템즈, 카달로그 번호 294-HGN-025)를 참조 표면 (항체가 포획되지 않음) 및 활성 표면 (시험될 항체) 상에 60 ㎕/분으로 2분 동안 순차적으로 주사하였다. 해리 단계는 농도에 따라 15분 또는 90분 동안 모니터링하였다. 이어서, 다른 주기가 시작되기 전에 10 mM 글리신-HCl (pH 1.7) (비아코어, 카달로그 번호 BR-1003-54)을 60 ㎕/분의 유속으로 3분 동안 주사하여 표면을 재생시켰다. 시험된 HGF 농도는 0.46 nM 내지 7.5 nM였다.

동역학 파라미터는 참조값을 감하고 BIA평가 소프트웨어의 동역학 함수를 사용하여 결정하였다. 각각의 항체에 대한 동역학 파라미터, k_a (결합 속도 상수), k_d (해리 속도 상수) 및 K_D (평형 해리 상수)를 아래 표 5에 요약하였다.

표 5의 데이타는 항체가 약 100 pM 이하, 약 50 pM 이하 또는 20 pM 이하의 K_D로 hHGF에 결합한다는 것을 입증한다.

실시예 7 - 항- hHGF 항체의 무력화 활성

본 실시예에서는, 실시예 1에서 생성된 항체를 이들이 (a) c-Met에 대한 hHGF의 결합을 억제하는 능력, 및 (b) 4MBr-5 세포에서 HGF 자극된 BrdU 혼입을 억제하는 능력에 대해 특성화하였다.

a. HGF - Met 결합 억제 검정 (무력화 검정)

항체를 이들이 c-Met에 대한 hHGF의 결합을 억제하는 능력에 대해 ELISA로 시험하였다.

특히, 발락(Wallac) 96-웰 DELFIA 검정 플레이트 (발락 인크., 카달로그 번호 AAAND-0001)를 카르보네이트 코팅 완충액 (15 mM Na₂CO₃ 및 34 mM NaHCO₃, pH 9.0) 중 6.25 ㎍/mL HGF (R＆D 시스템즈, 카달로그 번호 294-HGN-025) 100 ㎕로 4 ℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBS 중 5％ 무지방 분유 200 ㎕로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 조사 대상 항체를 PBS 중 5％ 무지방 분유 중에서 2nM c-Met (R＆D 시스템즈, 카달로그 번호 358-MT/CF)에 그의 농도를 증가시키면서 첨가 (0.033 내지 667 nM, 3-배-연속 희석)하여, 항체를 별도의 플레이트에서 준비하였다. 각각의 웰의 샘플 100 ㎕를 검정 플레이트로 옮기고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 검정 플레이트를 PBS-0.1％ Tween 20으로 3회 세척하고, PBS 중 5％ 무지방 분유로 제조한 2 mg/mL 비오티닐화된 항-인간 c-Met 항체 (R＆D 시스템즈, 카달로그 번호 BAF358) 100 mL/웰과 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.

이어서, 생성된 플레이트를 PBS-0.1％ Tween 20으로 3회 세척하고, DELFIA 검정 완충액 (발락, 카달로그 번호 4002-0010)으로 1:1000 희석시킨 Eu-표지된 스트렙타비딘 (발락, 카달로그 번호 1244-360)과 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 생성된 플레이트를 DELFIA 세척 용액 (발락, 카달로그 번호 4010-0010)으로 3회 세척하고, DELFIA 증강 용액 (발락 #4001-0010) 100 ㎕/웰과 실온에서 15분 동안 교반하면서 인큐베이션하였다.

플레이트를 유로퓸 방법을 이용하여 Victor³V 기기 (퍼킨 엘머; Perkin Elmer) 상에서 판독하였다. IC₅₀ 값을 계산하여, 표 6에 요약하였다.

상기 결과는 3B6 이외의 모든 항체 (즉, 1D3, 1A3, 2B8, 3A12, 1F3, 3D11 및 2F8)가 c-Met에 대한 HGF의 결합을 효율적으로 무력화시킨다는 것을 입증한다.

b. 4 MBr -5 세포에서 HGF 자극된 BrdU 혼입의 무력화

12.5 nM의 hHGF 10 ㎕를 96-웰 조직 배양 미세역가 플레이트 (코스타(Costar) 카달로그 번호 3903)의 각각의 웰에 분배하였다. 6667, 2222, 740, 247, 82, 27, 9.1, 3.0, 1.0, 0.33 nM 농도에서 희석된 일련의 항체 10 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서, HGF 항체 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. F-12K (ATCC, 30-2004), 15％ FBS (깁코 10438-026), 30 ng/mL EGF (시그마 E9644), 1％ 페니실린/스트렙토마이신 (PS, 깁코 카달로그 번호 15140-122)에서 배양한 원숭이 기관지 상피 세포 4MBr-5 (ATCC, CCL208)를 트립신 (깁코 카달로그 번호 25200-056)으로 해리시키고, 다시 검정 배지 (F-12K, 2.5％ FBS, 1％ PS)에서 75,000개 세포/mL로 현탁시키고, 세포 현탁액 80 ㎕를 HGF 항체 혼합물에 분배하였다.

생성된 세포를 37℃, 5％ CO₂에서 인큐베이션하였다. 48시간 후에, 100 μM BrdU (로쉐 카달로그 번호 1669915) 10 ㎕를 첨가하였다. 72시간 후에, 배지를 제거하고, 플레이트를 헤어 드라이기로 건조시키고, 제조자의 지시에 따라 BrdU ELISA (로쉐 카달로그 번호 1669915)로 처리하였다.

발광 신호를 시너지 HT 플레이트 (Synergy HT plate) 판독기 (바이오텍; Bio-Tek)로 정량화하였다. 데이타를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (그래프패드 소프트웨어)으로 방정식 y = 하부 + (상부-하부)/(1+10^(log(EC50-x)*힐(hill) 기울기))을 사용하여 가변 기울기를 갖는 S자형 투여량 곡선으로 피팅하였다. 각각의 실험은 2벌씩 적어도 3회 반복하였으며, 평균 EC₅₀ 값을 표 7에 나타내었다.

표 7의 결과는 항체 1A3, 1D3, 1F3, 2B8, 2F8, 3A12, 3B6 및 3D11이 모두 4MBr-5 세포에서 HGF 유도된 증식을 억제한다는 것을 입증한다.

실시예 8 - 항- hHGF 항체의 항-산란 활성

본 실시예는 실시예 1에서 생성된 항체를 이들이 HGF 유도된 산란 활성을 억제하는 능력에 대해 특성화하는 것에 대해 기재하고 있다. HGF는 MDCK 세포 (ATCC, 미국 버지니아주 매나서스 소재, 카달로그 번호 CCL-34)에서 클러스터의 "산란" (운동성)을 유도한다.

MDCK 세포를 96-웰 코스타 조직 배양 플레이트 (코닝 인코포레이티드(Corning Incorporated), 미국 뉴욕주 코닝 소재, 카달로그 번호 3595)에, 10％ 태아 소 혈청 (인비트로젠 카달로그 번호 10438026) 및 1％ 페니실린-스트렙토마이신 (인비트로젠 카달로그 번호 15140122)을 함유하는 MEM (ATCC, 미국 버지니아주 매나서스 소재, 카달로그 번호 30-2003) 80 ㎕ 중 웰 당 4×10³개 세포의 농도로 시딩하였다. 각각의 조사 대상 항체를 10％ 태아 소 혈청 및 1％ 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 MEM에서 6,667 nM으로 희석하였다. 이어서, 각각의 상이한 항체 희석액 뿐만 아니라, 항체 없이 10％ 태아 소 혈청 및 1％ 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 MEM을 10％ 태아 소 혈청 및 1％ 페니실린-스트렙토마이신 및 100 ng/ml HGF (R＆D 시스템즈 카달로그 번호 294-HGN-025)를 함유하는 동등한 부피의 MEM과 개별적으로 합하였다. 항체/HGF 희석액을 25℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 항체/HGF 희석액 20 ㎕를 각각의 웰에 개별적으로 첨가하여 666.7 nM의 최종 항체 농도 및 10 ng/ml의 최종 HGF 농도가 형성되었다. 이어서, MDCK 세포를 37℃, 5％ CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.

24시간 인큐베이션한 후에, MDCK 세포를 빙냉 PBS (인비트로젠 카달로그 번호 14190144) 100 ㎕/웰로 1회 조심스럽게 세척하고, 25℃에서 10분 동안 진동시키면서 빙냉 메탄올 100 ㎕/웰로 고정시켰디. 이어서, 플레이트를 증류수로 1회 조심스럽게 세척하였다. 100 ㎕ 부피의 크리스탈 바이올렛 용액 (0.5％의 크리스탈 바이올렛 (시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재, 카달로그 번호 C3886) 및 증류수 중 50％ 에탄올로 구성됨)을 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 진동시키면서 25℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다.

크리스탈 바이올렛 용액으로 염색한 후에, 세포를 증류수로 3회 조심스럽게 세척하였다. 이어서, PBS를 각각의 웰에 첨가하여 샘플이 건조되지 않도록 하였다. 레이카(Leica) DMIRB 현미경 (레이카 마이크로시스템즈 게엠베하(Leica Microsystems GmbH), 독일 베즐러 소재), DC500 카메라 (레이카 마이크로시스템즈 게엠베하, 독일 베즐러 소재), 및 MagnaFire 2.1C 소프트웨어 (옵트로닉스(Optronics), 미국 캘리포니아주 골레타 소재)를 이용하여 세포를 영상화하고, 샘플을 산란 수준에 대해 평가하였다. 그 결과를 표 8에 요약하였다.

표 8의 결과는 항체 2B8이 다른 항체 보다 더 많이 HGF-유도된 산란을 억제한다는 것을 입증한다. 항체 1D3 및 3B6은 중간 수준의 억제를 나타내었고, 항체 1A3은 낮은 수준에서 중간 수준의 억제르 나타내었고, 항체 1F3 및 2F8은 낮은 수준의 억제를 나타내었으며; 항체 3A12 및 3D11은 검출가능한 억제를 거의 또는 전혀 나타내지 않았다.

실시예 9 - HGF -자극된 c- Met 인산화의 억제

본 실시예는 실시예 1에서 생성된 항체를 이들이 PC-3 세포에서 HGF-자극된 c-Met 인산화를 억제하는 능력에 대해 특성화하는 것에 대해 기재하고 있다. HGF는 PC-3 세포 (ATCC No. CRL-1435)에서 Met의 인산화를 유도한다.

PC-3 세포를 96-웰 코스타 조직 배양 플레이트 (코닝 카달로그 번호 3595)의 각각의 웰에, 10％ 태아 소 혈청 (인비트로젠 카달로그 번호 10438026) 및 1％ 페니실린-스트렙토마이신 (인비트로젠 카달로그 번호 15140122)을 함유하는 F-12K (ATCC, 미국 버지니아주 매나서스 소재, 카달로그 번호 30-2004) 100 ㎕ 중 웰 당 4.5×10⁴개 세포의 농도로 시딩하였다. 37℃, 5％ CO₂에서 24시간 후에, 배지를 제거하고, 세포를 1％ 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 무혈청 F-12K로 1회 세정하였다. 이어서, 1％ 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 무혈청 F-12K 100 ㎕ 중에서 세포를 24시간 동안 인큐베이션하였다.

각각의 조사 대상 항체의 하기 10가지 상이한 농도의 희석액을 1％ 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 무혈청 F-12K로 제조하였다: 6667 nM, 2222 nM, 741 nM, 247 nM, 82.3 nM, 27.4 nM, 9.1 nM, 3.0 nM, 1.0 nM 및 0.3 nM. 각각의 항체 희석액, 및 항체 없이 1％ 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 무혈청 F-12K를 1％ 페니실린-스트렙토마이신 및 500 ng/mL HGF (R＆D 시스템즈 카달로그 번호 294-HGN-025)를 함유하는 동일한 부피의 무혈청 F-12K와 개별적으로 합하였다. 이들 항체/HGF 희석액을 25℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이로부터 최종 농도 1.25 nM의 HGF가 생성되었다.

이어서, 1％ 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 무혈청 F-12K로 PC-3 세포를 1회 세정하였다. 이어서, 1％ 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 무혈청 F-12K 70 ㎕를 세포에 첨가한 후에, 1％ 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 무혈청 F-12K 중 10 mM Na₃VO₄ (시그마 카달로그 번호 S6508) 10 ㎕를 첨가하였다. 이어서, 세포를 37℃, 5％ CO₂에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 이후에, 각각의 항체/HGF 희석액 20 ㎕를 별도의 웰에 개별적으로 첨가하여 50 ng/mL의 최종 HGF 농도가 형성되었으며, 각각의 항체의 경우 666.7 nM, 222.2 nM, 74.1 nM, 24.7 nM, 8.23 nM, 2.74 nM, 0.91 nM, 0.30 nM, 0.10 nM, 0.03 nM의 최종 농도가 형성되었다. 이어서, 세포를 37℃, 5％ CO₂에서 10분 동안 인큐베이션하고, 그 후에 배지/항체/HGF 혼합물을 제거하고, 플레이트를 얼음에 올려 놓았다. 이어서, 1 mM Na₃VO₄를 함유하는 빙냉 PBS (인비트로젠 카달로그 번호 14190144)를 웰 당 100 ㎕씩 사용하여 세포를 1회 세정하였다. 이어서, 세포를 1％ OmniPur Triton X-100 (MERCK KGaA, 독일 다름슈타트 소재, 카달로그 번호 9410), 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 0.3 mM Na₃VO₄, 1× 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마 카달로그 번호 P8340) 및 1× 포스파타제 억제제 칵테일 2 (시그마 카달로그 번호 5726)로 구성된 빙냉 용해 완충액 100 ㎕/웰 중에서 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다.

비오티닐화된 항-인간 HGF-R (c-met) 항체 (R＆D 시스템즈 카달로그 번호 BAF358)를 1％ 소 혈청 알부민 (시그마 카달로그 번호 A2153)을 함유하는 DELFIA 검정 완충액 (퍼킨 엘머, 핀란드 투르크 소재, 카달로그 번호 4002-0010)으로 2 ㎍/mL의 농도로 희석하고, 상기 희석액 50 ㎕를 황색 스트렙타비딘 미세적정 플레이트 (퍼킨 엘머 카달로그 번호 AAAND-0005)의 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 진동시키면서 25℃에서 30분 동안 항체와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후에, 플레이트를 DELFIA 세척 용액 (퍼킨 엘머 카달로그 번호 4010-0010)으로 세척하고, 각각의 상이한 PC-3 세포 용해물 80 ㎕를 세척된 스트렙타비딘 미세적정 플레이트의 각 웰에 개별적으로 첨가하였다.

PC-3 세포 용해물을 함유하는 스트렙타비딘 미세적정 플레이트를 진탕시키면서 25℃에서 60분 동안 인큐베이션한 후에, DELFIA 세척 용액으로 세척하였다. 1％ 소 혈청 알부민을 함유하는 DELFIA 검정 완충액으로 희석된 600 ng/mL DELFIA Eu-N1 P-Tyr-100 항체 (퍼킨 엘머 카달로그 번호 AD0159) 100 ㎕를 세척된 스트렙타비딘 미세적정 플레이트의 각 웰에 첨가한 다음, PC-3 세포 용해물과 인큐베이션하였다. 플레이트를 진동시키면서 25℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 DELFIA 세척 용액으로 마지막으로 세척하였다. 이어서, DELFIA 증강 용액 (퍼킨 엘머 카달로그 번호 4001-0010) 200 ㎕를 세척된 스트렙타비딘 미세적정 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 진탕시키면서 25℃에서 5분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하였다.

이어서, Victor3V 판독기 (퍼킨 엘머) 상에서 유로품 프로토콜을 사용하여 신호를 측정하였다. 윈도우용 프리즘 4 (그래프패드 소프트웨어 인크., 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재) 및 S자형 투여량-반응 방정식을 이용하여 EC₅₀ 값을 계산하였다.

EC₅₀ (nM)으로 요약된 결과를 표 9에 열거하였다.

표 9의 데이타는 8개의 항체가 모두 PC-3 세포에서 HGF-유도된 c-Met 인산화의 강력한 억제제라는 것을 입증한다.

실시예 10 - U87MG 이종이식 모델에서의 종양 억제

본 발명의 쥐과동물 모노클로날 항체가 종양 성장을 억제하는 능력을 U87MG 이종이식 모델에서 시험하였다. U87MG 세포 (ATCC)는 10％ 태아 소 혈청, 100 유닛/mL의 페니실린 및 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신이 포함된 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM))를 포함하는 배지를 사용하여, 5％ CO₂ 및 95％ 공기를 함유하는 분위기하에 37℃에서 배양하여 증식시켰다. 세포를 계대배양하고, 트립신-EDTA를 사용하여 배양 접시의 벽에서 세포를 분리시켜 유지시켰다.

전면 성장에 근접한 세포를 트립신처리하여 수집한 후에, 50％ 마트리겔 (BD 바이오사이언스(BD Biosciences); 카달로그 번호 356237) 중 5×10⁶개의 세포를 7주령 암컷 ICR SCID 마우스 (타코닉 랩스; Taconic Labs)의 견갑골 사이의 상부 등쪽 부위에 피하 주사하였다. 종양의 길고 (L) 짧은 (W) 직경 (mm)을 캘리퍼로 측정하였다. 종양 부피 (vol.)를 다음과 같이 계산하였다: 부피 (mm³) = L×W²/2. 종양이 대략 200 mm³로 성장하였을 때, 종양-보유 마우스를 각각 10마리씩 5개의 군으로 무작위적으로 분류하였다. 하나의 군은 PBS로 처치하였다. 다른 4개의 군은 각각 항체 1A3, 1D3, 1F3 또는 2B8 중 하나로 처치하였다. 모든 항체는 복막내 주사 (5 투여)에 의해 일주일에 2회 1 mg/kg(체중)으로 투여하였다. 종양 부피 및 마우스 체중을 일주일에 2회 기록하였다. 종양 성장 억제를 스튜던트 t-검정을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 6 및 표 10에 요약하였다.

부분적인 퇴화가 2B8 처치군에서 달성되었다 (도 6). 통계학적으로 유의한 성장 억제가 1A3-처치군 및 1F3-처치군에서 관찰되었다 (표 10). 1D3의 경우 0.075의 p 값에서 종양 성장이 51％ 억제되었다. 유의한 체중 감소는 관찰되지 않았다.

실시예 11 - U118 이종이식 모델에서의 종양 억제

항체 1A3, 1D3, 1F3 및 2B8이 종양 성장을 억제하는 능력을 U118 이종이식 모델에서 시험하였다. U118 세포 (ATCC)는 U87MG 세포에 대해 상기 실시예 10에 기재된 바와 같이 증식시켰다.

피하 종양은 사용된 마우스가 7주령 암컷 NCr 누드 마우스 (타코닉)라는 것을 제외하고는 상기 실시예 10에 기재된 바와 같이 확립하고, 종양이 대략 80 mm³까지 성장하였을 때 처치를 시작하였다. U87MG 모델에서와 같이, 모든 항체는 복막내 주사 (4 투여)에 의해 일주일에 2회 1 mg/kg(체중)으로 투여하였다. 종양 부피 및 마우스의 체중을 일주일에 2회 기록하였다. 종양 성장 억제를 스튜던트 t-검정을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 7 및 표 11에 요약하였다.

통계학상 유의한 종양 성장 억제가 2B8 및 1A3 처치군에서 관찰되었다 (도 7). 1F3 및 1D3 군에서 0.05 미만의 p 값에서 적당한 종양 성장 억제가 나타났으며, 이를 본 연구에서 통계학상 유의한 것으로 정의히였다 (표 11). 유의한 체중 감소는 관찰되지 않았다.

실시예 12 - 쥐과동물 모노클로날 항체의 인간화

본 실시예는 쥐과동물 2B8 항체의 인간화 및 생성된 인간화 항체의 특성화에 대해 기재하고 있다. 쥐과동물 2B8 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 2 가지 방법에 의해 "인간화"되었다.

A. 인간화 절차 1

첫번째 방법에서, 3개의 인간화 중쇄 가변 영역 및 2개의 인간화 κ 경쇄 가변 영역은 문헌 [Hwang et al. (2005) Methods 36:35-42]; [Tan et al. (2002) J. Immunol. 169:1119-1125]; 미국 특허 제6,881,557호에 기재된 "초인간화" 방법에 기초하여 설계하였다.

CDR 길이 및 아미노산 조성에 기초하여 각각의 마우스 2B8 CDR에 대해 코티아(Chothia) 정규 구조군을 결정하였다. 동일한 코티아 정규 구조군 경쇄 및 중쇄 가변 영역으로 이루어진 인간 생식선 가변 영역은 국제 면역학 정보 시스템 (IMGT) 웹사이트 (imgt.cines.fr and biochem.unizh.ch/antibody/sequences/index.html의 월드 와이드 웹 상에서 이용가능함)에 기재된 공지의 인간 생식선 가변 영역 참조 대립유전자에 기초하여 확인하였다. 동일한 구조군의 이들 인간 생식선 가변 영역은 CDR 아미노산 잔기 사이의 동일성 또는 유사성 비율을 계산함으로써 쥐과동물 2B8 가변 영역과 비교하였다. 마우스 2B8 CDR 잔기와 최고의 동일성 및/또는 유사성을 갖는 인간 생식선 가변 영역을 CDR 이식을 위해 선택하였다. 마우스 2B8 CDR 잔기를 사용하여 마우스 2B8 CDR과 인간 생식선 CDR 사이에서 상이한 상응하는 인간 생식선 가변 영역 잔기를 대체하여 인간 생식선 가변 영역의 프레임워크 잔기를 보존하였다. 이어서, 2B8 마우스 J 영역과 가장 유사한 인간 J 영역을 "초인간화" 가변 영역의 카르복실 말단에 첨가하였다. 이어서, 신호 서열을 "초인간화" 가변 영역의 아미노 말단에 첨가하고, 이들 아미노산 서열을 핵산 서열로 전환시켰다.

완전한 가변 영역 핵산 서열을 유전자 합성 PCR 방법 (문헌 [Young et al. (2004) NUCL. ACIDS RES. 32:e59])을 이용하여 구축하고, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 인간 불변 IgG1 (G1m(17,1) 알로타입) 또는 κ (Km(3) 알로타입 (대립유전자 2)) 영역 (가변 영역의 하류)을 함유하는 포유동물 발현 벡터 (pcDNA3.2 DEST (인비트로젠)에 기초함)에 클로닝하였다. 4개의 모든 중쇄 IgG1 항체 (키메라 2B8 및 3개의 인간화 중쇄 (Hu2B8 Hv1-f.1, Hu2B8 Hv5-a.1, Hu2B8 Hv5-51.1)를 3개의 모든 κ쇄 항체 (키메라 2B8 및 2개의 인간화 경쇄 (Hu2B8 Kv1-39.1 및 Hu2B8 Kv3-15.1))와 가능한 조합으로 발현시켜 12개의 상이한 항체 단백질을 생성하였다. 이어서, 키메라, 키메라/인간화 및 인간화 항체의 인간 HGF에 대한 결합을 아래 기재된 바와 같이 측정하고, 그 결과를 표 8에 요약하였다. 이뮤노글로불린 중쇄 및 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역의 가능한 조합을 각각 아래 표 12A에 열거하였다.

이뮤노글로불린 중쇄 및 이뮤노글로불린 경쇄의 가능한 조합을 각각 아래 표 12B에 열거하였다.

인간화 가변 영역을 함유하는 전장 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄를 함유하는 2개의 가능한 항체 구축물을 다음과 같이 설계하였다.

sh2B8-9 (G1m(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ IgG1 불변 영역 (G1m(17,1) 알로타입) (서열 171) + hu2B8 Kv 1-39.1 (+ κ 불변 영역 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 2))) (서열 177)

sh2B8-12 (G1m(17,1)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ IgG1 불변 영역 (G1m(17,1) 알로타입)) (서열 171) + hu2B8 Kv 3-15.1 (+ κ 불변 영역 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 2))) (서열 181).

각각의 인간화 항체를 코딩하는 핵산 서열 및 각각의 인간화 항체를 정하는 단백질 서열을 아래 요약하였다. 본 섹션에서, 각각의 가변 영역의 마지막 뉴클레오티드는 가변/불변 영역 연결에 의해 생성된 다음 코돈의 첫번째 염기이다. 이 뉴클레오티드는 그 엑손의 일부이므로 가변 영역에 포함된다. 아래 열거된 불변 영역의 아미노산 서열은 상기 연결 코돈의 번역물을 포함한다.

(1) 전장 키메라 2B8 중쇄 (마우스 가변 영역 및 인간 IgG1 불변 영역) ( 알로타입 G1m (17,1))를 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 154)

(2) 전장 키메라 2B8 중쇄 ( 키메라 2B8 IgG1 ( G1m (17,1) 알로타입 )를 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 155)

(3) 전장 키메라 2B8 경쇄 (마우스 가변 영역 및 인간 불변 영역) ( 키메라 2B8 κ ( Km (3)))를 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 156)

(4) 전장 키메라 2B8 경쇄 ( 키메라 2B8 κ ( Km (3)))를 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 157)

(5) 인간화 Hu2B8 Hv1 -f.1 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 158)

(6) 인간화 Hu2B8 Hv1 -f.1 중쇄 가변 영역을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 159)

(7) 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 ( G1m (17,1) 알로타입 )을 코딩하는 핵산 서열 (서열 160)

(8) 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 ( G1m (17,1) 알로타입 )을 정하는 단백질 서열 (서열 161). 첫번째 아미노산은 가변 영역의 마지막 뉴클레오티드 및 IgG1 중쇄 서열의 처음 2개의 뉴클레오티드의 번역으로부터 유래된다.

(9) 전장 중쇄 인간화 Hu2B8 Hv1f .1 가변 영역 및 인간 IgG1 ( G1m (17,1) 알로타입 ) 중쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 162)

(10) 전장 중쇄 인간화 Hu2B8 Hv1f .1 가변 영역 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 ( G1m (17,1) 알로타입 )을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 163)

(11) 인간화 Hu2B8 Hv5a .1 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 164)

(12) 인간화 Hu2B8 Hv5a .1 중쇄 가변 영역을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 165)

(13) 전장 인간화 Hu2B8 Hv5a .1 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG1 ( G1m (17,1) 알로타입) 중쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 166)

(14) 전장 인간화 Hu2B8 Hv5a .1 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG1 ( G1m (17,1) 알로타입) 중쇄 불변 영역을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 167)

(15) 인간화 Hu2B8 Hv5 -51.1 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 168)

(16) 인간화 Hu2B8 Hv5 -51.1 중쇄 가변 서열을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 169)

(17) 전장 인간화 Hu2B8 Hv5 -51.1 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG1 ( G1m (17,1) 알로타입) 중쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 170)

(18) 전장 인간화 Hu2B8 Hv5 -51.1 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG1 ( G1m (17,1) 알로타입) 중쇄 불변 영역을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 171)

(19) 인간화 Hu2B8 Kv1 -39.1 κ 쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 172). 2개의 가능한 출발 ATG를 대문자로 나타내었다.

(20) 인간화 Hu2B8 Kv1 -39.1 κ 쇄 가변 영역을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 173)

(21) 인간 κ 쇄 불변 영역 ( Km (3) 알로타입 ) (대립유전자 2)을 코딩하는 핵산 서열 (서열 174)

(22) 인간 κ 쇄 불변 영역 ( Km (3) 알로타입 ) (대립유전자 2)을 정하는 단백질 서열 (서열 175). 첫번째 아미노산은 가변 영역의 마지막 뉴클레오티드 및 κ 경쇄 서열의 처음 2개의 뉴클레오티드의 번역으로부터 유래된다.

(23) 전장 인간화 Hu2B8 Kv1 -39.1 경쇄 가변 영역 및 인간 κ 쇄 불변 영역 (Km(3) 알로타입 ) (대립유전자 2)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 176)

(24) 전장 인간화 Hu2B8 Kv1 -39.1 경쇄 가변 영역 및 인간 κ 쇄 불변 영역 (Km(3) 알로타입 ) (대립유전자 1)을 정하는 단백질 서열 (서열 177)

(25) 인간화 Hu2B8 Kv3 -15.1 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 178)

(26) 인간화 Hu2B8 Kv3 -15.1 경쇄 가변 영역을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 179)

(27) 전장 인간화 Hu2B8 Kv3 -15.1 경쇄 가변 영역 및 인간 κ 쇄 불변 영역 (Km(3) 알로타입 ) (대립유전자 2)을 코딩하는 핵산 (신호 서열 - 밑줄) (서열 180)

(28) 인간화 Hu2B8 Kv3 -15.1 경쇄 가변 영역 및 인간 κ 쇄 불변 영역 (Km(3) 알로타입 ) (대립유전자 2)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 181)

편의상, 표 13은 본 섹션에 논의된 항체의 전장 서열과 서열 목록에 제시된 것 사이의 대응을 보여주는 색인 차트를 제공한다.

B. 인간화 절차 2

마우스 2B8 항체의 면역원성 감소에 이용되는 두번째 인간화 방법은 문헌 [Studnicka et al. (1994) PROTEIN ENG. 7:805-814]에 기재된 방법에 기초한다. 마우스 2B8과 (아미노산 수준에서) 거의 동일한 중쇄 및 κ 인간 생식선 가변 영역이 확인되었다. 마우스와 인간 사이에서 상이한 잔기는 그 변화가 결합 또는 면역원성에 영향을 미칠 수 있는 위험도에 따라 인간 서열로 전환시켰다. 낮은 위험도의 잔기 (즉, 변화되었을 때 항원 결합에 영향을 미치지 않을 수 있으며, 또한 잠재적인 면역원성을 감소시키는 잔기)를 중쇄 가변 영역 (LR2B8HC 생성) 및 κ가변 영역 (LR2B8LC 생성)에서 인간 아미노산으로 변화시켰다. 또한, 작은 위험도 및 중간 위험도의 (즉, 변화되었을 때 항원 결합에 어느 정도 영향을 미칠 수 있으며, 또한 잠재적인 면역원성을 감소시키는 잔기)를 중쇄 가변 영역 (LRMR2B8HC 생성) 및 κ가변 영역 (LRMR2B8LC 생성)에서 인간 아미노산으로 변화시켰다. 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 (G1m(3) 알로타입 (대립유전자 1))을 2개의 조작된 인간 중쇄 가변 영역의 카르복실 말단에 첨가하고, 인간 κ 불변 영역 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 1))을 2개의 조작된 인간 경쇄 가변 영역의 카르복실 말단에 첨가하여, 4개의 조작된 인간 항체 쇄를 생성하였다. 가변 영역 핵산 서열을 우선 유전자 합성 방법에 의해 합성한 후에 인간 불변 영역 서열에 첨가하였다. 이들 조작된 인간 항체를 포유동물 단백질 발현 벡터에 클로닝하고, 단백질을 4가지 가능한 중쇄 및 경쇄의 조합으로 발현시켰다. 키메라, 키메라/인간화, 또는 인간화 항체의 인간 HGF에 대한 결합을 아래 기재된 통상적인 기술을 이용하여 측정하였다.

(1) 인간화 LR2B8HC 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 182)

(2) 인간화 LR2B8HC 중쇄 가변 영역을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 183)

(3) 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 ( G1m (3) 알로타입 ) (대립유전자 1)을 코딩하는 핵산 서열 (서열 184)

(4) 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 ( G1m (3) 알로타입 ) (대립유전자 1 또는 2)을 정하는 단백질 서열 (서열 185). 첫번째 아미노산은 가변 영역의 마지막 뉴클레오티드 및 IgG1 중쇄 서열의 처음 2개의 뉴클레오티드의 번역으로부터 유래된다.

(5) 전장 중쇄 인간화 LR2B8HC 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 ( G1m (3) 알로타입 ) (대립유전자 1)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 186)

(6) 전장 중쇄 인간화 LR2B8HC 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 ( G1m (3) 알로타입 ) (대립유전자 1)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 187)

(7) 인간화 LRMR2B8HC 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 188)

(8) 인간화 LRMR2B8HC 중쇄 가변 영역을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 189)

(9) 전장 중쇄 인간화 LRMR2B8HC 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 ( G1m (3) 알로타입 ) (대립유전자 1)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 190)

(10) 전장 중쇄 인간화 LRMR2B8HC 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 ( G1m (3) 알로타입 ) (대립유전자 1)을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 191)

(11) 인간화 LR2B8LC 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 192)

(12) 인간화 LR2B8LC 경쇄 가변 영역을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 193)

(13) 인간 κ 쇄 불변 영역 ( Km (3) 알로타입 ) (대립유전자 1)을 코딩하는 핵산 서열 (서열 194)

(14) 인간 κ 쇄 불변 영역 ( Km (3) 알로타입 ) (대립유전자 1)을 정하는 단백질 서열 (서열 195). 첫번째 아미노산은 가변 영역의 마지막 뉴클레오티드 및 κ 경쇄 서열의 처음 2개의 뉴클레오티드의 번역으로부터 유래된다.

(15) 전장 인간화 LR2B8LC 경쇄 가변 영역 및 인간 κ 쇄 불변 영역 ( Km (3) 알로타입) (대립유전자 1)을 코딩하는 핵산 서열 (서열 196)

(16) 전장 인간화 LR2B8LC 경쇄 가변 영역 및 인간 κ 쇄 불변 영역 ( Km (3) 알로타입) (대립유전자 1)을 코딩하는 단백질 서열 (서열 197)

(17) 인간화 LRMR2B8LC 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 198)

(18) 인간화 LRMR2B8LC 경쇄 가변 영역을 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 199)

(19) 전장 인간화 LRMR2B8LC 경쇄 가변 영역 및 인간 κ 쇄 불변 영역 (Km(3) 알로타입 ) (대립유전자 1)을 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 200)

(20) 전장 인간화 LRMR2B8LC 경쇄 가변 영역 및 인간 κ 쇄 불변 영역 (Km(3) 알로타입 ) (대립유전자 1)을 정하는 단백질 서열 (서열 201)

편의상, 표 14는 본 섹션에 논의된 항체의 전장 서열과 서열 목록에 제시된 것 사이의 대응을 보여주는 색인 차트를 제공한다.

표 15는 본 실시예에서 상기 본원에 기재된 인간화 절차 1 및 인간화 절차 2에 의해 제조된 인간화 2B8 항체의 중쇄 CDR 서열 (카바트(Kabat) 정의)을 요약하고 있다.

표 16은 본 실시예에서 상기 본원에 기재된 인간화 절차 1 및 인간화 절차 2에 의해 제조된 인간화 2B8 항체의 경쇄 CDR 서열 (카바트 정의)을 요약하고 있다.

C. 인간화 2B8 항체의 결합 친화도

항원-결합 친화도 및 상호작용의 동역학을 비아코어 T100 기기를 사용하는 표면 플라스몬 공명 기술로 평가하였다. 제조자의 제안에 따라 표준 커플링 프로토콜을 사용하는 아민 커플링 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-50)에 의해 마우스 항-인간 이뮤노글로불린 (잭슨 이뮤노리서치 랩스(Jackson ImmunoResearch Labs), 209-005-098)을 카르복시메틸화된 덱스트란 CM4 센서칩 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1005-34) 상에 고정시켰다. 0.05％ 계면활성제 P20 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-54), 2 mg/mL BSA (EMD, 카달로그 번호 2930) 및 10 mg/mL CM-덱스트란 나트륨 염 (플루카, 카달로그 번호 86524)을 함유하는 PBS (깁코, 카달로그 번호 14040-133)를 러닝 완충액 사용하여 25℃에서 분석을 수행하였다.

항체를 10 ㎕/분의 유속으로 유동하는 개별 세포에 포획시켰다. 주사 시간은 각각의 항체에 대해 각각의 주기 동안 대략 20 RU의 항체가 포획되도록 변화시킬 수 있다. 러닝 완충액으로 희석시킨 완충액 또는 HGF (R＆D 시스템즈, 카달로그 번호 294-HGN-025)를 참조 표면 (항체가 포획되지 않음) 및 활성 표면 (시험될 항체) 상에 60 ㎕/분으로 2분 동안 순차적으로 주사하였다. 해리 단계는 농도에 따라 15분 또는 90분 동안 모니터링하였다. 이어서, 다른 주기가 시작되기 전에 10 mM 글리신-HCl (pH 2.0) (비아코어, 카달로그 번호 BR-1003-55)을 60 ㎕/분의 유속으로 3분 동안 주사하여 표면을 재생시켰다. 시험된 HGF 농도는 1.88, 3.75 및 7.5 nM였다. 동역학 파라미터는 참조값을 감하고 BIA평가 소프트웨어의 동역학 함수를 사용하여 결정하였다. 각각의 항체에 대한 동역학 파라미터, k_a (결합 속도 상수), k_d (해리 속도 상수) 및 K_D (평형 해리 상수)를 도 8에 요약하였다.

도 8에 요약된 결과는 초인간화 중쇄 (Hu2B8 Hv5a.1, Hu2B8 Hv5-51.1 또는 Hu2B8 Hv1-f.1) 및 경쇄 (Hu2B8 Kv1-39.1 또는 Hu2B8 Kv3-15.1)의 특정 조합이 HGF에 대해 키메라 2B8 (마우스 가변 영역 + 인간 불변 영역) 및 2B8 (표 5)과 유사한 결합 친화도 (K_D)를 유지하고 있다는 것을 보여준다.

D. 상호 배타적 결합 검정

HGF에 대한 상호 배타적 결합을 비아코어 T100 기기를 사용하는 표면 플라스몬 공명 기술로 평가하였다. 제조자의 제안에 따라 표준 커플링 프로토콜을 사용하는 아민 커플링 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-50)에 의해 마우스 항-인간 이뮤노글로불린 (잭슨 이뮤노리서치 랩스, 209-005-098)을 카르복시메틸화된 덱스트란 CM5 센서칩 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1006-68) 상에 고정시켰다. 0.05％ 계면활성제 P20 (비아코어, #BR-1000-54), 2 mg/mL BSA (EMD, 카달로그 번호 2930) 및 10 mg/ml CM-덱스트란 나트륨 염 (플루카, 카달로그 번호 86524)을 함유하는 PBS (깁코, 카달로그 번호 14040-133)를 러닝 완충액으로 사용하여 25℃에서 분석을 수행하였다.

인간화 항체를 30 ㎕/분의 유속으로 유동하는 개별 세포에 포획시켰다. 주사 시간은 각각의 항체에 대해 각각의 주기에서 대략 150 RU의 항체가 포획되도록 변화시킬 수 있다. 러닝 완충액에서 7.5 ㎍/mL의 최종 농도로 희석시킨 HGF (R＆D 시스템즈, 카달로그 번호 294-HGN-025)를 포획된 인간화 항체 상에 30 ㎕/분으로 90초 동안 주사하였다. HGF의 결합을 모니터링한 후에, 마우스 2B8 항체 또는 폴리클로날 염소 항-HGF 항체 (R ＆ D 시스템즈, AF294)를 30 ㎕/분으로 3분 동안 주사하였다. 이어서, 다른 항체를 시험하기 전에 10 mM 글리신-HCl (pH 2.0) (비아코어, 카달로그 번호 BR-1003-55)을 60 ㎕/분의 유속으로 3분 동안 주사하여 표면을 재생시켰다. 그 결과를 도 9에 요약하였다.

도 9에 요약된 결과는 인간화 2B8 항체 및 키메라 2B8 항체가 모두 쥐과동물 2B8이 HGF에 결합하지 못하도록 한다는 것을 보여준다. 이들 결과는 인간화 항체가 여전히 본래 2B8 항체와 동일한 HGF 에피토프에 결합한다는 것을 입증한다.

실시예 13 - 인간화 2B8 변이체의 생성

a. HUMAN ENGINEERED (상표명) 항체

코돈- 및 발현-최적화되고, 낮은 위험도 및 낮은 위험도+중간 위험도로 조작된 인간 경쇄 (각각 LR2B8LC 및 LRMR2B8LC) 및 중쇄 (각각 LR2B8HC 및 LRMR2B8HC)를 XOMA의 일시적 항체 발현 벡터에 단계적으로 클로닝하였으며, 이는 인간 κ 및 γ-1 불변 영역 모듈을 함유한다. HEK293E 세포에 일시적으로 형질감염시켜 4개의 조작된 인간 2B8 변이체를 생성하였다. 다음과 같은 4개의 항체가 생성되었다.

HE2B8-1 = LR2B8HC (+ IgG1 불변 영역 (G1m(3) 알로타입 (대립유전자 1)) (서열 187) + LR2B8LC (+ κ 불변 영역 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 1))) (서열 197)

HE2B8-2 = LR2B8HC (+ IgG1 불변 영역 (G1m(3) 알로타입 (대립유전자 1)) (서열 187) + LRMR2B8LC (+ κ 불변 영역 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 1))) (서열 201)

HE2B8-3 = LRMR2B8HC (+ IgG1 불변 영역 (G1m(3) 알로타입 (대립유전자 1)) (서열 191) + LR2B8LC (+ κ 불변 영역 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 1))) (서열 197)

HE2B8-4 = LRMR2B8HC (+ IgG1 불변 영역 (G1m(3) 알로타입 (대립유전자 1)) (서열 191) + LRMR2B8LC (+ κ 불변 영역 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 1))) (서열 201)

경쇄 및 중쇄를 2 L 진탕 플라스크를 사용하여 IS293 배지 (어바인 사이언티픽(Irvine Scientific), 미국 캘리포니아주 어바인 소재)에서 성장시킨 XOMA의 현탁액 개조된 HEK293E 세포에 함께 형질감염시켰다. 진탕 플라스크에서 24시간 후에, 형질감염된 세포 200 mL를 원심분리하고, 다시 신선한 배지 40 mL에 현탁시키고, 생산용 인테그라(Integra) 플라스크 (윌슨 울프 메뉴팩투어링 인크(Wilson Wolf Manufacturing Inc.), 미국 미네소타주 소재)로 옮겼다. 7일 동안 인큐베이션한 후에, 세포 현탁액을 인테그라 플라스크로부터 분리하고, 원심분리하고, 배양물 상층액을 남겨두었다. 배양물 상층액의 항체를 단백질 A 스핀 컬럼 (프로-켐; Pro-Chem) 상에서 정제하고, PBS에 대해 투석하고, 농축하고, 멸균 여과하였다.

b. SUPERHUMANIZED (상표명) 항체

전장 Hu2B8_Hv5-51.1 + 인간 IgG1 불변 도메인 (G1m(3) 알로타입) cDNA를 HindIII 및 EcoRI 제한효소 부위를 사용하여 pEE6.4 (론자 바이올로직스(Lonza Biologics), 영국 버크셔 소재)에 클로닝하였다. 전장 Hu2B8_Kv1-39.1 가변 영역 + 인간 κ 불변 도메인 cDNA 및 전장 Hu2B8_Kv3-15.1 가변 영역 + 인간 κ 불변 도메인 cDNA를 각각 HindIII 및 EcoRI 제한효소 부위를 사용하여 pEE14.4 (론자 바이올로직스)에 클로닝하였다. hCMV-MIE 프로모터 + 전장 Hu2B8_Hv5-51.1 + 인간 IgG1 불변 도메인 (G1m(3) 알로타입) cDNA + SV40 폴리 A 단편 (pEE6.4)을 NotI/SalI 분해에 의해 분리하고, NotI/SalI 부위를 통해 κ 쇄 pEE14.4 벡터에 삽입하여, 각각 중쇄 및 경쇄를 동시에 발현시키는 2개의 상이한 발현 벡터를 생성함으로써 다음과 같은 항체를 만들었다.

sh2B8-9 (G1m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ IgG1 불변 영역 (G1m(3) 알로타입) (대립유전자 2)) (서열 210) + hu2B8 Kv 1-39.1 (+ κ 불변 영역 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 2))) (서열 177)

sh2B8-12 (G1m(3)) = hu2B8 Hv5-51.1 (+ IgG1 불변 영역 (G1m(3) 알로타입) (대립유전자 2)) (서열 210) + hu2B8 Kv 3-15.1 (+ κ 불변 영역 (Km(3) 알로타입 (대립유전자 2))) (서열 181)

인간 IgG1 중쇄 불변 영역 G1m(3) 알로타입 (대립유전자 2) 및 각각의 전장 중쇄 서열을 코딩하는 핵산 서열 및 이들을 정하는 단백질 서열을 아래 열거하였다. 경쇄 서열은 실시예 12에 기재된 바와 동일하였다.

(1) 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 ( G1m (3) 알로타입 ) (대립유전자 2)을 코딩하는 핵산 서열 (서열 207)

(2) 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 ( G1m (3) 알로타입 ) (대립유전자 1 또는 2)을 정하는 단백질 서열 (서열 208). 첫번째 아미노산은 가변 영역의 마지막 뉴클레오티드 및 IgG1 중쇄 서열의 처음 2개의 뉴클레오티드의 번역으로부터 유래된다.

(3) 인간화 Hu2B8 Hv5 -51.1 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 G1m(3) 알로타입 (대립유전자 2)을 함유하는 전장 쇄를 코딩하는 핵산 서열 (신호 서열 - 밑줄) (서열 209)

(4) 인간화 Hu2B8 Hv5 -51.1 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 G1m (3) 알로타입 (대립유전자 2)을 함유하는 전장 중쇄를 정하는 단백질 서열 (신호 서열 없음) (서열 210)

각 이중 발현 벡터를 DMEM 10％ 태아 소 혈청을 사용하여 일시적 발현에 사용되는 293T 세포에 형질감염시켰다. 형질감염시키고 48시간 후에, 세포를 4 mM L-글루타민을 함유하는 무혈청 배지 IS GRO(상표명) (어바인 사이언티픽, 미국 캘리포니아주 산타 아나 소재)으로 세척한 후에 이로 다시 교체하였다. 상층액을 10일 동안 매일 회수하고 신선한 배지로 교체하였다. 배양물 상층액을 원심분리하고, 여과하고 (0.45 ㎛), 10 내지 1000배 농축하였다. 항체를 ProSep vA 수지 (밀리포어; Millipore) 상에서 정제하고, PBS에 대해 투석하고, 농축하고, 멸균 여과하였다.

실시예 14 - 인간화 2B8 변이체의 결합 특성

실시예 13에서 생성된 인간화 항체를 이들이 hHGF 및 실시예 3에서 생성된 재조합 HGF 단백질에 결합하는 능력으로 특성화하였다.

비아코어 T100 기기를 이용하는 표면-플라스몬 공명에 의해 항체를 분석하여 이들이 hHGF 및 실시예 3에 논의된 융합 단백질에 결합하는 능력을 평가하였다. 제조자의 지시에 따라 표준 커플링 프로토콜을 사용하는 아민 커플링 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-50)에 의해 각각의 항체를 카르복시메틸화된 덱스트란 CM5 센서칩 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1006-68) 상에 고정시켰다.

0.05％ 계면활성제 P20 (비아코어, 카달로그 번호 R-1000-54), 2 mg/mL BSA (EMD, 카달로그 번호 2930) 및 10 mg/mL CM-덱스트란 나트륨 염 (플루카, 카달로그 번호 86524)을 함유하는 PBS (깁코, 카달로그 번호 14040-133)를 러닝 완충액으로 사용하여 25℃에서 분석을 수행하였다. 상이한 HGF 융합 단백질을 함유하는 상층액 또는 공벡터로 형질감염된 세포로부터의 상층액을 각각의 항체 상에 30 ㎕/분의 유속으로 3분 동안 주사하였다. 주사가 종결되고 30초 후에 생성된 결합을 기저선 상의 공명 유닛 (RU)으로 결정하였다. 결합을 러닝 완충액에 희석시킨 인간 HGF (R＆D 시스템즈, 카달로그 번호 294-HGN-025)와 비교하였다. 비-특이적 결합은 대조군 표면에 대한 결합과 비교하여 모니터링하였다. 그 결과를 표 17에 요약하였다.

표 17의 결과는 각각의 인간화 2B8-기재의 항체가 rhHGF 및 3개의 모든 마우스-인간-마우스 키메라에 결합한다는 것을 입증한다.

실시예 15 - 인간화 2B8 변이체의 결합 친화도

표 15에 열겨된 항체의 상호작용의 동역학 및 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명으로 측정하였다.

제조자의 지시에 따라 표준 커플링 프로토콜을 사용하는 아민 커플링 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-50)에 의해 마우스 항-인간 이뮤노글로불린 (잭슨 랩스, 카달로그 번호 209-005)을 카르복시메틸화된 덱스트란 CM4 센서칩 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1006-68) 상에 고정시켰다. 0.05％ 계면활성제 P20 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-54) 및 2 mg/mL BSA (EMD, 카달로그 번호 2930)를 함유하는 PBS (깁코, 카달로그 번호 14040-133)를 사용하여 25℃에서 분석을 수행하였다.

항체를 10 ㎕/분의 유속으로 유동하는 개별 세포에 포획시켰다. 주사 시간은 각각의 항체에 대해 각각의 주기 동안 대략 20 RU의 항체가 포획되도록 변화시킨다. 러닝 완충액으로 희석시킨 완충액 또는 HGF (R＆D 시스템즈, 카달로그 번호 294-HGN-025)를 참조 표면 (항체가 포획되지 않음) 및 활성 표면 (시험될 항체) 상에 60 ㎕/분으로 2분 동안 순차적으로 주사하였다. 해리 단계는 농도에 따라 15분 또는 90분 동안 모니터링하였다. 이어서, 다른 주기가 시작되기 전에 10 mM 글리신-HCl (pH 2.2) (비아코어, 카달로그 번호 BR-1003-54)을 60 ㎕L/분의 유속으로 3분 동안 주사하여 표면을 재생시켰다. 시험된 HGF 농도는 0.46 nM 내지 7.5 nM였다.

동역학 파라미터는 참조값을 감하고 BIA평가(상표명) 소프트웨어의 동역학 함수를 사용하여 결정하였다. 각 항체에 대한 동역학 파라미터, k_a (결합 속도 상수), k_d (해리 속도 상수) 및 K_D (평형 해리 상수)를 표 18에 요약하였다.

이들 데이타는 인간화 항체가 빠른 결합 속도 (k_a), 매우 느린 해리 속도 (k_d) 및 매우 높은 친화도 (K_D)를 갖는다는 것을 보여준다. 특히, 항체는 2.0 내지 12 pM 범위의 친화도를 갖는다.

실시예 16 - 25℃ 및 37℃에서의 결합 친화도 비교

항체 HE2B8-4, sh2B8-9, sh2B8-12 및 쥐과동물 2B8의 상호작용의 동역학 및 결합 친화도를 상이한 조건하에 표면 플라스몬 공명에 의해 측정하였다.

제조자의 지시에 따라 표준 커플링 프로토콜을 사용하는 아민 커플링 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-50)에 의해 마우스 항-인간 이뮤노글로불린 (잭슨 랩스, 카달로그 번호 209-005) 또는 토끼 항-마우스 이뮤노글로불린 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1005-14)을 카르복시메틸화된 덱스트란 CM4 센서칩 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1006-68)에 고정시켰다. sh2b8-9 및 sh2B8-12에 대해 25℃에서 측정하는 경우에는 CM5 센서칩 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1006-68)이 사용되었다. 0.05％ 계면활성제 P20 (비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-54) 및 2 mg/mL BSA (EMD, 카달로그 번호 2930)를 함유하는 PBS (깁코, 카달로그 번호 14040-133)를 러닝 완충액으로 사용하여 25℃ 및 37℃에서 분석을 수행하였다.

항체를 10 ㎕/분의 유속으로 유동하는 개별 세포에 포획시켰다. 주사 시간은 각각의 항체에 대해 각각의 주기 동안 대략 20 RU의 항체가 포획되도록 변화시킬 수 있다. 러닝 완충액으로 희석시킨 완충액 또는 HGF (R＆D 시스템즈, 카달로그 번호 294-HGN-025)를 참조 표면 (항체가 포획되지 않음) 및 활성 표면 (시험될 항체) 상에 60 ㎕/분으로 2분 동안 순차적으로 주사하였다. 해리 단계는 농도에 따라 15분 또는 90분 동안 모니터링하였다. 이어서, 마우스 항-인간 이뮤노글로불린 센서칩의 표면은 다른 주기가 시작되기 전에 10 mM 글리신-HCl (pH 2.2) (비아코어(비아코어), 카달로그 번호 BR-1003-54)을 60 ㎕/분의 유속으로 3분 동안 주사하여 재생시켰다. 토끼 항-마우스 이뮤노글로불린 센서칩의 표면은 다른 주기가 시작되기 전에 10 mM 글리신-HCl (pH 1.7) (비아코어, 카달로그 번호 BR-1003-54)을 60 ㎕/분의 유속으로 3분 동안 주사하여 재생시켰다. 시험된 HGF 농도는 0.46 nM 내지 7.5 nM였다.

동역학 파라미터는 참조값을 감하고 BIA평가 소프트웨어의 동역학 함수를 사용하여 결정하였다. 각각의 항체에 대한 동역학 파라미터, k_a (결합 속도 상수), k_d (해리 속도 상수) 및 K_D (평형 해리 상수)를 아래 표 19에 요약하였다.

예상한 바와 같이, 결합 속도 상수는 온도가 증가함에 따라 증가하였다. 놀랍게도, 해리 상수는 상응하는 온도 증가에 따라 유의하게 변화하지 않았다. 결과적으로, 전체 평형 해리 상수 (K_D)는 생리학적 온도 (37 ℃)에서 대략 1.4 내지 3배 더 작았다 (친화도는 더 높음).

실시예 17 - 인간화 2B8 변이체의 무력화 활성

실시예 14에 기재된 항체를 이들이 (a) c-Met에 대한 hHGF의 결합을 억제하는 능력, 및 (b) 4MBr-5 세포에서 HGF 자극된 BrdU 혼입을 억제하는 능력에 대해 특성화하였다.

HGF-Met 결합 억제 검정 (무력화 검정)은 다음에 기재되는 바와 같이 수행하였다. 항체를 이들이 c-Met에 대한 hHGF의 결합을 억제하는 능력에 대해 ELISA로 시험하였다. 특히, 발락 96-웰 DELFIA 검정 플레이트 (발락 인크., 카달로그 번호 AAAND-0001)를 카르보네이트 코팅 완충액 (15 mM Na₂CO₃ 및 34 mM NaHCO₃, pH 9.0) 중 6.25 ㎍/mL HGF (R＆D 시스템즈, 카달로그 번호 294-HGN-025) 100 ㎕로 4 ℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBS 중 5％ 무지방 분유 200 ㎕로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 조사 대상 항체를 PBS 중 5％ 무지방 분유 중에서 2nM 비오티닐화된 c-Met에 그의 농도를 증가시키면서 첨가 (0.033 내지 250 nM, 2-배-연속 희석)하여, 항체를 별도의 플레이트에서 준비하였다. c-Met (R＆D 시스템즈, 카달로그 번호 358-MT/CF)를 제조자의 지시에 따라 10:1의 비오틴 대 c-Met (피어스(Pierce), 카달로그 번호 21335) 비로 비오티닐화시켰다. 각 웰의 샘플 100 ㎕를 검정 플레이트로 옮기고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 생성된 플레이트를 PBS-0.1％ Tween 20으로 3회 세척하고, DELFIA 검정 완충액 (발락, 카달로그 번호 4002-0010)으로 1:1000 희석시킨 Eu-표지된 스트렙타비딘 (발락, 카달로그 번호 1244-360)과 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 생성된 플레이트를 DELFIA 세척 용액 (발락, 카달로그 번호 4010-0010)으로 3회 세척하고, 100 ㎕/웰 DELFIA 증강 용액 (발락 #4001-0010)과 실온에서 15분 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 플레이트를 유로퓸 방법을 이용하여 Victor³V 기기 (퍼킨 엘머) 상에서 판독하였다. IC₅₀ 값을 프리즘을 사용하여 계산하였다.

수득한 IC₅₀ 값을 표 20에 나타내었다.

상기 표 20의 결과는 시험된 인간화 항체가 c-Met에 대한 HGF의 결합을 효율적으로 무력화시킴을 입증한다.

표 17의 항체를 또한 실시예 7(b)에 기재된 세포 증식 검정으로 시험하였다. 그 결과를 아래 표 21에 요약하였다.

표 21의 결과는 시험된 인간화 항체가 모두 4MBr-5 세포의 HGF-유도된 증식을 억제한다는 것을 입증한다.

실시예 18 - 인간화 2B8 변이체의 항-산란 활성

표 17의 항체를 실시예 8에 기재된 항-산란 검정으로 시험하였다. 그 결과를 아래 표 22에 요약하였다.

표 22의 결과는 시험된 인간화 항체가 모두 쥐과동물 모노클로날 항체 2B8과 동등한 정도로 HGF-유도된 산란을 억제한다는 것을 입증한다.

실시예 19 - HGF -자극성 c- Met 인산화의 억제

표 17의 항체를 실시예 9에 기재된 c-Met 인산화 검정으로 시험하였다. 그 결과를 아래 표 23에 요약하였다.

표 23의 결과는 시험된 인간화 항체가 모두 PC-3 세포에서 HGF-유도된 c-Met 인산화의 강력한 억제제임을 입증한다.

실시예 20 - U87MG 이종이식 모델에서의 종양 억제

본 발명의 인간화 모노클로날 항체가 종양 성장을 억제하는 능력을 U87MG 이종이식 모델에서 시험하였다. U87MG 세포 (ATCC)는 10％ 태아 소 혈청, 100 유닛/mL의 페니실린 및 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신이 포함된 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)를 포함하는 배지를 사용하여, 5％ CO₂ 및 95％ 공기를 함유하는 분위기하에 37℃에서 배양하여 증식시켰다. 세포를 계대배양하고, 트립신-EDTA를 사용하여 배양 접시의 벽에서 세포를 분리시켜 유지하였다.

전면 성장에 근접한 세포를 트립신처리하여 수집한 후에, 50％ 마트리겔 (BD 바이오사이언스; 카달로그 번호 356237) 중 5×10⁶개의 세포를 7주령 암컷 ICR SCID 마우스 (타코닉 랩스)의 견갑골 사이의 상부 등쪽 부위에 피하 주사하였다. 종양의 길고 (L) 짧은 (W) 직경 (mm)을 캘리퍼로 측정하였다. 종양 부피 (vol.)를 다음과 같이 계산하였다: 부피 (mm³) = L×W²/2. 종양이 대략 200 mm³로 성장하였을 때, 종양-보유 마우스를 각각 10마리씩 5개의 군으로 무작위적으로 분류하였다. 하나의 군은 PBS로 처치하고, 하나의 군은 인간 IgG 대조군으로 처치하였다. 다른 4개의 군은 각각 인간화 항체 (HE2B8-1, HE2B8-2, HE2B8-3 및 HE2B8-4) 중 하나로 처치하였다. 모든 항체는 복막내 주사 (5 투여)에 의해 일주일에 2회 0.25 mg/kg(체중)으로 투여하였다. 종양 부피 및 마우스 체중을 일주일에 2회 기록하였다. 종양 성장 억제를 스튜던트 t-검정을 이용하여 분석하였다.

시험된 인간화 항체는 생체내에서 활성이었다. HE2B8-1의 경우에는 종양 성장이 57％ 억제되고 (p 값: 0.02), HE2B8-2의 경우에는 종양 성장이 61％ 억제되고 (p 값: 0.02), HE2B8-3의 경우에는 종양 성장이 85％ 억제되고 (p 값: 0.0004), HE2B8-4의 경우에는 종양 성장이 74％ 억제되었다 (p 값: 0.001). 유의한 체중 감소는 관찰되지 않았다.

이후의 연구는 옆구리에 접종된 피하 U87MG 종양을 보유하는 암컷 NCR 누드 마우스 (타코닉 랩스)에서 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 각각의 군 (각각 마우스 10 마리)을 0.5 mg/kg으로 PBS 비히클 대조군, huIgG 대조군, HE2B8-4 또는 sh2B8-9 중 하나로 처치하였다. 처치는 최소 5주 동안 매주 2회 복막내 투여하여 수행하였다. 각각의 처치군에서 sh2B8-9의 경우에는 종양 성장이 113％ 억제되고, HE2B8-4의 경우에는 종양 성장이 115％ 억제되는 유사한 종양 퇴화가 나타났으며, 최소 30일 종양 성장이 지연되는 것으로 나타났다. 처치는 모두 유의한 체중 감소 없이 허용성이 높았다.

참조문헌 도입

본원에 언급된 특허 문헌 및 과학 논문의 전체 개시문은 각각 그 거명을 통해 모든 목적에 있어 본원에 참조로 포함되는 것으로 간주한다.

등가물

본 발명은 그의 취지 또는 본질적인 특성에서 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 실시될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태는 모든 측면에서 본원에 기재된 본 발명을 한정하기 보다는 설명하기 위한 것으로 여겨진다. 이에 따라, 본 발명의 범위는 상기 발명의 상세한 설명 보다는 첨부된 특허청구범위로 나타내며, 특허청구범위와 동등한 의미 및 범위 내의 모든 변화가 그에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Winston, William M. Wright, Kirk S. Han, May Breault, Lyne Lin, Jie Etemad-Gilbertson, Bijan Knuehl, Christine Gyuris, Jeno <120> Hepatocyte Growth Factor (HGF) Binding Proteins <130> AVO-001B <150> 60/810,714 <151> 2006-06-02 <150> 60/860,509 <151> 2006-11-21 <160> 216 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 424 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Heavy Chain Variable Region 1A3 <400> 1 atgaactttg ggctcagatt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt gaagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctgaattcac tttcagtaac tattacatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaagaggc tgcagtgggt cgcatacatt agtcctggtg gtggtagctc ctactatcca 240 gccagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag acaaggggat 360 ggttactacg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 tcag 424 <210> 2 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Heavy Chain Variable Region 1A3 <400> 2 Met Asn 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gtccatcact 120 tgcactgtct ctgggttttc attaaccagc tatagtttac actgggttcg ccagcctcca 180 ggaaagggtc tggaatggct gggagtaata tgggctggtg gaaacacaaa ttataattcg 240 tctctcatgt ccagactgac catcaggaaa gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 300 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atgtactact gtgccagaga gaggtttgct 360 tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcag 397 <210> 42 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Heavy Chain Variable Region 3D11 <400> 42 Met Ala Val Pro Val Leu Phe Leu Cys Leu Val Ala Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Ser Tyr Ser Leu His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Ser Leu Met Ser Arg Leu Thr Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Glu Arg 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Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser 50 55 60 Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Heavy Chain CDR1 3D11 <400> 45 Ser Tyr Ser Leu His 1 5 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Heavy Chain CDR2 3D11 <400> 46 Val Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ser Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Heavy Chain CDR3 3D11 <400> 47 Glu Arg Phe Ala Tyr 1 5 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR1 3D11 <400> 48 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT 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180 ggaaaatctc ctcagctcct aatctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttccctca ggatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggaggtatta ctgtcaacat ttttggggga ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaaac tggaaataaa ac 382 <210> 54 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Light (kappa) Chain Variable Region 1D3 <400> 54 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Val Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Arg Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Arg Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> 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cctgtacctg 300 caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgtaag acaaggagat 360 ggttactatg gggactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 tcag 424 <210> 72 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Heavy Chain Variable Region 3A12 <400> 72 Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Lys Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Phe Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Arg Gln Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 73 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Light (kappa) Chain Variable Region 3A12 <400> 73 atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60 gacatccaga tgactcagtc gccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 120 atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac attaatttag catggtatca gcagaaacag 180 ggaaaatctc ctcagctcct ggtccatgct gcaacaaagt tagcagatgg tgtgccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 300 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaaac tagaaataaa ac 382 <210> 74 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Light (kappa) Chain Variable Region 3A12 <400> 74 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Ile Tyr Ile Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Val His Ala Ala Thr Lys Leu Ala Asp Gly Val Pro 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Ala Ala Thr Lys Leu Ala Asp 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Light (kappa) Chain CDR3 3A12 <400> 80 Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 81 <211> 974 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reference Mouse IgG1 Heavy Chain Constant Region (J00453) <400> 81 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 60 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct 120 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg gagtctgacc 180 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagccc tcggcccagc gagaccgtca 240 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 300 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc 360 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 420 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 480 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 540 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 600 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 660 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 720 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 780 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catgaacacg aatggctctt 840 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 900 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 960 ctcctggtaa atga 974 <210> 82 <211> 974 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse IgG1 Heavy Chain Constant Region Determined for 1A3, 1D3, 1F3, and 2B8 (derived from AJ strain mice) <400> 82 ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact 60 ccatggtgac cctgggatgc ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct 120 ggaactctgg atccctgtcc agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg cagtctgacc 180 tctacactct gagcagctca gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc gagaccgtca 240 cctgcaacgt tgcccacccg gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg 300 attgtggttg taagccttgc atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc 360 ccccaaagcc caaggatgtg ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg 420 tagacatcag caaggatgat cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg 480 tgcacacagc tcagacgcaa ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca 540 gtgaacttcc catcatgcac caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca 600 acagtgcagc tttccctgcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga 660 aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca 720 gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga 780 atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca gatggctctt 840 acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca 900 cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact 960 ctcctggtaa atga 974 <210> 83 <211> 323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reference Mouse Kappa Light Chain Constant Region (V00807) and Mouse Kappa Light Chain Constant Region Determined for 1D3, 1F3, and 2B8 (derived from AJ strain mice) <400> 83 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 60 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 120 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 180 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac 240 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 300 gcttcaacag gaatgagtgt tag 323 <210> 84 <211> 323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Mouse Kappa Light Chain Constant Region Determined for 1A3 containing one altered nucleotide as position 207 compared to 1D3, 1F3, and 2B8 <400> 84 gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg 60 gaggtgcctc agtcgtgtgc ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt 120 ggaagattga tggcagtgaa cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca 180 gcaaagacag cacctacagc atgagcagca ccctcatgtt gaccaaggac gagtatgaac 240 gacataacag ctatacctgt gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga 300 gcttcaacag gaatgagtgt tag 323 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer BD SMART II A <400> 85 aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30 <210> 86 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer RACE CDS <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, t or u <400> 86 tttttttttt tttttttttt tttttvn 27 <210> 87 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer of Universal Primer Mix A <400> 87 ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45 <210> 88 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer of Universal Primer Mix A <400> 88 ctaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IgG1 Constant Region specific primer <400> 89 tatgcaaggc ttacaaccac a 21 <210> 90 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IgG1 Constant Region specific primer <400> 90 gccagtggat agacagatgg gggtgtcg 28 <210> 91 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 91 ctcattcctg ttgaagctct tgacaat 27 <210> 92 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer <400> 92 cgactgaggc acctccagat gtt 23 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer T7 <400> 93 taatacgact cactataggg 20 <210> 94 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer M13 Forward <400> 94 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 95 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer M13 Reverse <400> 95 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 96 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide forward primer <400> 96 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg ccaccatgaa ctttgggctc agattgattt 60 tcc 63 <210> 97 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide reverse primer <400> 97 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt catttaccag gagagtggga gagg 54 <210> 98 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide forward primer <400> 98 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg ccaccatggg atggagctat atcatcctct 60 tt 62 <210> 99 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide reverse primer <400> 99 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt catttaccag gagagtggga gag 53 <210> 100 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide forward primer <400> 100 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg ccaccatgga atcacagact ctggtcttca 60 ta 62 <210> 101 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide reverse primer <400> 101 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc taacactcat tcctgttgaa gctc 54 <210> 102 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide 5 prime hHGF NheI primer <400> 102 actggctagc atgtgggtga ccaaactcct 30 <210> 103 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide 3 prime hHGF NotI his tag primer <400> 103 gtgatggtga tggtgatggc ggccgcatga ctgtggtacc ttatat 46 <210> 104 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide 5 prime His IgFc primer <400> 104 actggcggcc gccatcacca tcaccatcac 30 <210> 105 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide 3 prime IgFc BamHI primer <400> 105 actgggatcc tcactattta cccggggaca g 31 <210> 106 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic hHGF-Fc (G555E) sense primer <400> 106 catgatgtcc acgaaagagg agatgag 27 <210> 107 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic hHGF-Fc (G555E) antisense primer <400> 107 ctcatctcct ctttcgtgga catcatg 27 <210> 108 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic hHGF-Fc (C561R) sense primer <400> 108 ggaagaggag atgagaaacg caaacaggtt ctcaatg 37 <210> 109 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic hHGF-Fc (C561R) antisense primer <400> 109 cattgagaac ctgtttgcgt ttctcatctc ctcttcc 37 <210> 110 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fragment 1 Primer for mHGF alpha chain 5 prime NheI <400> 110 atcggctagc atgatgtggg ggaccaaac 29 <210> 111 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fragment 1 Primer for mHGF alpha chain 5 prime NheI <400> 111 ggttttgttt tgttgacgcc caacatttac cctaag 36 <210> 112 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fragment 2 Primer for hHGF beta chain aa V495-L585 <400> 112 ccaaaacaaa acaactgcgg gttgtaaatg ggattc 36 <210> 113 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fragment 2 Primer for hHGF beta chain aa V495-L585 <400> 113 tctagaccaa aattacttcg aacgagctgg acgttaggac 40 <210> 114 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fragment 3 Primer for mHGF beta chain C-terminus 3 prime NotI <400> 114 agatctggtt ttaatgaagc ttgctcgacc tgcaatcctg 40 <210> 115 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fragment 3 Primer for mHGF beta chain C-terminus 3 prime NotI <400> 115 cactaccact accactaccg ccggcgtgtt gaacatacag ttttaatg 48 <210> 116 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic mutagenesis primer 1 <400> 116 catcaccatc accatcacta agcgggtctg gtgccacg 38 <210> 117 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic mutagenesis primer 2 <400> 117 cgtggcacca gacccgctta gtgatggtga tggtgatg 38 <210> 118 <211> 2922 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of synthetic hHGF-Fc protein <400> 118 atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60 ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120 gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180 accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240 ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300 ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360 aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420 tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480 agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540 cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600 tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660 ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca 720 caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780 cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840 gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900 gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt 960 tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020 cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080 gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140 ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200 ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260 gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc 1320 cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct 1380 tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta 1440 gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaattgc gagttgtaaa tgggattcca 1500 acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga 1560 ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac 1620 ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa 1680 tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt 1740 ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct 1800 aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact 1860 ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag 1920 aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg 1980 gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag 2040 caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca 2100 aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt 2160 ttaacatata aggtaccaca gtcatgcggc cgccatcacc atcaccatca ctccgcgggt 2220 ctggtgccac gcggtagtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 2280 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 2340 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 2400 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 2460 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 2520 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 2580 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 2640 cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 2700 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 2760 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 2820 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2880 cactacacgc agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ag 2922 <210> 119 <211> 919 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of synthetic hHGF-Fc protein (without signal sequence and pro domain) <400> 119 Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys 1 5 10 15 Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala 20 25 30 Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn 35 40 45 Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe Gly His Glu Phe Asp Leu 50 55 60 Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg 65 70 75 80 Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln 85 90 95 Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Phe Leu Pro Ser Ser 100 105 110 Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly 115 120 125 Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr 130 135 140 Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr Cys 145 150 155 160 Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys 165 170 175 Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu 180 185 190 Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn 195 200 205 Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr 210 215 220 Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn 225 230 235 240 Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly 245 250 255 Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys 260 265 270 Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro Glu 275 280 285 Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp 290 295 300 Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val 305 310 315 320 Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln Asp 325 330 335 Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr 340 345 350 Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu 355 360 365 His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn 370 375 380 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr 385 390 395 400 Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu 405 410 415 Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile Ser 420 425 430 Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg 435 440 445 Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile 450 455 460 Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln 465 470 475 480 Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile 485 490 495 His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn 500 505 510 Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu Met 515 520 525 Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile Asp 530 535 540 Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser Val 545 550 555 560 Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu Arg 565 570 575 Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His 580 585 590 Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala Glu 595 600 605 Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Val 610 615 620 Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro Gly 625 630 635 640 Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val Ala 645 650 655 Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val Pro 660 665 670 Gln Ser Cys Gly Arg His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val 675 680 685 Pro Arg Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 690 695 700 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 705 710 715 720 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 725 730 735 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 740 745 750 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 755 760 765 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 770 775 780 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 785 790 795 800 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 805 810 815 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 820 825 830 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 835 840 845 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 850 855 860 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 865 870 875 880 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 885 890 895 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 900 905 910 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 915 <210> 120 <211> 2901 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding synthetic mhm (V495-L585)-Fc chimeric protein <400> 120 atgatgtggg ggaccaaact tctgccggtc ctgttgctgc agcatgtcct cctgcacctc 60 ctcctgcttc atgtcgccat cccctatgca gaaggacaga agaaaagaag aaatacactt 120 catgaattta aaaagtcagc aaaaactact cttaccaagg aagacccatt actgaagatt 180 aaaaccaaaa aagtgaactc tgcagatgag tgtgccaaca ggtgtatcag gaacaggggc 240 tttacgttca cttgcaaggc cttcgttttt gataagtcaa gaaaacgatg ctactggtat 300 cctttcaata gtatgtcaag tggagtgaaa aaagggtttg gccatgaatt tgacctctat 360 gaaaacaaag actatattag aaactgcatc attggtaaag gaggcagcta taaagggacg 420 gtatccatca ctaagagtgg catcaaatgc cagccttgga attccatgat cccccatgaa 480 cacagctatc gcggtaaaga cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa 540 gggggaccct ggtgtttcac aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct 600 cagtgttcag aagttgaatg catgacctgc aatggtgaaa gctacagagg tcccatggat 660 cacacagaat caggcaagac ttgtcagcgc tgggaccagc agacaccaca ccggcacaag 720 ttcttgccag aaagatatcc cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcctgat 780 ggcaagccga ggccatggtg ctacactctt gaccctgaca ccccttggga gtattgtgca 840 attaaaacgt gcgctcacag tgctgtgaat gagactgatg tccctatgga aacaactgaa 900 tgcattcaag gccaaggaga aggttacagg ggaaccagca ataccatttg gaatggaatt 960 ccctgtcagc gttgggattc gcagtaccct cacaagcatg atatcactcc cgagaacttc 1020 aaatgcaagg accttagaga aaattattgc cgcaatccag atggggctga atcaccatgg 1080 tgttttacca ctgacccaaa catccgagtt ggctactgct ctcaaattcc caagtgtgac 1140 gtgtcaagtg gacaagattg ttatcgtggc aatgggaaaa attacatggg caacttatcc 1200 aaaacaaggt ctggacttac atgttccatg tgggacaaga atatggagga tttacaccgt 1260 catatcttct gggagccaga tgctagcaaa ttgaataaga attactgccg gaatcctgat 1320 gatgatgccc atggaccttg gtgctacacg gggaatcctc ttattccttg ggattattgc 1380 cctatttccc gttgtgaagg agatactaca cctacaattg tcaatttgga ccatcctgta 1440 atatcctgtg ccaaaacaaa acaactgcgg gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac 1500 ataggatgga tggttagttt gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata 1560 aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat 1620 gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt 1680 ctcaatgttt cccagctggt atatggccct gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt 1740 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caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404 <210> 163 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Heavy Chain Humanized Hu2B8 Hv1f.1 Variable Region and Human IgG1 Heavy Chain Constant Region (G1m(17,1) allotype) (without signal sequence) <400> 163 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met 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Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 164 <211> 412 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Humanized Hu2B8 Hv5a.1 Heavy Chain Variable Region <400> 164 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag 412 <210> 165 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized Hu2B8 Hv5a.1 Heavy Chain Variable Region (without signal sequence) <400> 165 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 166 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Full Length Humanized Hu2B8 Hv5a.1 Heavy Chain Variable Region and Human IgG1 (G1m(17,1) allotype) Heavy Chain Constant Region <400> 166 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404 <210> 167 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Humanized Hu2B8 Hv5a.1 Heavy Chain Variable Region and Human IgG1 (G1m(17,1) allotype) Heavy Chain Constant Region (without signal sequence) <400> 167 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Tyr Val 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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 168 <211> 412 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Humanized Hu2B8 Hv5-51.1 Heavy Chain Variable Region <400> 168 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgaa 60 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccacc tactggatgc actgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat gggggagatt aatcctacca acggtcatac taactacaat 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aaactatgtt 360 ggtagcatct ttgactactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc ag 412 <210> 169 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized Hu2B8 Hv5-51.1 Heavy Chain Variable Sequence (without signal sequence) <400> 169 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr 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aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404 <210> 171 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence Defining synthetic Full Length Humanized Hu2B8 Hv5-51.1 Heavy Chain Variable Region and Human IgG1 (G1m(17,1) allotype) Heavy Chain Constant Region (without signal sequence) <400> 171 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Tyr Val Gly Ser Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu 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<211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence Defining synthetic Humanized Hu2B8 Kv1-39.1 Kappa Chain Variable Region (without signal sequence) <400> 173 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 174 <211> 323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Sequence Encoding synthetic Human Kappa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 2) <400> 174 gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 60 gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 120 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Encoding synthetic Full Length Humanized Hu2B8 Kv-39.1 Light Chain Variable Region and Human Kappa Chain Constant Region (Km(3) allotype) (allele 2) <400> 176 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgcaaggc cagtgagaat gtggtttctt atgtatcctg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggggcat ccaaccggaa cactggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 300 caacctgaag attttgcaac ttactactgt gggcagagtt acaactatcc gtacacgttt 360 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgttg a 711 <210> 177 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gaaaacaaag actatattag aaactgcatc attggtaaag gaggcagcta taaagggacg 420 gtatccatca ctaagagtgg catcaaatgc cagccttgga attccatgat cccccatgaa 480 cacagctttt tgccttcgag ctatcgcggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat 540 cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa 600 gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg tgaaagctac 660 agaggtccca tggatcacac agaatcaggc aagacttgtc agcgctggga ccagcagaca 720 ccacaccggc acaagttctt gccagaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat 780 tgccgcaatc ctgatggcaa gccgaggcca tggtgctaca ctcttgaccc tgacaccact 840 tgggagtatt gtgcaattaa aacgtgcgct cacagtgctg tgaatgagac tgatgtccct 900 atggaaacaa ctgaatgcat tcaaggccaa ggagaaggtt acaggggaac cagcaatacc 960 atttggaatg gaattccctg tcagcgttgg gattcgcagt accctcacaa gcatgatatc 1020 actcccgaga acttcaaatg caaggacctt agagaaaatt attgccgcaa tccagatggg 1080 gctgaatcac catggtgttt taccactgac ccaaacatcc gagttggcta ctgctctcag 1140 attcccaagt gtgacgtgtc aagtggacaa gattgttatc gtggcaatgg gaaaaattac 1200 atgggcaact tatccaaaac aaggtctgga cttacatgtt ccatgtggga caagaatatg 1260 gaggatttac accgtcatat cttctgggag ccagatgcta gcaaattgaa taagaattac 1320 tgccggaatc ctgatgatga tgcccatgga ccttggtgct acacggggaa tcctcttatt 1380 ccttgggatt attgccctat ttcccgttgt gaaggagata ctacacctac aattgtcaat 1440 ttggaccatc ctgtaatatc ctgtgccaaa acaaaacaac tgcgggttgt aaatgggatt 1500 ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc 1560 ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga 1620 gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag 1680 aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg 1740 gttttaatga agcttgctcg acctgcaatc ctggataact ttgtcagtac aattgattta 1800 cctagttatg gttgtacaat ccctgaaaag accacttgca gtatttacgg ctggggctac 1860 actggattga tcaacgcgga tggtttatta cgagtagctc atctgtatat tatggggaat 1920 gagaaatgca gtcagcacca tcaaggcaag gtgactttga atgagtctga gttatgtgct 1980 ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggagatt atggtggccc actcatttgt 2040 gaacaacaca aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatc 2100 ccaaatcgtc ctgttatttt tgttcgagta gcatattatg caaaatggat acacaaagta 2160 attttgacat acaagttgtg cggccgccat caccatcacc atcactaag 2209 <210> 212 <211> 680 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HGF mhm495-585 active <400> 212 Pro Leu Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val Asn Ser Ala Asp Glu Cys 1 5 10 15 Ala Asn Arg Cys Ile Arg Asn Arg Gly Phe Thr Phe Thr Cys Lys Ala 20 25 30 Phe Val Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn 35 40 45 Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Gly Phe Gly His Glu Phe Asp Leu 50 55 60 Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Gly 65 70 75 80 Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln 85 90 95 Pro Trp Asn Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Phe Leu Pro Ser Ser 100 105 110 Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly 115 120 125 Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr 130 135 140 Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln 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Leu Ile Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg 565 570 575 Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His 580 585 590 Gln Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu 595 600 605 Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ile 610 615 620 Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro Gly 625 630 635 640 Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Val Ile Phe Val Arg Val Ala 645 650 655 Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Val Ile Leu Thr Tyr Lys Leu Cys 660 665 670 Gly Arg His His His His His His 675 680 <210> 213 <211> 2194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HGF mhm (I499-R556) <400> 213 atgatgtggg ggaccaaact tctgccggtc ctgttgctgc agcatgtcct cctgcacctc 60 ctcctgcttc atgtcgccat cccctatgca gaaggacaga agaaaagaag aaatacactt 120 catgaattta aaaagtcagc aaaaactact cttaccaagg aagacccatt actgaagatt 180 aaaaccaaaa aagtgaactc tgcagatgag tgtgccaaca ggtgtatcag gaacaggggc 240 tttacgttca cttgcaaggc cttcgttttt gataagtcaa gaaaacgatg ctactggtat 300 cctttcaata gtatgtcaag tggagtgaaa aaagggtttg gccatgaatt tgacctctat 360 gaaaacaaag actatattag aaactgcatc attggtaaag gaggcagcta taaagggacg 420 gtatccatca ctaagagtgg catcaaatgc cagccttgga attccatgat cccccatgaa 480 cacagctatc gcggtaaaga cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa 540 gggggaccct ggtgtttcac aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct 600 cagtgttcag aagttgaatg catgacctgc aatggtgaaa gctacagagg tcccatggat 660 cacacagaat caggcaagac ttgtcagcgc tgggaccagc agacaccaca ccggcacaag 720 ttcttgccag aaagatatcc cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcctgat 780 ggcaagccga ggccatggtg ctacactctt gaccctgaca ccccttggga gtattgtgca 840 attaaaacgt gcgctcacag tgctgtgaat gagactgatg tccctatgga aacaactgaa 900 tgcattcaag gccaaggaga aggttacagg ggaaccagca ataccatttg gaatggaatt 960 ccctgtcagc gttgggattc gcagtaccct cacaagcatg atatcactcc cgagaacttc 1020 aaatgcaagg accttagaga aaattattgc cgcaatccag atggggctga atcaccatgg 1080 tgttttacca ctgacccaaa catccgagtt ggctactgct ctcagattcc caagtgtgac 1140 gtgtcaagtg gacaagattg ttatcgtggc aatgggaaaa attacatggg caacttatcc 1200 aaaacaaggt ctggacttac atgttccatg tgggacaaga atatggagga tttacaccgt 1260 catatcttct gggagccaga tgctagcaaa ttgaataaga attactgccg gaatcctgat 1320 gatgatgccc atggaccttg gtgctacacg gggaatcctc ttattccttg ggattattgc 1380 cctatttccc gttgtgaagg agatactaca cctacaattg tcaatttgga ccatcctgta 1440 atatcctgtg ccaaaacaaa acaactgcgg gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac 1500 ataggatgga tggttagttt gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata 1560 aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat 1620 gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac ggaagaggag aggagaaaag aaaacagatt 1680 ctcaatattt cccagctggt atatggccct gaaggatcag atctggtttt actgaagctt 1740 gctcgacctg caatcctgga taactttgtc agtacaattg atttacctag ttatggttgt 1800 acaatccctg aaaagaccac ttgcagtatt tacggctggg gctacactgg attgatcaac 1860 gcggatggtt tattacgagt agctcatctg tatattatgg ggaatgagaa atgcagtcag 1920 caccatcaag gcaaggtgac tttgaatgag tctgagttat gtgctggggc tgaaaagatt 1980 ggatcaggac catgtgaggg agattatggt ggcccactca tttgtgaaca acacaaaatg 2040 agaatggttc ttggtgtcat tgttcctggt cgtggatgtg ccatcccaaa tcgtcctggt 2100 atttttgttc gagtagcata ttatgcaaaa tggatacaca aagtaatttt gacatacaag 2160 ttgtgcggcc gccatcacca tcaccatcac taag 2194 <210> 214 <211> 675 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HGF mhm 499-556 active <400> 214 Pro Leu Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val Asn Ser Ala Asp Glu Cys 1 5 10 15 Ala Asn Arg Cys Ile Arg Asn Arg Gly Phe Thr Phe Thr Cys Lys Ala 20 25 30 Phe Val Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn 35 40 45 Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Gly Phe Gly His Glu Phe Asp Leu 50 55 60 Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Gly 65 70 75 80 Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln 85 90 95 Pro Trp Asn Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp 100 105 110 Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro 115 120 125 Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg 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Thr Arg Ser Gly Leu Thr 340 345 350 Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe 355 360 365 Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 370 375 380 Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile 385 390 395 400 Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro 405 410 415 Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys 420 425 430 Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp 435 440 445 Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu 450 455 460 Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg 465 470 475 480 Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly 485 490 495 Arg Gly Glu Glu Lys Arg Lys Gln Ile Leu Asn Ile Ser Gln Leu Val 500 505 510 Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu Leu Lys Leu Ala Arg Pro 515 520 525 Ala Ile Leu Asp Asn Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Ser Tyr Gly 530 535 540 Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Thr Cys Ser Ile Tyr Gly Trp Gly Tyr 545 550 555 560 Thr Gly Leu Ile Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr 565 570 575 Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His Gln Gly Lys Val Thr 580 585 590 Leu Asn Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly 595 600 605 Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ile Cys Glu Gln His Lys 610 615 620 Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile 625 630 635 640 Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp 645 650 655 Ile His Lys Val Ile Leu Thr Tyr Lys Leu Cys Gly Arg His His His 660 665 670 His His His 675 <210> 215 <211> 2193 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HGF mhm (W507-L585) <400> 215 atgatgtggg ggaccaaact tctgccggtc ctgttgctgc agcatgtcct cctgcacctc 60 ctcctgcttc atgtcgccat cccctatgca gaaggacaga agaaaagaag aaatacactt 120 catgaattta aaaagtcagc aaaaactact cttaccaagg aagacccatt actgaagatt 180 aaaaccaaaa aagtgaactc tgcagatgag tgtgccaaca ggtgtatcag gaacaggggc 240 tttacgttca cttgcaaggc cttcgttttt gataagtcaa gaaaacgatg ctactggtat 300 cctttcaata gtatgtcaag tggagtgaaa aaagggtttg gccatgaatt tgacctctat 360 gaaaacaaag actatattag aaactgcatc attggtaaag gaggcagcta taaagggacg 420 gtatccatca ctaagagtgg catcaaatgc cagccttgga attccatgat cccccatgaa 480 cacagctatc gcggtaaaga cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa 540 gggggaccct ggtgtttcac aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct 600 cagtgttcag aagttgaatg catgacctgc aatggtgaaa gctacagagg tcccatggat 660 cacacagaat caggcaagac ttgtcagcgc tgggaccagc agacaccaca ccggcacaag 720 ttcttgccag aaagatatcc cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcctgat 780 ggcaagccga ggccatggtg ctacactctt gaccctgaca ccccttggga gtattgtgca 840 attaaaacgt gcgctcacag tgctgtgaat gagactgatg tccctatgga aacaactgaa 900 tgcattcaag gccaaggaga aggttacagg ggaaccagca ataccatttg gaatggaatt 960 ccctgtcagc gttgggattc gcagtaccct cacaagcatg atatcactcc cgagaacttc 1020 aaatgcaagg accttagaga aaattattgc cgcaatccag atggggctga atcaccatgg 1080 tgttttacca ctgacccaaa catccgagtt ggctactgct ctcagattcc caagtgtgac 1140 gtgtcaagtg gacaagattg ttatcgtggc aatgggaaaa attacatggg caacttatcc 1200 aaaacaaggt ctggacttac atgttccatg tgggacaaga atatggagga tttacaccgt 1260 catatcttct gggagccaga tgctagcaaa ttgaataaga attactgccg gaatcctgat 1320 gatgatgccc atggaccttg gtgctacacg gggaatcctc ttattccttg ggattattgc 1380 cctatttccc gttgtgaagg agatactaca cctacaattg tcaatttgga ccatcctgta 1440 atatcctgtg ccaaaacaaa acaactgcgg gttgtaaatg ggattccaac acaaacaaca 1500 gtaggatgga tggttagttt gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata 1560 aaggagagtt gggttcttac tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat 1620 gaagcttggc ttggaattca tgatgtccac ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt 1680 ctcaatgttt cccagctggt atatggccct gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt 1740 gctcgacctg caatcctgga taactttgtc agtacaattg atttacctag ttatggttgt 1800 acaatccctg aaaagaccac ttgcagtatt tacggctggg gctacactgg attgatcaac 1860 gcggatggtt tattacgagt agctcatctg tatattatgg ggaatgagaa atgcagtcag 1920 caccatcaag gcaaggtgac tttgaatgag tctgagttat gtgctggggc tgaaaagatt 1980 ggatcaggac catgtgaggg agattatggt ggcccactca tttgtgaaca acacaaaatg 2040 agaatggttc ttggtgtcat tgttcctggt cgtggatgtg ccatcccaaa tcgtcctggt 2100 atttttgttc gagtagcata ttatgcaaaa tggatacaca aagtaatttt gacatacaag 2160 ttgtgcggcc gccatcacca tcaccatcac taag 2194 <210> 216 <211> 675 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HGF mhm507-585 active <400> 216 Pro Leu Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val Asn Ser Ala Asp Glu Cys 1 5 10 15 Ala Asn Arg Cys Ile Arg Asn Arg Gly Phe Thr Phe Thr Cys Lys Ala 20 25 30 Phe Val Phe Asp Lys Ser Arg Lys Arg Cys Tyr Trp Tyr Pro Phe Asn 35 40 45 Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Gly Phe Gly His Glu Phe Asp Leu 50 55 60 Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Gly 65 70 75 80 Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln 85 90 95 Pro Trp Asn Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp 100 105 110 Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro 115 120 125 Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile 130 135 140 Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr 145 150 155 160 Arg Gly Pro Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp 165 170 175 Asp Gln Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro 180 185 190 Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Pro 195 200 205 Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro Asp Thr Pro Trp Glu Tyr Cys 210 215 220 Ala Ile Lys Thr Cys Ala His Ser Ala Val Asn Glu Thr Asp Val Pro 225 230 235 240 Met Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly 245 250 255 Thr Ser Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser 260 265 270 Gln Tyr Pro His Lys His Asp Ile Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys 275 280 285 Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ala Glu Ser Pro 290 295 300 Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln 305 310 315 320 Ile Pro Lys Cys Asp Val Ser Ser Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn 325 330 335 Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Lys Thr Arg Ser Gly Leu Thr 340 345 350 Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe 355 360 365 Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 370 375 380 Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile 385 390 395 400 Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro 405 410 415 Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys 420 425 430 Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Gln Thr Thr Val Gly Trp 435 440 445 Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu 450 455 460 Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg 465 470 475 480 Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly 485 490 495 Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val 500 505 510 Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro 515 520 525 Ala Ile Leu Asp Asn Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Ser Tyr Gly 530 535 540 Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Thr Cys Ser Ile Tyr Gly Trp Gly Tyr 545 550 555 560 Thr Gly Leu Ile Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr 565 570 575 Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His Gln Gly Lys Val Thr 580 585 590 Leu Asn Glu Ser Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly 595 600 605 Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ile Cys Glu Gln His Lys 610 615 620 Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile 625 630 635 640 Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp 645 650 655 Ile His Lys Val Ile Leu Thr Tyr Lys Leu Cys Gly Arg His His His 660 665 670 His His His 675

Claims

(a) (i) CDR_L1이 서열 18 (2B8)의 아미노산 서열을 포함하고,

(ii) CDR_L2가 서열 206 (LRMR2B8LC)의 아미노산 서열을 포함하고,

(iii) CDR_L3이 서열 20 (2B8)의 아미노산 서열을 포함하는

구조 CDR_L1-CDR_L2-CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역; 및

(b) 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역

을 포함하며, 이 때 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 및 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역은 함께 인간 HGF에 대한 결합을 위한 단일 결합 부위를 정하는 것인, 인간 간세포 성장 인자 (HGF)에 결합하는 단리된 결합 단백질.
제1항에 있어서, CDR_L1, CDR_L2 및 CDR_L3이 인간 또는 인간화 이뮤노글로불린 프레임워크 영역 사이에 삽입되는 것인 결합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 결합 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 193 (LR2B8LC 경쇄 가변 영역) 또는 서열 199 (LRMR2B8LC 경쇄 가변 영역)의 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 을 포함하는 단리된 결합 단백질.
제4항에 있어서, 서열 197 (LR2B8LC + κ 불변 (km(3) 알로타입) (대립유전자 1)) 또는 서열 201 (LRMR2B8LC + κ 불변 (km(3) 알로타입) (대립유전자 1))의 이뮤노글로불린 경쇄 서열을 포함하는 단리된 결합 단백질.
(a) (i) CDR_H1이 서열 15 (2B8)의 아미노산 서열를 포함하고,

(ii) CDR_H2가 서열 204 (LR2B8HC) 및 서열 205 (LRMR2B8HC)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하고,

(iii) CDR_H3이 서열 17 (2B8)의 아미노산 서열을 포함하는

구조 CDR_H1-CDR_H2-CDR_H3을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역; 및

(b) 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역

을 포함하며, 이 때 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역 및 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역은 함께 인간 HGF에 대한 결합을 위한 단일 결합 부위를 정하는 것인, 인간 간세포 성장 인자 (HGF)에 결합하는 단리된 결합 단백질.
제6항에 있어서, CDR_H1, CDR_H2 및 CDR_H3이 인간 또는 인간화 이뮤노글로불린 프레임워크 영역 사이에 삽입되는 것인 결합 단백질.
제7항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 결합 단백질.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 183 (LR2B8HC 중쇄 가변 영역) 또는 서열 189 (LRMR2B8HC 중쇄 가변 영역)의 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 결합 단백질.
제9항에 있어서, 서열 187 (LR2B8HC + IgG1 불변 (G1m(3) 알로타입) (대립유전자 1)) 또는 서열 191 (LRMR2B8HC + IgG1 불변 (G1m(3) 알로타입) (대립유전자 1))의 이뮤노글로불린 중쇄 서열을 포함하는 단리된 결합 단백질.
제6항에 있어서,

(i) CDR_L1이 서열 18 (2B8)의 아미노산 서열을 포함하고,

(ii) CDR_L2가 서열 19 (2B8) 또는 서열 206 (LRMR2B8LC)의 아미노산 서열을 포함하고,

(iii) CDR_L3이 서열 20 (2B8)의 아미노산 서열을 포함하는

구조 CDR_L1-CDR_L2-CDR_L3을 포함하는 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 더 포함하며, 이 때 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 및 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역은 함께 인간 HGF에 대한 결합을 위한 단일 결합 부위를 정하는 것인 단리된 결합 단 백질.
제1항, 제6항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 결합 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
제13항 또는 제14항의 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터.
제15항의 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포.
(i) 숙주 세포가 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 및/또는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 발현시키는 조건하에 제16항의 숙주 세포를 성장시키는 단계; 및

(ii) 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역 및/또는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 회수하는 단계

를 포함하는, 결합 단백질의 생성 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 간세포 성장 인자에 4.0×10^-5 s^-1 이하의 k_d로 결합하는 단리된 결합 단백질.
제18항에 있어서, k_d가 3.0×10^-5 s^-1 이하인 단리된 결합 단백질.
제19항에 있어서, k_d가 2.0×10^-5 s^-1 이하인 단리된 결합 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 간세포 성장 인자에 20 pM 이하의 K_D로 결합하는 단리된 결합 단백질.
제21항에 있어서, K_D가 10 pM 이하인 단리된 결합 단백질.
제22항에 있어서, K_D가 5 pM 이하인 단리된 결합 단백질.
종양 세포를 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 결합 단백질에 노출시켜 종양 세포의 증식을 억제 또는 감소시키는 것을 포함하는, 종양 세포의 증 식을 억제 또는 감소시키는 방법.
제24항에 있어서, 종양 세포가 인간 종양 세포인 방법.
포유동물을 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 결합 단백질에 노출시켜 종양의 증식을 억제 또는 감소시키는 것을 포함하는, 포유동물에서 종양 성장을 억제 또는 감소시키는 방법.
유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 종양을 치료하는 방법.
제26항 또는 제27항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.