ES2962824T3 - Anticuerpos contra FcRn y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents

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Sucharita Roy
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Abstract

La presente invención presenta anticuerpos que tienen una alta afinidad de unión al receptor Fc neonatal humano (FcRn). Estos anticuerpos anti-FcRn son útiles, por ejemplo, para promover la eliminación de autoanticuerpos en un sujeto, para suprimir la presentación de antígenos en un sujeto, para bloquear una respuesta inmune, por ejemplo, bloquear una activación de la respuesta inmune basada en complejos inmunes en un sujeto, y para tratar enfermedades inmunológicas (por ejemplo, enfermedades autoinmunes) en un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra FcRn y procedimientos de uso de los mismos
Antecedentes de la invención
Las proteínas terapéuticas, por ejemplo, los anticuerpos terapéuticos, se han convertido rápidamente en una clase de fármacos clínicamente importante para los pacientes con enfermedades inmunológicas. El documento WO2012/167039 divulga la generación de anticuerpos anti-FcRn y el uso de los mismos para tratar diversas enfermedades, incluidas enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios y cáncer.
Sumario de la invención
La presente invención presenta nuevos anticuerpos contra el receptor de Fc neonatal humano (FcRn). Estos anticuerpos anti-FcRn son útiles, por ejemplo, para estimular la eliminación de autoanticuerpos en un sujeto, para reprimir la presentación de antígenos en un sujeto, para bloquear una respuesta inmunitaria, por ejemplo, bloquear la activación basada en inmunocomplejos de una respuesta inmunitaria en un sujeto, o para tratar enfermedades inmunológicas (por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias) en un sujeto.
La materia para la que se solicita protección es la definida en las reivindicaciones. Las realizaciones y/o ejemplos de la siguiente descripción que no son abarcados por las reivindicaciones adjuntas, cuando se interpretan de acuerdo con el Artículo 69 EPC y el Protocolo sobre la Interpretación del Artículo 69 EPC, no se consideran parte de la presente invención.
Cualquier referencia a procedimientos de tratamiento se considera una referencia a los compuestos y las composiciones de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento llevado a cabo en el cuerpo humano.
En un aspecto, la invención presenta un anticuerpo aislado que se une a un FcRn humano, comprendiendo el anticuerpo aislado un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un FcRn humano con una K<d>inferior a 200, 150, 100, 50 o 40 pM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un FcRn humano con una K<d>que es menor que la de un anticuerpo que tiene la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de N022, N023, N024 o N026 y que tiene además la misma región Fc que la del anticuerpo con el que se está comparando.
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene: (1) una región variable de cadena ligera que incluye una CDR L1, una CDR L2 y una CDR L3 y (2) una región variable de cadena pesada que incluye una CDR H1, una CDR H2 y una CDR H3, en el que la CDR L1 tiene la secuencia X1GTGSDVGSYNX2VS (SEQ ID NO: 12), la CDR L2 tiene la secuencia GDX3X4RPS (SEQ ID NO: 13), la CDR L3 tiene la secuencia XsSYXaGSGIYV (SEQ ID NO: 14), la CDR H1 tiene la secuencia Z1YAMG (SEQ ID NO: 15), la CDR H2 tiene la secuencia SIGZ2SGZ3QTZ4YADS (s Eq ID NO: 16) y la CDR H3 tiene la secuencia LAZ5Z6DSY (SEQ ID NO: 17), en el que X1 es un aminoácido polar 0 hidrófobo, X2 es un aminoácido hidrófobo, X3 es un aminoácido polar, X4 es un aminoácido polar o ácido, X5 es un aminoácido polar o hidrófobo, X6 es un aminoácido hidrófobo, Z1 es un aminoácido polar o ácido, Z2 es un aminoácido polar o hidrófobo, Z3 es G, S o A, Z4 es un aminoácido básico, Z5 es un aminoácido hidrófobo o básico, y Z6 es G, S, D, Q, o H, y en el que el anticuerpo se une a un FcRn humano con una Kd que es menor o igual que la del anticuerpo que tiene la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de N026 y que tiene además la misma región Fc que el anticuerpo que se está comparando. En algunas realizaciones, X1 es T, A, S o I. En otras realizaciones, X2 es L o I. En algunas realizaciones, X3 es S, N o T En otras realizaciones, X4 es Q, E o N, X5 es C, S, 1 o Y. En algunas realizaciones, X6 es A o V, Z1 es E, T, D o N. En otras realizaciones, Z2 es S o A. En algunas realizaciones, Z4 es K o R. En otras realizaciones, Z5 es I, L o H.
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera que incluye una CDR L1 que tiene la secuencia TGt Gs DVGSYn Lv S (SEQ ID NO: 1), una CDR L2 que tiene la secuencia GDSERPS (SEQ ID N<o>: 2) y una CDR L3 que tiene la secuencia S<s>YAGSGIYV (SEQ ID NO: 3), y una región variable de cadena pesada que incluye una CDR H1 que tiene la secuencia Z1YAMG (SEQ ID NO: 15), una CDR H2 que tiene la secuencia SIGZ2SGZ3QTRYADS (SEQ ID NO: 18) y una CDR H3 que tiene la secuencia LAIGDSY (SEQ ID NO: 11), en el que Z1 es T, D o N, Z2 es S o A, y Z3 es G, S o A.
El anticuerpo aislado de la invención contiene una CDR L1 que tiene la secuencia TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO: 1), una CDR L2 que tiene la secuencia GDSERPS (SEQ ID No : 2), una CDR L3 que tiene la secuencia s Sy AGSGIYV (Se Q ID NO: 3), una CDR H1 que tiene la secuencia TYAMG (SEQ ID NO: 4), una CDR H2 que tiene la secuencia SIGASGSQTRYADS (SEQ ID NO: 8) y una CDR H3 que tiene la secuencia LAIGDSY (SEQ ID NO: 11).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una CDR L1 que tiene la secuencia TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO: 1), una CDR L2 que tiene la secuencia GDSERPS (SEQ ID NO: 2), una CDR L3 que tiene la secuencia SSYAGSGIYV (SEQ ID NO: 3), una CDR H1 que tiene la secuencia TYAMG (SEQ ID NO: 4), una CDR H2 que tiene la secuencia S<i>GSSGAQT<r>Y<a>DS (SEQ ID NO: 7) y una CDR H3 que tiene la secuencia LAIGDSY (SEQ ID NO: 11).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una CDR L1 que tiene la secuencia TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO: 1), una CDR L2 que tiene la secuencia GDSERPS (SEQ ID NO: 2), una CDR L3 que tiene la secuencia SSYAGSGIYV (SEQ ID NO: 3), una CDR H1 que tiene la secuencia DYAMG (<s>E<q>ID NO: 4), una CDR H2 que tiene la secuencia S iGASGSQTrYa DS (SEQ ID NO: 8) y una CDR H3 que tiene la secuencia LAIGDSY (SEQ ID NO: 11).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una CDR L1 que tiene la secuencia TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO: 1), una CDR L2 que tiene la secuencia GDSERPS (SEQ ID NO: 2), una CDR L3 que tiene la secuencia SSYAGSGIYV (SEQ ID NO: 3), una CDR H1 que tiene la secuencia NYAMG (<s>E<q>ID NO: 6), una CDR H2 que tiene la secuencia S iGASGAQTrYa DS (SEQ ID NO: 9) y una CDR H3 que tiene la secuencia LAIGDSY (SEQ ID NO: 11).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una CDR L1 que tiene la secuencia TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO: 1), una CDR L2 que tiene la secuencia GDSERPS (SEQ ID NO: 2), una CDR L3 que tiene la secuencia SSYAGSGIYV (SEQ ID NO: 3), una CDR H1 que tiene la secuencia TYAMG (SEQ ID NO: 4), una CDR H2 que tiene la secuencia SIGASGGQTrYa DS (SEQ ID No : 10) y una CDR H3 que tiene la secuencia LAIGDSY (SEQ ID NO: 11).
La divulgación también prevé que la región variable de cadena ligera de un anticuerpo aislado tenga una secuencia que tenga al menos un 90 % de identidad con la secuencia QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC
S (SEQ ID NO: 19).
La divulgación también prevé que la región variable de cadena pesada de un anticuerpo aislado tenga una secuencia que tenga al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGAQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 20).
La divulgación también prevé que la región variable de cadena pesada de un anticuerpo aislado tenga una secuencia que tenga al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGSQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 21).
La divulgación también prevé que la región variable de cadena pesada de un anticuerpo aislado tenga una secuencia que tenga al menos un 90 % de identidad con la secuencia
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGAQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 22).
La divulgación también prevé que la región variable de cadena pesada de un anticuerpo aislado tenga una secuencia que tenga al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGGQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 23).
La divulgación también prevé que la región variable de cadena pesada de un anticuerpo aislado tenga una secuencia que tenga al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGSQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 24).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGAQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 20).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGSQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 21).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGAQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 22).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGGQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 23).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGSQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 24).
La región variable de cadena pesada del anticuerpo aislado de la divulgación puede tener una secuencia que tenga al menos un 95 %, un 97 %, un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 20 24. La región variable de cadena ligera del anticuerpo aislado de la divulgación puede tener una secuencia que tenga al menos un 95 %, un 97 %, un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 19.
En un ensayo de KD concreto, la KD del anticuerpo es inferior a 200, 150, 100, 50 o 40 pM.
Las posiciones de los aminoácidos asignadas a las regiones determinantes de la complementariedad ("complementarity determining regions", CDR) y a las regiones marco ("framework regions", FR) de cualquier anticuerpo aislado descrito en el presente documento se definen según el índice EU de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, m D (1991)).
En otro aspecto más, la invención presenta un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGSQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 24).
La divulgación también presenta un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGAQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 20).
La divulgación también presenta un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGSQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 21).
La divulgación también presenta un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGAQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 22).
La divulgación también presenta un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGGQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 23).
En algunas realizaciones de la invención, el anticuerpo aislado de la invención es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado es IgG1. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado incluye una cadena ligera A.
En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, el anticuerpo aislado de la invención es un anticuerpo humanizado o totalmente humano.
En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado se une a un FcRn humano con una KD de 1-100, 5-150, 5-100, 5-75, 5-50, 10-50 o 10-40 pM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado de la invención se une a un FcRn de roedor, por ejemplo, de ratón o de rata. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado de la invención se une a un FcRn de roedor, por ejemplo, de ratón o de rata, con una KD inferior a 200, 150, 100, 50 o 40 pM.
En otro aspecto, la invención presenta una molécula de ácido nucleico que codifica cualquier anticuerpo aislado de la invención.
En otro aspecto más, la invención presenta un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica cualquier anticuerpo de la invención.
En otro aspecto, la invención presenta una célula hospedadora que expresa cualquier anticuerpo aislado de la invención. La célula hospedadora incluye una molécula de ácido nucleico que codifica cualquier anticuerpo aislado de la invención o un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica cualquier anticuerpo aislado de la invención, en los que la molécula de ácido nucleico o el vector son expresados por la célula hospedadora.
En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de ovario de hámster chino ("Chinese hamster ovary", CHO). La célula hospedadora puede una célula Sp2 o una célula NS0.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para preparar cualquier anticuerpo aislado de la invención. El procedimiento incluye: a) proporcionar una célula hospedadora que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica cualquier anticuerpo aislado de la invención o un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica cualquier anticuerpo aislado de la invención, y b) expresar la molécula de ácido nucleico o el vector en la célula hospedadora en condiciones que permiten la formación del anticuerpo.
El procedimiento puede incluir la etapa de recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora, por ejemplo, en una concentración de aproximadamente 1-100, 1-50, 1-25, 2-50, 5-50 o 2-20 mg/ml.
La célula hospedadora utilizada en el procedimiento puede ser una célula CHO.
En otro aspecto, la invención presenta una composición farmacéutica que incluye el anticuerpo aislado de la invención y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye el anticuerpo en una cantidad de dosis terapéuticamente eficaz.
En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo aislado de la invención para su uso en un procedimiento de reducción o tratamiento de la activación basada en inmunocomplejos de una respuesta inmunitaria aguda que se activa por una afección médica seleccionada del grupo que consiste en pénfigo vulgar, nefritis lúpica, miastenia grave, síndrome de Guillain-Barré, rechazo mediado por anticuerpos, síndrome catastrófico de anticuerpos antifosfolípidos, vasculitis mediada por inmunocomplejos, glomerulitis, una canalopatía, neuromielitis óptica, pérdida de audición autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), anemia hemolítica autoinmunitaria (AHAI), neutropenia inmunitaria, cardiomiopatía dilatada y enfermedad del suero.
En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo aislado de la invención para su uso en un procedimiento de reducción o tratamiento de la activación basada en inmunocomplejos de una respuesta inmunitaria crónica que se activa por una afección médica seleccionada del grupo que consiste en polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), lupus sistémico, una forma crónica de un trastorno indicado para el tratamiento agudo, artropatías reactivas, cirrosis biliar primaria, colitis ulcerosa y vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ACAN).
En otro aspecto, la invención presenta un anticuerpo aislado de la invención para su uso en un procedimiento de reducción o tratamiento de una respuesta inmunitaria activada por una enfermedad autoinmunitaria.
En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para aumentar el catabolismo de IgG en un sujeto. En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para reducir los autoanticuerpos en un sujeto. En otro aspecto más, la divulgación presenta un procedimiento para tratar o reducir la activación basada en inmunocomplejos de una respuesta inmunitaria en un sujeto. Los procedimientos incluyen administrar al sujeto cualquier anticuerpo aislado descrito en el presente documento o una composición farmacéutica que incluye cualquier anticuerpo aislado descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria o la respuesta inmunitaria se activa por una enfermedad autoinmunitaria. En concreto, la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Addison, anemia hemolítica, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis, enfermedad de Behcet, penfigoide bulloso, cardiomiopatía, esprúe-dermatitis celíaca, síndrome de disfunción inmunitaria por fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, esclerodermia limitada (síndrome CREST), enfermedad por aglutininas frías, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia, fibromiositis, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, hipotiroidismo, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario, fibrosis pulmonar idiopática, nefropatía por IgA, diabetes insulinodependiente, artritis juvenil, liquen plano, lupus, enfermedad de Méniére, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome de la persona rígida, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, colitis ulcerosa, uveítis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.
Definiciones
El término "anticuerpo" se utiliza en el presente documento en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpos, incluidas, entre otras, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten actividad de unión al antígeno FcRn.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecíficos.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que ha sido separado y/o recuperado de un componente del entorno de la célula hospedante que lo ha fabricado. Los componentes contaminantes del entorno de la célula hospedante que lo ha fabricado son materiales que podrían interferir con los usos de investigación, diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo. Los componentes contaminantes pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica (1) hasta más del 95 % en peso de anticuerpo según lo determinado, por ejemplo, mediante el procedimiento de Lowry, y en algunas realizaciones, hasta más del 99 % en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso, por ejemplo, de un secuenciador de vaso giratorio, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando, por ejemplo, azul de Coomassie o tinción de plata. Un anticuerpo aislado incluye el anticuerpoin situdentro de células recombinantes. Sin embargo, normalmente un anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. Un preparado farmacéutico de un anticuerpo aislado suele tener menos de 250 ppm (por ejemplo, menos de 200 ppm, 150 ppm, 100 ppm) de proteínas de la célula hospedadora ("host cell proteins", HCP), según lo determinado por un ensayo de HCP basado en ELISA realizado según lo recomendado por el documento de la FDA "Guidance for Industry" (Guía para la Industria).
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales de la población tienen la misma secuencia primaria, excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en pequeña cantidad. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y están dirigidos contra un único sitio antigénico (es decir, un epítopo de un FcRn humano). A diferencia de los preparados de anticuerpos policlonales, que suelen incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único epítopo del antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo en el sentido de que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo mediante ningún procedimiento concreto.
Tal como se utilizan en el presente documento, las expresiones "región variable" y "dominio variable" se refieren a las porciones de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo que incluyen secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por ejemplo, CDR L1,<c>D<r>L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 y CDR H3) y regiones marco (FR). De acuerdo con los procedimientos utilizados en la presente invención, las posiciones de los aminoácidos asignadas a las CDR y FR se definen según Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Utilizando este sistema de numeración, la secuencia lineal de aminoácidos real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de una CDR o a una inserción en una CDR (definida más adelante en el presente documento) o FR (definida más adelante en el presente documento) de la región variable. Por ejemplo, una región variable de cadena pesada puede incluir un único residuo insertado (es decir, un residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de CDR H2 y residuos insertados (es decir, residuos 82a, 82b, 82c, etc., según Kabat) después del residuo 82 de la FR de cadena pesada. La numeración Kabat de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "patrón".
Tal como se utilizan en el presente documento, la expresión "regiones determinantes de la complementariedad" y el término "CDR" se refieren a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente. Una CDR también se conoce como región hipervariable. Las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada tienen tres CDR cada una. La región variable de cadena ligera contiene CDR L1, CDR L2 y CDR L3. La región variable de cadena pesada contiene CDR H1, CDR H2 y CDR H3. Cada CDR puede incluir residuos de aminoácidos de una región determinante de la complementariedad según la definición de Kabat (es decir, alrededor de los residuos 24-34 (CDR L1), 50-56 (CDR L2) y 89-97 (CDR L3) en la región variable de cadena ligera y alrededor de los residuos 31-35 (CDR H1), 50-65 (CDR<h>2) y 95-102 (CDR H3) en la región variable de cadena pesada.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "FcRn" se refiere a un receptor de Fc neonatal que se une a la región Fc de un anticuerpo IgG, por ejemplo, un anticuerpo IgG1. Un ejemplo de FcRn es el FcRn humano con el número de identificación UniProt P55899. Se cree que el FcRn humano es responsable de mantener la semivida de la IgG mediante la unión y el tráfico de la IgG internalizada constitutivamente de vuelta a la superficie celular para el reciclaje de la IgG.
Tal como se utilizan en el presente documento, el término "afinidad" y la expresión "afinidad de unión" se refieren a la fuerza de la interacción de unión entre dos moléculas. En general, la afinidad de unión se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula y su compañero de unión, tal como un anticuerpo aislado y su diana (por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRn aislado de la invención y un FcRn humano). A menos que se indique lo contrario, la afinidad de unión se refiere a la afinidad de unión intrínseca, que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de una pareja de unión. La afinidad de unión entre dos moléculas suele describirse mediante la constante de disociación (K<d>) o la constante de afinidad (K<a>). Dos moléculas que tienen una baja afinidad de unión entre sí generalmente se unen lentamente, tienden a disociarse con facilidad y muestran una K<d>alta. Dos moléculas que tienen una gran afinidad entre sí generalmente se unen con facilidad, tienden a permanecer unidas más tiempo y presentan una Kd baja. En el ejemplo 2 se describe un procedimiento para determinar la Kd de un anticuerpo contra un FcRn humano ("el procedimiento SPR"). Utilizando este procedimiento, la Kd de N022, N023, N024, N026 y N027 fue de 31, 31,4, 35,5, 36,5 y 19,3 pM, respectivamente.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "inhibir la unión de IgG a FcRn" se refiere a la capacidad de un anticuerpo anti-FcRn de la invención para bloquear o inhibir la unión de IgG (por ejemplo, IgG1) a un FcRn humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-FcRn de la invención se une a un FcRn, por ejemplo, en el sitio del FcRn humano al que se une la IgG. Así, el anticuerpo anti-FcRn de la invención es capaz de inhibir la unión de IgG (por ejemplo, los autoanticuerpos de un sujeto) a los FcRn. En algunas realizaciones, la molécula (por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRn de la invención) inhibe sustancial o completamente la unión a IgG. En algunas realizaciones, la unión de IgG se reduce en un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 50 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 % o incluso un 100 %.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "aminoácido hidrófobo" se refiere a un aminoácido que tiene una solubilidad relativamente baja en agua. Los aminoácidos hidrófobos incluyen, entre otros, la leucina, la isoleucina, la alanina, la fenilalanina, la valina y la prolina. Los aminoácidos hidrófobos especialmente preferidos en la presente invención son la alanina, la leucina, la isoleucina y la valina.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "aminoácido polar" se refiere a un aminoácido que tiene una polaridad química en su cadena lateral inducida por átomos con diferente electronegatividad. La polaridad de un aminoácido polar depende de la electronegatividad entre los átomos de la cadena lateral del aminoácido y de la asimetría de la estructura de la cadena lateral. Los aminoácidos polares incluyen, entre otros, la serina, la treonina, la cisteína, la metionina, la tirosina, el triptófano, la asparagina y la glutamina. Los aminoácidos polares especialmente preferidos en la presente invención son la serina, la treonina, la asparagina, la glutamina, la cisteína y la tirosina.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "aminoácido ácido" se refiere a un aminoácido cuya cadena lateral contiene un grupo ácido carboxílico que tiene un pKa entre 3,5 y 4,5. Los aminoácidos ácidos incluyen, entre otros, el ácido aspártico y el ácido glutámico.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "aminoácido básico" se refiere a un aminoácido cuya cadena lateral contiene un grupo amino que tiene un pKa entre 9,5 y 13. Los aminoácidos básicos incluyen, entre otros, la histidina, la lisina y la arginina.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "porcentaje (%) de identidad" se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de una secuencia candidata, por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRn de la invención, que son idénticos a los residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de una secuencia de referencia, por ejemplo, un anticuerpo anti-FcRn de tipo salvaje, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad (es decir, se pueden introducir huecos en una o ambas secuencias candidata y de referencia para un alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas se pueden descartar a efectos de comparación). La alineación para determinar el porcentaje de identidad puede lograrse de diversas maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático de acceso público, tal como el software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias comparadas. En algunas realizaciones, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de una secuencia candidata dada con o frente a una secuencia de referencia dada (que también puede expresarse como una secuencia candidata dada que tiene o que incluye un determinado porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) con o frente a una secuencia de referencia dada) se calcula como sigue:
100 x (fracción de A/B)
donde A es el número de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) considerados idénticos en el alineamiento de la secuencia candidata y la secuencia de referencia, y donde B es el número total de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en la secuencia de referencia. En algunas realizaciones en las que la longitud de la secuencia candidata no es igual a la longitud de la secuencia de referencia, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de la secuencia candidata con respecto a la secuencia de referencia no sería igual al porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de la secuencia de referencia con respecto a la secuencia candidata.
En realizaciones concretas, una secuencia de referencia alineada para su comparación con una secuencia candidata puede mostrar que la secuencia candidata presenta del 50 % al 100 % de identidad en toda la longitud de la secuencia candidata o en una porción seleccionada de residuos contiguos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) de la secuencia candidata. La longitud de la secuencia candidata alineada a efectos de comparación es de al menos un 30 %, al menos un 40 %, por ejemplo, al menos un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Cuando una posición en la secuencia candidata está ocupada por el mismo residuo de aminoácido (o ácido nucleico) que la posición correspondiente en la secuencia de referencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" se refiere a un vehículo que incluye los componentes celulares necesarios, por ejemplo, orgánulos, necesarios para expresar proteínas a partir de sus correspondientes ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos suelen estar incluidos en vectores de ácidos nucleicos que pueden introducirse en la célula hospedadora mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, etc.). Una célula hospedadora puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula bacteriana, o una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero (por ejemplo, una célula CHO). Tal como se describe en el presente documento, se utiliza una célula hospedadora para expresar uno o más polipéptidos que codifican anticuerpos anti-FcRn de la invención.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico a la que está asociada. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en el que se pueden acoplar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es el vector de fago. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden acoplar segmentos adicionales de ADN al genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en la célula hospedadora en que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, los vectores de mamífero no episómicos) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora y, de este modo, se replican junto con el genoma del hospedador. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante suelen adoptar la forma de plásmidos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero, por ejemplo, preferentemente un ser humano. Entre los mamíferos se incluyen, entre otros, los seres humanos y los animales domésticos y de granja, tales como monos (por ejemplo, un mono cynomolgus), ratones, perros, gatos, caballos y vacas, etc.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a una formulación medicinal o farmacéutica que contiene un ingrediente activo, así como uno o más excipientes y diluyentes para que el ingrediente activo sea adecuado para el procedimiento de administración. La composición farmacéutica de la presente invención incluye componentes farmacéuticamente aceptables que son compatibles con el anticuerpo anti-FcRn. La composición farmacéutica puede presentarse en forma acuosa para la administración intravenosa o subcutánea o en forma de comprimido o cápsula para la administración oral.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente o diluyente en una composición farmacéutica. El vehículo farmacéuticamente aceptable debe ser compatible con los demás ingredientes de las formulaciones y ser no perjudicial para el receptor. En la presente invención, el vehículo farmacéuticamente aceptable debe proporcionar una estabilidad farmacéutica adecuada a la construcción de Fc. La naturaleza del vehículo difiere según el modo de administración. Por ejemplo, para la administración intravenosa, generalmente se utiliza un vehículo de solución acuosa; para la administración oral, se prefiere un vehículo sólido.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad, por ejemplo, dosis farmacéutica, eficaz para inducir un efecto biológico deseado en un sujeto o paciente o para tratar a un paciente que padezca una afección o trastorno descrito en el presente documento. También debe entenderse en el presente documento que una "cantidad terapéuticamente eficaz" puede interpretarse como una cantidad que proporciona un efecto terapéutico deseado, ya sea tomada en una dosis o en cualquier pauta posológica o vía, tomada sola o en combinación con otros agentes terapéuticos.
Descripción de los dibujos
La figura 1 incluye dos gráficos y una tabla que muestran la unión competitiva de IgG de los anticuerpos N022-N024, N026 y N027 a un FcRn humano o de mono cynomolgus a pH 6,0.
La figura 2 incluye gráficos que muestran los efectos de los anticuerpos N023, N024, N026 y N027 sobre el catabolismo de IgG en ratones.
La figura 3 incluye gráficos que muestran los efectos dependientes de la dosis del anticuerpo N027 sobre los niveles de IgG y la ocupación de la diana en ratones.
La figura 4 incluye gráficos que muestran la inducción selectiva del catabolismo de IgG y la ocupación de la diana en monos cynomolgus tras la administración de diferentes dosis del anticuerpo N027.
La figura 5 incluye un gráfico que muestra la biodistribución de N027 en ratones.
La figura 6 incluye una cronología experimental y un gráfico que muestra la eficacia del N027 en un modelo de artritis inducida por anticuerpos de colágeno en ratones.
La figura 7 incluye una cronología experimental y dos gráficos que muestran la eficacia del N027 en un modelo de púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) crónica en ratón.
Descripción detallada de la invención
La presente invención presenta anticuerpos aislados que se unen al receptor Fc neonatal humano (FcRn) con alta afinidad. La presente invención presenta anticuerpos anti-FcRn, procedimientos y composiciones para preparar anticuerpos anti-FcRn, y usos de los mismos para bloquear la actividad de FcRn, reducir la activación basada en inmunocomplejos de una respuesta inmunitaria y tratar enfermedades inmunológicas.
I. Anticuerpos anti-FcRn
En general, la invención presenta anticuerpos aislados que se unen al FcRn humano con alta afinidad. Un anticuerpo anti-FcRn de la invención se refiere a un anticuerpo que puede unirse a un FcRn humano e inhibir la unión de IgG (por ejemplo, autoanticuerpos IgG) a FcRn. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un anticuerpo madurado por afinidad, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 o scFv.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo contiene secuencias de unión al antígeno de un donante no humano injertadas en una secuencia heteróloga no humana, humana o humanizada (por ejemplo, secuencias marco y/o de dominio constante). En una realización, el donante no humano es un ratón. En otra realización, una secuencia de unión al antígeno es sintética, por ejemplo, obtenida por mutagénesis (por ejemplo, selección por presentación por fagos, etc.). En otra realización, un anticuerpo quimérico tiene regiones variables no humanas (por ejemplo, de ratón) y regiones constantes humanas. En un ejemplo, una región variable de cadena ligera de ratón se fusiona con una cadena ligera k humana. En otro ejemplo, una región variable de cadena pesada de ratón se fusiona con una región constante de IgG1 humana.
En un aspecto, la divulgación presenta un anticuerpo aislado capaz de unirse a un FcRn humano. El anticuerpo aislado contiene: (1) una región variable de cadena ligera que incluye una CDR L1, una CDR L2 y una CDR L3 y (2) una región variable de cadena pesada que incluye una CDR H1, una CDR H2 y una CDR H3, en el que la CDR L1 tiene una secuencia con al menos un 92 % de identidad con la secuencia de TGTGSDVGSYNLVS (S<e>Q ID NO: 1), la CDR L2 tiene una secuencia con al menos un 85 % de identidad con la secuencia GDSERPS (SEQ ID NO: 2), la CDR L3 tiene una secuencia con al menos un 90 % de identidad con la secuencia SSYAGSGIYV (SEQ ID NO: 3), la CDR H1 tiene una secuencia con al menos un 80 % de identidad con la secuencia TYAMG (SEQ ID NO: 4), DYAMG (SEQ ID NO: 5) o NYAMG (SEQ ID NO: 6), la CDR H2 tiene una secuencia con al menos un 92 % de identidad con la secuencia SIGSSGAQTRYADS (SEQ ID NO: 7), SIGASGSQTRYADS (SEQ ID NO: 8), SIGASGAQTRYADS (SEQ ID NO: 9) o SIGASGGQTRYADS (SEQ ID NO: 10), y la CDR H3 tiene una secuencia con al menos un 85 % de identidad con la secuencia LAIGDSY (SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al FcRn humano con una Kd inferior a 200, 150, 100, 50 o 10 pM. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al FcRn humano con una Kd que es menor o igual a la de un anticuerpo que tiene la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de N022, N023, N024, N026 o N027, y que además tiene la misma región Fc que el anticuerpo que se está comparando.
En algunas realizaciones, un anticuerpo aislado de la divulgación tiene una CDR L1 que tiene la secuencia X1GTGSDVGSYNX2VS (SEQ ID NO: 12), una CDR L2 que tiene la secuencia GDX3X4RPS (SEQ ID NO: 13), una CDR L3 que tiene la secuencia X5SYX6GSGIYV (SEQ ID No : 14), una CDR H1 que tiene la secuencia Z1YAMG (SEQ ID NO: 15), una CDR H2 que tiene la secuencia SIGZ2SGZ3QTZ4YADS (SEQ ID NO: 16) y una CDR H3 que tiene la secuencia LAZ5Z6DSY (SEQ ID NO: 17), en el que X1 es un aminoácido polar o hidrófobo (por ejemplo, preferentemente T, A, S o I), X2 es un aminoácido hidrófobo (por ejemplo, preferentemente L o I), X3 es un aminoácido polar (por ejemplo, preferentemente S, N o T), X4 es un aminoácido polar o ácido (por ejemplo, preferentemente Q, E o N), X5 es un aminoácido polar o hidrófobo (por ejemplo, preferentemente C, S, I o Y), X6 es un aminoácido hidrófobo (por ejemplo, preferentemente A o V), Z1 es un aminoácido polar o ácido (por ejemplo, preferentemente E, T, D o N), Z2 es un aminoácido polar o hidrófobo (por ejemplo, preferentemente S o A), Z3 es G, S o A, Z4 es un aminoácido básico (por ejemplo, preferentemente K o R), Z5 es un aminoácido hidrófobo o básico (por ejemplo, preferentemente I, L o H) y Z6 es G, S, D, Q o H, y en el que el anticuerpo se une a un FcRn humano con una K<d>inferior a 200, 150, 100, 50 o 40 pM.
En otras realizaciones, un anticuerpo aislado de la divulgación tiene una CDR L1 que tiene la secuencia TGTGSDVGSYNLVS (SEQ ID NO: 1), una CDR L2 que tiene la secuencia GDSERPS (SEQ ID NO: 2), una CDR L3 que tiene la secuencia SSYAGSGIYV (SEQ ID NO: 3), una CDR H1 que tiene la secuencia Z1YAMG (s Eq ID NO: 15), una CDR H2 que tiene la secuencia SIGZ2SGZ3QTRYADS (SEQ ID NO: 18) y una CDR H3 que tiene la secuencia LAIGDSY (S<e>Q ID NO: 11), en el que Z1 es T, D o N,<z>2 es S o A, y Z3 es G, S o A.
La tabla 1 muestra las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las cadenas ligera y pesada de algunos ejemplos de anticuerpos anti-FcRn de la divulgación y la invención.
Tabla 1.
La tabla 2 muestra las SEQ ID NO de las regiones variables de cadena ligera y pesada de estos ejemplos de anticuerpos anti-FcRn de la divulgación y la invención.
Tabla 2.
En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera de un anticuerpo aislado de la divulgación tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC
S (SEQ ID NO: 19).
En algunas realizaciones, la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo aislado de la divulgación tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGAQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 20).
En algunas realizaciones, la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo aislado de la divulgación tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGSQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 21).
En algunas realizaciones, la región variable de cadena pesada de un anticuerpo aislado de la divulgación tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGAQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 22).
En otras realizaciones, la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo aislado de la divulgación tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGGQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 23).
En otras realizaciones, la región variable de cadena pesada de un anticuerpo aislado de la divulgación tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGSQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 24).
La divulgación presenta un anticuerpo aislado que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGSQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 24).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGAQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 20).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGSQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 21).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGAQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 22).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que incluye una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGGQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 23).
Además, en cualquiera de los anticuerpos anti-FcRn descritos en el presente documento, la región variable de cadena pesada del anticuerpo tiene una secuencia que tiene al menos un 95 %, un 97 %, un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 20-24. En cualquiera de los anticuerpos anti-FcRn descritos en el presente documento, la región variable de cadena ligera tiene una secuencia que tiene al menos un 95 %, un 97 %, un 99 % o un 100 % de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 19.
Los anticuerpos de la divulgación pueden contener además sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos fuera de las CDR (es decir, en regiones marco (FR)). En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden incluir además una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: A23V, S30R, L80V, A84T, E85D,<a>93V, en relación con la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 20-24, y Q38H, V58I y G99D, en relación con la secuencia SEQ ID NO: 19.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la divulgación pueden incluir sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones constantes (por ejemplo, región Fc) del anticuerpo que, por ejemplo, conducen a una disminución de la función efectora, por ejemplo, disminución de la citólisis dependiente del complemento (CDC), citólisis mediada por células dependiente de anticuerpos ("antibody-dependent cell-mediated cytolysis", ADCC) y/o fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos ("antibody-dependent cell-mediated phagocytosis", ADCP) y/o disminución de la destrucción de linfocitos B. Las regiones constantes no intervienen directamente en la unión de un anticuerpo a su diana, pero presentan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se caracterizan por una disminución de la unión (es decir, ausencia de unión) al factor del complemento humano C1q y/o al receptor Fc humano en linfocitos citolíticos naturales ("natural killer", n K). En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención se caracterizan por una unión disminuida (es decir, ausencia de unión) a FcyRI, FcyRIIA y/o FcyRIIIA humanos. Para alterar o reducir una función efectora dependiente de anticuerpos, tal como CDC, ADCC, ADCP y/o la destrucción de linfocitos B, los anticuerpos de la invención pueden ser de la clase IgG y contener una o más sustituciones de aminoácidos E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 y/o P329 (numeración según el índice EU de Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))). En algunas realizaciones, los anticuerpos contienen las mutaciones L234A/L235A o D265A/N297A. El anticuerpo sin función efectora resultante muestra muy poca unión al complemento o a los receptores de Fc (es decir, unión al complemento C1q), lo que indica un bajo potencial de CDC.
En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden incluir aquellos que tienen cambios de aminoácidos específicos que mejoran la estabilidad del anticuerpo.
Además, en otras realizaciones, para minimizar la inmunogenicidad potencial, algunos anticuerpos de la invención o divulgación, por ejemplo, N024, N026 y N027, pueden sufrir un cambio de alotipo de G1m17.1 a G1m17 sustituyendo los aminoácidos D355 y L357 (en relación con la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 20-24) a ácido glutámico y metionina, respectivamente.
La invención presenta un anticuerpo aislado que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos<QSALTQPASVSGSPGQS>m<SCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN>TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos
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La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGAQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 20).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGSQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 21).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGAQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 22).
La divulgación también proporciona un anticuerpo aislado que contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en el que la región variable de cadena ligera tiene la secuencia
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTGSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYGDSERPSGVSNRFSGSKSGN TASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGSGIYVFGTGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYP GAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC S (SEQ ID NO: 19); y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSSIGASGGQTRYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLAIGDSYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 23).
En cualquiera de los anticuerpos anti-FcRn descritos en el presente documento, en algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un FcRn de ratón o rata con una K<d>inferior a 200, 150, 100, 50 o 40 pM.
En cualquiera de los anticuerpos anti-FcRn descritos en el presente documento, en algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un FcRn humano con una afinidad de entre 1-100, 5-150, 5-100, 5-75, 5-50, 10-50 o 10-40 pM.
Los anticuerpos anti-FcRn de la divulgación pueden ser de anticuerpos de inmunoglobulina de isotipo IgG, IgE, IgM, IgA o IgD. Preferentemente, los anticuerpos anti-FcRn son de anticuerpos inmunoglobulina de isotipo IgG. Los anticuerpos anti-FcRn también pueden ser de cualquier subclase de isotipos de anticuerpos de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos anti-FcRn pueden ser de la subclase de IgG IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Preferentemente, los anticuerpos anti-FcRn son de la subclase IgG1. En concreto, los anticuerpos anti-FcRn de la divulgación contienen una cadena pesada de alotipo IgG G1m17 o G1 m17.1. En alguna realización, la cadena ligera de los anticuerpos anti-FcRn puede ser una cadena ligera<k>, una cadena ligera A o una cadena ligera quimérica<k>-A. En realizaciones preferidas, los anticuerpos anti-FcRn de la invención contienen una cadena ligera A de longitud completa.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son monoclonales. Los anticuerpos de la invención también pueden ser policlonales, quiméricos, humanizados o totalmente humanos. En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención puede haber sido madurado por afinidad. En otras realizaciones, el anticuerpo de la invención puede ser un fragmento de anticuerpo.
Sin querer ceñirse a ninguna teoría concreta, se cree que los anticuerpos anti-FcRn de la invención compiten con la unión de IgG a los FcRn humanos y la inhiben. La cartografía de epítopos obtenida por intercambio de hidrógenodeuterio de los anticuerpos de la invención indica que los anticuerpos se unen a un epítopo en FcRn situado en la interfaz de interacción Fc-FcRn y/o adyacente a ésta, lo que sugiere que los anticuerpos de la invención bloquean la unión de IgG a los FcRn por inhibición de la dirección. Además, el sitio de unión cartografiado por epítopos está alejado del sitio de unión a la albúmina del FcRn. En consecuencia, no debería inhibirse la unión a la albúmina sérica y los niveles de albúmina sérica no deberían disminuir. De hecho, pruebas experimentales demuestran que los niveles de albúmina en ratones permanecen constantes tras la administración de anticuerpos anti-FcRn, lo que indica que el reciclaje de albúmina no se ve alterado por la unión del anticuerpo al FcRn.
III. Inhibición de FcRn
El FcRn es una proteína transmembrana de tipo I que actúa como una proteína de tráfico vesicular intracelular de unión a IgG y a albúmina sérica. El FcRn se expresa en células endoteliales, células epiteliales luminales, hepatocitos, podocitos, granulocitos, monocitos, macrófagos, células dendríticas y células NK, pero no en linfocitos B o T El FcRn mantiene la semivida de la IgG mediante la unión y el tráfico de la IgG internalizada constitutivamente de vuelta a la superficie celular. La unión a Fc y a albúmina sérica del FcRn se produce en el endosoma temprano a pH 6,0, seguido de la clasificación del FcRn en vesículas, que transportan la IgG o albúmina unida al FcRn de vuelta a la superficie celular, donde el FcRn libera rápidamente la IgG o albúmina a pH 7,4. Este ciclo de tráfico mantiene la semivida de la IgG y la albúmina reciclando ambas hacia la circulación y evitando su tráfico hacia los lisosomas para su degradación. El FcRn también captura las Fc de IgG internalizadas en las células epiteliales y las transporta bidireccionalmente a las membranas basolateral o apical opuestas. Esta función permite el tráfico de IgG hacia el lumen de órganos, tales como el tracto gastrointestinal, o el transporte de IgG o complejos de IgG-antígeno desde el lumen a la vasculatura o tejidos linfoides en las capas estromales.
Para estudiar la contribución de la FcRn a la homeostasis de la IgG, se han modificado ratones de manera que partes de las cadenas ligera y pesada del FcRn han sido "eliminadas" para que estas proteínas no se expresen (Junghanset al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5512, 1996). En estos ratones, la semivida sérica y las concentraciones de IgG se redujeron drásticamente, lo que sugiere un mecanismo de homeostasis de la IgG dependiente del FcRn. Los estudios en modelos de roedores, como el comentado anteriormente, sugieren que el bloqueo del FcRn puede aumentar el catabolismo de las IgG, incluido el de los autoanticuerpos patógenos, inhibiendo así el desarrollo de la enfermedad (por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria). El FcRn también puede contribuir a la presentación de antígenos mediante el tráfico de inmunocomplejos a los compartimentos de degradación de antígenos y de carga del MHC.
La presente invención proporciona anticuerpos anti-FcRn aislados que se unen a los FcRn humanos con alta afinidad. Los anticuerpos anti-FcRn de la invención compiten con la unión de otros anticuerpos anti-FcRn (por ejemplo, IgG, autoanticuerpos IgG) a FcRn e inhiben su unión con eficacia, aumentando así el catabolismo y disminuyendo la semivida de otros anticuerpos anti-FcRn (por ejemplo, IgG, autoanticuerpos IgG). Los anticuerpos anti-FcRn de la invención pueden utilizarse en un procedimiento de tratamiento o reducción de la activación basada en inmunocomplejos de una respuesta inmunitaria en un sujeto, tal como una respuesta inmunitaria causada por autoanticuerpos en una enfermedad autoinmunitaria.
IV. Vectores, células hospedadoras y producción de anticuerpos
Los anticuerpos anti-FcRn de la invención pueden producirse a partir de una célula hospedadora. Una célula hospedadora se refiere a un vehículo que incluye los componentes celulares necesarios, por ejemplo, orgánulos, necesarios para expresar los polipéptidos y construcciones descritos en el presente documento a partir de sus correspondientes ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden incluirse en vectores de ácidos nucleicos que pueden introducirse en la célula hospedadora mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, infección, etc.). La elección de los vectores de ácidos nucleicos depende en parte de las células hospedadoras que se vayan a utilizar. Por lo general, las células hospedadoras preferidas son de origen procariota (por ejemplo, bacteriano) o eucariota (por ejemplo, mamífero).
Construcción de vectores de ácidos nucleicos y células hospedadoras
Una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-FcRn de la invención puede prepararse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, entre otros, la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a sitio) y la mutagénesis por PCR. Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-FcRn de la invención puede obtenerse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, síntesis génica. Como alternativa, una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-FcRn de tipo salvaje puede mutarse para que contenga sustituciones de aminoácidos específicos utilizando técnicas convencionales en la técnica, por ejemplo, mutagénesis QuikChange™. Las moléculas de ácido nucleico pueden sintetizarse utilizando un sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-FcRn de la invención pueden insertarse en un vector capaz de replicar y expresar las moléculas de ácido nucleico en células hospedadoras procariotas o eucariotas. Hay muchos vectores disponibles en la técnica que pueden utilizarse para los fines de la invención. Cada vector puede contener diversos componentes que pueden ajustarse y optimizarse para su compatibilidad con la célula hospedadora concreta. Por ejemplo, los componentes del vector pueden incluir, entre otros, un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión a ribosomas, una secuencia señal, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés y una secuencia de terminación de la transcripción.
En algunas realizaciones, se utilizan células de mamífero como células hospedadoras para la invención. Algunos ejemplos de tipos de células de mamífero incluyen, entre otros, células de riñón embrionario humano (HEK) (por ejemplo, HEK293, HEK 293F), células de ovario de hámster chino (CHO), HeLa, COS, PC3, Vero, MC3T3, NS0, Sp2/0, VERY, BHK, MDCK, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce endógenamente cadenas de inmunoglobulina), CRL7O3O y HsS78Bst. En otras realizaciones, se utilizan células deE. colicomo células hospedadoras para la invención. Algunos ejemplos de cepas deE. coliincluyen, entre otras,E. coli294 (ATCC®31,446), EcoliA 1776 (ATCC®31,537), EcoliBL21 (DE3) (ATCC® BAA-1025) y E.coliRV308 (ATCC® 31,608). Las distintas células hospedadoras poseen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccional de los productos proteicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas de hospedador adecuados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos del anticuerpo anti-FcRn expresado. Los vectores de expresión descritos anteriormente pueden introducirse en células hospedadoras apropiadas mediante técnicas convencionales en la técnica, por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio y microinyección directa. Una vez introducidos los vectores en las células hospedadoras para la producción de proteínas, las células se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según convenga para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Los procedimientos para la expresión de proteínas terapéuticas son conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.), Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2a ed., 2004 (20 de julio de 2004); y Vladimir Voynov y Justin A. Caravella (eds.), Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2a ed., 2012 (28 de junio de 2012).
Producción, recuperación y purificación de proteínas
Las células hospedadoras utilizadas para producir los anticuerpos anti-FcRn de la invención pueden cultivarse en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células hospedadoras seleccionadas. Algunos ejemplos de medios adecuados para células hospedadoras de mamífero son el medio esencial mínimo (MEM), el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el medio de expresión Expi293™, DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) y RPMI-1640. Algunos ejemplos de medios adecuados para células hospedadoras bacterianas incluyen el caldo Luria (LB) con los suplementos necesarios, tales como un agente de selección, por ejemplo, ampicilina. Las células hospedadoras se cultivan a temperaturas adecuadas, tales como de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 39 °C, por ejemplo, de 25 °C a aproximadamente 37 °C, preferentemente 37 °C, y con un nivel de CO2, tal como del 5 al 10 % (preferentemente al 8 %). El pH del medio suele ser de aproximadamente 6,8 a 7,4, por ejemplo, 7,0, en función principalmente del organismo hospedador. Si se utiliza un promotor inducible en el vector de expresión de la invención, la expresión de la proteína se induce en condiciones adecuadas para la activación del promotor.
La recuperación de proteínas suele implicar la alteración de la célula hospedadora, por lo general por medios como el choque osmótico, la sonicación o la lisis. Una vez alteradas las células, los restos celulares pueden eliminarse por centrifugación o filtración. Las proteínas pueden purificarse aún más. Un anticuerpo anti-FcRn de la invención puede purificarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica de la purificación de proteínas, por ejemplo, por afinidad de proteína A, otra cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad y en columna de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas (véase Process Scale Purification of Antibodies, Uwe Gottschalk (ed.), John Wiley & Sons, Inc., 2009). En algunos casos, un anticuerpo anti-FcRn puede conjugarse con secuencias marcadoras, tales como un péptido, para facilitar la purificación. Un ejemplo de secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina (His-tag), que se une a la columna de afinidad de agarosa funcionalizada con níquel con afinidad micromolar. Otros marcadores peptídicos útiles para la purificación incluyen, entre otros, el marcador hemaglutinina "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe.
Como alternativa, los anticuerpos anti-FcRn de la invención pueden ser producidos por las células de un sujeto (por ejemplo, un ser humano), por ejemplo, en el contexto de una terapia, mediante la administración de un vector (por ejemplo, un vector retrovírico, un vector adenovírico, un vector poxvírico (por ejemplo, un vector vírico de vaccinia, tal como vaccinia Ankara modificado (MVA)), un vector vírico adenoasociado y un vector alfavírico) que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-FcRn de la invención. El vector, una vez dentro de una célula del sujeto (por ejemplo, por transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, infección, etc.) estimulará la expresión del anticuerpo anti-FcRn, que luego será secretado por la célula. Si el resultado deseado es el tratamiento de una enfermedad o un trastorno, puede que no sea necesaria ninguna otra acción. Si se desea recoger la proteína, se puede extraer sangre del sujeto y purificar la proteína de la sangre por procedimientos conocidos en la técnica.
V. Composiciones y preparados farmacéuticos
La invención presenta composiciones farmacéuticas que incluyen uno o más anticuerpos anti-FcRn descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención contienen uno o más anticuerpos de la divulgación o invención, por ejemplo, N022-N024, N026 y N027, como proteínas terapéuticas. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen uno o más anticuerpos de la divulgación o invención, por ejemplo, N022-N024, N026 y N027, pueden usarse combinados con otros agentes (por ejemplo, productos biológicos terapéuticos y/o moléculas pequeñas) o composiciones en una terapia. Además de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, las composiciones farmacéuticas pueden contener uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, que pueden formularse por procedimientos conocidos por los expertos en la materia.
Los vehículos y excipientes aceptables en las composiciones farmacéuticas no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Los vehículos y excipientes aceptables pueden incluir tampones, antioxidantes, conservantes, polímeros, aminoácidos y carbohidratos. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por vía parenteral en forma de una formulación inyectable. Las composiciones farmacéuticas para inyección (es decir, inyección intravenosa) pueden formularse utilizando como vehículo una solución estéril o cualquier líquido farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, agua estéril, solución salina fisiológica y medios de cultivo celular (por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio de Eagle a-modificado (a-MEM), medio F-12). Los procedimientos de formulación son conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Banga (ed.), Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems (2a ed.), Taylor & Francis Group, CRC Press (2006).
La composición farmacéutica puede presentarse en forma de dosis unitaria según sea necesario. La cantidad de componente activo, por ejemplo, uno o más anticuerpos anti-FcRn de la divulgación o invención (por ejemplo, N022-N024, N026 y N027, preferentemente N027 y/o N024), incluida en los preparados farmacéuticos es tal que se proporciona una dosis adecuada dentro del intervalo designado (por ejemplo, una dosis dentro del intervalo de 0,01 500 mg/kg de peso corporal).
VI. Vías, dosis y administración
Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen uno o más anticuerpos anti-FcRn de la divulgación o invención (por ejemplo, N022-N024, N026 y N027, preferentemente N027 y/o N024) como proteínas terapéuticas pueden formularse para la administración intravenosa, la administración parenteral, la administración subcutánea, la administración intramuscular, la administración intraarterial, la administración intratecal o la administración intraperitoneal. En especial, se prefiere la administración intravenosa. La composición farmacéutica también puede formularse o administrarse por vía oral, nasal, en aerosol, rectal o vaginal. Para las formulaciones inyectables, se conocen en la técnica diversos vehículos farmacéuticos eficaces.
La dosis de las composiciones farmacéuticas de la invención depende de factores que incluyen la vía de administración, la enfermedad a tratar y las características físicas, por ejemplo, edad, peso, salud general, del sujeto. Por lo general, la cantidad de un anticuerpo anti-FcRn de la invención (es decir, N027) contenida en una dosis única puede ser una cantidad que prevenga, retrase o trate con eficacia la enfermedad sin inducir una toxicidad significativa. Una composición farmacéutica de la invención puede incluir una dosis de un anticuerpo anti-FcRn de la invención que oscila entre 0,01 y 500 mg/kg (por ejemplo, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 mg/kg) y, en una realización más específica, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg/kg y, en una realización más específica, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/kg. La dosis puede ser adaptada por el médico en función de factores convencionales, tales como la extensión de la enfermedad y diferentes parámetros del sujeto.
Las composiciones farmacéuticas se administran de forma compatible con la formulación farmacéutica y en una cantidad terapéuticamente eficaz para mejorar o remediar los síntomas. Las composiciones farmacéuticas se administran en una diversidad de formas farmacéuticas, por ejemplo, formas farmacéuticas intravenosas, formas farmacéuticas subcutáneas y formas farmacéuticas orales (por ejemplo, soluciones ingeribles, cápsulas de liberación de fármacos). Por lo general, las proteínas terapéuticas se administran entre 1 y 100 mg/kg, por ejemplo, entre 1 y 50 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen un anticuerpo anti-FcRn de la divulgación o invención (por ejemplo, cualquiera de N022-N024, N026 y N027, preferentemente N027 o N024) pueden administrarse a un sujeto que lo necesite, por ejemplo, una o más veces (por ejemplo, de 1 a 10 veces o más) al día, a la semana, al mes, al semestre, al año o según sea necesario desde el punto de vista médico. Las dosis pueden ser únicas o múltiples. El intervalo entre administraciones puede disminuir a medida que mejora el estado médico o aumentar a medida que empeora la salud del paciente.
VII. Indicaciones
El bloqueo del FcRn humano por anticuerpos anti-FcRn de la invención puede ser de beneficio terapéutico en enfermedades que son causadas por autoanticuerpos IgG. La capacidad de bloquear los FcRn para inducir el catabolismo general de IgG y la eliminación de múltiples especies de autoanticuerpos sin alterar la albúmina sérica, los metabolitos pequeños circulantes o las lipoproteínas, ofrece un procedimiento para ampliar la utilidad y la accesibilidad de una estrategia de eliminación de autoanticuerpos en pacientes con una patología de enfermedad autoinmunitaria causada por autoanticuerpos. Aunque la invención no está limitada por la teoría, el mecanismo de acción dominante de un anticuerpo anti-FcRn de la invención puede ser aumentar el catabolismo de los autoanticuerpos patógenos en circulación y disminuir el depósito de autoanticuerpos e inmunocomplejos en los tejidos afectados.
Las composiciones farmacéuticas de la divulgación o invención que contienen uno o más anticuerpos anti-FcRn (por ejemplo, N022-N024, N026 y N027, preferentemente N027 y/o N024) son útiles para estimular el catabolismo y la eliminación de anticuerpos patógenos, por ejemplo, IgG y autoanticuerpos IgG en un sujeto, para reducir la respuesta inmunitaria, por ejemplo, para bloquear la activación basada en inmunocomplejos de una respuesta inmunitaria en un sujeto, y para tratar afecciones o enfermedades inmunológicas en un sujeto. En especial, las composiciones farmacéuticas y los procedimientos de la invención son útiles para reducir o tratar la activación basada en inmunocomplejos de una respuesta inmunitaria aguda o crónica. La respuesta inmunitaria aguda puede ser activada por una afección médica seleccionada del grupo que consiste en pénfigo vulgar, nefritis lúpica, miastenia grave, síndrome de Guillain-Barré, rechazo mediado por anticuerpos, síndrome catastrófico de anticuerpos antifosfolípidos, vasculitis mediada por inmunocomplejos, glomerulitis, una canalopatía, neuromielitis óptica, pérdida de audición autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), anemia hemolítica autoinmunitaria (AHAI), neutropenia inmunitaria, cardiomiopatía dilatada y enfermedad del suero. La respuesta inmunitaria crónica puede activarse por una afección médica seleccionada del grupo que consiste en polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), lupus sistémico, una forma crónica de un trastorno indicado para tratamiento agudo, artropatías reactivas, cirrosis biliar primaria, colitis ulcerosa y vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ACAN).
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y los procedimientos de la invención son útiles para reducir o tratar una respuesta inmunitaria activada por una enfermedad autoinmunitaria. La enfermedad autoinmunitaria puede seleccionarse del grupo que consiste en alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Addison, anemia hemolítica, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis, enfermedad de Behcet, penfigoide bulloso, cardiomiopatía, esprúe-dermatitis celíaca, síndrome de disfunción inmunitaria por fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, esclerodermia limitada (síndrome CREST), enfermedad por aglutininas frías, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia, fibromiositis, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, hipotiroidismo, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario, fibrosis pulmonar idiopática, nefropatía por IgA, diabetes insulinodependiente, artritis juvenil, liquen plano, lupus, enfermedad de Méniére, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome de la persona rígida, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, colitis ulcerosa, uveítis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.
En especial, las composiciones farmacéuticas y los procedimientos de la invención son útiles para reducir o tratar una respuesta inmunitaria activada por lupus eritematoso sistémico, síndrome antifosfolipídico, pénfigo vulgar/penfigoide bulloso, vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ACAN), miastenia grave o neuromielitis óptica.
Ejemplos
Ejemplo 1: Producción de anticuerpos
Las moléculas de ácido nucleico de cadena pesada y ligera de IgG se clonaron en el vector pCDNA 3.3 utilizando señales de secreción de osteonectina. Se cultivaron células HEK 293F en medio Expi293 a 37 °C con un 8 % de CO2. Las células se transfectaron a una densidad de 3 * 106/ml con 1 mg de ADN total por litro. Se añadieron potenciadores los días 2 y 3 siguiendo las instrucciones del fabricante y las células se cultivaron hasta el día 5 o 6 antes de que la viabilidad celular cayera por debajo del 50 % al 60 %. A continuación, las células se centrifugaron y el medio utilizado se esterilizó por filtración y se conservó a 4 °C hasta la purificación del anticuerpo. Los anticuerpos se purificaron mediante un procedimiento de dos columnas: Cromatografía POROS de proteína A, seguida de cromatografía POROS HS-50 de intercambio catiónico. La primera separa la mayor parte de las proteínas de la célula hospedadora de los anticuerpos expresados, mientras que la segunda elimina los dímeros de cadena pesada, los dímeros de cadena ligera y los medios anticuerpos, así como las especies de mayor peso molecular. Las fracciones de la columna de intercambio catiónico HS-50 se agruparon a partir de un análisis en gel SDS-PAGE para maximizar la pureza de los anticuerpos de longitud completa. Las fracciones recogidas se introdujeron en una columna de intercambio de tampón Sephadex G50 equilibrada en PBS a pH 7,2. Las fracciones de los picos se agruparon y concentraron hasta más de 10 mg/ml utilizando centrifugadoras de 30 kDa y se congelaron a -30 °C en partes alícuotas de 2 mg y 5 mg. Se comprobó la pureza de las muestras finales de proteínas mediante SDS-PAGE.
Ejemplo 2: Afinidades de unión
A través de la maduración por afinidad, los inventores identificaron más de 100 anticuerpos anti-FcRn con afinidades de unión al FcRn humano con una K<d>en el intervalo submicromolar. Se seleccionaron cinco anticuerpos (N022-N024, N026 y N027) para su posterior caracterización. Se utilizó la resonancia de plasmón superficial ("Surface Plasmon Resonance", s Pr ) para determinar las constantes de afinidad y de disociación (ka y kd, respectivamente) de cada uno de estos cinco anticuerpos. Brevemente, se insertó un chip sensor Bio-Rad GLC en el ProteOn XPR 36 y se inició con aire. Tras el inicio, el tampón de ejecución se cambió por un tampón recién preparado, HBSP+ (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, P20 al 0,05 %, pH 7,4) o tampón fosfato de sodio (fosfato de sodio 0,02 M, NaCl 0,15 M, P20 al 0,05 %, pH 6,0), según el caso, que se utilizó para el resto del ensayo y para todas las diluciones. El chip se preacondicionó con una inyección de SDS al 0,5 %, NaOH 50 mM y HCl 10 mM a 30 pl/min durante 60 segundos (s). Se diluyó un mAb Fc antihumano de ratón de GE Healthcare (BR100839) hasta 10 pg/ml en tampón acetato 10 mM, pH 5,0 y se inmovilizaron aproximadamente 5700 unidades de respuesta ("response units", RU) utilizando la química convencional de acoplamiento de aminas en la orientación horizontal sobre un chip sensor GLC. Los mAb anti-hFcRn que se iban a ensayar se capturaron en la superficie en orientación vertical, con el objetivo de inmovilizar aproximadamente 200 unidades de respuesta (RU) por punto de interacción. El rhFcRn se diluyó en una serie de dilución triple de cinco puntos a partir de 1,25 pg/ml, dejando un carril de sólo tampón para una doble referencia. El analito fluyó a través de la superficie del sensor en orientación horizontal a 100 pl/min durante 240 s con un tiempo de disociación de 3600 s. La regeneración se realizó inyectando MgCh 3 M a 100 pl/min durante 30 s en dirección horizontal y vertical. Estos procedimientos se repitieron para todos los ligandos.
El análisis de los datos se realizó utilizando el software ProteOn Manager. Cada etapa de interacción se ajustó para la dirección Y y X utilizando la herramienta Auto Process, seguida de una referenciación entre canales de manchas para eliminar las interacciones no específicas y una doble referenciación de carriles de blanco para eliminar la desviación del ensayo. Los datos se ajustaron utilizando el modelo cinético Langmuir 1:1 con un Rmáx agrupado. Los valores de ka, kd y Kd obtenidos de ProteOn Manager en una sola ejecución se promediaron y su CV porcentual se calculó en Microsoft Excel cuando el N era tres o mayor. La tabla 3 demuestra que cinco anticuerpos anti-FcRn de la invención, N022, N022, N024, N026 y N027, se unen todos con alta afinidad al FcRn humano a pH 7,4. La constante de disociación en equilibrio, Kd, de los anticuerpos anti-FcRn de la invención osciló entre 19,4 pM (N027) y 36,5 pM (N026) para la unión al FcRn humano a pH 7,4. La tabla 3 también muestra las constantes de afinidad rápida y de disociación lenta de los cinco anticuerpos anti-FcRn. A pH 7,4, las constantes de afinidad fueron del orden de 0,93 1,42 x 1061/Ms para la unión al FcRn humano. Las constantes de disociación oscilaban entre 2,31 y 4,44 * 1061/s.
Tabla 3.
Ejemplo 3: Competición con IgG
La capacidad de los anticuerpos anti-FcRn de la invención para competir con IgG por la unión al FcRn humano o de mono cynomolgus se evaluó en células de riñón embrionario humano ("human embryonic kidney", HEK) 293 que expresan ectópicamente FcRn unido a glicofosfatidilinositol (GPI) en la superficie celular. Las secuencias de aminoácidos del FcRn alfa humano y de mono cynomolgus presentan una identidad de secuencia del 97,5 %. Nueve residuos de aminoácidos de 355 son diferentes entre el FcRn alfa humano y el de mono cynomolgus, pero ninguno se encuentra en la región de unión cartografiada por epítopos. El nivel de IgG unida a las células se determinó utilizando 66 nM de IgG inespecífica marcada con una sonda fluorescente. La unión de la IgG al FcRn de la superficie celular se realizó a pH 6,0, lo que permite que la porción Fc de la IgG interactúe con el FcRn. Tal como se muestra en la figura 1, la cantidad de IgG unida a las células disminuyó significativamente al aumentar la concentración del anticuerpo anti-FcRn (N022-N024, N026 o N027). Cada uno de los cinco anticuerpos anti-FcRn ilustrativos de la invención inhibió la unión de IgG de forma dependiente de la concentración y de la saturación, lo que demuestra la capacidad de los anticuerpos anti-FcRn, N022-N024, N026 y N027, para competir con eficacia por la unión de IgG a FcRn e inhibirla a pH 6,0. Los valores de CE50 de los anticuerpos variaron entre 2 y 6 nM.
Ejemplo 4: Efecto de los anticuerpos anti-FcRn sobre el catabolismo de IgG en ratones
Para medir el efecto de los anticuerpos anti-FcRn de la invención sobre el catabolismo de IgGin vivo,se utilizó la raza de ratón transgénico para FcRn humano FcRn-/-hFcRn (32) Tg, que carece de FcRn de ratón, pero expresa FcRn humano con una distribución tisular similar al FcRn endógeno de ratón y humano. A los ratones FcRn-/-hFcRn (32) Tg inyectados con 500 mg/kg de IgG humana el día 0 se les administró una dosis única de un anticuerpo anti-FcRn a 10 mg/kg los días 1 y 4. Tal como se muestra en la figura 2, el catabolismo de IgG aumentó con la administración de anticuerpos anti-FcRn, como se observa por los niveles más bajos de IgG medidos a lo largo del tiempo en los ratones tratados con anticuerpos anti-FcRn. Las actividades de N024 (K<d>= 35,5 pM), N026 (K<d>= 36,5 pM) y N027 (K<d>= 19,4 pM) parecían ser similares a 10 mg/kg.
Ejemplo 5: Caracterizaciones funcionalesin vitroein vivode anticuerpos anti-FcRn
In vitro
Las afinidades de unión celular de los anticuerpos de la invención se midieron en células de riñón embrionario humano (HEK) 293 que expresaban ectópicamente FcRn humano o de mono cynomolgus unido a glicofosfatidilinositol (GPI) en la superficie celular. La FcRn es una proteína transmembrana de tipo I con los dominios de unión a IgG y a albúmina orientados hacia el lado luminal de las membranas endosómicas o hacia la superficie celular cuando se transporta a la membrana plasmática. La unión de anticuerpos anti-FcRn a FcRn asociado a membrana en la superficie celular en células HEK293 a pH 7,4 imita la unión en un entorno fisiológicamente pertinente y a un pH en el que sólo el dominio Fab, y no el dominio Fc, de los anticuerpos interactúa con FcRn. El dominio extracelular FcRn se mostró en la superficie celular en alta densidad mediante un enlace GPI con modificación C-terminal. Los anticuerpos anti-FcRn de la invención se marcaron con una sonda fluorescente. Se dejó que los anticuerpos se uniesen durante 30 minutos en hielo. A continuación, las células se lavaron a 4 °C y los anticuerpos unidos se detectaron utilizando un anticuerpo secundario marcado con fluoróforo, por ejemplo, un anticuerpo de cabra anti-F(ab)2 de IgG humana. La unión al FcRn humano dependía de la concentración y los anticuerpos de la invención mostraban unos valores de CE50 que oscilaban entre 4 y 7 nM.
Las afinidades de unión celular de los anticuerpos de la invención también se midieron en FcRn humanos expresados endógenamente. Los monocitos expresan los niveles más altos de FcRn y muestran el mayor porcentaje de positividad para la expresión de FcRn en sangre de ratón y humana. Se utilizó la línea celular monocítica THP-1 para evaluar la unión de los anticuerpos anti-FcRn al FcRn humano endógeno a pH 7,4. Dado que el FcRn endógeno se encuentra principalmente en vesículas endosómicas intracelulares en las células THP-1, las células se permeabilizaron primero con un detergente suave y se fijaron antes de incubarlas durante 30 minutos a 4 °C con anticuerpos anti-FcRn en presencia de suero bovino para bloquear la unión inespecífica al receptor de Fc. Este ensayo fue capaz de distinguir los anticuerpos con mejor unión al FcRn humano endógeno. La unión de anticuerpos anti-FcRn a las células THP-1 depende de la concentración. Todos los anticuerpos de la invención, por ejemplo, N022-N024, N026 y N027, mostraron mejores afinidades de unión que la IgG1. El anticuerpo N027 mostró la afinidad de unión más alta, con un valor de CE50 de 3,0 nM.
La capacidad de los anticuerpos anti-FcRn de la invención para competir con IgG por la unión al FcRn humano o de mono cynomolgus se evaluó en células de riñón embrionario humano (HEK) 293 que expresaban ectópicamente FcRn unido a GPI en la superficie celular. El nivel de IgG unida a las células se determinó utilizando una IgG inespecífica marcada con una sonda fluorescente. La unión de la IgG al FcRn de la superficie celular se realizó a pH 6,0, lo que permite que la porción Fc de la IgG interactúe con el FcRn. Tal como se muestra en el ejemplo 3 y en la figura 1, la cantidad de IgG unida a las células disminuía significativamente a medida que aumentaba la concentración del anticuerpo anti-FcRn. Cada uno de los cinco anticuerpos anti-FcRn ilustrativos de la invención, por ejemplo, N022-N024, N026 y N027, inhibió la unión de IgG de forma dependiente de la concentración y de la saturación, lo que demuestra la capacidad de los anticuerpos anti-FcRn para competir con eficacia por la unión de IgG a FcRn e inhibirla a pH 6.0. Los valores de CE50 de los anticuerpos oscilaron entre 2 y 6 nM.
La cartografía de epítopos obtenida por intercambio de hidrógeno-deuterio de los anticuerpos de la invención indicó que los anticuerpos se unen a un epítopo en el FcRn humano situado en la interfaz de interacción Fc-FcRn y/o adyacente a ésta, lo que sugiere que los anticuerpos de la invención bloquean la unión de IgG al FcRn por inhibición de la dirección. Además, el sitio de unión cartografiado por epítopos está alejado del sitio de unión a la albúmina del FcRn, por lo que la unión a la albúmina sérica no debería inhibirse y los niveles de albúmina sérica no deberían disminuir. Se utilizó un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) para confirmar que los anticuerpos de la invención no inhiben la unión de la albúmina sérica al FcRn. El dominio extracelular soluble marcado con His del FcRn humano se unió a la superficie de la placa y se preincubó con concentraciones crecientes de anticuerpo anti-FcRn a pH 6,0. Se permitió que la albúmina sérica humana conjugada con peroxidasa de rábano picante ("horseradish peroxidase", HRP) se uniera al FcRn soluble marcado con His. Ninguno de los anticuerpos inhibió la unión de la albúmina al FcRn. Además, las pruebas experimentalesinvivo también demostraron que los niveles de albúmina en ratones permanecían constantes tras la administración del anticuerpo anti-FcRn, lo que indica que el reciclaje de albúmina no se alteró por la unión del anticuerpo al FcRn.
In vivo
Para ensayar el efectoin vivode los anticuerpos anti-FcRn de la invención sobre el catabolismo de IgG, se utilizó la raza de ratón transgénico para FcRn humano FcRn-/-hFcRn (32) Tg, que carece de FcRn de ratón, pero expresa FcRn humano con una distribución tisular similar a la del FcRn endógeno de ratón y humano. A los ratones FcRn-/-hFcRn (32) Tg inyectados con IgG humana el día 0 se les administró una dosis única de un anticuerpo anti-FcRn a 10 mg/kg los días 1 y 4. Tal como se muestra en el ejemplo 3 y en la figura 2, el catabolismo de IgG aumentó con la administración de anticuerpos anti-FcRn, como se observa por los niveles más bajos de IgG medidos a lo largo del tiempo en los ratones tratados con anticuerpos anti-FcRn. Las actividades de N024 (K<d>= 35,5 pM), N026 (K<d>= 36,5 pM) y N027 (K<d>= 19,4 pM) parecían ser similares a 10 mg/kg.
Ejemplo 6: Efecto de los anticuerpos anti-FcRn sobre los niveles de IgG y la ocupación de la diana en ratones
Se administró N027 por vía intravenosa (i.v.) 24 horas después de la administración de 500 mg/kg de IVIg (trazador) a ratones Tg32 transgénicos para FcRn humano (hFCGRT) y con FcRn de ratón inactivado (mFCGRT). La IgG humana circulante se detectó mediante ELISA cada día. La ocupación de la diana se midió cada día en monocitos procedentes de sangre total lisada mediante clasificación celular activada por fluorescencia ("fluorescence-activated cell sorting", FACS), tras la incubación de las células con marcadores de la superficie celular inmunofenotípicos, seguida de fijación y permeabilización. Los FcRn desocupados se midieron mediante tinción con N027 marcado con Dy650 (n = 4 machos por grupo). Tal como se muestra en la figura 3, el nivel de IgG y el porcentaje de FcRn desocupados disminuyeron con la administración de N027 de una forma dependiente de la dosis.
Ejemplo 7: Inducción selectiva del catabolismo de IgG y ocupación de dianas en monos cynomolgus
Se administró N027 i.v. en t = 0 a monos cynomolgus. La IgG y la albúmina endógenas circulantes se detectaron mediante ELISA. La ocupación de la diana se midió en monocitos de sangre total lisada mediante FACS, tras la incubación de las células con marcadores de la superficie celular inmunofenotípicos, seguida de fijación y permeabilización. Los FcRn desocupados se midieron mediante tinción con N027 marcado con Dy650 (n = 3 machos por grupo). Tal como se muestra en la figura 4, el nivel de IgG y el porcentaje de FcRn desocupados disminuyeron con la administración de N027 de una forma dependiente de la dosis, mientras que el nivel de albúmina plasmática permaneció inalterado.
Ejemplo 8: Biodistribución de N027 en ratones
Se administraron N027 o anticuerpo de control de isotipo de IgG1 humano marcado con fluoróforo (VT680) por vía intravenosa a ratones Tg32 transgénicos para FcRn humano y con FcRn de ratón inactivado a 30 mg/kg. Los niveles de anticuerpos marcados se midieron en órganos individuales mediante imágenes ópticas cuantitativasex vivo.La figura 5 muestra la biodistribución de N027 en diversos órganos en ratones.
Ejemplo 9: Eficacia del N027 en la artritis inducida por anticuerpos contra el colágeno en ratones
La artritis inducida por anticuerpos contra el colágeno se indujo en ratones Tg32 transgénicos para FcRn humano y con FcRn de ratón inactivado mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de cóctel ArthritoMab™ (MD Biosciences) el día 1 y la actividad de la enfermedad inflamatoria se indujo con 100 |jg de LPS i.p. el día 4. El N027 se dosificó terapéuticamente por vía intravenosa a 5 mg/kg (flecha) el día 6 tras la inducción de la enfermedad y la aleatorización. Se administró IVIG a 1 g/kg (grupo de control positivo) o vehículo-PBS (control negativo) el día 6 después de la aleatorización (n = 5 por grupo). Tal como se muestra en la figura 6, el N027 inhibe fuertemente la artritis inducida por anticuerpos contra el colágeno en ratones humanos transgénicos para FcRn cuando se administra terapéuticamente.
Ejemplo 10: Eficacia del N027 en la púrpura trombocitopénica idiopática crónica (PTI) en ratón
Se indujo trombocitopenia en ratones Tg32 transgénicos para FcRn humano (hFCGRT) y con FcRn de ratón inactivado (mFCGRT) mediante infusión continua de anticuerpo antiplaquetario (anti-CD41, MWReg30) por vía subcutánea (s.c.) con bomba miniosmótica. Los niveles de plaquetas circulantes disminuyeron a 300 * 109/l o menos a las 72 h (día 3) de la implantación de la bomba. El N027 fue administrado terapéuticamente i.v. 72 h (día 3) y 120 h (día 5) después de la implantación de la bomba (A, n = 4 por grupo; B, n = 7 por grupo). La figura 7 muestra los efectos del N027 sobre los niveles de plaquetas en ratones con trombocitopenia.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado que se une al FcRn humano, comprendiendo el anticuerpo aislado un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 y un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
2. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo aislado de la reivindicación 1 y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
3. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 para su uso en un procedimiento de reducción o tratamiento de la activación basada en inmunocomplejos de una respuesta inmunitaria aguda que se activa por una afección médica seleccionada del grupo que consiste en pénfigo vulgar, nefritis lúpica, miastenia grave, síndrome de Guillain-Barré, rechazo mediado por anticuerpos, síndrome catastrófico por anticuerpos antifosfolípidos, vasculitis mediada por inmunocomplejos, glomerulitis, una canalopatía, neuromielitis óptica, pérdida de audición autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), anemia hemolítica autoinmunitaria (AHAI), neutropenia inmunitaria, cardiomiopatía dilatada y enfermedad del suero.
4. El anticuerpo aislado para el uso de la reivindicación 3, en el que dicha afección es la miastenia grave.
5. El anticuerpo aislado para el uso de la reivindicación 3, en el que dicha afección es la nefritis lúpica.
6. El anticuerpo aislado para el uso de la reivindicación 3, en el que dicha afección es la AHAI.
7. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 para su uso en un procedimiento de reducción o tratamiento de LA activación basada en inmunocomplejos de una respuesta inmunitaria crónica que se activa por una afección médica seleccionada del grupo que consiste en polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), lupus sistémico, artropatías reactivas, cirrosis biliar primaria, colitis ulcerosa y vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ACAN).
8. El anticuerpo aislado para el uso de la reivindicación 3, en el que dicha afección es la PDIC.
9. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1 para su uso en un procedimiento de reducción o tratamiento de una respuesta inmunitaria activada por una enfermedad autoinmunitaria.
10. El anticuerpo aislado para el uso de la reivindicación 9, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Addison, anemia hemolítica, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis, enfermedad de Behcet, penfigoide bulloso, cardiomiopatía, esprúe-dermatitis celíaca, síndrome de disfunción inmunitaria por fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, esclerodermia limitada (síndrome CREST), enfermedad por aglutininas frías, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia, fibromiositis, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, hipotiroidismo, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario, fibrosis pulmonar idiopática, nefropatía por IgA, diabetes insulinodependiente, artritis juvenil, liquen plano, lupus, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome de la persona rígida, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, colitis ulcerosa, uveítis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.
11. El anticuerpo aislado para el uso de la reivindicación 10, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria es la anemia hemolítica.
12. El anticuerpo aislado para el uso de la reivindicación 10, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria es la artritis reumatoide.
13. Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo aislado de la reivindicación 1.
14. Un vector que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 13.
15. Una célula hospedadora que expresa el anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en la que la célula hospedadora comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 o el vector de la reivindicación 14, en la que la molécula de ácido nucleico o el vector se expresan en la célula hospedadora.
16. La célula hospedadora de la reivindicación 15, en la que la célula hospedadora es una célula de ovario de hámster chino (CHO).
17. Un procedimiento de preparación del anticuerpo aislado de la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar una célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 o un vector de la reivindicación 14; y
b) expresar dicha molécula de ácido nucleico o vector en dicha célula hospedadora en condiciones que permitan la formación del anticuerpo.
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