ES2881602T3 - Conjugados de anticuerpo-fynómero - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido de fusión biespecífico que comprende: (1) una secuencia de fynómeros que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de: **(Ver fórmula)** y donde la secuencia de aminoácidos en las posiciones 12-17 y 31-36 de la secuencia de fynómeros seleccionada se mantiene y la secuencia de fynómeros se une a la interleucina-17a (IL-17a), y (2) un anticuerpo o una subsecuencia del mismo que se une al receptor de interleucina-6 (IL-6R), donde la secuencia de fynómeros se conjuga con el anticuerpo, o subsecuencia del mismo, y el polipéptido de fusión se une tanto a IL-17a como a IL-6R e inhibe las actividades tanto de IL-17a como de IL-6R.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de anticuerpo-fynómero
Campo técnico
La presente invención se refiere a una proteína de fusión que puede unirse tanto a la interleucina 17a (IL-17a) como al receptor de interleucina 6 (IL-6R). La presente divulgación también se refiere a una célula transformada que produce el polipéptido de fusión, a una composición que comprende el polipéptido de fusión y a un método para tratar una enfermedad o un trastorno usando el polipéptido de fusión.
Técnica anterior
Las células Th17 son mediadores esenciales en los procesos inflamatorios crónicos y efectores patógenos predominantes en varios tipos de afecciones relacionadas con la autoinmunidad que anteriormente se pensaba que estaban mediadas por Th1 (Weaver T. et al.(2008) Annu. Rev. Immunol., 25, págs. 821-852). Las células Th17 expresan principalmente la citocina proinflamatoria IL-17, que está presente a niveles elevados en el líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (AR) y se ha demostrado que participa en el desarrollo temprano de la AR. Además, la IL-17 es un fuerte inductor del TNF-alfa y de la IL-1, siendo esta última la principal responsable del desgaste óseo y de las consecuencias tan dolorosas para los pacientes afectados (Lubberts E. (2008) Cytokine, 41, págs. 84-91). Además, la producción inapropiada o excesiva de IL-17 está asociada a la patología de diversas otras enfermedades y trastornos, tales como artrosis, aflojamiento de implantes óseos, rechazo agudo de trasplante (Antonysamy et al., (1999) J. Immunol, 162, págs. 577-584; van Kooten et al. (1998) J. Am. Soc. Nephrol., 9, págs.
1526-1534), septicemia, choque séptico o endotóxico, alergias, asthma (Molet et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol., 108, págs. 430-438), descalcificación ósea, psoriasis (Teunissen et al. (1998) J. Invest. Dermatol, 111, págs. 645­ 649), isquemia, esclerosis sistémica (Kurasawa et al. (2000) Arthritis Rheum., 43, págs. 2455-2463), ictus y otros trastornos inflamatorios. En consecuencia, existe una necesidad de terapias que modulen las actividades biológicas de la IL-17.
La neutralización temprana de la IL-17 endógena por una proteína de fusión del receptor de IL-17-IgG1-Fc que comience después del protocolo de inmunización durante la fase inicial de la artritis, suprime la aparición de la artritis experimental (Lubberts et al. (2001) J. Immunol., 167, págs. 1004-1013). Por otra parte, el tratamiento con un anticuerpo neutralizante anti IL-17 en un modelo animal después de la aparición de artritis inducida por colágeno, redujo la inflamación de las articulaciones, la destrucción del cartílago y el desgaste óseo (Lubberts et al. (2004) Arthritis and Rheumatism, 50; 650-659). El análisis histológico confirmó la supresión de la inflamación articular y los niveles sistémicos de IL-6 disminuyeron significativamente después del tratamiento con un anticuerpo anti IL-17. En cambio, la sobreexpresión sistémica y local de IL-17 usando un vector adenovírico que expresa IL-17 murina aceleró la aparición de artritis inducida por colágeno (AIC) y agravó la inflamación sinovial en el sitio (Lubberts et al. (2001) J. Immunol., 167, págs. 1004-1013 y Lubberts et al. (2002), Inflamm. Res. 51, págs. 102-104). Más recientemente se pudo demostrar que el uso de anticuerpos anti IL-17 mejoraba los síntomas clínicos de la psoriasis, artritis reumatoide y uveítis no infecciosa (Leonardi C. et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366, págs. 1190-1199; Hueber W. et al. (2010) Sci Transl Med. 2(52):52ra72).
La interleucina 6 (IL-6) es una fuerte citocina que regula el crecimiento y la diferenciación celular, y también es un mediador importante de las respuestas inflamatorias agudas. La IL-6 actúa a través de un complejo receptor que consiste en un receptor de IL-6 (IL-6R) específico y en una subunidad transductora de señales (gp130). La señalización desregulada de IL-6 se ha implicado en la patogenia de muchas enfermedades, tales como mieloma múltiple, enfermedades autoinmunitarias y cáncer de próstata. Por consiguiente, existe una necesidad de terapias que modulen las actividades biológicas de IL-6 y/o IL-6R.
En el documento WO 2009 149189 se hace referencia a inmunoglobulinas de doble dominio variable y a usos de las mismas. En el documento WO 2011 023685 se describen compuestos de unión a IL-17 y usos médicos de los mismos. Grabulovski et al. (Arthritis & Rheumatism, vol. 65, n.° 510, 1 de octubre de 2013, página S544) se refieren a COVA322: superando las limitaciones de las biologías actuales en la artritis reumatoide mediante un nuevo inhibidor biespecífico del factor alfa de necrosis tumoral/interleucina 17a (TNF/IL-17a) que avanza hacia la clínica. Sumario de la invención
Es un objeto de la presente invención proporcionar un polipéptido de fusión que pueda unirse tanto a la interleucina 17a (en lo sucesivo en el presente documento "IL-17a") como al receptor de interleucina-6 (en lo sucesivo en el presente documento "IL-6R"). Otro objeto de la presente invención es proporcionar un polipéptido de fusión que pueda suprimir, reducir, disminuir, inhibir o bloquear las actividades de IL-17a e IL-6R. Es un objeto de la presente divulgación proporcionar una célula transformada que produzca el polipéptido de fusión. Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición que comprenda el polipéptido de fusión para tratar una enfermedad o un trastorno. Es un objeto de la presente divulgación proporcionar un método para tratar una enfermedad o un trastorno usando el polipéptido de fusión.
En el presente documento, los inventores proporcionan datos que muestran que los polipéptidos de fusión, en concreto los FynomAb, que comprenden una secuencia de fynómeros ("fyno" también conocida como Fynomer™) que se une a la interleucina 17a (IL-17a) y que se conjuga con un anticuerpo ("mAb") o con una subsecuencia del mismo que se une al receptor de interleucina 6 (IL-6R), pueden unirse tanto a la IL-17a como al IL-6R y suprimir, reducir, disminuir, inhibir o bloquear la función o actividad tanto de IL-17a como de IL-6R. Los datos también muestran que diferentes lotes de FynomAb ilustrativos, producidos a diferentes momentos y a partir de diferentes células, se comportaron de manera similar entre los lotes. Las 8 construcciones FynomAb ilustrativas tenían afinidades muy similares por IL-17a e IL-6R y tenían una actividad funcional similar en ensayos basados en células. Las fusiones de cadenas ligeras (COVA802, COVA804, COVA806 y COVA808) tenían mejores perfiles de SEC y eran menos propensas a la agregación.
En una realización, se proporciona un polipéptido de fusión biespecífico que comprende una secuencia de fynómeros que se une a la interleucina 17a (IL-17a) y que se conjuga con un anticuerpo, o con una subsecuencia del anticuerpo, que se une al receptor de interleucina 6 (IL-6R). El polipéptido de fusión biespecífico puede ser un polipéptido de fusión que se una simultáneamente a IL-17a y a IL-6R.
En una realización, la secuencia de fynómeros puede conjugarse con una secuencia de cadena pesada o ligera del anticuerpo que se une a IL-6R o a una subsecuencia de la secuencia de cadena pesada o ligera. La secuencia de fynómeros puede conjugarse con el extremo amino o el extremo carboxilo de una secuencia de cadena pesada del anticuerpo o una subsecuencia del mismo. La secuencia de fynómeros puede conjugarse con el extremo amino o el extremo carboxilo de una secuencia de cadena ligera del anticuerpo o una subsecuencia del mismo.
El polipéptido de fusión biespecífico puede incluir una o más secuencias de unión a IL-17a conjugadas con el anticuerpo que se une a IL-6R o una subsecuencia del anticuerpo. En realizaciones particulares, el polipéptido de fusión biespecífico puede incluir dos o más, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho secuencias de fynómeros de unión a IL-17a que se conjugan con un anticuerpo de unión a IL-6R o con una subsecuencia del mismo.
La secuencia de fynómeros de unión a IL-17a puede ser la que tenga diversas longitudes. En una realización, la secuencia de fynómeros tiene una longitud de aproximadamente 10 a 80 aminoácidos.
La secuencia de fynómeros de unión a IL-17a puede ser la que tenga diversas afinidades por IL-17a. En una realización, la secuencia de fynómeros puede tener una afinidad de unión (Kd) para unirse a IL-17a de aproximadamente 10"9 M a aproximadamente 10"13 M. En una realización preferida, la secuencia de fynómeros puede tener una afinidad de unión (KD) para unirse a IL-17a glucosilada de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 nM. En otra realización preferida, la secuencia de fynómeros puede tener una afinidad de unión (Kd) para unirse a IL-17a humana glicosilada de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 nM, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 nM. La secuencia de fynómeros puede tener una afinidad de unión (Kd o KD) comparable o mayor por la IL-17a glicosilada que la afinidad de unión de la secuencia de fynómeros de SEQ ID NO: 1 por la IL-17a glicosilada.
La secuencia de fynómeros de unión a IL-17a puede ser la que tenga identidad con las secuencias de fynómeros de referencia. En realizaciones particulares, una secuencia de fynómeros puede ser una secuencia al menos 90 % o más (por ejemplo, al menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a cualquiera de las secuencias de referencia mostradas a continuación:
G VTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q (tcc 11L0-C6) (SEQ ID NO: 2);
G VTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q (tcc 11L5-B06) (SEQ ID NO: 3);
GVTLFVALYDYESVSW SDLSFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q (tcc 11L9-C09) (SEQ ID NO: 5);
G VTLFVALYDYSSRG VLDLSFHKG EKFQ ILSTHEYEDW W EARSLTTG ETG YIPSNYVAPVDSI
Q (tcc 11L10-A05) (SEQ ID NO: 6);
G VTLFVALYDYANHGNRDLSFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q (tcc 1L3-B9) (SEQ ID NO: 1);
GVTLFVALYDYDKLSALDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q (tcc 11L6-F03) (SEQ ID NO: 4); y
G VTLFVALYDYSRKSNLDLSFHKG EKFQ ILSTHEYEDW W EARSLTTG ETG YIPSNYVAPVDSI
Q (tcc 11L11-A09) (SEQ ID NO: 7).
La secuencia de fynómeros de unión a IL-17a puede ser la que tenga sustituciones, inserciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en a las secuencias de fynómeros de referencia anteriores. En una realización, la secuencia de fynómeros puede ser cualquiera de las siguientes secuencias:
GVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q (SEQ ID NO: 2 ) ;
G VTLFVALYDY SARGQLDLS FHKGEKFQILSTHEYEDWWEARS LTTG E TG Y IP S N Y V A P V D S I
Q (SEQ ID NO: 3 ) ;
G VTLFVALYDYESVSW SDLSFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q(SEQ ID NO: 5 ) ;
G VTLFVALYDYSSRGVLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q (SEQ ID NO: 6 ) ;
GVTLFVALYDYANHGNRDLSFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q(SEQ ID NO: 1 ) ;
Q(SEQ ID NO: 4); y GVTLFVALYDYSRKSNLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI Q (SEQ ID NO: 7), o cualquiera de las secuencias anteriores con 1-2, 2-3, 3-4, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-15, 15-20, 20-25 o 25-30 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, o cualquiera de las secuencias anteriores con 1-2, 2-3, 3-4, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-15, 15-20, 20-25 o 25-30 deleciones o inserciones de aminoácidos.
En una realización, la secuencia de fynómeros de unión a IL-17a puede contener determinada secuencia motivo idéntica a las contenidas en las secuencias de fynómeros de referencia. En una realización, uno o más de los motivos de GVTLFVALYDY, DLSFHKGEKFQIL, STHEYE, STHEYED, WWEAR, DWWEAR y SLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ, están incluidos en la secuencia de fynómeros de unión a IL-17a usada en la presente invención. En una realización particular, la secuencia de fynómeros puede incluir la secuencia STHEYE de las posiciones de aminoácidos 31-36 de la secuencia, o la secuencia QILSTHEYEDWWEAR de las posiciones de aminoácidos 28-42 de la secuencia.
La secuencia de fynómeros de unión a IL-17a puede ser la que tenga un resto de aminoácido particular en una posición o ubicación específica. En particular, la secuencia de fynómeros puede tener un resto E situado inmediatamente después de la secuencia bucle src, y/o un resto E situado inmediatamente después de la secuencia bucle src, STHEY.
La secuencia de fynómeros de unión a IL-17a puede ser la que tenga actividades o funciones particulares. En una realización, la secuencia de fynómeros puede unirse a IL-17a e inhibir, disminuir o suprimir la función o señalización del receptor de IL-17. En una realización adicional, la secuencia de fynómeros puede unirse a IL-17a glucosilada e inhibir, disminuir o suprimir la función o señalización del receptor de IL-17. En otra realización más, la secuencia de fynómeros puede unirse a IL-17a glucosilada e inhibir, disminuir o suprimir la producción de IL-6 por fibroblastos. Por ejemplo, la secuencia de fynómeros puede tener una CI50 para inhibir, disminuir o suprimir la producción de IL-6 por fibroblastos de aproximadamente 10 a aproximadamente 250 nM, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nM.
El polipéptido de fusión biespecífico de la presente invención comprende un anticuerpo que se une a IL-6R o una subsecuencia del anticuerpo, tal como la cadena VH o VL que se une a IL-6R. En una realización, el anticuerpo o subsecuencia del mismo puede tener una afinidad de unión (Kd) para unirse a IL-6R de aproximadamente 10"5 M a aproximadamente 10"13 M.
El anticuerpo de unión a IL-6R o una subsecuencia del mismo, tal como la cadena VH o VL, pueden ser el que tenga diversas longitudes. En particular, la secuencia puede ser la que tenga una longitud de aproximadamente 50 a 100 aminoácidos. En realizaciones particulares, el anticuerpo o subsecuencia del mismo puede ser un fragmento Fab, Fab', F(ab')2 , Fv, Fd, Fv monocatenario (scFv), Fv unidos por disulfuro (sdFv), Vl, Vh, diacuerpo ((Vl-Vh)2 o (Vh-Vl)2), triacuerpo (trivalente), tetracuerpo (tetravalente), minicuerpo ((scFv-Ch3)2), IgGdeltaCH2, scFv-Fc o (scFv)2-Fc. El anticuerpo de unión a IL-6R o una subsecuencia del mismo, puede ser el que tenga diversos isotipos. En una realización, el anticuerpo puede ser el que tenga un isotipo IgG, IgA, IgE, IgM o IgD.
El anticuerpo de unión a IL-6R o una subsecuencia del mismo puede ser el que tenga una identidad significativa con las secuencias de referencia mostradas más adelante. En realizaciones particulares, el anticuerpo o subsecuencia del mismo puede ser el que tenga una secuencia al menos 90 % o más (por ejemplo, al menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a cualquiera de las siguientes secuencias de cadena pesada (HC, heavy chain) y cadena ligera (LC, light chain):
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAW SW VRQPPGRGLEW IGYISYSGITT
YNPS LKS RVTMLRDTS KNQ F S LR LS SVTAADTAVYY CARSLARTTAMDYWGQGSLVTVS SAST
KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SW TVPSSSLG TQ TYIC N W H KPSN TKVD KKVEPKSC D KTH TC PPC PAPELLG G PSVFLFPPK
PKDTLM ISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVL
HQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGF
YPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 12 ) ;
(LC )D IQ M TQ SPSSLSASVG D R VTITC R ASQ D ISSYLN W YQ Q KPG KAPKLLIYYTSR LH SG VP
SR FSG SG SG TD FTFTISSLQ PED IATYYC Q Q G N TLPYTFG Q G TKVEIKR TVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASW CLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD
YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 13 ) .
El anticuerpo de unión a IL-6R o subsecuencia del mismo puede ser el que tenga una o más sustituciones, inserciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en una de las secuencias de referencia. En realizaciones particulares, un anticuerpo o subsecuencia del mismo puede ser cualquiera de las siguientes secuencias de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC):
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAW SW VRQPPGRGLEW IGYISYSGITT
YNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYW GQGSLVTVSSAST
KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SW TVPSSSLG TQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG G PSVFLFPPK
PKDTLM ISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVL
HQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQ KSLSLSPG (SEQ ID NO: 12 ) ;
(LC) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQ PEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 13), o la que tenga 1-2, 2-3, 3-4, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30 sustituciones de aminoácidos conservativas, no conservativas, o conservativas y no conservativas, o inserciones o deleciones de aminoácidos dentro o fuera de la secuencia de cadena variable de cualquiera de las secuencias de cadena pesada (HC) o cadena ligera (LC) anteriores.
El anticuerpo de unión a IL-6R o subsecuencia del mismo puede ser cualquiera de las siguientes secuencias de cadena pesada (HC) y/o cadena ligera (LC) expuestas como:
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAW SW VRQPPGRGLEW IGYISYSGITT
YNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYW GQGSLVTVSSAST
KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SW TVPSSSLG TQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG G PSVFLFPPK
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPR.EEQYNSTYRVVSVLTVL
HQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGF
YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTHEYED
W W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 14 ) ;
(LC )D IQ M TQ SPSSLSASVG D R VTITC R ASQ D ISSYLN W YQ Q KPG KAPKLLIYYTSR LH SG VP
SRFSG SG SG TD FTFTISSLQ PED IATYYC Q Q G N TLPYTFG Q G TKVEIKR TVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD
YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 15 )
(tcc COVA 801); (HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAW SW VRQPPGRGLEW IGYISYSGITT YNPSLKSRVTMLRDTS KNQFS LRLSSVTAADTAVYYCARS LARTTAMDYWGQGSLVTVS SAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG(SEQ ID NO: 1 6 ) ;
(LC )D IQ M TQ SPSSLSASVG D R VTITC R ASQ D ISSYLN W YQ Q KPG KAPKLLIYYTSR LH SG VP SR FSG SG SG TD FTFTISSLQ PED IATYYC Q Q G N TLPYTFG Q G TKVEIKR TVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASW CLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYKQKGHLDL SFHKG EKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 17 ) (tcc COVA 802);
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAW SW VRQPPGRGLEW IGYISYSGITT YNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYW GQGSLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SW TVPSSSLG TQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG G PSVFLFPPK PKDTLM ISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVL HQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQILSTHEYED W W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO: 1 8 ) ;
(LC )D IQ M TQ SPSSLSASVG D R VTITC R ASQ D ISSYLN W YQ Q KPG KAPKLLIYYTSR LH SG VP SR FSG SG SG TD FTFTISSLQ PED IATYYC Q Q G N TLPYTFG Q G TKVEIKR TVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 19 )
(tcc COVA 803); (HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAW SW VRQPPGRGLEW IGYISYSGITT YNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYW GQGSLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SW TVPSSSLG TQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG G PSVFLFPPK
PKDTLM ISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQ KSLSLSPG (SEQ ID N O : 20 ) ;
(LC )D IQ M TQ SPSSLSASVG D R VTITC R ASQ D ISSYLN W YQ Q KPG KAPKLLIYYTSR LH SG VP SR FSG SG SG TD FTFTISSLQ PED IATYYC Q Q G N TLPYTFG Q G TKVEIKR TVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASW CLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYSARGQLDL SFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 21 ) (tcc COVA 804);
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAW SW VRQPPGRGLEW IGYISYSGITT YNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYW GQGSLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SW TVPSSSLG TQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG G PSVFLFPPK PKDTLM ISRTPEVTCW VDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVL HQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYESVSWSDLSFHKGEKFQILSTHEYED W W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 2 2 )
(LC )D IQ M TQ SPSSLSASVG D R VTITC R ASQ D ISSYLN W YQ Q KPG KAPKLLIYYTSR LH SG VP SR FSG SG SG TD FTFTISSLQ PED IATYYC Q Q G N TLPYTFG Q G TKVEIKR TVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASW CLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 23 ) „ _
(tcc COVA805);
(H C )QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAW SW VRQPPGRGLEW IGYISYSGITT YNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLM ISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVL
HQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGF
YPSDIAVEW E SNGQPENNYKTTP PVLDSDGS FFLYSKLTVD KS RWQQGNVFS CSVMHEALHNH
YTQ KSLSLSPG (SEQ ID NO: 2 4 ) ;
(LC )D IQ M TQ SPSSLSASVG D R VTITC R ASQ D ISSYLN W YQ Q KPG KAPKLLIYYTSR LH SG VP
SR FSG SG SG TD FTFTISSLQ PED IATYYC Q Q G N TLPYTFG Q G TKVEIKR TVAAP'SVFIFPPSD EQLKSGTASW CLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYESVSWSDL SFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 25 ) (t COVA 806);
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAW SW VRQPPGRGLEW IGYISYSGITT YNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYW GQGSLVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SW TVPSSSLG TQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG G PSVFLFPPK PKDTLM ISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVL HQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYSSRGVLDLSFHKGEKFQILSTHEYED W W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 2 6 ) ;
(LC )D IQ M TQ SPSSLSASVG D R VTITC R ASQ D ISSYLN W YQ Q KPG KAPKLLIYYTSR LH SG VP SR FSG SG SG TD FTFTISSLQ PED IATYYC Q Q G N TLPYTFG Q G TKVEIKR TVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGÉC (SEQ ID NO: 2 7 ) (tcc COVA 807);
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAW SW VRQPPGRGLEW IGYISYSGITT
YNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYW GQGSLVTVSSAST
KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SW TVPSSSLG TQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG G PSVFLFPPK
PKDTLM ISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVL
HQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF
YP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYS KLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNH
YTQ KSLSLSPG (SEQ ID N O : 28 ) ;
(LC)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVP SRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYSSRGVLDL SFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 29) (tcc COVA 808), o la que tenga 1-2, 2-3, 3-4, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30 sustituciones de aminoácidos conservativas, no conservativas, o conservativas y no conservativas, o inserciones o deleciones de aminoácidos dentro o fuera de una secuencia de cadena variable de cualquiera de las secuencias de cadena pesada (HC) o cadena ligera (LC) anteriores.
El anticuerpo de unión a IL-6R puede ser un anticuerpo IL-6R conocido como Tocilizumab. La subsecuencia del anticuerpo puede ser una cadena pesada o una cadena ligera del anticuerpo, o la que tenga sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos dentro o fuera de la secuencia de la región variable de la cadena pesada o ligera. La subsecuencia también puede ser la que tenga sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos dentro o fuera de una región determinante de complementariedad (CDR) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. La subsecuencia también puede ser la que tenga sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos dentro o fuera de una región marco conservada (FR, del inglés framework) de la secuencia de la región variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de unión a IL-6R.
La secuencia de unión a IL-6R puede ser la que tenga actividades o funciones particulares. En una realización, la secuencia de unión de IL-6R se une a IL-6R e inhibe, disminuye o suprime la función o señalización de IL-6R.
De acuerdo con la presente invención, un anticuerpo de unión a IL-6R, subsecuencia del mismo, o cadena VH o VL del mismo y una secuencia de fynómeros pueden conjugarse directamente o por medio de un enlazador. En una realización, la conjugación puede ser por medio de un enlace covalente o un enlace amida. En otra realización, la conjugación puede ser por medio de un enlazador. Los ejemplos no limitantes de enlazadores pueden incluir secuencias peptídicas y de carbono. En una realización, como enlazador puede emplearse una secuencia peptídica que tenga aproximadamente 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-50 o 50-100 restos de aminoácido; y una cadena de carbono que tenga aproximadamente 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-50 o 50-100 átomos de carbono. Los ejemplos de péptidos enlazadores pueden ser los que incluyan o consistan en un motivo de (GGGGS)x (X=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) o de GGGGSGGGGSGGGGS.
Las secuencias diana a las que se une el polipéptido de fusión biespecífico de la presente invención incluyen IL-17 a e IL-6R de mamífero. En una realización particular, la diana puede ser la IL-17a humana y/o el IL-6R humano.
El polipéptido de fusión biespecífico de la presente invención puede proporcionarse como un polipéptido aislado y/o purificado. La presente invención también proporciona una composición tal como una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de fusión biespecífico de la invención. La composición puede ser una composición o formulación farmacéutica estéril.
De acuerdo con la presente divulgación, también se proporcionan células transformadas que producen el polipéptido de fusión biespecífico de la presente invención. La célula puede ser una célula procariota o eucariota.
El polipéptido de fusión biespecífico de la presente invención puede usarse para el tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto tal como un ser humano. La enfermedad o afección que se va a tratar con esta invención, es una enfermedad o un trastorno autoinmunitario. En el presente documento también se desvela el uso del polipéptido de fusión biespecífico de la presente invención para tratar la inflamación asociada a o causada por una respuesta inmunitaria aberrante o indeseable. En una realización, el polipéptido de fusión biespecífico de la presente invención se administra a un sujeto que necesita el tratamiento para una enfermedad o un trastorno autoinmunitario, o una inflamación. Las enfermedades, trastornos autoinmunitarios y la inflamación pueden ser los que afecten a cualquier célula, tejido u órgano en el sujeto. La enfermedad, trastorno autoinmunitario o la inflamación a tratar con el polipéptido de fusión biespecífico, puede ser uno que afecte al músculo, esqueleto, sistema nervioso, tejido conjuntivo, aparato endocrino, piel, vías respiratorias o aparato respiratorio, aparato gastrointestinal, aparato ocular o aparato circulatorio.
El polipéptido de fusión biespecífico de la presente invención puede administrarse solo o coadministrarse con un segundo agente o agente adicional que sea útil para el tratamiento de la enfermedad o trastorno autoinmunitario, o la inflamación que se va a tratar con el polipéptido de fusión biespecífico. En una realización, el polipéptido de fusión biespecífico de la presente invención puede administrarse antes, simultáneamente con, o después de la administración del segundo agente.
De acuerdo con la presente divulgación, también se proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno tal como una enfermedad o un trastorno autoinmunitario, o inflamación que se va a tratar con el polipéptido de fusión biespecífico que comprende el polipéptido de fusión biespecífico y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender además un segundo agente o agente adicional que sea útil para el tratamiento de la enfermedad o afección que se va a tratar con el polipéptido de fusión biespecífico.
De acuerdo con la presente divulgación, también se proporciona el uso del polipéptido de fusión biespecífico para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, tal como una enfermedad o trastorno autoinmunitario, o inflamación.
Breve descripción de los dibujos
En la Figura 1 se muestra un análisis de SDS-PAGE (acrónimo en inglés de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) de material FynomAb CHO transitorio.
En la Figura 2 se muestra un análisis SDS-PAGE de material FynomAb CHO estable preparado para un estudio FC (farmacocinético) en ratón.
En la Figura 3 se muestra un análisis SDS-PAGE de material FynomAb CHO estable preparado para un estudio FC en macaco cangrejero (cynomolgus, cyno).
En la Figura 4 se muestra un análisis de unión cinética de la interacción de FynomAb con la IL-17A humana recombinante.
En la Figura 5 se muestra un ensayo ELISA de unión a IL-17A para COVA804 y COVA806.
En la Figura 6 se muestra un análisis de unión cinética de la interacción de FynomAb con el IL-6R humano recombinante.
En la Figura 7 se muestra un ensayo con IL-17A en HT-29 con material FynomAb CHO transitorio.
En la Figura 8 se muestra un ensayo con IL-17A en HT-29 con material FynomAb agrupado CHO estable producido para el estudio FC de ratón.
En la Figura 9 se muestra un ensayo con IL-17A en HT-29 con material FynomAb agrupado CHO estable producido para el estudio FC de macaco cangrejero (cyno).
En la Figura 10 se muestra un ensayo de inhibición HEK-Blue IL-6R con material FynomAb CHO transitorio. En la Figura 11 se muestra un ensayo de inhibición HEK-Blue IL-6R con material FynomAb agrupado CHO estable producido para el estudio FC de ratón.
En la Figura 12 se muestra un ensayo de inhibición HEK-Blue IL-6R con material FynomAb agrupado CHO estable producido para el estudio FC de macaco cangrejero (cyno).
En la Figura 13 se muestra la configuración del ensayo ELISA de unión doble de estabilidad en suero.
En la Figura 14 se muestra la evaluación de la estabilidad en suero de los FynomAb indicados COVA801-808. En la Figura 15 se muestra la evaluación de la unión doble de los FynomAb indicados COVA804 y 806 en presencia de suero humano.
En la Figura 16 se muestra la unión simultánea de IL-6R e IL-17A soluble expresados en la superficie celular. En la Figura 17 se muestra un ensayo funcional con IL-17A en HT-29 en presencia de IL-6R soluble.
En la Figura 18 se muestra la inhibición de IL-6R en presencia de IL-17A.
En la Figura 19 se muestra la inhibición in vitro dependiente de la dosis de IL-17A glucosilada y no glucosilada con los polipéptidos de fynómero indicados. A) 1L3-B09, (B) 11L0-C6, (C) 11L5-B06, (D) 11L6-F03, (E) 11L9-C09, (F) 11L10-A05.
En la Figura 20 se muestra la inhibición in vitro dependiente de la dosis de la IL-17A glucosilada y no glucosilada con los polipéptidos procedentes de SH3 Fyn descritos en el documento WO2011/023685: (A) proteína de unión a IL-17 procedente de SH3 Fyn, 2C1 (SEQ ID NO: 30) (SEQ ID NO: 107 en el documento WO2011/023685). (B) proteína de unión a IL-17 procedente de SH3 Fyn, A1_2 ("A1") (SEQ ID: 31)(SEQ ID NO: 53 en el documento WO2011/023685). (C) proteína de unión a IL-17 procedente de SH3 Fyn, B1_2 ("B1") (SEQ ID: 32) (SEQ ID NO: 39 en el documento WO2011/023685).
En la Figura 21 se muestra los resultados de la inhibición in vitro dependiente de la dosis de la IL-17A glucosilada y no glucosilada con el polipéptido de fynómero 11L11-A09.
En la Figura 22 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de los FynomAb indicados COVA801 y COVA802.
En la Figura 23 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de los FynomAb indicados COVA803 y COVA804.
En la Figura 24 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de los FynomAb indicados COVA805 y COVA806.
En la Figura 25 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de los FynomAb indicados COVA807 y COVA808.
En la Figura 26 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de los FynomAb indicados COVA801 y COVA802 en macacos cangrejeros.
En la Figura 27 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de los FynomAb indicados COVA803 y COVA804 en macacos cangrejeros.
En la Figura 28 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo del FynomAb indicado COVA806 en macacos cangrejeros.
En la Figura 29 se muestra las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo del FynomAb indicado COVA808 en macacos cangrejeros.
Descripción detallada
El término "fynómero" se refiere a un (poli)péptido de unión no procedente de inmunoglobulina, modelado después, basado en o procedente del dominio SH3 de la cinasa Fyn humana, un denominado armazón descrito en Gebauer y Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13: 245-255). El dominio SH3 de la cinasa Fyn humana puede usarse como un armazón para diseñar proteínas (denominadas fynómeros) que se unen con alta afinidad y especificidad a diferentes dianas, tales como proteínas (WO 2008/022759, WO 2011/023685, Grabulovski D. et al., (2007) J Biol Chem 282, págs. 3196-3204, Bertschinger J. et al. (2007) Protein Eng Des Sel, 20, págs. 57-68 y Schlatter et al. (2012) mAbs, 4(4) págs. 497-50). La secuencia de la secuencia Fyn3, con las respectivas regiones bucle RT (EARTED) y bucle src (NSSE) se indican subrayadas: GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEKFQILNSSEGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ bucle RT bucle src Un "fynómero de IL-17a" o "fynómero anti IL-17a", y variaciones gramaticales de estas expresiones, significa una secuencia de fynómero que se une a una proteína interleucina 17a (IL-17a). Se cree que las posiciones de aminoácido dentro del bucle RT y del bucle src determinan la especificidad de unión a la IL-17A glucosilada. Las secuencias de fynómeros de unión a IL-17a representativas (SEQ ID NO: 1-7) son las siguientes:
Bucle RT bucle src
SEQ ID NO 1 :
G VTLFVALYD YANHGNRD LS F H K G E K F Q ILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q ;
SEQ ID NO 2 :
G VTLFVALYD YKQKGHLD LS F H K G E K F Q ILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q ;
SEQ ID NO 3 :
G VTLFVALYD YSARGQLD LS F H K G E K F Q ILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q ;
SEQ ID NO 4 :
G VTLFVALYD YD KLSALD LS F H K G E K F Q ILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q ;
SEQ ID NO 5 :
G VTLFVALYD YESVSW SD LSFH KG EKFQ ILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q;
Figure imgf000013_0001
Q; y
SEQ ID NO 7 :
G VTLFVALYDYSRKSNLD LS FH K G E K FQ ILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q-
Un "anticuerpo anti IL-6R" o "anticuerpo anti IL-6R", y variaciones gramaticales de estas expresiones, significa un anticuerpo policlonal o monoclonal que se une a una proteína de receptor de interleucina 6 (IL-6R). Las secuencias representativas de cadena pesada y ligera del anticuerpo de unión a IL-6R (SEQ ID NO: 8 y 9) son las siguientes: Secuencia de la cadena pesada de tocilizumab (SEQ ID NO: 8), las CDR se indican subrayadas
1 QVQLQESGPG LVRPSQTLSL TCTVSGYSIT SDHAWSWVRQ PPGRGLEWIG
51 YISYSGITTY NPSLKSR V / LRDTSKNQFS lrlssvta^ ~ tavyycarsl ™
101 ARTTAMDYWG QGSLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD
151 YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG L Y S L S S W T V PSSSLGTQTY
251 DTLM ISRTPE VTCVW DVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
301 TY R W S V LTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL P A P IE K T IS K AKGQPREPQV
351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGKVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG*
Secuencia de la cadena ligera de tocilizumab (SEQ ID NO: 9), las CDR se indican subrayadas
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT IT C RASQDIS SYLNWYQQKP G KAPKLLIYY
51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQ P EDIATYYCQQ GNTLFYTFGQ
101 GTKVEIKRTV A A P S V FIFP P SDEQLKSGTA SW C LLN N FY PREAKVQWKV
151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
201 LSSPVTKSFN RGEC*
En los documentos US 20130122012; US 20120225060; US 20120128626 y US 20120077731, se describen ejemplos adicionales de anticuerpos de unión a IL-6R y/o secuencias de cadena pesada y ligera de anticuerpos que se unen a IL-6R. En el documento WO/2008/020079 se describen nanocuerpos que se unen a IL-6R.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "IL-17a, "proteína de IL-17a", "secuencia de IL-17a", y "dominio de IL-17a" se refieren a la totalidad o a una parte de una secuencia de la proteína de IL-17a (por ejemplo, una subsecuencia tal como una región antigénica o un epítopo) aislada de, basada en o presente en cualquier contexto de origen natural o producida artificialmente (por ejemplo, por ingeniería genética) de Il-17a. Por tanto, la expresión IL-17a y similares, incluyen secuencias de IL-17a tanto celulares como producidas de manera recombinante o sintética.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "IL-6R", proteína de IL-6R", "secuencia de IL-6R", y "dominio de IL-6R", se refieren a la totalidad o a una parte de una secuencia de proteína de IL-6R (por ejemplo, una subsecuencia, tal como una región antigénica o epítopo) aislada de, basada en o presente en cualquier contexto de origen natural o producida artificialmente (por ejemplo, por ingeniería genética) de IL-6R. Por tanto, la expresión IL-6R y similares incluyen secuencias de IL-6R tanto celulares como producidas de manera recombinante o sintética. Los expertos en la técnica conocen secuencias de IL-17a e IL-6R de mamíferos. Un ejemplo representativo no limitativo de secuencia de la proteína de IL-17a humana (SEQ ID NO: 10) es:
M TPG KTSLVSLLLLLSLEAIVKAG ITIPR N PG C PN SE D K N FP R TV M V N LN IH N R N TN TN P KR S
SDYYNRSTSPW NLHRNEDPERYPSVIW EAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREP
P H C P N S FR LE K ILV S V G C TC V TP IV H H V A .
Un ejemplo representativo no limitativo de secuencia de la proteína de IL-6R humana (SEQ ID NO: 11) es:
M LAVGCALLAALLAAPGAALAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCPGVEPEDNATVHW VLR
KPAAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQLSCFRKSP
LSNW CEW GPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYI
VSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRW LSVTW QDPHSW NSSFYRLR
FELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHWQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPW
TESRSPPAENEVSTPM QLTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQDSSSVPLPTFLVAGGSLAFGTL
LC IA IVLR FKKTW KLR ALKEG KTSM H PPYSLG Q LVPER PR PTPVLVPLISPPVSPSSLG SD N T
SSHNRPDARDPRSPYDISNTDYFFPR.
El término "anticuerpo" se refiere a una proteína que se une a otra molécula (antígeno) a través de dominios variables de cadena pesada y ligera, denominados Vh y Vl, respectivamente. "Anticuerpo" se refiere a cualquier molécula de inmunoglobulina policlonal o monoclonal, o a sus mezclas, tales como IgM, IgG, IgA, IgE, IgD. Los anticuerpos pertenecen a cualquier clase o subclase de anticuerpos. Son subclases ilustrativas de IgG, IgGi, IgG2 , IgG3 e IgG4.
Cuando el término "humanizado" se usa en referencia a un anticuerpo, se refiere a un anticuerpo que se basa en, se obtiene de o procede de, un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago. Por lo tanto, en el presente documento, un anticuerpo "monoclonal" se define estructuralmente, y no por el método mediante el cual se produce.
Los anticuerpos incluyen anticuerpos que tienen secuencias de cadenas ligeras kappa o lambda, ya sea de longitud completa, como en los anticuerpos de origen natural, mezclas de los mismos (es decir, fusiones de secuencias de cadenas kappa y lambda) y subsecuencias/fragmentos de los mismos. Las moléculas de anticuerpo de origen natural contienen dos cadenas ligeras kappa y dos lambda. La principal diferencia entre las cadenas ligeras kappa y lambda está en las secuencias de la región constante.
Un anticuerpo que incluye o consta de una cadena pesada (H, Heavy) y/o una cadena ligera (L, Light) o un fragmento de una cadena pesada (H) o una cadena ligera (L), puede incluir una sola cadena H o L o un solo fragmento de cadena H o L, o una pluralidad (2, 3, 4 o más) de cadenas pesadas (H) y/o cadenas ligeras (L), o una pluralidad de fragmentos de cadenas pesadas (H) y/o cadenas ligeras (L). Un polipéptido de fusión (FynomAb) que incluye una cadena pesada (H) y/o una cadena ligera (L) de un anticuerpo o fragmento puede incluir, aunque no es necesario, 2 cadenas pesadas (H) y 2 cadenas ligeras (L) y, por lo tanto, los polipéptidos de fusión (FynomAb) como se expone en el presente documento. Un anticuerpo o un fragmento del mismo puede ser una forma oligomérica (de orden o valencia superior), tal como un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, y así sucesivamente, con otros anticuerpos, fragmentos de los mismos, cadena pesada (H), cadena ligera (L) o polipéptidos distintos de una cadena pesada (H) o ligera (L) de un anticuerpo.
Como se usa en el presente documento, el término "biespecífico" y sus variaciones gramaticales, cuando se usa en referencia a una secuencia polipeptídica de fusión, significa que el polipéptido de fusión se une a dos dianas distintas. Las dianas polipeptídicas se consideran distintas cuando tienen secuencias de aminoácidos distintas. El polipéptido de fusión biespecífico de la presente invención se une al receptor de interleucina 6 (IL-6R) y a la interleucina 17a (IL-17a).
Como se usa en el presente documento, el término "fusión" o "quimera" y sus variaciones gramaticales, cuando se usa en referencia a una secuencia, significa que la secuencia contiene una o más partes que se basan en, proceden o se obtienen o se aíslan de, dos o más proteínas diferentes. Es decir, por ejemplo, una parte de la secuencia puede basarse en o proceder de una proteína particular, y otra parte de la secuencia puede basarse en o proceder de una proteína particular diferente. Por tanto, un polipéptido de fusión o quimérico es una molécula en la que diferentes partes del polipéptido son de diferentes orígenes proteicos.
Los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido", se usan indistintamente en el presente documento para referirse a dos o más aminoácidos, o "restos", unidos de manera covalente por un enlace amida o equivalente. Las secuencias de aminoácidos pueden estar unidas por enlaces químicos no naturales y no amídicos que incluyen, por ejemplo, los formados con glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, o N, N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC). Los enlaces no amídicos incluyen, por ejemplo, cemetileno, aminometileno, olefina, éter, tioéter y similares (véase, por ejemplo, Spatola en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, págs 267-357 (1983), "Peptide and Backbone Modifications", Marcel Decker, NY).
La presente invención proporciona un polipéptido de fusión, como se define en las reivindicaciones, (FynomAb) que comprende una secuencia de fynómeros que se une a la interleucina 17a (IL-17a) y se conjuga con un anticuerpo que se une al receptor de interleucina 6 (IL-6R) o una subsecuencia del mismo que se une a IL-6R. La secuencia de fynoméros puede unirse al extremo amino o carboxilo terminal del anticuerpo de unión a IL-6R o una subsecuencia del mismo. Del mismo modo, el extremo amino o carboxilo terminal de la secuencia de fynoméros puede estar unido al extremo amino o carboxilo terminal del anticuerpo o subsecuencia del mismo. A través del extremo amino o carboxilo terminal de la secuencia de fynómeros, múltiples fynoméros pueden unirse a múltiples extremos amino o carboxilo terminales del anticuerpo o subsecuencia del mismo. Además, al extremo amino o carboxilo terminal del anticuerpo o subsecuencia del mismo, pueden unirse múltiples fynómeros de principio a fin o en serie.
El término "unir", o "unirse" cuando se usa en referencia a un fynómero, a un anticuerpo o a subsecuencia del mismo, o un polipéptido de fusión (por ejemplo, FynomAb), significa que el fynómero, el anticuerpo o subsecuencia del mismo, o el polipéptido de fusión, se une específicamente a toda o a una parte de una diana. El fynómero, el anticuerpo o subsecuencia del mismo, o el polipéptido de fusión (FynomAb) se une de manera específica o selectiva la proteína IL-17a y/o IL-6R, que es selectiva para un epítopo o determinante antigénico presente en la proteína IL-17a o IL-6R. Unión selectiva se refiere a la unión a una proteína diana. La unión a una proteína no diana que no interfiere significativamente con la unión a la proteína diana también se considera selectiva. La unión selectiva se puede diferenciar de la unión no selectiva usando ensayos de especificidad, afinidad y de unión competitiva y no competitiva, como se describe en el presente documento o se conoce en la materia.
Los polipéptidos de fusión de fynómero/anticuerpo (FynomAb) de la invención, pueden tener la misma o sustancialmente la misma especificidad de unión que los fynómeros, anticuerpos y subsecuencias de los mismos, ilustrados. La afinidad por una diana puede ser mayor o menor que la de un fynómero, anticuerpo, o subsecuencias de los mismos de referencia, o un polipéptido de fusión de fynómero/anticuerpo (FynomAb) de referencia. Un FynomAb dado puede o no competir de manera detectable o inhibir la unión de otro fynómero, anticuerpo, subsecuencia o FynomAb con regiones de una diana que no interfieren entre sí.
Un polipéptido de fusión de fynómero/anticuerpo (FynomAb) que se une específicamente a la totalidad o a parte de la secuencia en una diana, también puede unirse a otras proteínas que tengan el mismo epítopo o un epítopo similar que la diana. Los polipéptidos de fusión (FynomAb) que se unen a la misma secuencia o epítopo o a una parte del epítopo, pueden tener más o menos afinidad o especificidad de unión relativa por la diana que un fynómero o anticuerpo de referencia o fusión del mismo.
Los fynómeros y anticuerpos, y los polipéptidos de fusión (FynomAb), también incluyen secuencias que compiten por la unión con sus dianas respectivas objetivos. Por tanto, por ejemplo, un fynómero, anticuerpo, subsecuencia o FynomAb dado puede inhibir o competir por la unión de otro fynómero, anticuerpo, subsecuencia o FynomAb por la unión a IL-17a y/o IL-6R. En un ejemplo particular no limitativo, a fynómero, anticuerpo, subsecuencia o FynomAb puede inhibir la unión con IL-17a y/o IL-6R en al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % o más de cualquiera de COVA801 a 808. Por consiguiente, el fynómero puede ser uno que compita por la unión de cualquiera de los fynómeros indicados como SEQ ID NO: 1-7 por la unión a IL-17a (por ejemplo, IL-17a glucosilada), y el anticuerpo o subsecuencia del mismo puede ser uno que compita por la unión de un anticuerpo que comprenda las SEQ ID NO: 8 y 9 por la unión a IL-6R.
Los FynomAb de la divulgación pueden incluir un fynómero/anticuerpo o una subsecuencia del mismo o un polipéptido de fusión (FynomAb) con más o menos afinidad por la diana (por ejemplo, IL-17a o IL-6R) que un fynómero/anticuerpo de referencia o una subsecuencia del mismo o un polipéptido de fusión (FynomAb ). Por ejemplo, un FynomAb de la presente divulgación puede ser el que tenga mayor o menor afinidad por IL-17a (por ejemplo, IL-17a glucosilada) y/o por IL-6R y que tenga una secuencia al menos 60 % o más (por ejemplo, al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) idéntica a una secuencia de fynómeros como se expone en las SEQ ID NO: 1-7, o una secuencia al menos 60 % o más (por ejemplo, al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) idéntica a una secuencia de región variable de cadena pesada o ligera como se expone en las SEQ ID NO: 8 o 9. En una realización particular, el polipéptido de fusión (FynomAb) de la divulgación tiene mayor afinidad por la IL-17a glucosilada que por una secuencia de fynómeros como se expone en la SEQ ID NO: 1.
Los FynomAb de la divulgación incluyen secuencias que tienen la misma o diferente afinidad de unión por IL-17a (por ejemplo, IL-17a glicosilada) y/o IL-6R. Por ejemplo, un FynomAb de la divulgación puede tener una afinidad por la diana (por ejemplo, IL-17a glucosilada y/o IL-6R) que sea mayor o menor que 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000 o 1000­ 10 000 veces la afinidad o cualquier valor numérico o intervalo o valor dentro de dichos intervalos, como otro FynomAb, por ejemplo, COVA801-808.
La afinidad de unión puede determinarse mediante la velocidad de asociación (Ka) y disociación (Kd). La constante de afinidad de equilibrio, KD, es la proporción de Ka/Kd. Un fynómero o anticuerpo que tiene la misma afinidad de unión que otro fynómero o anticuerpo, significa que la constante de disociación (Kd) de cada anticuerpo está dentro de aproximadamente 1 a 10 veces (afinidad 1-10 veces mayor o afinidad 1-10 veces menor, o cualquier valor numérico o intervalo o valor dentro de dichos intervalos, en comparación con el fynómero o el anticuerpo de referencia). Las afinidades ilustrativas por un antígeno diana (por ejemplo, Il-17a, tal como IL-17a glucosilada o IL-6R) tienen una constante de disociación (Kd) menor que 5x10-2 M, 10-2 M, 5x10-3 M, 10-3 M, 5x10-4 M, 10-4 M, 5x10' 5 M, 10-5 M, 5x10-6 M 10-6 M, 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10­ 11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M, 10-13 M, 5x10-14 M, 10-14 M, 5x10-15 M y 10-15 M. Normalmente, las afinidades de unión (Kd) por la diana pueden ser menores que 10- M, 5x10 "M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 IMV/I, / 1n0-1"1' M JI, C 5wx1-m0--1122 i Mv/i, ' o A 1f0\-1"22 M
Las afinidades ilustrativas más particulares del fynómero o del polipéptido de fusión (FynomAb) por el antígeno diana IL-17a (por ejemplo, IL-17a glucosilada), tienen una KD de entre aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 0,50 nM, o de aproximadamente 0,02 nM a aproximadamente 0,40 nM. Las afinidades ilustrativas más particulares del anticuerpo o subsecuencia del mismo o del polipéptido de fusión (FynomAb) por el antígeno diana IL-6R, tienen una KD de entre aproximadamente 0,20 nM a aproximadamente 1,25 nM, o de aproximadamente 0,30 nM a aproximadamente 1,10 nM.
Los fynómeros y anticuerpos, y los polipéptidos de fusión (FynomAb), pueden incluir los que tengan al menos una parte de una "actividad" o "función" como la de un fynómero, anticuerpo o fusión de referencia comprenda FynomAb. La actividad o función puede ser afinidad de unión (por ejemplo, Kd, KD), especificidad de unión, o actividad, por ejemplo, actividad antagonista. La expresión "al menos una parte" significa que el fynómero, anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb) conserva al menos una cantidad medible o detectable de la actividad o función del fynómero, anticuerpo, o del polipéptido de fusión (FynomAb) de referencia ilustrado en el presente documento. El fynómero, anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb) de la presente divulgación, puede tener una actividad o función mayor o menor que la del fynómero, anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb) de referencia.
El fynómero, anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb) puede tener una actividad o función antagonista o agonista. En una realización, el fynómero, anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb) puede ser el que tenga actividad o función antagonista o agonista contra IL-17a y/o IL-6R.
Un "antagonista" es capaz de disminuir, reducir o inhibir una o más actividades de la molécula diana, tal como la señalización por IL-17a o IL-6R. Un antagonista puede interferir con la unión de IL-17a con un receptor o de IL-6R con un ligando, e incapacitar o destruir las células activadas por el ligando y/o interferir con la transducción de señales. El antagonista puede bloquear completamente, disminuir, reducir o inhibir sustancialmente interacciones entre el ligando y el receptor.
Un "agonista" es capaz de aumentar, inducir o activar una o más actividades de una molécula diana, tal como la señalización por IL-17a o IL-6R. Los agonistas pueden aumentar, inducir o promover la unión de un receptor con un ligando (o viceversa), o pueden actuar directamente sobre el receptor o ligando para aumentar, inducir, promover o activar la transducción de señales.
A través de los diversos métodos desvelados en el presente documento o conocidos en la técnica, pueden identificarse fynómeros, anticuerpos o polipéptidos de fusión (FynomAb) que tengan una actividad o función de un fynómero, anticuerpo o de un polipéptido de fusión (FynomAb) de referencia. Por ejemplo, pueden emplearse ensayos de unión contra IL-17a (por ejemplo, IL-17a glucosilada) o IL-6R en placas (ELISA) o en células (ELISA basado en células). La inhibición específica de la unión a IL-17a o IL-6R puede usarse como una medida de la especificidad y afinidad de unión. Los ejemplos de ensayos pueden ser los que puedan determinar la función o actividad, tal como la actividad de IL-17a o IL-6R, por ejemplo, actividad de señalización.
Como se expone en el presente documento, un anticuerpo, fynómero o polipéptido de fusión (FynomAb) de la presente divulgación, puede ser el que tenga una o más modificaciones en una secuencia de referencia. Como ejemplos no limitantes de las modificaciones pueden incluirse una o más sustituciones (por ejemplo, 1-3, 3-5, 5-10 o más restos), adiciones (por ejemplo, 1-3, 3-5, 5-10 o más restos) o deleciones (por ejemplo, subsecuencias o fragmentos) de aminoácidos de un fynómero de referencia, un anticuerpo de referencia (cadena pesada o ligera) o un polipéptido de fusión (FynomAb). En realizaciones particulares, un fynómero, anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb) modificado, conserva al menos parte de una función o una actividad del anticuerpo, fynómero o polipéptido de fusión (FynomAb) de referencia, por ejemplo, afinidad de unión (por ejemplo, Kd, KD) o especificidad de unión a IL-6R o IL-17a (por ejemplo, IL-17a glicosilada), in vitro o in vivo o en o sobre una célula (por ejemplo, en cultivo), o en vivo.
El fynómero, anticuerpo o subsecuencia de los mismos o los FynomAb, pueden incluir los que tengan al menos una identidad de secuencia parcial (menor del 100 %) con un fynómero precursor o de referencia, o secuencia de región variable de cadena ligera o pesada de anticuerpo, o polipéptido de fusión (FynomAb) expuesto en el presente documento respectivamente. Por ejemplo, los fynómeros expuestos en el presente documento (SEQ ID NO: 1-7) y/o las secuencias de cadena ligera y pesada de tocilizumab (SEQ ID NO: 8-9). El porcentaje de identidad de dicho fynómero, anticuerpo, subsecuencia de los mismos o polipéptido de fusión (FynomAb), puede ser tan pequeño como del 60 % o puede ser mayor que (por ejemplo, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %). El porcentaje de identidad puede extenderse por toda la longitud de secuencia de una secuencia como se expone en las SEQ ID NO: 1-9, o una región o área contigua dentro de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-9. En un aspecto, la longitud de la secuencia que comparte el porcentaje de identidad es de 5 o más aminoácidos contiguos, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos contiguos. En otro aspecto, la longitud de la secuencia que comparte el porcentaje de identidad es de 20 o más aminoácidos contiguos, por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 aminoácidos contiguos. En un aspecto adicional, la longitud de la secuencia que comparte el porcentaje de identidad es de 35 o más aminoácidos contiguos, por ejemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49 o 50 aminoácidos contiguos. En otro aspecto más, la longitud de la secuencia que comparte el porcentaje de identidad es de 50 o más aminoácidos contiguos, por ejemplo, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-100 o 100-110 aminoácidos contiguos.
De acuerdo con la divulgación, se proporcionan polipéptidos de fusión (FynomAb) que tienen cualquiera de las secuencias de fynómeros, la región variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo, tal como se expone en las SEQ ID NO:1-9 o una secuencia que contiene una o más sustituciones de aminoácidos en la secuencia de las SEQ ID NO: 1-9. En una realización, el fynómero y/o la secuencia de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo sustituido puede conservar al menos la afinidad y/o especificidad de unión parcial con la IL-17a (por ejemplo, IL-17a glucosilada) y/o el IL-6R diana.
En una realización, la secuencia de fynómeros puede tener 1-15, 1-12, 1-8, 1-5, 1-3 o menos (por ejemplo, 1 o 2) sustituciones de aminoácidos. En particular, una sustitución será de un aminoácido dentro de cualquier secuencia de fynómeros (SEQ ID NO: 1-7).
En otra realización, cualquier sustitución no está en un motivo de GVTLFVALYDY, DLSFHKGEKFQIL, STHEY, STHEYE, STHEYED, WWEAR, DWWEAR, SLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ o QILSTHEYEDWWEAR en la secuencia de fynómeros. En otra realización, el resto de aminoácido E situado inmediatamente después de la secuencia del bucle src en la secuencia de fynómeros, no está sustituido.
El anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb) puede tener una o más sustituciones en la región constante o variable (por ejemplo, en la región hipervariable tal como CDR o FR). Es probable que se tolere una o algunas sustituciones de aminoácidos en las regiones constante o variable. Es probable que la sustitución no conservativa de múltiples aminoácidos en una o más regiones hipervariables influya en la actividad de unión, en la especificidad del anticuerpo o en el polipéptido de fusión (FynomAb).
Por tanto, las modificaciones pueden incluir eliminar regiones grandes y pequeñas de secuencias de aminoácidos del anticuerpo, fynómero o polipéptido de fusión (FynomAb) de referencia. Opcionalmente, la región eliminada puede sustituirse por otra secuencia de aminoácidos. La secuencia sustituida puede tener la misma longitud, o una longitud que sea mayor o menor que la de la región eliminada.
Un ejemplo particular de una modificación de anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb) es una alteración para tener un isotipo o subclase diferente, por ejemplo, por sustitución de la región constante de cadena pesada o ligera. Una alteración de la subclase de Ig puede dar lugar a un cambio o a una mejora en una función o una actividad (por ejemplo, una actividad, estabilidad anti IL-6R). Otro ejemplo es una alteración que da como resultado una característica mejorada, tal como mayor estabilidad en suero y/o semivida in vivo o FC. (por ejemplo, como se describe en Antibody Engineering Vol. 1, Konterman R y Duebel S, eds., 2010, Springer, en el documento WO 2006/130834 y en Horton et al., Cancer Res 68:8049 (2008)). Como ejemplos no limitantes de sustituciones en la región Fc se incluyen I253A, H310A, H435 R, H435Q, G236r , L328 R, S239D, I332E. Ejemplos no limitantes de sustituciones en la IgG1 pueden estar en los restos 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 289, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 439 y/o 477 de la región Fc.
En una realización, una CDR (CDR1, CDR2 o CDR3) de cadena pesada o ligera o FR puede tener 1-15, 1-12, 1-8, 1-5, 1-3 o menos sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, 1 o 2). En una realización, la sustitución dentro de una secuencia de región variable puede ser una sustitución de aminoácidos conservativa, por ejemplo, dentro de una CDR o FR. En otra realización, la sustitución dentro de una secuencia de región variable puede no estar dentro de una CDR. En otra realización, la sustitución puede estar dentro de un FR. En otra realización, la sustitución dentro de una secuencia de región variable puede no estar dentro de una FR. En las SEQ ID NO: 8 y 9 se exponen ejemplos de secuencias de CDR de región variable de cadena pesada y cadena ligera que confieren unión a IL-6R, en concreto, las CDR1-3 de la región variable de la cadena pesada son: SDHAw S; YISYSGITTYNPSLKS; y SLARTTAMDY; y las CDR1-3 de la región variable de la cadena ligera son:
RASQDISSYLN; YTSRLHS; y QQGNTLPYT.
En la técnica se conocen los determinantes estructurales que contribuyen a la unión del antígeno por un anticuerpo, tales como regiones determinantes de complementariedad (CDR, complementarity determining regions) y regiones marco conservadas (FR, framework regions) dentro de regiones hipervariables. También se conoce la ubicación, la estructura y la función de regiones adicionales, tales como las regiones D y J. Un anticuerpo, una subsecuencia del mismo o un polipéptido de fusión (FynomAb) que se une a una diana determinada (por ejemplo, IL-6R) normalmente puede tener una o más secuencias de CDR y FR con suficiente identidad de secuencia con una secuencia de cadena pesada o ligera que se une a IL-6R, de manera que conserva al menos la función parcial o la actividad de unión de IL-6R. Por ejemplo, como se ilustra en el presente documento, una o más de las CDR de secuencia de cadena pesada o ligera, como se expone en las SEQ ID NO: 8-9, puede conservar al menos la función o actividad parcial de un anticuerpo que tenga especificidad de unión por IL-6R.
El análisis de mutabilidad regional puede usarse para predecir el efecto de sustituciones particulares en regiones determinantes de complementariedad (CDR) y en regiones marco conservadas (FR) (Shapiro et al., J Immunol. 163: 259 (1999)). En resumen, la comparación de secuencias indica una jerarquía de mutabilidad entre las secuencias de di y trinucleótidos ubicadas dentro del ADN intrónico de Ig, que predice regiones que son más o menos mutables. La relación cuantitativa estructura-actividad (QSAR, quantitative structure-activity relationship) puede usarse para identificar la naturaleza del dominio de reconocimiento del anticuerpo y, por lo tanto, los aminoácidos que participan en la unión del ligando. A su vez, los modelos predictivos basados en QSAR pueden usarse para predecir el efecto de las sustituciones (mutaciones). Por ejemplo, el efecto de mutaciones sobre la velocidad de asociación y disociación de un anticuerpo que interacciona con su antígeno, se ha usado para construir modelos predictivos cuantitativos para las dos constantes cinéticas (Ka y Kd), que a su vez puede usarse para predecir el efecto de otras mutaciones en el anticuerpo (De Genst et al., J Biol. Chem. 277: 29897 (2002)). Por lo tanto, el experto en la técnica puede usar dicho análisis para predecir sustituciones de aminoácidos que probablemente den como resultado un anticuerpo o una subsecuencia que conserve al menos la actividad o función parcial del anticuerpo, subsecuencia o polipéptido de fusión (FynomAb) no sustituido, por ejemplo, que conserve al menos la unión parcial a IL-6R.
El efecto de una sustitución determinada puede ensayarse para identificar anticuerpos y polipéptidos de fusión (FynomAb) que conserven al menos una parte de la actividad de unión, especificidad o función del anticuerpo o actividad del anticuerpo de referencia no sustituido o polipéptido de fusión (FynomAb). Por ejemplo, una sustitución, adición, deleción o inserción de aminoácido en una región hipervariable de un anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb) que se une a IL-6R, puede ensayarse para determinar la actividad de unión o la especificidad de unión de IL-6R. Por consiguiente, se incluyen anticuerpos y polipéptidos de fusión (FynomAb) que tengan sustituciones, así como adiciones, deleciones e inserciones de aminoácidos, siempre que se conserve al menos una parte de una función o actividad, tal como afinidad de unión, especificidad de unión, unión a una diana (por ejemplo, IL-6R) en una célula in vitro (por ejemplo, en cultivo), o in vivo.
El término "identidad" y variaciones gramaticales del mismo, significa que dos o más entidades mencionadas son iguales. Por tanto, cuando dos secuencias de aminoácidos son idénticas, tienen la misma secuencia de aminoácidos. La identidad puede ser sobre un área definida (región o dominio) de la secuencia. Las "áreas, regiones o dominios" de homología o identidad significan que una parte de dos o más entidades mencionadas comparten homología o son iguales. Por tanto, cuando dos secuencias son idénticas en una o más regiones de secuencia, comparten identidad en estas regiones.
Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas o no conservativas. Una "sustitución conservativa" significa el reemplazo de un aminoácido por un aminoácido por un resto biológica, química o estructuralmente similar. Biológicamente similar significa que la sustitución es compatible con la actividad biológica, por ejemplo, conserva la unión a IL-17a o a IL-6R. Estructuralmente similar significa que los aminoácidos tienen cadenas laterales con una longitud similar, como alanina, glicina y serina, o tamaño similar. Similitud química significa que los restos tienen la misma carga o son hidrófilos o hidrófobos. Como ejemplos particulares no limitantes se incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un resto polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por asparagina, serina por treonina y similares.
Las sustituciones de aminoácidos pueden ser con el mismo aminoácido, salvo que un L-aminoácido de origen natural pueda sustituirse por un D-aminoácido. Por lo tanto, las modificaciones incluyen uno o más D-aminoácidos sustituidos por L-aminoácidos, o mezclas de D-aminoácidos sustituidos por L-aminoácidos.
El grado de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando un programa informático y un algoritmo matemático conocidos en la técnica. Dichos algoritmos que calculan el porcentaje de identidad de secuencia (homología) generalmente tienen en cuenta los huecos y los emparejamientos erróneos de la secuencia en la región o área de comparación. Por ejemplo, un algoritmo de búsqueda BLAST (por ejemplo, BLAST 2.0) (véase, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990), disponible al público a través del NCBI), tiene los siguientes parámetros de búsqueda ilustrativos: Emparejamiento erróneo -2; apertura de hueco 5; extensión de hueco 2. Para comparaciones de secuencias de polipéptidos, normalmente se usa un algoritmo BLASTP en combinación con una matriz de puntuación, tal como PAM100, PAM250, BLOSUM 62 o BLOSUM 50. Los programas de comparación de secuencias FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) y SSEARCH también se usan para cuantificar el grado de identidad (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185 (2000); y Smith et al., J. Mol. Biol. 147: 195 (1981)). También se han desarrollado programas para cuantificar la similitud estructural de proteínas usando mapeo topológico basado en Delaunay (Bostick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 304: 320 (2003)).
Las modificaciones incluyen cambios en una actividad o función de una composición de referencia (por ejemplo, afinidad o unión específica a IL-17a o IL-6R). Usando un método conocido en la técnica pueden producirse fynómeros, anticuerpos y polipéptidos de fusión (FynomAb) modificados que tengan características alteradas, tal como mayor afinidad de unión, mayor actividad antagonista. Por ejemplo, para mejorar la afinidad de unión del anticuerpo pueden usarse técnicas de maduración por afinidad (documento US 2004/0162413 A1; patentes de Estados Unidos n.° 6.656.467, 6.531.580, 6.590.079 y 5.955.358; Fiedler et al., Protein Eng. 15:931 (2002); Pancook et al., Hybrid. Hybridomics 20:383 (2001); Daugherty et al., Protein Eng. 11:825 (1998); Wu et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6037 (1998); y Osbourn et al., Immunotechnology 2:181 (1996)).
Los fynómeros, anticuerpos y polipéptidos de fusión (FynomAb), incluyen subsecuencias (por ejemplo, fragmentos) y formas modificadas (por ejemplo, variantes de secuencia), como se expone en el presente documento. Una subsecuencia de fynómero se refiere a un fragmento o subsecuencia funcional de un fynómero de referencia, por ejemplo, una secuencia que tiene la deleción de uno o más aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7. Una subsecuencia de "anticuerpo" se refiere a un fragmento o subsecuencia funcional de una inmunoglobulina. Los ejemplos no limitantes de subsecuencias de anticuerpos pueden incluir un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fv monocatenario (scFv), Fv unidos por disulfuro (sdFv), Vl, Vh, diacuerpo ((Vl-Vh)2 o (Vh-Vl)2), triacuerpo, tetracuerpo (tetravalente), minicuerpo ((scFV-CH3)2), IgGdeltaCH2, un fragmento scFv-Fc o (scFv)2-Fc. En aspectos particulares, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fv monocatenario (scFv), Fv unidos por disulfuro (sdFv), VL, VH, diacuerpo ((VL-VH)2 o (Vh-Vl)2), triacuerpo, tetracuerpo (tetravalente), minicuerpo ((scFv-Ch3)2), IgGdeltaCH2, subsecuencia scFv-Fc y (scFv)2-Fc. Dichas subsecuencias y polipéptidos de fusión (FynomAb) pueden tener al menos una parte de una secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 8 o 9 (por ejemplo, una o más CDR (CDR1-CDR3 de la secuencia de la región variable de la cadena pesada o ligera) y/o de las f R de las SEQ ID NO: 8-9).
En aspectos particulares, una subsecuencia tiene sustancialmente la misma o tiene la misma afinidad de unión por IL-17a o IL-6R o especificidad de unión por IL-17a o IL-6R, o una o más funciones o actividades del fynómero de unión a IL-17a o del anticuerpo de unión a IL-6R in vitro o in vivo, en una célula in vitro o en vivo. Las expresiones "subsecuencia funcional" y "fragmento funcional" cuando se refieren a un fynómero, anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb), se refieren a una parte de un fynómero o anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb) que conserva al menos una parte de una o más funciones o actividades como un fynómero o anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb) de referencia intacto, por ejemplo, un fynómero que se une a IL-17a, un anticuerpo que se une a IL-6R o un polipéptido de fusión (FynomAb) que se une a IL-17a y a IL-6R.
Las subsecuencias de anticuerpos, incluidas las de los anticuerpos monocatenarios, pueden incluir toda o una parte de la(s) región(es) variable(es) de cadena pesada o ligera (por ejemplo, CDR1, CDR2 o CDR3) solas o en combinación con todas o con una parte de uno o más de lo siguiente: región de bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen subsecuencias de unión a antígeno de cualquier combinación de la(s) región(es) variable(es) de cadena pesada o ligera (por ejemplo, CDR1, CDR2 o CDR3) con una región de bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3.
Las modificaciones adicionales de los polipéptidos de fusión biespecíficos (FynomAb) incluidos en la invención, son adiciones (derivados)/inserciones. Los ejemplos de adiciones pueden incluir una adición de una secuencia polipeptídica, que es una secuencia de aminoácidos que tiene una o más moléculas que no están normalmente presentes en una secuencia nativa (tipo silvestre) de referencia, unida de manera covalente a la secuencia. Un ejemplo particular de adición de péptidos es uno en el que se une una segunda secuencia heteróloga, es decir, un dominio funcional heterólogo (unión covalente o no covalente), que confiere una función distinta o complementaria al polipéptido de fusión (FynomAb) biespecífico. Por tanto, el polipéptido de fusión (FynomAb) biespecífico puede incluir un dominio heterólogo, donde el dominio confiere una función distinta, es decir, un dominio funcional heterólogo. Por ejemplo, una región Fc puede ser una quimera que incluya partes de regiones Fc de IgG1 e IgG3 humanas.
Los dominios funcionales heterólogos que pueden emplearse en esta invención no están restringidos a restos de aminoácido o a dominios. Por tanto, un dominio funcional heterólogo puede consistir en cualquiera de una variedad de diferentes tipos de fracciones funcionales pequeñas o grandes. Dichas fracciones pueden incluir ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, lípidos, moléculas/compuestos orgánicos pequeños, tal como un fármaco (por ejemplo, un fármaco antiproliferativo celular), un metal (oro, plata) o un radioisótopo. Por tanto, en otra realización, en el presente documento se proporciona un FynomAb que está marcado de forma detectable.
Los ejemplos no limitantes de dominios heterólogos pueden incluir etiquetas y marcadores de purificación o detección. Los ejemplos específicos de etiquetas y marcadores (de detección) de purificación y detectables pueden incluir enzimas (peroxidasa de rábano picante, ureasa, catalasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, cloranfenicol transferasa); sustratos enzimáticos, ligandos (por ejemplo, biotina); receptores (avidina); isótopos/radionúclidos radiactivos (por ejemplo, C14, S35, Pt2, P3t, H3, I , I , galio 67 y 68, escandio 47, indio 111 y radio 223); etiquetas de T7, polihistidina, His, myc, HA y FLAG; reactivos con densidad electrónica; moléculas de transferencia de energía; marcadores paramagnéticos; fluoróforos (fluoresceína, rodamina, ficoeritrina); cromóforos; agentes quimioluminiscentes (imidazol, luciferasa); bioluminiscentes; agentes de contraste (por ejemplo, gadolinio; manganeso; sulfato de bario; un agente yodado o no yodado); un agente iónico o un agente no iónico; agentes magnéticos y paramagnéticos (por ejemplo, quelato de óxido de hierro); nanopartículas; un grupo protésico (por ejemplo, estreptavidina/biotina y avidina/biotina); un material fluorescente (por ejemplo, umbeliferona, fluoresceína, isocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina); un material luminiscente (por ejemplo, luminol); o un material bioluminiscente (por ejemplo, luciferasa, luciferina, aequorina).
Normalmente las enzimas se detectan por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante generalmente se detecta por su capacidad para convertir un sustrato, tal como t,t',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) en un pigmento azul, que puede cuantificarse. Los ligandos pueden unirse a otras moléculas tal como biotina, que puede unirse a avidina o estreptavidina, e IgG, que puede unirse a la proteína A.
Ejemplos adicionales no limitantes de marcadores detectables pueden incluir un material radiactivo, tal como un radioisótopo, un metal o un óxido de metal. Los radioisótopos incluyen radionúclidos que emiten radiación alfa, beta o gamma, tales como uno o más de: 3H, 10B, 18F, 11C, 14C, 13N, 18O ,15O, t2P, P3t, t5S, t5Cl, 45Ti, 59Fe, 57Co, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 6W 68Ga, 72As 76Br, 77Br, 81mKr, 82Rb, 85Sr, 89Sr, 86Y, 99mTc, 97Ru, 10tRu, 105Rh, 109Cd, 111In, 113Sn, 11tmIn, 114In, I125, I131, 14oLa, 141Ce, 149Pm, 15tGd, 157Gd, 15tSm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 169Er, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 186Re, 188Re, 201Tl, 2°3Pb, 211At, 212Bi o 225Ac.
Otros ejemplos no limitantes más de marcadores detectables pueden incluir un metal o un óxido de metal, tal como oro, plata, cobre, boro, manganeso, gadolinio, hierro, cromo, bario, europio, erbio, praseodimio, indio o tecnecio.
El fármaco que puede usarse como un dominio heterólogo que se une al anticuerpo o polipéptido de fusión (FynomAb) puede ser un agente citotóxico. La expresión "agente citotóxico" usada en este contexto se refiere a una sustancia que disminuye, inhibe, suprime, reduce, interfiere o bloquea la función, o el crecimiento, de células y/o una sustancia que causa la destrucción de las células. El agente citotóxico puede usarse para destruir o inhibir la proliferación o replicación de las células diana.
Los ejemplos de agentes citotóxicos pueden incluir toxina diftérica, toxina colérica, ricina y mitomicina C. Los ejemplos adicionales incluyen caliqueamicina, duocarmicina, PBD, auristatinas y dolastatinas (patentes de Estados Unidos N.° 5.635.483 y 5.780.588); caliqueamicina (patentes de Estados Unidos N.° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296), gemcitabina, cisplatino, doxorrubicina, irinotecán, BCNU, estreptozocina, vincristina y 5-fluorouracilo (atente de Estados Unidos N.° 5.770.710; véanse también, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 4.362.663; 4.371.533; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545; y 6.333.410).
Otros ejemplos de agentes citotóxicos pueden incluir taxanos (por ejemplo, Taxol) y maitansinoides. Ejemplos de maitansinoides, que inhiben la formación de microtúbulos en células de mamíferos, puede incluir maitansinol y análogos de maitansinol. Ejemplos de análogos de maitansinol incluyen los que tienen un anillo aromático modificado y los que tienen modificaciones en otras posiciones (véase, por ejemplo, maitansina y maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres C-3 de maitansinol (patente de Estados Unidos N.° 4.151.042); maitansinol sintético y sus derivados y análogos (patentes de Estados Unidos N.° 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608;
4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348;
4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533).
El polipéptido de fusión FynomAb biespecífico puede tener una adición o puede ser un derivado. Por ejemplo, el polipéptido puede incluir un residuo de azúcar, un grupo fosfato, ubiquitina, un ácido graso o un lípido, o puede estar glucosilado, fosforilado, acetilado, amidado o formilado. El polipéptido puede derivatizarse mediante un grupo protector/bloqueante o mediante cualquiera de las numerosas modificaciones químicas. La modificación del polipéptido también puede ser mediante uno o más enlaces disulfuro intra o intermoleculares.
Los enlazadores, tales como secuencias de aminoácidos o de peptidomiméticos, pueden insertarse entre el fynómero y/o la secuencia de anticuerpos y el dominio funcional heterólogo, de modo que las dos entidades mantengan, al menos en parte, la función o actividad diferenciada. En una realización, un dominio de fynómero está unido a una cadena pesada (H) o cadena ligera (L) inmediatamente después del último aminoácido en el extremo amino(NH2) o el extremo carboxilo(C) de la cadena pesada (H) o la cadena ligera (L). Los enlazadores pueden tener una o más propiedades que incluyan una conformación flexible, una incapacidad para formar una estructura secundaria ordenada o un carácter hidrófobo o con carga que podría promover o interaccionar con cualquiera de los dominios. Ejemplos de aminoácidos que se encuentran normalmente en regiones proteicas flexibles pueden incluir Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, también pueden usarse en la secuencia enlazadora. La longitud de la secuencia enlazadora puede variar sin que afecte significativamente en la función o actividad de la proteína de fusión (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.087.329). En un aspecto particular, un fynómero y una cadena pesada o ligera de anticuerpo están unidos por una secuencia peptídica que tiene de aproximadamente 1 a 25 restos de aminoácido.
Los ejemplos de enlazadores también pueden incluir fracciones químicas y agentes de conjugación, tales como derivados de sulfo-succinimidil (sulfo-SMCC, sulfo-SMPB), suberato de disuccinimidilo (DSS), glutarato de disuccinimidilo (DSG) y tartrato de disuccinimidilo (DST). Los enlazadores incluyen además una cadena de carbono lineal, tal como Cn (donde N=1-100 átomos de carbono, por ejemplo, C, CC, CCC, CCCC, CCCCC, CCCCCC, CCCCCCC, CCCCCCCC).
Se entiende que un fynómero, anticuerpo o subsecuencia puede tener múltiples (por ejemplo, dos o más) variaciones, modificaciones o etiquetas. Por ejemplo, una secuencia de cadena pesada o ligera de un anticuerpo puede acoplarse a biotina para que pueda detectarse con avidina y marcarse con I125 para que proporcione una señal detectable. Otras permutaciones y posibilidades son de inmediato obvias para los expertos habituales en la técnica y se considera que están dentro del alcance de la invención.
Los ejemplos de anticuerpos y polipéptidos de fusión (FynomAb) pueden incluir secuencias de mamífero, humanas, humanizadas y primatizadas. El término "humano", en referencia a un anticuerpo, significa que la secuencia de aminoácidos es de origen completamente humano. Por tanto, un "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que tiene secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina humana, es decir, regiones variables y constantes de cadena pesada y ligera humana que se unen específicamente a una diana. Por lo tanto, un "anticuerpo de IL-6R humano" o "anticuerpo anti IL-6R humano" se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina humana y que se une a IL-6R. Es decir, todos los aminoácidos del anticuerpo son humanos o pueden existir o existen en un anticuerpo humano. Por tanto, por ejemplo, un anticuerpo que no es humano puede convertirse en uno completamente humano sustituyendo los restos de aminoácido no humanos por restos de aminoácido que pueden existir o no en un anticuerpo humano. En la técnica se conocen restos de aminoácido presentes en anticuerpos humanos, mapas de las regiones CDR y restos consenso de anticuerpos humanos (véase, por ejemplo, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Ed.US Department of Health and Human Services. Public Health Service (1987); y Chothia y Lesk J. Mol. Biol.186:651 (1987)). En Padlan Mol. Immunol.31:169 (1994) y en Padlan Mol. Immunol.28:489 (1991), se describe una secuencia consenso de subgrupo III de Vh humano, basada en un estudio de 22 secuencias de Vh III humanas conocidas y una secuencia consenso de subgrupo I de cadena kappa Vl humana, basada en un estudio de 30 secuencias kappa I humanas conocidas. Por lo tanto, los anticuerpos humanos incluyen anticuerpos en los que uno o más restos de aminoácido se han sustituido por uno o más aminoácidos presentes en otro anticuerpo humano.
El término "humanizado", cuando se usa en referencia a un anticuerpo, significa que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo tiene restos de aminoácido no humanos (por ejemplo, de ratón, rata, cabra, conejo, primates no humanos, etc.) de una o más regiones determinantes (CDR) que se unen específicamente a la diana deseada (por ejemplo, IL-6R) en una molécula de inmunoglobulina humana aceptora, y uno o más restos de aminoácido humanos en la región marco conservada (FR) Fv, que son restos de aminoácido que flanquean las CDR. Los restos humanos de la región marco conservada de la inmunoglobulina pueden reemplazarse por restos no humanos correspondientes. Por lo tanto, los restos humanos de las regiones marco conservadas pueden sustituirse por un resto correspondiente del anticuerpo donante de la CDR no humana para alterar, generalmente para mejorar, la afinidad o especificidad por el antígeno, por ejemplo. Además, un anticuerpo humanizado puede incluir restos que no se encuentren ni en el anticuerpo humano ni en las secuencias de CDR o estructurales del donante. Por ejemplo, puede predecirse una sustitución estructural en una posición particular que no se encuentre en un anticuerpo humano o en el anticuerpo no humano donante, para mejorar la afinidad de unión o la especificidad del anticuerpo humano en esa posición.
En la técnica se conocen sustituciones, basadas en modelado molecular, en las regiones marco conservadas y en las CDR del anticuerpo, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de los restos de CDR y de las regiones marco conservadas para identificar restos estructurales que son importantes para la unión con el antígeno y la comparación de secuencias para identificar restos estructurales inusuales en posiciones particulares (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.585.089; y Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Los anticuerpos denominados "primatizados" se incluyen en el significado de "humanizados" como se usa en el presente documento, excepto que la molécula de inmunoglobulina humana aceptora y los restos de aminoácido de la región marco conservada pueden ser cualquier resto de aminoácido de primate (por ejemplo, mono, gibón, gorila, chimpancé, orangután, macaco), además de cualquier resto de ser humano.
En una célula hospedadora pueden prepararse subsecuencias de anticuerpos y de fynómeros mediante técnicas genéticas que incluyen la expresión de toda o parte de la secuencia codificante del anticuerpo o del fynómero. Los anticuerpos de unión a IL-6R pueden generarse usando técnicas que incluyen tecnología de hibridoma convencional, tecnologías de presentación de fagos y recombinantes, o una combinación de las mismas (véanse las patentes de Estados Unidos N.° 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993; véase también Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn y Bechtol (eds.), 1980, y Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988). Los anticuerpos monoclonales de unión a IL-6R también pueden obtenerse mediante clonación directa de secuencias de inmunoglobulinas de animales, incluidos primates o sujetos humanos.
Un animal, tal como un ratón, un conejo, una rata, una oveja, una vaca o cabestro, una cabra, un cerdo, un caballo, una cobaya y primates, incluidos los seres humanos, pueden inmunizarse con IL-6R para obtener un anticuerpo que se una a IL-6R. Dicho animal puede ser un animal no humano modificado genéticamente que tiene locus de genes de IgG humana (por ejemplo, cadena ligera lambda o kappa), que es capaz de expresar anticuerpos humanos. Por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 5.939.598, se describen animales transgénicos con uno o más genes de inmunoglobulina humana (kappa o lambda) que no expresan inmunoglobulinas endógenas. Por tanto, dichos animales pueden usarse para producir anticuerpos humanos. Como ejemplos no limitantes de animales pueden incluirse ratones KM™ transcromosómicos humanos (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722 (2000); e Ishida et al., Cloning Stem Cells 4:91 (2004)) que pueden producir genes de inmunoglobulina humana (WO02/43478) y ratones HAC (WO02/092812). La tecnología de hibridoma convencional que usa esplenocitos aislados de animales inmunizados que responden al antígeno y fusionados con células de mieloma, puede usarse para obtener anticuerpos monoclonales humanos. Se describen métodos adicionales para producir anticuerpos policlonales humanos y anticuerpos monoclonales humanos (véase, por ejemplo, Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol.
20:889 (2002); los documentos WO 98/24893, WO 92/01047, WO 96/34096 y WO 96/33735; las patentes de Estados Unidos N.° 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598). Lonberg y Huszar (Int. Rev. Immunol.13: 65 (1995)), describen una visión general sobre tecnología para producir anticuerpos humanos.
También pueden producirse subsecuencias de fynómeros y de anticuerpos mediante hidrólisis proteolítica. Un anticuerpo, por ejemplo, se puede someter a digestión con pepsina o papaína. Los fragmentos de anticuerpos producidos por escisión enzimática con pepsina proporcionan un fragmento 5s denominado F(ab')2. Este fragmento se puede escindir adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes Fab' 3.5S. Como alternativa, una escisión enzimática que usa pepsina produce directamente dos fragmentos Fab' monovalentes y el fragmento Fc (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 4.036.945 y 4.331.647; y Edelman et al., Methods Enymol. 1:422 (1967)). También pueden usarse otros métodos de escisión de anticuerpos, tales como separación de cadenas pesadas, para formar fragmentos monovalentes de cadena ligera-pesada, escisión adicional de fragmentos u otra escisión enzimática o química. Se pueden producir anticuerpos Fv monocatenarios como se describe en las patentes de Estados Unidos N.° 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods Enzymol. 203:46 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038 (1988).
Los anticuerpos se pueden humanizar usando una variedad de técnicas conocidas en la materia, incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR (documento EP 239.400; documento WO91/09967; patentes de Estados Unidos N.° 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), rechapado o rebarnizado (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Immunol molecular. 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805 (1994); Roguska. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91: 969 (1994)), y barajado de cadenas (patente de Estados Unidos N.° 5.565.332). Para humanizar anticuerpos pueden usarse secuencias consenso humanas (Padlan, Mol. Immunol.31:169 (1994); y Padlan, Mol. Immunol. 28: 489 (1991)) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); y Presta et al., J. Immunol.151:2623 (1993)).
En la técnica se conocen métodos para producir anticuerpos quiméricos (por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191 (1989); y patentes de Estados Unidos N.° 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397). Se describen anticuerpos quiméricos en los que un dominio variable de un anticuerpo de una especie sustituye al dominio variable de otra especie, por ejemplo, en Munro, Nature 312:597 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604 (1984); Sharon et al., Nature 309:364 (1984); Morrison et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); Capon et al., Nature 337:525 (1989); y Traunecker et al., Nature 339:68 (1989).
También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican fynómeros, anticuerpos y polipéptidos de fusión (FynomAb). En una realización, un ácido nucleico codifica una secuencia que es al menos 60 % o más (por ejemplo, al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a cualquier secuencia de fynómero que se una a IL-17a, por ejemplo, 60 % o más idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido como se expone en las SEQ ID NO: 1-7.
En otra realización, un ácido nucleico codifica una secuencia que es al menos 60 % o más (por ejemplo, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a cualquier secuencia de región variable de cadena ligera o pesada como se expone en las SEQ ID NO: 8 o 9. En una realización adicional, un ácido nucleico codifica una secuencia que es al menos 60 % o más (por ejemplo, al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a cualquier secuencia de región variable de cadena ligera o pesada de un anticuerpo que se une a IL-6R, tal como una secuencia de cadena pesada o ligera como se expone en las SEQ ID NO: 8 o 9 que está fusionada o conjugada con cualquier secuencia de fynómero que se una a IL-17a, por ejemplo, una secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 1-7. En una realización adicional, un ácido nucleico codifica una secuencia que tiene una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1-7, o de las SEQ ID NO: 8 o 9, o un polipéptido de fusión que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7 fusionado a cualquiera de las SEQ ID NO: 8 o 9.
Las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" y similares, se refieren a al menos dos o más pares de bases (nucleótidos) de ácido ribonucleico o desoxirribonucleico que están unidos a través de un enlace fosfodiéster o equivalente. Los ácidos nucleicos incluyen polinucleótidos y polinucleósidos. Los ácidos nucleicos incluyen moléculas sencillas, dobles o triples, circulares o lineales. Como ejemplos de ácidos nucleicos se incluyen, pero sin limitación: ARN, ADN, ADNc, ácido nucleico de origen natural y no natural, por ejemplo, ácido nucleico sintético.
Los ácidos nucleicos pueden tener diversas longitudes. Las longitudes de los ácidos nucleicos suelen variar de aproximadamente 20 nucleótidos a 20 Kb, o cualquier valor numérico o intervalo dentro de dichas longitudes o que las abarque, de 10 nucleótidos a 10 Kb, de 1 a 5 Kb o menor, de 1000 a aproximadamente 500 nucleótidos o menos de longitud. Los ácidos nucleicos también pueden ser más cortos, por ejemplo, de 100 a aproximadamente 500 nucleótidos, o de aproximadamente 12 a 25, 25 a 50, 50 a 100, 100 a 250, o de aproximadamente 250 a 500 nucleótidos de longitud, o cualquier valor numérico o intervalo o valor dentro de dichas longitudes o que las abarque. En aspectos particulares, una secuencia de ácido nucleico tiene una longitud de aproximadamente 10-20, 20-30, 30­ 50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500- 1000 o 1000-2000, nucleótidos, o cualquier valor numérico o intervalo dentro de dichas longitudes o que las abarque. Los polinucleótidos más cortos se denominan comúnmente "oligonucleótidos" o "sondas" de ADN monocatenario o bicatenario. Sin embargo, no existe un límite superior para la longitud de dichos oligonucleótidos.
El término "aislado" cuando se usa en relación con los componentes (por ejemplo, fynómeros, anticuerpos, secuencias de cadenas pesadas o ligeras, polipéptidos de fusión (FynomAb), ácidos nucleicos que los codifican, etc.), significa que el componente está fabricado manualmente o que está separado, completamente o al menos en parte, de su entorno de origen natural in vivo. Generalmente, un componente aislado carece sustancialmente de uno o más materiales con los que normalmente se asocia en la naturaleza, por ejemplo, una o más proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, hidratos de carbono, membranas celulares. El término "aislado" no excluye formas físicas alternativas del componente, tales como multímeros/oligómeros, variantes, modificaciones o formas derivatizadas, o formas expresadas en células hospedadoras producidas manualmente. El término "aislado" tampoco excluye la composición o la formulación que contiene el componente que se produce manualmente.
Un componente "aislado" también se puede "purificar" cuando carece de la mayor parte o de todos los materiales con los que normalmente se asocia en la naturaleza. Por tanto, un polipéptido de fusión (FynomAb) aislado, que también es sustancialmente puro o que está purificado, no incluye polipéptidos o polinucleótidos presentes entre millones de otras secuencias, tal como ocurre, por ejemplo, en una biblioteca de polipéptidos o de ácidos nucleicos en una biblioteca genómica o de ADNc. Un componente "purificado" puede combinarse con una o más moléculas distintas. Por tanto, "purificado" no excluye combinaciones de los componentes, tales como combinaciones de los FynomAb (múltiples FynomAb) y de los FynomAb en combinación con otros agentes o fármacos activos.
Los ácidos nucleicos se pueden producir usando diversas técnicas estándar de clonación y de síntesis química. Las técnicas incluyen, pero sin limitación, amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR, siglas del inglés polymerase chain reaction), con dianas de a Dn genómico o ADNc usando cebadores (por ejemplo, una mezcla de cebadores degenerados) que pueden emparejarse con la secuencia que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos también se pueden producir mediante síntesis química (por ejemplo, síntesis de fosforamidita en fase sólida) o mediante transcripción de un gen. Las secuencias producidas se pueden traducir después in vitro, o clonarse en un plásmido y propagarse y expresarse después en una célula (por ejemplo, una célula hospedadora tal como una célula eucariota o de mamífero, levadura o bacteria, en un animal o en una planta).
El ácido nucleico puede insertarse en una construcción de ácido nucleico en la que la expresión del ácido nucleico está influenciada o regulada por un "elemento de control de la expresión". Un "elemento de control de expresión" se refiere a un elemento de la secuencia de ácido nucleico que regula o confiere la expresión de una secuencia de ácido nucleico con la que está unido operativamente. Los elementos de control de expresión incluyen, según sea apropiado, promotores, potenciadores, terminadores de transcripción, silenciadores de genes, un codón de inicio (por ejemplo, ATG) delante de un gen que codifica una proteína, etc.
Un elemento de control de expresión unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico controla la transcripción y, según sea apropiado, la traducción de la secuencia de ácido nucleico. Los elementos de control de la expresión incluyen elementos que activan la transcripción de manera constitutiva, que son inducibles (es decir, requieren una señal externa para su activación), o reprimibles (es decir, requieren una señal para desactivar la transcripción; cuando la señal ya no está presente, la transcripción está activada o "reprimida"), o son específicos para tipos de células o tejidos (es decir, elementos de control específicos de tejido).
El ácido nucleico puede insertarse en un plásmido para su propagación en una célula hospedadora y para la posterior manipulación genética. Un plásmido es un ácido nucleico que puede propagarse en una célula hospedadora; los plásmidos pueden contener opcionalmente elementos de control de expresión para impulsar la expresión del ácido nucleico que codifica el fynómero, anticuerpo (cadenas pesadas o ligeras) o polipéptido de fusión (FynomAb) en la célula hospedadora. En el presente documento el término vector se usa como sinónimo de plásmido y también puede incluir un elemento de control de expresión para su expresión en una célula hospedadora (por ejemplo, vector de expresión). Los plásmidos y los vectores contienen generalmente al menos un origen de replicación para la propagación en una célula y un promotor. Por lo tanto, los plásmidos y los vectores son útiles para la manipulación genética y la expresión de un fynómero, anticuerpo (cadenas pesadas o ligeras) o polipéptido de fusión (Fynom-Ab).
Los ácidos nucleicos que codifican el fynómero, anticuerpo (cadenas pesadas o ligeras) o polipéptido de fusión (FynomAb), pueden producirse sintéticamente o usando métodos recombinantes, o aislarse de una célula tal como un hibridoma. Los ácidos nucleicos aislados pueden insertarse en un vector de expresión adecuado e introducirse en células hospedadoras adecuadas (por ejemplo, células de CHO (ovario de hámster chino), vegetales y otras células) que pueden cultivarse para la producción de un fynómero, anticuerpo (cadenas pesadas o ligeras) o polipéptido de fusión (Fynom-Ab).
De acuerdo con la divulgación, se proporcionan células hospedadoras que expresan o se transforman con un ácido nucleico que codifica un fynómero, anticuerpo (cadenas pesadas o ligeras) o polipéptido de fusión (FynomAb) de la invención. Las células hospedadoras y su descendencia pueden transfectarse de manera estable o transitoria para la expresión del fynómero, anticuerpo (cadenas pesadas o ligeras) o polipéptido de fusión (FynomAb).
Las células hospedadoras pueden incluir, pero sin limitación, células procariotas y eucariotas, tales como células de bacterias, hongos (levaduras), vegetales, insectos y animales (por ejemplo, de mamífero, incluyendo primates y seres humanos). Por ejemplo, bacterias transformadas con ácido nucleico de bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ácido nucleico de plásmido o de ácido nucleico de cósmido; levadura transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti); sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus); y sistemas de células animales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, virus variolovacunal) o sistemas de células animales transformadas diseñados para una expresión estable.
El término "transformado(a)" o "transfectado(a)" cuando se usa en referencia a una célula (por ejemplo, una célula hospedadora) u organismo, significa un cambio genético en una célula después de la incorporación de una molécula exógena, por ejemplo, una proteína o ácido nucleico (por ejemplo, un transgén) en la célula. Por tanto, una célula "transfectada" o "transformada" es una célula, o una descendencia de la misma, en la que se ha introducido manualmente una molécula exógena, por ejemplo, mediante técnicas de ADN recombinante.
La(s) célula(s) puede(n) propagarse de modo que se genere el polipéptido deseado. Es posible que la descendencia de una célula transfectada o transformada no sea idéntica a la célula precursora, ya que puede haber mutaciones que se producen durante la replicación.
La divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de fusión biespecífico de la invención y un portador, diluyente o excipiente farmacéutica o fisiológicamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" y "fisiológicamente aceptable", al referirse a un transportador, diluyente o excipiente, puede ser un disolvente (acuoso o no acuoso), un detergente, una solución, una emulsión, un medio de dispersión, un recubrimiento o un agente isotónico y promotor o retardador de la absorción, que sea compatible con la administración farmacéutica y con los demás componentes de la composición. La composición farmacéutica de la presente invención se puede proporcionar en forma de comprimido (con o sin recubrimiento), cápsula (dura o blanda), microperla, emulsión, polvo, gránulo, cristal, suspensión, jarabe o elixir.
Se puede formular una composición farmacéutica de modo que sea compatible con una vía de administración o uso particular. Una composición farmacéutica para administración parenteral, intradérmica o subcutánea puede contener un diluyente estéril, tal como agua, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos. La composición puede contener además uno o más conservantes para impedir el crecimiento de microorganismos (por ejemplo, agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como EDTA; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa).
Una composición farmacéutica para inyección puede estar en forma de solución acuosa estéril (cuando sea soluble en agua) o de preparación extemporánea para solución o dispersión inyectable estéril que consiste en un medio de dispersión y polvos estériles. Para la administración intravenosa, los ejemplos de transportadores adecuados pueden incluir solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) y solución salina tamponada con fosfato (PBS). El transportador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol), o una mezcla adecuada de los mismos. La fluidez puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, o usando tensioactivos. Los ejemplos de agentes antibacterianos y antifúngicos pueden incluir parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, y timerosal. La inclusión de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina, puede prolongar la absorción de las composiciones inyectables. A la composición puede añadirse, por ejemplo, hasta un 1 % de polisorbato 20 o polisorbato 80. Otros ejemplos no limitantes de aditivos pueden incluir histidina HCl, a,a-trehalosa deshidratada.
Los expertos en la materia conocen formulaciones farmacéuticas y sistemas de suministro adicionales y son aplicables en los métodos de la divulgación (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12a ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993); y Poznansky, et al., Drug Delivery Systems, R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980), págs. 253-315).
La divulgación proporciona un método y uso del polipéptido de fusión biespecífico para modular o tratar una respuesta, un trastorno o una enfermedad asociada a la función o actividad de IL-17a y/o IL-6R. Los ejemplos de respuestas, trastornos y enfermedades pueden incluir, sin limitación, respuestas, trastornos y enfermedades inmunitarias, respuestas, trastornos y enfermedades inflamatorias e inflamación. Los ejemplos de respuestas, trastornos y enfermedades también incluyen, sin limitación, respuestas, trastornos y enfermedades autoinmunitarias. Los ejemplos de respuestas pueden incluir además respuestas, trastornos y enfermedades de linfocitos T y/o B.
En una realización, se proporciona un método o uso en el que el polipéptido de fusión biespecífico o la composición farmacéutica como se expone en el presente documento, se administra a un sujeto que necesita el tratamiento para una respuesta, un trastorno o enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria o inflamación. En otra realización, se proporciona un método o uso para el tratamiento de un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria. En una realización adicional, se proporciona un método o uso para modular una respuesta de linfocitos T y/o B, o para tratar un trastorno y una enfermedad asociados a una respuesta de linfocitos T y/o B. En una realización adicional, se proporciona un método o uso para modular la función o actividad de IL-17a y/o IL-6R.
Los ejemplos de respuestas, trastornos y enfermedades que pueden modularse o tratarse de acuerdo con la divulgación pueden incluir, pero sin limitación, respuestas, trastornos o enfermedades inmunitarias, respuestas, trastornos o enfermedades inflamatorias agudas y crónicas no deseables o aberrantes o inflamación. Los ejemplos de respuestas, trastornos y enfermedades también pueden incluir, pero sin limitación, respuestas, trastornos y enfermedades autoinmunitarias agudas y crónicas. Las respuestas, trastornos y enfermedades pueden ser los mediados por anticuerpos o células, o una combinación de anticuerpos y células. Además, las respuestas, trastornos y enfermedades pueden ser los mediados por la función o actividad de IL-17a y/o IL-6R. Por otra parte, las respuestas, los trastornos y las enfermedades pueden ser los que sean susceptibles de tratamiento modulando la función o actividad de IL-17a y/o IL-6R.
En una realización, se proporciona un método o uso del polipéptido de fusión biespecífico para disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar en un sujeto una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria aguda o crónica no deseable o aberrante o una inflamación. En una realización, se proporciona un método o uso para disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar en un sujeto una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria aguda o crónica. En una realización adicional, se proporciona un método o uso para disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar en un sujeto una respuesta, un trastorno o una enfermedad aguda o crónica mediada por anticuerpos y/o células. En otra realización adicional, se proporciona un método o uso para disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar una respuesta, un trastorno o una enfermedad aguda o crónica mediada por la función o la actividad de IL-17a y/o IL-6R. En otra realización más, se proporciona un método o uso para disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar una respuesta, un trastorno o una enfermedad aguda o crónica susceptible de tratamiento modulando la función o actividad de IL-17a y/o IL-6R.
Las expresiones "trastorno inmunitario" y "enfermedad inmunitaria" se refieren a una función o actividad inmunitaria, que se caracteriza por diferentes síntomas fisiológicos o anomalías, dependiendo del trastorno o de la enfermedad. Una "respuesta inmunitaria no deseable" o "respuesta inmunitaria aberrante" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier respuesta, actividad o función inmunitaria que es mayor o menor que la respuesta, actividad o función deseada o fisiológicamente normal. Los ejemplos incluyen respuestas, actividades o funciones inmunitarias agudas o crónicas. Una "respuesta inmunitaria no deseable" se caracteriza generalmente como una respuesta, actividad o función aumentada o inapropiada no deseable o aberrante del sistema inmunitario. Sin embargo, una respuesta, función o actividad inmunitaria no deseable puede ser, por ejemplo, una respuesta, función o actividad normal. Por tanto, las respuestas inmunitarias normales, siempre que sean no deseables, aunque no se consideren aberrantes, se incluyen en el significado de estos términos. Una respuesta, función o actividad inmunitaria no deseable también puede ser una respuesta, función o actividad anómala. Una respuesta, función o actividad inmunitaria anómala (aberrante), se desvía de lo normal.
Un ejemplo no limitante de una respuesta inmunitaria no deseable o aberrante es cuando la respuesta inmunitaria es hipersensible, tal como en el caso de un trastorno autoinmunitario o de una enfermedad autoinmunitaria. Otro ejemplo no limitante de una respuesta inmunitaria no deseable o aberrante es cuando una respuesta inmunitaria conduce a una respuesta inflamatoria aguda o crónica o a una inflamación en cualquier tejido u órgano, tal como en las articulaciones esqueléticas (artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil), en los pulmones o en las vías respiratorias (alergia), o en el tubo digestivo o gastrointestinal (enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal (EII) o colitis ulcerosa).
Las respuestas inmunitarias e inflamatorias, así como la inflamación, no deseables o aberrantes, se caracterizan por muchos síntomas adversos fisiológicos o complicaciones diferentes, que pueden estar mediados por células humorales o sus combinaciones. Las respuestas, trastornos y enfermedades que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen, pero sin limitación, aquellos que, directa o indirectamente, provocan o causan daño celular o tisular/orgánico en un sujeto. En todo el cuerpo, a nivel regional o local, una respuesta inmunitaria, una respuesta inflamatoria o una inflamación puede caracterizarse por hinchazón, dolor, cefalea, fiebre, náuseas, artralgia, hinchazón, rigidez o falta de movilidad, erupción, enrojecimiento u otra decoloración. A nivel celular, una respuesta inmunitaria, una respuesta inflamatoria o una inflamación, puede caracterizarse por una o más de activación y/o diferenciación de linfocitos T, infiltración celular de la región por macrófagos, monocitos, etc., producción de anticuerpos, producción de citocinas, linfocinas, quimiocinas, interferones e interleucinas, factores de crecimiento y maduración celular (por ejemplo, factores de proliferación y diferenciación), acumulación o migración celular y daños a células, tejidos u órganos. Por tanto, los métodos y usos de la divulgación incluyen el tratamiento de, y un efecto mejorador sobre, cualquiera de dichos síntomas fisiológicos o respuestas celulares o biológicas características de las respuestas inmunitarias, la respuesta inflamatoria o la inflamación.
Las respuestas, los trastornos y las enfermedades autoinmunitarias se caracterizan generalmente por una respuesta, una actividad o una función no deseable o aberrante del sistema inmunitario, caracterizada por una capacidad de respuesta o una memoria inmunitaria humoral o celular aumentada o no deseable, o por una tolerancia disminuida o insuficiente a autoantígenos. Las respuestas, los trastornos y las enfermedades autoinmunitarias que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen, pero sin limitación, respuestas, trastornos y enfermedades que causan daño celular o tisular/orgánico en el sujeto.
En una realización, se proporciona un método o uso para disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar en un sujeto una respuesta inmunitaria, un trastorno inmunitario, una respuesta inflamatoria o una inflamación no deseable o aberrante. En una realización, se proporciona un método o uso para disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar en un sujeto una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria. En una realización adicional, se proporciona un método o uso para disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar un síntoma adverso de la respuesta inmunitaria, trastorno inmunitario, respuesta inflamatoria, o inflamación, no deseable o aberrante, o un síntoma adverso de la respuesta, trastorno o enfermedad autoinmunitaria.
En un aspecto, el método o uso de acuerdo con la divulgación puede dar como resultado una reducción en la manifestación, frecuencia, gravedad, evolución o duración de un síntoma de la afección (por ejemplo, respuesta inmunitaria, trastorno inmunitaria, respuesta inflamatoria o inflamación no deseable o aberrante). Por ejemplo, el método o uso de la divulgación puede proteger al sujeto de la evolución de, o disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar, la gravedad, la frecuencia, la duración o la probabilidad de que se produzca un síntoma adverso de la respuesta inmunitaria, trastorno inmunitario, respuesta inflamatoria, o inflamación, o una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante.
Los ejemplos de síntomas adversos de una respuesta inmunitaria, un trastorno inmunitario, una respuesta inflamatoria o una inflamación no deseable o aberrante, o de un síntoma adverso de una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria pueden incluir hinchazón, dolor, erupción, decoloración, cefalea, fiebre, náuseas, diarrea, entumecimiento, letargo, rigidez articular esquelética o movilidad reducida, disnea, movilidad reducida de músculos o extremidades, parálisis, una discapacidad sensorial, tal como daños en la visión o en los tejidos o las células. El síntoma adverso puede producirse, en particular, en tejidos u órganos o en regiones o zonas del cuerpo, tales como en la piel, tejido epidérmico o mucoso, tubo digestivo, gastrointestinal, intestinal y genitourinario, páncreas, timo, pulmón, hígado, riñón, músculo, nervios centrales o periféricos, bazo, piel, una articulación esquelética (por ejemplo, rodilla, tobillo, cadera, hombro, muñeca, dedo, dedo del pie o codo), vaso sanguíneo o linfático, o un tejido u órgano cardiopulmonar. Otros ejemplos de síntomas adversos de una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria pueden incluir la producción, supervivencia, proliferación, activación o diferenciación de linfocitos T y/o la producción de autoanticuerpos o citocinas o quimiocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-17a e IL-6).
Como ejemplos no limitantes de respuestas, trastornos y enfermedades inmunitarias aberrantes o no deseables pueden incluirse respuestas, trastornos y enfermedades inflamatorias, inflamación, respuestas, trastornos y enfermedades, autoinmunitarias tratables de acuerdo con la invención, entre los que se incluyen: polimiositis, síndrome de vasculitis, arteritis de células gigantes, arteritis de Takayasu, policondritis recidivante, hemofilia A adquirida, enfermedad de Still, enfermedad de Still del adulto, amiloidosis amiloide A, polimialgia reumática, espondiloartritis, hipertensión arterial pulmonar, enfermedad de injerto contra huésped, miocarditis autoinmunitaria, hipersensibilidad por contacto (dermatitis por contacto), enfermedad por reflujo gastroesofágico, eritrodermia, enfermedad de Behcet, esclerosis lateral amiotrófica, trasplante, neuromielitis óptica, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide maligna, artritis reumatoide resistente a fármacos, neuromielitis óptica, enfermedad de Kawasaki, artritis idiopática juvenil poliarticular o sistémica, psoriasis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad de Castleman, asma, asma alérgica, encefalomielitis alérgica, artritis, artritis progresiva crónica, artritis reactiva, artritis psoriásica, artritis enteropática, artritis deformante, enfermedades reumáticas, espondiloartropatías, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, hipersensibilidad (incluida tanto la hipersensibilidad de las vías respiratorias como la hipersensibilidad dérmica), alergias, lupus eritematoso sistémico (LES), lupus eritematoso cutáneo, eritema nudoso leproso, síndrome de Sjogren, trastornos musculares inflamatorios, policondritis, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, síndrome de Steven-Johnson, hepatitis crónica activa, miastenia grave, esprúe idiopático, enfermedad inflamatoria intestinal autoinmunitaria, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, síndrome del intestino irritable, oftalmopatía endocrina, esclerodermia, enfermedad de Grave, sarcoidosis, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, vaginitis, proctitis, diabetes mellitus insulinodependiente, diabetes mellitus resistente a insulina, diabetes juvenil (diabetes mellitus tipo I), trastornos hematológicos autoinmunitarios, anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia eritrocítica pura, trombocitopenia idiopática (TPI), uveítis autoinmunitaria, uveítis (anterior y posterior), queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis primaveral, fibrosis pulmonar intersticial, glomerulonefritis (con y sin síndrome nefrótico), síndrome nefrótico idiopático o nefropatía por cambios mínimos, enfermedad inflamatoria de la piel, inflamación de la córnea, miositis, aflojamiento de implantes óseos, trastorno metabólico, aterosclerosis, dislipidemia, descalcificación ósea, artrosis, osteoporosis, enfermedad periodontal de enfermedades obstructivas o inflamatorias de las vías respiratorias, bronquitis, neumoconiosis, enfisema pulmonar, reacciones inflamatorias agudas e hiperagudas, infecciones agudas, choque séptico, choque endotóxico, síndrome de distrés respiratorio del adulto, meningitis, neumonía, síndrome consuntivo por caquexia, ictus, queratitis estromal herpética, xeroftalmia, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, síndrome de Guillain-Barre, Síndrome de Stiffman, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis autoinmunitaria, encefalomielitis, fiebre reumática aguda, oftalmia simpática, síndrome de Goodpasture, vasculitis necrosante sistémica, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Addison, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, dermatitis herpetiforme, dermatitis atópica, dermatitis eccematosa, úlcera aftosa, liquen plano, alopecia autoinmunitaria, vitíligo, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, anemia perniciosa, hipoacusia neurosensorial, hipoacusia neurosensorial progresiva bilateral idiopática, síndrome poliglandular autoinmunitario tipo I o tipo II, infertilidad inmunitaria o infertilidad inmunomediada.
La expresión "poner en contacto" significa interacción directa o indirecta entre dos o más entidades (por ejemplo, entre un polipéptido de fusión (FynomAb) y una diana, tal como IL-17a y/o IL-6R). Un ejemplo particular de interacción directa es la unión. Como se usa en el presente documento, la puesta en contacto puede ser una puesta en contacto en solución, en fase sólida, in vitro, ex vivo, en una célula o in vivo. La puesta en contacto in vivo puede referirse a la administración, a administrar, al suministro o a suministrar a un sujeto o paciente.
En el método o uso de la presente divulgación, el polipéptido de fusión o la composición como se expone en el presente documento puede administrarse antes, sustancialmente al mismo tiempo o después de la aparición de una respuesta inmunitaria, un trastorno inmunitario, una respuesta inflamatoria o una inflamación o una respuesta o un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria o uno o más síntomas, trastornos, dolencias, patologías, enfermedades o complicaciones adversas, no deseables o aberrantes, causadas por o asociadas a lo anterior. Por tanto, el método o uso de la divulgación se puede poner en práctica antes (es decir, como profilaxis), simultáneamente o después de que comience una señal de la respuesta, trastorno o enfermedad de uno o más síntomas, trastornos, dolencias, patologías, enfermedades o complicaciones adversas causadas por o asociadas a la respuesta inmunitaria, al trastorno inmunitario, a la respuesta inflamatoria, a la inflamación o a una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante. La administración del polipéptido de fusión o de la composición como se expone en el presente documento antes, simultáneamente o inmediatamente después del desarrollo de un síntoma adverso, puede disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar la manifestación, frecuencia, gravedad, evolución o duración de uno o más síntomas, trastornos, dolencias, patologías, enfermedades o complicaciones adversas causadas por o asociadas a la respuesta inmunitaria, trastorno inmunitario, respuesta inflamatoria, inflamación o respuesta, trastorno o enfermedad inmunitaria no deseable o aberrante.
De acuerdo con el método o uso de la presente divulgación, el polipéptido de fusión biespecífico de la presente invención puede formularse y/o administrarse en combinación con un segundo agente, tal como un agente inmunosupresor, antiinflamatorio o paliativo. El polipéptido de fusión de la presente invención puede administrarse antes, sustancialmente al mismo tiempo o después de la administración del segundo agente, como un agente inmunosupresor, antiinflamatorio o paliativo. El polipéptido de fusión de la presente invención puede formularse en combinación con el segundo agente, tal como un agente inmunosupresor, antiinflamatorio o paliativo.
Los ejemplos no limitantes de los segundos agentes pueden incluir agentes antiinflamatorios, tales como fármacos antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos (AINE) y productos biológicos antiinflamatorios tales como anticuerpos que limitan o controlan las respuestas o los síntomas inflamatorios. Los segundos agentes y fármacos incluyen corticosteroides inmunosupresores (agonistas del receptor de esteroides) tales como budesonida, prednisona, flunisolida; agentes antiinflamatorios tales como flunisolida hidrofluoroalcano, estrógeno, progesterona, dexametasona y loteprednol; beta-agonistas (por ejemplo, de acción corta o prolongada) tal como bambuterol, formoterol, salmeterol, albuterol; anticolinérgicos tales como bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio, cromolín y agentes bloqueantes de los canales de calcio; antihistamínicos tales como terfenadina, astemizol, hidroxizina, clorfeniramina, tripelenamina, cetirizina, desloratadina, mizolastina, fexofenadina, clorhidrato de olopatadina, norastemizol, levocetirizina, levocabastina, azelastina, ebastina y loratadina; antileucotrienos (por ejemplo, anticisteinil leucotrienos (Cys-LT)) tales como oxatomida, montelukast, zafirlukast y zileutón; inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, subtipo PDE4) tales como ibudilast, cilomilast, BAY 19-8004, teofilina (por ejemplo, de liberación sostenida) y otros derivados de xantina (por ejemplo, doxofilina); antagonistas de tromboxano tales como seratrodast, clorhidrato de ozagrel y ramatrobán; antagonistas de prostaglandinas tales como inhibidores de COX-1 y COX-2 (por ejemplo, celecoxib y rofecoxib), aspirina; y abridores de canales de potasio. Ejemplos adicionales no limitantes de clases de otros agentes y fármacos incluyen agentes antiinflamatorios que son terapias inmunomoduladoras, tales como antagonistas de citocinas proinflamatorias, tales como antagonistas de TNFa (por ejemplo, etanercept, tcc Enbrel™); antagonistas de las células inmunitarias, tales como el agente reductor de linfocitos B rituximab y el bloqueador de la coestimulación de linfocitos T abatacept, que se han usado para tratar la artritis reumatoide, y anticuerpos antiinflamatorios que se unen a citocinas, tales como anti IgE (por ejemplo, rhuMAb-E25 omalizumab) y anti TNFa, IFNy, IL-1, IL-2, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13, IL-16 y factores de crecimiento tal como el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos.
Como se desvela en el presente documento, el método o uso de la presente divulgación que usa el polipéptido de fusión biespecífico puede proporcionar a un sujeto un beneficio terapéutico o una mejora terapéutica detectable o medible.
El beneficio terapéutico o la mejora terapéutica puede ser cualquier beneficio medible o detectable, objetivo o subjetivo, transitorio, temporal o prolongado para el sujeto o una mejora en la respuesta, trastorno o enfermedad, o de uno o más síntomas, trastornos, dolencias, patologías, enfermedades o complicaciones adversas causadas por o asociadas a la respuesta, al trastorno o a la enfermedad no deseable o aberrante. Los beneficios terapéuticos y las mejoras terapéuticas pueden incluir, pero sin limitación, disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar la manifestación, frecuencia, gravedad, progresión o duración de un síntoma adverso de una respuesta, un trastorno o una enfermedad no deseable o aberrante. Los beneficios terapéuticos y las mejoras terapéuticas también pueden incluir, pero sin limitación, disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar o controlar las cantidades o la actividad de la inflamación y las respuestas inflamatorias, tales como linfocitos T, linfocitos B, autoanticuerpos, infiltración o movilización de células inmunitarias, citocinas, linfocinas o quimiocinas proinflamatorias.
De acuerdo con la presente divulgación, a un sujeto se le administra una cantidad eficaz o suficiente del polipéptido de fusión biespecífico. Una "cantidad eficaz" o "cantidad suficiente" se refiere a una cantidad que proporciona, en dosis únicas o múltiples, sola o en combinación con uno o más componentes distintos (un agente terapéutico tal como un fármaco), tratamientos, protocolos o agentes de regímenes terapéuticos, una respuesta detectable de cualquier periodo de tiempo (a largo o corto plazo), un resultado esperado o deseado en un sujeto o un beneficio a un sujeto de cualquier grado medible o detectable o durante cualquier período de tiempo (por ejemplo, durante minutos, horas, días, meses, años, o hasta la curación).
La expresión "cantidad eficaz" o "cantidad suficiente" para el tratamiento (por ejemplo, para mejorar o proporcionar un beneficio terapéutico o una mejora terapéutica), se refiere normalmente a una cantidad eficaz para proporcionar una respuesta, un trastorno o una enfermedad, de uno, múltiples o todos los síntomas adversos, consecuencias o complicaciones de la respuesta, trastorno o enfermedad, uno o más síntomas, trastornos, dolencias, patologías, enfermedades o complicaciones adversas, por ejemplo, las causadas por o asociados a una respuesta, a un trastorno o a una enfermedad inmunitaria, a una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante, a un grado medible, aunque disminuyendo, reduciendo, inhibiendo, suprimiendo, limitando o controlando la progresión o el empeoramiento de la respuesta, trastorno o enfermedad de una célula, tejido u órgano, o un síntoma adverso del mismo, es un resultado satisfactorio.
Aunque no necesariamente, puede proporcionarse una cantidad eficaz o una cantidad suficiente en una sola administración, pueden necesitarse múltiples administraciones, y puede, pero no necesariamente, administrarse sola o en combinación con otra composición (por ejemplo, agente), tratamiento, protocolo o régimen terapéutico. Por ejemplo, la cantidad puede aumentarse proporcionalmente según lo indique la necesidad del sujeto, el tipo, el estado y la gravedad de la respuesta, el trastorno o la enfermedad tratados o los efectos secundarios (si los hubiera) del tratamiento. Además, una cantidad eficaz o una cantidad suficiente no es necesariamente eficaz o suficiente si se administra en dosis únicas o múltiples sin una segunda composición (por ejemplo, otro fármaco o agente), tratamiento, protocolo o régimen terapéutico, ya que pueden incluirse dosis, cantidades o duraciones adicionales por encima y más allá de dichas dosis, o composiciones (por ejemplo, fármacos o agentes), tratamientos, protocolos o regímenes terapéuticos adicionales para se consideren eficaces o suficientes en un sujeto determinado. Las cantidades que se considera que son eficaces también incluyen cantidades que dan como resultado una reducción del uso de otro tratamiento, régimen terapéutico o protocolo.
Como es habitual en los tratamientos, algunos sujetos pueden mostrar una respuesta mayor, o una respuesta menor o nula a un tratamiento dado. Por lo tanto, no es necesario que una cantidad eficaz o suficiente sea eficaz en todos y cada uno de los sujetos tratados, profiláctica o terapéuticamente, ni en la mayoría de los sujetos tratados en un grupo o una población determinados. Una cantidad eficaz o una cantidad suficiente significa eficacia o suficiencia en sujeto particular, no en un grupo o en la población en general. Por consiguiente, las cantidades apropiadas dependerán de la afección tratada, del efecto terapéutico deseado, así como el sujeto individual (por ejemplo, la biodisponibilidad en el sujeto, el género o la edad).
El término "mejorar" se refiere a una mejora detectable o medible en la afección de un sujeto o una respuesta celular subyacente. Una mejora detectable o medible incluye una disminución, reducción, inhibición, supresión, limitación o control subjetivo u objetivo en la manifestación, frecuencia, gravedad, progresión, o duración de la respuesta, trastorno o enfermedad, tal como una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria, o uno o más síntomas, trastornos, dolencias, patologías, enfermedades o complicaciones adversas, no deseables o aberrantes, causadas o asociadas a la respuesta, trastorno o enfermedad, tal como una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante, o una inversión de la respuesta, trastorno o enfermedad, tal como una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable y aberrante. Dichas mejoras también pueden producirse a nivel celular.
Por tanto, un resultado de tratamiento satisfactorio puede conducir a un "efecto terapéutico", o "beneficio" de disminuir, reducir, inhibir, suprimir, limitar, controlar o impedir la manifestación, frecuencia, gravedad, progresión o duración de una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o un enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante, o uno o más síntomas adversos o causas o consecuencias subyacentes de la respuesta, trastorno o enfermedad inmunitaria, una respuesta, trastorno o enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, trastorno o enfermedad, autoinmunitaria no deseable o aberrante en un sujeto. Por lo tanto, se considera que los métodos de tratamiento que afectan a una o más causas subyacentes de la respuesta, el trastorno, la enfermedad o el síntoma adverso, son beneficiosos. Una disminución o reducción del empeoramiento, tal como estabilizar una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante, también es un resultado de tratamiento satisfactorio.
Por lo tanto, un beneficio o una mejora terapéutica no tiene por qué ser la ablación completa de una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante, o uno cualquiera, la mayoría o todos los síntomas, complicaciones, consecuencias o causas subyacentes adversas asociadas a una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante. Por tanto, se puede obtener un criterio de valoración satisfactorio cuando hay una mejora progresiva en la respuesta, trastorno o enfermedad de un sujeto, o una disminución, reducción, inhibición, supresión, limitación, control o prevención parcial en la manifestación, frecuencia, gravedad, progresión, o duración, o inhibición o inversión, de la respuesta, trastorno o enfermedad (por ejemplo, estabilización de uno o más síntomas o complicaciones), tal como una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante, o uno o más síntomas, trastornos, dolencias, patologías, enfermedades o complicaciones adversas causadas por o asociadas a una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria no deseable o aberrante durante un período de tiempo corto o prolongado (horas, días, semanas o meses).
La eficacia de un método o uso, tal como un tratamiento que proporcione un posible beneficio terapéutico o una mejora de una respuesta, un trastorno o enfermedad, tal como una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante, también puede determinarse mediante diversos métodos. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, la medición de puntuaciones de hinchazón, dolor, erupción, cefalea, fiebre, náuseas, diarrea, entumecimiento, letargo, rigidez articular esquelética, falta de movilidad, erupción o daño tisular o celular. La medición de la activación y/o diferenciación de linfocitos T o B, infiltración celular de una región, acumulación o migración celular a una región, producción de anticuerpos, citocinas, linfocinas, quimiocinas, interferones e interleucinas, factores de crecimiento y maduración celular usando diversos ensayos inmunológicos, tales como ELISA. La determinación del grado daño celular, tisular u orgánico puede determinarse mediante TC (tomografía computarizada), RMN, ultrasonidos, imágenes de contraste molecular o imágenes de contraste de ultrasonido molecular. En el caso de las articulaciones esqueléticas, la inflamación puede evaluarse mediante una autoevaluación del paciente, recuentos de articulaciones sensibles y recuentos de articulaciones inflamadas, y la velocidad de sedimentación globular (VSG) o proteína reactiva con (el polisacárido) C (PRC). En el caso del tubo gastrointestinal, la inflamación puede evaluarse, por ejemplo, mediante endoscopia (colonoscopia, gastroscopia, CPRE (colangiopancreatografía retrógrada endoscópica)). En el caso de inflamación del sistema nervioso central (SNC), las células y citocinas en la punción lumbar reflejan inflamación, por ejemplo.
El término "sujeto" se refiere a un animal, normalmente a un animal mamífero, tales como un ser humano, un primate no humano (por ejemplo, mono, gibón, chimpancé, orangután o macaco), un animal de compañía (por ejemplo, perro y gato), un animal de granja (por ejemplo, caballo, vaca, cabra, oveja o cerdo) o un animal de laboratorio (por ejemplo, ratón, rata, conejo o cobaya). Los ejemplos de sujetos pueden incluir modelos de enfermedades animales, por ejemplo, modelos animales de una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante (por ejemplo, ratones con CIA, BXSB, EAE y SCID), para análisis in vivo.
Los ejemplos de sujetos apropiados para el tratamiento pueden incluir los que tienen una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante, los que están en tratamiento por una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante, así como los que se han sometido a tratamiento o terapia por una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante, incluyendo sujetos donde la respuesta, el trastorno o la enfermedad inmunitaria, la respuesta, el trastorno o la enfermedad inflamatoria, la inflamación, la respuesta, el trastorno o la enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante, está en remisión.
Los ejemplos de sujetos pueden incluir los que tienen o están en riesgo de tener cualquiera de: polimiositis, síndrome de vasculitis, arteritis de células gigantes, arteritis de Takayasu, policondritis recidivante, hemofilia A adquirida, enfermedad de Still, enfermedad de Still del adulto, amiloidosis amiloide A, polimialgia reumática, espondiloartritis, hipertensión arterial pulmonar, enfermedad de injerto contra huésped, miocarditis autoinmunitaria, hipersensibilidad por contacto (dermatitis por contacto), enfermedad por reflujo gastroesofágico, eritrodermia, enfermedad de Behcet, esclerosis lateral amiotrófica, trasplante, neuromielitis óptica, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide maligna, artritis reumatoide resistente a fármacos, neuromielitis óptica, enfermedad de Kawasaki, artritis idiopática juvenil poliarticular o sistémica, psoriasis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad de Castleman, asma, asma alérgica, encefalomielitis alérgica, artritis, artritis progresiva crónica, artritis reactiva, artritis psoriásica, artritis enteropática, artritis deformante, enfermedades reumáticas, espondiloartropatías, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, hipersensibilidad (incluida tanto la hipersensibilidad de las vías respiratorias como la hipersensibilidad dérmica), alergias, lupus eritematoso sistémico (LES), lupus eritematoso cutáneo, eritema nudoso leproso, síndrome de Sjogren, trastornos musculares inflamatorios, policondritis, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, síndrome de Steven-Johnson, hepatitis crónica activa, miastenia grave, esprúe idiopático, enfermedad inflamatoria intestinal autoinmunitaria, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, síndrome del intestino irritable, oftalmopatía endocrina, esclerodermia, enfermedad de Grave, sarcoidosis, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, vaginitis, proctitis, diabetes mellitus insulinodependiente, diabetes mellitus resistente a insulina, diabetes juvenil (diabetes mellitus tipo I), trastornos hematológicos autoinmunitarios, anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia eritrocítica pura, trombocitopenia idiopática (TPI), uveítis autoinmunitaria, uveítis (anterior y posterior), queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis primaveral, fibrosis pulmonar intersticial, glomerulonefritis (con y sin síndrome nefrótico), síndrome nefrótico idiopático o nefropatía por cambios mínimos, enfermedad inflamatoria de la piel, inflamación de la córnea, miositis, aflojamiento de implantes óseos, trastorno metabólico, aterosclerosis, dislipidemia, descalcificación ósea, artrosis, osteoporosis, enfermedad periodontal de enfermedades obstructivas o inflamatorias de las vías respiratorias, bronquitis, neumoconiosis, enfisema pulmonar, reacciones inflamatorias agudas e hiperagudas, infecciones agudas, choque séptico, choque endotóxico, síndrome de distrés respiratorio del adulto, meningitis, neumonía, síndrome consuntivo por caquexia, ictus, queratitis estromal herpética, xeroftalmia, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, síndrome de Guillain-Barre, síndrome del hombre rígido, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis autoinmunitaria, encefalomielitis, fiebre reumática aguda, oftalmia simpática, síndrome de Goodpasture, vasculitis necrosante sistémica, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Addison, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, dermatitis herpetiforme, dermatitis atópica, dermatitis eccematosa, úlcera aftosa, liquen plano, alopecia autoinmunitaria, vitíligo, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, anemia perniciosa, hipoacusia neurosensorial, hipoacusia neurosensorial progresiva bilateral idiopática, síndrome poliglandular autoinmunitario tipo I o tipo II, infertilidad inmunitaria o infertilidad inmunomediada.
Los ejemplos de sujetos pueden incluir además a los que tienen un mayor riesgo de tener una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno, una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante. Un sujeto candidato, por ejemplo, tiene una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno, una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante, o se está tratando con una terapia o fármaco para una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno, una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante. Los sujetos candidatos también incluyen sujetos que se beneficiarían o necesitan tratamiento para una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno, una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante.
El sujeto "en riesgo" normalmente puede tener factores de riesgo aumentados para una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno, una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante. Ejemplos particulares de sujetos en riesgo pueden incluir los que han tenido una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno, una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante. Los ejemplos de sujetos en riesgo también pueden incluir aquellos a los que se les prescribió un tratamiento o una terapia para una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno, una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante. Los ejemplos de sujetos en riesgo también pueden incluir aquellos con factores de riesgo tales como antecedentes familiares (por ejemplo, predisposición genética), género, estilo de vida (dieta, tabaquismo), profesión (personal médico y clínico, trabajadores agrícolas y ganaderos) o factores ambientales (exposición a alérgenos).
De acuerdo con la presente divulgación, la composición que comprende el polipéptido de fusión puede envasarse en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. "Forma de dosificación unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas, adecuadas como tratamiento de dosificaciones unitarias; conteniendo cada unidad una cantidad de la composición junto con el transportador, excipiente, diluyente o vehículo, calculada para producir el tratamiento o efecto terapéutico (por ejemplo, beneficioso) deseado. Las formas de dosificación unitaria pueden variar según factores que incluyen, pero sin limitación, la composición particular empleada, el trastorno o enfermedad que se va a tratar, el efecto que se va a lograr y el sujeto que se va a tratar. Las dosis unitarias ilustrativas varían de aproximadamente 25-250, 250-500, 500-1.000, 1.000-2.500, 2.500-5.000, 5.000-25.000 o 5.000-50.000 pg; de aproximadamente 50­ 500, 500-5.000, 5.000-25.000 o 25.000-50.000 ng; de aproximadamente 50-500, 500-5.000, 5.000-25.000 o 25.000­ 50.000 pg; de aproximadamente 25-250, 250-500, 500-1.000, 1.000-2.500, 2.500-5.000, 5.000-25.000 o 5.000­ 50.000 mg; y de aproximadamente 1-5, 5-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100-250, 250-500, 500-1.000, 1.000-2.500 o 2.500-5.000 gramos.
Como se expone en el presente documento, los polipéptidos de fusión y sus composiciones pueden ponerse en contacto o proporcionarse in vitro, ex vivo o administrarse o suministrarse in vivo a un sujeto o paciente en diversas dosis, cantidades y frecuencias. Por ejemplo, para proporcionar el efecto deseado, se puede administrar o suministrar un polipéptido de fusión o una composición del mismo, como dosis única o múltiple, por ejemplo, en una cantidad eficaz o suficiente. Las dosis ilustrativas varían de aproximadamente 25-250, 250-500, 500-1.000, 1.000­ 2.500, 2.500-5.000, 5.000-25.000 o 5.000-50.000 pg/kg; de aproximadamente 50-500, 500-5.000, 5.000-25.000 o 25.000-50.000 ng/kg; de aproximadamente 50-500, 500-5.000, 5.000-25.000 o 25.000-50.000 pg/kg; y de aproximadamente 25-250, 250-500, 500-1.000, 1.000-2.500, 2.500-5.000, 5.000-25.000 o 5.000-50.000 mg/kg, en días consecutivos, en días alternos o de manera intermitente.
Las administraciones únicas o múltiples (por ejemplo, de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces) o dosis de la composición, pueden administrarse en el mismo día o en días consecutivos, en días alternos o de manera intermitente. Por ejemplo, la composición que comprende el polipéptido de fusión puede administrarse una, dos, tres, cuatro o más veces al día, en días alternos, quincenal, semanal, mensual, bimensual o anualmente. La composición que comprende el polipéptido de fusión puede administrarse durante cualquier duración apropiada, por ejemplo, durante un período de 1 hora, o menor, por ejemplo, 30 minutos o menor, 15 minutos o menor, 5 minutos o menor, o 1 minuto o menor.
La composición que comprende el polipéptido de fusión puede administrarse a un sujeto antes de, sustancialmente al mismo tiempo, o en aproximadamente 1-60 minutos, horas (por ejemplo, en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24 horas) o días (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7-14, 14-21, 21-28, 28-45, 45-60 o 60-90 días) de que aparezca un síntoma o una respuesta, un trastorno o una enfermedad inmunitaria, una respuesta, un trastorno o una enfermedad inflamatoria, inflamación, una respuesta, un trastorno o una enfermedad autoinmunitaria no deseable o aberrante.
La composición que comprende el polipéptido de fusión puede administrarse mediante administración sistémica, regional o local, por cualquier vía. Por ejemplo, la composición que comprende el polipéptido de fusión puede administrarse por vía sistémica, regional o local, mediante inyección, infusión, por vía oral (por ejemplo, ingestión o inhalación), tópica, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intracavitaria, intracraneal, transdérmica (tópica), parenteral, por ejemplo, un catéter por vía transmucosa o intrarrectal (enema) o por vía óptica. Los polipéptidos de fusión, las composiciones, los métodos y usos de la divulgación incluyen formulaciones farmacéuticas administradas mediante un sistema de suministro (micro) encapsulado o envasadas en un implante para su administración.
La presente divulgación también proporciona un kit que incluye el polipéptido de fusión (FynomAb) de la invención y envasarse en un material de envasado adecuado. Un kit puede incluir opcionalmente una etiqueta o un prospecto que incluya una descripción de los componentes o instrucciones de uso in vitro, in vivo o ex vivo, de los componentes que contiene. Como ejemplos de instrucciones se incluyen instrucciones para un método, protocolo de tratamiento o régimen terapéutico.
Un kit puede contener un conjunto de componentes, por ejemplo, dos o más composiciones, comprendiendo cada una de ellas un polipéptido de fusión biespecífico diferente, o una composición que comprenda un polipéptido de fusión biespecífico y una composición que comprenda otra composición terapéuticamente útil (por ejemplo, un fármaco antiproliferativo o inmunopotenciador). La expresión "material de envasado" se refiere a una estructura física que contiene los componentes del kit. El material de envasado puede conservar los componentes de forma estéril y puede estar fabricado de material comúnmente usado para dichos fines (por ejemplo, papel, fibra ondulada, vidrio, plástico, papel de aluminio, ampollas, viales o tubos).
El kit puede incluir una etiqueta o un prospecto. La etiqueta o el prospecto puede ser un "material impreso", por ejemplo, papel o cartón, o puede estar separado o fijado a un componente, a un kit o a un material de envasado (por ejemplo, una caja), o unido a una ampolla, a un tubo o a un vial que contenga un componente del kit. La etiqueta o el prospecto puede ser un medio legible por ordenador, un disco óptico tal como CD o DVD-ROM/RAM, dVd , MP3, una cinta magnética, o un medio de almacenamiento eléctrico, tal como RAM y ROM o híbridos de estos, tales como medios de almacenamiento magnético/óptico, medios FLASH de tarjetas de tipo memoria.
La etiqueta o el prospecto puede incluir información de identificación de uno o más componentes en el mismo, cantidades de dosis, farmacología clínica del (de los) principio(s) activo(s), incluido el mecanismo de acción, la farmacocinética (FC) y la farmacodinámica (FD). Las etiquetas o prospectos pueden incluir información de identificación del fabricante, números de lote, ubicación y fecha del fabricante.
La etiqueta o el prospecto puede incluir información sobre una afección, un trastorno, una enfermedad o un síntoma para el que se pueda usar un componente del kit. Las etiquetas o prospectos pueden incluir instrucciones para el médico o para un sujeto sobre el uso de uno o más de los componentes del kit en un método, protocolo de tratamiento o régimen terapéutico. Las instrucciones pueden incluir cantidades, frecuencia o duración de la dosificación, e instrucciones para poner en práctica cualquiera de los métodos, protocolos de tratamiento o regímenes terapéuticos establecidos en el presente documento. Por lo tanto, los kits de la divulgación pueden incluir adicionalmente una etiqueta o instrucción para poner en práctica cualquiera de los métodos y usos de la invención descritos en el presente documento.
La etiqueta o el prospecto puede incluir información sobre cualquier beneficio que pueda proporcionar un componente, tal como un beneficio profiláctico o terapéutico. La etiqueta o el prospecto puede incluir información sobre posibles efectos secundarios adversos, tales como advertencias al sujeto o al médico con respecto a situaciones en las que no sería apropiado usar una composición en particular. Los efectos secundarios adversos también pueden producirse cuando el sujeto tiene, estará o está tomando actualmente uno o más medicamentos distintos que pueden ser incompatibles con la composición, o cuando el sujeto tiene, estará o está actualmente en otro protocolo de tratamiento o régimen terapéutico que sería incompatible con la composición y, por lo tanto, las instrucciones pueden incluir información sobre dichas incompatibilidades.
El kit puede incluir además otros componentes. Cada componente del kit puede incluirse en un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden incluirse en un solo envase. Los kits de la invención pueden diseñarse para su conservación en frío. Los kits de la invención pueden diseñarse además para que contengan células hospedadoras que expresen los polipéptidos de fusión de la invención, o para que contengan los ácidos nucleicos que codifiquen los polipéptidos de fusión. Las células del kit se pueden mantener en condiciones de conservación apropiadas hasta que estén listas para usarse. Por ejemplo, un kit que incluye una o más células puede contener un medio de conservación de células apropiado para que las células se puedan descongelar y cultivar.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, en el presente documento se describen métodos y materiales adecuados.
Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido de fusión (FynomAb)" o a "una diana (por ejemplo, IL-17a o IL-6R)", puede incluir uno o una pluralidad de dichos polipéptidos de fusión, dianas, y así sucesivamente.
Como se usa en el presente documento, los valores numéricos se presentan frecuentemente en un formato de intervalo a lo largo de este documento. El uso de un formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la divulgación a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por consiguiente, un intervalo incluye expresamente todos los posibles subintervalos, todos los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo, y todos los valores numéricos o intervalos numéricos incluidos los números enteros dentro de dichos intervalos y fracciones de los valores o los números enteros dentro de los intervalos a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Esta construcción se aplica independientemente de la amplitud del intervalo y en todos los contextos a lo largo de este documento de patente. Por tanto, por ejemplo, la referencia a un intervalo de 90-100 % incluye 91-99 %, 92-98 %, 93-95 %, 91­ 98 %, 91-97 %, 91-96 %, 91-95 %, 91-94 %, 91-93 % y así sucesivamente. La referencia a un intervalo de 90-100 % también incluye 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 95 %, 97 %, etc., así como 91,1 %, 91,2 %, 91,3 %, 91,4 %, 91,5 %, etc., 92,1 %, 92,2 %, 92,3 %, 92,4 %, 92,5 % y así sucesivamente.
Además, la referencia a un intervalo de 1-5.000 veces incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 veces, etc., así como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, veces, etc., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, veces, etc., y cualquier intervalo numérico dentro de dichos intervalos, tal como 1-2, 5-10, 10-50, 50-100, 100-500, 100-1000, 500-1000, 1000-2000, 1000-5000, etc. En un ejemplo adicional, la referencia a un intervalo de una KD de 10-5 M a aproximadamente una KD de 10-13 M, incluye cualquier valor numérico o intervalo dentro o abarcando dichos valores.
A lo largo de este documento también se desvela una serie de intervalos usados en el presente documento. El uso de una serie de intervalos incluye combinaciones de los intervalos superior e inferior para proporcionar otro intervalo. Esta construcción se aplica independientemente de la amplitud del intervalo y en todos los contextos a lo largo de este documento de patente. Por tanto, por ejemplo, la referencia a una serie de intervalos tales como 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, etc., incluye intervalos tales como 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 5­ 75, 5-100, 5-150, 5-200 y 10-30, 10-40, 10-50, 10-75, 10-100, 10-150, 10-171 y 20-40, 20-50, 20-75, 20-100, 20-150, 20-200, y así sucesivamente.
En el presente documento la invención se desvela en general usando un lenguaje afirmativo para describir las numerosas realizaciones. La divulgación también incluye específicamente realizaciones en las que se excluye una materia de estudio particular, en su totalidad o en parte, tal como sustancias o materiales, etapas y condiciones del método, protocolos, procedimientos, ensayos o análisis. Por tanto, aunque en la divulgación no se expresa generalmente en términos de lo que esta no incluye en el presente documento se divulgan aspectos que no se incluyen expresamente en la divulgación.
Se han descrito diversas realizaciones de la invención. No obstante, se entenderá que pueden realizarse diversas modificaciones. Por consiguiente, los siguientes ejemplos pretenden ser ilustrativos y no limitativos. El alcance de la invención se define en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1
Los polipéptidos de la invención, procedentes de SH3 Fyn (dominio SH3 (del inglés Src Homology 3, dominio de homología 3 de Src) de la proteína Fyn)), se unen a IL-17A tal como se determina mediante ensayo ELISA con lisado monoclonal.
Método
El proceso para producir fynómeros que se unan a IL-17a se describe en el documento PCT/EP2013/069481. En resumen, usando como antígeno IL-17A recombinante (R&D Systems), se aislaron proteínas de unión procedentes de SH3 Fyn específicas de IL-17A y presentación en fagos estándar como tecnología de selección (Grabulovski D. et al., (2007) J Biol Chem 282, págs. 3196-3204, Viti, F. et al. (2000) Methods Enzymol. 326, 480-505). Durante el proceso de selección, el polipéptido de la invención, 1L3-B09, procedente de SH3 Fyn que lleva la secuencia n-srcbucle "STHEYE", se enriqueció. 1L3-B09 se unió a IL-17A y se descubrió que inhibía tanto a la IL-17A glucosilada como a la IL-17A no glucosilada. Para obtener proteínas de unión a IL-17A procedentes de SH3 Fyn con mayores afinidades, se usó 1L3-B09 como molde para la maduración por afinidad. La secuencia n-src-bucle "STHEYE" se mantuvo constante y se combinó con un repertorio de RT-bucle aleatorizado (6 restos de aminoácido designados como (X1) (X2) (X3) (X4) (X5) (X6)). El proceso de generación de la biblioteca de maduración por afinidad fue esencialmente el mismo que el descrito para la clonación de la biblioteca intacta con un RT-bucle aleatorizado ("biblioteca 0" en Schlatter et al. (2012) mAbs, 4(4) págs. 497-50).
Después de selecciones intactas y de maduración por afinidad, los polipéptidos procedentes de SH3 Fyn enriquecidos se exploraron para determinar la unión a IL-17A mediante ELISA con lisado. El ADN que codifica las proteínas de unión procedentes de SH3 Fyn, se clonó en el vector de expresión bacteriano pQE12 (Qiagen) de modo que las construcciones resultantes llevaran una etiqueta de myc-hexahistidina en el extremo C como se describe en Grabulovski et al. (Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, págs. 3196-3204). Los polipéptidos se expresaron en el citosol de bacterias E. coli en un formato de 96 pocillos y se prepararon 200 ^l de lisado limpio por pocillo como se describe en Bertschinger. et al. (Bertschinger et al. (2007) Protein Eng Des Sel 20 (2): págs. 57-68). Brevemente, las colonias bacterianas transformadas se recogieron de la placa de agar y se cultivaron en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (Nunc, n.° de cat. 163320) en 200 ^l de medio 2xYT que contenía 100 pg/ml de ampicilina y glucosa al 0,1 % (p/v). La expresión proteica se indujo después del cultivo durante 3 h a 37 °C y a 200 r.p.m. añadiendo IPTG 1 mM (Applichem, Alemania). Las proteínas se expresaron durante la noche en un agitador rotatorio (200 r.p.m., a 30 °C). Posteriormente, la placa de 96 pocillos se centrifugó a 1800 g durante 10 min y se descartó el sobrenadante. Los sedimentos bacterianos se resuspendieron en 200 ^l de tampón de lisis (NaH2PO450 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, pH 8,0) que contenía 1 mg/ml de lisozima y se dejaron en hielo durante 30 min. A continuación, las células bacterianas se sometieron a lisis en un baño ultrasónico con agua (seis ráfagas durante 10 s) y después se centrifugaron a 1800 g durante 10 min. Para el ELISA se usaron lisados bacterianos monoclonales: la IL-17A biotinilada (producida internamente en células HEK EBNA, la biotinilación se realizó con NHS-PEO4-biotina (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante) se inmovilizó en pocillos recubiertos con estreptavidina (StreptaWells, High Bind, Roche), y después de bloquear con PBS, se aplicó leche al 2 % (Rapilait, Migros, Suiza), 50 ^l de PBS, leche al 4 % que contenía 6 ^g/ml de anticuerpo anti myc 9E10 (concentración final 3 ^g/ml) y 50 ^l de lisado bacteriano. Después de incubar durante 1 h y de lavar, los polipéptidos procedentes de SH3 Fyn unidos, se detectaron con un anticuerpo anti ratón conjugado con HRP (horseradish peroxidase, peroxidasa de rábano picante) (Sigma). La detección de la actividad peroxidasa se realizó añadiendo sustrato BM blue POD (Roche) y la reacción se detuvo añadiendo H2SO4 1 M. La secuencia de ADN de las proteínas de unión específicas, se verificó mediante secuenciación de ADN.
Resultados
Las secuencias de siete secuencias de fynómeros de unión a IL-17A (SEC ID NO: 1-7) representativas son las siguientes:
SEQ ID NO;1 (1L3-B9);
GVTLFVALYDYANHGNRDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q; .
SEQ ID NO;2(11L0-C06);
GVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q;
SEQ ID NO;3 (11L5-B06):
GVTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q;
SEQ ID NO:4 (11L6-F03):
GVTLFVALYD YD KLSALD LSFH KG EKFQ ILSTH EYED W W EAR SLTTG ETG YIPSN YVAPVD SI
Q;
SEQ ID NO:5(11L9-C09):
GVTLFVALYDYESVSW SDLSFHKGEKFQILSTHEYEDW W EARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSI
Q;
SEQ ID NO:6 (11L10-A05):
GVTLFVALYDYSSRG VLDLSFHKG EKFQ ILSTHEYEDW W EARSLTTG ETG YIPSNYVAPVDSI
Q; Y
SEQ ID NO:7(11L11-A09):
G VTLFVALYDYSRKSNLDLSFHKG EKFQ ILSTHEYEDW W EARSLTTG ETG YIPSNYVAPVDSI
Q.
Se crearon ocho (8) fusiones diferentes de fynómero-anticuerpo (FynomAb) fusionando cuatro (4) fynómeros distintos de unión a anti IL-17A con el extremo C de la cadena pesada (COVA801, COVA803, COVA8 O5 , COVA807) o con el extremo C de la cadena ligera (COVA802, COVA804, COVA806, COVA808) de un anticuerpo de unión a IL-6R, tocilizumab (véase la Tabla 1).
T l 1 D ri i n l F n mA
Figure imgf000035_0001
Los estudios evalúan las características bioquímicas y funcionales, así como las propiedades farmacocinéticas de estos diferentes FynomAb. Se evaluaron varios lotes diferentes de los FynomAb COVA801-808. Los FynomAb se produjeron a partir de transfecciones transitorias o estables de células CHO. Los estudios FC de los FynomAb de ratones y monos cangrejeros (cyno) se produjeron a partir de líneas celulares CHO estables.
Ejemplo 2
Expresión y purificación de proteínas
En los estudios que se documentan a continuación, se prepararon y evaluaron cuatro lotes distintos de los FynomAb. Dos lotes de material procedían de células CHO transfectadas de forma transitoria. Los lotes de material generado internamente procedían de grupos de CHO estables usando los vectores de expresión de Lonza como se describe a continuación.
Las secuencias de cadena pesada y ligera de Actemra (tocilizumab) se obtuvieron de la base de datos CAS y también se confirmaron como Secuencia n.° 15 en el documento US 2011/0076275 A1. Se realizó una modificación en la secuencia para mutar los aminoácidos 356-358 DEL a EEM. Esta es una mutación del alotipo G1m1 al nG1m1 y posiblemente podría reducir la inmunogenicidad.
Secuencia de la cadena pesada de Actemra (tocilizumab) (SEQ ID NO: 8) (las CDR se indican en negrita)
1 QVQLQESGPG LVRPSQTLSL TCTVSGYSIT SDHAWSWVRQ PPGRGLEWIG
51 YISYSGITTY NPSLKSRVTM LRDTSKNQFS LRLSSVTAAD TAVYYCARSL
101 ARTTAMDYWG QGSLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD
151 YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LY S LS S W T V PSSSLGTQTY
201 ICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK
251 DTLM ISRTPE VTCVW DVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
3 01 TYR W S V LTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL P A P IE K T IS K AKGQPREPQV
351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG*
Secuencia de la cadena ligera de Actemra (tocilizumab) (SEQ ID NO: 9) (las CDR se indican en negrita)
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS SYLNWYQQKP G K A P K L L IY Y
51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD F T F T IS S L Q P EDIATYYCQ Q GNTLPYTFGQ
101 G TK V E IK R T V A A P S V F IF P P SDEQLKSGTA S W C L L N N F Y PREAKVQWKV
151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD S TY S LS S TLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
201 LSSPVTKSFN RGEC*
Estas secuencias de las cadenas ligera y pesada de tocilizumab, se optimizaron con respecto a sus codones para la expresión en CHO y se sintetizaron los genes. Se añadieron secuencias señal en los extremos 5' de cada gen (Hc ss = MEWSWVFLFFLSVTTGVHS; Lc ss = MSVPTQVLGLLLLWLTDARC). Las proteínas de fusión FynomAb se construyeron colocando cada una de las cuatro secuencias de fynómeros en el extremo C de la cadena pesada o ligera de tocilizumab, con un enlazador de 15 aminoácidos en el medio (GGGGSx3). Esto creó los genes necesarios para generar ocho FynomAb. Los genes sintetizados se clonaron en los vectores pEE 12.4 (cadena pesada) y 6.4 (cadena ligera) de Lonza. Después, estos vectores se combinaron para fabricar un solo vector de expresión para expresar las combinaciones de cadenas pesadas y ligeras de tocilizumab y las ocho moléculas de FynomAb.
T l 2 D ri i n l F n mA n n i f n m r
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Con ADN linealizado de cada uno de los ocho vectores FynomAb y tocilizumab, se nucleofectaron células CHO-K1-SV (Amaxa). Estas células se pusieron en selección MSX y se cultivaron en pares de matraces estáticos hasta que se recuperaron los cultivos. Una vez que las células se recuperaron, se transfirieron a matraces de agitación y se congelaron o expandieron inmediatamente a matraces de producción para la expresión de proteínas a gran escala. Las primeras rondas de los matraces de producción se purificaron para generar material para el estudio FC con ratones interno y para su uso en los ensayos realizados in vitro. Los cultivos congelados de estos mismos grupos se descongelaron y expandieron posteriormente cuando se necesitó más proteína para los estudios FC con monos cangrejeros.
Los niveles de expresión se cuantificaron mediante AlphaLISA y transferencia Western. Los niveles de expresión de los grupos estables variaban aproximadamente entre 100 y 500 mg/l. Los matraces de producción se cultivaron durante diez días antes de la recogida, filtración y congelación con inhibidores de proteasa. Algunos grupos de baja expresión se "capturaron en frío" y se clasificaron: el anticuerpo presente en las superficies celulares se tiñó y después las células se clasificaron mediante citometría de flujo para capturar las células de mayor producción para su cultivo y producción. Los sobrenadantes de los grupos estables (0,5 - 8,0 l) se filtraron a través de un filtro de vacío de 0,2 |jM en el momento de la recogida y antes de congelarlos o conservarlos a 4 °C, se añadieron comprimidos inhibidores de proteasa (Sigma, n.° de cat. P2714, 1 comprimido/100 ml de sobrenadante).
Los sobrenadantes de todas las líneas celulares de producción de FynomAb, se purificaron inicialmente en condiciones asépticas usando columnas HiTrap MabSelect SuRe (columnas de 1 o 5 ml; a veces múltiples en tándem) cargadas a un caudal de 5-20 ml/minuto. Las columnas se lavaron con PBS hasta que se alcanzó una lectura de referencia de A280, seguido de elución con glicina, pH 3,0.
En la Tabla 3 se enumeran los diferentes lotes del material estable de CHO fabricados para cada FynomAb junto con los rendimientos de proteínas.
T l r n imi n r i l F n mA iliz m
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Ejemplo 3
Análisis de SDS-PAGE
El análisis de SDS-PAGE se realizó en tres lotes distintos de cada FynomAb y tocilizumab. Cinco microgramos de cada proteína se sometieron a electroforesis en condiciones tanto reductoras como no reductoras en geles en gradiente de Tris-glicina al 4-20 % usando una muestra de SDS de Tris-glicina y tampones de ejecución. Los geles se tiñeron durante la noche con azul brillante de Coomassie (SimplyBlue SafeStain, Invitrogen) y se destiñeron hasta que quedaron suficientemente transparentes con agua destilada. Los resultados se muestran en la Figura 1 (análisis de s Ds -PAGE de material CHO transitorio) y en las Figuras 2 y 3 (análisis de SDS-PAGE de material CHO estable preparado para el estudio FC en ratón).
Ejemplo 4
HPLC-SEC analítica
Tres lotes distintos de FynomAb se evaluaron mediante HPLC-SEC (siglas del inglés high-performance liquid chromatography-size exclusión chromatography, cromatografía líquida de alto rendimiento combinada con cromatografía de exclusión por tamaño) analítica. Un lote de material CHO transitorio y los otros dos lotes, se produjeron internamente a partir de líneas celulares CHO transfectadas de manera estable. En una columna Zenix-C SEC-300 (Sepax Technologies) se inyectaron diez microgramos de cada proteína FynomAb usando PBS como fase móvil con un caudal de 1 ml/min. La absorbancia se controló a un valor de A280. En comparación con Actemra, la presencia del fynómero retrasa la elución de los FynomAb a diversos grados, presumiblemente debido a una interacción secundaria entre la fase sólida y los fynómeros. La agregación soluble se observó como picos que eluían antes que el pico principal del FynomAb, y era más evidente en las construcciones de fusión de cadenas pesadas COVA801, COVA803, COVA805 y COVA807.
Las fusiones de cadenas ligeras (FynomAb COVA802, COVA804, COVA806 y COVA808) tenían perfiles de SEC mucho más claros, sin observarse agregación en los FynomAb COVA804 o COVA806. Estos datos son coherentes con datos anteriores, que también mostraron que las fusiones de cadenas ligeras tenían perfiles de SEC más claros con una agregación soluble menos aparente.
Ejemplo 5
Mediciones de afinidad de la IL-17A humana y del IL-6R humano
Para determinar la afinidad y los parámetros cinéticos de la unión de FynomAb a la IL-17A humana y al IL-6R humano, un anticuerpo anti ser humano se acopló con amina a un chip de GLM. Después, los FynomAb COVA801-808 o los anticuerpos de control se capturaron como ligando, y se hizo fluir la IL-17A o el IL-6R como analito. Se utilizó PBST como fase móvil y la regeneración se logró con dos inyecciones de 15 segundos de HCl 100 mM. Secukinumab se usó como control positivo para la unión de la IL-17A y como control negativo para la unión del IL-6R. Tocilizumab y/o Actemra se usaron como controles positivos para la unión del IL-6R y como controles negativos para la unión de la IL-17-A.
Secukinumab se usó como control positivo para la unión de la IL-17A y como control negativo para la unión del IL-6R. Las cadenas VH y VL de Secukinumab son las siguientes:
Cadena ligera variable (SEQ ID NO: 33)
Secuencia señal (subrayada), dominio variable (kappa) (en negrita)
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQ
APRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPCTFGQGTRLE
IKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASW CLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDS
KDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC *
Cadena pesada variable (SEQ ID NO: 34)
Secuencia señal (subrayada), dominio variable (kappa) (en negrita)
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKG
LEWVAAINQDGSEKYYVGSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDYYDILTDY
YIHYW YFDLW GRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NS
G ALTSG VH TFPAVLQ SSG LYSLSSW TVPSSSLG TQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT
HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHN
AKT KPRE EQ YNS T Y R W S V L T VLHQD WLNGKE YKC K V S N K A LP A P IE K T IS KAKGQ PRE PQVY
TLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Tocilizumab y/o Actemra se usaron como control positivo para la unión del IL-6R y como controles negativos para la unión de la IL-17-A.
Unión de la IL-17A
En la Figura 4 se muestran sensogramas representativos de la unión de la IL-17A por los FynomAb COVA801-808, así como de secukinumab (control positivo y de referencia) y tocilizumab o Actemra (controles negativos). En la Tabla 4 se muestra un resumen de los datos de la cinética de unión de múltiples estudios para múltiples lotes de cada FynomAb y secukinumab. Los sensogramas que se muestran son de COVA801-808, de lotes distintos de tocilizumab (toc), de Actemra comercial y de secukinumab (sec).
La cinética de ajuste está bastante de acuerdo con otros valores de datos, y la mayoría de las construcciones tienen una KD aparente similar a la de secukinumab. La evaluación de la unión a la IL17A se confunde por la asociación compleja con los FynomAb, como se observa por una desviación significativa de la unión 1: 1 en los conjuntos de datos de FynomAb, pero no en el conjunto de datos de secukinumab. Parece que se produce una re-unión significativa de la IL-17A que se observa más fácilmente con una fase de disociación prolongada. Por tanto, los valores cinéticos y de afinidad comunicados de la interacción FynomAb/IL-17A deben interpretarse con cuidado. Aunque COVA807 y COVA808 tenían valores de KD más bajos, la desviación significativa de la unión 1: 1 de IL-17A por estos dos FynomAb puede explicar su aparente mayor afinidad. Se observa una actividad funcional inferior del FynomAb COVA807 en el ensayo funcional con IL-17A (véanse más adelante los datos del ensayo funcional con IL-17A de HT29).
Tabla 4: Resumen de datos mediante SPR (siglas del inglés, resonancia de plasmón superficial) de la unión F n mA n l IL-1 A h m n
Figure imgf000039_0001
Debido a la asociación compleja de las construcciones de FynomAb con el homodímero de IL-17A recombinante, se realizó un ELISA de unión sencillo para estudiar la especificidad y las afinidades relativas de COVA804 y COVA806 por la IL-17A humana. Brevemente, una placa ELISA se recubrió con 1 pg/ml de IL-17A humana recombinante en PBS, seguido de bloqueo con BSA e incubación con 0-10 pg/ml de anticuerpo de ensayo o FynomAb. Se usó un anticuerpo de cabra anti ser humano conjugado con peroxidasa de rábano picante para detectar la unión usando TMB. Los resultados de la unión de la respuesta a la concentración a IL-17A fueron sumamente reproducibles en cuatro estudios, mostrándose un estudio representativo en la Figura 5. La unión a la IL-17A humana se evaluó mediante ELISA para COVA804 (804), COVA806 (806) y secukinumab (sec). Actemra se usó como control negativo para la unión a la IL-17A. Los valores de CE50 de las diferentes construcciones fueron los siguientes: secukinumab = 0,36 ± 0,12 nM; COVA804 = 1,02±0,24 nM; COVA806 = 0,98±0,23 nM. Por tanto, estos datos confirman los datos de SPR que demuestran que los FynomAb COVA804 y COVA806 tienen una afinidad similar a la secukinumab por IL-17A.
Unión al IL-6R
En la Figura 6 se muestran sensogramas representativos de la unión del IL-6R por los FynomAb COVA801-808, así como de tocilizumab y Actemra (controles positivos y de referencia) y secukinumab (control negativo). La evaluación de la interacción entre FynomAb/IL6R mediante SPR es muy reproducible, y la interacción se puede modelar fácilmente con un ajuste de Langmuir clásico como se muestra en la Figura 6. Los sensogramas que se muestran son de COVA801-808, de lotes distintos de tocilizumab (toc), de Actemra comercial y de secukinumab (sec). En la Tabla 5 se muestra un resumen de los datos de la cinética de unión de múltiples estudios para múltiples lotes de cada FynomAb y tocilizumab. Estos datos muestran que la presencia de los Fynómeros en los extremos C de la cadena ligera o pesada no afecta a la unión del IL-6R con el anticuerpo precursor. Todos los FynomAb muestran una cinética de unión muy similar entre sí y con el anticuerpo precursor tocilizumab.
Tabla 5: Resumen de datos mediante SPR (siglas del inglés, resonancia de plasmón superficial) de la unión F n mA n l IL- R h m n
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Ejemplo 6
Ensayo de inhibición con IL-17A en HT-29
Para evaluar la actividad biológica de los FynomAb COVA801-808 contra la IL-17A humana, células HT-29 (ATCC, n.° HTB-38) se estimularon con IL-17A (1,9 nM) en presencia de diversas concentraciones de cada FynomAb, que variaban de 100 nM a 6 pM. Para el bloqueo de la función de IL-17A, secukinumab se usó como control positivo. Para cada condición, se añadieron 20.000 células viables y se incubaron durante 48 horas en una placa de 96 pocillos de fondo plano a 37 °C y con CO2 al 5 %. Cada condición se analizó por duplicado.
La estimulación de las células HT29 con IL17A dio como resultado la producción y liberación de Groa en el sobrenadante celular. A continuación, se midieron las concentraciones de Groa en los sobrenadantes mediante ELISA, usando el kit ELISA DuoSet de R&D Systems (DY275). El ELISA se realizó de acuerdo con el manual del fabricante (excepto que todos los anticuerpos se usaron a 1: 200).
Las medias de los resultados por duplicado se representaron gráficamente con las desviaciones estándar y los valores de CI50 se calcularon usando una función de inhibición de respuesta a la dosis de cuatro parámetros en GraphPad Prism®. En las Figuras 7-9 se muestran datos representativos de múltiples estudios usando tres lotes diferentes de los FynomAb COVA801-808. En la Tabla 6 se muestran los valores de CI50 calculados a partir de los datos representativos. Todos los FynomAb mostraron actividad similar contra IL-17A al igual que el secukinumab de referencia, y todos los FynomAb pudieron lograr un bloqueo completo a concentraciones más altas. COVA806 mostró regularmente la actividad más fuerte contra IL-17A y fue regularmente más fuerte que secukinumab.
Tabla 6A
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Tabla 6B
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Tabla 6C
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Ejemplo 7
Ensayo de inhibición de IL-6R en HEK-Blue™
Para evaluar la actividad biológica de la parte anti IL-6R en las construcciones COVA801-808, se estimularon células HEK Blue sensibles a IL-6 (Invivogen, hkb-il6) con IL-6 (15 pM) en presencia de diversas concentraciones de FynomAb, que variaban de 500 nM a 0,2 nM. Antes de la adición de IL-6, los inhibidores se preincubaron con las células durante 30 minutos. Como controles, se usó solo medio, o medio que contenía IL-6 (15 pM). Además, como control positivo para el bloqueo de IL-6R, se usó tocilizumab o Actemra. Para cada muestra, se añadieron 50.000 células viables y se incubaron durante 20-24 horas en un pocillo de una placa de 96 pocillos a 37 °C, con CO2 al 5 %. Cada condición se analizó por triplicado.
La adición de IL-6 a las células dio como resultado la estimulación de la ruta de señalización de IL-6R, que activó el gen indicador de SEAP (fosfatasa alcalina embrionaria secretada) inducible por STAT3. En los sobrenadantes, la SEAP se midió usando el reactivo de detección HEK-Blue™ (Invivogen, hb-det2), usado de acuerdo con el manual del fabricante.
Las medias de los resultados se representaron gráficamente por triplicado, con la desviación estándar. Los valores de CI50 se calcularon utilizando una función de inhibición de respuesta a la dosis de cuatro parámetros en GraphPad Prism®. Más adelante, en las Figuras 10-12, se muestran datos representativos de múltiples estudios usando tres lotes diferentes de los FynomAb COVA801-808. En la Tabla 7 se muestran los valores de CI50 calculados a partir de los datos representativos. Todos los FynomAb de los tres lotes mostraron un bloqueo de IL-6R similar al de Actemra y tocilizumab de calidad comercial. Estos datos son similares a otros datos e indican que la presencia de los fynómeros de unión a IL-17A en la cadena principal del Ab tocilizumab, no afecta a la actividad de bloqueo de IL-6R de estos FynomAb.
Tabla 7A
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Tabla 7B
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Tabla 7C
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Ejemplo 8
Ensayo de estabilidad en suero
Para evaluar la estabilidad de cada FynomAb en suero humano, cada uno de los FynomAb COVA801-808, se incubó en suero humano al 90 % (Sigma n.° H4522) durante 6 días a 37 °C a una concentración de 10 |jg/ml, y después se analizó en un ensayo ELISA de tipo sándwich para evaluar si los FynomAb conservaban su capacidad para unirse tanto a IL-17A como a IL-6R. Para evaluar la unión simultánea de los FynomAb después de la incubación en PBS o en suero humano, se usó un ensayo ELISA de tipo sándwich. En la Figura 13 se muestra la configuración del ensayo ELISA de tipo sándwich.
Brevemente, Una placa Maxisorp de 96 pocillos se recubrió con 5 jg/ml de IL17A humana en PBS, y las muestras de FynomAb se diluyeron 5 veces en BSA/PBST al 1 % de 50 nM a 0,003 nM y se añadieron a las placas. A continuación, a cada pocillo que contenía los FynomAb, se añadió IL-6R humano marcado con His y se reveló con un mAb (anticuerpo monoclonal) anti His conjugado con HRP. Después, la placa se lavó y se reveló usando sustrato TMB (Sigma n.° T0440) y la reacción se detuvo con ácido. Las medias de los resultados por triplicado se representaron gráficamente junto con las desviaciones estándar (véase la Figura 14).
Con más detalle, los FynomAb COVA801-808 se incubaron en las siguientes condiciones (a-d), y después se evaluó la retención de la doble actividad de unión en el ensayo ELISA descrito en la Figura 10: a) dilución en PBS e inmediatamente evaluada (PBS día 0), b) dilución en PBS y conservada durante 6 días a 4 °C (PBS día 6), c) dilución en suero humano al 90 % e inmediatamente evaluada (suero humano día 0), d) dilución en suero humano al 90 % e incubada durante 6 días a 37 °C (suero humano día 6).
Durante 6 días, se incubó un conjunto distinto de muestras de control a 4 °C en PBS (PBS día 6). Otro conjunto de muestras de control se diluyó en suero humano y se usó inmediatamente en el ensayo (suero humano día 0). El propósito de las muestras de suero humano del día 0 fue evaluar si la presencia de suero humano afectaría a la capacidad de FynomAb para unirse a sus dos dianas simultáneamente. Como se muestra en la Figura 14, la conservación de los FynomAb en suero humano durante 6 días, no disminuyó su actividad de unión (en comparación con el día 0 en suero humano), lo que sugiere que los 8 FynomAb son estables en suero humano. Como se muestra en la Figura 15, la doble actividad de unión de COVA804 y COVA806 no se vio afectada en presencia de suero humano.
Ejemplo 9
Unión simultánea de IL-6R e IL-17A
Los datos indicaron que los FynomAb COVA801-808 fueron capaces de unirse simultáneamente a la IL-17A humana y al IL-6R humano.
Para demostrar que los FynomAb COVA801-808 podían unirse simultáneamente al IL-6R en la superficie celular y a la IL-17A soluble, se realizó un ensayo de citometría de flujo basado en células. En este ensayo, se usaron células HEK Blue sensibles a IL-6 que expresaban el IL-6R humano en la superficie (Invivogen hkb-il6). Brevemente, cada uno de los FynomAb COVA801-808 (o controles) se incubaron durante 60 minutos con células HEK-Blue IL-6 (o células HEK-293 como control negativo) a diversas concentraciones que variaban de 300 nM a 5 pM. Después de esta incubación primaria, la unión de las construcciones con el IL-6R se detectó usando un anticuerpo anti IgG humana conjugado con el fluoróforo Alexa488 (Invitrogen A11013).
Los resultados se muestran en la Figura 16. Se incubaron células HEK-Blue-IL6 (IL6R+) o células HEK-293 (IL6R-) con los FynomAb indicados, seguido de incubación con un anticuerpo anti IgG humana con jugado con Alexa488 para detectar los FynomAb unidos a la superficie celular o con IL-17A biotinilada más estreptavidina APC para evaluar la unión simultánea. Se usó tocilizumab como control positivo para la unión de IL-6R y como control negativo para la unión de IL-17A.
Los datos de la Figura 16 A, C, E, G, I, K, M y O, muestran que las 8 construcciones de FynomAb, así como el tocilizumab, se unen a células HEK-Blue IL-6 que expresan el IL-6R humano en la superficie celular, pero ninguna de las construcciones se une a células HEK-293 de control que no expresan el IL-6R humano en la superficie celular. Para detectar la unión simultánea al IL-6R en la superficie celular y a la IL-17A humana soluble, se realizó un estudio distinto en el que después de la incubación primaria con cada construcción se realizó una incubación secundaria con la IL-17A biotinilada (R&D 317-ILB) seguido de incubación con estreptavidina-aloficocianina (APC; eBioscience 17-4317). Como se muestra en la Figura 16 B, D, F, H, J, L y P, los 8 FynomAb mostraron unión simultánea al IL-6R en la superficie celular y a la IL-17A soluble. Como se esperaba, tocilizumab pudo unirse al IL-6R expresado en la superficie de las células HEK Blue sensibles a IL-6 pero no se unió a la IL-17A soluble.
Ejemplo 10
Actividad funcional de FynomAb biespecíficos en presencia de IL-17A e IL-6R
Los datos de las Figuras 15 y 16 muestran que los FynomAb pueden unirse simultáneamente a la IL-17A humana y al IL-6R humano. Sin embargo, no está claro si la unión del IL-6R por la parte de mAb del FynomAb influye en la capacidad del fynómero para unirse a su ligando IL-17A e inhibirlo. Para abordar este asunto, se realizó el ensayo funcional con IL-17A en HT-29 en presencia de IL-6R soluble para observar si la unión de IL-6R por los FynomAb reduciría su unión y actividad funcional contra IL-17A. El ensayo con IL-17A en HT-29 se realizó exactamente como ha descrito anteriormente, excepto que se realizó tanto en presencia como en ausencia de un exceso de IL-6R soluble. Brevemente, se mezclaron cantidades tituladas de COVA804 o COVAB06 con IL-17A (1,9 nM) en presencia o ausencia de IL-6R soluble en exceso (20 nM), y después estas mezclas se añadieron a la línea celular HT-29 sensible a IL-17A. A continuación, se midió la liberación de GROa después de 48 horas mediante ELISA como se describió anteriormente. Secukinumab se utilizó como control positivo para el bloqueo de IL-17A.
En la Figura 17, se muestran los resultados. Las células HT-29 se estimularon con IL-17A humana recombinante sola (panel superior) o IL-17A humana e IL-6R humana soluble (panel inferior) en presencia de cantidades tituladas de COVA804 o COVA806, y la producción de GROa se evaluó mediante ELISA. Secukinumab se utilizó como control positivo para el bloqueo de IL-17A.
Como se observa en la Figura 17 y en la Tabla 8, COVA804 y COVA806 mostraron bloqueo de la producción de GROa inducida por IL-17A en presencia de IL-6R soluble en exceso, y se observaron valores de CI50 similares en presencia y ausencia de IL-6R. Estos datos sugieren que la unión de IL-6R no afecta a la capacidad de la parte del fynómero de los FynomAb para unirse a la IL-17A e inhibirla.
Tabla 8
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Para evaluar el bloqueo de IL-6R por los FynomAb en presencia de IL-17A, se realizó un estudio similar (véase la Figura 18). El ensayo de inhibición de IL-6R en HEK-Blue se realizó exactamente como se ha descrito anteriormente, excepto que se realizó tanto en presencia como en ausencia de IL-17A humana recombinante a 20 nM. Se usó una concentración de 20 nM porque concentraciones más altas de IL-17A condujeron a una fuerte activación del gen indicador de SEAP inducible por STAT3, posiblemente a través de la inducción de IL-6 por IL-17A en esta línea celular. Brevemente, se estimularon células h Ek Blue sensibles IL-6 con IL-6 (15 pM) en presencia de diversas concentraciones de los FynomAb COVA803 o COVA804. Los inhibidores se preincubaron con las células en presencia o ausencia de IL-17A 20 nM durante 30 minutos antes de la adición de IL-6. Se usó COVA803 y COVA804 porque estos FynomAb contienen el mismo fynómero fusionado a la cadena pesada o ligera. La capacidad de COVA803 y COVA804 para bloquear la señalización de IL-6 se comparó con la de tocilizumab (producido internamente) en presencia o ausencia de IL-17A.
Como se observa en la Figura 18 y en la Tabla 9, la capacidad de los FynomAb y de tocilizumab para bloquear la señalización a través de IL-6R, no se vio afectada por la presencia de IL-17A. Se obtuvieron valores de CI50 similares tanto en presencia como en ausencia de IL-17A. Estos datos sugieren que la unión de IL-17A por la parte de fynómero del FynomAb (unida a la cadena pesada o ligera del Ab precursor) no afecta la capacidad de los FynomAb para unirse al IL-6R e inhibirlo.
Tabla 9
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Ejemplo 11
Los polipéptidos de fynómero se unen a la IL-17A humana glucosilada con alta afinidad
Este ejemplo muestra los rendimientos de expresión de los polipéptidos de fynómeros de unión a la IL-17A y la caracterización de estos polipéptidos mediante estudios de cromatografía de exclusión por tamaño y resonancia de plasmón superficial.
Mediciones de afinidad
Las mediciones de afinidad se realizaron usando un instrumento BIAcore T200 (GE. Healthcare). Para el análisis de la interacción entre la IL-17A glucosilada (producida internamente en células HEK EBNA) y los polipéptidos de fynómero de unión a IL-17A monoméricos, se usó una microplaca CM5 Serie S (GE Healthcare) con 2000 UR. La IL-17A se inmovilizó usando el kit de acoplamiento de aminas (GE Healthcare). El tampón de ejecución fue PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %. Las interacciones se midieron a un flujo de 30 pl/min y se inyectaron diferentes concentraciones de polipéptidos de fynómeros de unión a IL-17A. Todos los datos cinéticos de la interacción se evaluaron usando el programa informático de evaluación T200 de BIAcore.
Propiedades de unión
Las propiedades de unión se analizaron mediante análisis de interacción en tiempo real en una microplaca BIAcore que revelaba las siguientes constantes de disociación (KD) para los polipéptidos de fynómero de unión a IL-17A seleccionados:
Tabla 10. Constantes cinéticas de la unión de polipéptidos de fynómero de unión a IL-17A con IL-17A glucosilada humana recombinante (producida en células HEK EBNA).
FYNÓMERO SEQ ID NO. Kd (nM)
1L3- B09 1 245
11L0- C06 2 7
11L5 - B06 3 12
11L6 - F03 4 11
11L9 - C09 5 11
Figure imgf000045_0001
Los datos del Ejemplo 11 se desvelaron en el documento WO2014/044.758 (PCT/EP2013/069481).
Ejemplo 12
Los polipéptidos de fynómero inhiben la IL-17A glucosilada
El clon 1L3-B09 (SEQ ID NO: 1) y cinco polipéptidos de fynómero con la mayor afinidad de unión por la IL-17A (11L0-C06, 11L5-B06, 11L6-F03, 11L9-C09, 11L10-A05, SEQ ID NO: 2-6) se analizaron para determinar su capacidad para inhibir a IL-17A. Las actividades inhibidoras de los polipéptidos de fynómero de unión a IL-17A indicados, se analizaron estimulando fibroblastos dérmicos humanos con IL-17A glucosilada recombinante (producida internamente en células HEK EBNA) y TNFa recombinante (Thermo Fisher Scientific) en ausencia o presencia de diversas concentraciones de polipéptidos de fynómero de unión a IL-17A. Después de 24 h de estimulación se tomaron los sobrenadantes del cultivo celular y mediante ensayo ELISA se determinó la concentración de IL-6 en el sobrenadante. Los resultados muestran que los polipéptidos de fynómero de unión a IL-17A fueron capaces de inhibir específicamente la IL-17A glucosilada.
Métodos
Para la eliminación de endotoxinas, las soluciones proteicas se filtraron tres veces con la membrana Acrodisc Mustang E (VWR). Después de la filtración, los niveles de endotoxina de las soluciones proteicas que contenían polipéptidos de fynómero inhibidores de unión a IL-17A fueron inferiores a 0,1 UE/ml, según lo determinado por la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) (ensayo de LAL Single test Gel Clot de PYROGENT (Lonza)). Se distribuyeron 100 pl por pocillo (placa de 96 pocillos, TPP o Corning) de una suspensión celular que contenía aproximadamente 3900 fibroblastos dérmicos humanos normales (PromoCell, NHDF-c, C12300) y se cultivaron durante 24 horas a 37 °C (medio: medio de crecimiento de fibroblastos C-23010, PromoCell). Se aspiró el sobrenadante y, después de mezclar diferentes concentraciones de polipéptidos de fynómero de unión a IL-17A con medio que contenía IL-17A y TNFa (concentraciones finales de 1 ng/ml y 50 pg/ml respectivamente), se añadieron 100 pl por pocillo de la solución correspondiente. Como controles, se mezcló PBS con el medio que contenía IL-17A/TNFa (control pos. = "sin inhibidor") y medio con las citocinas individuales IL-17A o TNFa solamente (siendo este último el pocillo de "control de TNFa"). Como control negativo, se mezcló PBS solo con medio. Para comparar, el ensayo también se realizó usando IL-17A no glucosilada (R&D Systems) con las mismas condiciones. Después de 24 horas de incubación a 37 °C, el sobrenadante se sometió a ensayo ELISA para determinar la concentración de IL-6 usando un kit de ELISA para IL-6 siguiendo las instrucciones del fabricante (kit de ELISA IL-6, R&D Systems). Los porcentajes de inhibición se representaron gráficamente y los valores de CI50 se calcularon usando el programa informático Prism 5. El porcentaje de inhibición de IL-17A se determinó con la siguiente fórmula:
inhibición (%) = (.4450 -650 n m (m u e s t ra ) - A 4 S 0 -6 S 0 n m (control de TNFa))x 100
.4450 -650 n m (control pos .) -A 4S0-6S0 n m ) control de TNFa)
Resultados
Se incubaron fibroblastos dérmicos humanos normales con IL-17A/TNFa y diferentes concentraciones de polipéptidos de fynómero de unión a IL-17A indicados. Se observó que los polipéptidos de fynómero inhibían la IL-17A glucosilada. En la Tabla 11 se muestran los valores de CI50.
Tabla 11. Valores de CI50 para la inhibición de la IL-17A glucosilada obtenidos para los polipéptidos de _____________________________ fynómero de unión a IL-17A.________________________________ FYNÓMERO SEQ ID NO. valor de CI50 (nM)
1L3- B09 1 300
11L0- C06 2 35
11L5 - B06 3 43
11L6 - F03 4 63
11L9 - C09 5 32
11L10- A05 6 28
En la Figura 19 se muestran curvas de inhibición dependiente de la dosis de los polipéptidos de fynómero de unión a IL-17A indicados que inhiben la IL-17A tanto glucosilada como no glucosilada.
Se descubrió que los polipéptidos de fynómero de unión a IL-17A podían inhibir completamente la IL-17A glucosilada con fuerzas similares en comparación con la IL-17A no glucosilada. Esta es una propiedad ventajosa en comparación con los polipéptidos de unión a IL-17A procedentes de SH3 Fyn descritos anteriormente en el documento WO2011/023685.
En la figura 20 se muestran tres ejemplos de polipéptidos de unión a IL-17A procedentes de SH3 Fyn descritos en el documento WO2011/023685.
La proteína de unión a IL-17, 2C1, procedente de SH3 Fyn (SEQ ID NO: 107 en el documento WO2011/023685), la proteína de unión a IL-17, A1_2, procedente de SH3 Fyn (SeQ ID NO: 53 en el documento WO2011/023685) y la proteína de unión a IL-17, B1_2 ("B1") procedente de SH3 Fyn (SEQ ID NO: 39 en el documento WO2011/023685), tampoco inhiben completamente la IL-17A glucosilada incluso a altas concentraciones y/o muestran grandes diferencias en la fuerza de inhibición (valores de CI50) entre la IL-17A glucosilada y no glucosilada.
Ejemplo 13
Los datos del Ejemplo 13 se desvelaron en el documento WO2014/044758 (PCT/EP2013/069481).
El polipéptido de fynómero 11L11-A09 inhibe la IL-17A glucosilada
Métodos
Se analizó la capacidad del fynómero 11L11-A09 para inhibir la IL-17A. Las condiciones del estudio fueron las mismas que las descritas anteriormente para los otros polipéptidos de fynómero.
Resultados
Se incubaron fibroblastos dérmicos humanos normales con IL-17A/TNFa y con diferentes concentraciones del polipéptido de fynómero 11L11-A09. Se observó que 11L11-A09 inhibió la IL-17A glucosilada con un valor de CI50 de 66 nM (Tabla 12).
Tabla 12. Valor de CI50 para la inhibición de la IL-17A glucosilada obtenido para el polipéptido de fynómero _________________________________ de unión a IL-17A, 11L11-A09._________________________________ FYNÓMERO SEQ ID NO. valor de CI50 (nM)
11L11 - A09 7 66
La Figura 21 muestra curvas de inhibición dependientes de la dosis del polipéptido de fynómero 11L11-A09. 11L11-A09 inhibió la IL-17A tanto glucosilada como no glucosilada con una fuerza y eficacia comparables.
Ejemplo 14
Estudio farmacocinético en ratones C57BL/6
Para ayudar a clasificar los FynomAb COVA801-808, se evaluó el perfil farmacocinético de los 8 FynomAb en ratones C57BL/6.
Dosificación y tomas de muestras de sangre
La determinación de las propiedades farmacocinéticas de los FynomAb indicados COVA801, COVA802, COVA803, COVA804, COVA805, c OvA806, COVA807, COVA808 y Tocilizumab, se realizó mediante ensayo ELISA midiendo las concentraciones en suero de ratón tomadas a diferentes puntos temporales después de una sola inyección retroorbital. Mediante inyección intravenosa, ratones hembra C56BL/6 de seis a 8 semanas de vida (Charles River, Estados Unidos), recibieron una dosis de 10 mg/kg en función del peso individual. Cada grupo estaba formado por 5 ratones. Se extrajo sangre de la vena caudal (vena de la cola), a los 30 minutos y a las 6, 24, 48, 96, 144, 192, 240 y 288 horas de la inyección retroorbital. La sangre se recogió en tubos de sangre microvettes (CB300, Sarstedt) con activador de coagulación y el suero se preparó mediante centrifugación durante 10 min a 10.000 rpm. El suero se conservó a -20 °C hasta el análisis.
ELISA para IL-6R e IL-17A
Las concentraciones en suero de los FynomAb y tocilizumab analizados se determinaron mediante ensayo ELISA usando la IL-17 alfa humana inmovilizada (Cell Signaling Technologies, 8928BF) y el IL-6R alfa humano recombinante (R&D Systems, Inc. 227-SR/CF) en placas de ELISA Nunc de alta unión (Thermo Scientific, 456537), respectivamente. Ambos se recubrieron a 5 mg/ml a 4 °C en PBS durante la noche. Las placas se lavaron en PBS Tween al 0,05 % (PBST) y se bloquearon durante 2 horas con BSA (Fischer Scientific, 37525) diluido al 1 % en PBST. Para cada ratón y punto temporal, se prepararon diluciones de suero de factor 800, 4.000 y 20.000 en diluyente bloqueador. Se preparó el patrón correspondiente de cada FynomAb haciendo diluciones en serie en diluyente bloqueador comenzando a 4 nM con titulaciones de factor 2 (4 nM-0,03125 nM). Se añadieron 50 pl de patrón (por duplicado) y diluciones en suero (por triplicado) a las placas y se incubaron durante 1 hora a TA. Las placas se lavaron 3 veces con PBST y se incubaron con 50 pl de anticuerpo de cabra anti IgG (H+L) humana conjugado con Peroxidasa-AffiniPure (Jackson ImmunoResearch, 109-035-003) diluidos a 1: 5.000 durante 1 hora a TA. Las placas se lavaron 3 veces con PBST. Se añadieron 50 |jl de sustrato líquido TMB (Sigma-Aldrich Inc., T0440-1L) a todos los pocillos. Las placas se incubaron durante 3 min y la reacción se detuvo con 50 j l de solución de terminación. Los valores de absorbancia se registraron a 405 nM (PHERAstar Plus).
Análisis de los datos
Las concentraciones en suero de cada ratón se calcularon usando la curva patrón y el análisis de ajuste de 4 parámetros (valor logarítmico X, valor lineal Y). Para cada punto temporal y ratón, el promedio de la concentración en suero nM de las pruebas realizadas por duplicado, se multiplicó por el factor de dilución correspondiente y después se convirtió a una concentración de ug/ml mínima. Se calculó la DEVST y el % de CV de cada punto temporal y de los 3 factores de dilución. Como valor para cada punto temporal, se eligió un valor con el % de CV más bajo y el que mejor representaba la parte lineal de la curva patrón. Estos valores se sometieron a análisis de parámetros farmacocinéticos (Phoenix 64, WinNonlin 6.3). La semivida (h), el área bajo la curva (ABC; h*ug/ml), el volumen de distribución (Vz; ml) y el aclaramiento (Cl; ml/h), se calcularon usando análisis FC no compartimental, Tipo de Modelo: Plasma (200-202), Método de Cálculo: Interpolación Lineal Trapezoidal Lineal. Las curvas patrón de cada ratón se basaron en una ponderación uniforme y el cálculo de lambda Z de mejor ajuste, requirió al menos 3 puntos de datos en la regresión y no incluyó la Cmáx.
Resultados
En las Tablas 13-21 se muestran las concentraciones en suero y los parámetros farmacocinéticos de cada FynomAb y tocilizumab. Aunque para calcular las concentraciones en suero y los parámetros FC se usaron los ensayos ELISA para IL-6R e IL-17A, en este caso solo se muestran los datos del IL-6R. Sin embargo, a partir de los datos de ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares. Por tanto, las curvas de concentración en suero frente al tiempo de los dos métodos ELISA diferentes, parecen muy similares para cada FynomAb (véanse las Figuras 22-25). Estos datos indican que los FynomAb son estables. in vivo, y que se conserva su capacidad para unirse tanto a IL-6R como a IL-17A. En general, los resultados de este estudio farmacocinético están en consonancia con los datos anteriores en la misma cepa de ratón.
Tablas 13A y 13B: Concentraciones en suero y parámetros FC de tocilizumab.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A.
Tabla 13A
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Tabla 13B
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Tablas 14A y 14B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA801.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 14A
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Tabla 14B
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Tablas 15A y 15B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA802.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 15A
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Tabla 15B
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Tablas 16A y 16B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA803.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 16A
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Tabla 16B
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Tablas 17A y 17B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA804.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 17A
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Tabla 17B
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Tablas 18A y 18B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA805.
(A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 18A
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Tabla 18B
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Tablas 19A y 19B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA806.
(A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 19A
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Tabla 19B
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Tablas 20A y 20B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA807.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 20A
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Tabla 20B
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Tablas 21A y 21B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA808.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 21A
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Tabla 21B
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En la Figura 22 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de COVA801 y COVA802.
Se muestran las concentraciones en suero medias /- la desviación estándar (DEVST), determinadas mediante ensayos ELISA de IL6R o IL-17A de COVA801 y COVA802 con tocilizumab (ELISA de IL-6R) como comparador. En la Figura 23 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de COVA803 y COVA804.
Se muestran las concentraciones en suero medias /- la desviación estándar (DEVST), determinadas mediante ensayos ELISA de IL6R o IL-17A de COVA803 y COVA804 con tocilizumab (ELISA de IL-6R) como comparador. En la Figura 24 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de COVA805 y COVA806.
Se muestran las concentraciones en suero medias /- la desviación estándar (DEVST), determinadas mediante ensayos ELISA de IL6R o IL-17A de COVA805 y COVA806 con tocilizumab (ELISA de IL-6R) como comparador. En la Figura 25 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de COVA807 y COVA808.
Se muestran las concentraciones en suero medias /- la desviación estándar (DEVST), determinadas mediante ensayos ELISA de IL6R o IL-17A de COVA807 y COVA808 con tocilizumab (ELISA de IL-6R) como comparador. Ejemplo 15
Estudio farmacocinético en macacos cangrejeros
Dosificación y tomas de muestras de sangre
La determinación de las propiedades farmacocinéticas de los FynomAb indicados como COVA801, COVA802, COVA803, COVA804, COVA806, COVA808 y Tocilizumab, se realizó mediante ensayo ELISA midiendo las concentraciones en suero de mono cangrejero tomadas a diferentes puntos temporales después de una sola inyección i.v. Mediante inyección intravenosa, monos macho y hembra recibieron una dosis de 5 mg/kg en función del peso individual. Cada grupo estaba formado por 4 monos. La sangre se extrajo a los 5 min, 30 min, a las 2 h, 6 h, 24 h, el día 3, el día 4, el día 5, el día 7, el día 10, el día 13, el día 17, el día 22 y el día 27 después de la inyección i.v. La sangre se recogió en tubos sin ningún anticoagulante y el suero se preparó mediante centrifugación durante 1-2 min a 10.000 rpm. El suero se conservó a -80 °C hasta el análisis.
ELISA para IL-6R e IL-17A
La concentración en suero de los FynomAb y Tocilizumab analizados se determinó mediante ELISA siguiendo el mismo protocolo que el descrito anteriormente en el estudio FC en ratones.
Análisis de los datos
Las concentraciones en suero de cada mono se calcularon usando la curva patrón y el análisis de ajuste de 4 parámetros (valor logarítmico X, valor lineal Y). Para cada punto temporal y mono, el promedio de la concentración en suero nM de las pruebas realizadas por duplicado, se multiplicó por el factor de dilución correspondiente y después se convirtió a una concentración de ug/ml. Se calculó la DEVST y el % de CV de cada punto temporal y de los 3 factores de dilución. Como valor para cada punto temporal, se eligió un valor con el % de CV más bajo y el que mejor representaba la parte lineal de la curva patrón. Estos valores se sometieron a análisis de parámetros farmacocinéticos (Phoenix 64, WinNonlin 6.3). La semivida (h), el área bajo la curva (ABC; h*ug/ml), el volumen de distribución (Vz; ml) y el aclaramiento (Cl; ml/h), se calcularon usando análisis FC no compartimental, Tipo de Modelo: Plasma (200-202), Método de Cálculo: Interpolación Lineal Trapezoidal Lineal. Las curvas patrón de cada mono se basaron en una ponderación uniforme y el cálculo de lambda Z de mejor ajuste, requirió al menos 3 puntos de datos en la regresión y no incluyó la Cmáx.
Resultados
En las Tablas 22-28 se muestran las concentraciones en suero y los parámetros farmacocinéticos de cada FynomAb y tocilizumab. Aunque para calcular las concentraciones en suero y los parámetros FC se usaron los ensayos ELISA para IL-6R e IL-17A, en este caso solo se muestran los datos del IL-6R. Sin embargo, a partir de los datos de ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares. Por tanto, las curvas de concentración en suero frente al tiempo de los dos métodos ELISA diferentes, parecen muy similares para cada FynomAb (véanselas Figuras 26-29). Esto sugiere nuevamente que los FynomAb son estables in vivo, y que se conserva su capacidad para unirse tanto a IL-6R como a IL-17A.
En general, todos los FynomAb mostraron perfiles FC favorables ya que ninguno de ellos se eliminó rápidamente de la circulación. COVA804 pareció tener el perfil FC más favorable con la mejor ABC, que fue muy similar a la de tocilizumab.
Tablas 22A-22B: Concentraciones en suero y parámetros FC de tocilizumab en macacos cangrejeros.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A.
Tabla 22A
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Tabla 22B
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Tablas 23A-23B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA801 en macacos cangrejeros.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 23A
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Tabla 23B
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Tablas 24A-24B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA802 en macacos cangrejeros.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 24A
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Tabla 24B
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Tablas 25A-25B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA803 en macacos cangrejeros.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 25A
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Tabla 25B
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Tablas 26A-26B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA804 en macacos cangrejeros.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 26A
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Tabla 26B
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Tablas 27A-27B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA806 en macacos cangrejeros.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 27A
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Tabla 27B
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Figure imgf000056_0002
Tablas 28A-28B: Concentraciones en suero y parámetros FC de COVA808 en macacos cangrejeros.
A) Se muestran las concentraciones en suero de cada punto temporal determinadas por ELISA (IL-6R). También se muestran los valores promedio y la desviación estándar (DEVST). (B) Resumen de parámetros farmacocinéticos importantes, tales como semivida, volumen de distribución (Vz), aclaramiento (Cl) y área bajo la curva (ABC). Los parámetros se calcularon usando las concentraciones en suero presentadas en A. A partir del ELISA para IL-17A, se determinaron concentraciones en suero y parámetros FC similares.
Tabla 28A
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Tabla 28B
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En la Figura 26 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de COVA801 y COVA802 en macacos cangrejeros. En la figura 26, se muestran las concentraciones en suero medias /- la desviación estándar (DEVST) determinadas mediante ensayos ELISA de IL6R o IL-17A de COVA801 y COVA802 con tocilizumab (ELISA de IL-6R) como comparador.
En la Figura 27 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de COVA803 y COVA804 en macacos cangrejeros. En la figura 27, se muestran las concentraciones en suero medias /- la desviación estándar (DEVST) determinadas mediante ensayos ELISA de IL6R o IL-17A de COVA803 y COVA804 con tocilizumab (ELISA de IL-6R) como comparador.
En la Figura 28 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de COVA806 en macacos cangrejeros. En la figura 28, se muestran las concentraciones en suero medias /- la desviación estándar (DEVST) determinadas mediante ensayos ELISA de IL6R o IL-17A ELISA de COVA806 con tocilizumab (ELISA de IL-6R) como comparador.
En la Figura 29 se muestran las concentraciones en suero medias representadas gráficamente frente al tiempo de COVA808 en macacos cangrejeros. En la figura 29, se muestran las concentraciones en suero medias /- la desviación estándar (DEVST) determinadas mediante ensayos ELISA de IL6R o IL-17A ELISA de COVA808 con tocilizumab (ELISA de IL-6R) como comparador.
Resumen de los ejemplos
Los datos desvelados en el presente documento muestran que los 8 FynomAb pueden unirse tanto a IL-17A como a IL-6R y bloquearlos funcionalmente. Las 8 construcciones tuvieron afinidades muy similares por IL-17A e IL-6R y tuvieron una actividad funcional similar en los ensayos basados en células, y las fusiones de los fynómeros de cadena ligera (los FynomAb indicados como COVA802, COVA804, COVA806 y COVA808) tenían mejores perfiles de SEC y eran menos propensas a la agregación.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido de fusión biespecífico que comprende:
(1) una secuencia de fynómeros que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
GVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPV
DSIQ (SEQID NO: 2);
GVTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPV
DSIQ (SEQID NO: S);
GVTLFVALYDYESVSWSDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPV
DSIQ (SEQID NO: 5);
GVTLFVALYDYSSRGVLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPV
DSIQ (SEQID NO: 6);
GVTLFVALYDYANHGNRDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAP
VDSIQ(SEQID NO: 1);
GVTLFVALYDYDKLSALDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPV
DSIQ (SEQID NO: 4); y
GVTLFVALYDYSRKSNLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPV
DSIQ (SEQID NO: 7),
donde la secuencia de aminoácidos en las posiciones 12-17 y 31-36 de la secuencia de fynómeros seleccionada se mantiene y la secuencia de fynómeros se une a la interleucina-17a (IL-17a), y
(2) un anticuerpo o una subsecuencia del mismo que se une al receptor de interleucina-6 (IL-6R),
donde la secuencia de fynómeros se conjuga con el anticuerpo, o subsecuencia del mismo, y el polipéptido de fusión se une tanto a IL-17a como a IL-6R e inhibe las actividades tanto de IL-17a como de IL-6r .
2. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, donde la secuencia de fynómeros comprende la secuencia de aminoácidos QILSTHEYEDWWEAR.
3. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1 o 2, donde la secuencia de fynómeros se une a la IL-17a glucosilada y por lo tanto inhibe la función o la señalización del receptor de IL-17.
4. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1 o 2, donde la secuencia de fynómeros tiene una afinidad de unión (Kd) para unirse a la IL-17a glucosilada de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 nM.
5. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la secuencia de fynómeros comprende una secuencia al menos 95 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1-7.
6. El polipéptido de fusión de la reivindicación 5, donde la secuencia de fynómeros comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 7.
7. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la secuencia de fynómeros está conjugada con la secuencia de cadena pesada o ligera del anticuerpo o subsecuencia del mismo que se une a IL-6R.
8. El polipéptido de fusión de la reivindicación 7, donde la secuencia de fynómeros está conjugada con el extremo amino o el extremo carboxilo de una secuencia de cadena pesada del anticuerpo o subsecuencia del mismo que se une a IL-6R.
9. El polipéptido de fusión de la reivindicación 7, donde la secuencia de fynómeros está conjugada con el extremo amino o el extremo carboxilo de una secuencia de cadena ligera del anticuerpo o subsecuencia del mismo que se une a IL-6R.
10. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la secuencia de fynómeros está conjugada con la secuencia de cadena pesada o ligera del anticuerpo o subsecuencia del mismo que se une a IL-6R a través de un enlazador.
11. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el polipéptido de fusión se une simultáneamente a IL-17a y a IL-6R.
12. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el anticuerpo o subsecuencia del mismo que se une a IL-6R comprende una cadena pesada que tiene las CDR1-3 siguientes: SDHAWS, YISYSGITTYNPSLKS y SLARTTAMDY, y una cadena ligera que tiene las CDR1-3 siguientes: RASQDISSYLN, YTSRLHS y QQGNTLPYT.
13. El polipéptido de fusión de la reivindicación 12, donde el anticuerpo que se une a IL-6R comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la secuencia de cadena pesada (HC):
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNP SLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 12); y una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la secuencia de cadena ligera (LC):
(LC)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFS
GSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA
SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:13).
14. El polipéptido de fusión de la reivindicación 13, donde el anticuerpo o subsecuencia del mismo que se une a IL-6R comprende un par de cadenas pesadas que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
15. El polipéptido de fusión de la reivindicación 12, donde el anticuerpo o subsecuencia del mismo que se une a IL-6R comprende un par de secuencias de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) seleccionadas de las siguientes:
(HC)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLK
SRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFP
LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG
GSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYI
PSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 14)
(LC)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSG
SGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASW
CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 15);
(HC)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLK SRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 16)
y
(LC)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPG KAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSG
SGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV
CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTH
EYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 17);
(HC)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLK
SRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFP
LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG
GSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYI PSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 18)
y
(LC)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPG KAPKLUYYTSRLHSGVPSRFSGSG SGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 19);
(HC)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLK SRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 20)
y
(LC)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPG KAPKLUYYTSRLHSGVPSRFSGSG
SGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV
CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQILSTH
EYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 21);
(HC)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLK
SRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFP
LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG
GSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYESVSWSDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYI
PSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 22)
(LC)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPG KAPKLUYYTSRLHSGVPSRFSGSG SGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 23);
(HC)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLK
SRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFP
LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ
ID NO: 24)
y
(LC)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPG KAPKLUYYTSRLHSGVPSRFSGSG
SGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV
CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYESVSWSDLSFHKGEKFQILSTH
EYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 25);
(HC)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLK SRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGG GSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYSSRGVLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIP SNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 26) y
(LC)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPG KAPKLUYYTSRLHSGVPSRFSGSG
SGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV
CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 27); u
(HC)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLK
SRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFP
LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC
KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ
ID NO: 28)
(LC)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPG KAPKLUYYTSRLHSGVPSRFSGSG
SGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYSSRGVLDLSFHKGEKFQILSTHE YEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 29).
16. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde el polipéptido de fusión se une a la IL-17a humana y al IL-6R humano.
17. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el polipéptido está aislado o purificado.
18. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
19. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o un trastorno autoinmunitario.
20. El polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde la enfermedad autoinmunitaria o el trastorno autoinmunitario es una(o) que afecta al músculo, esqueleto, sistema nervioso, tejido conjuntivo, aparato endocrino, piel, vías respiratorias o aparato respiratorio, aparato gastrointestinal, aparato ocular o aparato circulatorio.
21. El polipéptido de fusión para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde la enfermedad autoinmunitaria o el trastorno autoinmunitario se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, psoriasis, artritis y uveítis.
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