JP2009539347A5 - - Google Patents

Description

肝細胞成長因子（ＨＧＦ）結合蛋白質

関連する出願
本願は、２００６年６月２日に出願された米国仮特許出願第６０／８１０，７１４号、および２００６年１１月２１日に出願された同第６０／８６０，５０９号の利益およびそれらへの優先権を主張するものであり、それらの開示は本明細書中に参考として援用される。

発明の分野
本発明の分野は、分子生物学、免疫学及び腫瘍学の分野である。より詳細には、この分野は、ヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に結合する抗体系結合蛋白質の分野である。

背景
分散因子（ＳＦ：Ｓｃａｔｔｅｒ Ｆａｃｔｏｒ）とも呼ばれる肝細胞成長因子（ＨＧＦ：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）は、主として間葉細胞により産生される多機能性ヘテロ二量体蛋白質であり、Ｍｅｔチロシンキナーゼ受容体を発現する細胞のエフェクタである（非特許文献１、非特許文献２）。ヒトＭｅｔ受容体は「ｃ−Ｍｅｔ」とも呼ばれる。成熟ＨＧＦは２本のポリペプチド鎖、α鎖及びβ鎖を含有している。公表された研究によれば、ＨＧＦのｃ−Ｍｅｔ受容体結合ドメインを含有するのはα鎖であることが示唆されている。

ＨＧＦは、その同族受容体に結合すると、多くの細胞活動を媒介する。ＨＧＦ−Ｍｅｔシグナル伝達経路は、肝臓の再生、創傷治癒、神経再生、血管形成及び悪性腫瘍に関係している。例えば、非特許文献３、非特許文献４並びに特許文献１及び特許文献２を参照されたい。ＨＧＦ活性が関係する各種の疾患、例えば、特定のＨＧＦ反応性癌、を治療するために、抗体を含む多くのＨＧＦ調節剤が研究者らにより開発されてきた。例えば、特許文献３を参照されたい。

全ての抗体に共通する基本的構造を図１に摸式図的に示した。抗体は４本のポリペプチド鎖を含有する多量体蛋白質である。これらのポリペプチド鎖のうちの２本は重鎖又はＨ鎖と呼ばれ、他の２本は軽鎖又はＬ鎖と呼ばれている。これら免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって連結されている。免疫グロブリン重鎖同士も多くの鎖間ジスルフィド結合により連結されている。軽鎖が１箇所の可変領域（図１中のＶ_Ｌ）と１箇所の定常領域（図１中のＣ_Ｌ）とで構成されるのに対して、重鎖は１箇所の可変領域（図１中のＶ_Ｈ）と少なくとも３箇所の定常領域（図１中のＣＨ_１、ＣＨ_２及びＣＨ_３）とで構成される。可変領域は抗体の特異性を決定し、定常領域は他の機能を有する。

アミノ酸及び構造上の情報から、各可変領域は４箇所の比較的保存されたフレームワーク領域又はＦＲに隣接して存在する３箇所の超可変領域（相補性決定領域又はＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれる）を含むことが分かっている。ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２及びＣＤＲ_３と称されるこれら３箇所のＣＤＲは個々の抗体の結合特異性に関与している。抗体を診断剤及び治療剤として使用する場合には、通常、その標的分子に対して最も高い結合特異性及び親和性を有する抗体を作製することが望ましい。可変領域間の相違は、抗体の特異性及び親和性に対して大きな影響を与え得ると考えられている。

特許文献４には、カポジ肉腫の治療における抗ＨＧＦ抗体の使用について開示されている。同じように、特許文献５には、治療対象の患者に抗ＨＧＦ抗体を投与して腫瘍における内因性ＨＧＦの血管形成促進能を妨げることによる腫瘍の治療について開示されている。最近になって、研究者らにより、ＨＧＦのβ鎖に結合する抗体がＨＧＦ依存性腫瘍の患者に対して治療剤となる可能性を有するとの提案がなされている（非特許文献４）。

米国特許第５，９９７，８６８号明細書 米国特許第５，７０７，６２４号明細書 国際公開第２００５／０１７１０７号パンフレット 米国特許第５，７０７，６２４号明細書 米国特許第５，９９７，８６８号明細書

Ｂｏｔｔａｒｏ ｅｔ ａｌ． （１９９１年） ＳＣＩＥＮＣＥ ２５１： ｐ．８０２−８０４ Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３年） ＢＩＯＣＨＩＭ． ＢＩＯＰＨＹＳ． ＡＣＴＡ １１５５： ｐ．３５７−３７１ Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２００１年） ＰＲＯＣ． ＮＡＴＬ． ＡＣＡＤ． ＳＣＩ． ＵＳＡ ９８：ｐ．７４４３−７４４８ Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００６年） ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ． ６６：ｐ．１７２１−１７２９

それでもなお、治療剤及び診断剤として使用できるＨＧＦ調節剤がさらに求められている。

発明の要旨
本発明の一部は、ＨＧＦ、特にヒトＨＧＦを特異的に結合する一群の結合蛋白質の発見に基づいている。これらの結合蛋白質は、ＨＧＦを特異的に結合する一群の抗体のＣＤＲに基づく抗原（即ち、ＨＧＦ）結合部位を含有する限りにおいて、抗体系である。このＣＤＲは結合蛋白質のＨＧＦに対する結合特異性をもたらす。こうした結合蛋白質は診断剤及び治療剤として使用することができる。治療剤として用いる場合、結合蛋白質は、レシピエント（例えば、ヒト）に投与した時にこの結合蛋白質に対する免疫反応を誘発するリスクを低減又は排除できるように設計（例えば、ヒト化）する。
結合蛋白質は、ＨＧＦ活性を中和するので、治療剤として用いることができる。一部の実施態様として、この結合蛋白質は、ＨＧＦがその同族受容体ｃ−Ｍｅｔに結合するのを妨げることによってＨＧＦ活性を中和する。別の実施態様として、この結合蛋白質は、ＨＧＦに結合してその生物活性を中和するが、ＨＧＦがｃ−Ｍｅｔ受容体に結合するのを妨げない。ＨＧＦが癌細胞の成長及び増殖に関与しているので、この結合蛋白質は癌細胞の増殖を抑制するのに用いることができる。さらに、この結合蛋白質は、哺乳動物に投与すると、その哺乳動物における腫瘍の成長を抑制又は低減することができる。

本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に結合する単離結合蛋白質であって、
（ａ）構造ＣＤＲ_Ｌ１−ＣＤＲ_Ｌ２−ＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域であって、
（ｉ）ＣＤＲ_Ｌ１が配列番号１８（２Ｂ８）のアミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）ＣＤＲ_Ｌ２が配列番号２０６（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ）のアミノ酸配列を含み、及び
（ｉｉｉ）ＣＤＲ_Ｌ３が配列番号２０（２Ｂ８）のアミノ酸配列を含む
ものとする免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに
（ｂ）免疫グロブリン重鎖可変領域
を含み、該免疫グロブリン軽鎖可変領域及び該免疫グロブリン重鎖可変領域が共同してヒトＨＧＦに結合するための単一結合部位を規定するものとする結合蛋白質。
（項目２）
ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２及びＣＤＲ_Ｌ３がヒト又はヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域間に挿入されている項目１の結合蛋白質。
（項目３）
前記結合蛋白質が抗体又はその抗原結合断片である項目１又は２の結合蛋白質。
（項目４）
配列番号１９３（ＬＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域）又は配列番号１９９（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域）の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む項目１乃至３のいずれか１項の単離結合蛋白質。
（項目５）
配列番号１９７（ＬＲ２Ｂ８ＬＣ＋カッパ定常（ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１））又は配列番号２０１（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ＋カッパ定常（ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１））の免疫グロブリン軽鎖配列を含む項目４の単離結合蛋白質。
（項目６）
ヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に結合する単離結合蛋白質であって、
（ａ）構造ＣＤＲ_Ｈ１−ＣＤＲ_Ｈ２−ＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域であって、
（ｉ）ＣＤＲ_Ｈ１が配列番号１５（２Ｂ８）のアミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）ＣＤＲ_Ｈ２が配列番号２０４（ＬＲ２Ｂ８ＨＣ）及び配列番号２０５（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣ）からなる群から選ばれる配列を含み、及び
（ｉｉｉ）ＣＤＲ_Ｈ３が配列番号１７（２Ｂ８）のアミノ酸配列を含む
ものとする免疫グロブリン重鎖可変領域、並びに
（ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含み、該免疫グロブリン重鎖可変領域及び該免疫グロブリン軽鎖可変領域が共同してヒトＨＧＦに結合するための単一結合部位を規定するものとする結合蛋白質。
（項目７）
ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２及びＣＤＲ_Ｈ３がヒト又はヒト化免疫グロブリンの複数のフレームワーク領域間に挿入されている項目６の結合蛋白質。
（項目８）
前記結合蛋白質が抗体又はその抗原結合断片である項目７の結合蛋白質。
（項目９）
配列番号１８３（ＬＲ２Ｂ８ＨＣ重鎖可変領域）又は配列番号１８９（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣ重鎖可変領域）の免疫グロブリン重鎖可変領域を含む項目６乃至８のいずれか１項の単離結合蛋白質。
（項目１０）
配列番号１８７（ＬＲ２Ｂ８ＨＣ＋ＩｇＧ１定常（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１））又は配列番号１９１（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣ＋ＩｇＧ１定常（Ｇｌｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１））の免疫グロブリン重鎖配列を含む項目９の単離結合蛋白質。（項目１１）
さらに、構造ＣＤＲ_Ｌ１−ＣＤＲ_Ｌ２−ＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、
（ｉ）ＣＤＲ_Ｌ１が配列番号１８（２Ｂ８）のアミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）ＣＤＲ_Ｌ２が配列番号１９（２Ｂ８）又は配列番号２０６（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ）のアミノ酸配列を含み、及び
（ｉｉｉ）ＣＤＲ_Ｌ３が配列番号２０（２Ｂ８）のアミノ酸配列を含むものとし、該免疫グロブリン軽鎖可変領域及び前記免疫グロブリン重鎖可変領域が共同してヒトＨＧＦに結合するための単一結合部位を規定するものとする項目６の単離結合蛋白質。
（項目１２）
前記抗体がモノクローナル抗体である項目１、６又は１１のいずれか１項の結合蛋白質。
（項目１３）
項目１乃至５のいずれか１項の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む単離核酸。
（項目１４）
項目６乃至１０のいずれか１項の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む単離核酸。
（項目１５）
項目１３又は１４の核酸配列を含む発現ベクター。
（項目１６）
項目１５の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目１７）
結合蛋白質を作製する方法であって、
（ｉ）項目１６の宿主細胞を該宿主細胞が前記免疫グロブリン軽鎖可変領域及び／又は前記免疫グロブリン重鎖可変領域を発現するような条件下で増殖させ、及び
（ｉｉ）該免疫グロブリン軽鎖可変領域及び／又は該免疫グロブリン重鎖可変領域を採取すること
を含む方法。
（項目１８）
前記結合蛋白質が４．０×１０^−５ｓ^−１以下のｋ_ｄでヒト肝細胞成長因子に結合する項目１乃至１１のいずれか１項の単離結合蛋白質。
（項目１９）
前記ｋ_ｄが３．０×１０^−５ｓ^−１以下である項目１８の単離結合蛋白質。
（項目２０）
前記ｋ_ｄが２．０×１０^−５ｓ^−１以下である項目１９の単離結合蛋白質。
（項目２１）
前記結合蛋白質が２０ｐＭ以下のＫ_Ｄでヒト肝細胞成長因子に結合する項目１乃至１１のいずれか１項の単離結合蛋白質。
（項目２２）
前記Ｋ_Ｄが１０ｐＭ以下である項目２１の単離結合蛋白質。
（項目２３）
前記Ｋ_Ｄが５ｐＭ以下である項目２２の単離結合蛋白質。
（項目２４）
腫瘍細胞に有効量の項目１乃至１１のいずれか１項の結合蛋白質を作用させて該腫瘍細胞の増殖を抑制又は低減させることを含む腫瘍細胞の増殖を抑制又は低減させる方法。
（項目２５）
前記腫瘍細胞がヒト腫瘍細胞である項目２４の方法。
（項目２６）
哺乳動物において腫瘍成長を抑制又は低減させる方法であって、該哺乳動物に有効量の項目１乃至１１のいずれか１項の結合蛋白質を作用させて該腫瘍細胞の増殖を抑制又は低減させることを含む方法。
（項目２７）
哺乳動物において腫瘍を治療する方法であって、有効量の項目１乃至１１のいずれか１項の結合蛋白質を投与することを含む方法。
（項目２８）
前記哺乳動物がヒトである項目２６又は２７の方法。
本発明の以上その他の態様及び効果は、以下の図、詳細な説明及び特許請求の範囲を考慮すれば明瞭に理解されよう。

本発明は、以下の図面にてさらに完全な理解が可能となろう。
代表的な抗体を模式図化したものである。 １Ａ３、１Ｄ３、１Ｆ３、２Ｂ８、２Ｆ８、３Ａ１２、３Ｂ６及び３Ｄ１１で表した抗体の完全な免疫グロブリン重鎖可変領域を規定するアミノ酸配列を示す模式図である。各抗体のアミノ酸配列は全て相互に整列させてあり、シグナルペプチド、ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２及びＣＤＲ_３を規定する領域は枠で囲んで識別されている。枠で囲んでない配列はＦＲ配列を表す。 図２に示した免疫グロブリン重鎖可変領域配列のそれぞれのＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２及びＣＤＲ_３を示す模式図である。 １Ａ３、１Ｄ３、１Ｆ３、２Ｂ８、２Ｆ８、３Ａ１２、３Ｂ６及び３Ｄ１１で表した抗体の完全な免疫グロブリン軽鎖可変領域を規定するアミノ酸配列を示す模式図である。各抗体のアミノ酸配列は全て相互に整列させてあり、シグナルペプチド、ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２及びＣＤＲ_３を規定する領域は枠で囲んで識別されている。枠で囲んでない配列はＦＲ配列を表す。 図４に示した免疫グロブリン軽鎖可変領域配列のそれぞれのＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２及びＣＤＲ_３を示す模式図である。 Ｕ８７ＭＧ異種移植モデルにおいて抗ＨＧＦ抗体１Ｄ３、１Ｆ３、１Ａ３及び２Ｂ８の腫瘍抑制活性を測定する実験からの結果をまとめたグラフである。菱形はＰＢＳ、三角形は抗ＨＧＦ抗体１Ａ３、Ｘは抗ＨＧＦ抗体１Ｄ３、四角形は抗ＨＧＦ抗体１Ｆ３、丸は抗ＨＧＦ抗体２Ｂ８を示す。 Ｕ１１８異種移植モデルにおいて抗ＨＧＦ抗体１Ｄ３、１Ｆ３、１Ａ３及び２Ｂ８の腫瘍抑制活性を測定する実験からの結果をまとめたグラフである。菱形はＩｇＧ、四角形は抗ＨＧＦ抗体１Ｆ３、三角形は抗ＨＧＦ抗体１Ｄ３、Ｘは抗ＨＧＦ抗体１Ａ３、丸は抗ＨＧＦ抗体２Ｂ８に相当する。 ヒトＨＧＦとキメラ、キメラ／ヒト化又はヒト化２Ｂ８抗体との間の抗原結合親和性及び相互作用速度に関する表面プラスモン共鳴データをまとめた一覧表である。この表には試験したカッパ鎖とＩｇＧ１重鎖との対が示されている。標準偏差（ＳＴＤＥＶ）が示されている抗体は３回の独立した実験において解析したものである。 Ｈｕ２Ｂ８がマウスモノクローナル抗体２Ｂ８に対して互いに限定される抗原決定基に結合することを示す実験データをまとめた棒グラフである。ヒト化又はキメラ２Ｂ８を抗ヒトＦｃチップ上に捕捉した。次いで、ＨＧＦをこのヒト化又はキメラ２Ｂ８に結合させた。次に、マウス２Ｂ８又は対照抗体（ポリクロナールヤギ抗ＨＧＦ抗体）の上記捕捉ＨＧＦへの結合能を測定した。その結果、ヒト化２Ｂ８抗体及びキメラ２Ｂ８はマウス２Ｂ８がＨＧＦに結合するのを妨げた。白色棒はキメラ２Ｂ８抗体、灰色棒はヒト化Ｈｕ２Ｂ８抗体（カッパ可変領域Ｋｖ１−３９．１及び重鎖可変領域Ｈｖ５−５１．１）、黒色棒はヒト化Ｈｕ２Ｂ８抗体（カッパ可変領域Ｋｖ３−１５．１及び重鎖可変領域Ｈｖ５−５１．１）を示す。

本発明の一部は、ＨＧＦを特異的に結合し、その活性を中和する一群の結合蛋白質、特にヒトＨＧＦの発見に基づいている。こうした結合蛋白質は種々の診断的、治療的用途に使用することができる。この結合蛋白質は、ＨＧＦに結合し、その活性を中和する能力から選択された特定のモノクローナル抗体の抗原結合部位をベースとしている。具体的には、この結合蛋白質は、ＨＧＦに対する結合部位を共同して規定する免疫グロブリン可変領域ＣＤＲ配列を含有している。

こうした抗体は、その中和活性を考慮すると、ＨＧＦ反応性細胞、例えば、癌細胞の成長及び／又は増殖を調節するのに特に有用である。この結合蛋白質は、治療剤として用いる場合には、レシピエントに投与した時にこの蛋白質に対する免疫反応を誘発するリスクをできる限り少なくしたり排除することができるように設計することができる。さらに、この結合蛋白質は、特定の用途に応じて、他の成分、例えば、検出可能な標識（例えば、放射能標識）並びにエフェクタ分子（例えば、他の蛋白質及び低分子系治療剤）に結合させることができることが企図されている。本発明のこれらの特徴及び態様については、それぞれ以下でさらに詳細に論じる。
Ｉ． ＨＧＦに結合する結合蛋白質
一態様として、本発明はヒトＨＧＦに結合する単離結合蛋白質を提供する。この結合蛋白質は、（ｉ）ＣＤＲ_Ｌ１−ＣＤＲ_Ｌ２−ＣＤＲ_Ｌ３の構造を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域及び（ｉｉ）３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。この場合、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域はヒトＨＧＦに結合するための単一結合部位を共同して規定するものとする。ＣＤＲ_Ｌ１は、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２ＳｅｒＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５であって、アミノ酸Ｘ_１がＡｒｇ、Ｌｙｓ又はＳｅｒであり、Ｘ_２がＡｌａ又はＴｈｒであり、Ｘ_４がＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＳｅｒであり、Ｘ_５がＡｓｎ、Ａｓｐ又はＳｅｒであり、Ｘ_６がＩｌｅ又はＶａｌであり、Ｘ_７がＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又はＴｙｒであり、Ｘ_８がペプチド結合又はＴｙｒであり、Ｘ_９がペプチド結合又はＡｓｐであり、Ｘ_１０がペプチド結合又はＧｌｙであり、Ｘ_１１がペプチド結合又はＡｓｎであり、Ｘ_１２がペプチド結合、Ｉｌｅ又はＳｅｒであり、Ｘ_１３がＡｓｎ又はＴｙｒであり、Ｘ_１４がＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ又はＶａｌであり、Ｘ_１５がＡｌａ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ又はＳｅｒであるものとするアミノ酸配列を含む。ＣＤＲ_Ｌ２は、アミノ酸配列Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２であって、アミノ酸Ｘ_１６がＡｌａ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ又はＶａｌであり、Ｘ_１７がＡｌａ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり、Ｘ_１８がＡｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ_１９がＡｒｇ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ又はＨｉｓであり、Ｘ_２０がＬｅｕ又はＡｒｇであり、Ｘ_２１がＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ又はＰｒｏであり、Ｘ_２２がＡｓｐ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであるものとするアミノ酸配列を含む。ＣＤＲ_Ｌ３は、アミノ酸配列Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８ＰｒｏＸ_３０Ｔｈｒであって、アミノ酸Ｘ_２３がＬｅｕ、Ｇｌｙ又はＧｌｎであり、Ｘ_２４がＨｉｓ又はＧｌｎであり、Ｘ_２５がＰｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ_２６がＡｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ_２７がＧｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＳｅｒであり、Ｘ_２８がＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ又はＴｙｒであり、Ｘ_３０がＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ又はＴｙｒであるものとするアミノ酸配列を含む。

別の態様として、本発明は、（ｉ）ＣＤＲ_Ｈ１−ＣＤＲ_Ｈ２−ＣＤＲ_Ｈ３の構造を含む免疫グロブリン重鎖可変領域及び（ｉｉ）３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、ヒトＨＧＦに結合する単離結合蛋白質であって、これら免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域がヒトＨＧＦに結合するための単一結合部位を共同して規定するものとする単離結合蛋白質を提供する。ＣＤＲ_Ｈ１は、アミノ酸配列Ｘ_１ＴｙｒＸ_３Ｘ_４Ｘ_５であって、アミノ酸Ｘ_１がＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ_３がＰｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ_４がＩｌｅ、Ｌｅｕ又はＭｅｔであり、Ｘ_５がＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＳｅｒであるものとするアミノ酸配列を含む。ＣＤＲ_Ｈ２は、アミノ酸配列Ｘ_６ＩｌｅＸ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＧｌｙＸ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＴｙｒＸ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２であって、アミノ酸Ｘ_６がＬｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ又はＴｙｒであり、Ｘ_８がＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ_９がＡｌａ、Ｐｒｏ又はＳｅｒであり、Ｘ_１０がＧｌｙ又はＴｈｒであり、Ｘ_１１がペプチド結合、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ_１３がＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ又はＳｅｒであり、Ｘ_１４がＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ_１５がＡｓｎ又はＴｙｒであり、Ｘ_１７がＡｓｎ又はＰｒｏであり、Ｘ_１８がＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ又Ｓｅｒであり、Ｘ_１９がＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ又はＳｅｒであり、Ｘ_２０がＬｅｕ、Ｐｈｅ又はＶａｌであり、Ｘ_２１がＬｙｓ、Ｍｅｔ又はＧｌｎであり、Ｘ_２２がＡｓｐ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであるものとするアミノ酸配列を含む。ＣＤＲ_Ｈ３は、アミノ酸配列Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｔｙｒであって、アミノ酸Ｘ_２３がＡｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＧｌｕであり、Ｘ_２４がＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ又はＴｙｒであり、Ｘ_２５がペプチド結合、Ａｓｐ又はＧｌｙであり、Ｘ_２６がペプチド結合又はＧｌｙであり、Ｘ_２７がペプチド結合又はＴｙｒであり、Ｘ_２８がペプチド結合、Ｌｅｕ又はＴｙｒであり、Ｘ_２９がペプチド結合、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ又はＶａｌであり、Ｘ_３０がペプチド結合、Ａｓｐ、Ｇｌｙ又はＧｌｕであり、Ｘ_３１がペプチド結合、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ又はＴｙｒであり、Ｘ_３２がペプチド結合、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ又Ｔｙｒであり、Ｘ_３３がＭｅｔ又はＰｈｅであり、Ｘ_３４がＡｌａ又はＡｓｐであるものとするアミノ酸配列を含む。

上記結合蛋白質が上述の免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖の配列又はこれらの断片を共に含み得ることは理解されよう。さらに、上記結合蛋白質が完全な状態の抗体又はその抗原結合性断片或いは生合成抗体結合部位であってもよいことも理解されよう。

一部の実施態様として、上記の免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ配列はフレームワーク領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）と共に挿入されている。

一部の実施態様として、上記の免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ配列は、複数のヒト又はヒト化フレームワーク領域間に挿入されている。

別の態様として、本発明はヒトＨＧＦに特異的に結合する単離結合蛋白質を提供する。この結合蛋白質は、（ａ）ＣＤＲ_Ｌ１−ＣＤＲ_Ｌ２−ＣＤＲ_Ｌ３の構造を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域及び（ｂ）免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。この場合、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域はヒトＨＧＦに結合するための単一結合部位を共同して規定するものとする。上記ＣＤＲ_Ｌ１は、配列番号８（１Ａ３）、配列番号１８（２Ｂ８）、配列番号２８（２Ｆ８）、配列番号３８（３Ｂ６）、配列番号４８（３Ｄ１１）、配列番号５８（１Ｄ３）、配列番号６８（１Ｆ３）及び配列番号７８（３Ａ１２）からなる群から選ばれる配列を含む。上記ＣＤＲ_Ｌ２は、配列番号９（１Ａ３）、配列番号１９（２Ｂ８）、配列番号２９（２Ｆ８）、配列番号３９（３Ｂ６）、配列番号４９（３Ｄ１１）、配列番号５９（１Ｄ３）、配列番号６９（１Ｆ３）、配列番号７９（３Ａ１２）及び配列番号２０６（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ）からなる群から選ばれる配列を含む。上記ＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号１０（１Ａ３）、配列番号２０（２Ｂ８）、配列番号３０（２Ｆ８）、配列番号４０（３Ｂ６）、配列番号５０（３Ｄ１１）、配列番号６０（１Ｄ３）、配列番号７０（１Ｆ３）及び配列番号８０（３Ａ１２）からなる群から選ばれる配列を含む。本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じて、特定の配列番号により示した配列の後に続けて、その特定の配列が由来する抗体を括弧内に示した。例えば、配列番号８（１Ａ３）は、配列番号８の配列が抗体１Ａ３に存在する配列に基づいていることを意味している。

一実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号８（１Ａ３）の配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号９（１Ａ３）の配列を含むＣＤＲ_Ｌ２及び配列番号１０（１Ａ３）を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号１８（２Ｂ８）の配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号１９（２Ｂ８）又は配列番号２０６（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ）の配列を含むＣＤＲ_Ｌ２及び配列番号２０（２Ｂ８）を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号２８（２Ｆ８）の配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号２９（２Ｆ８）の配列を含むＣＤＲ_Ｌ２及び配列番号３０（２Ｆ８）を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号３８（３Ｂ６）の配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号３９（３Ｂ６）配列を含むＣＤＲ_Ｌ２及び配列番号４０（３Ｂ６）を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号４８（３Ｄ１１）の配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号４９（３Ｄ１１）配列を含むＣＤＲ_Ｌ２及び配列番号５０（３Ｄ１１）を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号５８（１Ｄ３）の配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号５９（１Ｄ３）配列を含むＣＤＲ_Ｌ２及び配列番号６０（１Ｄ３）を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号６８（１Ｆ３）の配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号６９（１Ｆ３）配列を含むＣＤＲ_Ｌ２及び配列番号７０（１Ｆ３）を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号７８（３Ａ１２）の配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号７９（３Ａ１２）配列を含むＣＤＲ_Ｌ２及び配列番号８０（３Ａ１２）を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

前記の各実施態様において、ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２及びＣＤＲ_Ｌ３の配列は、ヒト又はヒト化免疫グロブリンのＦＲ間に挿入されていることが好ましい。上記結合蛋白質を完全な状態の抗体又はその抗原結合性断片或いは生合成抗体結合部位とすることができることは理解されよう。

別の態様として、本発明はヒトＨＧＦに結合する単離結合蛋白質を提供する。この結合蛋白質は、(ａ)ＣＤＲ_Ｈ１−ＣＤＲ_Ｈ２−ＣＤＲ_Ｈ３の構造を含む免疫グロブリン重鎖可変領域及び（ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変領域を含有する。この場合、これら免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒトＨＧＦに結合するための単一結合部位を共同して規定するものとする。上記ＣＤＲ_Ｈ１は、配列番号５（１Ａ３）、配列番号１５（２Ｂ８）、配列番号２５（２Ｆ８）、配列番号３５（３Ｂ６）、配列番号４５（３Ｄ１１）、配列番号５５（１Ｄ３）、配列番号６５（１Ｆ３）及び配列番号７５（３Ａ１２）からなる群から選ばれる配列を含み、上記ＣＤＲ_Ｈ２は、配列番号６（１Ａ３）、配列番号１６（２Ｂ８）、配列番号２６（２Ｆ８）、配列番号３６（３Ｂ６）、配列番号４６（３Ｄ１１）、配列番号５６（１Ｄ３）、配列番号６６（１Ｆ３）、配列番号７６（３Ａ１２）、配列番号２０２（Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ１ｆ．１）、配列番号２０３（Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５ａ．１又はＨｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１）、配列番号２０４（ＬＲ２Ｂ８ＨＣ）及び配列番号２０５（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣ）からなる群から選ばれる配列を含み、上記ＣＤＲ_Ｈ３は、配列番号７（１Ａ３）、配列番号１７（２Ｂ８）、配列番号２７（２Ｆ８）、配列番号３７（３Ｂ６）、配列番号４７（３Ｄ１１）、配列番号５７（１Ｄ３）、配列番号６７（１Ｆ３）及び配列番号７７（３Ａ１２）からなる群から選ばれる配列を含む。

一実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号５（１Ａ３）の配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号６（１Ａ３）の配列を含むＣＤＲ_Ｈ２及び配列番号７（１Ａ３）を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号１５（２Ｂ８）の配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号１６（２Ｂ８）、配列番号２０２（Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ１ｆ．１）、配列番号２０３（Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５ａ．１又はＨｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１）、配列番号２０４（ＬＲ２Ｂ８ＨＣ）又は配列番号２０５（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣ）の配列を含むＣＤＲ_Ｈ２及び配列番号１７（２Ｂ８）を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号２５（２Ｆ８）の配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号２６（２Ｆ８）の配列を含むＣＤＲ_Ｈ２及び配列番号２７（２Ｆ８）を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号３５（３Ｂ６）の配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号３６（３Ｂ６）配列を含むＣＤＲ_Ｈ２及び配列番号３７（３Ｂ６）を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号４５（３Ｄ１１）の配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号４６（３Ｄ１１）配列を含むＣＤＲ_Ｈ２及び配列番号４７（３Ｄ１１）を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号５５（１Ｄ３）の配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号５６（１Ｄ３）配列を含むＣＤＲ_Ｈ２及び配列番号５７（１Ｄ３）を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号６５（１Ｆ３）の配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号６６（１Ｆ３）配列を含むＣＤＲ_Ｈ２及び配列番号６７（１Ｆ３）を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号７５（３Ａ１２）の配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号７６（３Ａ１２）配列を含むＣＤＲ_Ｈ２及び配列番号７７（３Ａ１２）を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。

前記の各実施態様において、ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２及びＣＤＲ_Ｈ３の配列は、ヒト又はヒト化免疫グロブリンのＦＲ間に挿入されていることが好ましい。上記結合蛋白質を完全な状態の抗体又はその抗原結合性断片或いは生合成抗体結合部位とすることができることは理解されよう。

別の態様として、本発明はヒトＨＧＦに結合する結合蛋白質を提供する。この結合蛋白質は、配列番号２（１Ａ３）の２０乃至１４１番目残基、配列番号１２（２Ｂ８）の２０乃至１３７番目残基、配列番号２２（２Ｆ８）の２０乃至１３７番目残基、配列番号３２（３Ｂ６）の２０乃至１３９番目残基、配列番号４２（３Ｄ１１）の２０乃至１３２番目残基、配列番号５２（１Ｄ３）の２０乃至１４１番目残基、配列番号６２（１Ｆ３）の２０乃至１４１番目残基及び配列番号７２（３Ａ１２）の２０乃至１４１番目残基からなる群から選ばれる免疫グロブリン重鎖可変領域、並びに配列番号４（１Ａ３）の２１乃至１２７番目残基、配列番号１４（２Ｂ８）の２１乃至１２７番目残基、配列番号２４（２Ｆ８）の２０乃至１３１番目残基、配列番号３４（３Ｂ６）の２３乃至１２９番目残基、配列番号４４（３Ｄ１１）の２３乃至１２８番目残基、配列番号５４（１Ｄ３）の２１乃至１２７番目残基、配列番号６４（１Ｆ３）の２１乃至１２７番目残基及び配列番号７４（３Ａ１２）の２１乃至１２７番目残基からなる群から選ばれる免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号２（１Ａ３）の２０乃至１４１番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域及び配列番号４（１Ａ３）の２１乃至１２７番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

一実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号１２（２Ｂ８）の２０乃至１３７番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域及び配列番号１４（２Ｂ８）の２１乃至１２７番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号２２（２Ｆ８）の２０乃至１３７番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域及び配列番号２４（２Ｆ８）の２０乃至１３１番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号３２（３Ｂ６）の２０乃至１３９番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域及び配列番号３４（３Ｂ６）の２３乃至１２９番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号４２（３Ｄ１１）の２０乃至１３２番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域及び配列番号４４（３Ｄ１１）の２３乃至１２８番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号５２（１Ｄ３）の２０乃至１４１番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域及び配列番号５４（１Ｄ３）の２１乃至１２７番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号６２（１Ｆ３）の２０乃至１４１番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域及び配列番号６４（１Ｆ３）の２１乃至１２７番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号７２（３Ａ１２）の２０乃至１４１番目残基のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域及び配列番号７４（３Ａ１２）の２１乃至１２７番目の残基アミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

前記の各実施態様において、結合蛋白質は完全な状態の抗体又はその抗原結合性断片或いは生合成抗体結合部位とすることができる。

別の態様として、本発明はヒトＨＧＦに結合する単離結合蛋白質を提供する。この結合蛋白質は、（ｉ）配列番号１７３（Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ１−３９．１軽鎖可変領域）、配列番号１７９（Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ３−１５．１軽鎖可変領域）、配列番号１９３（ＬＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域）及び配列番号１９９（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域）からなる群から選ばれる免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに（ｉｉ）配列番号１５９（Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ１ｆ．１重鎖可変領域）、配列番号１６５（Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５ａ．１重鎖可変領域）、配列番号１６９（Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１重鎖可変領域）、配列番号１８３（ＬＲ２Ｂ８ＨＣ重鎖可変領域）及び配列番号１８９（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域）からなる群から選ばれる免疫グロブリン重鎖可変領域を含有する。上記結合蛋白質は、完全な状態の抗体又はその抗原結合性断片或いは生合成抗体結合部位とすることができる。

別の態様として、本発明はヒトＨＧＦに結合する単離結合蛋白質を提供する。この結合蛋白質は、（ｉ）配列番号１７７（Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ１−３９．１＋カッパ定常（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子２））、配列番号１８１（Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ３−１５．１＋カッパ定常（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子２））、配列番号１９７（ＬＲ２Ｂ８ＬＣ＋カッパ定常（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子１））及び配列番号２０１（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ＋カッパ定常（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子１））からなる群から選ばれる免疫グロブリン軽鎖、並びに（ｉｉ）配列番号１６３（Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ１ｆ．１＋ＩｇＧ１定常（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ））、配列番号１６７（Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５ａ．１＋ＩｇＧ１定常領域（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ））、配列番号１７１（Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１＋ＩｇＧ１定常（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ））、配列番号１８７（ＬＲ２Ｂ８ＨＣ＋ＩｇＧ１定常（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１））及び配列番号１９１（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣ＋ＩｇＧ１定常（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１））からなる群から選ばれる免疫グロブリン重鎖を含む。上記結合蛋白質は、完全な状態の抗体又はその抗原結合性断片或いは生合成抗体結合部位とすることができる。

別の態様として、本発明は還元型ヒトＨＧＦに結合する単離結合蛋白質を提供する。この結合蛋白質は、（ｉ）３箇所のＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域及び（ｉｉ）３箇所のＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。これらのＣＤＲは、通常ＦＲ間に挿入される。免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖のＣＤＲは、還元型ヒトＨＧＦ、例えば、還元型ＨＧＦのα鎖に結合する結合部位を共同して規定する。還元型ＨＧＦとは、α鎖とβ鎖との間のジスルフィド結合を還元するのに十分な量の還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ：ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、２−メルカプトエタノール又はグルタチオンで処理したＨＧＦのことをいう。典型的な濃度としては、例えば、１００ｍＭのＤＴＴ及び５％の２−メルカプトエタノールが挙げられる。

一部の実施態様として、上記結合蛋白質は、ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２及びＣＤＲ_Ｌ３からなる群から選ばれる少なくとも１つのＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。上記結合蛋白質は、任意選択的に、２つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ_Ｌ１とＣＤＲ_Ｌ２又はＣＤＲ_Ｌ１とＣＤＲ_Ｌ３又はＣＤＲ_Ｌ１とＣＤＲ_Ｌ３を含む。上記結合蛋白質は、任意選択的に、３つのＣＤＲの全て、即ち、ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２及びＣＤＲ_Ｌ３を含む。ＣＤＲ_Ｌ１は、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２ＳｅｒＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５であって、アミノ酸Ｘ_１がＡｒｇ又はＬｙｓであり、Ｘ_２がＡｌａ又はＴｈｒであり、Ｘ_４がＧｌｕ又はＧｌｎであり、Ｘ_５がＡｓｎ、Ｓｅｒ又はＡｓｐであり、Ｘ_６がＩｌｅ又はＶａｌであり、Ｘ_７がＴｙｒ、Ａｓｐ又はＬｙｓであり、Ｘ_８がペプチド結合又はＴｙｒであり、Ｘ_９がペプチド結合又はＡｓｐであり、Ｘ_１０がペプチド結合又はＧｌｙであり、Ｘ_１１がペプチド結合又はＡｓｎであり、Ｘ_１２がペプチド結合又はＳｅｒであり、Ｘ_１３がＡｓｎ又はＴｙｒであり、Ｘ_１４がＩｌｅ又はＬｅｕであり、Ｘ_１５がＡｌａ、Ａｓｎ又はＳｅｒであるものとする配列を含む。ＣＤＲ_Ｌ２は、アミノ酸配列Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９ＬｅｕＸ_２１Ｘ_２２であって、アミノ酸Ｘ_１６がＡｌａ、Ａｓｐ、Ｖａｌ又はＡｒｇであり、Ｘ_１７がＡｌａ又はＶａｌであり、Ｘ_１８がＡｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ_１９がＡｒｇ、Ａｓｎ又はＨｉｓであり、Ｘ_２１がＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ又はＰｒｏであり、Ｘ_２２がＡｓｐ又はＳｅｒであるものとする配列を含む。ＣＤＲ_Ｌ３は、アミノ酸配列Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８ＰｒｏＸ_３０Ｔｈｒであって、アミノ酸Ｘ_２３がＬｅｕ又はＧｌｎであり、Ｘ_２４がＨｉｓ又はＧｌｎであり、Ｘ_２５がＰｈｅ、Ｓｅｒ又はＴｙｒであり、Ｘ_２６がＡｓｐ、Ｉｌｅ又はＴｒｐであり、Ｘ_２７がＧｌｙ又はＧｌｕであり、Ｘ_２８がＡｓｐ、Ｐｈｅ又はＴｈｒであり、Ｘ_３０がＰｈｅ、Ｐｒｏ又はＴｙｒであるものとする配列を含む。

別の実施態様として、上記結合蛋白質は、ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２及びＣＤＲ_Ｈ３からなる群から選ばれる少なくとも１つのＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。上記結合蛋白質は、任意選択的に、２つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ_Ｈ１とＣＤＲ_Ｈ２又はＣＤＲ_Ｈ１とＣＤＲ_Ｈ３又はＣＤＲ_Ｈ１とＣＤＲ_Ｈ３を含む。上記結合蛋白質は、任意選択的に、３つのＣＤＲの全て、即ち、ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２及びＣＤＲ_Ｈ３を含む。ＣＤＲ_Ｈ１は、アミノ酸配列Ｘ_１ＴｙｒＸ_３Ｘ_４Ｘ_５であって、アミノ酸Ｘ_１がＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ_３がＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、Ｘ_４がＩｌｅ又はＭｅｔであり、Ｘ_５がＡｓｎ、Ｈｉｓ又はＳｅｒであるものとする配列を含む。ＣＤＲ_Ｈ２は、アミノ酸配列Ｘ_６ＩｌｅＸ_８Ｘ_９ＧｌｙＸ_１１ＧｌｙＸ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５ＴｙｒＸ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０ＬｙｓＸ_２２であって、アミノ酸Ｘ_６がＬｙｓ、Ｇｌｎ又はＴｙｒであり、Ｘ_８がＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＴｙｒであり、Ｘ_９がＰｒｏ又はＳｅｒであり、Ｘ_１１がＡｓｐ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ_１３がＡｓｐ又はＳｅｒであり、Ｘ_１４がＳｅｒ又はＴｈｒであり、Ｘ_１５がＡｓｎ又はＴｙｒであり、Ｘ_１７がＡｓｎ又はＰｒｏであり、Ｘ_１８がＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ又はＧｌｕであり、Ｘ_１９がＡｓｎ、Ｍｅｔ又はＳｅｒであり、Ｘ_２０がＰｈｅ又はＶａｌであり、Ｘ_２２がＡｓｐ又はＧｌｙであるものとする配列を含む。ＣＤＲ_Ｈ３は、アミノ酸配列Ｘ_２３Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３ＡｓｐＴｙｒであって、アミノ酸Ｘ_２３がＡｒｇ又はＧｌｎであり、Ｘ_２４がＧｌｙ又はＬｅｕであり、Ｘ_２５がＡｓｐ、Ｇｌｙ又はペプチド結合であり、Ｘ_２６がＧｌｙ又はペプチド結合であり、Ｘ_２７がペプチド結合又はＴｙｒであり、Ｘ_２８がＬｅｕ、ペプチド結合又はＴｙｒであり、Ｘ_２９がＧｌｙ、Ａｒｇ又はＬｅｕであり、Ｘ_３０がＡｓｐ、Ｇｌｙ又はＧｌｕであり、Ｘ_３１がＴｙｒ、Ａｒｇ又はＡｓｎであり、Ｘ_３２がＡｌａ、Ｇｌｙ又はＴｙｒであり、Ｘ_３３がＭｅｔ又はＰｈｅであるものとする配列を含む。

上記結合蛋白質が上述の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の配列又はこれらの断片を含有し得ることは理解されよう。さらに、上記結合蛋白質は完全な状態の抗体又はその抗原結合性断片或いは生合成抗体結合部位とすることができることも理解されよう。

一部の実施態様として、上記結合蛋白質は、（ｉ）配列番号８（１Ａ３）、配列番号２８（２Ｆ８）、配列番号３８（３Ｂ６）、配列番号５８（１Ｄ３）及び配列番号６８（１Ｆ３）からなる群から選ばれる配列を有するＣＤＲ_Ｌ１、（ｉｉ）配列番号９（１Ａ３）、配列番号２９（２Ｆ８）、配列番号３９（３Ｂ６）、配列番号５９（１Ｄ３）及び配列番号６９（１Ｆ３）からなる群から選ばれる配列を有するＣＤＲ_Ｌ２並びに（ｉｉｉ）配列番号１０（１Ａ３）、配列番号３０（２Ｆ８）、配列番号４０（３Ｂ６）、配列番号６０（１Ｄ３）及び配列番号７０（１Ｆ３）からなる群から選ばれる配列を有するＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。これらのＣＤＲ配列はヒト又はヒト化ＦＲ間に挿入されていてもよい。他の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号４（１Ａ３）の２１乃至１２７番目残基、配列番号２４（２Ｆ８）の２０乃至１３１番目残基、配列番号３４（３Ｂ６）の２３乃至１２９番目残基、配列番号５４（１Ｄ３）の２１乃至１２７番目残基及び配列番号６４（１Ｆ３）の２１乃至１２７番目残基からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

一部の実施態様として、上記結合蛋白質は、（ｉ）配列番号５（１Ａ３）、配列番号２５（２Ｆ８）、配列番号３５（３Ｂ６）、配列番号５５（１Ｄ３）及び配列番号６５（１Ｆ３）からなる群から選ばれる配列を有するＣＤＲ_Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６（１Ａ３）、配列番号２６（２Ｆ８）、配列番号３６（３Ｂ６）、配列番号５６（１Ｄ３）及び配列番号６６（１Ｆ３）からなる群から選ばれる配列を有するＣＤＲ_Ｈ２並びに（ｉｉｉ）配列番号７（１Ａ３）、配列番号２７（２Ｆ８）、配列番号３７（３Ｂ６）、配列番号５７（１Ｄ３）及び配列番号６７（１Ｆ３）からなる群から選ばれる配列を有するＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。これらのＣＤＲ配列はヒト又はヒト化ＦＲ間に挿入されていてもよい。別の実施態様として、この免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号２（１Ａ３）の２０乃至１４１番目残基、配列番号２２（２Ｆ８）の２０乃至１３７番目残基、配列番号３２（３Ｂ６）の２０乃至１３９番目残基、配列番号５２（１Ｄ３）の２０乃至１４１番目残基及び配列番号６２（１Ｆ３）の２０乃至１４１番目残基からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含有する。

別の態様として、本発明は、ヒトＨＧＦに結合し、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を含む単離結合蛋白質を提供する。この単離結合蛋白質は、（ｉ）配列番号２４（２Ｆ８）の２０乃至１３１番目残基の免疫グロブリン軽鎖可変領域及び配列番号２２（２Ｆ８）の２０乃至１３７番目残基の免疫グロブリン重鎖可変領域を有する抗体、（ｉｉ）配列番号３４（３Ｂ６）の２３乃至１２９番目残基の免疫グロブリン軽鎖可変領域及び配列番号３２（３Ｂ６）の２０乃至１３９番目残基の免疫グロブリン重鎖可変領域を有する抗体、並びに（ｉｉｉ）配列番号４４（３Ｄ１１）の２３乃至１２８番目残基の免疫グロブリン軽鎖可変領域及び配列番号４２（３Ｄ１１）の２０乃至１３２番目残基の免疫グロブリン重鎖可変領域を有する抗体からなる群から選ばれる少なくとも１種の対照抗体と、ＨＧＦへの結合に対して競合する。ある状況では、この結合蛋白質はこれらの対照抗体のうちの１種と同じＨＧＦの抗原決定基に結合する。

上述の各結合蛋白質が完全な状態の抗体、例えばモノクローナル抗体であってもよいことは理解されよう。或いは、上記結合蛋白質は、抗体の抗原結合性断片であってもよく、又は生合成抗体結合部位であってもよい。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）_２又はＦｖ断片が挙げられる。このような抗体断片を作製するための技術は当業者に周知である。多くの生合成抗体結合部位が当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，４７６，７８６号明細書に記載されている単一Ｆｖ又はｓＦｖ分子が挙げられる。他の生合成抗体結合部位としては、二重特異性又は二機能性結合蛋白質、例えば、二重特異性又は二機能性抗体が挙げられ、これらは少なくとも２種の異なる抗原に結合する抗体又は抗体断片である。例えば、二重特異性結合蛋白質はＨＧＦ、例えばヒトＨＧＦと別の対象とする抗原とに結合することができる。二重特異性抗体を作製するための方法は当該技術分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマを融合させる方法又はＦａｂ’断片を連結させる方法が挙げられる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０年） ＣＬＩＮ． Ｅｘｐ． ＩＭＭＵＮＯＬ． ７９：ｐ．３１５−３２５及びＫｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２年） Ｊ． ＩＭＭＵＮＯＬ． １４８：ｐ．１５４７−１５５３を参照されたい。

本発明の結合蛋白質は、５６１番目の位置にシステインからアルギニンへの置換及び５５５番目の位置にグリシンからグルタメートへの置換を含むｈＨＧＦに結合することができる。

別の態様として、本発明は、４．０×１０^−５ｓ^−１以下、３．０×１０^−５ｓ^−１以下又は２．０×１０^−５ｓ^−１以下のＫｄでヒトＨＧＦに結合する単離結合蛋白質を提供する。これらの単離結合蛋白質は、５．０×１０^−５ｓ^−１乃至０．５×１０^−５ｓ^−１又は４．０×１０^−５ｓ^−１乃至１．０×１０^−５ｓ^−１又は３．０×１０^−５ｓ^−１乃至１．５×１０^−５ｓ^−１のＫｄでヒトＨＧＦに結合することができる。別の態様として、本発明は、１００ｐＭ以下又は２０ｐＭ以下又は１０ｐＭ以下又は５ｐＭ以下のＫ_ＤでヒトＨＧＦに結合する単離結合蛋白質を提供する。これらの単離結合蛋白質は、１００ｐＭ乃至５ｐＭ又は２０ｐＭ乃至５ｐＭ又は１５ｐＭ乃至１０ｐＭ又は２０ｐＭ乃至１０ｐＭ乃至１５ｐＭ乃至５ｐＭのＫ_ＤでヒトＨＧＦに結合することができる。特に明記しない限り、Ｋ_Ｄ値は実施例６に記載した方法及び条件下で測定する。

別の態様として、本発明は、ヒトＨＧＦに結合する単離結合蛋白質であって、この抗体が２５℃よりも３７℃でより低いＫｄでヒトＨＧＦに結合するものとする結合蛋白質を提供する。この結合蛋白質結合は、任意選択的に、３７℃において５ｐＭ未満のＫｄでヒトＨＧＦに結合する。

他の態様及び実施態様として、上記結合蛋白質は、ｈＨＧＦがｃ−Ｍｅｔに結合するのを阻害することができる。例えば、上記結合蛋白質のＩＣ_５０（最大阻害の５０％を来す濃度）は、実施例７（ａ）に記載したプロトコルを用いて測定した場合、少なくとも約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５及び７．０ｎＭとすることができる。一部の他の実施態様として、上記結合蛋白質は、実施例７（ｂ）に記載した方法を用いて４ＭＢｒ−５細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ２０８）におけるＨＧＦ ＢｒｄＵの取り込みを中和することができる。

上記結合蛋白質のＩＣ_５０は、実施例７（ｂ）に記載したプロトコルを用いて測定した場合、５０ｎＭ以下、好ましくは、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、１又は０．５ｎＭ以下である。一部の他の実施態様として、上記結合蛋白質を用いて、実施例９に記載した測定法によるＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア州、カタログ番号ＣＣＬ１４３５）のＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化を抑制することができる。上記結合蛋白質は、実施例９に記載した測定法によるＰＣ−３細胞におけるＨＧＦ刺激（１．２５ｎＭ）ｃ−Ｍｅｔリン酸化を２ｎＭ以下のＩＣ_５０（表８）で抑制する。
ＩＩ．結合蛋白質の作製
本発明の結合蛋白質は、当該技術分野で周知の手法を用いる種々の方法で作製することができる。例えば、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードしているＤＮＡ分子は、市販の合成機及び本明細書に示した配列情報を用いて、化学的に合成することができる。このような合成ＤＮＡ分子を、例えば、定常領域コード配列、発現制御配列などの他の適切なヌクレオチド配列に結合させて所望の結合蛋白質をコードしている通常の遺伝子発現構築物を作製することができる。特定の遺伝子構築物の作製は当該技術分野では日常的な技術の範囲内にある。或いは、本明細書に示した配列は、本明細書に示した配列情報、又はハイブリドーマ細胞中のマウス抗体の重及び軽鎖をコードしている遺伝子に関する従来技術の配列情報に基づいた配列を有する合成核酸プローブを用いて、通常のハイブリダイゼーション技術又はＰＣＲ技術によりハイブリドーマからクローニングすることができる。このようなプローブの作製及び使用法は、当該技術分野では日常的な技術の範囲内にある。

この所望の結合蛋白質をコードしている核酸を発現ベクター中に導入（結合）して、これを、当該技術分野で周知の標準的な形質移入又は形質転換技術により宿主細胞中に導入することができる。典型的な宿主細胞としては、例えば、大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞、仔ハムスター腎（ＢＨＫ：ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）及び普通なら免疫グロブリンを産生しない骨髄腫細胞が挙げられる。形質移入させた宿主細胞は、この宿主細胞が対象とする遺伝子、例えば免疫グロブリン軽又は重鎖可変領域をコードしている遺伝子を発現するのを可能にする条件下で増殖させることができる。得られる発現産物は当該技術分野で周知の技術を用いて採取することができる。

特定の発現及び精製条件は、どんな発現系を用いるかによって異なるであろう。例えば、上記遺伝子を大腸菌で発現させる場合にはこれを先ず発現ベクター中にクローニングする。これは、好適な細菌プロモーター（例えばＴｒｐ又はＴａｃ）及びシグナル配列（例えばプロテインＡのフラグメントＢ（ＦＢ）をコードしている配列）よりも下流に上記の設計遺伝子を配置することによって達成される。得られる発現融合蛋白質は、通常、細胞細胞質中の屈折体又は封入体に蓄積するので、フレンチプレス又は音波処理により細胞を破壊して採取することができる。次に、この屈折体を可溶化し、多くの他の組換え蛋白質について既に確立されている方法により発現蛋白質をリフォールディングし、切断する。

上記設計遺伝子を真核宿主細胞、例えば骨髄腫細胞又はＣＨＯ細胞で発現させる場合には、先ず、これを、好適な真核生物プロモータ、分泌シグナル、免疫グロブリンエンハンサ及び各種イントロンを含有する発現ベクター中に挿入する。この発現ベクターには、任意選択的に定常領域の全て又は一部をコードしている配列を含有させることができ、これによって重又は軽鎖の全体又は一部の発現が可能となる。上記遺伝子構築物は、確立されている形質移入プロトコルを用いて骨髄腫細胞又はＣＨＯ細胞中に形質移入することができる。このような形質移入細胞は、Ｖ_Ｌ又はＶ_Ｈ断片、Ｖ_Ｌ−Ｖ_Ｈヘテロ二量体、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ又はＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ一本鎖ポリペプチド、完全な免疫グロブリン重又は軽鎖、或いはこれらの部分を発現することができ、これらは、それぞれ別の機能（例えば、細胞毒性）を有する蛋白質ドメインに結合させてもよい。
ＩＩＩ． 結合蛋白質に対する修飾
上記結合蛋白質を修飾してこの結合蛋白質の目的とする用途に応じて性能を最適化することができることは理解されよう。例えば、結合蛋白質を治療剤として用いようとする場合、この結合蛋白質を修飾して対象レシピエントにおける免疫原性を低減することができる。或いは、又はさらに、結合蛋白質を別の蛋白質又はペプチド、例えば、成長因子、サイトカインもしくは細胞毒と融合又は結合させることができる。このような修飾は、当該技術分野で周知の通常の遺伝子操作技術を用いることで達成することができる。

抗体及び抗体断片の抗原性を低減させるための種々の技術が当該技術分野において周知である。これらの技術を用いて本発明の結合蛋白質の抗原性を低減又は除去することができる。例えば、上記結合蛋白質をヒトに投与しようとする場合、この結合蛋白質を改良してヒトにおけるその抗原性を低減させることが好ましい。このプロセスをヒト化と呼ぶことが多いが、このヒト化結合蛋白質は、それが由来する元の非ヒト化結合蛋白質と抗原に対する親和性が同じか実質的に同じであることが好ましい。

ヒト化のための公知の一方法では、ある種、例えばマウスからの抗体の免疫グロブリン定常領域を別の異なる種、例えばヒトからの免疫グロブリン定常領域で置換したキメラ蛋白質を作製する。この例では、得られる抗体はマウス−ヒトキメラであり、このキメラのヒト定常領域の配列は、原理的に、対応するマウスの配列よりも免疫原性が少ない。この種の抗体改良については、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８４年） ＰＲＯＣ．ＮＡＴ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．８１：ｐ．６８５１−６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４年）ＮＡＴＵＲＥ ３１２：ｐ．６０４−６０８、並びに米国特許第６，８９３，６２５号明細書（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）、同第５，５００，３６２号明細書（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）及び同第４，８１６，５６７号明細書（Ｃａｂｉｌｌｙ）に記載されている。

ＣＤＲ移植と呼ばれる別の方法では、対象とする抗体の軽及び重鎖可変領域のＣＤＲを別の種からのフレームワーク（ＦＲ）中に移植する。例えば、マウスＣＤＲをヒトＦＲ配列中に移植することができる。一部の実施態様として、抗ＨＧＦ抗体の軽及び重鎖可変領域のＣＤＲをヒトＦＲ又はコンセンサスヒトＦＲ中に移植する。コンセンサスヒトＦＲを作製するためには、いく種かのヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列からのＦＲを整列させてコンセンサスアミノ酸配列を特定する。ＣＤＲ移植については、例えば、米国特許第７，０２２，５００号明細書（Ｑｕｅｅｎ）、同第６，９８２，３２１号明細書（Ｗｉｎｔｅｒ）、同第６，１８０，３７０号明細書（Ｑｕｅｅｎ）、同第６，０５４，２９７号明細書（Ｃａｒｔｅｒ）、同第５，６９３，７６２号明細書（Ｑｕｅｅｎ）、同第５，８５９，２０５号明細書（Ａｄａｉｒ）、同第５，６９３，７６１号明細書（Ｑｕｅｅｎ）、同第５，５６５，３３２号明細書（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）、同第５，５８５，０８９号明細書（Ｑｕｅｅｎ）及び同第５，５３０，１０１号明細書（Ｑｕｅｅｎ）、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６年）ＮＡＴＵＲＥ ３２１：ｐ．５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８年）ＮＡＴＵＲＥ ３３２：ｐ．３２３−３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８年）ＳＣＩＥＮＣＥ ２３９：ｐ．１５３４−１５３６並びにＷｉｎｔｅｒ（１９９８年）ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ ４３０：ｐ．９２−９４に記載されている。

「超ヒト化」と呼ばれる方法では、ヒトにおける免疫原性が低減又は除去されている抗体を別のタイプの移植によって作製する。超ヒト化法では、ヒトＣＤＲのヒト化対象マウス抗体のＣＤＲに対する構造的類似性に基づいて一組のヒト生殖細胞遺伝子からヒトＦＲ配列を選択する。この方法については、例えば、米国特許第６，８８１，５５７号明細書（Ｆｏｏｔｅ）及びＴａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２年）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ １６９：ｐ．１１１９−１１２５に記載されている。

免疫原性を低減する他の方法としては、ヒト化抗体を作製するための「再成形（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」、「超キメラ化」又は「ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）／再表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」と呼ばれる技術が挙げられる。例えば、Ｖａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８年） ＡＮＮＡＬＳ ＯＦ ＡＬＬＥＲＧＹ， ＡＳＴＨＭＡ， ＆ ＩＭＭＵＮＯＬ． ８１：ｐ．１０５、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９６年） ＰＲＯＴ． ＥＮＧＩＮＥＥＲ ９：ｐ．８９５−９０４及び米国特許第６，０７２，０３５号明細書（Ｈａｒｄｍａｎ）を参照されたい。ベニア化／再表面化法では、マウス抗体の表面接近可能アミノ酸残基をヒト抗体の同一位置により多くみられるアミノ酸残基によって置換する。このタイプの抗体再表面化については、例えば、米国特許第５，６３９，６４１号明細書（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）に記載されている。

マウス抗体をヒトにおける医学的用途に好適な構造に変換するための１つの典型的な方法は、ＡＣＴＩＶＭＡＢ（商標）技術（Ｖａｃｃｉｎｅｘ社、ロチェスター、ニューヨーク州）と呼ばれ、これは哺乳動物細胞で抗体を発現させるためのワクシニアウイルス系ベクターを必要とする。免疫グロブリン重及び軽鎖の高レベルの組み合わせ多様性がもたらされると言われている。例えば、米国特許第６，７０６，４７７号明細書（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）、同第６，８００，４４２号明細書（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）及び同第６，８７２，５１８号明細書（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）を参照されたい。

マウス抗体をヒトにおける用途に好適な構造に変換するための別の典型的な方法は、カロビオス・ファーマシューティカルズ社（ＫａｌｏＢｉｏｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．）（パロアルト、カリフォルニア州）により商業的に実施されている技術である。この技術は、特許権のあるヒト「アクセプター」ライブラリを用いて抗体選択用の「抗原決定基に焦点を合わせた」ライブラリを作製するものである。

マウス抗体をヒトにおける医学的用途に好適な構造に修飾するための別の典型的な方法は、ＸＯＭＡ（米国）ＬＬＣ社によって商業的に実施されているＨＵＭＡＮ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ）（商標）（ＨＥ（商標））技術である。例えば、国際公開第９３／１１７９４号パンフレット並びに米国特許第５，７６６，８８６号明細書、同第５，７７０，１９６号明細書、同第５，８２１，１２３号明細書及び同第５，８６９，６１９号明細書を参照されたい。

上記方法のいずれかを含む任意の適切な方法を用いて対象とする結合蛋白質のヒト免疫原性を低減又は除去することができる。

さらに、マウスにおいて完全にヒト型の抗体を作製することが可能である。この方法では、マウスの抗体産生遺伝子がヒト抗体産生遺伝子の実質的な部分で置換されている遺伝子導入マウスを用いてヒト型抗体を調製する。このようなマウスは、マウスの免疫グロブリン分子ではなく、ヒト型の免疫グロブリンを産生する。例えば、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット（Ｊａｃｏｂｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．）及びＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ． （１９９７年） ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ １５：ｐ．１４６−１５６を参照されたい。完全にヒト型の抗ＨＧＦモノクローナル抗体は、以下の方法を用いて作製することができる。ヒト型免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスを対象とする抗原、例えばＨＧＦで免疫する。次いで、このマウスからマウスのリンパ細胞を得、これを脊髄系細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製する。このハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、ＨＧＦに特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定するための選択を行う。

本発明の結合蛋白質は、その目的とする用途に応じて他の分子と結合させることができる。例えば、結合蛋白質を治療剤として用いようとする場合、この結合蛋白質を別の作用物質、例えば、その治療を調節するか、それとも促進するエフェクター分子と結合させることができる。このエフェクターが非蛋白質系の作用物質、例えば、低分子薬剤、放射標識又は毒素である限り、この物質を標準的なインビトロ結合化学反応を用いて結合蛋白質に化学的に結合させることができる。一方、エフェクター分子が蛋白質又はペプチド、例えば、酵素、受容体、毒素、成長因子、サイトカイン又は他の免疫調節因子である場合、結合蛋白質は、インビトロ結合化学反応を用いてこのエフェクターに化学的に結合させることができ、或いは、融合蛋白質としてこのエフェクターに結合させることができる。融合蛋白質は、セクションＩＩに記載したのと同様な技術を用いて構築し、発現させることができる。
ＩＶ． 結合蛋白質の用途
本明細書に記載した結合蛋白質は、診断剤又は治療剤として用いることができる。

（１）治療的用途
本発明の結合蛋白質は、ＨＧＦの活性を中和するので、種々の治療的用途に用いることができる。例えば、本発明の結合蛋白質の一部は、過剰増殖性疾病又は疾患、例えば、各種形態の癌の予防又は治療に有用である。

上記結合蛋白質を用いることにより腫瘍細胞の増殖を抑制又は低減させることができる。このような方法では、腫瘍細胞に対して治療的有効量の上記結合蛋白質を作用させることによって腫瘍細胞の増殖を抑制又は低減させる。一部の実施態様として、上記結合蛋白質は、腫瘍細胞の増殖を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％抑制する。

一部の実施態様として、上記結合蛋白質を用いることにより、結合蛋白質がｈＨＧＦのｃ−Ｍｅｔへの結合能を低減させることで腫瘍細胞の増殖を抑制又は低減させる。他の実施態様として、上記結合蛋白質を用いることにより、表５及び６において抗体３Ｂ６が示すように、この結合蛋白質がｈＨＧＦに結合するが、ｈＨＧＦのｃ−Ｍｅｔへの結合を実質的に抑制しない場合にも腫瘍細胞の増殖は抑制され、又は低下する。

さらに、上記結合蛋白質を用いることにより、哺乳動物における腫瘍の成長又は発症を抑制又は遅延させることができる。このような方法では、有効量の上記結合蛋白質を哺乳動物に投与することによってこの哺乳動物における腫瘍の成長を抑制又は遅延させる。従って、上記結合蛋白質を用いることによって、例えば、哺乳動物において腫瘍を治療することができる。この方法は哺乳動物に治療的有効量の上記結合蛋白質を投与するものである。上記結合蛋白質を単独又は別の医薬として有効な分子と併用して投与することにより腫瘍を治療することができる。

本発明の結合蛋白質は、種々のＨＧＦ反応性疾患、例えば、肺癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、卵巣癌、多発性骨髄腫、肝臓癌、胃癌、食道癌、腎癌、鼻咽腔癌、膵癌、中皮腫、黒色腫及びグリア芽細胞腫におけるＨＧＦ反応性腫瘍細胞などの治療に用いることができる。

本明細書でいう「治療する」、「治療すること」及び「治療」とは、哺乳動物、特にヒトにおける病態の治療のことを指し、（ａ）その病態が哺乳動物において、特に、その哺乳動物がその病態に罹患する素因を有するが、まだこれを有していないと診断されている場合に発生するのを予防すること、（ｂ）その病態を抑制する、即ち、その発症を阻止すること、及び／又は（ｃ）その病態を緩和すること、即ち、その病態を軽減させること含む。

一般に、活性成分の治療的有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ乃至約１００ｍｇ／ｋｇ、必要に応じて約１ｍｇ／ｋｇ乃至約１００ｍｇ／ｋｇ、必要に応じて約１ｍｇ／ｋｇ乃至約１０ｍｇ／ｋｇの範囲となる。投与の量は、治療対象の疾患又は徴候の種類及び程度、特定の患者の全般的な健康状態、送達する結合蛋白質の相対的生物学的有効性、この結合蛋白質の剤型、製剤中の添加物の存在及び種類並びに投与経路などの変数によって決まることになる。所望の血液濃度又は組織濃度に急速に到達させるために、初期の投与用量を上記の上限を超えて増加させることができ、又は初期用量を最適用量より少なくすることができ、さらに、特定の状況に応じて治療の過程で初期用量を段階的に増加させることができる。ヒトにおける用量は、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ乃至２０ｍｇ／ｋｇで実施するようにデザインされた通常の第Ｉ相用量増加試験において最適化することができる。投与頻度については、投与経路、投与量、治療対象の疾患状態などの要因によって変更することができる。典型的な投与頻度は、１日当たり１回、１週当たり１回、２週ごとに１回である。好ましい投与経路は全身性投与、例えば、静脈内注入である。モノクローナル抗体系薬剤の製剤化については当該技術分野では日常的な技術の範囲内にある。本発明の一部の実施態様として、上記結合蛋白質、例えばモノクローナル抗体は、凍結乾燥され、投与時に緩衝生理食塩水で元に戻される。

上記結合蛋白質は、単独又は他の医薬として有効な成分との併用で投与することができる。上記他の有効な成分、例えば、免疫調節剤はこの結合蛋白質と一緒に投与することができ、或いはこの結合蛋白質投与の前又は後で投与することができる。

治療的用途の上記結合蛋白質含有製剤としては、典型的には、上記結合蛋白質を医薬用として許容可能な担体と組み合わせたものが挙げられる。本明細書でいう「医薬用として許容可能な担体」とは、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な利益／危険度比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー応答又は問題もしくは合併症を伴うことなくヒトその他の動物の組織と接触させて用いるのに適している緩衝剤、担体及び賦形剤を意味する。この担体は、製剤のその他の成分と適合し、レシピエントに対して有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。なお、医薬用として許容可能な担体は、医薬用としての投与に適合するありとあらゆる緩衝剤、溶媒、分散媒、被覆剤、等張性吸収遅延剤などを含むものとする。医薬として有効な物質のためのこのような媒体及び剤については当該技術分野では周知である。

こうした製剤は、投与単位形態で適宜提示することができ、薬学分野で公知の方法のいずれかを含め、任意の適切な方法によって調製することができる。本発明の医薬組成物は、対象とする投与経路に適合するように製剤化する必要がある。投与経路としては、例えば、全身性投与又は非全身性投与、例えば、静脈内、皮内、吸入、経皮（局所）、経粘膜及び直腸投与が挙げられる。経口又は全身性投与に有用な液剤は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版（マック出版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）１９９０年）に記載されている、医薬分野で公知の方法のいずれかによって調製することができる。

経口投与に適した製剤は、所定量の上記結合蛋白質を含有する、注射液、カプセル剤、ゼラチンカプセル剤、サッシェ剤、錠剤、トローチ剤又は舐剤などの個々の単位体；粉末状又は顆粒状組成物；水性液体又は非水性液体の液剤又は懸濁剤；或いは水中油型乳剤又は油中水型乳剤の形をとることができる。

全身性投与に適した製剤は、例えば、以下の成分、即ち、注射用水などの滅菌希釈液、食塩水、固定油類、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの等張性調整用剤を含む。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。全身性投与用製剤は、アンプル、使い捨て注射器、或いはガラス又はプラスチック製多回投与用バイアルに封入することができる。

一般的に言って、注射剤用途に適した組成物としては、水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射液又は分散液の即時調整用粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、クレモフォア（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ社、パーシパニ（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）、ニュージャージー州）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）が挙げられる。これは作製及び貯蔵の条件下で安定である必要があり、細菌、真菌などの微生物の汚染作用に対して保護される必要がある。上記担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコール）並びにこれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒とすることができる。

医薬製剤は滅菌されていることが好ましい。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いた滅菌は凍結乾燥及び再形成の前又は後に行うことができる。医薬組成物は、ひとたび製剤化すれば、例えば、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体として、又は脱水もしくは凍結乾燥粉末としてバイアルに貯蔵することができる。

（２）診断用途
上記結合蛋白質を診断目的のためにインビトロ又はインビボで用いる場合はいつも、この結合蛋白質を検出可能な成分で直接又は間接に標識するのが通常である。この検出可能成分は、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に発生することができる任意の成分とすることができる。例えば、この検出可能成分は、^３水素（^３Ｈ）、^１４炭素（^１４Ｃ）、^３２燐（^３２Ｐ）、^３５硫黄（^３５Ｓ）又は^１２５ヨウ素（^１２５Ｉ）などの放射性同位体；フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリンなどの蛍光又は化学発光化合物；アルカリ性ホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素；スピン標識などのスピンプローブ；或いは、カラー粒子、例えばラテックスもしくは金粒子であってもよい。上記結合蛋白質を、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９６２年） ＮＡＴＵＲＥ １４４：ｐ．９４５、Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａ１． （１９７４年） ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ １３：ｐ．１０１４、Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ． （Ｉ９８１年） Ｊ． ＩＭＭＵＮＯＬ． ＭＥＴＨ． ４０：ｐ．２１９及びＮｙｇｒｅｎ （１９８２年） Ｊ． ＨＩＳＴＯＣＨＥＭ． ＡＮＤ ＣＹＴＯＣＨＥＭ． ３０：ｐ．４０７に記載されているような、当該技術分野において周知の多くの方法を用いて上記検出可能成分に結合させることができることは理解されよう。これらの標識は、例えば、目視により、又は分光光度計その他の検出器を用いて検出することができる。

上記結合蛋白質は、当該技術分野で利用可能な広範囲の免疫測定技術において用いることができる。典型的な免疫測定法としては、例えば、サンドイッチ免疫測定法、競合免疫測定法、免疫組織化学的方法が挙げられる。

サンドイッチ免疫測定法では、被分析物、即ち、対象とする抗原に結合する２種の抗体、例えば、固形担体上に固定化した１種と、溶液中に遊離し、検出可能成分で標識された１種とを用いる。抗原を含むサンプルをこの系に添加すると、抗原は、上記の固定化抗体及び標識抗体の両者に結合して担体の表面に「サンドイッチ」免疫複合体を形成する。結合しなかったサンプル成分及び過剰の標識抗体を洗い落とし、担体表面で蛋白質と複合体化した標識抗体の量を測定することにより上記複合体化蛋白質を検出する。或いは、上記の溶液中に遊離した抗体を、この遊離抗体に結合する検出可能成分で標識した第３の抗体によって検出することができる。免疫学的測定法のデザイン、理論及びプロトコルに関する詳細な総説は、Ｂｕｔｔ編、（１９８４年）ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、マーセルデッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．編（１９８８年）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）及びＤｉａｍａｎｄｉｓ ｅｔ ａｌ．編（１９９６年）ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）ボストンを含む多くの教科書に見出すことができる。

上記標識結合蛋白質はインビボ造影剤として有用であり、これにより結合蛋白質はレシピエントの特定の対象組織を標的にしてこの造影剤を送達することができることが企図されている。インビボイメージング用の好ましい遠隔検出可能成分としては、約６時間の半減期を有するガンマ放出体である放射性原子テクネチウム^-９９ｍ(^９９ｍＴｃ)が挙げられる。また、インビボイメージングにおいて有用な非放射性成分としては、インサイツ(ｉｎｓｉｔｕ)でプロトン緩和を誘導するニトロキシドスピンラベル並びにランタニド及び遷移金属イオンが挙げられる。免疫イメージングの他に、標的とする細胞を破壊するために、複合体化放射性成分を標準的な放射免疫治療プロトコルで用いることができる。高線量放射免疫治療用の好ましいヌクレオチド類は、放射性原子^９０イットリウム（^９０Ｙｔ）、^１３１ヨウ素（^１３１Ｉ）及び^１１１インジウム（^１１１Ｉｎ）を含む。上記結合蛋白質は、イメージング分野で周知の結合技術を用いて^１３１Ｉ 、^１１１Ｉｎ及び^−９９ｍＴｃで標識することができる。同様に、造影剤を調製し投与する方法及びイメージを捕捉し処理する方法もイメージング分野において公知であるので、本明細書では詳しく論じない。同様に、抗体を利用した免疫療法を実施する方法も当該分野では公知である。例えば、米国特許第５，５３４，２５４号を参照されたい。

本説明の全体を通して、組成物が特定の成分を有する（ｈａｖｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）又は含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されているところでは、組成物は、本質的にその列挙された成分からなる、又はこれらの成分からなることも企図されている。同様に、工程が特定の工程段階を有する（ｈａｖｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）又は含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されているところでは、その工程は、また、本質的にその列挙された工程段階からなる、又はこれらの工程段階からなる。特に示さない限り、段階の順序又は特定の処置を行う順序は、本発明が実施可能である限り、重要ではない。さらに、特に断りのない限り、２つ以上の段階又は処置を同時に実施することができる。

以下の実施例では、いくつかの抗ｈＨＧＦモノクローナル抗体の作製及び特性化について検討する。
（実施例１）
抗ｈＨＧＦモノクローナル抗体の作製
この実施例ではいくつかの抗ｈＨＧＦモノクローナル抗体の作製について説明する。

免疫化、融合及び一次スクリーニングについては、反復性複数部位免疫化（ＲＩＭＭＳ：Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｉｔｅｓ）プロトコルに従ってＭＢＳ社（ポートランド、メイン州）で行われた。ＡＪマウス５匹及びＢａｌｂ／ｃマウス５匹を組換えヒトＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネアポリス、ミネソタ州、カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５）で免疫化した。酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）で最も高い抗ＨＧＦ活性を示す血清を有するマウス２匹を後の融合のために選んだ。該当するマウスから脾臓及びリンパ節を採取した。次いで、Ｂ細胞を採取し、骨髄腫細胞株と融合させた。融合産物は１枚以上のプレート上でほぼクローン性になるまで連続希釈した。得られた融合産物からの上清をＥＬＩＳＡによりそのｈＨＧＦへの結合についてスクリーニングした。ＨＧＦに対する抗体を含むとみなされた上清は、さらに、以下の実施例で検討したようにして、インビボ機能試験により特性を明らかにした。１パネルのハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマをサブクローニングして増やした。次いで、得られたモノクローナル抗体を標準的な条件下でプロテインＡ／Ｇ樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
（実施例２）
抗ｈＨＧＦモノクローナル抗体の配列分析
この実施例では実施例１で作製した抗ｈＨＧＦモノクローナル抗体のアイソタイプ及び配列の分析について説明する。

ａ．ＨＧＦマウスモノクローナル抗体アイソタイプの決定
各モノクローナル抗体の軽鎖タイプ及び重鎖アイソタイプについて、イソストリップマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＩｓｏＳｔｒｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ）を用い、そのメーカーの使用説明書（ロシュ・アプライド・サイエンス社（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ））に従って決定した。

全ての抗体は、カッパ免疫グロブリン軽鎖及びＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖を含むように決定した。

ｂ．免疫グロブリン重及び軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列の決定
各モノクローナルハイブリドーマ細胞株から、ＲＮｅａｓｙミニプレップ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キットを用い、そのメーカーの使用説明書（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、ヴェンロ、オランダ）に従って全ＲＮＡを抽出した。ＢＤ ＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットを用い、そのメーカーの使用説明書（クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に従い、５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ））のためのオリゴヌクレオチドプライマＢＤ ＳＭＡＲＴ ＩＩＡ（５’ａａｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｇｃａｇａｇｔａｃｇｃｇｇｇ ３’）（配列番号８５）及び５’−ＲＡＣＥ ＣＤＳ Ｐｒｉｍｅｒ（５’ ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｖｎ ３’、但し、ｖ＝ａ、ｇ又はｃ及びｎ＝ａ、ｇ、ｃ又はｔ）（配列番号８６）を用いて、完全長の第１鎖ｃＤＮＡを作製した。

エキスパンドハイフィデリティ（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＰＣＲシステム（ロシュ・アプライド・サイエンス社）を用い、そのメーカーの使用説明書に従ってＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ポリメラーゼ連鎖反応））により上記カッパ及び重（ＩｇＧ１）免疫グロブリン鎖の可変領域を増幅させた。重鎖可変領域は、５’オリゴヌクレオチドプライマ混合物ユニバーサルプライマミックスＡ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ Ａ）（ ５’ｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃａａｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｇｃａｇａｇｔ ３’（配列番号８７）と５’ｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃ ３’（配列番号８８）との混合物）及び３’ＩｇＧ１定常領域特異的プライマ５’ｔａｔｇｃａａｇｇｃｔｔａｃａａｃｃａｃａ ３’（配列番号８９）又は５’ｇｃｃａｇｔｇｇａｔａｇａｃａｇａｔｇｇｇｇｇｔｇｔｃｇ ３’（配列番号９０）を用いて増幅した。カッパ鎖可変領域は、５’オリゴヌクレオチドプライマ混合物ユニバーサルプライマミックスＡ及び３’カッパ定常領域特異的プライマ５’ｃｔｃａｔｔｃｃｔｇｔｔｇａａｇｃｔｃｔｔｇａｃａａｔ ３’（配列番号９１）又は５’ｃｇａｃｔｇａｇｇｃａｃｃｔｃｃａｇａｔｇｔｔ ３’（配列番号９２）を用いて増幅した。

個々のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分画し、キアクイック・ゲル精製（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）キットを用い、そのメーカーの使用説明書（キアゲン社）に従って精製した。次いで、トポイソメラーゼ利用クローニングキットＴＯＰＯ ＴＡクローニング（登録商標）キット（ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターを含む）を用い、そのメーカーの使用説明書（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールズバッド、カリフォルニア州）に従って、これらのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯプラスミド中にクローニングした後、標準的な形質転換技術を用いて細菌ＤＨ５に形質転換した。形質転換した細菌のクローンから単離したプラスミドＤＮＡについて、アジェンコートバイオサイエンス社（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のＴ７（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’）（配列番号９３）、Ｍ１３順方向プライマ（５’ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’）（配列番号９４）及びＭ１３逆方向プライマ（５’ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ３’）（配列番号９５）を用い、標準的なジデオキシＤＮＡ配列決定方法により配列を決定することにより可変領域配列の配列を特定した。ベクターＮＴＩ（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ）ソフトウェア（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）及びＩＭＧＴ／Ｖ−クエスト（Ｑｕｅｓｔ）ウェブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ｖｑｕｅｓｔ）を用いてこれらの配列を解析し、可変領域の配列を同定、確認した。

ｃ．１Ａ３、１Ｄ３、１Ｆ３及び２Ｂ８カッパ及びＩｇＧ１鎖の免疫グロブリン重及び軽鎖定常領域の配列をコードしているヌクレオチド配列の決定
順方向プライマ５’ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｇｃｃａｃｃａｔｇａａｃｔｔｔｇｇｇｃｔｃａｇａｔｔｇａｔｔｔｔｃｃ ３’（下線箇所：開始コドン）（配列番号９６）及び逆方向プライマ５’ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｔｃａｔｔｔａｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｇ３’（下線箇所：停止コドン）（配列番号９７）を用いて上記で作製したｃＤＮＡから、１Ａ３、１Ｄ３及び１Ｆ３ ＩｇＧ１鎖の完全長ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅させた。順方向プライマ５’ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｇｃｃａｃｃａｔｇｇｇａｔｇｇａｇｃｔａｔａｔｃａｔｃｃｔｃｔｔｔ３’（下線箇所：開始コドン）（配列番号９８）及び逆方向プライマ５’ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｔｃａｔｔｔａｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｇｇａｇａｇ３’（下線箇所：停止コドン）（配列番号９９）を用いて上記で作製したｃＤＮＡから、２Ｂ８ＩｇＧ１鎖の完全長ｃＤＮＡを増幅させた。

順方向プライマ５’ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｇｃｃａｃｃａｔｇｇａａｔｃａｃａｇａｃｔｃｔｇｇｔｃｔｔｃａｔａ３’（下線箇所：開始コドン）（配列番号１００）及び逆方向プライマ５’ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｃｔａａｃａｃｔｃａｔｔｃｃｔｇｔｔｇａａｇｃｔｃ３’（下線箇所：停止コドン）（配列番号１０１）を用いて２Ｂ８カッパ鎖の完全長ｃＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ断片をゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）ＢＰ組換え反応によりｐＤＯＮＲ２２１（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）中にクローニングし、標準的なジデオキシＤＮＡ配列決定方法を用いてアジェンコートバイオサイエンス社で配列決定することによりその定常領域の配列を同定し、さらに可変領域の配列を確認した。

ｄ．配列の解析
可変領域（標準テキスト）は、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴウェブサーバーソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｅｓ／ｖｑｕｅｓｔ／）を用いて同定した。シグナルペプチド配列は、同定した可変領域の上流にあるインフレーム開始コドン（ＡＴＧ）の同定に基づいて予測した。シグナルペプチド配列を同定し、下記に下線で示した。

各可変領域の最後のヌクレオチドは、可変／定常領域結合により生じる次のコドンの最初の塩基である。このヌクレオチドは、そのエキソンの一部であるので、可変領域に含まれる。以下に列挙した定常領域のアミノ酸配列にはこの結合コドンの翻訳が含まれる。

完全な重鎖又はカッパ鎖抗体配列を作製するためには、下記の可変領域の配列をそのそれぞれの定常領域の配列と結合させる（下線箇所：シグナル配列）。

（１）１Ａ３重鎖可変領域（配列番号１）

（２）１Ａ３カッパ軽鎖可変領域（配列番号３）

（３）２Ｂ８重鎖可変領域（配列番号１１）

（４）２Ｂ８カッパ軽鎖可変領域（配列番号１３）

（５）２Ｆ８重鎖可変領域（配列番号２１）

（６）２Ｆ８カッパ軽鎖可変領域（配列番号２３）

（７）３Ｂ６重鎖可変領域（配列番号３１）

（８）３Ｂ６カッパ軽鎖可変領域（２個の可能なＡＴＧ開始コドン（大文字））（配列番号３３）

（９）３Ｄ１１重鎖可変領域（配列番号４１）

（１０）３Ｄ１１カッパ軽鎖可変領域（配列番号４３）

（１１）１Ｄ３重鎖可変領域（配列番号５１）

（１２）１Ｄ３カッパ軽鎖可変領域（配列番号５３）

（１３）１Ｆ３重鎖可変領域（配列番号６１）

（１４）１Ｆ３カッパ軽鎖可変領域（配列番号６３）

（１５）３Ａ１２重鎖可変領域（配列番号７１）

（１６）３Ａ１２カッパ軽鎖可変領域（配列番号７３）

（１７）対照マウスＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｊ００４５３）（配列番号８１）

（１８）１Ａ３、１Ｄ３、１Ｆ３及び２Ｂ８（ＡＪ系マウス由来）について決定されたマウスＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号８２）

（１９）対照マウスカッパ軽鎖定常領域（Ｖ００８０７）並びに１Ｄ３、１Ｆ３及び２Ｂ８（ＡＪ系マウス由来）について決定されたマウスカッパ軽鎖定常領域（配列番号８３）

（２０）１Ｄ３、１Ｆ３及び２Ｂ８に比し変更されたヌクレオチド（下線箇所）を１個含む１Ａ３について決定されたマウスカッパ軽鎖定常領域（配列番号８４）

実施例１で作製した抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域を規定するアミノ酸配列は、いずれも図２に記載されている。これらの配列は全て相互に整列させてあり、シグナルペプチド、ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２及びＣＤＲ_３を規定する配列は枠で囲んで識別されている。図３は、全ての抗体のＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２及びＣＤＲ_３配列を別々に整列させて示したものである。

実施例１で作製した全ての抗体の免疫グロブリン軽鎖可変領域を規定するアミノ酸配列は、いずれも図４に記載されている。これらの配列は全て相互に整列させてあり、シグナルペプチド、ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２及びＣＤＲ_３を規定する配列は枠で囲んで識別されている。図５は、全ての抗体のＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２及びＣＤＲ_３配列を別々に整列させて示したものである。

便宜のため、本実施例で検討した抗体配列と配列表に示したものとの対応関系を示すコンコーダンス表を表１に示した。

また、便宜のため、下記の配列は、本実施例に記載した全ての抗体の実際の、又は企図された完全長の重及び軽鎖配列（即ち、可変領域及び定常領域の両者の配列を含む）を表したものである。マウス抗体２Ｆ８、３Ａ１２、３Ｂ６及び３Ｄ１１の定常領域は配列決定を行わなかったが、これらが全てＡＪ系マウス由来の抗体であることから、配列決定した１Ｄ３、１Ｆ３及び２Ｂ８抗体と同一の定常領域配列を有すると推定されることは注目される。しかしながら、本明細書に記載した可変領域の配列を当業者に周知の他のいく種かの定常領域配列のそれぞれに結合させて活性のある完全長の免疫グロブリン重及び軽鎖を作製することができることは了解されよう。

（１）完全長１Ａ３重鎖配列（１Ａ３重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１２２）

（２）完全長１Ａ３重鎖配列（１Ａ３重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１２３）

（３）完全長１Ａ３軽鎖配列（１Ａ３カッパ可変領域及び定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１２４）

（４）完全長１Ａ３軽鎖配列（１Ａ３カッパ可変領域及び定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１２５）

（５）完全長２Ｂ８重鎖配列（２Ｂ８重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１２６）

（６）完全長２Ｂ８重鎖配列（２Ｂ８重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１２７）

（７）完全長２Ｂ８軽鎖配列（２Ｂ８カッパ可変領域及び定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１２８）

（８）完全長２Ｂ８軽鎖配列（２Ｂ８カッパ可変領域及び定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１２９）

（９）完全長２Ｆ８重鎖配列（２Ｆ８重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１３０）

（１０）完全長２Ｆ８重鎖配列（２Ｆ８重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１３１）

（１１）完全長２Ｆ８軽鎖配列（２Ｆ８カッパ可変領域及び定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１３２）

（１２）完全長２Ｆ８軽鎖配列（２Ｆ８カッパ可変領域及び定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１３３）

（１３）完全長３Ｂ６重鎖配列（３Ｂ６重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１３４）

（１４）完全長３Ｂ６重鎖配列（３Ｂ６重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１３５）

（１５）完全長３Ｂ６軽鎖配列（３Ｂ６カッパ可変領域及び定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１３６）

（１６）完全長３Ｂ６軽鎖配列（３Ｂ６カッパ可変領域及び定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１３７）

（１７）完全長３Ｄ１１重鎖配列（３Ｄ１１重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１３８）

（１８）完全長３Ｄ１１重鎖配列（３Ｄ１１重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１３９）

（１９）完全長３Ｄ１１軽鎖配列（３Ｄ１１カッパ可変領域及び定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１４０）

（２０）完全長３Ｄ１１軽鎖配列（３Ｄ１１カッパ可変領域及び定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１４１）

（２１）完全長１Ｄ３重鎖配列（１Ｄ３重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１４２）

（２２）完全長１Ｄ３重鎖配列（１Ｄ３重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１４３）

（２３）完全長１Ｄ３軽鎖配列（１Ｄ３カッパ可変領域及び定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１４４）

（２４）完全長１Ｄ３軽鎖配列（１Ｄ３カッパ可変領域及び定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１４５）

（２５）完全長１Ｆ３重鎖配列（１Ｆ３重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１４６）

（２６）完全長１Ｆ３重鎖配列（１Ｆ３重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１４７）

（２７）完全長１Ｆ３軽鎖配列（１Ｆ３カッパ可変領域及び定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１４８）

（２８）完全長１Ｆ３軽鎖配列（１Ｆ３カッパ可変領域及び定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１４９）

（２９）完全長３Ａ１２重鎖配列（３Ａ１２重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１５０）

（３０）完全長３Ａ１２重鎖配列（３Ａ１２重鎖可変領域及びＩｇＧ１定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１５１）

（３１）完全長３Ａ１２軽鎖配列（３Ａ１２カッパ可変領域及び定常領域）をコードしている核酸配列（下線箇所：シグナル配列）（配列番号１５２）

（３２）完全長３Ａ１２軽鎖配列（３Ａ１２カッパ可変領域及び定常領域）を規定している蛋白質配列（シグナル配列含まず）（配列番号１５３）

便宜のため、本実施例で検討した抗体の完全長配列と配列表に示したものとの対応関系を示すコンコーダンス表を表２に示した。

（実施例３）
各種組換えｈＨＧＦ蛋白質の作製
本実施例では、実施例１及び実施例１４で作製された抗体の特性を明らかにするために用いるいくつかの組換え蛋白質のクローニング及び発現について説明する。具体的には、本実施例では、組換えｈＨＧＦ蛋白質、５５５番目の位置にグリシンからグルタメートへの置換を含む組換えｈＨＧＦ蛋白質（Ｇ５５５Ｅ）、５６１番目の位置にシステインからアルギニンへの置換を含む組換えｈＨＧＦ蛋白質（Ｃ５６１Ｒ）、マウスＨＧＦ配列内に配置されたヒトＶ４９５乃至Ｌ５８５ＨＧＦ配列を含む組換えマウス−ヒト−マウス（ｍｈｍ）キメラＨＧＦ蛋白質、マウスＨＧＦ配列内に配置されたヒトＩ４９９乃至Ｒ５６６ＨＧＦ配列を含む組換えｍｈｍキメラＨＧＦ蛋白質及びマウスＨＧＦ配列内に配置されたヒトＷ５０７乃至Ｌ５８５ＨＧＦ配列を含む組換えｍｈｍキメラＨＧＦ蛋白質のクローニング及び発現について説明する。

標準的な分子技術を用いて以下の発現構築物を作製し、得られたｃＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定法によって確認した。

ａ． ｈＨＧＦ−Ｆｃ
１回目のＰＣＲでは、ＮｏｔＩ部位を導入し、ｈＨＧＦとｈＩｇＦｃとの間に６×Ｈｉｓ標識をコードしている２本の重なり合うＰＣＲ断片を作製した。２回目に、これらの重なり合うＰＣＲ断片を鋳型としてｈＨＧＦ−ｈｉｓ−ＩｇＦｃを増幅させた。得られた断片をＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（インビトロジェン社、＃３５−３０１４）中にクローニングした。次いで、インビトロジェン社のクローンＩＤ：ＩＯＨ２９７９４（ヒトＨＧＦ ｃＤＮＡ）からｈＨＧＦを増幅させた。その配列は、アクセッション番号ＮＭ＿０００６０１．４としてＮＣＢＩに寄託されている配列に相当することが分かった。

（１） ５’ｈＨＧＦ ＮｈｅＩプライマー

（２） ３’ｈＨＧＦ ＮｏｔＩ Ｈｉｓ標識プライマー

（３） ５’ＨｉｓＩｇＦｃプライマー

（４） ３’ＩｇＦｃ ＢａｍＨＩプライマー

ｂ． ｈＨＧＦ−Ｆｃ Ｇ５５５Ｅ及びｈＨＧＦ−Ｆｃ Ｃ５６１Ｒ
ｈＨＧＦ−Ｆｃ突然変異体Ｇ５５５Ｅ及びＣ５６１Ｒは、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）ＩＩ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））をメーカーの使用説明書に従って用いた部位特異的突然変異誘発法により作製した。

（１） ｈＨＧＦ−Ｆｃ（Ｇ５５５Ｅ）センスプライマ

（２） ｈＨＧＦ−Ｆｃ（Ｇ５５５Ｅ）アンチセンスプライマ

（３） ｈＨＧＦ−Ｆｃ（Ｃ５６１Ｒ）センスプライマ

（４） ｈＨＧＦ−Ｆｃ（Ｃ５６１Ｒ）アンチセンスプライマ

ｃ． マウス−ヒト−マウスキメラＦｃ
マウス−ヒト−マウスキメラＩｇＦｃ構築物は、ｍＨＧＦアルファ鎖ｈＨＧＦ、ヒトＨＧＦのβ鎖アミノ酸Ｖａｌ４９５乃至Ｌｅｕ５８５、及びｍＨＧＦ Ｃ末端β鎖とこれに続く６×Ｈｉｓ標識及びＩｇＧ−Ｆｃを含む。

アミノ酸Ｖ４９５乃至Ｌ５８５をコードしているヒトＨＧＦ ｃＤＮＡは、インビトロジェン社のクローンＩＤ：ＩＯＨ２９７９４（ヒトＨＧＦ ｃＤＮＡ）から増幅させた。その配列は、アクセッション番号ＮＭ＿０００６０１．４としてＮＣＢＩに寄託されている配列に相当する。マウスＨＧＦ配列は、インビトロジェン社製のスーパースクリプトワンステップ（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ）ＲＴ−ＰＣＲキット（＃１０９２８−０３４）をメーカーの使用説明書に従って用い、マウス肝の全ＲＮＡ（クローンテック社、＃６３６６０３）からＲＴ−ＰＣＲによって増幅させた。そのｍＨＧＦ ｃＤＮＡ配列は、アセッション番号Ｄ１０２１３．１としてＮＣＢＩに寄託されている配列に相当する。

重なり合うＰＣＲプライマーを用いて断片１、２及び３と称する３本の断片を作製し、連続回のＰＣＲ増幅でアニーリングした。最終産物をＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ ＩｇＧＦｃ中にクローニングした。

（１） ｍＨＧＦアルファ鎖５’ＮｈｅＩの断片１プライマー

（２） ｈＨＧＦベータ鎖ａａＶ４９５乃至Ｌ５８５の断片２プライマー

（３） ｍＨＧＦベータ鎖Ｃ末端３’ＮｏｔＩの断片３プライマー

ｄ． ｈＨＧＦ及びｍｈｍキメラの構築
ｈＨＧＦ及びｍｈｍキメラ（Ｖ４９５乃至Ｌ５８５）をコードしているベクターであるｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ ｈＨＧＦ及びｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ｍｈｍキメラ（Ｖ４９５乃至Ｌ−Ｌ５８５）を、Ｆｃ標識を含ませずに、部位特異的突然変異誘発法により作製した。前記クイックチェンジＩＩ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン社）をメーカーの使用説明書に従って用い、上記６×Ｈｉｓ標識の３’末端に停止コドンを導入した。突然変異誘発プライマーには、プライマー１：

及びプライマー２：

を含めた。

さらに、前記クイックチェンジＩＩ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン社）をメーカーの使用説明書に従って用い、部位特異的突然変異誘発法により上記ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ｍｈｍ（Ｖ４９５乃至Ｌ−Ｌ５８５）構築物から２種の別のｍｈｍキメラを作製した。そのうちの１種のｍｈｍ構築物はマウス配列間に配置されたｈＨＧＦのＩ４９９乃至Ｒ５５６の領域を含んだ。もう一方のｍｈｍ構築物は、マウス配列間に配置されたｈＨＧＦのＷ５０７乃至Ｌ５８５の領域を含んだ。

上記ｍｈｍキメラ（Ｉ４９９乃至Ｒ５５６）の場合、適切なオリゴヌクレオチド配列を用いて、鋳型ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ｍｈｍキメラ（Ｖ４９５乃至Ｌ５８５）構築物中に、点突然変異Ｄ５５８Ｅ、Ｃ５６１Ｒ、Ｖ５６４Ｉ、Ｖ５６７Ｉ及びＭ５８３Ｌを順番に起こさせた。上記ｍｈｍキメラ（Ｗ５０７乃至Ｌ５８５）の場合、適切なオリゴヌクレオチド配列を用いて、鋳型ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ｍｈｍキメラ（Ｖ４９５乃至Ｌ５８５）構築物中に、点突然変異Ｑ５０２Ｒ、Ｎ５０４Ｔ及びＩ５０５Ｖを１ステップで導入した。

得られたｈＨＧＦ−Ｆｃ蛋白質のヌクレオチド配列は、シグナル配列（１乃至９３番目ヌクレオチド）及びプロドメイン（９４乃至１６２番目ヌクレオチド）を含めて、配列番号１１８として記載している。このｈＨＧＦ−Ｆｃ蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１１９として記載している。

得られたｍｈｍ（Ｖ４９５−Ｌ５８５）−Ｆｃキメラ蛋白質をコードしているヌクレオチド配列は、シグナル配列（１乃至９６番目ヌクレオチド）及びプロドメイン（９７乃至１６５番目ヌクレオチド）を含めて、配列番号１２０として記載している。このｍｈｍ（Ｖ４９５−Ｌ５８５）−Ｆｃキメラ蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１２１として記載している。

得られたｍｈｍ（Ｖ４９５−Ｌ５８５）構築物をコードしているヌクレオチド配列及びこの構築物を規定する蛋白質配列は、それぞれ配列番号２１１及び２１２として記載している。配列番号２１１で表される核酸配列は、シグナル配列（１乃至９６番目ヌクレオチド）及びプロドメイン（９７乃至１６５番目ヌクレオチド）を含み、配列番号２１２で表される蛋白質配列は、（シグナル配列又はプロドメインを含まない）活性蛋白質配列を含む。得られたｍｈｍ（Ｉ４９９〜Ｒ５５６）構築物をコードしているヌクレオチド配列及びこの構築物を規定する蛋白質配列は、それぞれ配列番号２１３及び２１４として記載している。配列番号２１３で表される核酸配列は、シグナル配列（１乃至９６番目ヌクレオチド）及びプロドメイン（９７乃至１６５番目ヌクレオチド）を含み、配列番号２１４で表される蛋白質配列は、（シグナル配列又はプロドメインを含まない）活性蛋白質配列を含む。得られたｍｈｍ（Ｗ５０７〜Ｌ５８５）をコードしているヌクレオチド配列及びこの構築物を規定する蛋白質配列は、それぞれ配列番号２１５及び２１６として記載している。配列番号２１５で表される核酸配列は、シグナル配列（１乃至９６番目ヌクレオチド）及びプロドメイン（９７乃至１６５番目ヌクレオチド）を含み、配列番号２１６で表される蛋白質配列は、（シグナル配列又はプロドメインを含まない）活性蛋白質配列を含む。

ｅ． 蛋白質発現
（１） 細胞培養
ＣＨＯ ＦＩｐＩｎ細胞（インビトロジェン社、カタログ番号Ｒ７５８−０７）をＦ１２Ｋ培地（ＡＴＴＣ、カタログ番号３０−２００４）、１０％ＦＣＳ（インビトロジェン社、カタログ番号１０４３８０２６）、１％ペニシリン（１０，０００単位／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍＬ）（インビトロジェン社、カタログ番号１５１４０−１２２）中、３７℃、５％ ＣＯ_２、１００μｇ／ｍＬゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）（インビトロジェン社、カタログ番号Ｒ２５０−０１）の条件下で増殖させた。

（２） 安定なＣＨＯ ＦＩｐＩｎ細胞株の作製
リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社、カタログ番号１１６６８−０２７）をそのメーカーの使用説明書に従って用い、発現プラスミドＤＮＡ ｐＯＧ４４及びｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴを９：１の比率で用いてＣＨＯ ＦＩｐＩｎ宿主細胞に形質移入した。対照として、空のｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクター／ｐＯＧ４４及びｐＯＧ４４プラスミド（インビトロジェン社、カタログ番号３５−３０１８）単独を細胞に形質移入した。形質移入後２４時間に、この細胞を分裂させ、４８時間後に、０．５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｈ０６５４−ＳＰＥＣ）を細胞に添加した。Ｆ１２Ｋ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．５ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ中で安定細胞の多クローン性選択を行った。

（３） 安定なＣＨＯ ＦＩｐＩｎ細胞株における蛋白質発現
約２×１０^６個の細胞を１５ｃｍプレートに接種し、Ｆ１２Ｋ（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００４）／ＤＭＥＭ高グルコース（インビトロジェン社、カタログ番号１１９９５０６５）１：１、５％超低ＩｇＧ ＦＣＳ（インビトロジェン社、＃１６２５０−７８）中、３７℃、５％ＣＯ_２で５乃至６日間増殖させた。上清を採取し、得られた蛋白質をＥＬＩＳＡ及び表面プラスモン共鳴により分析した。
（実施例４）
抗ｈＨＧＦモノクローナル抗体の結合特性
実施例１で作製したモノクローナル抗体の特徴は、これらがｈＨＧＦ及び実施例３で作製した組換えＨＧＦ蛋白質の一部に結合することができることにあった。

ＢｌＡｃｏｒｅ Ｔ１００装置を用いて表面プラスモン共鳴によりこれらの抗体を分析することによってＨＧＦ及び実施例３に記載した融合蛋白質の一部へのその結合能を評価した。各抗体は、標準的なカップリングプロトコルをメーカーの使用説明書に従って用いたアミンカップリング（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５０）によりカルボキシメチル化デキストランＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００６−６８）上に固定化した。

分析は、０．０５％界面活性剤Ｐ２０（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号Ｒ−１０００−５４）、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＥＭＤ社カタログ番号２９３０）及び１０ｍｇ／ｍＬのＣＭ−デキストランナトリウム塩（フルカ社（Ｆｌｕｋａ）、カタログ番号８６５２４）を含有するＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社、カタログ番号１４０４０−１３３）を泳動用緩衝液として用い、２５℃で行った。種々のＨＧＦ融合蛋白質を含む上清又は空のベクターを形質移入した細胞からの上清を各抗体上に３０μＬ／分の流速で３分間注入した。その結果生じた結合は、注入終了後３０秒のベースラインに対する共鳴単位（ＲＵ）として求めた。結合は、泳動用緩衝液で希釈したヒトＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５）と比較した。非特異的な結合は、同じアミンカップリング法を用いてマウスＩｇＧ（ロックランド社（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、カタログ番号０１０−０１０２）を固定化した対照表面への結合を比較することにより測定した。

以上の結果は表３にまとめた。

表３の結果から明らかなように、上記の各抗体はｒＨＧＦ及び精製ヒトＨＧＦに結合する。さらに、これらの抗体は全て、点突然変異Ｇ５５５Ｅ及びＣ５６１Ｒを含むｈＨＧＦに結合する。総じて、１Ｆ３及び２Ｆ８を除く全ての抗体はマウスＨＧＦに結合せず、このことから抗体１Ａ３、１Ｄ３、２Ｂ８、３Ａ１２、３Ｂ６及び３Ｄ１１がヒトＨＧＦに特異的に結合することが明らかとなった。抗体１Ｄ３、１Ｆ３及び２Ｂ８がマウス−ヒト−マウスキメラに結合するのに対して、残りの抗体は結合しなかった。以上の結果から、抗体１Ｄ３及び２Ｂ８は、ヒトＨＧＦの４９５乃至５８５番目残基に少なくとも部分的に結合することが分かる。抗体１Ａ３、３Ａ１２、３Ｂ６及び３Ｄ１１は、４９５乃至５８５番目残基以外のヒトｈＨＧＦの部分に結合するように思われる。２Ｆ８がｈＨＧＦ及びｍＨＧＦのいずれにも結合するように思われるので、現在のところ、これがなぜｍｈｍキメラに結合しないのか不明である。
（実施例５）
抗ｈＨＧＦモノクローナル抗体の還元及び非還元ＨＧＦへの結合能
本実施例では、実施例１で作製した抗ｈＨＧＦモノクローナル抗体の還元及び非還元ＨＧＦへの結合能について分析した。

抗ＨＧＦ血清の上記組換えｈＨＧＦとの反応性を免疫ブロット法によって評価した。ＮｕＰＡＧＥサンプル還元緩衝液（インビトロジェン社）を含む、又は含まないＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液（インビトロジェン社）中８μｇの組換えｈＨＧＦ蛋白質を４乃至１２％ビス−トリス１．０ｍｍ×２Ｄウェルゲル（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州）で分画した。次いで、分画した蛋白質を標準的な手順によりニトロセルロース膜上に移した。このニトロセルロース膜を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有トリス緩衝食塩液（ＴＢＳＴ）に溶かした脱脂乳粉の５％溶液でブロックした後、更なるブロックのために、ミニプロテアンＩＩマルチスクリーン（Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｃｒｅｅｎ）装置（バイオラッド社（ＢｉｏＲａｄ））に取り付けた。

その結果得られた膜をマルチスクリーン装置上で精製抗体によりプローブした。精製抗体はブロッキング緩衝液で５μｇ／ｍＬに希釈した。次いで、このニトロセルロース膜を装置から取り外し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。得られた結果は表４に示した。表中、数字は結合の程度を示し、−は最も弱い（殆どあるいは全く結合しない）、３＋は最も強い結合を表している。

表４のデータから明らかなように、抗体は全て、非還元ｒｈＨＧＦに結合する。これに対し、モノクローナル抗体１Ａ３、１Ｄ３、１Ｆ３、２Ｆ８及び３Ｂ６は還元ｒｈＨＧＦに結合したが、抗体２Ｂ８、３Ａ１２及び３Ｄ１１は還元ｒｈＨＧＦに結合しなかった。
（実施例６）
結合親和性
実施例１で作製した各抗体のｈＨＧＦに対する結合親和性及び相互作用の速度を表面プラスモン共鳴によって測定した。

ウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００５−１４）を、標準的なカップリングプロトコルをメーカーの使用説明書に従って用いたアミンカップリング（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５０）によりカルボキシメチル化デキストランＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００６−６８）上に固定化した。分析は、０．０５％界面活性剤Ｐ２０（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号Ｒ−１０００−５４）、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＥＭＤ社カタログ番号２９３０）及び１０ｍｇ／ｍＬのＣＭ−デキストランナトリウム塩（フルカ社（Ｆｌｕｋａ）、カタログ番号８６５２４）を含有するＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社、カタログ番号１４０４０−１３３）を泳動用緩衝液として用い、２５℃で行った。

前記抗体は、個々のフローセル内で１０μＬ／分の流速で捕捉した。各抗体が各サイクルで捕捉される約２０ＲＵの抗体を生じるための注入時間にはばらつきがあった。緩衝液、又は泳動用緩衝液で希釈したＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５）を対照表面（捕捉抗体なし）及び活性表面（試験対象抗体あり）上に６０μＬ／分で２分間順次注入した。解離相を濃度に応じて１５又は９０分間モニターした。その後、上記表面は、別のサイクルが開始される前に、ｐＨ１．７の１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ＢＩＡｃｏｒｅ社、カタログ番号ＢＲ−１００３−５４）を６０μＬ／分の流速で３分間注入して再生させた。試験したＨＧＦ濃度は０．４６ｎＭ乃至７．５ｎＭであった。

速度論的パラメータは、対照値減算を含むＢＩＡエバリュエーション（ＢＩＡｅｖａｌｕｔａｔｉｏｎ）ソフトウェアの速度関数を用いて求めた。各抗体の速度論的パラメータｋ_ａ（会合速度定数）、ｋ_ｄ（解離速度定数）及びＫ_Ｄ（平衡解離定数）を表５にまとめた。

表５のデータから明らかなように、これらの抗体は、Ｋ_Ｄ値約１００ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下又は約２０ｐＭ以下でｈＨＧＦに結合する。
（実施例７）
抗ｈＨＧＦ抗体の中和活性
本実施例では、実施例１で作製した抗体について、（ａ）ｃ−ＭｅｔへのｈＨＧＦの結合を阻害し、（ｂ）４ＭＢｒ−５細胞におけるＢｒｄＵ取り込みのＨＧＦによる促進を阻害する能力を特性化した。

ａ． ＨＧＦ−Ｍｅｔ結合阻害試験（中和試験）
上記抗体について、ｃ−ＭｅｔへのｈＨＧＦ結合を阻害する能力をＥＬＩＳＡにより試験した。

すなわち、ワラック９６穴ＤＥＬＦＩＡアッセイプレート（ワラック社、カタログ番号ＡＡＡＮＤ−０００１）を６．２５μｇ／ｍＬ ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５）の炭酸コーティング緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３及び３４ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．０）溶液１００μＬにより４℃で１６時間コーティングした。次に、このプレートを室温で１時間５％脱脂粉乳のＰＢＳ溶液２００μＬでブロックした。抗体は、別のプレートにおいて５％脱脂粉乳のＰＢＳ溶液に溶解した２ｎＭのｃ−Ｍｅｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号３５８−ＭＴ／ＣＦ）に検討対象の抗体を漸増濃度（０．０３３乃至６６７ｎＭ、３倍段階希釈）で加えることにより調製した。ウェル当たり１００μＬのサンプルを上記アッセイプレートに移し、４℃で一夜インキュベートした。次いで、このアッセイプレートをＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、５％脱脂粉乳のＰＢＳ溶液で調製した１００μＬ／ウェルの２μｇ／ｍＬビオチン化抗ヒトｃ−Ｍｅｔ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号ＢＡＦ３５８）溶液と共に室温で２時間インキュベートした。

その後、上記で得られたプレートをＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液（ワラック社、カタログ番号４００２−００１０）で１：１，０００に希釈したＥｕ標識ストレプトアビジン（ワラック社、カタログ番号１２４４−３６０）と共に室温で１時間インキュベートした。その結果得られたプレートをＤＥＬＦＩＡ洗浄液（ワラック社、カタログ番号４０１０−００１０）で３回洗浄した後、１００μＬ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ強化溶液（ワラック社、＃４００１−００１０）と共に攪拌しながら室温で１５分間インキュベートした。

上記プレートは、ユウロピウム法を用いるビクター^３Ｖ装置（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））で読み取らせた。ＩＣ_５０値を算出し、表６にまとめた。

以上の結果から明らかなように、３Ｂ６以外の全ての抗体（即ち、１Ｄ３、１Ａ３、２Ｂ８、３Ａ１２、１Ｆ３、３Ｄ１１及び２Ｆ８）は、ｃ−ＭｅｔへのＨＧＦの結合を効率的に中和する。

ｂ． ４ＭＢｒ−５細胞におけるＢｒｄＵ取り込みのＨＧＦによる促進の中和
１２．５ｎＭのｈＨＧＦ １０μＬを９６穴組織培養マイクロタイタープレート（コスター社（Ｃｏｓｔａｒ）カタログ番号３９０３）の個々のウェルに分注した。次いで、６６６７、２２２２、７４０、２４７、８２、２７、９．１、３．０、１．０及び０．３３ｎＭの濃度に連続希釈した抗体１０μＬを各ウェルに添加した。次に、このＨＧＦ抗体混合液を室温で３０分間インキュベートした。Ｆ−１２Ｋ（ＡＴＣＣ、３０−２００４）、１５％ＦＢＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）１０４３８−０２６）、３０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｅ９６４４）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ、ギブコ社カタログ番号１５１４０−１２２）中で培養したサル気管支上皮細胞４ＭＢｒ−５（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ２０８）をトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）（ギブコ社カタログ番号２５２００−０５６）で解離させ、７５，０００個／ｍＬの濃度でアッセイ培地（Ｆ−１２Ｋ、２．５％ ＦＢＳ、１％ ＰＳ）に再懸濁し、この細胞懸濁液８０μＬを上記ＨＧＦ抗体混合液に分注した。

この細胞を３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下でインキュベートした。４８時間後、１００μＭ ＢｒｄＵ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、カタログ番号１６６９９１５）を１０μＬ添加した。７２時間後、培地を除去し、プレートをヘアドライヤーで乾燥させた後、ＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡをメーカーの使用説明書（ロシュ社、カタログ番号１６６９９１５）に従って用いて処理した。

発光シグナルは、シナジーＨＴ（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ）プレートリーダー（バイオテック社（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ））によって定量化した。このデータは、グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）（グラフパッドソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ））において式ｙ＝ボトム＋（トップ−ボトム）／（１＋１０＾（ｌｏｇ（ＥＣ５０−ｘ）＊ヒル勾配））の可変勾配を有するＳ字形の用量反応に当てはめた。各実験は、２回ずつ、少なくとも３回繰り返した。表７にＥＣ_５０の平均値を示した。

表７の結果から明らかなように、抗体１Ａ３、ＩＤ３、１Ｆ３、２Ｂ８、２Ｆ８、３Ａ１２、３Ｂ６及び３Ｄ１１は全て、４ＭＢｒ−５細胞のＨＧＦ誘発性増殖を抑制する。
（実施例８）
抗ｈＨＧＦ抗体の抗散乱（Ａｎｔｉ−Ｓｃａｔｔｅｒ）活性
本実施例では、実施例１で作製した抗体のＨＧＦ誘発性散乱活性を抑制する能力に関する特性化について説明する。ＨＧＦは、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州、カタログ番号ＣＣＬ−３４）においてクラスターの「散乱」（運動）を誘発する。

ＭＤＣＫ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（インビトロジェン社、カタログ番号１０４３８０２６）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（インビトロジェン社カタログ番号１５１４０１２２）を含有するＭＥＭ（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州、カタログ番号３０−２００３）８０μＬ中ウェル当たり４×１０^３個の密度で９６穴Ｃｏｓｔａｒ組織培養プレート（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、コーニング、ニューヨーク州、カタログ番号３５９５）に接種した。検討対象の各抗体は、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＭＥＭで６，６６７ｎＭに希釈した。次いで、種々の抗体希釈液のそれぞれ、及び１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有し抗体を含まないＭＥＭを別々に、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン並びに１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５）を含有する等容量のＭＥＭと混合した。各抗体／ＨＧＦ希釈液は、２５℃で３０分間インキュベートした。各抗体／ＨＧＦ希釈液２０μＬを個別に個々のウェルに添加し、最終抗体濃度６６６．７ｎＭ及び最終ＨＧＦ濃度１０ｎｇ／ｍｌを得た。次に、ＭＤＣＫ細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。

２４時間のインキュベーション後、ＭＤＣＫ細胞をウェル当たり１００μＬの氷冷ＰＢＳ（インビトロジェン社カタログ番号１４１９０１４４）で一度注意深く洗い、２５℃で１０分間揺動させながらウェル当たり１００μＬの氷冷メタノールで固定した。次いで、プレートを一度蒸留水で注意深く洗浄した。蒸留水に溶解した０．５％クリスタルバイオレット（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号Ｃ３８８６）及び５０％エタノールからなる１００μＬ容のクリスタルバイオレット溶液を各ウェルに添加し、細胞を揺動させながら２５℃で２０分間インキュベートした。

クリスタルバイオレット溶液による染色後、細胞を蒸留水で三度注意深く洗浄した。次に、各ウェルにＰＢＳを添加してサンプルの乾燥を防いだ。ライカ（Ｌｅｉｃａ）ＤＭＩＲＢ顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社、ウェッツラー、ドイツ）、ＤＣ５００カメラ（ライカマイクロシステムズ社、ウェッツラー、ドイツ）及びマグナファイア（ＭａｇｎａＦｉｒｅ）２．１Ｃソフトウェア（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ、ゴレタ、カリフォルニア）を用いて細胞を撮像し、サンプルを散乱レベルについて評価した。表８にその結果をまとめた。

表８の結果から明らかなように、抗体２Ｂ８は、その他の抗体よりも多くのＨＧＦ誘発性散乱を抑制した。抗体１Ｄ３及び３Ｂ６は中間的なレベルの抑制を示し、抗体１Ａ３は低乃至中間レベルの抑制を示し、抗体１Ｆ３及び２Ｆ８は低レベルの抑制を示し、抗体３Ａ１２及び３Ｄ１１はほとんど或いは全く検出可能な抑制を示さなかった。
（実施例９）
ＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害
本実施例では、実施例１で作製した抗体の、ＰＣ−３細胞におけるＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害する能力に関する特性化について説明する。ＨＧＦはＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４３５）においてＭｅｔのリン酸化を誘発する。

ＰＣ−３細胞は、１０％ウシ胎仔血清（インビトロジェン社、カタログ番号１０４３８０２６）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（インビトロジェン社カタログ番号１５１４０１２２）を含有するＦ−１２Ｋ（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州、カタログ番号３０−２００４）１００μＬ中ウェル当たり４．５×１０^４個の密度で９６穴Ｃｏｓｔａｒ組織培養プレート（コーニング社カタログ番号３５９５）の個々のウェルに接種した。３７℃、５％ ＣＯ_２で２４時間培養後、培地を除去し、１％ ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する無血清Ｆ−１２Ｋで細胞を一度洗った。次いで、細胞を１％ ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する無血清Ｆ−１２Ｋ １００μＬ中で２４時間インキュベートした。

１％ ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する無血清Ｆ−１２Ｋを用いて、検討対象の各抗体の１０種の希釈液、即ち、６，６６７ｎＭ、２，２２２ｎＭ、７４１ｎＭ、２４７ｎＭ、８２．３ｎＭ、２７．４ｎＭ、９．１ｎＭ、３．０ｎＭ、１．０ｎＭ及び０．３ｎＭの希釈液を調製した。各抗体希釈液、及び１％ ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するが抗体を含まない無血清Ｆ−１２Ｋを別々に、１％ ペニシリン−ストレプトマイシン及び５００ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５）を含有する等容量の無血清Ｆ−１２Ｋと混合した。次いで、これらの抗体／ＨＧＦ希釈液を２５℃で３０分間インキュベートした。これによりＨＧＦの最終濃度は１．２５ｎＭとなった。

その後、１％ ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する無血清Ｆ−１２Ｋで上記ＰＣ−３細胞を一度洗った。次に、この細胞に、１％ ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する無血清Ｆ−１２Ｋを７０μＬ添加した後、１０ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４（シグマ社カタログ番号Ｓ６５０８）の１％ ペニシリン−ストレプトマイシン含有無血清Ｆ−１２Ｋ溶液１０μＬを添加した。次いで、この細胞を３７℃、５％ ＣＯ_２で６０分間インキュベートした。このインキュベーションの後、各抗体／ＨＧＦ希釈液２０μＬを別々に個別のウェルに添加し、最終ＨＧＦ濃度５０ｎｇ／ｍＬ並びに各抗体の最終濃度６６６．７ｎＭ、２２２．２ｎＭ、７４．１ｎＭ、２４．７ｎＭ、８．２３ｎＭ、２．７４ｎＭ、０．９１ｎＭ、０．３０ｎＭ、０．１０ｎＭ及び０．０３ｎＭを得た。次に、この細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で１０分間インキュベートし、その時点後に培地／抗体／ＨＧＦ混合物を除去してプレートを氷上に置いた。その後、細胞を、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４を含有する１００μＬ／ウェルの氷冷ＰＢＳ（インビトロジェン社カタログ番号１４１９０１４４）で一度洗った。次いで、この細胞を、１％ ＯｍｎｉＰｕｒ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ドイツメルク社（ＭＥＲＣＫ ＫＧａＡ）、ダルムシュタット、ドイツ、カタログ番号９４１０）、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．３ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社カタログ番号Ｐ８３４０）及び１×ホスファターゼ阻害剤カクテル２（シグマ社カタログ番号５７２６）からなる１００μＬ／ウェルの氷冷溶解緩衝液中、４℃で、３０分間インキュベートした。

ビオチニル化抗ヒトＨＧＦ−Ｒ（ｃ−ｍｅｔ）抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社カタログ番号ＢＡＦ３５８）を、１％ウシ血清アルブミン（シグマ社カタログ番号Ａ２１５３）を含有するＤＥＬＦＩＡアッセイバッファ（Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ）（パーキンエルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、トゥルク、フィンランド、カタログ番号４００２−００１０）で２μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、黄色ストレプトアビジンマイクロタイトレーションプレート（パーキンエルマー社カタログ番号ＡＡＡＮＤ−０００５）のウェル当たり５０μＬのこの希釈液を添加した。次に、このプレートを揺動させながら２５℃で３０分間抗体と共にインキュベートした。インキュベーション後、このプレートをＤＥＬＦＩＡ洗浄液（パーキンエルマー社カタログ番号４０１０−００１０）で洗浄し、各種ＰＣ−３細胞溶解物のそれぞれ８０μＬを別々に、洗浄したストレプトアビジンマイクロタイトレーションプレートの個々のウェルに添加した。

上記のＰＣ−３細胞溶解物を含むストレプトアビジンマイクロタイトレーションプレートを振盪しながら２５℃で６０分間インキュベートした後、ＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液で洗浄した。この前もってＰＣ−３細胞溶解物とインキュベートした洗浄ストレプトアビジンマイクロタイトレーションプレートの各ウェルに、１％ウシ血清アルブミンを含有するＤＥＬＦＩＡアッセイバッファーで希釈した６００ｎｇ／ｍＬ ＤＥＬＦＩＡ Ｅｕ−Ｎ１ Ｐ−ｔｙｒ−１００抗体（パーキンエルマー社、カタログ番号ＡＤ０１５９）溶液１００μＬを添加した。次いで、このプレートを揺動させながら２５℃で６０分間インキュベートした。最後に、このプレートをＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液で洗浄した。次に、この洗浄ストレプトアビジンマイクロタイトレーションプレートの各ウェルにＤＥＬＦＩＡエンハンスメントソリューション（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（パーキンエルマー社カタログ番号４００１−００１０）２００μＬを添加し、プレートを暗所で振盪しながら２５℃で５分間インキュベートした。

その後、ビクター３Ｖ（Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖ）リーダ（パーキンエルマー社）でユウロピウム（Ｅｕｒｏｐｉｕｍ）プロトコルを用いてシグナルを測定した。ウィンドウズ（登録商標）（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標））用プリズム（Ｐｒｉｓｍ）４（グラフパッドソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）、サンディエゴ、カリフォルニア州）及びＳ字形用量反応式を用いてＥＣ_５０値を算出した。

ｎＭ単位のＥＣ５０としてまとめた結果を表９に示した。

表９のデータから明らかなように、８種の抗体は全てＰＣ−３細胞におけるＨＧＦ誘導性ｃ−Ｍｅｔリン酸化の強力な阻害剤である。
（実施例１０）
Ｕ８７ＭＧ異種移植モデルにおける腫瘍抑制
Ｕ８７ＭＧ異種移植モデルを用い、本発明のマウスモノクローナル抗体の腫瘍増殖抑制能について試験した。Ｕ８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ）は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）を１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンと共に含む培地を用いた、５％ＣＯ_２及び９５％空気を含有する雰囲気中３７℃の培養で増殖させた。これらの細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて培養皿の壁から細胞を剥離することにより二次培養して維持した。

ほぼコンフルエントの細胞をトリプシン処理により回収し、次いで、５０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤバイオサイエンシズ社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、カタログ番号３５６２３７）中の細胞５×１０^６個を、７週齢雌性ＩＣＲ ＳＣＩＤマウス（タコニックラボラトリー社（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ））の肩甲骨間の上背部に皮下注射した。キャリパで腫瘍の長径（Ｌ）及び短径（Ｗ）（ｍｍ）を測定した。腫瘍容積（ｖｏｌ．）は、容積（ｍｍ^３）＝Ｌ×Ｗ^２／２として計算した。腫瘍が約２００ｍｍ^３にまで成長した時に、担腫瘍マウスを１群１０匹の５群に無作為化した。１群にはＰＢＳを投与した。その他の４群のそれぞれには、抗体１Ａ３、１Ｄ３、１Ｆ３又は２Ｂ８のうちの１種を投与した。抗体は全て、５用量の腹腔内注射により週２回１ｍｇ／ｋｇ体重を投与した。腫瘍容積及びマウス体重を週２回記録した。スチューデントのｔ−検定を用いて腫瘍成長の抑制を解析した。結果は図６及び表１０にまとめた。

２Ｂ８投与群で部分的な退縮が達成された（図６）。１Ａ３投与群及び１Ｆ３投与群では統計的に有意な成長抑制が認められた（表１０）。１Ｄ３の場合、５１％の腫瘍成長抑制（ｐ値：０．０７５）が認められた。有意な体重減少は認められなかった。
（実施例１１）
Ｕ１１８異種移植モデルにおける腫瘍抑制
Ｕ１１８異種移植モデルを用い、抗体１Ａ３、１Ｄ３、１Ｆ３及び２Ｂ８の腫瘍増殖抑制能について試験した。Ｕ１１８細胞（ＡＴＣＣ）は、Ｕ８７ＭＧ細胞に関して（上記）実施例１０に記載したのと同様にして増殖させた。

使用マウスが７週齢雌性ＮＣｒヌードマウス（タコニック社）であること以外は上記実施例１０に記載したのと同様にして皮下腫瘍を確立し、投与は、腫瘍が約８０ｍｍ^３にまで成長した時に開始した。Ｕ８７ＭＧモデルの場合と同様に、抗体は全て、４用量の腹腔内注射により週２回１ｍｇ／ｋｇ体重を投与した。腫瘍容積及びマウス体重を週２回記録した。スチューデントのｔ−検定を用いて腫瘍成長の抑制を解析した。結果は図７及び表１１にまとめた。

２Ｂ８投与群及び１Ａ３投与群では統計的に有意な成長抑制が認められた（図７）。１Ｆ３群及び１Ｄ３群では中等度の腫瘍成長抑制が認められ、ｐ値は、本試験で統計的に有意であると定義した０．０５未満であった（表１１）。有意な体重減少は認められなかった。
（実施例１２）
マウスモノクローナル抗体のヒト化
本実施例では、マウス２Ｂ８抗体のヒト化及び得られるヒト化抗体の特性化について説明する。マウス２Ｂ８重及び軽鎖可変領域は２通りの方法で「ヒト化」した。
Ａ． ヒト化の方法１
第一の方法では、Ｈｗａｎｇほか （２００５年） ＭＥＴＨＯＤＳ ３６：ｐ．３５−４２、Ｔａｎほか （２００２年） Ｊ． ＩＭＭＵＮＯＬ． １６９：ｐ．１１１９−１１２５及び米国特許第６，８８１，５５７号明細書に記載されている「超ヒト化」方法に基づいて、３つのヒト化重鎖可変領域及び２つのヒト化カッパ軽鎖可変領域を設計した。

各マウス２Ｂ８ＣＤＲについてＣＤＲの長さ及びアミノ酸組成に基づき、チョチア規定構造クラス（Ｃｈｏｔｈｉａ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｌａｓｓ）を特定した。同じチョチア規定構造クラスの軽及び重鎖可変領域からなるヒト生殖細胞系可変領域は、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）ウェブサイトに記載されている既知ヒト生殖細胞系可変領域基準対立遺伝子（ワールドワイドウェブのｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ及びｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで入手可能）に基づいて確認した。同構造クラスのこれらヒト生殖細胞系可変領域は、ＣＤＲアミノ酸残基間の完全な同一性又は類似性を計算することによってマウス２Ｂ８可変領域と比較した。マウス２Ｂ８ＣＤＲ残基と最も高い同一性及び／又は類似性を有するヒト生殖細胞系可変領域をＣＤＲ移植用に選んだ。これらのヒト生殖細胞系可変領域のフレームワーク残基を保存する一方、マウス２Ｂ８ ＣＤＲ残基は、マウス２Ｂ８ ＣＤＲとヒト生殖細胞系ＣＤＲとの間で異なる対応するヒト生殖細胞系可変領域残基を置換するために用いた。次いで、２Ｂ８マウスＪ領域に最も類似したヒトＪ領域を上記「超ヒト化」可変領域のカルボキシル末端に付加した。次に、この「超ヒト化」可変領域のアミノ末端にシグナル配列を付加し、これらのアミノ酸配列を核酸配列に変換した。

この完全な可変領域核酸配列は、遺伝子合成ＰＣＲ法（Ｙｏｕｎｇほか （２００４年） ＮＵＣＬ． ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ． ３２：ｅ５９）を用いて構築し、標準的な分子生物学的技術を使用して、（上記可変領域の下流にある）ヒト定常ＩｇＧ１（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ）又はカッパ（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子２））領域を含む（ｐｃＤＮＡ３．２ＤＥＳＴ（インビトロジェン社）を利用した）哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。４種の重鎖ＩｇＧ１抗体（キメラ２Ｂ８及び３種のヒト化重鎖（Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ１−ｆ．１、Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−ａ．１及びＨｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１））の全てを３種のカッパ鎖抗体（キメラ２Ｂ８及び２種のヒト化軽鎖（Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ１−３９．１及びＨｕ２Ｂ８ Ｋｖ３−１５．１））の全てとの考えられる全ての組合せで発現させ、１２種の抗体蛋白質を作製した。次いで、これらキメラ、キメラ／ヒト化及びヒト化抗体のヒトＨＧＦへの結合を下記のようにして測定し、その結果を図８にまとめた。免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域との考えられる全ての組合せはいずれも下記の表１２Ａに記載した。

免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖とのえられる全ての組合せはいずれも下記の表１２Ｂに記載した。

ヒト化可変領域を含む完全長免疫グロブリン重及び軽鎖を含む考えられる抗体構築物のうちの２種について下記の通り命名した。

ｓｈ２Ｂ８−９ （Ｇ１ｍ（１７，１））＝ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１（＋ＩｇＧ１定常領域（Ｇｌｍ（１７，１）アロタイプ）（配列番号１７１）プラスｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ １−３９．１ （＋カッパ定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子２））） （配列番号１７７）
ｓｈ２Ｂ８−１２ （Ｇｌｍ（１７，１））＝ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１（＋ＩｇＧ１定常領域（Ｇｌｍ（ｌ７，１）アロタイプ））（配列番号１７１）プラスｈｕ２Ｂ８
Ｋｖ ３−１５．１ （＋カッパ定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子２））） （配列番号１８１）
各ヒト化抗体をコードしている核酸配列及び各ヒト化抗体を規定する蛋白質配列を下記にまとめた。このセクションでは、各可変領域の最後のヌクレオチドは、可変／定常領域接合部によって生じる次のコドンの最初の塩基である。このヌクレオチドは、可変領域に含まれる。何故なら、これはそのエクソンの一部であるからである。下記に列挙した定常領域のアミノ酸配列はこの接合部コドンの翻訳物を含む。

（１） 完全長キメラ２Ｂ８重鎖（マウス可変領域及びヒトＩｇＧ１定常領域）（アロタイプＧ１ｍ（１７，１））をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１５４）

（２） 完全長キメラ２Ｂ８重鎖（キメラ２Ｂ８ ＩｇＧ１（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ）を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１５５）

（３） 完全長キメラ２Ｂ８軽鎖（マウス可変領域及びヒト定常領域）（キメラ２Ｂ８カッパ（Ｋｍ（３）））をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１５６）

（４） 完全長キメラ２Ｂ８軽鎖（キメラ２Ｂ８カッパ（Ｋｍ（３）））を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１５７）

（５） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ１−ｆ．１重鎖可変領域をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１５８）

（６） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ１−ｆ．１重鎖可変領域を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１５９）

（７） ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ）をコードしている核酸配列（配列番号１６０）

（８） ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ）を規定する蛋白質配列（配列番号１６１） 最初のアミノ酸は、可変領域の最後のヌクレオチド及びＩｇＧ１重鎖配列の初めの２個のヌクレオチドの翻訳物に由来する。

（９） 完全長重鎖ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ１ｆ．１可変領域及びヒトＩｇＧ１（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ）重鎖定常領域をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１６２）

（１０） 完全長重鎖ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ１ｆ．１可変領域及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ）を規定する蛋白質配列（配列番号１６３）

（１１） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５ａ．１重鎖可変領域をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１６４）

（１２） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５ａ．１重鎖可変領域を規定する蛋白質配列（配列番号１６５）

（１３） 完全長ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５ａ．１重鎖可変領域及びヒトＩｇＧ１（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ）重鎖定常領域をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１６６）

（１４） 完全長ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５ａ．１重鎖可変領域及びヒトＩｇＧ１（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ）重鎖定常領域を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１６７）

（１５） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１重鎖可変領域をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１６８）

（１６） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１重鎖可変領域を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１６９）

（１７） 完全長重鎖ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１重鎖可変領域及びヒトＩｇＧ１（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ）重鎖定常領域をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１７０）

（１８） 完全長重鎖ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１重鎖可変領域及びヒトＩｇＧ１（Ｇ１ｍ（１７，１）アロタイプ）重鎖定常領域を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１７１）

（１９） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ１−３９．１カッパ鎖可変領域をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１７２）。考えられる２つの開始ＡＴＧを大文字で示した。

（２０） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ１−３９．１カッパ鎖可変領域を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１７３）

（２１） ヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子２）をコードしている核酸配列（配列番号１７４）

（２２） ヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子２）を規定する蛋白質配列 （配列番号１７５）

（２３） 完全長ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ１−３９．１軽鎖可変領域及びヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子２）をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１７６）

（２４） 完全長ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ１−３９．１軽鎖可変領域及びヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１）を規定する蛋白質配列 （配列番号１７７）

（２５） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ３−１５．１軽鎖可変領域をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１７８）

（２６） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ３−１５．１軽鎖可変領域を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１７９）

（２７） 完全長ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ３−１５．１軽鎖可変領域及びヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子２）をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１８０）

（２８） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ３−１５．１軽鎖可変領域及びヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子２）を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１８１）

便宜のため、このセクションで説明した抗体の完全長配列と配列表に示したものとの対応関系を示すコンコーダンス表を表１３に示した。

Ｂ． ヒト化の方法２
マウス２Ｂ８抗体の免疫原性を低減させるのに用いる第二のヒト化方法は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａほか（１９９４年） ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＮＧ． ７：ｐ．８０５−８１４に記載されている方法に基づくものである。重及びカッパヒト生殖細胞系可変領域のうち、マウス２Ｂ８のものに（アミノ酸レベルで）最も一致する領域を特定した。マウスとヒトとの間で異なる残基は、そのような変化が結合又は免疫原性に影響すると思われるリスクに応じてヒトの配列に変換した。低リスク残基（即ち、変化があっても、抗原結合に影響しないと考えられ、免疫原性を生じる可能性も少ない残基）は、ヒトアミノ酸への変更を重鎖可変領域（ＬＲ２Ｂ８ＨＣを作製）及びカッパ可変領域（ＬＲ２Ｂ８ＬＣを作製）において行った。さらに、低リスク及び中間リスク残基（即ち、変化があると、抗原結合に影響する可能性が若干高いが、免疫原性を生じる可能性も少ない残基）は、ヒトアミノ酸への変更を重鎖可変領域（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣを作製）及びカッパ可変領域（ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣを作製）において行った。上記２種のヒト型に設計された重鎖可変領域のカルボキシル末端にヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子１））を付加し、２種のヒト型に設計された軽鎖可変領域のカルボキシル末端にヒトカッパ定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子１））を付加して、ヒト型に設計された抗体鎖を作製した。先ず、遺伝子合成法によって各可変領域の核酸配列を合成した後、これに各ヒト定常領域の配列に付加した。これらのヒト型に設計された抗体を哺乳動物の蛋白質発現ベクター中にクローニングし、重鎖プラス軽鎖の考えられる４種の組合せの蛋白質を発現させた。キメラ、キメラ／ヒト化又はヒト化抗体のヒトＨＧＦへの結合については、下記のように、従来の技術を用いて測定した。

各ヒト化抗体をコードしている核酸配列及び各ヒト化抗体を規定する蛋白質配列を下記にまとめた。このセクションでは、各可変領域の最後のヌクレオチドは、可変／定常領域接合部によって生じる次のコドンの最初の塩基である。このヌクレオチドは、可変領域に含まれる。何故なら、これはそのエクソンの一部であるからである。下記に列挙した定常領域のアミノ酸配列はこの接合部コドンの翻訳物を含む。

（１） ヒト化ＬＲ２Ｂ８ＨＣ重鎖可変領域をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１８２）

（２） ヒト化ＬＲ２Ｂ８ＨＣ重鎖可変領域を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１８３）

（３） ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１）をコードしている核酸配列（配列番号１８４）

（４） ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１又は２）を規定する蛋白質配列（配列番号１８５）。最初のアミノ酸は、可変領域の最後のヌクレオチド及びＩｇＧ１重鎖配列の初めの２個のヌクレオチドの翻訳物に由来する。

（５） 完全長重鎖ヒト化ＬＲ２Ｂ８ＨＣ重鎖可変領域及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１）（下線：シグナル配列）（配列番号１８６）

（６） 完全長重鎖ヒト化ＬＲ２Ｂ８ＨＣ重鎖可変領域及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１）を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１８７）

（７） ヒト化ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣ重鎖可変領域をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１８８）

（８） ヒト化ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣ重鎖可変領域を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１８９）

（９） 完全長重鎖ヒト化ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣ重鎖可変領域及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１）をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１９０）

（１０） 完全長重鎖ヒト化ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣ重鎖可変領域及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１）を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１９１）

（１１） ヒト化ＬＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１９２）

（１２） ヒト化ＬＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１９３）

（１３） ヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１）をコードしている核酸配列（配列番号１９４）

（１４） ヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１）を規定する蛋白質配列（配列番号１９５）。最初のアミノ酸は、可変領域の最後のヌクレオチドおよびκ軽鎖配列の開始２ヌクレオチドの翻訳物に由来する。

（１５） 完全長ＬＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域及びヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１）をコードしている核酸配列 （配列番号１９６）

（１６） 完全長ＬＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域及びヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１）をコードしている蛋白質配列（配列番号１９７）

（１７） ヒト化ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号１９８）

（１８） ヒト化ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号１９９）

（１９） 完全長ヒト化ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域及びヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１）をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号２００）

（２０） 完全長ヒト化ＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ軽鎖可変領域及びヒトカッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１）を規定する蛋白質配列（配列番号２０１）

便宜のため、このセクションで説明した抗体の完全長配列と配列表に示したものとの対応関系を示すコンコーダンス表を表１４に示した。

表１５は、以上の本実施例で説明したヒト化の方法１及びヒト化の方法２により作製したヒト化２Ｂ８抗体の重鎖ＣＤＲ配列（カバットの定義）をまとめたものである。

表１６は、以上の本実施例で説明したヒト化の方法１及びヒト化の方法２により作製したヒト化２Ｂ８抗体の軽鎖ＣＤＲ配列（カバット（Ｋａｂａｔ）の定義）をまとめたものである。

Ｃ． ヒト化２Ｂ８抗体の結合親和性
ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００装置を用いて表面プラスモン共鳴法により抗原結合親和性及び相互作用の速度を評価した。マウス抗ヒト免疫グロブリン（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）、２０９−００５−０９８）は、標準的なカップリングプロトコルをメーカーの推奨事項に従って用いたアミンカップリング（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５０）によりカルボキシメチル化デキストランＣＭ４センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００５−３４）上に固定化した。分析は、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５４）、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＥＭＤ社カタログ番号２９３０）及び１０ｍｇ／ｍＬのＣＭ−デキストランナトリウム塩（フルカ社（Ｆｌｕｋａ）、カタログ番号８６５２４）を含有するＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社、カタログ番号１４０４０−１３３）を泳動用緩衝液として用い、２５℃で行った。

前記抗体は、個々のフローセル上で１０μＬ／分の流速で捕捉した。各抗体が各サイクルで捕捉される約２０ＲＵの抗体を生じるための注入時間にはばらつきがあった。緩衝液又は泳動用緩衝液で希釈したＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５）を対照表面（捕捉抗体なし）及び活性表面（試験対象抗体あり）上に６０μＬ／分で２分間順次注入した。解離相を濃度に応じて１５又は９０分間モニターした。その後、上記表面は、別のサイクルが開始される前に、ｐＨ２．０の１０ｍＭグリシン−塩酸（ＢＩＡｃｏｒｅ社、カタログ番号ＢＲ−１００３−５５）を６０μＬ／分の流速で３分間注入して再生させた。試験したＨＧＦ濃度は１．８８、３．７５及び７．５ｎＭであった。速度論的パラメータは、対照値減算を含むＢＩＡエバリュエーション（ＢＩＡｅｖａｌｕｔａｔｉｏｎ）ソフトウェアの速度関数を用いて求めた。各抗体の速度論的パラメータｋ_ａ（会合速度定数）、ｋ_ｄ（解離速度定数）及びＫ_Ｄ（平衡解離定数）を図８にまとめた。

図８にまとめた結果から、超ヒト化重鎖（Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５ａ．１、Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１又はＨｕ２Ｂ８ Ｈｖｌ−ｆ．ｌ）及び軽鎖（Ｈｕ２Ｂ８ Ｋｖｌ−３９．１又はＨｕ２Ｂ８ Ｋｖ３−１５．１）の一部の組合せは、キメラ２Ｂ８（マウス可変領域及びヒト定常領域）並びに２Ｂ８（表５）と同様なＨＧＦとの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を保持することが分かる。
Ｄ． 相互排他的結合
ＨＧＦへの相互排他的結合についてＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００装置を用いて表面プラスモン共鳴により評価した。マウス抗ヒト免疫グロブリン（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）、２０９−００５−０９８）は、標準的なカップリングプロトコルをメーカーの推奨事項に従って用いたアミンカップリング（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５０）によりカルボキシメチル化デキストランＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００６−６８）上に固定化した。分析は、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＢＲ−１０００−５４）、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＥＭＤ社カタログ番号２９３０）及び１０ｍｇ／ｍＬのＣＭ−デキストランナトリウム塩（フルカ社（Ｆｌｕｋａ）、カタログ番号８６５２４）を含有するＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社、カタログ番号１４０４０−１３３）を泳動用緩衝液として用い、２５℃で行った。

前記ヒト化抗体は、個々のフローセル上で３０μＬ／分の流速で捕捉した。各抗体が各サイクルで捕捉される約１５０ＲＵの抗体を生じるための注入時間にはばらつきがあった。７．５μｇ／ｍＬの最終濃度に泳動用緩衝液で希釈したＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５）を上記捕捉ヒト化抗体上に３０μＬ／分で９０秒間注入した。ＨＧＦの結合を測定した後、続いてマウス２Ｂ８抗体又はヤギポリクロナール抗ＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ＡＦ２９４）を３０μＬ／分で３分間注入した。その後、上記表面は、別の抗体が試験される前に、ｐＨ２．０の１０ｍＭグリシン−塩酸（ＢＩＡｃｏｒｅ社、カタログ番号ＢＲ−１００３−５５）を６０μＬ／分の流速で３分間注入して再生させた。得られた結果は図９にまとめた。

図９にまとめた結果から、ヒト化２Ｂ８抗体及びキメラ２Ｂ８抗体はいずれもマウス２Ｂ８がＨＧＦに結合するのを妨げることが分かる。以上の結果は、ヒト化抗体がそれでもなお元の２Ｂ８抗体と同じＨＧＦ抗原決定基に結合することを証明している。
（実施例１３）
ヒト化２Ｂ８変異体の作製
ａ． ヒューマン・エンジニアード（商標）抗体
ヒトカッパ及びガンマ−１定常領域モジュールを含むＸＯＭＡ社の一過性抗体発現ベクター中に、コドン−及び発現適正化低リスク及び低プラス中等度リスクヒューマン・エンジニアード軽鎖（それぞれ、ＬＲ２Ｂ８ＬＣ及びＬＲＭＲ２Ｂ８Ｌ）及び重鎖（それぞれ、ＬＲ２Ｂ８ＨＣ及びＬＲＭＲ２ＢＨＣ）をインフェーズでクローニングした。これら４種のヒューマン・エンジニアード２Ｂ８変異体は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞への一過性形質移入によって作製した。以下の４種の抗体を作製した。

ＨＥ２Ｂ８−１ ＝ ＬＲ２Ｂ８ＨＣ（＋ＩｇＧ１定常領域（Ｇｌｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子１））（配列番号１８７）プラスＬＲ２Ｂ８ＬＣ（＋カッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子１）））（配列番号１９７）
ＨＥ２Ｂ８−２ ＝ ＬＲ２Ｂ８ＨＣ（＋ＩｇＧｌ定常領域（Ｇｌｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子１））（配列番号１８７）プラスＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ（＋カッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子１）））（配列番号２０１）
ＨＥ２Ｂ８−３ ＝ ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣ（＋ＩｇＧ１定常領域（Ｇｌｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子１））（配列番号１９１）プラスＬＲ２Ｂ８ＬＣ（＋カッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子１）））（配列番号１９７）
ＨＥ２Ｂ８−４ ＝ ＬＲＭＲ２Ｂ８ＨＣ（＋ＩｇＧ１定常領域（Ｇｌｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子１））（配列番号１９１）プラスＬＲＭＲ２Ｂ８ＬＣ（＋カッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子１）））（配列番号２０１）
これら軽及び重鎖は、２リットルの振盪フラスコを用いてＩＳ２９３培地（アーバイン・サイエンティフィック社、アーバイン、カリフォルニア州）中で増殖させたＸＯＭＡ社の懸濁適応ＨＥＫ２９３Ｅ細胞中に同時形質移入した。振盪フラスコでの２４時間の形質移入後、形質移入細胞２００ｍＬを遠心分離し、新鮮培地４０ｍＬに再懸濁し、産生用インテグラ（Ｉｎｔｅｇｒａ）フラスコ（ウィルソン・ウォルフ・マニュファクチャリング社（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｃ．）、ミネソタ州）に移した。数日間のインキュベーション後、細胞懸濁液をインテグラフラスコから取り出し、遠心分離して培養上清を残した。この培養上清中の抗体をプロテインＡスピンカラム（プロ−ケム社）で精製し、ＰＢＳに対して透析し、濃縮して除菌した。

ｂ． スーパーヒューマナイズド（ＳＵＰＥＲＨＵＭＡＮＩＺＥＤ）（商標）抗体
完全長Ｈｕ２Ｂ８＿Ｈｖ５−５１．１＋ヒトＩｇＧ１定常ドメイン（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）ｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を利用してｐＥＥ６．４（ロンザバイオロジックス社（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、バークシャー、英国）中にクローニングした。完全長Ｈｕ２Ｂ８＿Ｋｖ−３９．１可変領域＋ヒトカッパ鎖定常ドメインｃＤＮＡ及び完全長Ｈｕ２Ｂ８＿Ｋｖ３−１５．１可変領域＋ヒトカッパ鎖定常ドメインｃＤＮＡをそれぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を利用してｐＥＥ１４．４（ロンザバイオロジックス社）中にクローニングした。（ｐＥＥ６．４内の）ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター＋完全長Ｈｕ２Ｂ８＿Ｈｖ５−５１．１＋ヒトＩｇＧ１定常ドメイン（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）ｃＤＮＡ＋ＳＶ４０ポリＡ断片をＮｏｔＩ／ＳａｌＩ消化により切り出し、どちらのカッパ鎖ｐＥＥ１４．４ベクター中にもＮｏｔＩ／ＳａｌＩ部位から挿入することにより、それぞれ重及び軽鎖を同時に発現する２種の発現ベクターを作り、以下の抗体を作製した。

ｓｈ２Ｂ８−９（Ｇｌｍ（３）） ＝ ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１（＋ＩｇＧｌ定常領域（Ｇｌｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子２））（配列番号２１０）プラスｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ １−３９．１（＋カッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子２）））（配列番号１７７）
ｓｈ２Ｂ８−１２（Ｇｌｍ（３）） ＝ ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１（＋ＩｇＧ１定常領域（Ｇｌｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子 ２））（配列番号２１０）プラスｈｕ２Ｂ８ Ｋｖ ３−１５．１（＋カッパ鎖定常領域（Ｋｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子２）））（配列番号１８１）
上記ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域Ｇ１ｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子２）及び上記各完全長重鎖配列をコードしている核酸配列並びにこれらを規定する蛋白質配列を以下に記載した。軽鎖の配列は実施例１２に記載したのと同じであった。

（１） ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子２）をコードしている核酸配列（配列番号２０７）。

（２） ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｇ１ｍ（３）アロタイプ）（対立遺伝子１又は２） を規定する蛋白質配列（配列番号２０８）。最初のアミノ酸は、可変領域の最後のヌクレオチドおよびＩｇＧ１重鎖配列の開始２ヌクレオチドの翻訳物に由来する。

（３） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１重鎖可変領域及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域Ｇ１ｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子２）を含む完全長鎖をコードしている核酸配列（下線：シグナル配列）（配列番号２０９）

（４） ヒト化Ｈｕ２Ｂ８ Ｈｖ５−５１．１及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域Ｇ１ｍ（３）アロタイプ（対立遺伝子２）を含む完全長鎖を規定する蛋白質配列（シグナル配列なし）（配列番号２１０）

各二重発現ベクターを２９３Ｔ細胞中に形質移入し、ＤＭＥＭ １０％ウシ胎仔血清を用いて一過性に発現させた。形質移入後４８時間に、無血清培地である、４ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＩＳ ＧＲＯ（商標）（アーバイン・サイエンティフィック社（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、サンタアナ、カリフォルニア州）で細胞を洗浄した後、これで置換した。上清を１０日間毎日採取し、新鮮培地で置換した。この培養上清を遠心分離し、濾過（０．４５μｍ）して１０〜１００倍に濃縮した。抗体は、プロステップ（ＰｒｏＳｅｐ）ｖＡ樹脂（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で精製し、ＰＢＳに対して透析し、除菌した。
（実施例１４）
ヒト化２Ｂ８変異体の結合特性
実施例１３で作製したヒト化抗体の特徴は、ｈＨＧＦ及び実施例３で作製した組換えＨＧＦ蛋白質に結合できることであった。

ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００装置を用いて表面プラスモン共鳴によりこれらの抗体を分析することによってＨＧＦ及び実施例３に記載した融合蛋白質へのその結合能を評価した。各抗体は、標準的なカップリングプロトコルをメーカーの使用説明書に従って用いたアミンカップリング（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５０）によりカルボキシメチル化デキストランＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００６−６８）上に固定化した。

分析は、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号Ｒ−１０００−５４）、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＥＭＤ社カタログ番号２９３０）及び１０ｍｇ／ｍＬのＣＭ−デキストランナトリウム塩（フルカ社（Ｆｌｕｋａ）、カタログ番号８６５２４）を含有するＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社、カタログ番号１４０４０−１３３）を泳動用緩衝液として用い、２５℃で行った。種々のＨＧＦ融合蛋白質を含む上清又は空のベクターを形質移入した細胞からの上清を各抗体上に３０μＬ／分の流速で３分間注入した。その結果生じた結合は、注入終了後３０秒のベースラインに対する共鳴単位（ＲＵ）として求めた。結合は、泳動用緩衝液で希釈したヒトＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５）と比較した。非特異的な結合は、対照表面への結合を比較することにより測定した。得られた結果は表１７にまとめた。

表１７の結果から明らかなように、ヒト化２Ｂ８系抗体はｒｈＨＧＦ及び３種のマウス−ヒト−マウスキメラ抗体の全てに結合する。
（実施例１５）
ヒト化２Ｂ８変異体の結合親和性
表１５に示した抗体の結合親和性及び相互作用の速度を表面プラスモン共鳴によって測定した。

マウス抗ヒト免疫グロブリン（ジャクソン・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）、２０９−００５）は、標準的なカップリングプロトコルをメーカーの使用説明書に従って用いたアミンカップリング（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５０）によりカルボキシメチル化デキストランＣＭ４センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００６−６８）上に固定化した。分析は、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５４）及び２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＥＭＤ社カタログ番号２９３０）を含有するＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社、カタログ番号１４０４０−１３３）を用い、２５℃で行った。

前記抗体は、個々のフローセル内で１０μＬ／分の流速で捕捉した。各抗体が各サイクルで捕捉される約２０ＲＵの抗体を生じるための注入時間にはばらつきがあった。緩衝液又は泳動用緩衝液で希釈したＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５）を対照表面（捕捉抗体なし）及び活性表面（試験対象抗体あり）上に６０μＬ／分で２分間順次注入した。解離相を濃度に応じて１５又は９０分間モニターした。その後、上記表面は、別のサイクルが開始される前に、ｐＨ２．２の１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ＢＩＡｃｏｒｅ社、カタログ番号ＢＲ−１００３−５４）を６０μＬ／分の流速で３分間注入して再生させた。試験したＨＧＦ濃度は０．４６ｎＭ及び７．５ｎＭであった。

速度論的パラメータは、対照値減算を含むＢＩＡエバリュエーション（商標）ソフトウェアの速度関数を用いて求めた。各抗体の速度論的パラメータｋ_ａ（会合速度定数）、ｋ_ｄ（解離速度定数）及びＫ_Ｄ（平衡解離定数）を表１８にまとめた。

これらのデータから、これらのヒト化抗体は速い会合速度（ｋ_ａ）、極めて遅い解離速度（ｋ_ｄ）及び極めて高い親和性（Ｋ_Ｄ）を有することが分かる。具体的には、これらの抗体は２．０乃至１２ｐＭの範囲の親和性を有する。
（実施例１６）
２５℃及び３７℃における結合親和性の比較
抗体ＨＥ２Ｂ８−４、ｓｈ２Ｂ８−９、ｓｈ２Ｂ８−１２及びマウス２Ｂ８の結合親和性及び相互作用の速度を種々の条件下で表面プラスモン共鳴により測定した。

マウス抗ヒト免疫グロブリン（ジャクソン・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）、２０９−００５）又はウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００５−１４）は、標準的なカップリングプロトコルをメーカーの使用説明書に従って用いたアミンカップリング（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５０）によりカルボキシメチル化デキストランＣＭ４センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００６−６８）上に固定化した。ｓＨ２ｂ８−９及びｓｈ２Ｂ８−１２についての２５℃における測定の場合、ＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００６−６８）を用いた。これらの分析は、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０（ＢＩＡｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１０００−５４）及び２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＥＭＤ社カタログ番号２９３０）を含有するＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社、カタログ番号１４０４０−１３３）を泳動用緩衝液として用い、２５℃及び３７℃で行った。

前記抗体は、個々のフローセル内で１０μＬ／分の流速で捕捉した。各抗体が各サイクルで捕捉される約２０ＲＵの抗体を生じるための注入時間にはばらつきがあった。緩衝液又は泳動用緩衝液で希釈したＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５）を対照表面（捕捉抗体なし）及び活性表面（試験対象抗体あり）上に６０μＬ／分で２分間順次注入した。解離相を濃度に応じて１５又は９０分間モニターした。その後、マウス抗ヒト免疫グロブリンセンサーチップの表面は、別のサイクルが開始される前に、ｐＨ２．２の１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ＢＩＡｃｏｒｅ社、カタログ番号ＢＲ−１００３−５４）を６０μＬ／分の流速で３分間注入して再生させた。ウサギ抗マウスグロブリンセンサーチップの表面は、別のサイクルが開始される前に、ｐＨ１．７の１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ＢＩＡｃｏｒｅ社、カタログ番号ＢＲ−１００３−５４）を６０μＬ／分の流速で３分間注入して再生させた。試験したＨＧＦ濃度は０．４６ｎＭ及び７．５ｎＭであった。

速度論的パラメータは、対照値減算を含むＢＩＡエバリュエーションソフトウェアの速度関数を用いて求めた。各抗体の速度論的パラメータｋ_ａ（会合速度定数）、ｋ_ｄ（解離速度定数）及びＫ_Ｄ（平衡解離定数）を下記の表１９にまとめた。

予想どおり、会合速度定数は温度の上昇と共に増大した。意外なことに、解離定数は温度の対応する上昇と共に増大することはなかった。その結果、全体としての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、生理的温度（３７℃）で約１．４乃至３倍小さい（高い親和性）ものであった。
（実施例１７）
ヒト化２Ｂ８変異体の中和活性
実施例１４で作製した抗体について、（ａ）ｃ−ＭｅｔへのｈＨＧＦの結合を阻害し、（ｂ）４ＭＢｒ−５細胞におけるＢｒｄＵ取り込みのＨＧＦによる促進を阻害する能力を特性化した。

ＨＧＦ−Ｍｅｔ結合阻害試験（中和試験）は以下のようにして実施した。ｃ−ＭｅｔへのｈＨＧＦの結合を阻害する抗体の能力についてはＥＬＩＳＡにより試験した。すなわち、ワラック９６穴ＤＥＬＦＩＡアッセイプレート（ワラック社、カタログ番号ＡＡＡＮＤ−０００１）を６．２５μｇ／ｍＬ ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号２９４−ＨＧＮ−０２５）の炭酸コーティング緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３及び３４ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．０）溶液１００μＬにより４℃で１６時間コーティングした。次に、このプレートを室温で１時間５％脱脂粉乳のＰＢＳ溶液２００μＬでブロックした。抗体は、別のプレートにおいて５％脱脂粉乳のＰＢＳ溶液に溶解した２ｎＭのビオチニル化ｃ−Ｍｅｔに検討対象の抗体を漸増濃度（０．０３３乃至２５０ｎＭ、２倍段階希釈）で加えることにより調製した。ｃ−Ｍｅｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号３５８−ＭＴ／ＣＦ）のビオチニル化は、１０：１のビオチン／ｃ−Ｍｅｔ比でメーカーの使用説明書に従って行う（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）、カタログ番号２１３３５）。ウェル当たり１００μＬのサンプルを上記アッセイプレートに移し、室温で２時間インキュベートした。次いで、上記で得られたプレートをＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液（ワラック社、カタログ番号４００２−００１０）で１：１，０００に希釈したＥｕ標識ストレプトアビジン（ワラック社、カタログ番号１２４４−３６０）と共に室温で１時間インキュベートした。その結果得られたプレートをＤＥＬＦＩＡ洗浄液（ワラック社、カタログ番号４０１０−００１０）で３回洗浄した後、１００μＬ／ウェルのＤＥＬＦＩＡ強化溶液（ワラック社、＃４００１−００１０）と共に攪拌しながら室温で１５分間インキュベートした。上記プレートは、ユウロピウム法を用いるビクター^３Ｖ装置（パーキンエルマー社）で読み取らせた。ＩＣ_５０値はプリズム（Ｐｒｉｓｍ）を用いて算出した。

得られたＩＣ_５０値を表２０に示した。

この表２０の結果から明らかなように、試験したヒト化抗体はｃ−ＭｅｔへのＨＧＦの結合を効率的に中和する。

表１７の抗体は、実施例７（ｂ）で説明した細胞増殖アッセイにおいても試験した。その結果は下記の表２１にまとめた。

この表２１の結果から明らかなように、試験したヒト化抗体は全て４ＭＢｒ−５細胞のＨＧＦ誘発性増殖を抑制する。
（実施例１８）
ヒト化２Ｂ８変異体の抗散乱活性
表１７の抗体を実施例８で説明した抗散乱アッセイにおいて試験した。その結果を下記の表２２にまとめた。

表２２の結果から明らかなように、試験したヒト化抗体は全て、マウスモノクローナル抗体２Ｂ８と同程度にＨＧＦ誘発性散乱を抑制した。
（実施例１９）
ＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害
表１７の抗体を実施例９で説明したｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイにおいて試験した。その結果を下記の表２３にまとめた。

表２３の結果から明らかなように、試験したヒト化抗体は、ＰＣ−３細胞においてＨＧＦ誘発性ｃ−Ｍｅｔリン酸化の強力な阻害剤である。
（実施例２０）
Ｕ８７ＭＧ異種移植モデルにおける腫瘍抑制
Ｕ８７ＭＧ異種移植モデルを用い、本発明のヒト化モノクローナル抗体の腫瘍増殖抑制能について試験した。Ｕ８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ）は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）を１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンと共に含む培地を用いた、５％ＣＯ_２及び９５％空気を含有する雰囲気中３７℃の培養で増殖させた。これらの細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて培養皿の壁から細胞を剥離することにより二次培養して維持した。

コンフルエントに近い細胞をトリプシン処理により回収し、次いで、５０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤバイオサイエンシズ社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、カタログ番号３５６２３７）中の細胞５×１０^６個を、７週齢雌性ＩＣＲ ＳＣＩＤマウス（タコニックラボラトリー社（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ））の肩甲骨間の上背部に皮下注射した。キャリパで腫瘍の長径（Ｌ）及び短径（Ｗ）（ｍｍ）を測定した。腫瘍容積（ｖｏｌ．）は、容積（ｍｍ^３）＝Ｌ×Ｗ^２／２として計算した。腫瘍が約２００ｍｍ^３にまで成長した時に、担腫瘍マウスを１群１０匹の５群に無作為化した。１群にはＰＢＳを投与し、１群にはヒトＩｇＧ対照を投与した。その他の４群のそれぞれには、ヒト化抗体（ＨＥ２Ｂ８−１、ＨＥ２Ｂ８−２、ＨＥ２Ｂ８−３及びＨＥ２Ｂ８−４）のうちの１種を投与した。抗体は全て、５用量の腹腔内注射により週２回０．２５ｍｇ／ｋｇ体重を投与した。腫瘍容積及びマウス体重を週２回記録した。スチューデントのｔ−検定を用いて腫瘍成長の抑制を解析した。

試験したヒト化抗体はインビボで活性があった。ＨＥ２Ｂ８−１では５７％の腫瘍成長抑制（ｐ値：０．０２）、ＨＥ２Ｂ８−２では６１％の腫瘍成長抑制（ｐ値：０．０２）、ＨＥ２Ｂ８−３では８５％の腫瘍成長抑制（ｐ値：０．０００４）、ＨＥ２Ｂ８−４では７４％の腫瘍成長抑制（ｐ値：０．００１）が認められた。有意な体重減少は認められなかった。

その後の実験は、側腹部に接種された皮下Ｕ８７ＭＧ腫瘍を有する雌性ＮＣＲヌードマウス（タコニックラボラトリー社）において前述のようにして実施した。各群（１群１０匹）には０．５ｍｇ／ｋｇの以下の処置剤、即ち、ＰＢＳ溶媒対照、ｈｕＩｇＧ対照、ＨＥ２Ｂ８−４又はｓｈ２Ｂ８−９のうちの１種を投与した。処置剤は、最低でも５週間、週２回腹腔内投与した。各投与群は、腫瘍成長の抑制がｓｈ２Ｂ８−９で１１３％、ＨＥ２Ｂ８−４で１１５％と同様な腫瘍退縮を示し、最低腫瘍成長遅延日数が３０日であった。両投与とも有意な体重減少がなく、忍容性良好であった。
引用による組込み
本明細書で触れた特許文献及び科学論文のそれぞれの開示内容はその全体があらゆる目的で引用により組み込まれている。

均等物
本発明は, 当該発明の精神または主要な特徴から逸脱することなく, 他のさまざまな形式で実施することができる。そのため、前述の実施態様はあらゆる点で単なる例示にすぎず、本明細書に記載された発明に対して限定的に解釈してはならない。従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって示すものであり、明細書の本文によって拘束されるものではない。また、特許請求の範囲の記載内容と同等の範囲に含まれる変形もしくは変更は、すべて本発明の範囲内のものである。

Claims (4)

1. 配列番号１９９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、および、配列番号１８９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、ヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に結合する単離された抗体、または、該抗体の抗原結合フラグメント。
2. 配列番号２０１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖配列、および、配列番号１９１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖配列を含む、ヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に結合する単離された抗体、または、該抗体の抗原結合フラグメント。
3. モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
4. モノクローナル抗体である、請求項２に記載の抗体。