JP2013090632A - 肝細胞成長因子(hgf)結合蛋白質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の一部は、HGF、特にヒトHGFを特異的に結合する一群の結合蛋白質の発見に基づいている。これらの結合蛋白質は、HGFを特異的に結合する一群の抗体のCDRに基づく抗原(即ち、HGF)結合部位を含有する限りにおいて、抗体系である。本願は肝細胞成長因子(HGF)、特にヒトHGFを結合し、その活性を中和する一群の結合蛋白質を提供する。これらの結合蛋白質は診断剤及び/又は治療剤として用いることができる。治療活性に関して言えば、これらの結合蛋白質は特定のHGF反応性疾患、例えば、特定のHGF反応性腫瘍を治療するのに用いることができる。
【選択図】なし
Description
本願は、2006年6月2日に出願された米国仮特許出願第60/810,714号、および2006年11月21日に出願された同第60/860,509号の利益およびそれらへの優先権を主張するものであり、それらの開示は本明細書中に参考として援用される。
本発明の分野は、分子生物学、免疫学及び腫瘍学の分野である。より詳細には、この分野は、ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する抗体系結合蛋白質の分野である。
分散因子(SF:Scatter Factor)とも呼ばれる肝細胞成長因子(HGF:Hepatocyte Growth Factor)は、主として間葉細胞により産生される多機能性ヘテロ二量体蛋白質であり、Metチロシンキナーゼ受容体を発現する細胞のエフェクタである(非特許文献1、非特許文献2)。ヒトMet受容体は「c−Met」とも呼ばれる。成熟HGFは2本のポリペプチド鎖、α鎖及びβ鎖を含有している。公表された研究によれば、HGFのc−Met受容体結合ドメインを含有するのはα鎖であることが示唆されている。
本発明の一部は、HGF、特にヒトHGFを特異的に結合する一群の結合蛋白質の発見に基づいている。これらの結合蛋白質は、HGFを特異的に結合する一群の抗体のCDRに基づく抗原(即ち、HGF)結合部位を含有する限りにおいて、抗体系である。このCDRは結合蛋白質のHGFに対する結合特異性をもたらす。こうした結合蛋白質は診断剤及び治療剤として使用することができる。治療剤として用いる場合、結合蛋白質は、レシピエント(例えば、ヒト)に投与した時にこの結合蛋白質に対する免疫反応を誘発するリスクを低減又は排除できるように設計(例えば、ヒト化)する。
結合蛋白質は、HGF活性を中和するので、治療剤として用いることができる。一部の実施態様として、この結合蛋白質は、HGFがその同族受容体c−Metに結合するのを妨げることによってHGF活性を中和する。別の実施態様として、この結合蛋白質は、HGFに結合してその生物活性を中和するが、HGFがc−Met受容体に結合するのを妨げない。HGFが癌細胞の成長及び増殖に関与しているので、この結合蛋白質は癌細胞の増殖を抑制するのに用いることができる。さらに、この結合蛋白質は、哺乳動物に投与すると、その哺乳動物における腫瘍の成長を抑制又は低減することができる。
(項目1)
ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質であって、
(a)構造CDRL1−CDRL2−CDRL3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域であって、
(i)CDRL1が配列番号18(2B8)のアミノ酸配列を含み、
(ii)CDRL2が配列番号206(LRMR2B8LC)のアミノ酸配列を含み、及び
(iii)CDRL3が配列番号20(2B8)のアミノ酸配列を含む
ものとする免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに
(b)免疫グロブリン重鎖可変領域
を含み、該免疫グロブリン軽鎖可変領域及び該免疫グロブリン重鎖可変領域が共同してヒトHGFに結合するための単一結合部位を規定するものとする結合蛋白質。
(項目2)
CDRL1、CDRL2及びCDRL3がヒト又はヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域間に挿入されている項目1の結合蛋白質。
(項目3)
前記結合蛋白質が抗体又はその抗原結合断片である項目1又は2の結合蛋白質。
(項目4)
配列番号193(LR2B8LC軽鎖可変領域)又は配列番号199(LRMR2B8LC軽鎖可変領域)の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む項目1乃至3のいずれか1項の単離結合蛋白質。
(項目5)
配列番号197(LR2B8LC+カッパ定常(km(3)アロタイプ)(対立遺伝子1))又は配列番号201(LRMR2B8LC+カッパ定常(km(3)アロタイプ)(対立遺伝子1))の免疫グロブリン軽鎖配列を含む項目4の単離結合蛋白質。
(項目6)
ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質であって、
(a)構造CDRH1−CDRH2−CDRH3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域であって、
(i)CDRH1が配列番号15(2B8)のアミノ酸配列を含み、
(ii)CDRH2が配列番号204(LR2B8HC)及び配列番号205(LRMR2B8HC)からなる群から選ばれる配列を含み、及び
(iii)CDRH3が配列番号17(2B8)のアミノ酸配列を含む
ものとする免疫グロブリン重鎖可変領域、並びに
(b)免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含み、該免疫グロブリン重鎖可変領域及び該免疫グロブリン軽鎖可変領域が共同してヒトHGFに結合するための単一結合部位を規定するものとする結合蛋白質。
(項目7)
CDRH1、CDRH2及びCDRH3がヒト又はヒト化免疫グロブリンの複数のフレームワーク領域間に挿入されている項目6の結合蛋白質。
(項目8)
前記結合蛋白質が抗体又はその抗原結合断片である項目7の結合蛋白質。
(項目9)
配列番号183(LR2B8HC重鎖可変領域)又は配列番号189(LRMR2B8HC重鎖可変領域)の免疫グロブリン重鎖可変領域を含む項目6乃至8のいずれか1項の単離結合蛋白質。
(項目10)
配列番号187(LR2B8HC+IgG1定常(G1m(3)アロタイプ)(対立遺伝子1))又は配列番号191(LRMR2B8HC+IgG1定常(Glm(3)アロタイプ)(対立遺伝子1))の免疫グロブリン重鎖配列を含む項目9の単離結合蛋白質。
(項目11)
さらに、構造CDRL1−CDRL2−CDRL3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、
(i)CDRL1が配列番号18(2B8)のアミノ酸配列を含み、
(ii)CDRL2が配列番号19(2B8)又は配列番号206(LRMR2B8LC)のアミノ酸配列を含み、及び
(iii)CDRL3が配列番号20(2B8)のアミノ酸配列を含むものとし、該免疫グロブリン軽鎖可変領域及び前記免疫グロブリン重鎖可変領域が共同してヒトHGFに結合するための単一結合部位を規定するものとする項目6の単離結合蛋白質。
(項目12)
前記抗体がモノクローナル抗体である項目1、6又は11のいずれか1項の結合蛋白質。
(項目13)
項目1乃至5のいずれか1項の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む単離核酸。
(項目14)
項目6乃至10のいずれか1項の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む単離核酸。
(項目15)
項目13又は14の核酸配列を含む発現ベクター。
(項目16)
項目15の発現ベクターを含む宿主細胞。
(項目17)
結合蛋白質を作製する方法であって、
(i)項目16の宿主細胞を該宿主細胞が前記免疫グロブリン軽鎖可変領域及び/又は前記免疫グロブリン重鎖可変領域を発現するような条件下で増殖させ、及び
(ii)該免疫グロブリン軽鎖可変領域及び/又は該免疫グロブリン重鎖可変領域を採取すること
を含む方法。
(項目18)
前記結合蛋白質が4.0×10−5s−1以下のkdでヒト肝細胞成長因子に結合する項目1乃至11のいずれか1項の単離結合蛋白質。
(項目19)
前記kdが3.0×10−5s−1以下である項目18の単離結合蛋白質。
(項目20)
前記kdが2.0×10−5s−1以下である項目19の単離結合蛋白質。
(項目21)
前記結合蛋白質が20pM以下のKDでヒト肝細胞成長因子に結合する項目1乃至11のいずれか1項の単離結合蛋白質。
(項目22)
前記KDが10pM以下である項目21の単離結合蛋白質。
(項目23)
前記KDが5pM以下である項目22の単離結合蛋白質。
(項目24)
腫瘍細胞に有効量の項目1乃至11のいずれか1項の結合蛋白質を作用させて該腫瘍細胞の増殖を抑制又は低減させることを含む腫瘍細胞の増殖を抑制又は低減させる方法。
(項目25)
前記腫瘍細胞がヒト腫瘍細胞である項目24の方法。
(項目26)
哺乳動物において腫瘍成長を抑制又は低減させる方法であって、該哺乳動物に有効量の項目1乃至11のいずれか1項の結合蛋白質を作用させて該腫瘍細胞の増殖を抑制又は低減させることを含む方法。
(項目27)
哺乳動物において腫瘍を治療する方法であって、有効量の項目1乃至11のいずれか1項の結合蛋白質を投与することを含む方法。
(項目28)
前記哺乳動物がヒトである項目26又は27の方法。
本発明の以上その他の態様及び効果は、以下の図、詳細な説明及び特許請求の範囲を考慮すれば明瞭に理解されよう。
一態様として、本発明はヒトHGFに結合する単離結合蛋白質を提供する。この結合蛋白質は、(i)CDRL1−CDRL2−CDRL3の構造を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域及び(ii)3箇所の相補性決定領域(CDR)を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。この場合、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域はヒトHGFに結合するための単一結合部位を共同して規定するものとする。CDRL1は、アミノ酸配列X1X2SerX4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15であって、アミノ酸X1がArg、Lys又はSerであり、X2がAla又はThrであり、X4がGlu、Gln又はSerであり、X5がAsn、Asp又はSerであり、X6がIle又はValであり、X7がAsp、Lys、Ser、Val又はTyrであり、X8がペプチド結合又はTyrであり、X9がペプチド結合又はAspであり、X10がペプチド結合又はGlyであり、X11がペプチド結合又はAsnであり、X12がペプチド結合、Ile又はSerであり、X13がAsn又はTyrであり、X14がIle、Leu、Met又はValであり、X15がAla、Asn、His又はSerであるものとするアミノ酸配列を含む。CDRL2は、アミノ酸配列X16X17X18X19X20X21X22であって、アミノ酸X16がAla、Asp、Arg、Gly又はValであり、X17がAla、Thr又はValであり、X18がAsn、Ser又はThrであり、X19がArg、Asn、Lys又はHisであり、X20がLeu又はArgであり、X21がAla、Asn、Glu、Val又はProであり、X22がAsp、Ser又はThrであるものとするアミノ酸配列を含む。CDRL3は、アミノ酸配列X23X24X25X26X27X28ProX30Thrであって、アミノ酸X23がLeu、Gly又はGlnであり、X24がHis又はGlnであり、X25がPhe、Ser、Trp又はTyrであり、X26がAsp、Ile、Ser、Trp又はTyrであり、X27がGly、Glu、Asn又はSerであり、X28がAsp、Asn、Phe、Thr又はTyrであり、X30がLeu、Phe、Pro又はTyrであるものとするアミノ酸配列を含む。
別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号28(2F8)の配列を含むCDRL1、配列番号29(2F8)の配列を含むCDRL2及び配列番号30(2F8)を含むCDRL3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
本発明の結合蛋白質は、当該技術分野で周知の手法を用いる種々の方法で作製することができる。例えば、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードしているDNA分子は、市販の合成機及び本明細書に示した配列情報を用いて、化学的に合成することができる。このような合成DNA分子を、例えば、定常領域コード配列、発現制御配列などの他の適切なヌクレオチド配列に結合させて所望の結合蛋白質をコードしている通常の遺伝子発現構築物を作製することができる。特定の遺伝子構築物の作製は当該技術分野では日常的な技術の範囲内にある。或いは、本明細書に示した配列は、本明細書に示した配列情報、又はハイブリドーマ細胞中のマウス抗体の重及び軽鎖をコードしている遺伝子に関する従来技術の配列情報に基づいた配列を有する合成核酸プローブを用いて、通常のハイブリダイゼーション技術又はPCR技術によりハイブリドーマからクローニングすることができる。このようなプローブの作製及び使用法は、当該技術分野では日常的な技術の範囲内にある。
上記結合蛋白質を修飾してこの結合蛋白質の目的とする用途に応じて性能を最適化することができることは理解されよう。例えば、結合蛋白質を治療剤として用いようとする場合、この結合蛋白質を修飾して対象レシピエントにおける免疫原性を低減することができる。或いは、又はさらに、結合蛋白質を別の蛋白質又はペプチド、例えば、成長因子、サイトカインもしくは細胞毒と融合又は結合させることができる。このような修飾は、当該技術分野で周知の通常の遺伝子操作技術を用いることで達成することができる。
本明細書に記載した結合蛋白質は、診断剤又は治療剤として用いることができる。
本発明の結合蛋白質は、HGFの活性を中和するので、種々の治療的用途に用いることができる。例えば、本発明の結合蛋白質の一部は、過剰増殖性疾病又は疾患、例えば、各種形態の癌の予防又は治療に有用である。
上記結合蛋白質を診断目的のためにインビトロ又はインビボで用いる場合はいつも、この結合蛋白質を検出可能な成分で直接又は間接に標識するのが通常である。この検出可能成分は、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に発生することができる任意の成分とすることができる。例えば、この検出可能成分は、3水素(3H)、14炭素(14C)、32燐(32P)、35硫黄(35S)又は125ヨウ素(125I)などの放射性同位体;フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリンなどの蛍光又は化学発光化合物;アルカリ性ホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素;スピン標識などのスピンプローブ;或いは、カラー粒子、例えばラテックスもしくは金粒子であってもよい。上記結合蛋白質を、例えば、Hunter et al.(1962年) NATURE 144:p.945、David et a1.(1974年) BIOCHEMISTRY 13:p.1014、Pain et al.(I981年) J.IMMUNOL.METH. 40:p.219及びNygren (1982年) J.HISTOCHEM.AND CYTOCHEM.30:p.407に記載されているような、当該技術分野において周知の多くの方法を用いて上記検出可能成分に結合させることができることは理解されよう。これらの標識は、例えば、目視により、又は分光光度計その他の検出器を用いて検出することができる。
抗hHGFモノクローナル抗体の作製
この実施例ではいくつかの抗hHGFモノクローナル抗体の作製について説明する。
抗hHGFモノクローナル抗体の配列分析
この実施例では実施例1で作製した抗hHGFモノクローナル抗体のアイソタイプ及び配列の分析について説明する。
各モノクローナル抗体の軽鎖タイプ及び重鎖アイソタイプについて、イソストリップマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit)を用い、そのメーカーの使用説明書(ロシュ・アプライド・サイエンス社(Roche Applied Science))に従って決定した。
各モノクローナルハイブリドーマ細胞株から、RNeasyミニプレップ(Miniprep)キットを用い、そのメーカーの使用説明書(キアゲン社(Qiagen)、ヴェンロ、オランダ)に従って全RNAを抽出した。BD SMART(商標)RACE cDNA増幅キットを用い、そのメーカーの使用説明書(クロンテック社(Clontech))に従い、5’RACE(cDNA末端の迅速増幅(Rapid Amplification of cDNA Ends))のためのオリゴヌクレオチドプライマBD SMART IIA(5’aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg 3’)(配列番号85)及び5’−RACE CDS Primer(5’ tttttttttttttttttttttttttvn 3’、但し、v=a、g又はc及びn=a、g、c又はt)(配列番号86)を用いて、完全長の第1鎖cDNAを作製した。
順方向プライマ5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgaactttgggctcagattgattttcc 3’(下線箇所:開始コドン)(配列番号96)及び逆方向プライマ5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagagg3’(下線箇所:停止コドン)(配列番号97)を用いて上記で作製したcDNAから、1A3、1D3及び1F3 IgG1鎖の完全長cDNAをPCRにより増幅させた。順方向プライマ5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgggatggagctatatcatcctcttt3’(下線箇所:開始コドン)(配列番号98)及び逆方向プライマ5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagag3’(下線箇所:停止コドン)(配列番号99)を用いて上記で作製したcDNAから、2B8IgG1鎖の完全長cDNAを増幅させた。
可変領域(標準テキスト)は、IMGT/V−QUESTウェブサーバーソフトウェア(http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)を用いて同定した。シグナルペプチド配列は、同定した可変領域の上流にあるインフレーム開始コドン(ATG)の同定に基づいて予測した。シグナルペプチド配列を同定し、下記に下線で示した。
ードしている核酸配列(下線箇所:シグナル配列)(配列番号150)
各種組換えhHGF蛋白質の作製
本実施例では、実施例1及び実施例14で作製された抗体の特性を明らかにするために用いるいくつかの組換え蛋白質のクローニング及び発現について説明する。具体的には、本実施例では、組換えhHGF蛋白質、555番目の位置にグリシンからグルタメートへの置換を含む組換えhHGF蛋白質(G555E)、561番目の位置にシステインからアルギニンへの置換を含む組換えhHGF蛋白質(C561R)、マウスHGF配列内に配置されたヒトV495乃至L585HGF配列を含む組換えマウス−ヒト−マウス(mhm)キメラHGF蛋白質、マウスHGF配列内に配置されたヒトI499乃至R566HGF配列を含む組換えmhmキメラHGF蛋白質及びマウスHGF配列内に配置されたヒトW507乃至L585HGF配列を含む組換えmhmキメラHGF蛋白質のクローニング及び発現について説明する。
1回目のPCRでは、NotI部位を導入し、hHGFとhIgFcとの間に6×His標識をコードしている2本の重なり合うPCR断片を作製した。2回目に、これらの重なり合うPCR断片を鋳型としてhHGF−his−IgFcを増幅させた。得られた断片をNheI及びBamHIで消化し、pcDNA5/FRT(インビトロジェン社、#35−3014)中にクローニングした。次いで、インビトロジェン社のクローンID:IOH29794(ヒトHGF cDNA)からhHGFを増幅させた。その配列は、アクセッション番号NM_000601.4としてNCBIに寄託されている配列に相当することが分かった。
hHGF−Fc突然変異体G555E及びC561Rは、クイックチェンジ(QuickChange)II XL部位特異的突然変異誘発キット(ストラタジーン社(Stratagene))をメーカーの使用説明書に従って用いた部位特異的突然変異誘発法により作製した。
マウス−ヒト−マウスキメラIgFc構築物は、mHGFアルファ鎖hHGF、ヒトHGFのβ鎖アミノ酸Val495乃至Leu585、及びmHGF C末端β鎖とこれに続く6×His標識及びIgG−Fcを含む。
hHGF及びmhmキメラ(V495乃至L585)をコードしているベクターであるpcDNA5/FRT hHGF及びpcDNA5/FRT−mhmキメラ(V495乃至L−L585)を、Fc標識を含ませずに、部位特異的突然変異誘発法により作製した。前記クイックチェンジII XL部位特異的突然変異誘発キット(ストラタジーン社)をメーカーの使用説明書に従って用い、上記6×His標識の3’末端に停止コドンを導入した。突然変異誘発プライマーには、プライマー1:
(1) 細胞培養
CHO FIpIn細胞(インビトロジェン社、カタログ番号R758−07)をF12K培地(ATTC、カタログ番号30−2004)、10%FCS(インビトロジェン社、カタログ番号10438026)、1%ペニシリン(10,000単位/mL)/ストレプトマイシン(10,000μg/mL)(インビトロジェン社、カタログ番号15140−122)中、37℃、5% CO2、100μg/mLゼオシン(Zeocin)(インビトロジェン社、カタログ番号R250−01)の条件下で増殖させた。
リポフェクタミン2000(インビトロジェン社、カタログ番号11668−027)をそのメーカーの使用説明書に従って用い、発現プラスミドDNA pOG44及びpcDNA5/FRTを9:1の比率で用いてCHO FIpIn宿主細胞に形質移入した。対照として、空のpcDNA5/FRTベクター/pOG44及びpOG44プラスミド(インビトロジェン社、カタログ番号35−3018)単独を細胞に形質移入した。形質移入後24時間に、この細胞を分裂させ、48時間後に、0.5mg/mLのハイグロマイシンB(シグマ社(Sigma)、カタログ番号H0654−SPEC)を細胞に添加した。F12K、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.5mg/mLハイグロマイシンB中で安定細胞の多クローン性選択を行った。
約2×106個の細胞を15cmプレートに接種し、F12K(ATCC、カタログ番号30−2004)/DMEM高グルコース(インビトロジェン社、カタログ番号11995065)1:1、5%超低IgG FCS(インビトロジェン社、#16250−78)中、37℃、5%CO2で5乃至6日間増殖させた。上清を採取し、得られた蛋白質をELISA及び表面プラスモン共鳴により分析した。
抗hHGFモノクローナル抗体の結合特性
実施例1で作製したモノクローナル抗体の特徴は、これらがhHGF及び実施例3で作製した組換えHGF蛋白質の一部に結合することができることにあった。
抗hHGFモノクローナル抗体の還元及び非還元HGFへの結合能
本実施例では、実施例1で作製した抗hHGFモノクローナル抗体の還元及び非還元HGFへの結合能について分析した。
結合親和性
実施例1で作製した各抗体のhHGFに対する結合親和性及び相互作用の速度を表面プラスモン共鳴によって測定した。
抗hHGF抗体の中和活性
本実施例では、実施例1で作製した抗体について、(a)c−MetへのhHGFの結合を阻害し、(b)4MBr−5細胞におけるBrdU取り込みのHGFによる促進を阻害する能力を特性化した。
上記抗体について、c−MetへのhHGF結合を阻害する能力をELISAにより試験した。
12.5nMのhHGF 10μLを96穴組織培養マイクロタイタープレート(コスター社(Costar)カタログ番号3903)の個々のウェルに分注した。次いで、6667、2222、740、247、82、27、9.1、3.0、1.0及び0.33nMの濃度に連続希釈した抗体10μLを各ウェルに添加した。次に、このHGF抗体混合液を室温で30分間インキュベートした。F−12K(ATCC、30−2004)、15%FBS(ギブコ(Gibco)10438−026)、30ng/mL EGF(シグマ(Sigma)E9644)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(PS、ギブコ社カタログ番号15140−122)中で培養したサル気管支上皮細胞4MBr−5(ATCC、CCL208)をトリプシン(Trypsin)(ギブコ社カタログ番号25200−056)で解離させ、75,000個/mLの濃度でアッセイ培地(F−12K、2.5% FBS、1% PS)に再懸濁し、この細胞懸濁液80μLを上記HGF抗体混合液に分注した。
抗hHGF抗体の抗散乱(Anti−Scatter)活性
本実施例では、実施例1で作製した抗体のHGF誘発性散乱活性を抑制する能力に関する特性化について説明する。HGFは、MDCK細胞(ATCC、マナッサス、バージニア州、カタログ番号CCL−34)においてクラスターの「散乱」(運動)を誘発する。
HGF刺激c−Metリン酸化の阻害
本実施例では、実施例1で作製した抗体の、PC−3細胞におけるHGF刺激c−Metリン酸化を阻害する能力に関する特性化について説明する。HGFはPC−3細胞(ATCC番号CRL−1435)においてMetのリン酸化を誘発する。
U87MG異種移植モデルにおける腫瘍抑制
U87MG異種移植モデルを用い、本発明のマウスモノクローナル抗体の腫瘍増殖抑制能について試験した。U87MG細胞(ATCC)は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM:Dulbecco’s Modified Eagle medium)を10%ウシ胎仔血清、100単位/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンと共に含む培地を用いた、5%CO2及び95%空気を含有する雰囲気中37℃の培養で増殖させた。これらの細胞は、トリプシン−EDTAを用いて培養皿の壁から細胞を剥離することにより二次培養して維持した。
U118異種移植モデルにおける腫瘍抑制
U118異種移植モデルを用い、抗体1A3、1D3、1F3及び2B8の腫瘍増殖抑制能について試験した。U118細胞(ATCC)は、U87MG細胞に関して(上記)実施例10に記載したのと同様にして増殖させた。
マウスモノクローナル抗体のヒト化
本実施例では、マウス2B8抗体のヒト化及び得られるヒト化抗体の特性化について説明する。マウス2B8重及び軽鎖可変領域は2通りの方法で「ヒト化」した。
第一の方法では、Hwangほか (2005年) METHODS 36:p.35−42、Tanほか (2002年) J.IMMUNOL.169:p.1119−1125及び米国特許第6,881,557号明細書に記載されている「超ヒト化」方法に基づいて、3つのヒト化重鎖可変領域及び2つのヒト化カッパ軽鎖可変領域を設計した。
sh2B8−12 (Glm(17,1))=hu2B8 Hv5−51.1(+IgG1定常領域(Glm(l7,1)アロタイプ))(配列番号171)プラスhu2B8
Kv 3−15.1 (+カッパ定常領域(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子2))) (配列番号181)
各ヒト化抗体をコードしている核酸配列及び各ヒト化抗体を規定する蛋白質配列を下記にまとめた。このセクションでは、各可変領域の最後のヌクレオチドは、可変/定常領域接合部によって生じる次のコドンの最初の塩基である。このヌクレオチドは、可変領域に含まれる。何故なら、これはそのエクソンの一部であるからである。下記に列挙した定常領域のアミノ酸配列はこの接合部コドンの翻訳物を含む。
マウス2B8抗体の免疫原性を低減させるのに用いる第二のヒト化方法は、Studnickaほか(1994年) PROTEIN ENG.7:p.805−814に記載されている方法に基づくものである。重及びカッパヒト生殖細胞系可変領域のうち、マウス2B8のものに(アミノ酸レベルで)最も一致する領域を特定した。マウスとヒトとの間で異なる残基は、そのような変化が結合又は免疫原性に影響すると思われるリスクに応じてヒトの配列に変換した。低リスク残基(即ち、変化があっても、抗原結合に影響しないと考えられ、免疫原性を生じる可能性も少ない残基)は、ヒトアミノ酸への変更を重鎖可変領域(LR2B8HCを作製)及びカッパ可変領域(LR2B8LCを作製)において行った。さらに、低リスク及び中間リスク残基(即ち、変化があると、抗原結合に影響する可能性が若干高いが、免疫原性を生じる可能性も少ない残基)は、ヒトアミノ酸への変更を重鎖可変領域(LRMR2B8HCを作製)及びカッパ可変領域(LRMR2B8LCを作製)において行った。上記2種のヒト型に設計された重鎖可変領域のカルボキシル末端にヒトIgG1重鎖定常領域(G1m(3)アロタイプ(対立遺伝子1))を付加し、2種のヒト型に設計された軽鎖可変領域のカルボキシル末端にヒトカッパ定常領域(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子1))を付加して、ヒト型に設計された抗体鎖を作製した。先ず、遺伝子合成法によって各可変領域の核酸配列を合成した後、これに各ヒト定常領域の配列に付加した。これらのヒト型に設計された抗体を哺乳動物の蛋白質発現ベクター中にクローニングし、重鎖プラス軽鎖の考えられる4種の組合せの蛋白質を発現させた。キメラ、キメラ/ヒト化又はヒト化抗体のヒトHGFへの結合については、下記のように、従来の技術を用いて測定した。
BIAcoreT100装置を用いて表面プラスモン共鳴法により抗原結合親和性及び相互作用の速度を評価した。マウス抗ヒト免疫グロブリン(ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社(Jackson ImmunoResearch Labs)、209−005−098)は、標準的なカップリングプロトコルをメーカーの推奨事項に従って用いたアミンカップリング(BIAcore、カタログ番号BR−1000−50)によりカルボキシメチル化デキストランCM4センサーチップ(BIAcore、カタログ番号BR−1005−34)上に固定化した。分析は、0.05%の界面活性剤P20(BIAcore、カタログ番号BR−1000−54)、2mg/mLのBSA(EMD社カタログ番号2930)及び10mg/mLのCM−デキストランナトリウム塩(フルカ社(Fluka)、カタログ番号86524)を含有するPBS(GIBCO社、カタログ番号14040−133)を泳動用緩衝液として用い、25℃で行った。
HGFへの相互排他的結合についてBIAcore T100装置を用いて表面プラスモン共鳴により評価した。マウス抗ヒト免疫グロブリン(ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社(Jackson ImmunoResearch Labs)、209−005−098)は、標準的なカップリングプロトコルをメーカーの推奨事項に従って用いたアミンカップリング(BIAcore、カタログ番号BR−1000−50)によりカルボキシメチル化デキストランCM5センサーチップ(BIAcore、カタログ番号BR−1006−68)上に固定化した。分析は、0.05%の界面活性剤P20(BIAcore、BR−1000−54)、2mg/mLのBSA(EMD社カタログ番号2930)及び10mg/mLのCM−デキストランナトリウム塩(フルカ社(Fluka)、カタログ番号86524)を含有するPBS(GIBCO社、カタログ番号14040−133)を泳動用緩衝液として用い、25℃で行った。
ヒト化2B8変異体の作製
a.ヒューマン・エンジニアード(商標)抗体
ヒトカッパ及びガンマ−1定常領域モジュールを含むXOMA社の一過性抗体発現ベクター中に、コドン−及び発現適正化低リスク及び低プラス中等度リスクヒューマン・エンジニアード軽鎖(それぞれ、LR2B8LC及びLRMR2B8L)及び重鎖(それぞれ、LR2B8HC及びLRMR2BHC)をインフェーズでクローニングした。これら4種のヒューマン・エンジニアード2B8変異体は、HEK293E細胞への一過性形質移入によって作製した。以下の4種の抗体を作製した。
HE2B8−2 = LR2B8HC(+IgGl定常領域(Glm(3)アロタイプ(対立遺伝子1))(配列番号187)プラスLRMR2B8LC(+カッパ鎖定常領域(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子1)))(配列番号201)
HE2B8−3 = LRMR2B8HC(+IgG1定常領域(Glm(3)アロタイプ(対立遺伝子1))(配列番号191)プラスLR2B8LC(+カッパ鎖定常領域(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子1)))(配列番号197)
HE2B8−4 = LRMR2B8HC(+IgG1定常領域(Glm(3)アロタイプ(対立遺伝子1))(配列番号191)プラスLRMR2B8LC(+カッパ鎖定常領域(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子1)))(配列番号201)
これら軽及び重鎖は、2リットルの振盪フラスコを用いてIS293培地(アーバイン・サイエンティフィック社、アーバイン、カリフォルニア州)中で増殖させたXOMA社の懸濁適応HEK293E細胞中に同時形質移入した。振盪フラスコでの24時間の形質移入後、形質移入細胞200mLを遠心分離し、新鮮培地40mLに再懸濁し、産生用インテグラ(Integra)フラスコ(ウィルソン・ウォルフ・マニュファクチャリング社(Wilson Wolf Manufacturing Inc.)、ミネソタ州)に移した。数日間のインキュベーション後、細胞懸濁液をインテグラフラスコから取り出し、遠心分離して培養上清を残した。この培養上清中の抗体をプロテインAスピンカラム(プロ−ケム社)で精製し、PBSに対して透析し、濃縮して除菌した。
完全長Hu2B8_Hv5−51.1+ヒトIgG1定常ドメイン(G1m(3)アロタイプ)cDNAをHindIII及びEcoRI制限部位を利用してpEE6.4(ロンザバイオロジックス社(Lonza Biologics)、バークシャー、英国)中にクローニングした。完全長Hu2B8_Kv−39.1可変領域+ヒトカッパ鎖定常ドメインcDNA及び完全長Hu2B8_Kv3−15.1可変領域+ヒトカッパ鎖定常ドメインcDNAをそれぞれ、HindIII及びEcoRI制限部位を利用してpEE14.4(ロンザバイオロジックス社)中にクローニングした。(pEE6.4内の)hCMV−MIEプロモーター+完全長Hu2B8_Hv5−51.1+ヒトIgG1定常ドメイン(G1m(3)アロタイプ)cDNA+SV40ポリA断片をNotI/SalI消化により切り出し、どちらのカッパ鎖pEE14.4ベクター中にもNotI/SalI部位から挿入することにより、それぞれ重及び軽鎖を同時に発現する2種の発現ベクターを作り、以下の抗体を作製した。
sh2B8−12(Glm(3)) = hu2B8 Hv5−51.1(+IgG1定常領域(Glm(3)アロタイプ)(対立遺伝子 2))(配列番号210)プラスhu2B8 Kv 3−15.1(+カッパ鎖定常領域(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子2)))(配列番号181)
上記ヒトIgG1重鎖定常領域G1m(3)アロタイプ(対立遺伝子2)及び上記各完全長重鎖配列をコードしている核酸配列並びにこれらを規定する蛋白質配列を以下に記載した。軽鎖の配列は実施例12に記載したのと同じであった。
ヒト化2B8変異体の結合特性
実施例13で作製したヒト化抗体の特徴は、hHGF及び実施例3で作製した組換えHGF蛋白質に結合できることであった。
ヒト化2B8変異体の結合親和性
表15に示した抗体の結合親和性及び相互作用の速度を表面プラスモン共鳴によって測定した。
25℃及び37℃における結合親和性の比較
抗体HE2B8−4、sh2B8−9、sh2B8−12及びマウス2B8の結合親和性及び相互作用の速度を種々の条件下で表面プラスモン共鳴により測定した。
ヒト化2B8変異体の中和活性
実施例14で作製した抗体について、(a)c−MetへのhHGFの結合を阻害し、(b)4MBr−5細胞におけるBrdU取り込みのHGFによる促進を阻害する能力を特性化した。
ヒト化2B8変異体の抗散乱活性
表17の抗体を実施例8で説明した抗散乱アッセイにおいて試験した。その結果を下記の表22にまとめた。
HGF刺激c−Metリン酸化の阻害
表17の抗体を実施例9で説明したc−Metリン酸化アッセイにおいて試験した。その結果を下記の表23にまとめた。
U87MG異種移植モデルにおける腫瘍抑制
U87MG異種移植モデルを用い、本発明のヒト化モノクローナル抗体の腫瘍増殖抑制能について試験した。U87MG細胞(ATCC)は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM:Dulbecco’s Modified Eagle medium)を10%ウシ胎仔血清、100単位/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンと共に含む培地を用いた、5%CO2及び95%空気を含有する雰囲気中37℃の培養で増殖させた。これらの細胞は、トリプシン−EDTAを用いて培養皿の壁から細胞を剥離することにより二次培養して維持した。
引用による組込み
本明細書で触れた特許文献及び科学論文のそれぞれの開示内容はその全体があらゆる目的で引用により組み込まれている。
本発明は, 当該発明の精神または主要な特徴から逸脱することなく, 他のさまざまな形式で実施することができる。そのため、前述の実施態様はあらゆる点で単なる例示にすぎず、本明細書に記載された発明に対して限定的に解釈してはならない。従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって示すものであり、明細書の本文によって拘束されるものではない。また、特許請求の範囲の記載内容と同等の範囲に含まれる変形もしくは変更は、すべて本発明の範囲内のものである。
Claims (18)
- 配列番号189のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第2の単離された核酸と組み合わせて使用するための、配列番号199のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第1の単離された核酸。
- 配列番号199のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第2の単離された核酸と組み合わせて使用するための、配列番号189のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第1の単離された核酸。
- 配列番号191のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第2の単離された核酸と組み合わせて使用するための、配列番号201のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第1の単離された核酸。
- 配列番号201のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第2の単離された核酸と組み合わせて使用するための、配列番号191のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第1の単離された核酸。
- 配列番号199のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および配列番号189のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、該免疫グロブリン軽鎖可変領域および該免疫グロブリン重鎖可変領域が一緒になってヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する、単離された核酸。
- 配列番号201のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列、および配列番号191のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、該免疫グロブリン軽鎖および該免疫グロブリン重鎖が一緒になってヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する、単離された核酸。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の第1の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項5または6に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項7または8に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 配列番号199のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第1の発現ベクターと、配列番号189のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第2の発現ベクターとを含む宿主細胞。
- 配列番号201のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第1の発現ベクターと、配列番号191のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む第2の発現ベクターとを含む宿主細胞。
- 免疫グロブリン軽鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドを生成する方法であって、該方法は、以下:
(i)該免疫グロブリン軽鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項9〜11のいずれか1項に記載の宿主細胞を増殖させる工程;および
(ii)該免疫グロブリン軽鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドを精製する工程
を包含する、方法。 - 免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチドを生成する方法であって、該方法は、以下:
(i)請求項9〜11のいずれか1項に記載の宿主細胞を、該免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチドの発現を可能にする条件下で増殖させる工程;および
(ii)該免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチドを精製する工程
を包含する、方法。 - ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合するモノクローナル抗体または該抗体の抗原結合フラグメントを生成する方法であって、該方法は、以下:
(i)請求項9〜11のいずれか1項に記載の宿主細胞を、前記免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチドと、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドの発現を可能にする条件下で増殖させ、それによって、該抗体または該抗体の抗原結合フラグメントを産生させる工程;および
(ii)該抗体または該抗体の抗原結合フラグメントを精製する工程
を包含する、方法。 - 腫瘍細胞の増殖を抑制または低減するための組成物であって、該組成物は、ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する抗体または該抗体の抗原結合フラグメントの、該腫瘍細胞の増殖を抑制または低減するために有効な量を含み、該抗体は、以下:
(i)配列番号199のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域;および
(ii)配列番号189のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、組成物。 - 哺乳動物における腫瘍の成長を抑制または低減するための組成物であって、該組成物は、ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する抗体または該抗体の抗原結合フラグメントの、該腫瘍の成長を抑制または低減するために有効な量を含み、該抗体は、以下:
(i)配列番号199のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域;および
(ii)配列番号189のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、組成物。 - 哺乳動物における腫瘍を治療するための組成物であって、該組成物は、ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する抗体または該抗体の抗原結合フラグメントの、該腫瘍を治療するために有効な量を含み、該抗体は、以下:
(i)配列番号199のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域;および
(ii)配列番号189のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、組成物。 - 前記抗体が、配列番号201の免疫グロブリン軽鎖および配列番号191の免疫グロブリン重鎖、または該抗体の抗原結合フラグメントを含む、請求項15〜17のいずれか1項に記載の組成物。
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