JP4560582B2 - 肝細胞成長因子(hgf)結合蛋白質 - Google Patents
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Description
本願は、2006年6月2日に出願された米国仮特許出願第60/810,714号、および2006年11月21日に出願された同第60/860,509号の利益およびそれらへの優先権を主張するものであり、それらの開示は本明細書中に参考として援用される。
本発明の分野は、分子生物学、免疫学及び腫瘍学の分野である。より詳細には、この分野は、ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する抗体系結合蛋白質の分野である。
分散因子(SF:Scatter Factor)とも呼ばれる肝細胞成長因子(HGF:Hepatocyte Growth Factor)は、主として間葉細胞により産生される多機能性ヘテロ二量体蛋白質であり、Metチロシンキナーゼ受容体を発現する細胞のエフェクタである(非特許文献1、非特許文献2)。ヒトMet受容体は「c−Met」とも呼ばれる。成熟HGFは2本のポリペプチド鎖、α鎖及びβ鎖を含有している。公表された研究によれば、HGFのc−Met受容体結合ドメインを含有するのはα鎖であることが示唆されている。
本発明の一部は、HGF、特にヒトHGFを特異的に結合する一群の結合蛋白質の発見に基づいている。これらの結合蛋白質は、HGFを特異的に結合する一群の抗体のCDRに基づく抗原(即ち、HGF)結合部位を含有する限りにおいて、抗体系である。このCDRは結合蛋白質のHGFに対する結合特異性をもたらす。こうした結合蛋白質は診断剤及び治療剤として使用することができる。治療剤として用いる場合、結合蛋白質は、レシピエント(例えば、ヒト)に投与した時にこの結合蛋白質に対する免疫反応を誘発するリスクを低減又は排除できるように設計(例えば、ヒト化)する。
結合蛋白質は、HGF活性を中和するので、治療剤として用いることができる。一部の実施態様として、この結合蛋白質は、HGFがその同族受容体c−Metに結合するのを妨げることによってHGF活性を中和する。別の実施態様として、この結合蛋白質は、HGFに結合してその生物活性を中和するが、HGFがc−Met受容体に結合するのを妨げない。HGFが癌細胞の成長及び増殖に関与しているので、この結合蛋白質は癌細胞の増殖を抑制するのに用いることができる。さらに、この結合蛋白質は、哺乳動物に投与すると、その哺乳動物における腫瘍の成長を抑制又は低減することができる。
(項目1)
ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質であって、
(a)構造CDR L1 −CDR L2 −CDR L3 を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域であって、
(i)CDR L1 が、アミノ酸配列X 1 X 2 SerX 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 X 12 X 13 X 14 X 15 であって、アミノ酸X 1 がArg、Lys又はSerであり、X 2 がAla又はThrであり、X 4 がGlu、Gln又はSerであり、X 5 がAsn、Asp又はSerであり、X 6 がIle又はValであり、X 7 がAsp、Lys、Ser、Val又はTyrであり、X 8 がペプチド結合又はTyrであり、X 9 がペプチド結合又はAspであり、X 10 がペプチド結合又はGlyであり、X 11 がペプチド結合又はAsnであり、X 12 がペプチド結合、Ile又はSerであり、X 13 がAsn又はTyrであり、X 14 がIle、Leu、Met又はValであり、X 15 がAla、Asn、His又はSerであるものとするアミノ酸配列を含み、
(ii)CDR L2 が、アミノ酸配列X 16 X 17 X 18 X 19 X 20 X 21 X 22 であって、アミノ酸X 16 がAla、Asp、Arg、Gly又はValであり、X 17 がAla、Thr又はValであり、X 18 がAsn、Ser又はThrであり、X 19 がArg、Asn、Lys又はHisであり、X 20 がLeu又はArgであり、X 21 がAla、Asn、Glu、Val又はProであり、X 22 がAsp、Ser又はThrであるものとするアミノ酸配列を含み、及び
(iii)CDR L3 が、アミノ酸配列X 23 X 24 X 25 X 26 X 27 X 28 ProX 30 Thrであって、アミノ酸X 23 がLeu、Gly又はGlnであり、X 24 がHis又はGlnであり、X 25 がPhe、Ser、Trp又はTyrであり、X 26 がAsp、Ile、Ser、Trp又はTyrであり、X 27 がGly、Glu、Asn又はSerであり、X 28 がAsp、Asn、Phe、Thr又はTyrであり、X 30 がLeu、Phe、Pro又はTyrであるものとするアミノ酸配列を含む
ものとする免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに
(b)3箇所の相補性決定領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含み、該免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖の相補性決定領域がヒトHGFに結合する結合部位を規定するものとする結合蛋白質。
(項目2)
ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質であって、
(a)構造CDR H1 −CDR H2 −CDR H3 を含む免疫グロブリン重鎖可変領域であって、
(i)CDR H1 が、アミノ酸配列X 1 TyrX 3 X 4 X 5 であって、アミノ酸X 1 がAsp、Asn、Ser又はThrであり、X 3 がPhe、Ser、Trp又はTyrであり、X 4 がIle、Leu又はMetであり、X 5 がAsn、His又はSerであるものとするアミノ酸配列を含み、
(ii)CDR H2 が、アミノ酸配列X 6 IleX 8 X 9 X 10 X 11 GlyX 13 X 14 X 15 TyrX 17 X 18 X 19 X 20 X 21 X 22 であって、アミノ酸X 6 がLys、Gln、Glu、Val又はTyrであり、X 8 がAsn、Gly、Ser、Trp又はTyrであり、X 9 がAla、Pro又はSerであり、X 10 がGly又はThrであり、X 11 がペプチド結合、Asp、Asn、Gly又はSerであり、X 13 がAsp、Asn、His又はSerであり、X 14 がSer又はThrであり、X 15 がAsn又はTyrであり、X 17 がAsn又はProであり、X 18 がAla、Asp、Gly、Glu、Pro又はSerであり、X 19 がAsn、Lys、Met又はSerであり、X 20 がLeu、Phe又はValであり、X 21 がLys、Met又はGlnであり、X 22 がAsp、Gly又はSerであるものとするアミノ酸配列を含み、及び
(iii)CDR H3 が、アミノ酸配列X 23 X 24 X 25 X 26 X 27 X 28 X 29 X 30 X 31 X 32 X 33 X 34 Tyrであって、アミノ酸X 23 がArg、Asn、Gln又はGluであり、X 24 がGly、Leu、Arg又はTyrであり、X 25 がペプチド結合、Asp又はGlyであり、X 26 がペプチド結合又はGlyであり、X 27 がペプチド結合又はTyrであり、X 28 がペプチド結合、Leu又はTyrであり、X 29 がペプチド結合、Gly、Leu、Arg又はValであり、X 30 がペプチド結合、Asp、Gly又はGluであり、X 31 がペプチド結合、Asn、Arg、Ser又はTyrであり、X 32 がペプチド結合、Ala、Gly、Ile又はTyrであり、X 33 がMet又はPheであり、X 34 がAla又はAspであるものとするアミノ酸配列を含む
ものとする免疫グロブリン重鎖可変領域、並びに
(b)3箇所の相補性決定領域を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含み、該免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖の相補性決定領域がヒトHGFに結合する結合部位を規定するものとする結合蛋白質。
(項目3)
該免疫グロブリン軽鎖可変領域が、構造CDR L1 −CDR L2 −CDR L3 であって、
(i)CDR L1 が、アミノ酸配列X 1 X 2 SerX 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 X 12 X 13 X 14 X 15 であって、アミノ酸X 1 がArg、Lys又はSerであり、X 2 がAla又はThrであり、X 4 がGlu、Gln又はSerであり、X 5 がAsn、Asp又はSerであり、X 6 がIle又はValであり、X 7 がAsp、Lys、Ser、Val又はTyrであり、X 8 がペプチド結合又はTyrであり、X 9 がペプチド結合又はAspであり、X 10 がペプチド結合又はGlyであり、X 11 がペプチド結合又はAsnであり、X 12 がペプチド結合、Ile又はSerであり、X 13 がAsn又はTyrであり、X 14 がIle、Leu、Met又はValであり、X 15 がAla、Asn、His又はSerであるものとするアミノ酸配列を含み、
(ii)CDR L2 が、アミノ酸配列X 16 X 17 X 18 X 19 X 20 X 21 X 22 であって、アミノ酸X 16 がAla、Asp、Arg、Gly又はValであり、X 17 がAla、Thr又はValであり、X 18 がAsn、Ser又はThrであり、X 19 がArg、Asn、Lys又はHisであり、X 20 がLeu又はArgであり、X 21 がAla、Asn、Glu、Val又はProであり、X 22 がAsp、Ser又はThrであるものとするアミノ酸配列を含み、及び
(iii)CDR L3 が、アミノ酸配列X 23 X 24 X 25 X 26 X 27 X 28 ProX 30 Thrであって、アミノ酸X 23 がLeu、Gly又はGlnであり、X 24 がHis又はGlnであり、X 25 がPhe、Ser、Trp又はTyrであり、X 26 がAsp、Ile、Ser、Trp又はTyrであり、X 27 がGly、Glu、Asn又はSerであり、X 28 がAsp、Asn、Phe、Thr又はTyrであり、X 30 がLeu、Phe、Pro又はTyrであるものとするアミノ酸配列を含む
ものとする構造を含む項目2の単離抗体。
(項目4)
前記相補性決定領域がフレームワーク領域間に挿入されている項目1、2又は3の結合蛋白質。
(項目5)
前記CDR配列がヒト又はヒト化フレームワーク領域間に挿入されている項目4の結合蛋白質。
(項目6)
項目1の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む単離核酸。
(項目7)
項目6のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
(項目8)
項目7の発現ベクターを含む宿主細胞。
(項目9)
結合蛋白質を作製する方法であって、
(a) 項目8の宿主細胞を該宿主細胞が前記免疫グロブリン軽鎖可変領域発現するような条件下で増殖させ、及び
(b)該免疫グロブリン軽鎖可変領域を採取すること
を含む方法。
(項目10)
工程(b)の後、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域が共同してヒトHGFに結合するように、該軽鎖可変領域が該重鎖可変領域に共有結合される項目9の方法。
(項目11)
項目2の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む単離核酸。
(項目12)
項目11のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
(項目13)
項目12の発現ベクターを含む宿主細胞。
(項目14)
結合蛋白質作製する方法であって、
(a) 項目13の宿主細胞を該宿主細胞が前記免疫グロブリン重鎖可変領域を発現するような条件下で増殖させ、及び
(b)該免疫グロブリン重鎖可変領域を採取すること
を含む方法。
(項目15)
工程(b)の後、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域及び該免疫グロブリン重鎖可変領域がヒトHGFに結合する結合部位を共同して規定するように、該重鎖可変領域が該軽鎖可変領域に共有結合される項目14の方法。
(項目16)
ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質であって、
(a)構造CDR L1 −CDR L2 −CDR L3 を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域であって、
(i)CDR L1 が、配列番号8(1A3)、配列番号18(2B8)、配列番号28(2F8)、配列番号38(3B6)、配列番号48(3D11)、配列番号58(1D3)、配列番号68(1F3)及び配列番号78(3A12)からなる群から選ばれる配列を含み、
(ii)CDR L2 が、配列番号9(1A3)、配列番号19(2B8)、配列番号29(2F8)、配列番号39(3B6)、配列番号49(3D11)、配列番号59(1D3)、配列番号69(1F3)及び配列番号79(3A12)からなる群から選ばれる配列を含み、及び
(iii)CDR L3 が、配列番号10(1A3)、配列番号20(2B8)、配列番号30(2F8)、配列番号40(3B6)、配列番号50(3D11)、配列番号60(1D3)、配列番号70(1F3)及び配列番号80(3A12)からなる群から選ばれる配列を含む
ものとする免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに
(b)免疫グロブリン重鎖可変領域
を含み、該免疫グロブリン軽鎖可変領域及び該免疫グロブリン重鎖可変領域が共同してヒトHGFに結合するための単一結合部位を規定するものとする結合蛋白質。
(項目17)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が
(i) 配列番号8(1A3)の配列を含むCDR L1 、
(ii) 配列番号9(1A3)の配列を含むCDR L2 及び
(iii) 配列番号10(1A3)の配列を含むCDR L3
を含む項目16の結合蛋白質。
(項目18)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が
(i) 配列番号18(2B8)の配列を含むCDR L1 、
(ii) 配列番号19(2B8)の配列を含むCDR L2 及び
(iii) 配列番号20(2B8)の配列を含むCDR L3
を含む項目16の結合蛋白質。
(項目19)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が
(iv) 配列番号28(2F8)の配列を含むCDR L1 、
(v) 配列番号29(2F8)の配列を含むCDR L2 及び
(vi) 配列番号30(2F8)の配列を含むCDR L3
を含む項目16の結合蛋白質。
(項目20)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が
(i) 配列番号38(3B6)の配列を含むCDR L1 、
(ii) 配列番号39(3B6)の配列を含むCDR L2 及び
(iii) 配列番号40(3B6)の配列を含むCDR L3
を含む項目16の結合蛋白質。
(項目21)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が
(i) 配列番号48(3D11)の配列を含むCDR L1 、
(ii) 配列番号49(3D11)の配列を含むCDR L2 及び
(iii) 配列番号50(3D11)の配列を含むCDR L3
を含む項目16の結合蛋白質。
(項目22)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が
(i) 配列番号58(1D3)の配列を含むCDR L1 、
(ii) 配列番号59(1D3)の配列を含むCDR L2 及び
(iii) 配列番号60(1D3)の配列を含むCDR L3
を含む項目16の結合蛋白質。
(項目23)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が
(i) 配列番号68(1F3)の配列を含むCDR L1 、
(ii) 配列番号69(1F3)の配列を含むCDR L2 及び
(iii) 配列番号70(1F3)の配列を含むCDR L3
を含む項目16の結合蛋白質。
(項目24)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が
(i) 配列番号78(3A12)の配列を含むCDR L1 、
(ii) 配列番号79(3A12)の配列を含むCDR L2 及び
(iii) 配列番号80(3A12)の配列を含むCDR L3
を含む項目16の結合蛋白質。
(項目25)
CDR L1 、CDR L2 及びCDR L3 がヒト又はヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域間に挿入される項目16の結合蛋白質。
(項目26)
前記結合蛋白質が抗体又はその抗原結合断片である項目16の結合蛋白質。
(項目27)
前記結合蛋白質がモノクローナル抗体である項目26の結合蛋白質。
(項目28)
ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質であって、
(a)構造CDR H1 −CDR H2 −CDR H3 を含む免疫グロブリン重鎖可変領域であって、
(i)CDR H1 が、配列番号5(1A3)、配列番号15(2B8)、配列番号25(2F8)、配列番号35(3B6)、配列番号45(3D11)、配列番号55(1D3)、配列番号65(1F3)及び配列番号75(3A12)からなる群から選ばれる配列を含み、
(ii)CDR H2 が、 配列番号6(1A3)、配列番号16(2B8)、配列番号26(2F8)、配列番号36(3B6)、配列番号46(3D11)、配列番号56(1D3)、配列番号66(1F3)、配列番号76(3A12)、配列番号202(Hu2B8 Hv1f.1)及び配列番号203(Hu2B8 Hv5a.1及び Hu2B8 Hv5−51.1)からなる群から選ばれる配列を含み、及び
(iii)CDR H3 が、配列番号7(1A3)、配列番号17(2B8)、配列番号27(2F8)、配列番号37(3B6)、配列番号47(3D11)、配列番号57(1D3)、配列番号67(1F3)及び配列番号77(3A12)からなる群から選ばれる配列を含む
ものとする免疫グロブリン重鎖可変領域、並びに
(b)免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含み、該免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域が共同してヒトHGFに結合するための結合部位を規定するものとする結合蛋白質。
(項目29)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が
(i) 配列番号5(1A3)の配列を含むCDR H1 、
(ii) 配列番号6(1A3)の配列を含むCDR H2 及び
(iii) 配列番号7(1A3)の配列を含むCDR H3
を含む項目28の結合蛋白質。
(項目30)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が
(i) 配列番号15(2B8)の配列を含むCDR H1 、
(ii) 配列番号16(2B8)、配列番号202(Hu2B8 Hv1f.1)又は配列番号203(Hu2B8 Hv5a.1及びHu2B8 Hv5−51.1)の配列を含むCDR H2 及び
(iii) 配列番号17(2B8)の配列を含むCDR H3
を含む項目28の結合蛋白質。
(項目31)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が
(i) 配列番号25(2F8)の配列を含むCDR H1 、
(ii) 配列番号26(2F8)の配列を含むCDR H2 及び
(iii) 配列番号27(2F8)の配列を含むCDR H3
を含む項目28の結合蛋白質。
(項目32)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が
(i) 配列番号35(3B6)の配列を含むCDR H1 、
(ii) 配列番号36(3B6)の配列を含むCDR H2 及び
(iii) 配列番号37(3B6)の配列を含むCDR H3
を含む項目28の結合蛋白質。
(項目33)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が
(i) 配列番号45(3D11)の配列を含むCDR H1 、
(ii) 配列番号46(3D11)の配列を含むCDR H2 及び
(iii) 配列番号47(3D11)の配列を含むCDR H3
を含む項目28の結合蛋白質。
(項目34)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が
(i) 配列番号55(1D3)の配列を含むCDR H1 、
(ii) 配列番号56(1D3)の配列を含むCDR H2 及び
(iii) 配列番号57(1D3)の配列を含むCDR H3
を含む項目28の結合蛋白質。
(項目35)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が
(i) 配列番号65(1F3)の配列を含むCDR H1 、
(ii) 配列番号66(1F3)の配列を含むCDR H2 及び
(iii) 配列番号67(1F3)の配列を含むCDR H3
を含む項目28の結合蛋白質。
(項目36)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が
(i) 配列番号75(3A12)の配列を含むCDR H1 、
(ii) 配列番号76(3A12)の配列を含むCDR H2 及び
(iii) 配列番号77(3A12)の配列を含むCDR H3
を含む項目28の結合蛋白質。
(項目37)
CDR H1 、CDR H2 及びCDR H3 がヒト又はヒト化免疫のグロブリンのフレームワーク領域間に挿入される項目28の結合蛋白質。
(項目38)
前記結合蛋白質が抗体又はその抗原結合断片である項目28の結合蛋白質。
(項目39)
前記結合蛋白質がモノクローナル抗体である項目38の結合蛋白質。
(項目40)
項目16の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む単離核酸。
(項目41)
項目40の核酸配列を含む発現ベクター。
(項目42)
項目41の発現ベクターを含む宿主細胞。
(項目43)
結合蛋白質を作製する方法であって、
(a) 項目42の宿主細胞を該宿主細胞が前記免疫グロブリン軽鎖可変領域発現するような条件下で増殖させ、及び
(b)該免疫グロブリン軽鎖可変領域を採取すること
を含む方法。
(項目44)
工程(b)の後、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域及び前記免疫グロブリン重鎖可変領域がヒトHGFに共同して結合するように、該軽鎖可変領域が該重鎖可変領域に共有結合される項目43の方法。
(項目45)
項目28の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む単離核酸。
(項目46)
項目45の核酸配列を含む発現ベクター。
(項目47)
項目46の発現ベクターを含む宿主細胞。
(項目48)
結合蛋白質を作製する方法であって、
(a) 項目47の宿主細胞を該宿主細胞が前記免疫グロブリン重鎖可変領域を発現するような条件下で増殖させ、及び
(b)該免疫グロブリン重鎖可変領域を採取すること
を含む方法。
(項目49)
工程(b)の後、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域及び前記免疫グロブリン重鎖可変領域がヒトHGFに結合することができる結合部位を共同して規定するように、該重鎖可変領域が該軽鎖可変領域に共有結合される項目48の方法。
(項目50)
配列番号4(1A3)の21乃至127番目残基、配列番号14(2B8)の21乃至127番目残基、配列番号24(2F8)の20乃至131番目残基、 配列番号34(3B6)の23乃至129番目残基、配列番号44(3D11)の23乃至128番目残基、配列番号54(1D3)の21乃至127番目残基、配列番号64(1F3)の21乃至127番目残基、配列番号74(3A12)の21乃至127番目残基、配列番号173(Hu2B8 Kv1−39.1カッパ鎖可変領域)及び配列番号179(Hu2B8
Kv3−15.1カッパ鎖可変領域)からなる群から選ばれる免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに
配列番号2(1A3)の2乃至141番目残基、配列番号12(2B8)の20乃至137番目残基、配列番号22(2F8)の20乃至137番目残基、配 列番号32(3B6)の20乃至139番目残基、配列番号42(3D11)の20乃至132番目残基、配列番号52(1D3)の20乃至141番目残基、配列番号62(1F3)の20乃至141番目残基、配列番号72(3A12)の20乃至141番目残基、配列番号159(Hu2B8 Hv1f.1重鎖可 変領域)、配列番号165(Hu2B8 Hv5a.1重鎖可変領域)及び配列番号169(Hu2B8 Hv5−51.1重鎖可変領域)からなる群から選ばれる免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質。
(項目51)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号4(1A3)の21乃至127番目残基のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号2(1A3)の20乃至141番目残基のアミノ酸配列を含む項目50の結合蛋白質。
(項目52)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号14(2B8)の21乃至127番目残基のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号12(2B8)の20乃至137番目残基のアミノ酸配列を含む項目50の結合蛋白質。
(項目53)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号24(2F8)の20乃至131番目残基のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号22(2F8)の20乃至137番目残基のアミノ酸配列を含む項目50の結合蛋白質。
(項目54)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号34(3B6)の23乃至129番目残基のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号32(3B6)の20乃至139番目残基のアミノ酸配列を含む項目50の結合蛋白質。
(項目55)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号44(3D11)の23乃至128番目残基のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号42(3D11)の20乃至132番目残基のアミノ酸配列を含む項目50の結合蛋白質。
(項目56)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号54(1D3)の21乃至127番目残基のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号52(1D3)の20乃至141番目残基のアミノ酸配列を含む項目50の結合蛋白質。
(項目57)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号64(1F3)の21乃至127番目残基のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号62(1F3)の20乃至141番目残基のアミノ酸配列を含む項目50の結合蛋白質。
(項目58)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号74(3A12)の21乃至127番目残基のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号72(3A12)の20乃至141番目残基のアミノ酸配列を含む項目50の結合蛋白質。
(項目59)
配列番号173(Hu2B8 Kv1−39.1軽鎖可変領域)及び配列番号179(Hu2B8 Kv3−15.1軽鎖可変領域)からなる群から選ばれる免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに
配列番号159(Hu2B8 Hv1f.1重鎖可変領域)、配列番号165(Hu2B8 Hv5a.1重鎖可変領域)及び配列番号169(Hu2B8 Hv5−51.1重鎖可変領域)からなる群から選ばれる免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質。
(項目60)
配列番号177(Hu2B8 Kv1−39.1+カッパ定常(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子2))及び配列番号181(Hu2B8 Kv3−15.1+カッパ定常(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子2))からなる群から選ばれる免疫グロブリン軽鎖可変領域、並びに
配列番号163(Hu2B8 Hv1f.1+IgG1定常(G1m(17,1) アロタイプ))、配列番号167(Hu2B8 Hv5a.1+IgG1 定常(G1m(17,1) アロタイプ))、配列番号171(Hu2B8 Hv5−51.1+IgG1定常(G1m(17,1) アロタイプ))及び配列番号210(Hu2B8 Hv5−51.1+IgG1定常G1m(3) アロタイプ(対立遺伝子2))からなる群から選ばれる免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質。
(項目61)
前記結合蛋白質が抗体又はその抗原結合断片である項目50、59又は60の結合蛋白質。
(項目62)
前記抗体がモノクローナル抗体である項目61の結合蛋白質。
(項目63)
ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質であって、
(i)3箇所の相補性決定領域を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、及び
(ii)3箇所の相補性決定領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含み、
該免疫グロブリン軽鎖及び該免疫グロブリン重鎖の該相補性決定領域が還元型ヒトHGFに結合する結合部位を共同して規定するものとする
結合蛋白質。
(項目64)
前記結合蛋白質が抗体又はその抗原結合断片である項目63の結合蛋白質。
(項目65)
前記抗体がモノクローナル抗体である項目64の結合蛋白質。
(項目66)
前記相補性決定領域がフレームワーク領域間に挿入されている項目63の結合蛋白質。
(項目67)
前記免疫グロブリン重鎖がIgG1である項目63の結合蛋白質。
(項目68)
前記結合蛋白質が561番目の位置にシステインからアルギニンへの置換又は555番目の位置にグリシンからグルタメートへの置換を含むヒトHGFに結合する項目63の結合蛋白質。
(項目69)
前記結合蛋白質がヒトHGFのα鎖に結合する項目63の結合蛋白質。
(項目70)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域がCDR L1 、CDR L2 及びCDR L3 からなる群から選ばれる少なくとも1種の相補性決定領域(CDR)を含み、
CDR L1 が、アミノ酸配列X 1 X 2 SerX 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 X 12 X 13 X 14 X 15 であって、アミノ酸X 1 がArg又はLysであり、X 2 がAla又はThrであり、X 4 がGlu又はGlnであり、X 5 がAsn、Ser又はAspであり、X 6 がIle又はValであり、X 7 がTyr、Asp又はLysであり、X 8 がペプチド結合又はTyrであり、X 9 がペプチド結合又はAspであり、X 10 がペプチド結合又はGlyであり、X 11 がペプチド結合又はAsnであり、X 12 がペプチド結合又はSerであり、X 13 がAsn又はTyrであり、X 14 がIle又はLeuであり、X 15 がAla、Asn又はSerであるものとするアミノ酸配列を含むものとし、
CDR L2 が、アミノ酸配列X 16 X 17 X 18 X 19 LeuX 21 X 22 であって、アミノ酸X 16 がAla、Asp、Val又はArgであり、X 17 がAla又はValであり、X 18 がAsn、Ser又はThrであり、X 19 がArg、Asn又はHisであり、X 21 がAla、Glu、Val又はProであり、X 22 がAsp又はSerであるものとするアミノ酸配列を含むものとし、及び
CDR L3 が、アミノ酸配列X 23 X 24 X 25 X 26 X 27 X 28 ProX 30 Thrであって、アミノ酸X 23 がLeu又はGlnであり、X 24 がHis又はGlnであり、X 25 がPhe、Ser又はTyrであり、X 26 がAsp、Ile又はTrpであり、X 27 がGly又はGluであり、X 28 がAsp、Phe又はThrであり、X 30 がPhe、Pro又はTyrであるものとするアミノ酸配列を含ものとする
項目63の結合蛋白質。
(項目71)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域がCDR L1 、CDR L2 及びCDR L3 からなる群から選ばれる少なくとも1種のCDRを含み、
CDR H1 が、アミノ酸配列X 1 TyrX 3 X 4 X 5 であって、アミノ酸X 1 がAsp、Asn、Ser又はThrであり、X 3 がPhe、Trp又はTyrであり、X 4 がIle又はMetであり、X 5 がAsn、His又はSerであるものとするアミノ酸配列を含ものとし、
CDR H2 が、アミノ酸配列X 6 IleX 8 X 9 GlyX 11 GlyX 13 X 14 X 15 TyrX 17 X 18 X 19 X 20 LysX 22 であって、アミノ酸X 6 がLys、Gln又はTyrであり、X 8 がGly、Ser又はTyrであり、X 9 がPro又はSerであり、X 11 がAsp、Gly又はSerであり、X 13 がAsp又はSerであり、X 14 がSer又はThrであり、X 15 がAsn又はTyrであり、X 17 がAsn又はProであり、X 18 がAla、Asp、Gly又はGluであり、X 19 がAsn、Met又はSerであり、X 20 がPhe又はValであり、X 22 がAsp又はGlyであるものとするアミノ酸配列を含ものとし、及び
CDR H3 が、アミノ酸配列X 23 X 24 X 25 X 26 X 27 X 28 X 29 X 30 X 31 X 32 X 33 AspTyrであって、アミノ酸X 23 がArg又はGlnであり、X 24 がGly又はLeuであり、X 25 がAsp、Gly又はペプチド結合であり、X 26 がGly又はペプチド結合であり、X 27 がペプチド結合又はTyrであり、X 28 がLeu、ペプチド結合又はTyrであり、X 29 がGly、Arg又はLeuであり、X 30 がAsp、Gly又はGluであり、X 31 がTyr、Arg又はAsnであり、X 32 がAla、Gly又はTyrであり、X 33 がMet又はPheであるものとするアミノ酸配列を含むものとする
項目63又は70の結合蛋白質。
(項目72)
前記免疫グロブリン軽鎖が
(i)配列番号8(1A3)、配列番号28(2F8)、配列番号38(3B6)、配列番号58(1D3)及び配列番号68(1F3)からなる群から選ばれる配列を有するCDR L1 、
(ii)配列番号9(1A3)、配列番号29(2F8)、配列番号39(3B6)、配列番号59(1D3)及び配列番号69(1F3)からなる群から選ばれる配列を有するCDR L2 、
(iii)配列番号10(1A3)、配列番号30(2F8)、配列番号40(3B6)、配列番号60(1D3)及び配列番号70(1F3)からなる群から選ばれる配列を有するCDR L3
を含む項目70の結合蛋白質。
(項目73)
前記CDR配列が複数のヒト又はヒト化フレームワーク領域間に挿入されている項目72の結合蛋白質。
(項目74)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号4(1A3)の21乃至127番目残基、配列番号24(2F8)の20乃至131番目残基、配列番号 34(3B6)の23乃至129番目残基、配列番号54(1D3)の21乃至127番目残基及び配列番号64(1F3)の21乃至127番目残基からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む項目72の結合蛋白質。
(項目75)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が
(i)配列番号5(1A3)、配列番号25(2F8)、配列番号35(3B6)、配列番号55(1D3)及び配列番号65(1F3)からなる群から選ばれる配列を有するCDR H1 、
(ii)配列番号6(1A3)、配列番号26(2F8)、配列番号36(3B6)、配列番号56(1D3)及び配列番号66(1F3)からなる群から選ばれる配列を有するCDR H2 、並びに
(iii)配列番号7(1A3)、配列番号27(2F8)、配列番号37(3B6)、配列番号57(1D3)及び配列番号67(1F3)からなる群から選ばれる配列を有するCDR H3
を含む項目71の結合蛋白質。
(項目76)
前記CDR配列が複数のヒト又はヒト化フレームワーク領域間に挿入されている項目75の結合蛋白質。
(項目77)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号2(1A3)の20乃至141番目残基、配列番号22(2F8)の20乃至137番目残基、配列番号 32(3B6)の20乃至139番目残基、配列番号52(1D3)の20乃至141番目残基及び配列番号62(1F3)の20乃至141番目残基からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む項目75の結合蛋白質。
(項目78)
項目63、70、72又は74の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む単離核酸。
(項目79)
項目78の核酸配列を含む発現ベクター。
(項目80)
項目79の発現ベクターを含む宿主細胞。
(項目81)
項目63、71、75又は77の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む単離核酸。
(項目82)
項目81の核酸配列を含む発現ベクター。
(項目83)
項目82の発現ベクターを含む宿主細胞。
(項目84)
免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を含むヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質であって、該単離結合蛋白質がHGFへの結合に対して
(i)配列番号24(2F8)の20乃至131番目残基の免疫グロブリン軽鎖可変領域及び配列番号22(2F8)の20乃至137番目残基の免疫グロブリン重鎖可変領域を有する抗体、
(ii)配列番号34(3B6)の23乃至129番目残基の免疫グロブリン軽鎖可変領域及び配列番号32(3B6)の20乃至139番目残基の免疫グロブリン重鎖可変領域を有する抗体、及び
(iii)配列番号44(3D11)の23乃至128番目残基の免疫グロブリン軽鎖可変領域及び配列番号42(3D11)の20乃至132番目残基の免疫グロブリン重鎖可変領域を有する抗体
からなる群から選ばれる少なくとも1種の対照抗体と競合するものとする結合蛋白質。
(項目85)
前記結合蛋白質が前記対照抗体のうちの1種と同じHGFの抗原決定基に結合する項目84の結合蛋白質。
(項目86)
4.0×10 −5 s −1 以下のk d でヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質。
(項目87)
前記k d が3.0×10 −5 s −1 以下である項目86の結合蛋白質。
(項目88)
前記k d が2.0×10 −5 s −1 以下である項目87の結合蛋白質。
(項目89)
20pM以下のK D でヒト肝細胞成長因子(HGF)に特異的に結合する単離結合蛋白質。
(項目90)
前記K D が10pM以下である項目89の結合蛋白質。
(項目91)
前記K D が5pM以下である項目90の結合蛋白質。
(項目92)
ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離結合蛋白質であって、前記抗体が25℃よりも37℃で、より低いK D でヒトHGFに結合するものとする、結合蛋白質。
(項目93)
前記結合蛋白質が37℃で5pM未満のK D を有する項目92の結合蛋白質。
(項目94)
腫瘍細胞に対して有効量の項目1、2、3、16、28、50、59、60、63、70、71、72、74、75、77、84、86又は89の結合蛋白質を作用させて該細胞の増殖を抑制又は低減させることを含む、腫瘍細胞の増殖を抑制又は低減させる方法。
(項目95)
腫瘍細胞に対して有効量の、該細胞の増殖を抑制又は低減させる結合蛋白質を作用させることを含む、腫瘍細胞の増殖を抑制又は低減させる方法であって、該 結合蛋白質がヒトHGFに特異的に結合するが、ヒトHGFのc−Metへの結合能を実質的に低減させないものとする方法。
(項目96)
前記結合蛋白質が項目22、23、24、34、35、36、56、57、58、84、86又は89の結合蛋白質を含む項目95の方法。
(項目97)
前記腫瘍細胞がヒト腫瘍細胞である項目94又は95の方法。
(項目98)
哺乳動物において腫瘍成長を抑制又は低減させる方法であって、該哺乳動物に対して有効量の項目1、2、3、16、28、50、59、60、63、84、86、89又は92の結合蛋白質を作用させて該腫瘍の増殖を抑制又は低下させることを含む方法。
(項目99)
哺乳動物において腫瘍を治療する方法であって、有効量の項目1、2、3、16、28、50、59、60、63、84、86、89又は92の結合蛋白質を投与することを含む方法。
(項目100)
前記哺乳動物がヒトである項目98又は99の方法。
本発明の以上その他の態様及び効果は、以下の図、詳細な説明及び特許請求の範囲を考慮すれば明瞭に理解されよう。
I. HGFに結合する結合蛋白質
一態様として、本発明はヒトHGFに結合する単離結合蛋白質を提供する。この結合蛋白質は、(i)CDRL1−CDRL2−CDRL3の構造を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域及び(ii)3箇所の相補性決定領域(CDR)を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。この場合、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域はヒトHGFに結合するための単一結合部位を共同して規定するものとする。CDRL1は、アミノ酸配列X1X2SerX4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15であって、アミノ酸X1がArg、Lys又はSerであり、X2がAla又はThrであり、X4がGlu、Gln又はSerであり、X5がAsn、Asp又はSerであり、X6がIle又はValであり、X7がAsp、Lys、Ser、Val又はTyrであり、X8がペプチド結合又はTyrであり、X9がペプチド結合又はAspであり、X10がペプチド結合又はGlyであり、X11がペプチド結合又はAsnであり、X12がペプチド結合、Ile又はSerであり、X13がAsn又はTyrであり、X14がIle、Leu、Met又はValであり、X15がAla、Asn、His又はSerであるものとするアミノ酸配列を含む。CDRL2は、アミノ酸配列X16X17X18X19X20X21X22であって、アミノ酸X16がAla、Asp、Arg、Gly又はValであり、X17がAla、Thr又はValであり、X18がAsn、Ser又はThrであり、X19がArg、Asn、Lys又はHisであり、X20がLeu又はArgであり、X21がAla、Asn、Glu、Val又はProであり、X22がAsp、Ser又はThrであるものとするアミノ酸配列を含む。CDRL3は、アミノ酸配列X23X24X25X26X27X28ProX30Thrであって、アミノ酸X23がLeu、Gly又はGlnであり、X24がHis又はGlnであり、X25がPhe、Ser、Trp又はTyrであり、X26がAsp、Ile、Ser、Trp又はTyrであり、X27がGly、Glu、Asn又はSerであり、X28がAsp、Asn、Phe、Thr又はTyrであり、X30がLeu、Phe、Pro又はTyrであるものとするアミノ酸配列を含む。
配列番号9(1A3)の配列を含むCDRL2及び配列番号10(1A3)を含むCDRL3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
別の実施態様として、上記結合蛋白質は、配列番号28(2F8)の配列を含むCDRL1、配列番号29(2F8)の配列を含むCDRL2及び配列番号30(2F8)を含むCDRL3を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
配列番号6(1A3)の配列を含むCDRH2及び配列番号7(1A3)を含むCDRH3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。
II.結合蛋白質の作製
本発明の結合蛋白質は、当該技術分野で周知の手法を用いる種々の方法で作製することができる。例えば、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードしているDNA分子は、市販の合成機及び本明細書に示した配列情報を用いて、化学的に合成することができる。このような合成DNA分子を、例えば、定常領域コード配列、発現制御配列などの他の適切なヌクレオチド配列に結合させて所望の結合蛋白質をコードしている通常の遺伝子発現構築物を作製することができる。特定の遺伝子構築物の作製は当該技術分野では日常的な技術の範囲内にある。或いは、本明細書に示した配列は、本明細書に示した配列情報、又はハイブリドーマ細胞中のマウス抗体の重及び軽鎖をコードしている遺伝子に関する従来技術の配列情報に基づいた配列を有する合成核酸プローブを用いて、通常のハイブリダイゼーション技術又はPCR技術によりハイブリドーマからクローニングすることができる。このようなプローブの作製及び使用法は、当該技術分野では日常的な技術の範囲内にある。
III. 結合蛋白質に対する修飾
上記結合蛋白質を修飾してこの結合蛋白質の目的とする用途に応じて性能を最適化することができることは理解されよう。例えば、結合蛋白質を治療剤として用いようとする場合、この結合蛋白質を修飾して対象レシピエントにおける免疫原性を低減することができる。或いは、又はさらに、結合蛋白質を別の蛋白質又はペプチド、例えば、成長因子、サイトカインもしくは細胞毒と融合又は結合させることができる。このような修飾は、当該技術分野で周知の通常の遺伝子操作技術を用いることで達成することができる。
IV. 結合蛋白質の用途
本明細書に記載した結合蛋白質は、診断剤又は治療剤として用いることができる。
本発明の結合蛋白質は、HGFの活性を中和するので、種々の治療的用途に用いることができる。例えば、本発明の結合蛋白質の一部は、過剰増殖性疾病又は疾患、例えば、各種形態の癌の予防又は治療に有用である。
上記結合蛋白質を診断目的のためにインビトロ又はインビボで用いる場合はいつも、この結合蛋白質を検出可能な成分で直接又は間接に標識するのが通常である。この検出可能成分は、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に発生することができる任意の成分とすることができる。例えば、この検出可能成分は、3水素(3H)、14炭素(14C)、32燐(32P)、35硫黄(35S)又は125ヨウ素(125I)などの放射性同位体;フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリンなどの蛍光又は化学発光化合物;アルカリ性ホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素;スピン標識などのスピンプローブ;或いは、カラー粒子、例えばラテックスもしくは金粒子であってもよい。上記結合蛋白質を、例えば、Hunter et al. (1962年) NATURE 144:p.945、David et a1. (1974年) BIOCHEMISTRY 13:p.1014、Pain et al. (I981年) J. IMMUNOL. METH. 40:p.219及びNygren (1982年) J. HISTOCHEM. AND CYTOCHEM. 30:p.407に記載されているような、当該技術分野において周知の多くの方法を用いて上記検出可能成分に結合させることができることは理解されよう。これらの標識は、例えば、目視により、又は分光光度計その他の検出器を用いて検出することができる。
(実施例1)
抗hHGFモノクロナール抗体の作製
この実施例ではいくつかの抗hHGFモノクロナール抗体の作製について説明する。
(実施例2)
抗hHGFモノクロナール抗体の配列分析
この実施例では実施例1で作製した抗hHGFモノクロナール抗体のアイソタイプ及び配列の分析について説明する。
各モノクロナール抗体の軽鎖タイプ及び重鎖アイソタイプについて、イソストリップマウスモノクロナール抗体アイソタイピングキット(IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit)を用い、そのメーカーの使用説明書(ロシュ・アプライド・サイエンス社(Roche Applied Science))に従って決定した。
各モノクロナールハイブリドーマ細胞株から、RNeasyミニプレップ(Miniprep)キットを用い、そのメーカーの使用説明書(キアゲン社(Qiagen)、ヴェンロ、オランダ)に従って全RNAを抽出した。BD SMART(商標)RACE cDNA増幅キットを用い、そのメーカーの使用説明書(クロンテック社(Clontech))に従い、5’RACE(cDNA末端の迅速増幅(Rapid Amplification of cDNA Ends))のためのオリゴヌクレオチドプライマBD SMART IIA(5’aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg 3’)(配列番号85)及び5’−RACE CDS Primer(5’ tttttttttttttttttttttttttvn 3’、但し、v=a、g又はc及びn=a、g、c又はt)(配列番号86)を用いて、完全長の第1鎖cDNAを作製した。
順方向プライマ5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgaactttgggctcagattgattttcc 3’(下線箇所:開始コドン)(配列番号96)及び逆方向プライマ5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagagg3’(下線箇所:停止コドン)(配列番号97)を用いて上記で作製したcDNAから、1A3、1D3及び1F3 IgG1鎖の完全長cDNAをPCRにより増幅させた。順方向プライマ5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgggatggagctatatcatcctcttt3’(下線箇所:開始コドン)(配列番号98)及び逆方向プライマ5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcatttaccaggagagtgggagag3’(下線箇所:停止コドン)(配列番号99)を用いて上記で作製したcDNAから、2B8IgG1鎖の完全長cDNAを増幅させた。
可変領域(標準テキスト)は、IMGT/V−QUESTウェブサーバーソフトウェア(http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)を用いて同定した。シグナルペプチド配列は、同定した可変領域の上流にあるインフレーム開始コドン(ATG)の同定に基づいて予測した。シグナルペプチド配列を同定し、下記に下線で示した。
は、いずれも図4に記載されている。これらの配列は全て相互に整列させてあり、シグナルペプチド、CDR1、CDR2及びCDR3を規定する配列は枠で囲んで識別されている。図5は、全ての抗体のCDR1、CDR2及びCDR3配列を別々に整列させて示したものである。
各種組換えhHGF蛋白質の作製
本実施例では、実施例1及び実施例14で作製された抗体の特性を明らかにするために用いるいくつかの組換え蛋白質のクローニング及び発現について説明する。具体的には、本実施例では、組換えhHGF蛋白質、555番目の位置にグリシンからグルタメートへの置換を含む組換えhHGF蛋白質(G555E)、561番目の位置にシステインからアルギニンへの置換を含む組換えhHGF蛋白質(C561R)、マウスHGF配列内に配置されたヒトV495乃至L585HGF配列を含む組換えマウス−ヒト−マウス(mhm)キメラHGF蛋白質、マウスHGF配列内に配置されたヒトI499乃至R566HGF配列を含む組換えmhmキメラHGF蛋白質及びマウスHGF配列内に配置されたヒトW507乃至L585HGF配列を含む組換えmhmキメラHGF蛋白質のクローニング及び発現について説明する。
1回目のPCRでは、NotI部位を導入し、hHGFとhIgFcとの間に6×His標識をコードしている2本の重なり合うPCR断片を作製した。2回目に、これらの重なり合うPCR断片を鋳型としてhHGF−his−IgFcを増幅させた。得られた断片をNheI及びBamHIで消化し、pcDNA5/FRT(インビトロジェン社、#35−3014)中にクローニングした。次いで、インビトロジェン社のクローンID:IOH29794(ヒトHGF cDNA)からhHGFを増幅させた。その配列は、アクセッション番号NM_000601.4としてNCBIに寄託されている配列に相当することが分かった。
hHGF−Fc突然変異体G555E及びC561Rは、クイックチェンジ(QuickChange)II XL部位特異的突然変異誘発キット(ストラタジーン社(Stratagene))をメーカーの使用説明書に従って用いた部位特異的突然変異誘発法により作製した。
マウス−ヒト−マウスキメラIgFc構築物は、mHGFアルファ鎖hHGF、ヒトHGFのβ鎖アミノ酸Val495乃至Leu585、及びmHGF C末端β鎖とこれに続く6×His標識及びIgG−Fcを含む。
hHGF及びmhmキメラ(V495乃至L585)をコードしているベクターであるpcDNA5/FRT hHGF及びpcDNA5/FRT−mhmキメラ(V495乃至L−L585)を、Fc標識を含ませずに、部位特異的突然変異誘発法により作製した。前記クイックチェンジII XL部位特異的突然変異誘発キット(ストラタジーン社)をメーカーの使用説明書に従って用い、上記6×His標識の3’末端に停止コドンを導入した。突然変異誘発プライマーには、プライマー1:
(1) 細胞培養
CHO FIpIn細胞(インビトロジェン社、カタログ番号R758−07)をF12K培地(ATTC、カタログ番号30−2004)、10%FCS(インビトロジェン社、カタログ番号10438026)、1%ペニシリン(10,000単位/mL)/ストレプトマイシン(10,000μg/mL)(インビトロジェン社、カタログ番号15140−122)中、37℃、5% CO2、100μg/mLゼオシン(Zeocin)(インビトロジェン社、カタログ番号R250−01)の条件下で増殖させた。
リポフェクタミン2000(インビトロジェン社、カタログ番号11668−027)をそのメーカーの使用説明書に従って用い、発現プラスミドDNA pOG44及びpcDNA5/FRTを9:1の比率で用いてCHO FIpIn宿主細胞に形質移入した。対照として、空のpcDNA5/FRTベクター/pOG44及びpOG44プラスミド(インビトロジェン社、カタログ番号35−3018)単独を細胞に形質移入した。形質移入後24時間に、この細胞を分裂させ、48時間後に、0.5mg/mLのハイグロマイシンB(シグマ社(Sigma)、カタログ番号H0654−SPEC)を細胞に添加した。F12K、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.5mg/mLハイグロマイシンB中で安定細胞の多クローン性選択を行った。
約2×106個の細胞を15cmプレートに接種し、F12K(ATCC、カタログ番号30−2004)/DMEM高グルコース(インビトロジェン社、カタログ番号11995065)1:1、5%超低IgG FCS(インビトロジェン社、#16250−78)中、37℃、5%CO2で5乃至6日間増殖させた。上清を採取し、得られた蛋白質をELISA及び表面プラスモン共鳴により分析した。
(実施例4)
抗hHGFモノクロナール抗体の結合特性
実施例1で作製したモノクロナール抗体の特徴は、これらがhHGF及び実施例3で作製した組換えHGF蛋白質の一部に結合することができることにあった。
(実施例5)
抗hHGFモノクロナール抗体の還元及び非還元HGFへの結合能
本実施例では、実施例1で作製した抗hHGFモノクロナール抗体の還元及び非還元HGFへの結合能について分析した。
(実施例6)
結合親和性
実施例1で作製した各抗体のhHGFに対する結合親和性及び相互作用の速度を表面プラスモン共鳴によって測定した。
(実施例7)
抗hHGF抗体の中和活性
本実施例では、実施例1で作製した抗体について、(a)c−MetへのhHGFの結合を阻害し、(b)4MBr−5細胞におけるBrdU取り込みのHGFによる促進を阻害する能力を特性化した。
上記抗体について、c−MetへのhHGF結合を阻害する能力をELISAにより試験した。
12.5nMのhHGF 10μLを96穴組織培養マイクロタイタープレート(コスター社(Costar)カタログ番号3903)の個々のウェルに分注した。次いで、6667、2222、740、247、82、27、9.1、3.0、1.0及び0.33nMの濃度に連続希釈した抗体10μLを各ウェルに添加した。次に、このHGF抗体混合液を室温で30分間インキュベートした。F−12K(ATCC、30−2004)、15%FBS(ギブコ(Gibco)10438−026)、30ng/mL EGF(シグマ(Sigma)E9644)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(PS、ギブコ社カタログ番号15140−122)中で培養したサル気管支上皮細胞4MBr−5(ATCC、CCL208)をトリプシン(Trypsin)(ギブコ社カタログ番号25200−056)で解離させ、75,000個/mLの濃度でアッセイ培地(F−12K、2.5% FBS、1% PS)に再懸濁し、この細胞懸濁液80μLを上記HGF抗体混合液に分注した。
(実施例8)
抗hHGF抗体の抗散乱(Anti−Scatter)活性
本実施例では、実施例1で作製した抗体のHGF誘発性散乱活性を抑制する能力に関する特性化について説明する。HGFは、MDCK細胞(ATCC、マナッサス、バージニア州、カタログ番号CCL−34)においてクラスターの「散乱」(運動)を誘発する。
(実施例9)
HGF刺激c−Metリン酸化の阻害
本実施例では、実施例1で作製した抗体の、PC−3細胞におけるHGF刺激c−Metリン酸化を阻害する能力に関する特性化について説明する。HGFはPC−3細胞(ATCC番号CRL−1435)においてMetのリン酸化を誘発する。
(実施例10)
U87MG異種移植モデルにおける腫瘍抑制
U87MG異種移植モデルを用い、本発明のマウスモノクロナール抗体の腫瘍増殖抑制能について試験した。U87MG細胞(ATCC)は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM:Dulbecco’s Modified Eagle medium)を10%ウシ胎仔血清、100単位/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンと共に含む培地を用いた、5%CO2及び95%空気を含有する雰囲気中37℃の培養で増殖させた。これらの細胞は、トリプシン−EDTAを用いて培養皿の壁から細胞を剥離することにより二次培養して維持した。
(実施例11)
U118異種移植モデルにおける腫瘍抑制
U118異種移植モデルを用い、抗体1A3、1D3、1F3及び2B8の腫瘍増殖抑制能について試験した。U118細胞(ATCC)は、U87MG細胞に関して(上記)実施例10に記載したのと同様にして増殖させた。
(実施例12)
マウスモノクロナール抗体のヒト化
本実施例では、マウス2B8抗体のヒト化及び得られるヒト化抗体の特性化について説明する。マウス2B8重及び軽鎖可変領域は2通りの方法で「ヒト化」した。
A. ヒト化の方法1
第一の方法では、Hwangほか (2005年) METHODS 36:p.35−42、Tanほか (2002年) J. IMMUNOL. 169:p.1119−1125及び米国特許第6,881,557号明細書に記載されている「超ヒト化」方法に基づいて、3つのヒト化重鎖可変領域及び2つのヒト化カッパ軽鎖可変領域を設計した。
sh2B8−12 (Glm(17,1))=hu2B8 Hv5−51.1(+IgG1定常領域(Glm(l7,1)アロタイプ))(配列番号171)プラスhu2B8 Kv 3−15.1 (+カッパ定常領域(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子2))) (配列番号181)
各ヒト化抗体をコードしている核酸配列及び各ヒト化抗体を規定する蛋白質配列を下記にまとめた。このセクションでは、各可変領域の最後のヌクレオチドは、可変/定常領域接合部によって生じる次のコドンの最初の塩基である。このヌクレオチドは、可変領域に含まれる。何故なら、これはそのエクソンの一部であるからである。下記に列挙した定常領域のアミノ酸配列はこの接合部コドンの翻訳物を含む。
マウス2B8抗体の免疫原性を低減させるのに用いる第二のヒト化方法は、Studnickaほか(1994年) PROTEIN ENG. 7:p.805−814に記載されている方法に基づくものである。重及びカッパヒト生殖細胞系可変領域のうち、マウス2B8のものに(アミノ酸レベルで)最も一致する領域を特定した。マウスとヒトとの間で異なる残基は、そのような変化が結合又は免疫原性に影響すると思われるリスクに応じてヒトの配列に変換した。低リスク残基(即ち、変化があっても、抗原結合に影響しないと考えられ、免疫原性を生じる可能性も少ない残基)は、ヒトアミノ酸への変更を重鎖可変領域(LR2B8HCを作製)及びカッパ可変領域(LR2B8LCを作製)において行った。さらに、低リスク及び中間リスク残基(即ち、変化があると、抗原結合に影響する可能性が若干高いが、免疫原性を生じる可能性も少ない残基)は、ヒトアミノ酸への変更を重鎖可変領域(LRMR2B8HCを作製)及びカッパ可変領域(LRMR2B8LCを作製)において行った。上記2種のヒト型に設計された重鎖可変領域のカルボキシル末端にヒトIgG1重鎖定常領域(G1m(3)アロタイプ(対立遺伝子1))を付加し、2種のヒト型に設計された軽鎖可変領域のカルボキシル末端にヒトカッパ定常領域(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子1))を付加して、ヒト型に設計された抗体鎖を作製した。先ず、遺伝子合成法によって各可変領域の核酸配列を合成した後、これに各ヒト定常領域の配列に付加した。これらのヒト型に設計された抗体を哺乳動物の蛋白質発現ベクター中にクローニングし、重鎖プラス軽鎖の考えられる4種の組合せの蛋白質を発現させた。キメラ、キメラ/ヒト化又はヒト化抗体のヒトHGFへの結合については、下記のように、従来の技術を用いて測定した。
BIAcoreT100装置を用いて表面プラスモン共鳴法により抗原結合親和性及び相互作用の速度を評価した。マウス抗ヒト免疫グロブリン(ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社(Jackson ImmunoResearch Labs)、209−005−098)は、標準的なカップリングプロトコルをメーカーの推奨事項に従って用いたアミンカップリング(BIAcore、カタログ番号BR−1000−50)によりカルボキシメチル化デキストランCM4センサーチップ(BIAcore、カタログ番号BR−1005−34)上に固定化した。分析は、0.05%の界面活性剤P20(BIAcore、カタログ番号BR−1000−54)、2mg/mLのBSA(EMD社カタログ番号2930)及び10mg/mLのCM−デキストランナトリウム塩(フルカ社(Fluka)、カタログ番号86524)を含有するPBS(GIBCO社、カタログ番号14040−133)を泳動用緩衝液として用い、25℃で行った。
D. 相互排他的結合
HGFへの相互排他的結合についてBIAcore T100装置を用いて表面プラスモン共鳴により評価した。マウス抗ヒト免疫グロブリン(ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社(Jackson ImmunoResearch Labs)、209−005−098)は、標準的なカップリングプロトコルをメーカーの推奨事項に従って用いたアミンカップリング(BIAcore、カタログ番号BR−1000−50)によりカルボキシメチル化デキストランCM5センサーチップ(BIAcore、カタログ番号BR−1006−68)上に固定化した。分析は、0.05%の界面活性剤P20(BIAcore、BR−1000−54)、2mg/mLのBSA(EMD社カタログ番号2930)及び10mg/mLのCM−デキストランナトリウム塩(フルカ社(Fluka)、カタログ番号86524)を含有するPBS(GIBCO社、カタログ番号14040−133)を泳動用緩衝液として用い、25℃で行った。
(実施例13)
ヒト化2B8変異体の作製
a. ヒューマン・エンジニアード(商標)抗体
ヒトカッパ及びガンマ−1定常領域モジュールを含むXOMA社の一過性抗体発現ベクター中に、コドン−及び発現適正化低リスク及び低プラス中等度リスクヒューマン・エンジニアード軽鎖(それぞれ、LR2B8LC及びLRMR2B8L)及び重鎖(それぞれ、LR2B8HC及びLRMR2BHC)をインフェーズでクローニングした。これら4種のヒューマン・エンジニアード2B8変異体は、HEK293E細胞への一過性形質移入によって作製した。以下の4種の抗体を作製した。
HE2B8−2 = LR2B8HC(+IgGl定常領域(Glm(3)アロタイプ(対立遺伝子1))(配列番号187)プラスLRMR2B8LC(+カッパ鎖定常領域(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子1)))(配列番号201)
HE2B8−3 = LRMR2B8HC(+IgG1定常領域(Glm(3)アロタイプ(対立遺伝子1))(配列番号191)プラスLR2B8LC(+カッパ鎖定常領域(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子1)))(配列番号197)
HE2B8−4 = LRMR2B8HC(+IgG1定常領域(Glm(3)アロタイプ(対立遺伝子1))(配列番号191)プラスLRMR2B8LC(+カッパ鎖定常領域(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子1)))(配列番号201)
これら軽及び重鎖は、2リットルの振盪フラスコを用いてIS293培地(アーバイン・サイエンティフィック社、アーバイン、カリフォルニア州)中で増殖させたXOMA社の懸濁適応HEK293E細胞中に同時形質移入した。振盪フラスコでの24時間の形質移入後、形質移入細胞200mLを遠心分離し、新鮮培地40mLに再懸濁し、産生用インテグラ(Integra)フラスコ(ウィルソン・ウォルフ・マニュファクチャリング社(Wilson Wolf Manufacturing Inc.)、ミネソタ州)に移した。数日間のインキュベーション後、細胞懸濁液をインテグラフラスコから取り出し、遠心分離して培養上清を残した。この培養上清中の抗体をプロテインAスピンカラム(プロ−ケム社)で精製し、PBSに対して透析し、濃縮して除菌した。
完全長Hu2B8_Hv5−51.1+ヒトIgG1定常ドメイン(G1m(3)アロタイプ)cDNAをHindIII及びEcoRI制限部位を利用してpEE6.4(ロンザバイオロジックス社(Lonza Biologics)、バークシャー、英国)中にクローニングした。完全長Hu2B8_Kv−39.1可変領域+ヒトカッパ鎖定常ドメインcDNA及び完全長Hu2B8_Kv3−15.1可変領域+ヒトカッパ鎖定常ドメインcDNAをそれぞれ、HindIII及びEcoRI制限部位を利用してpEE14.4(ロンザバイオロジックス社)中にクローニングした。(pEE6.4内の)hCMV−MIEプロモーター+完全長Hu2B8_Hv5−51.1+ヒトIgG1定常ドメイン(G1m(3)アロタイプ)cDNA+SV40ポリA断片をNotI/SalI消化により切り出し、どちらのカッパ鎖pEE14.4ベクター中にもNotI/SalI部位から挿入することにより、それぞれ重及び軽鎖を同時に発現する2種の発現ベクターを作り、以下の抗体を作製した。
sh2B8−12(Glm(3)) = hu2B8 Hv5−51.1(+IgG1定常領域(Glm(3)アロタイプ)(対立遺伝子 2))(配列番号210)プラスhu2B8 Kv 3−15.1(+カッパ鎖定常領域(Km(3)アロタイプ(対立遺伝子2)))(配列番号181)
上記ヒトIgG1重鎖定常領域G1m(3)アロタイプ(対立遺伝子2)及び上記各完全長重鎖配列をコードしている核酸配列並びにこれらを規定する蛋白質配列を以下に記載した。軽鎖の配列は実施例12に記載したのと同じであった。
(実施例14)
ヒト化2B8変異体の結合特性
実施例13で作製したヒト化抗体の特徴は、hHGF及び実施例3で作製した組換えHGF蛋白質に結合できることであった。
(実施例15)
ヒト化2B8変異体の結合親和性
表15に示した抗体の結合親和性及び相互作用の速度を表面プラスモン共鳴によって測定した。
(実施例16)
25℃及び37℃における結合親和性の比較
抗体HE2B8−4、sh2B8−9、sh2B8−12及びマウス2B8の結合親和性及び相互作用の速度を種々の条件下で表面プラスモン共鳴により測定した。
(実施例17)
ヒト化2B8変異体の中和活性
実施例14で作製した抗体について、(a)c−MetへのhHGFの結合を阻害し、(b)4MBr−5細胞におけるBrdU取り込みのHGFによる促進を阻害する能力を特性化した。
(実施例18)
ヒト化2B8変異体の抗散乱活性
表17の抗体を実施例8で説明した抗散乱アッセイにおいて試験した。その結果を下記の表22にまとめた。
(実施例19)
HGF刺激c−Metリン酸化の阻害
表17の抗体を実施例9で説明したc−Metリン酸化アッセイにおいて試験した。その結果を下記の表23にまとめた。
(実施例20)
U87MG異種移植モデルにおける腫瘍抑制
U87MG異種移植モデルを用い、本発明のヒト化モノクロナール抗体の腫瘍増殖抑制能について試験した。U87MG細胞(ATCC)は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM:Dulbecco’s Modified Eagle medium)を10%ウシ胎仔血清、100単位/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンと共に含む培地を用いた、5%CO2及び95%空気を含有する雰囲気中37℃の培養で増殖させた。これらの細胞は、トリプシン−EDTAを用いて培養皿の壁から細胞を剥離することにより二次培養して維持した。
引用による組込み
本明細書で触れた特許文献及び科学論文のそれぞれの開示内容はその全体があらゆる目的で引用により組み込まれている。
本発明は, 当該発明の精神または主要な特徴から逸脱することなく, 他のさまざまな形式で実施することができる。そのため、前述の実施態様はあらゆる点で単なる例示にすぎず、本明細書に記載された発明に対して限定的に解釈してはならない。従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって示すものであり、明細書の本文によって拘束されるものではない。また、特許請求の範囲の記載内容と同等の範囲に含まれる変形もしくは変更は、すべて本発明の範囲内のものである。
Claims (7)
- 配列番号177の免疫グロブリン軽鎖および配列番号171の免疫グロブリン重鎖を含む、ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離された抗体、または、その抗原結合フラグメント。
- モノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 以下:
(i)配列番号18の配列を含むCDRL1、配列番号19の配列を含むCDRL2及び配列番号20の配列を含むCDRL3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域;並びに
(ii)配列番号15の配列を含むCDRH1 、配列番号203の配列を含むCDRH2及び配列番号17の配列を含むCDRH3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域;
を含むヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離された抗体、または、該抗体の抗原結合フラグメント。 - 前記CDR配列が、ヒト又はヒト化フレームワーク配列間に挿入されている、請求項3に記載の抗体。
- 配列番号173のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域および配列番号169のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、ヒト肝細胞成長因子(HGF)に結合する単離された抗体、または、その抗原結合フラグメント。
- モノクローナル抗体である、請求項3に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項5に記載の抗体。
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