CN106211782B - 抗体-fynomer缀合物 - Google Patents

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Abstract

提供了双特异性融合多肽，其包含与白介素‑17a(IL‑17a)结合并且与结合白介素‑6受体(IL‑6R)之抗体或其子序列缀合的fynomer序列。所述融合多肽可与IL‑17a和IL‑6R二者结合，从而阻抑、减小、降低、抑制或阻断IL‑17a和IL‑6R二者的活性。

Description

抗体-fynomer缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年3月16日提交并分配序列号61/954,437的临时申请的优先权。该临时申请的全部内容均通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及可与白介素-17a(interleukin-17a，IL-17a)和白介素-6受体(interleukin-6receptor，IL-6R)二者结合的融合蛋白。本发明还涉及产生所述融合多肽的经转化细胞、包含所述融合多肽的组合物以及用于使用所述融合多肽来治疗疾病或病症的方法。
背景技术
Th17细胞是慢性炎性过程中的中心介质，并且是先前认为是Th1介导的数种类型自身免疫性病症的主要致病性效应物(Weaver T.等(2008)Annu.Rev.Immunol.，25，第821-852页)。促炎细胞因子IL-17主要由Th17细胞表达，并且在患有类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)的患者的滑液中以升高的水平存在并且已显示参与早期RA发生。另外，IL-17是TNF-α和IL-1的强效诱导物，后者主要导致受影响患者的骨侵蚀和非常疼痛的结果(Lubberts E.(2008)Cytokine，41，第84-91页)。再者，IL-17的不适当或过度产生与多种其他疾病或病症的病理学有关，例如骨关节炎、骨植入物松动、急性移植物排斥(Antonysamy等，(1999)J.Immunol，162，第577-584页；van Kooten等(1998)J.Am.Soc.Nephrol.，9，第1526-1534页)、败血病、感染性休克或内毒素性休克、变态反应、哮喘(Molet等(2001)J.Allergy Clin.Immunol.，108，第430-438页)、骨脱失(bone loss)、银屑病(Teunissen等(1998)J.Invest.Dermatol，111，第645-649页)、缺血、系统性硬化病(Kurasawa等(2000)Arthritis Rheum.，43，第2455-2463页)、卒中、以及其他炎性病症。因此，需要调节IL-17的生物活性的治疗。
在关节炎初始阶段期间在免疫方案之后开始通过IL-17受体-IgG1-Fc融合蛋白早期中和内源性IL-17抑制实验性关节炎的发生(Lubberts等(2001)J.Immunol.，167，第1004-1013页)。此外，在发生胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis)之后在动物模型中用中和性抗IL-17抗体进行处理降低关节炎症、软骨破坏和骨侵蚀(Lubberts等(2004)Arthritis and Rheumatism，50；650-659)。组织学分析确定：在用抗IL-17抗体处理之后，对关节炎症的抑制和全身性IL-6水平显著降低。相比之下，使用表达鼠IL-17之腺病毒载体的全身性以及局部IL-17过表达加速胶原诱导的关节炎(collagen-inducedarthritis，CIA)的发生并且加重该部位处的滑液炎症(Lubberts等(2001)J.Immunol.，167，第1004-1013页和Lubberts等(2002)，Inflamm.Res.51，第102-104页)。最近，可证明：抗IL-17抗体的使用改善银屑病、类风湿性关节炎和非感染性葡萄膜炎的临床症状(Leonardi C.等(2012)N.Engl.J.Med.366，第1190-1199页；Hueber W.等(2010)SciTransl Med.2(52)：52ra72)。
白介素6(IL-6)是调节细胞生长和分化的强效细胞因子，并且还是急性炎性应答的重要介质。IL-6通过由特异性IL-6受体(IL-6R)和信号转导亚基(gp130)组成的受体复合物来起作用。调节异常的IL-6信号传导已与很多疾病(例如多发性骨髓瘤、自身免疫病和前列腺癌)的发病机制相关。因此，需要调节IL-6和/或IL-6R的生物活性的治疗。
发明概述
本发明的一个目的是提供可与白介素-17a(在下文为“IL-17a”)和白介素-6受体(在下文为“IL-16R”)二者结合的融合多肽。本发明的另一个目的是提供可阻抑、降低、减小、抑制或阻断IL-17a和IL-16R二者的活性的融合多肽。本发明的又一个目的是提供产生所述融合多肽的经转化细胞。本发明的另一个目的是提供包含所述融合多肽的组合物，其用于治疗疾病或病症。本发明的又一个目的是提供用于使用所述融合多肽来治疗疾病或病症的方法。
本发明人在本文中提供数据表明：包含与白介素-17a(IL-17a)结合并且与结合白介素-6受体(IL-6R)的抗体或其子序列(“mAb”)缀合的fynomer序列(“fyno”，还称为FynomerTM)的融合多肽(即FynomAb)可结合并且阻抑、降低、减小、抑制或阻断IL-17a和IL-6R二者的功能或活性。该数据还表明在不同时间由不同细胞产生的不同批次的示例性FynomAb在批次间表现相似。示例性的8种FynomAb构建体对IL-17a和IL-6R具有非常相似的亲和力，并且在基于细胞的测定中具有相似的功能活性。轻链融合物(COVA802、COVA804、COVA806和COVA808)具有更好的SEC谱并且较不容易聚集。
在一个实施方案中，提供了双特异性融合多肽，其包含与白介素-17a(IL-17a)结合并且与结合白介素-6受体(IL-6R)的抗体或所述抗体的子序列缀合的fynomer序列。所述双特异性融合多肽可以是与IL-17a结合并且同时与IL-6R结合的融合多肽。
在一个实施方案中，所述fynomer序列可与结合IL-6R的抗体的重链或轻链序列或者所述重链或轻链序列的子序列缀合。所述fynomer序列可与抗体的重链序列或其子序列的氨基端或羧基端缀合。所述fynomer序列可与抗体的轻链序列或其子序列的氨基端或羧基端缀合。
所述双特异性融合多肽可包含一个或更多个与结合IL-6R的抗体或所述抗体的子序列缀合的IL-17a结合序列。在一些具体实施方案中，所述双特异性融合多肽可包含两个或更多个(例如3、4、5、6、7或8个)与IL-6R结合抗体或其子序列缀合的IL-17a结合fynomer序列。
所述IL-17a结合fynomer序列可以是具有不同长度的那些。在一个实施方案中，所述fynomer序列的长度为约10至80个氨基酸。
所述IL-17a结合fynomer序列可以是对IL-17a具有不同亲和力的那些。在一个实施方案中，所述fynomer序列结合IL-17a的结合亲和力(Kd)可以是约10-9M至约10-13M。在一个优选实施方案中，所述fynomer序列结合糖基化IL-17a的结合亲和力(Kd)可以是约1至约200nM。在另一个优选实施方案中，所述fynomer序列结合糖基化人IL-17a的结合亲和力(Kd)可以是约1至约200nM，或者约5至约50nM。与SEQ ID NO：1之fynomer序列对糖基化IL-17a的结合亲和力相比，所述fynomer序列可对糖基化IL-17a具有相当或更大的结合亲和力(Kd或KD)。
所述IL-17a结合fynomer序列可以是与参照fynomer序列具有同一性的那些。在一些具体实施方案中，fynomer序列可以是与如下所示的任一参照序列具有至少90％或更高(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列：
Figure GDA0001875602890000031
Figure GDA0001875602890000041
所述IL-17a结合fynomer序列可以是相对于上述参照fynomer序列具有氨基酸替换、插入、添加或缺失的那些。在一个实施方案中，所述fynomer序列可以是以下任一序列：
Figure GDA0001875602890000042
或者具有1至2、2至3、3至4、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至15、15至20、20至25或25至30个保守、非保守或者保守和非保守氨基酸替换的前述任一序列，或者具有1至2、2至3、3至4、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至15、15至20、20至25或25至30个氨基酸缺失或插入的前述任一序列。
在一个实施方案中，所述IL-17a结合fynomer序列可包含某些与参照fynomer序列中含有的那些相同的基序序列。在一个实施方案中，用于本发明的IL-17a结合fynomer序列中包含以下一个或更多个基序：GVTLFVALYDY、DLSFHKGEKFQIL、STHEYE、STHEYED、WWEAR、DWWEAR和SLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ。在一个具体实施方案中，所述fynomer序列可从该序列的第31-36位氨基酸包含序列STHEYE，或者从该序列的第28-42位氨基酸包含序列QILSTHEYEDWWEAR。
所述IL-17a结合fynomer序列可以是在指定位置或位点具有特定氨基酸残基的那些。特别地，所述fynomer序列可在紧靠src环序列之后具有E残基，和/或在紧靠src环序列STHEY之后具有E残基。
所述IL-17a结合fynomer序列可以是具有特定活性或功能的那些。在一个实施方案中，所述fynomer序列可与IL-17a结合并且抑制、降低或阻抑IL-17a受体功能或信号传导。在另一个实施方案中，所述fynomer序列可与糖基化IL-17a结合并且抑制、降低或阻抑IL-17a受体功能或信号传导。在又一个实施方案中，所述fynomer序列可与糖基化IL-17a结合并且抑制、降低或阻抑成纤维细胞产生IL-6。例如，所述fynomer序列抑制、降低或阻抑成纤维细胞产生IL-6的IC50可以是约10至约250nM，或者约10至约100nM。
本发明的双特异性融合多肽包含与IL-6R结合的抗体或所述抗体的子序列，例如与IL-6R结合的VH或VL链。在一个实施方案中，所述抗体或其子序列与IL-6R结合的结合亲和力(Kd)可以是约10-5M至约10-13M。
所述IL-6R结合抗体或其子序列(例如VH或VL链)可以是具有不同长度的那些。特别地，所述序列可以是长度为约50至100个氨基酸的那些。在一些具体实施方案中，所述抗体或其子序列可以是Fab、Fab’、F(ab')2、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、VL、VH、双抗体((VL-VH)2或(VH-VL)2)、三链抗体(三价体)、四链抗体(四价体)、微抗体((scFV-CH3)2)、IgGδCH2、scFv-Fc或(scFv)2-Fc片段。
所述IL-6R结合抗体或其子序列可以是具有多种同种型的那些。在一个实施方案中，所述抗体可以是具有IgG、IgA、IgE、IgM或IgD同种型的那些。
所述IL-6R结合抗体或其子序列可以是与下文所示的参照序列具有显著同一性的那些。在一些具体实施方案中，所述抗体或其子序列可以是具有与以下重链(HC)和轻链(LC)序列中任一个具有至少90％或更高(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列的那些：
Figure GDA0001875602890000061
所述IL-6R结合抗体或其子序列可以是相对于参照序列之一具有一个或更多个氨基酸替换、插入、添加或缺失的那些。在一些具体实施方案中，所述抗体或其子序列可以是以下重链(HC)和轻链(LC)序列中的任一个：
Figure GDA0001875602890000062
Figure GDA0001875602890000071
或者前述重链(HC)或轻链(LC)序列中任一个在可变链序列之内或之外具有1至2、2至3、3至4、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至15、15至20、20至25、25至30个保守、非保守或者保守和非保守氨基酸替换或者氨基酸插入或缺失的那些。
所述IL-6R结合抗体或其子序列可以是如下所示的重链(HC)和/或轻链(LC)序列中的任一个：
Figure GDA0001875602890000072
Figure GDA0001875602890000081
Figure GDA0001875602890000091
Figure GDA0001875602890000101
Figure GDA0001875602890000111
或者前述重链(HC)或轻链(LC)序列中任一个在可变链序列之内或之外具有1至2、2至3、3至4、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至15、15至20、20至25或25至30个保守、非保守或者保守和非保守氨基酸替换或者氨基酸插入或缺失的那些。
所述IL-6R结合抗体可以是已知的IL-6R抗体，例如托珠单抗(Tocilizumab)。抗体的子序列可以是该抗体的重链或轻链，或者重链或轻链在可变区序列之内或之外具有氨基酸替换、插入或缺失的那些。所述子序列还可以是在抗体的重链或轻链可变区序列的互补决定区(complementarity determining region，CDR)之内或之外具有氨基酸替换、插入或缺失的那些。所述子序列还可以是在已知IL-6R结合抗体的重链或轻链可变区序列在框架区(framework region，FR)之内或之外具有氨基酸替换、插入或缺失的那些。
所述IL-6R结合序列可以是具有特定活性或功能的那些。在一个实施方案中，所述IL-6R结合序列与IL-6R结合并且抑制、降低或阻抑IL-6R功能或信号传导。
根据本发明，IL-6R结合抗体、其子序列或者其VH或VL链与fynomer序列可直接缀合或通过接头缀合。在一个实施方案中，缀合通过共价键或酰胺键来进行。在另一个实施方案中，缀合可通过接头来进行。接头的非限制性实例可包括肽和碳序列。在一个实施方案中，可采用具有约1至5、5至10、10至15、15至20、20至25、25至50或50至100个氨基酸残基的肽序列；和具有约1至5、5至10、10至15、15至20、20至25、25至50或50至100个碳原子的碳链作为接头。接头肽的实例可以是包含基序(GGGGS)X(X＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)或GGGGSGGGGSGGGGS，或者由其组成的那些。
与本发明的双特异性融合多肽结合的靶序列包括哺乳动物IL-17a和IL-6R。在一个具体实施方案中，靶标可以是人IL-17a和/或IL-6R。
本发明的双特异性融合多肽可作为分离的和/或经纯化的多肽提供。本发明还提供了包含本发明的双特异性融合多肽的组合物，例如药物组合物。所述组合物可以是无菌的药物组合物或制剂。
根据本发明，还提供了产生本发明的双特异性融合多肽的经转化细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。
本发明的双特异性融合多肽可用于在对象(例如人)中治疗疾病或病症。需通过本发明治疗的疾病或病症可包括但不限于与异常或不期望免疫应答相关或者由其引起的自身免疫性疾病或病症以及炎症。在一个实施方案中，本发明的双特异性融合多肽施用于需要治疗自身免疫性疾病或病症或者炎症的对象。自身免疫性疾病、病症和炎症可以是影响对象中任何细胞、组织或器官的那些。需通过所述双特异性融合多肽治疗的自身免疫性疾病、病症或炎症可以是影响肌肉、骨骼、神经系统、结缔组织、内分泌系统、皮肤、气道或肺系统、胃肠系统、眼系统或循环系统的那些。
本发明的双特异性融合多肽可单独施用或者与可用于治疗需通过所述双特异性融合多肽治疗的自身免疫性疾病或病症或者炎症的第二或另一药剂共施用。在一个实施方案中，本发明的双特异性融合多肽可在施用第二药剂之前、同时或之后施用。
根据本发明，还提供了用于治疗需通过所述双特异性融合多肽治疗的疾病或病症(例如自身免疫性疾病或病症)或者炎症的药物组合物，其包含所述双特异性融合多肽和可药用载体或稀释剂。所述组合物还可包含可用于治疗需通过所述双特异性融合多肽治疗的疾病或病症的第二或另一药剂。
根据本发明，还提供了所述双特异性融合多肽用于制备用于治疗疾病或病症(例如自身免疫性疾病或病症)或者炎症的药物组合物的用途。
附图简述
图1示出了瞬时CHO FynomAb物质的SDS-PAGE分析。
图2示出了针对小鼠PK研究制备的稳定CHO FynomAb物质的SDS-PAGE分析。
图3示出了针对食蟹猴(cynomolgus，cyno)PK研究制备的稳定CHO FynomAb物质的SDS-PAGE分析。
图4示出了FynomAb与重组人IL-17A相互作用的动力学结合分析。
图5示出了COVA804和COVA806的IL-17A结合ELISA。
图6示出了FynomAb与重组人IL-6R相互作用的动力学结合分析。
图7示出了使用瞬时CHO FynomAb物质的HT-29 IL-17A测定。
图8示出了使用针对小鼠PK研究产生的稳定CHO库(pool)FynomAb物质的HT-29IL-17A测定。
图9示出了使用针对食蟹猴(cyno)PK研究产生的稳定CHO库FynomAb物质的HT-29IL-17A测定。
图10示出了使用瞬时CHO FynomAb物质的HEK-BIue IL-6R抑制测定。
图11示出了使用针对小鼠PK研究产生的稳定CHO库FynomAb物质的HEK-Blue IL-6R抑制测定。
图12示出了使用针对食蟹猴(cyno)PK研究产生的稳定CHO库FynomAb物质的HEK-Blue IL-6R抑制测定。
图13示出了血清稳定性双重结合ELISA设置。
图14示出了表示为COVA801-808的FynomAb的血清稳定性评估。
图15示出了表示为COVA804和806的FynomAb在人血清存在下的双重结合的评估。
图16示出了细胞表面表达的IL-6R和可溶性IL-17A的同时结合。
图17示出了在可溶性IL-6R存在下的HT-29 IL-17A功能性测定。
图18示出了在IL-17A存在下的IL-6R抑制。
图19示出了指定fynomer多肽对糖基化和非糖基化IL-17A的剂量依赖性体外抑制。A)1L3-B09、(B)11L0-C6、(C)11L5-B06、(D)11L6-F03、(E)11L9-C09、(F)11L10-A05。
图20示出了WO2011/023685中所述的Fyn SH3衍生多肽对糖基化和非糖基化IL-17A的剂量依赖性体外抑制：(A)Fyn SH3衍生的IL-17结合剂2C1(SEQ ID NO：30)(WO2011/023685中的SEQ ID NO：107)、(B)Fyn SH3衍生的IL-17结合剂A1_2(“A1”)(SEQ ID：31)(WO2011/023685中的SEQ ID NO：53)、(C)Fyn SH3衍生的IL-17结合剂B1_2(“B1”)(SEQ ID：32)(WO2011/023685中的SEQ ID NO：39)。
图21示出了fynomer多肽11L11-A09剂量依赖性地体外抑制糖基化和非糖基化IL-17A的结果。
图22示出了表示为COVA801和COVA802的FynomAb的相对于时间绘制的平均血清浓度。
图23示出了表示为COVA803和COVA804的FynomAb的相对于时间绘制的平均血清浓度。
图24示出了表示为COVA805和COVA806的FynomAb的相对于时间绘制的平均血清浓度。
图25示出了表示为COVA807和COVA808的FynomAb的相对于时间绘制的平均血清浓度。
图26示出了食蟹猴中表示为COVA801和COVA802的FynomAb的相对于时间绘制的平均血清浓度。
图27示出了食蟹猴中表示为COVA803和COVA804的FynomAb的相对于时间绘制的平均血清浓度。
图28示出了食蟹猴中表示为COVA806的FynomAb的相对于时间绘制的平均血清浓度。
图29示出了食蟹猴中表示为COVA808的FynomAb的相对于时间绘制的平均血清浓度。
发明详述
术语“fynomer”指在人Fyn激酶SH3结构域(所谓的Gebauer和Skerra(2009)CurrOpinion in Chemical Biology 13：245-255中描述的支架)之后建模、基于其或者由其衍生的非免疫球蛋白衍生结合(多)肽。人Fyn激酶的SH3结构域可用作工程化以高亲和力和特异性与不同靶标(例如蛋白质)结合的蛋白质(称为fynomer)的支架(WO 2008/022759；WO2011/023685，Grabulovski D.等，(2007)J Biol Chem 282，第3196-3204页；BertschingerJ.等(2007)Protein Eng Des Sel，20，第57-68页，以及Schlatter等(2012)mAbs，4(4)第497-50页)。Fyn3序列的序列，其中相应的RT环(EARTED)和src环(NSSE)区加有下划线：
Figure GDA0001875602890000151
“IL-17a fynomer”或“抗IL-17a fynomer”及其语法上的变化形式意指与白介素17a(IL-17a)蛋白结合的fynomer序列。认为RT环和src环内的氨基酸位置决定对糖基化IL-17A的结合特异性。代表性的IL-17a结合fynomer序列(SEQ ID NO：1至7)如下：
Figure GDA0001875602890000152
“IL-6R抗体”或“抗IL-6R抗体”及其语法上的变化形式意指与白介素6受体(IL-6R)蛋白结合的多克隆或单克隆抗体。代表性的IL-6R结合抗体重链和轻链序列(SEQ IDNO：8和9)如下：
托珠单抗重链序列(SEQ ID NO：8)，CDR加有下划线：
Figure GDA0001875602890000161
托珠单抗轻链序列(SEQ ID NO：9)，CDR加有下划线：
Figure GDA0001875602890000162
IL-6R结合抗体和/或与IL-6R结合之抗体的重链和轻链序列的另外实例在US20130122012、US 20120225060、US 20120128626和US 20120077731中进行了描述。WO/2008/020079中描述了与IL-6R结合的纳米抗体(nanobody)。
本文中使用的术语“IL-17a”、“IL-17a蛋白”、“IL-17a序列”和“IL-17a结构域”指从任何天然存在环境分离的、基于任何天然存在环境的或任何天然存在环境中存在的IL-17a蛋白序列或者人工产生的(例如，遗传工程化)IL-17a的全部或一部分(例如，子序列，例如抗原区或表位)。因此，术语IL-17a等包括细胞以及重组或合成产生的IL-17a序列。
本文中使用的术语“IL-6R”、“IL-6R蛋白”、“IL-6R序列”和“IL-6R结构域”指从任何天然存在环境分离的、基于任何天然存在环境的或任何天然存在环境中存在的IL-6R蛋白序列或者人工产生的(例如，遗传工程化)IL-6R的全部或一部分(例如，子序列，例如抗原区或表位)。因此，术语IL-6R等包括细胞以及重组或合成产生的IL-6R序列。
哺乳动物IL-17a和IL-6R序列为本领域技术人员所知晓。人IL-17a蛋白序列的代表性的非限制性实例(SEQ ID NO：10)是：
Figure GDA0001875602890000171
人IL-6R蛋白序列的代表性的非限制性实例(SEQ ID NO：11)是：
Figure GDA0001875602890000172
术语“抗体”指通过重链和轻链可变结构域(分别表示为VH和VL)与另一分子(抗原)结合的蛋白质。“抗体”指任何多克隆或单克隆免疫球蛋白分子或者其混合物，例如IgM、IgG、IgA、IgE、IgD。抗体属于任何抗体类或亚类。IgG的示例性亚类是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
术语“单克隆的”当提及抗体使用时指基于单一克隆(包括任何真核生物、原核生物或噬菌体克隆)、由单一克隆获得或者来源于单一克隆的抗体。因此，“单克隆”抗体在此是在结构上进行限定，而不是产生其的方法。
抗体包括这样的抗体，其具有κ或λ轻链序列(任一个是全长的，如同天然存在抗体中)、其混合物(即，κ或λ链序列的融合物)及其子序列/片段。天然存在的抗体分子包含两条κ轻链和两条λ轻链。κ和λ轻链之间的主要差异在于恒定区的序列。
包含重(H)链和/或轻(L)链或者重(H)链或轻(L)链片段或者由其组成的抗体可包含单个H或L链，或者单个H或L链片段，或者多条(2、3、4条或更多条)重(H)链和/或轻(L)链，或者多个重(H)链和/或轻(L)链片段。包含抗体的重(H)链和/或轻(L)链或者片段的融合多肽(FynomAb)可以但并不要求包含2条重(H)链和2条轻(L)链，并且因此可以是但不要求是如本文所示的融合多肽(FynomAb)。抗体或其片段可以是与其他抗体、其片段、重(H)链、轻(L)链或者不同于抗体重(H)链或轻(L)链的多肽的低聚体(较高阶或较高化合价)形式，例如三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体等。
本文中使用的术语“双特异性的”及其语法上的变化形式当提及融合多肽序列使用时意指该融合多肽与两个不同的靶标结合。当多肽靶标具有不同的氨基酸序列时，认为其是不同的。本发明的双特异性融合多肽与白介素6受体(IL-6R)和白介素-17a(IL-17a)结合。
本文中使用的术语“融合物”或“嵌合体”及其语法上的变化形式当提及序列使用时意指该序列包含一个或更多个基于、来源于、或者获自或分离自两种或更多种不同蛋白质的部分。即，例如，该序列的一部分可基于或来自于一种特定蛋白质，而该序列的另一部分可基于或来自于不同的特定蛋白质。因此，融合或嵌合多肽是其中该多肽的不同部分来源于不同蛋白质的分子。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，指通过酰胺键或等效键共价连接的两个或更多个氨基酸或者“残基”。氨基酸序列可通过非天然和非酰胺化学键连接，包括例如与戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双官能马来酰亚胺或N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)形成的那些。非酰胺键包括例如酮亚甲基、氨基亚甲基、烯烃、醚、硫醚等(参见，例如Spatola in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，第7卷，第267-357页(1983)，“Peptide and Backbone Modifications，”Marcel Decker，NY)。
本发明提供了这样的融合多肽(FynomAb)，其包含与白介素-17a(IL-17a)结合并且与结合白介素-6受体(IL-6R)的抗体或者其结合IL-6R的子序列缀合的fynomer序列。所述fynomer序列可与IL-6R结合抗体或其子序列的氨基或羧基末端结合。同样地，fynomer序列的氨基或羧基末端可与所述抗体或其子序列的氨基或羧基末端结合。多个fynomer可通过fynomer序列的氨基或羧基末端与所述抗体或其子序列的多个氨基或羧基末端结合。另外，多个fynomer可端对端(end-to-end)或串联地与所述抗体或子序列的氨基或羧基末端结合。
术语“结合”当提及fynomer、抗体或其子序列或者融合多肽(例如，FynomAb)使用时意指该fynomer、抗体或其子序列或者融合多肽与靶标的全部或一部分特异性结合。该fynomer、抗体或其子序列或者融合多肽(FynomAb)与IL-17a和/或IL-6R蛋白特异性或选择性结合，其对IL-17a或IL-6R蛋白中存在的表位或抗原决定簇具有选择性。选择性结合指与靶蛋白结合。认为不显著干扰与靶蛋白结合的与非靶蛋白结合也是选择性的。可使用本文中所述或本领域中已知的特异性、亲和力以及竞争性和非竞争性结合测定来区别选择性结合与非选择性结合。
本发明的Fynomer/抗体融合多肽(FynomAb)可具有与所例示fynomer、抗体及其子序列相同或基本相同的结合特异性。对靶标的亲和力可高于或低于参照fynomer、抗体或其子序列或者参照fynomer/抗体融合多肽(FynomAb)。给定FynomAb可以或者可以不可检测地竞争或抑制另一fynomer、抗体、子序列或FynomAb与彼此不干扰的靶区域结合。
与靶标上序列的全部或一部分特异性结合的Fynomer/抗体融合多肽(FynomAb)还可结合其他与该靶标具有相同或类似表位的蛋白质。与参照fynomer或抗体或者其融合物相比，与相同序列或者表位或该表位的一部分结合的融合多肽(FynomAb)可对靶标具有更高或更低的相对结合亲和力或特异性。
Fynomer和抗体以及融合多肽(FynomAb)还包括竞争与其各自靶标结合的序列。因此，例如，给定的fynomer、抗体、子序列或FynomAb可抑制或竞争另一fynomer、抗体、子序列或FynomAb与IL-17a和/或IL-6R结合。在一个具体的非限制性实例中，在COVA801-808中的任一个中，fynomer、抗体、子序列或FynomAb可将与IL-17a和/或IL-6R的结合抑制至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或者更多。因此，fynomer可以是竞争与IL-17a(例如，糖基化IL-17a)结合之表示为SEQ ID NO：1至7的任意fynomer的结合的fynomer，并且抗体或其子序列可以是竞争包含与IL-6R结合之SEQ ID NO：8和9的抗体的结合的抗体或其子序列。
本发明的FynomAb可包括与参照fynomer/抗体或其子序列或者融合多肽(FynomAb)相比对靶标(例如，IL-17a或IL-6R)具有更高或更低亲和力的fynomer/抗体或其子序列或者融合多肽(FynomAb)。例如，本发明的FynomAb可以是以下那些：其对IL-17a(例如，糖基化IL-17a)和/或IL-6R具有更高或更低的亲和力并且具有与SEQ ID NO：1至7中所示fynomer序列具有至少60％或更高(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列，或者与SEQ ID NO：8或9中所示重链或轻链可变区序列具有至少60％或更高(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列。在一个具体实施方案中，与SEQ ID NO：1中所示的fynomer序列相比，本发明的融合多肽(FynomAb)对糖基化IL-17a具有更大的亲和力。
因此，本发明的FynomAb包括对IL-17a(例如，糖基化IL-17a)和/或IL-6R具有相同或不同结合亲和力的序列。例如，本发明的FynomAb与另一FynomAb(例如COVA801-808)相比对靶标(例如，糖基化IL-17a和/或IL-6R)的亲和力可大于或小于2至5、5至10、10在100、100至1000或1000至10,000倍亲和力或者在这些范围内的任何数值或范围或值。
可通过缔合(Ka)和解离(Kd)速率来确定结合亲和力。平衡亲和常数(KD)是Ka/Kd之比。与另一fynomer或抗体具有相同结合亲和力的fynomer或抗体意指每种抗体的解离常数(Kd)在约1至10倍(比参照fynomer或抗体大1至10倍的亲和力或小1至10倍的亲和力或者在这些范围内的任何数值或范围或值)内。对靶抗原(例如，IL-17a(例如糖基化IL-17a)或IL-6R)的示例性亲和力具有小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M和10-15M的解离常数(Kd)。通常来说，对靶标的结合亲和力(Kd)可小于10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M或10-12M。
对靶抗原IL-17a(例如，糖基化IL-17a)的更具体示例性fynomer或融合多肽(FynomAb)亲和力具有约0.01nM至约0.50nM或者约0.02nM至约0.40nM的KD。对靶抗原IL-6R的更具体示例性抗体或其子序列或者融合多肽(FynomAb)亲和力具有约0.20nM至约1.25nM或者约0.30nM至约1.10nM的KD。
Fynomer和抗体以及融合多肽(FynomAb)可包括与参照fynomer、抗体或包含FynomAb的融合物具有至少一部分“活性”或“功能”的那些。所述活性或功能可以是结合亲和力(例如，Kd、KD)、结合特异性或例如拮抗剂活性的活性。术语“至少一部分”意指该Fynomer、抗体或融合多肽(FynomAb)至少保留本文中所例示参照fynomer、抗体或融合多肽(FynomAb)的可测量或可检测量的活性或功能。与参照fynomer、抗体或融合多肽(FynomAb)相比，本发明的Fynomer、抗体或融合多肽(FynomAb)可具有更大或更小的活性或功能。
所述fynomer、抗体或融合多肽(FynomAb)可具有拮抗或激动活性或功能。在一个实施方案中，所述fynomer、抗体或融合多肽(FynomAb)可以是具有针对IL-17a和/或IL-6R的拮抗或激动活性或功能的那些。
“拮抗剂”能够降低、减小或抑制靶分子的一种或更多种活性，例如通过IL-17a或IL-6R的信号传导。拮抗剂可干扰IL-17a与受体或者IL-6R与配体的结合，并且使通过配体活化的细胞失能或者将其杀死和/或干扰信号转导。拮抗剂可完全阻断、显著降低、减小或抑制配体和受体之间的相互作用。
“激动剂”能够提高、诱导或激活靶分子的一种或更多种活性，例如通过IL-17a或IL-6R的信号传导。激动剂可提高、诱导或促进受体与配体(反之亦然)的结合，或者可直接作用于受体或配体以提高、诱导、促进或激活信号转导。
可通过本文中公开的或本领域中已知的多种方法来鉴定具有参照fynomer、抗体或融合多肽(FynomAb)的活性或功能的fynomer、抗体或融合多肽(FynomAb)。例如，可采用在板上(ELISA)或者在细胞上(基于细胞的ELISA)的针对IL-17a(例如，糖基化IL-17a)或IL-6R的结合测定。可使用对与IL-17a或IL-6R结合的特异性抑制作为结合特异性以及亲和力的量度。测定的实例可以是可确定功能或活性例如IL-17a或IL-6R活性(例如信号传导活性)的那些。
如本文中所述，本发明的抗体fynomer或融合多肽(FynomAb)可以是在参照序列中具有一种或更多种修饰的那些。修饰的非限制性实例可包括参照fynomer、参照抗体(重链或轻链)或融合多肽(FynomAb)的一个或更多个氨基酸替换(例如，1至3、3至5、5至10个或更多个残基)、添加(例如，1至3、3至5、5至10个或更多个残基)或缺失(例如，子序列或片段)。在一些具体实施方案中，经修饰的fynomer、抗体或融合多肽(FynomAb)至少保留未经修饰参照抗体、fynomer或融合多肽(FynomAb)的一部分功能或活性，例如对IL-6R或IL-17a(例如，糖基化IL-17a)的结合亲和力(例如，Kd、KD)或结合特异性，在体外或体内或者在细胞内或上(例如，在培养物内)，或者在体内。
Fynomer、抗体或其子序列或者FynomAb可包括分别与本文中所示的亲本或参照fynomer或者抗体重链或轻链可变区序列或者融合多肽(FynomAb)具有至少部分序列同一性(低于100％)的那些。例如，本文中所示的fynomer(SEQ ID NO：1至7)和/或托珠单抗的重链和轻链序列(SEQ ID NO：8至9)。这样的fynomer、抗体、其子序列或融合多肽(FynomAb)的同一性百分比可小至60％或者可更大(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)。同一性百分比可在如SEQ ID NO：1至9中所示序列的整个序列长度上或者在SEQ ID NO：1至9中任一个内的连续区域或范围上延伸。在一个方面，共有同一性百分比的序列的长度为5个或更多个连续氨基酸，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续氨基酸。在另一个方面，共有同一性百分比的序列的长度为20个或更多个连续氨基酸，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个连续氨基酸。在另一个方面，共有同一性百分比的序列的长度为35个或更多个连续氨基酸，例如35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、45、47、48、49或50个连续氨基酸。在又一个方面，共有同一性百分比的序列的长度为50个或更多个连续氨基酸，例如50至55、55至60、60至65、65至70、70至75、75至80、80至85、85至90、90至95、95至100或100至110个连续氨基酸。
根据本发明，提供了这样的融合多肽(FynomAb)，其具有如SEQ ID NO：1至9中所示的任意fynomer序列、抗体重链或轻链可变区，或者在SEQ ID NO：1至9的序列内包含一个或更多个氨基酸替换的序列。在一个实施方案中，经替换的fynomer和/或抗体重链和/或轻链序列可至少保留针对靶IL-17a(例如，糖基化IL-17a)和/或IL-6R的部分结合亲和力和/或特异性。
在一个实施方案中，所述fynomer序列可具有1至15、1至12、1至8、1至5、1至3个或更少(例如，1个或2个)氨基酸替换。特别地，替换将为任意fynomer序列(SEQ ID NO：1至7)内的氨基酸。
在另一个实施方案中，任何替换均不在fynomer序列内的以下基序中：GVTLFVALYDY、DLSFHKGEKFQIL、STHEY、STHEYE、STHEYED、WWEAR、DWWEAR、SLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ或QILSTHEYEDWWEAR。在另一个实施方案中，不替换fynomer序列内紧靠src环序列之后的E氨基酸残基。
所述抗体或融合多肽(FynomAb)可在恒定区或可变区(例如，高变区，例如CDR或FR区)中具有一个或更多个替换。恒定区或可变区中的一个或少数氨基酸替换是可以容许的。一个或更多个高变区中多个氨基酸的非保守替换可能影响抗体或融合多肽(FynomAb)的结合活性、特异性。
因此，修饰可包括从参照抗体、fynomer或融合多肽(FynomAb)缺失小的和大的氨基酸序列区。可任选地用另一氨基酸序列替换缺失的区域。替换的序列可与缺失区域具有相同或者更大或更小的长度。
抗体或融合多肽(FynomAb)修饰的一个具体实例是赋予不同同种型或亚类的改变，例如通过替换重链或轻链恒定区。Ig亚类的改变可导致功能或活性(例如，抗IL-6R活性、稳定性)改变或提高。另一实例是导致特征改善，例如血清稳定性和/或体内或PK半衰期提高的改变(例如，如Antibody Engineering第1卷，Konterman R和Duebel S，编辑，2010，Springer、WO 2006/130834以及Horton等，Cancer Res 68：8049(2008)中所述)。Fc中的替换的非限制性实例包括I253A、H310A、H435R、H435Q、G236R、L328R、S239D、I332E。IgG1中的替换的非限制性实例可在Fc区的以下残基处：238、252、253、254、255、256、265、272、289、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、439和/或477。
在一个实施方案中，重链或轻链CDR(CDR1、CDR2或CDR3)或FR可具有1至15、1至12、1至8、1至5、1至3个或更少(例如，1个或2个)氨基酸替换。在一个实施方案中，在可变区序列内的替换可以是例如在CDR或FR中的保守氨基酸替换。在另一个实施方案中，在可变区序列内的替换可不在CDR内。在另一个实施方案中，所述替换可在FR内。在另一个实施方案中，在可变区序列内的替换可不在FR内。赋予IL-6R结合的重链和轻链可变区CDR序列的实例示于SEQ ID NO：8和9中，即重链可变区CDR1至3是：SDHAWS、YISYSGITTYNPSLKS和SLARTTAMDY；轻链可变区CDR1至3是：RASQDISSYLN、YTSRLHS和QQGNTLPYT。
高变区内有助于抗体的抗原结合的结构决定簇(例如互补决定区(CDR)和框架区(FR))在本领域中是已知的。其他区域例如D区和J区的位置、结构和功能也是已知的。与给定靶标(例如，IL-6R)结合的抗体、其子序列或融合多肽(FynomAb)通常可具有一个或更多个与结合IL-6R之重链或轻链序列具有足够序列同一性的CDR和FR序列以至少保留部分的功能或IL-6R结合活性。例如，如本文中所例示的，如SEQ ID NO：8至9中所示的重链或轻链序列的一个或更多个CDR可保留对IL-6R具有结合特异性之抗体的至少部分功能或活性。
可使用区域可突变性分析(regional mutability analysis)来预测互补决定区(CDR)和框架区(FR)内的特定替换的影响(Shapiro等，J Immunol.163：259(1999))。简言之，序列比较指示位于Ig内含子DNA内的二核苷酸和三核苷酸序列中可突变性的等级，其预测较易突变或较不易突变的区域。可使用定量结构-活性关系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)来鉴定抗体识别结构域的性质，并且由此鉴定参与配体结合的氨基酸。基于QSAR的预测模型可继而用于预测替换(突变)的影响。例如，已使用突变对抗体与其抗原相互作用的缔合和解离速率的影响来构建两个动力学(Ka和Kd)常数的定量预测模型，其可继而用于预测其他突变对抗体的影响(De Genst等，J Biol.Chem.277：29897(2002))。因此，技术人员可使用这样的分析来预测可产生保留未经替换抗体、子序列或融合多肽(FynomAb)的至少部分活性或功能，例如保留与IL-6R至少部分结合的抗体或子序列的氨基酸替换。
可测定给定替换的影响以鉴定保留未经替换之参照抗体或融合多肽(FynomAb)的至少一部分结合活性、特异性或者抗体功能或活性的抗体和融合多肽(FynomAb)。例如，可针对IL-6R结合活性或结合特异性来测定与IL-6R结合之抗体或融合多肽(FynomAb)的高变区中的氨基酸替换、添加、缺失或插入。因此，包括具有氨基酸替换以及添加、缺失和插入的抗体和融合多肽(FynomAb)，只要至少部分地保留在体外细胞上(例如在培养物中)或在体内的至少一部分功能或活性，例如结合亲和力、结合特异性、与靶标(例如IL-6R)结合。
术语“同一性”及其语法上的变化形式意指提及的两个或更多个实体相同。因此，当两条氨基酸序列相同时，其具有相同的氨基酸序列。同一性可在序列的限定范围(区域或结构域)上。同一性或同源性的“范围、区域或结构域”意指提及的两个或更多个实体的一部分共有同源性或相同。因此，当两条序列在一个或更多个序列区上相同时，其在这些区域中共有同一性。
氨基酸替换可以是保守的或非保守的。“保守替换”意指一个氨基酸被生物学上、化学上或结构上相似的残基替代。生物学上相似意指替换与生物活性相兼容，即保留与IL-17a或IL-6R结合。结构上相似意指氨基酸具有类似长度(例如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸)或类似大小的侧链。化学相似性意指残基具有相同的电荷或者二者都是亲水性或疏水性的。具体的非限制性实例包括用一种疏水性残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)替换另一种疏水性残基，或者用一种极性残基替换另一种极性残基，例如用精氨酸替换赖氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸或者用谷氨酰胺替换天冬酰胺、用丝氨酸替换苏氨酸等。
除可用D-氨基酸替换天然存在的L-氨基酸之外，氨基酸替换可用相同的氨基酸来进行。因此，修饰包括替换L氨基酸的一种或更多种D-氨基酸或者替换L-氨基酸的D-氨基酸混合物。
两条序列之间的同一性程度可使用本领域中已知的计算机程序和数学算法来确定。计算序列同一性(同源性)百分比的这样的算法一般将在比较区域或范围内的序列空位和错配考虑在内。例如，BLAST(例如，BLAST 2.0)检索算法(参见，例如Altschul等，J.Mol.Biol.215：403(1990)，可通过NCBI公开获得)具有如下示例性检索参数：错配-2；空位开放5；空位延伸2。对于多肽序列比较，通常将BLASTP算法与评分矩阵(例如PAM100、PAM250、BLOSUM 62或BLOSUM 50)组合使用。还使用FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)和SSEARCH序列比较程序来量化同一性程度(Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185(2000)；和Smith等，J.Mol.Biol.147：195(1981))。还已经开发了使用基于Delaunay的拓扑映射(topological mapping)来量化蛋白质结构相似性的程序(Bostick等，Biochem.Biophys.Res.Commun.304：320(2003))。
修饰包括参照组合物的活性或功能(例如，对IL-17a或IL-6R的亲和力或特异性结合)的改变。具有经改变特征(例如亲和力提高、拮抗剂活性提高)的经修饰fynomer、抗体和融合多肽(FynomAb)可使用本领域中已知的方法来产生。例如，可使用亲和力成熟技术来提高抗体结合亲和力(US 2004/0162413 A1；美国专利No.6,656,467、6,531,580、6,590,079和5,955,358；Fiedler等，Protein Eng.15：931(2002)；Pancook等，Hybrid.Hybridomics20：383(2001)；Daugherty等，Protein Eng.11：825(1998)；Wu等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95：6037(1998)；以及Osbourn等，Immunotechnology 2：181(1996))。
fynomer、抗体和融合多肽(FynomAb)包含如本文中所示的子序列(例如，片段)和经修饰形式(例如，序列变体)。fynomer子序列指参照fynomer的功能性片段或子序列，例如SEQ ID NO：1至7中任一个缺失一个或更多个氨基酸的序列。“抗体”子序列指免疫球蛋白的功能性片段或子序列。抗体子序列的非限制性实例可包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、VL、VH、双抗体((VL-VH)2或(VH-VL)2)、三链抗体(三价体)、四链抗体(四价体)、微抗体((scFV-CH3)2)、IgGδCH2、scFv-Fc或(scFv)2-Fc片段。在一些具体方面，Fab、Fab’、F(ab，)2、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、VL、VH、双抗体((VL-VH)2或(VH-VL)2)、三链抗体(三价体)、四链抗体(四价体)、微抗体((scFV-CH3)2)、IgGδCH2、scFv-Fc和(scFv)2-Fc子序列。这样的子序列和融合多肽(FynomAb)可具有SEQ ID NO：8或9中任一个中所示序列的至少一部分(例如，SEQ ID NO：8至9的一个或更多个CDR(重链或轻链可变区序列的CDR1至CDR3)和/或FR)。
在一些具体方面，子序列具有基本相同或者具有相同的IL-17a或IL-6R结合亲和力或者IL-17a或IL-6R结合特异性，或者IL-17a结合fynomer或IL-6R结合抗体在体外或体内、在体外或体内细胞上的一种或更多种功能或活性。术语“功能性子序列”和“功能性片段”当提及fynomer、抗体和融合多肽(FynomAb)时指fynomer或抗体或融合多肽(FynomAb)的与完整参照fynomer或抗体或融合多肽(FynomAb)保留一种或更多种功能或活性的至少一部分的部分，所述完整参照fynomer或抗体或融合多肽(FynomAb)例如，与IL-17a结合的fynomer、与IL-6R结合的抗体或与IL-17a和IL-6R结合的融合多肽(FynomAb)。
抗体子序列(包括单链抗体)可包括单独或者与以下一个或更多个的全部或一部分组合的重链或轻链可变区的全部或一部分(例如，CDR1、CDR2或CDR3)：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。还包括重链或轻链可变区(例如，CDR1、CDR2或CDR3)与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合的抗原结合子序列。
本发明中包括的双特异性融合多肽(FynomAb)的另外修饰是添加(衍生物)/插入。添加的实例可包括多肽序列的添加，所述多肽序列是具有一个或更多个与该序列共价连接的参照天然(野生型)序列中通常不存在的分子的氨基酸序列。肽添加的一个具体实例是其中连接(共价或非共价结合)有赋予双特异性融合多肽(FynomAb)独特或互补功能的第二异源序列(即，异源功能性结构域)的肽添加。因此，双特异性融合多肽(FynomAb)可包含异源结构域，其中所述结构域赋予独特的功能，即异源功能性结构域。例如，Fc区可以是包含人IgG1和IgG3Fc区的一部分的嵌合体。
可用于本发明的异源功能性结构域不局限于氨基酸残基或结构域。因此，异源功能性结构域可由任意多种不同类型的大或小功能性部分组成。这样的部分可包括核酸、肽、碳水化合物、脂质、小有机分析/化合物(例如药物(例如抗细胞增殖药物))、金属(金、银)或放射性同位素。因此，在另一个实施方案中，在此提供了经可检测地标记的FynomAb。
异源结构域的非限制性实例可包括纯化或检测标签和标记。纯化和可检测(检测)标签或标记的具体实例可包括酶(辣根过氧化物酶、脲酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素转移酶)；酶底物；配体(例如，生物素)；受体(亲和素)；放射性同位素/放射性核素(例如，C14、S35、P32、P33、H3、I125、I131、镓-67和68、钪-47、铟-111和镭-223)；T7-、多组氨酸、His-、myc-、HA--和FLAG-标签；电子致密试剂；能量转移分子；顺磁标记；荧光团(荧光素、罗丹明、藻红素)；生色团；化学发光剂(咪唑、萤光素酶)；生物发光剂；造影剂(例如，钆、锰、硫酸钡、碘化剂或非碘化剂)；离子剂或非离子剂；磁剂和顺磁剂(例如，铁氧化物螯合物)；纳米颗粒；辅基(例如，链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素)；荧光物质(例如，伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白)；发光物质(例如，鲁米诺)；或者生物发光物质(例如，萤光素酶、萤光素、水母蛋白(aequorin))。酶通常通过其活性来进行检测。例如，辣根过氧化物酶通常通过其将底物(例如3，3-'，5，5-’-四甲基联苯胺(TMB))转化成可量化的蓝色颜料的能力来进行检测。配体可结合其他分子，例如生物素和IgG，而生物素可结合亲和素或链霉亲和素，IgG可结合蛋白A。
可检测标记的其他非限制性实例可包括放射性物质(例如放射性同位素)、金属或金属氧化物。放射性同位素包括发射α、β或γ辐射的放射性核素，例如以下中的一种或更多种：3H、10B、18F、11C、14C、13N、18O、15O、32P、P33、35S、35Cl、45Ti、46Sc、47Sc、51Cr、52Fe、59Fe、.57Co、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As76Br、77Br、81mKr、82Rb、85Sr、89Sr、86Y、90Y、95Nb、94mTc、99mTc、97Ru、103Ru、105Rh、109Cd、111In、113Sn、113mIn、114In、I125、I131、140La、141Ce、149Pm、153Gd、157Gd、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、169Yb、175Yb、177Lu、186Re、188Re、201Tl、203Pb、211At、212Bi或225Ac。
可检测标记的又一些非限制性实例可包括金属或金属氧化物，例如金、银、铜、硼、锰、钆、铁、铬、钡、铕、铒、镨、铟或锝。
可用作与融合多肽(FynomAb)的抗体连接的异源结构域的药物可以是细胞毒剂。在此情形下使用的术语“细胞毒剂”指降低、抑制、阻抑、减小、干扰或阻断细胞的功能或生长的物质，和/或导致细胞破坏的物质。细胞毒剂可用于杀死靶细胞或者抑制靶细胞的增殖或复制。
细胞毒剂的实例可包括白喉毒素、霍乱毒素、篦麻蛋白和丝裂霉素C。其他实例包括刺孢霉素(Calicheamicin)、倍癌霉素(Duocarmycin)、PBD、阿里他汀类和多拉司他汀类(美国专利No.5,635,483和5,780,588)；刺孢霉素(美国专利No.5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296)、吉西他滨、顺铂、多柔比星、伊立替康、BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱和5-氟尿嘧啶(美国专利No.5,770,710；还参见例如美国专利No.4,362,663、4,371,533、5,475,092、5,585,499、5,846,545和6,333,410)。
细胞毒剂的另一些实例可包括紫杉烷类(例如，泰素)和美登素类(maytansinoid)。抑制哺乳动物细胞中的微管形成的美登素类实例可包括美登醇(maytansinol)及美登醇类似物。美登醇类似物的实例包括具有经修饰芳环的那些以及在其他位置具有修饰的那些(参见，例如美登素(maytansine)及美登素类，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)；合成的美登醇及其衍生物和类似物(美国专利No.4,137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,364,866、4,424,219、4,450,254、4,362,663和4,371,533)。
双特异性融合多肽FynomAb可具有添加(addition)或者可以是衍生物。例如，所述多肽可包含糖残基、磷酸基团、泛素、脂肪酸或脂质，或者可以是糖基化的、磷酸化的、乙酰化的、酰胺化的或甲酰化的。所述多肽可通过保护/封闭基团或多种化学修饰中的任一种衍生而来。多肽的修饰还可以是分子内或分子间二硫键。
可在fynomer和/或抗体序列与异源功能性结构域之间插入接头(例如氨基酸或肽拟序列(peptidimimetic sequence))，使得这两个实体至少部分地维持独特的功能或活性。在一个实施方案中，在紧接重(H)链或轻(L)链之氨基(NH2)端或羧基(C)端的最后一个氨基酸之后将fynomer结构域与重(H)链或轻(L)链连接。接头可具有一种或更多种特性，包括柔性构象、不能够形成有序的二级结构或者疏水性或带电性，其可促进任一结构域或与任一结构域相互作用。通常见于柔性蛋白质区域中的氨基酸的实例可包括Gly、Asn和Ser。其他接近中性的氨基酸(例如Thr和Ala)也可用于接头序列。接头序列的长度可变化而不显著影响融合蛋白的功能或活性(参见，例如美国专利No.6,087,329)。在一个具体方面，通过具有约1至25个氨基酸残基的肽序列来连接fynomer和抗体重链或轻链。
接头的实例还可包括化学部分和缀合剂，例如磺基-琥珀酰亚胺基衍生物(磺基-SMCC、磺基-SMPB)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)和酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)。接头还包括线性碳链，例如CN(其中N＝1至100个碳原子，例如C、CC、CCC、CCCC、CCCCC、CCCCCC、CCCCCCC、CCCCCCCC)。
应理解，fynomer、抗体或子序列可具有多种(例如，两种或更多种)变化、修饰或标记。例如，抗体的重链或轻链序列可与生物素偶联使得其可用亲和素进行检测，以及用I125标记使得其提供可检测的信号。其他的排列和可能性对本领域普通技术人员而言是显而易见的并且认为在本发明的范围之内。
抗体和融合多肽(FynomAb)的实例可包括哺乳动物、人、人源化和灵长类动物源化序列。术语“人”在提及抗体时意指氨基酸序列是全人来源的。因此，“人抗体”指与靶标特异性结合的具有人免疫球蛋白氨基酸序列，即人重链和轻链可变区和恒定区的抗体。因此，“人IL-6R抗体”或“人抗IL-6R抗体”指具有人免疫球蛋白氨基酸序列并且与IL-6R结合的抗体。即，抗体氨基酸的全部都是人的，或者可或确实存在于人抗体中。因此，例如非人抗体可通过用可或确实存在于人抗体中的氨基酸残基替换非人氨基酸残基而制成全人的。人抗体中存在的氨基酸残基、CDR区图谱和人抗体共有残基在本领域中是已知的(参见，例如Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版.US Department ofHealth and Human Services.Public Health Service(1987)；以及Chothia和LeskJ.Mol.Biol.186：651(1987))。人VH亚组III的共有序列(基于对22条已知人VH III序列的研究)和人VLκ链亚组I的共有序列(基于对30条已知人κI序列的研究)在PadlanMol.Immunol.31：169(1994)；和Padlan Mol.Immunol.28：489(1991)中进行了描述。因此，人抗体包括其中一个或更多个氨基酸残基已替换成另一人抗体中存在的一个或更多个氨基酸的抗体。
术语“人源化”当提及抗体使用时意指该抗体的氨基酸序列在受体人免疫球蛋白分子中与期望靶标(例如，IL-6R)特异性结合的一个或更多个决定区(CDR)中具有非人氨基酸残基(例如，小鼠、大鼠、山羊、兔、非人灵长类动物等)，并且在Fv框架区(FR)中具有一个或更多个人氨基酸残基，其是位于CDR侧翼的氨基酸残基。可用对应的非人残基来替代免疫球蛋白的人框架区残基。因此，例如，可用来自非人CDR供体抗体的对应残基替换人框架区中的残基以改变、一般性地提高抗原亲和力或特异性。另外，人源化抗体可包含在人抗体或者供体CDR或框架序列二者中均不存在的残基。例如，可预测特定位置之人抗体或供体非人抗体中不存在的框架替换提高人抗体在该位置处的结合亲和力或特异性。
基于分子建模的抗体框架和CDR替换在本领域中是已知的，例如通过对CDR与框架残基相互作用的建模来鉴定对抗原结合重要的框架残基，并进行序列比较来鉴定特定位置处的不寻常框架残基(参见，例如美国专利No.5,585,089；和Riechmann等，Nature 332：323(1988))。称为“灵长类动物源化”的抗体在本文中使用的“人源化”的含义之内，不同之处在于，除任何人残基之外，受体人免疫球蛋白分子和框架区氨基酸残基还可以是任何灵长类动物氨基酸残基(例如，猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)。
Fynomer和抗体子序列可通过遗传技术来制备，包括在宿主细胞中表达fynomer或抗体编码序列的全部或一部分。IL-6R结合抗体可使用以下技术来产生，包括常规的杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术，或者其组合(参见美国专利No.4,902,614、4,543,439和4,411,993；还参见Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，Kennett、McKearn和Bechtol(编辑)，1980；以及Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)。还可通过从动物(包括灵长类动物或人对象)直接克隆免疫球蛋白序列来获得IL-6R结合单克隆抗体。
可用IL-6R免疫动物(例如小鼠、兔、大鼠、绵羊、母牛(cow)或公牛(steer)、绵羊、山羊、猪、马、豚鼠和灵长类动物，包括人)来获得与IL-6R结合的抗体。这样的动物可以是具有能够表达人抗体的人IgG基因座(例如，λ或κ轻链)的经遗传改造的非人动物。具有一个或更多个不表达内源性免疫球蛋白的人免疫球蛋白基因(κ或λ)的转基因动物在例如美国专利No.5,939,598中进行了描述。因此，可使用这样的动物来产生人抗体。所述动物的非限制性实例可包括可产生人免疫球蛋白基因(WO02/43478)和HAC小鼠(WO02/092812)的人转染色体KM小鼠TM(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722(2000)；和Ishida等，CloningStem Cells 4：91(2004))。可利用使用从对抗原作出响应之经免疫动物分离并与骨髓瘤细胞融合的脾细胞的常规杂交瘤技术来获得人单克隆抗体。用于产生人多克隆抗体和人单克隆抗体的另外的方法也有所描述(参见，例如Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.20：889(2002)；WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利No.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771和5,939,598)。用于产生人抗体的技术的综述在Lonberg和Huszar(Int.Rev.Immunol.13：65(1995))中进行了描述。
还可通过蛋白水解来产生Fynomer和抗体子序列。例如可用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶来消化抗体。通过用胃蛋白酶进行酶促切割产生的抗体片段提供表示为F(ab’)2的5S片段。可使用巯基还原剂进一步切割该片段以产生3.5S Fab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab’片段和Fc片段(参见，例如美国专利No.4,036,945和4,331,647；以及Edelman等，Methods Enymol.1：422(1967))。还可使用其他切割抗体的方法，例如分离重链以形成单价的轻-重链片段、进一步切割片段或者其他酶促或化学切割。可如美国专利No.4,946,778和5,258,498；Huston等，Methods Enzymol.203：46(1991)；Shu等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90：7995(1993)；以及Skerra等，Science 240：1038(1988)中所述产生单链Fv和抗体。
可使用本领域中已知的多种技术来人源化抗体，包括例如CDR移植(EP 239,400；W091/09967；美国专利No.5,225,539、5,530,101和5,585,089)、面饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunol.28：489(1991)；Studnicka等，Protein Engineering 7：805(1994)；Roguska.等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 91：969(1994))和链混编(chain shuffling)(美国专利No.5,565,332)。可使用人共有序列(Padlan，Mol.Immunol.31：169(1994)；和Padlan，Mol.Immunol.28：489(1991))来人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；和Presta等，J.Immunol.151：2623(1993))。
用于产生嵌合抗体的方法在领域中是已知的(例如，Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等，J.Immunol.Methods 125：191(1989)；以及美国专利No.5,807,715、4,816,567和4,816,397)。其中将来自一种物种之抗体的可变结构域替换成另一物种的可变结构域的嵌合抗体在例如以下中进行了描述：Munro，Nature 312：597(1984)；Neuberger等，Nature 312：604(1984)；Sharon等，Nature309：364(1984)；Morrison等，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 81：6851(1984)；Boulianne等，Nature 312：643(1984)；Capon等，Nature 337：525(1989)；和Traunecker等，Nature 339：68(1989)。
还提供了编码fynomer、抗体和融合多肽(FynomAb)的核酸。在一个实施方案中，核酸编码与结合IL-17a的任一fynomer序列具有至少60％或更高(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列，例如与编码如SEQ ID NO：1至7中所示多肽的核酸序列具有至少60％或更高同一性的序列。
在另一个实施方案中，核酸编码与如SEQ ID NO：8或9中所示的任一重链或轻链可变区序列具有至少60％或更高(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一个实施方案中，核酸编码与任意结合IL-17a之fynomer序列(例如SEQ ID NO：1至7中所示的序列)融合或缀合的结合IL-6R之抗体的任一重链或轻链可变区序列(例如SEQ ID NO：8或9中所示的重链或轻链序列)具有至少60％或更高(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在另一个实施方案中，核酸编码具有SEQ ID NO：1至7或者SEQ IDNO：8或9或者包含与任意SEQ ID NO：8或9融合之SEQ ID NO：1至7中的任一个的融合多肽的一个或更多个氨基酸添加、缺失或替换的序列。
术语“核酸”和“多核苷酸”等指通过磷酸二酯键或等效键连接的至少两个或更多个核糖核酸或脱氧核糖核酸碱基对(核苷酸)。核酸包括多核苷酸和多核苷。核酸包括单链、双链或三链的环状或线性分子。示例性的核酸包括但不限于RNA、DNA、cDNA、天然核酸和非天然核酸(例如合成核酸)。
核酸可具有不同的长度。核酸长度的范围通常为约20个核苷酸至20Kb，或者在这些长度之内或涵盖这些长度的任何数值或范围，长度为10个核苷酸至10Kb、1至5Kb或更短、1000至约500个核苷酸或更短。核酸还可更短，例如长度为100至约500个核苷酸或者约12至25、25至50、50至100、100至250或约250至500个核苷酸，或者在这些长度之内或涵盖这些长度的任何数值或范围或值。在一些具体方面，核酸序列的长度为约10至20、20至30、30至50、50至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至400、400至500、500至1000或1000至2000个核苷酸，或者在这些长度之内或涵盖这些长度的任何数值或范围。通常将较短的多核苷酸称为单链DNA或双链DNA的“寡核苷酸”或“探针”。然而，对这样的寡核苷酸的长度没有上限。
术语“分离的”当涉及组分(例如，fynomer、抗体、重链或轻链序列、融合多肽(FynomAb)、其编码核酸等)使用时意指该组分通过人工制成或者完全地或至少部分地与其天然存在的体内环境分离。一般来说，分离的组分基本不含通常在自然界中与其相关的一种或更多种物质，例如一种或更多种蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜。术语“分离的”不排除通过人工产生的该组分的作为替代的物理形式，例如多聚体/寡聚体、变体、修饰形式或衍生化形式或者在宿主细胞中表达的形式。术语“分离的”也不排除通过人工产生的包含该组分的组合物或制剂。
当“分离的”组分不含通常在自然界中与其相关的大部分或全部物质时，其还可以是“经纯化的”。因此，例如，还是基本纯的或经纯化的分离融合多肽(FynomAb)不包括存在于数百万条其他序列中的多肽或多核苷酸，例如多肽文库中或者基因组或cDNA文库中的核酸。“经纯化的”组分可与一种或更多种其他分子组合。因此，“经纯化的”不排除组分的组合，例如FynomAb的组合(多个FynomAb)以及FynomAb与其他活性剂或药物的组合。
核酸可使用多种标准的克隆和化学合成技术来产生。技术包括但不限于核酸扩增，例如使用能够退火于抗体编码序列的引物(例如，简并引物混合物)以基因组DNA或cDNA靶标来进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)。还可通过化学合成(例如，固相亚磷酰胺合成)或由基因转录来产生核酸。然后，可将产生的序列体外翻译或者克隆到质粒中并在细胞(例如，宿主细胞例如原核细胞或哺乳动物细胞，酵母或细菌，动物或植物)中增殖，随后表达。
可将核酸插入到其中通过“表达控制元件”来影响或调控该核酸的表达的核酸构建体中。“表达控制元件”指与核酸可操作地连接的调控或赋予其表达的核酸序列元件。表达控制元件在适当时包括启动子、增强子、转录终止子、基因沉默子、在蛋白质编码基因之前的起始密码子(例如，ATG)等。
与核酸序列可操作地连接的表达控制元件控制核酸序列的转录，并且在适当时控制核酸序列的翻译。表达控制元件包括组成型地激活转录的元件，其是诱导型的(即，需要外部信号来激活)或者是去阻遏型(即，需要关闭转录的信号；当信号不再存在时，转录被激活或者“去阻遏”)的或者是细胞类型或组织特异性的(即，组织特异性控制元件)。
可将核酸插入到质粒中以用于在宿主细胞中增殖并用于后续遗传操作。质粒是可在宿主细胞中增殖的核酸；质粒可任选地包含表达控制元件以驱动编码fynomer、抗体(重链或轻链)或融合多肽(FynomAb)的核酸在宿主细胞中表达。载体在本文中与质粒同义使用并且也可包含表达控制元件以用于在宿主细胞中表达(例如，表达载体)。质粒和载体一般至少包含用于在细胞中增殖的复制起点和启动子。因此，质粒和载体可用于遗传操作和表达fynomer、抗体(重链或轻链)或融合多肽(FynomAb)。
编码fynomer、抗体(重链或轻链)或融合多肽(FynomAb)的核酸可合成产生或者使用重组方法产生或者从例如杂交瘤的细胞分离。可将分离的核酸插入到合适的表达载体中并引入合适的宿主细胞(例如，CHO、植物细胞和其他细胞)中，可培养所述宿主细胞以产生fynomer、抗体(重链或轻链)或融合多肽(FynomAb)。
根据本发明，提供了表达或转化有编码本发明的fynomer、抗体(重链或轻链)或融合多肽(FynomAb)的核酸的宿主细胞。可稳定地或瞬时转染宿主细胞及其子代以表达fynomer、抗体(重链或轻链)或融合多肽(FynomAb)。
宿主细胞可包括但不限于原核细胞和真核细胞，例如细菌、真菌(酵母)、植物、昆虫和动物(例如，哺乳动物，包括灵长类动物和人)的细胞。例如，转化有重组噬菌体核酸、质粒核酸或黏粒核酸表达载体的细菌；转化有重组酵母表达载体的酵母；感染有重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或者转化有重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)的植物细胞系统；感染有重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)的昆虫细胞系统；以及感染有重组病毒表达载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒)的动物细胞系统；或者工程化成稳定表达的经转化动物细胞系统。
术语“经转化的”或“经转染的”当提及细胞(例如，宿主细胞)或生物体使用时意指在将外源分子(例如，蛋白质或核酸(例如，转基因))引入细胞中之后该细胞中发生的遗传改变。因此，“经转染的”或“经转化的”细胞是其中已通过人工(例如，通过重组DNA技术)引入外源分子的细胞或其子代。
可使细胞增殖使得产生期望的多肽。经转染或经转化细胞的子代可与亲代细胞不同，因为在复制期间可发生突变。
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的双特异性融合多肽以及可药用或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本文中使用的术语“可药用”和“生理学上可接受的”当提及载体、稀释剂或赋形剂是可以是与药物施用相容并且与该组合物中的其他组分相容的溶剂(水性的或非水性的)、洗涤剂、溶液、乳剂、分散介质、包衣或者等张剂和吸收促进剂或延迟剂。本发明的药物组合物可以以下形式提供：片剂(带有包衣或不带包衣)、胶囊剂(硬或软)、微珠、乳剂、散剂、颗粒剂、结晶、混悬剂、糖浆剂或酏剂。
可将药物组合物配制成使得其与特定的施用途径或用途相容。用于肠胃外、皮内或皮下施用的药物组合物可包含无菌的稀释剂，例如水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。所述组合物还可包含一种或更多种防腐剂以防止微生物生长(例如，抗菌剂，例如苄醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如EDTA；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖)。
注射用药物组合物可以是无菌水溶液(当是水溶性的时)的形式或者由分散介质和无菌散剂组成的用于无菌可注射溶液或分散体的的临时制剂形式。对于静脉内施用，合适载体的实例可包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)和磷酸缓冲盐水(PBS)。所述载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇)或其合适混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)或者通过使用表面活性剂来维持流动性。抗细菌剂和抗真菌剂的实例可包括尼泊金类、氯丁醇、酚、抗坏血酸和硫柳汞。包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可延长可注射组合物的吸收。可向组合物中添加例如多至1％的聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。添加剂的其他非限制性实例可包括组氨酸HCl、α，α-海藻糖脱水物(α，α-treahlose dehydrate)。
另外的药物制剂和递送系统是本领域技术人员已知的并且适用于本发明的方法(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)第18版，Mack PublishingCo.，Easton，PA；The Merck Index(1996)第12版，Merck Publishing Group，Whitehouse，NJ；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms，Technonic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，Pa.，(1993)；以及Poznansky等，Drug Delivery Systems，R.L.Juliano，编辑，Oxford，N.Y.(1980)，第253-315页)。
本发明提供了所述双特异性融合多肽用于调节或治疗与IL-17a和/或IL-6R功能或活性相关的应答、病症或疾病的方法和用途。应答、病症和疾病的实例可包括但不限于免疫应答、病症和疾病，炎性应答、病症和疾病，以及炎症。应答、病症和疾病的实例还包括但不限于自身免疫性应答、病症和疾病。所述应答的实例还可包括T细胞和/B细胞性应答、病症和疾病。
在一个实施方案中，提供了这样的方法或用途，其中向需要治疗免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，或者炎症的对象施用如本文中所示的双特异性融合多肽或药物组合物。在另一个实施方案中，提供了用于治疗自身免疫性病症或疾病的方法或用途。在另一个实施方案中，提供了用于调节T细胞和/或B细胞应答或者用于治疗与T细胞和/或B细胞应答相关的病症和疾病的方法或用途。在另一个实施方案中，提供了用于调节IL-17a和/或IL-6R功能或活性的方法或用途。
可根据本发明来调节或治疗的应答、病症和疾病的实例可包括但不限于急性和慢性的不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，或者炎症。所述应答、病症和疾病的实例还可包括但不限于急性和慢性的自身免疫性应答、病症和疾病。所述应答、病症或疾病可以是由抗体或细胞或者抗体和细胞的组合介导的那些。另外，应答、病症和疾病可以是由IL-17a和/或IL-6R功能或活性介导的那些。再者，应答、病症和疾病可以是通过调节IL-17a和/或IL-6R功能或活性可治疗的那些。
在一个实施方案中，提供了所述双特异性融合多肽用于在对象中降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制急性或慢性的不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，或者炎症的方法或用途。在一个实施方案中，提供了用于在对象中降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制急性或慢性自身免疫性应答、病症或疾病的方法或用途。在另一个实施方案中，提供了用于在对象中降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制抗体和/或细胞介导的急性或慢性应答、病症或疾病的方法或用途。在又一个实施方案中，提供了用于降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制由IL-17a和/或IL-6R功能或活性介导的急性或慢性应答、病症或疾病的方法或用途。在又一个实施方案中，提供了用于降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制通过调节IL-17a和/或IL-6R功能或活性可治疗的急性或慢性应答、病症或疾病的方法或用途。
术语“免疫性病症”和“免疫性疾病”意指基于病症或疾病以不同生理症状或异常为特征的免疫功能或活性。本文中使用的“不期望免疫性应答”或“异常免疫性应答”指大于或小于期望的或生理学上正常的应答、活性或功能的任何免疫性应答、活性或功能。实例包括急性或慢性免疫性应答、活性或功能。“不期望的免疫性应答”一般表征为免疫系统的不期望或异常提高的或不适当的应答、活性或功能。然而，不期望的免疫性应答、功能或活性可以是例如正常的应答、功能或活性。因此，正常免疫性应答只要其是不期望的，即使不认为是异常的也包括在这些术语的含义之内。不期望的免疫性应答、功能或活性还可以是异常的应答、功能或活性。异常(失常)的免疫性应答、功能或活性偏离正常。
不期望或异常免疫性应答的一个非限制性实例是其中免疫性应答是超应答性的，例如在自身免疫性病症或疾病的情况下。不期望或异常免疫性应答的另一个非限制性实例是其中免疫性应答在任何组织或器官中均导致急性或慢性炎性应答或炎症，所述组织或器官例如骨骼关节(类风湿性关节炎、幼年型特发性关节炎)、肺或气道(变态反应)或者肠或胃肠道(克罗恩病(Crohn's disease)、炎性肠病(inflammatory bowel disease IBD)或溃疡性结肠炎)。
不期望或异常的免疫性应答、炎性应答、炎症以很多不同的生理学不良症状或并发症为特征，其可以是体液的、细胞介导的或其组合。可根据本发明治疗的应答、病症和疾病包括但限于直接或间接在对象中导致或引起细胞或组织/器官损伤的那些。在整体、区域或局部水平，免疫性应答、炎性应答或炎症可以以肿胀、疼痛、头痛、发热、恶心、骨骼关节疼痛、肿胀、僵硬或活动性缺乏、皮疹、发红或其他变色为特征。在细胞水平，免疫性应答、炎性应答或炎症可以以下中的一种或更多种为特征：T细胞活化和/或分化，被巨噬细胞、单核细胞等细胞浸润区域，产生抗体，产生细胞因子、淋巴因子、趋化因子、干扰素和白介素，细胞生长和成熟因子(例如，增殖和分化因子)，细胞累积或迁移以及细胞、组织或器官损伤。因此，本发明的方法和用途包括对免疫性应答、炎性应答或炎症特征性的任何此类生理学症状或者细胞或生物应答的治疗和改善效应。
自身免疫性应答、病症和疾病一般表征为免疫系统的不期望或异常应答、活性或功能，其以提高的或不期望的体液或细胞介导的免疫应答性或记忆，或者对自体抗原的耐受性降低或不足为特征。可根据本发明治疗的自身免疫性应答、病症和疾病包括但不限于在对象中导致细胞或组织/器官损伤的应答、病症和疾病。
在一个实施方案中，提供了在对象中降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制不期望或异常免疫性应答、免疫性病症、炎性应答或炎症的方法或用途。在另一个实施方案中，提供了在对象中降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制自身免疫性应答、病症或疾病的方法或用途。在另一个实施方案中，提供了用于降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制不期望或异常免疫性应答、免疫性病症、炎性应答或炎症的不良症状或者自身免疫性应答、病症或疾病的不良症状的方法或用途。
在一个方面，根据本发明的方法或用途可导致病症(例如，不期望或异常免疫性应答、免疫性病症、炎性应答或炎症)的症状的发生、频率、严重程度、进程或持续时间降低。例如，本发明的方法或用途可保护对象免受不期望或异常免疫性应答、免疫性病症、炎性应答或炎症，或者自身免疫性应答、病症或疾病的发展或者降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制其不良症状的严重程度、频率、持续时间或概率。
不期望或异常免疫性应答、免疫性病症、炎性应答或炎症的不良症状，或者自身免疫性应答、病症或疾病的不良症状的实例可包括肿胀、疼痛、皮疹、变色、头痛、发热、恶心、腹泻、腹胀、嗜睡、骨骼关节僵硬或活动性降低、呼吸困难、肌肉或肢体活动性降低、麻痹、感觉受损，例如视力或组织或细胞损伤。所述不良症状可发生在机体的特定组织或器官或者区域或部位中，例如皮肤、表皮或黏膜组织、肠胃(gut)、胃肠、肠、生殖泌尿道、胰、胸腺、肺、肝、肾、肌肉、中枢神经或外周神经、脾、皮肤、骨骼关节(例如，膝、踝、髋、肩、腕、指、趾或肘)、血管或淋巴管或者心肺组织或器官。自身免疫性应答、病症或疾病的不良症状的其他实例可包括T细胞产生、存活、增殖、活化或分化和/或自身抗体的产生或者促炎细胞因子或趋化因子(例如，IL-17a和IL-6)的产生。
异常或不期望免疫性应答、病症或疾病的非限制性实例可包括根据本发明可治疗的炎性应答、病症和疾病，炎症，自身免疫性应答、病症和疾病，其包括多肌炎、血管炎综合征、巨细胞性动脉炎、大动脉炎(Takayasu arteritis)、复发性、多软骨炎、获得性血友病A、斯蒂尔病(Still′s disease)、成年型斯蒂尔病(adult-onset Still's disease)、淀粉样蛋白A淀粉样变性、风湿性多肌痛、脊椎关节炎、肺动脉高血压、移植物抗宿主病、自身免疫性心肌炎、接触性超敏反应(接触性皮炎)、胃食管反流病、红皮病、白塞病(
Figure GDA0001875602890000392
disease)、肌萎缩侧索硬化、移植、视神经脊髓炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、恶性类风湿性关节炎、抗药性类风湿性关节炎、视神经脊髓炎、川崎病(Kawasakidisease)、多关节性或全身性幼年型特发性关节炎、银屑病、慢性阻塞性肺病(chronicobstructive pulmonary disease，COPD)、卡斯尔曼病(Castleman’s disease)、哮喘、变应性哮喘、变应性脑脊髓炎、关节炎、慢性进行性关节炎、反应性关节炎、银屑病关节炎、肠病性关节炎、变形性关节炎、风湿性疾病、脊椎关节病、强直性脊柱炎、莱特尔综合征(Reitersyndrome)、超敏反应(包括气道超敏反应和皮肤超敏反应二者)、变态反应、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、皮肤红斑狼疮、麻风结节性红斑、舍格伦综合征(
Figure GDA0001875602890000391
Syndrome)、炎性肌病、多软骨炎、韦氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)、皮肌炎、史-约综合征(Steven-Johnson syndrome)、慢性活动性肝炎、重症肌无力、特发性口炎性腹泻、自身免疫性炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠易激综合征、内分泌性眼病、硬皮病、格雷夫斯病(Grave’s disease)、结节病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、阴道炎、直肠炎、胰岛素依赖型糖尿病、胰岛素抵抗型糖尿病、幼年型糖尿病(I型糖尿病)、自身免疫性血液病、溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞性贫血、特发性血小板减少(idiopathic thrombocytopenia，ITP)、自身免疫性葡萄膜炎、葡萄膜炎(前葡萄膜炎和后葡萄膜炎)、干燥性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、间质性肺纤维化、肾小球肾炎(具有和不具有肾病综合征)、特发性肾病综合征或微小病变性肾病、炎性皮肤病、角膜炎症、肌炎、骨植入物松动、代谢病、动脉粥样硬化、血脂异常、骨脱失、骨关节炎、骨质疏松症、阻塞性或炎性气道疾病的牙周病、支气管炎、尘肺病、肺气肿、急性和超急性炎性反应、急性感染、感染性休克、内毒素性休克、成人型呼吸窘迫综合征、脑膜炎、肺炎、恶病质消耗综合征、卒中、疱疹性基质性角膜炎、干眼病、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)、僵人综合征(Stiff-man syndrome)、桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、自身免疫性甲状腺炎、脑脊髓炎、急性风湿热、交感性眼炎、肺出血肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、系统性坏死性血管炎、抗磷脂综合征、艾迪生病(Addison′s disease)、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、疱疹样皮炎、特应性皮炎、湿疹性皮炎、阿弗他溃疡(aphthous ulcer)、扁平苔藓、自身免疫性脱发、白癜风(Vitiligo)、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、恶性贫血、感音神经性听力丧失、特发性双侧进行性感音神经性听力丧失、I型或II型自身免疫性多腺性综合征、免疫性不育或免疫介导的不育。
术语“接触”意指两个或更多个实体之间(例如，融合多肽(FynomAb)与靶标(例如IL-17a和/或IL-6R)之间)直接或间接相互作用。直接相互作用的一个具体实例是结合。本文中使用的接触可以是在溶液中、固相中、体外、离体、细胞中或体内的接触。可将体内接触称为向对象或患者施用或递送。
在本发明的方法或用途中，如本文中所示的融合多肽或组合物可在发生以下之前、基本同时或之后施用：不期望或异常免疫性应答、免疫性病症、炎性应答或炎症，或者自身免疫性应答、病症或疾病，或者由前述引起或与其相关的一种或更多种不良症状、病症、病患、病理状况、疾病或并发症。因此，本发明的方法或用途可在开始显现应答、病症或疾病，或者由不期望或异常免疫性应答、免疫性病症、炎性应答、炎症或者自身免疫性应答、病症或疾病引起或者与其相关的一种或更多种不良症状、病症、病患、病理状况、疾病或并发症之前(即预防)、同时或之后实施。在发生不良症状之前、同时或之后立即施用如本文中所示的融合多肽或组合物可降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制由不期望或异常免疫性应答、免疫性病症、炎性应答、炎症或者自身免疫性应答、病症或疾病引起或者由其相关的一种或更多种不良症状、病症、病患、病理状况、疾病或并发症的发生、频率、严重程度、进程或持续时间。
根据本发明的方法或用途，本发明的双特异性融合多肽可与第二药剂(例如免疫抑制剂、抗炎剂或姑息剂(palliative agent))组合配制和/或施用。本发明的融合多肽可在施用第二药剂(例如免疫抑制剂、抗炎剂或姑息剂)之前、基本同时或之后施用。本发明的融合多肽可与第二药剂(例如免疫抑制剂、抗炎剂或姑息剂)组合配制。
第二药剂的非限制性实例可包括抗炎剂，例如甾体和非甾体抗炎药(NSAID)，和抗炎性生物制剂，例如限制或控制炎性应答或症状的抗体。第二药剂和药物包括免疫抑制性皮质类固醇(甾体受体激动剂)，例如布地奈德(budesonide)、泼尼松、氟尼缩松；抗炎剂，例如氟尼缩松氢氟烷烃、雌激素、孕酮、地塞米松和氯替泼诺；β-激动剂(例如，短效或长效的)，例如班布特罗、福莫特罗、沙美特罗、沙丁胺醇；抗胆碱能剂，例如异丙托溴铵、氧托溴铵、色甘酸和钙通道阻断剂；抗组胺药，例如特非那定、阿司咪唑、羟嗪、氯苯那敏、曲吡那敏、西替利嗪、地氯雷他定、咪唑斯汀、非索非那定、盐酸奥罗他定、诺阿斯米唑、左西替利嗪、左卡巴斯汀、氮卓斯汀、依巴斯汀和氯雷他定；抗白三烯剂(例如，抗半胱氨酰白三烯剂(CysLT))，例如奥沙米特、孟鲁司特、扎鲁司特和齐留通；磷酸二酯酶抑制剂(例如，PDE4亚型)，例如异丁司特、西洛司特、BAY19-8004、茶碱(例如，持续释放型)以及其他黄嘌呤衍生物(例如，多索茶碱)；血栓烷拮抗剂，例如塞曲司特、盐酸奥扎格雷和雷马曲班；前列腺素拮抗剂，例如COX-1和COX-2抑制剂(例如，塞来昔布和罗非昔布)、阿司匹林；以及钾通道开放剂。其他药剂和药物种类的其他非限制性实例包括作为免疫调节性治疗剂的抗炎剂，例如促炎细胞因子拮抗剂，例如TNFα拮抗剂(例如，依那西普、也称为EnbrelTM)；免疫细胞拮抗剂，例如B细胞消耗剂利妥昔单抗和T细胞共刺激阻断剂阿巴西普(abatacept)(其已用于治疗类风湿性关节炎)，以及与细胞因子结合的抗炎性抗体，例如抗IgE(例如，rhuMAb-E25奥马珠单抗)和抗TNFα、IFNγ、IL-1、IL-2、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13、IL-16以及生长因子，例如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子。
如本文中所公开的，本发明使用双特异性融合多肽的方法或用途可向对象提供可检测或可测量的治疗益处或改善。
所述治疗益处或改善可以是任何可测量或可检测的、客观或主观的、短暂的、临时的或长期的对对象的益处，或者应答、病症或疾病，或者由不期望或异常应答、病症或疾病引起或与其相关的一种或更多种不良症状、病症、病患、病理状况、疾病或并发症的改善。治疗益处或改善可包括但不限于降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制不期望或异常应答、病症或疾病的不良症状的发生、频率、严重程度、进程或持续时间。治疗益处和改善还可包括但不限于降低、减小、抑制、阻抑、限制或控制炎症和炎性应答(例如T细胞、B细胞、自身抗体、免疫细胞浸润或动员、促炎细胞因子、淋巴因子或趋化因子)的量或活性。
根据本发明，向对象施用有效量或足够量的双特异性融合多肽。“有效量”或“足够量”指这样的量，其以单剂量或多剂量、单独或者与一种或更多种其他组分(治疗剂，例如药物)、治疗、方案或治疗方案药剂组合在对象中或者向对象提供任意持续时间(长期或短期)的可检测应答、预期或期望结果或者益处，其是任何可测量或可检测程度的或者持续任意时间(例如，数分钟、数小时、数天、数个月、数年或治愈)。
术语治疗的“有效量”或“足够量”(例如，以改善或者提供治疗益处或改善)通常指这样的量，其有效地以可测量程度提供应答、病症或疾病，或者所述应答、病症或疾病的一种、多种或全部不良症状、后果或并发症，一种或更多种不良症状、病症、病患、病理状况、疾病或并发症，例如与不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病引起或者与其相关的那些，但是令人满意的结果是降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制细胞、组织或器官的应答、病症或疾病或者其不良症状发展或恶化。
有效量或足够量可以但不一定以单次施用提供，可能需要多次施用，并且可以但不一定单独施用或者与另一组合物(例如，药剂)、治疗、方案或治疗方案组合施用。例如，所述量可根据以下的指示而按比例地提高：对象的需求，所治疗应答、病症或疾病的类型、状态和严重程度，或治疗的副作用(如果有的话)。另外，有效量或足够量如果在无第二组合物(例如，另一药物或药剂)、治疗、方案或治疗方案的情况下以单剂量或多剂量给予则不一定是有效或足够的，因为可包括高于此类剂量的另外的剂量、量或持续时间，或者另外的组合物(例如药物或药剂)、治疗、方案或治疗方案以认为在给定对象中是有效或足够的。认为有效的量还包括导致另一治疗、治疗方案或方案的使用降低的量。
对治疗而言典型的是，一些对象可针对给定治疗而表现出较大的应答或者较低的应答或者无应答。因此，有效量或足够量不一定在预防性或治疗性地治疗的各个和每个对象中均有效，给定组或群体中的大部分治疗对象也如此。有效量或足够量意指在特定对象而非组群或一般群体中有效或足够。因此，合适量将取决于所治疗的病症、期望治疗效果以及个体对象(例如，在该对象中的生物利用度、性别或年龄)。
术语“改善”指对象病症或潜在细胞应答的可检测或可测量改善。可检测或可测量改善包括应答、病症或疾病(例如不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病)或者由所述应答、病症或疾病(例如不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病)引起或与其相关的一种或更多种不良症状、病症、病患、病理状况、疾病或并发症的发生、频率、严重程度、进程或持续时间的主观或客观降低、减轻、抑制、阻抑、限制或控制；或者应答、病症或疾病(例如不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病)的逆转。这样的改善还可发生在细胞水平。
因此，成功的治疗结果可在对象中导致以下“治疗效果”或“益处”：降低、减轻、抑制、阻抑、限制、控制或防止不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病，或者不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病的一种或更多种不良症状或者潜在原因或后果的发生、频率、严重程度、进程或持续时间。因此，认为影响应答、病症或疾病或者不良症状的一个或更多个潜在原因的治疗方法是有益的。降低或减轻恶化，例如稳定不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病也是成功的治疗结果。
因此，治疗益处或改善不一定是完全消除不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病，或者与不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病相关的任何一种、大多数或全部不良症状、并发症、后果或潜在原因。因此，当在短或长持续时间内(数小时、数天、数周或数月)递增地改善对象的应答、病症或疾病，或者部分地降低、减轻、抑制、阻抑、限制、控制或防止所述应答、病症或疾病的发生、频率、严重程度、进程或持续时间，或者抑制或逆转所述应答、病症或疾病(例如，稳定一种或更多种症状或并发症)时，可实现令人满意的终点，所述应答、病症或疾病例如不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病，或者由不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病引起或者与其相关的一种或更多种不良症状、病症、病患、病理状况、疾病或并发症。
方法或用途(例如提供应答、病症或疾病的潜在治疗益处或改善的治疗)的有效性可通过多种方法来确定，所述应答、病症或疾病例如不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病。这样的方法包括例如测量肿胀、疼痛、皮疹、头痛、发热、恶心、腹泻、腹胀、嗜睡、骨骼关节疼痛、活动性缺乏、皮疹或者组织或细胞损伤的评分。使用多种免疫学测定(例如ELISA)来测量T或B细胞活化和/或分化，区域的细胞浸润，细胞累积或向区域迁移，抗体、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、干扰素和白介素的产生，细胞生长和成熟因子。确定细胞、组织或器官损伤的程度可通过CT扫描、MRI、超声、分子造影成像或分子超声造影成像来进行。对于骨骼关节，可通过患者自评估、触痛关节计数和肿胀关节计数以及红细胞沉降率(ESR)或C反应蛋白(CRP)来评估炎症。对于胃肠道，可通过例如内窥镜检查术(例如结肠镜检查术、胃镜检查术、ERCP)来评估炎症。对于中枢神经系统(CNS)的炎症，例如脊椎抽液(spinal tap)中的细胞和细胞因子反映炎症。
术语“对象”指动物，通常是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物(例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩或猕猴)、伴侣动物(例如，狗和猫)、农场动物(例如，马、牛、山羊、绵羊或猪)或者实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔或豚鼠)。对象的实例可包括用于体内分析的动物疾病模型，例如不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病的动物模型(例如，CIA、BXSB、EAE和SCID小鼠)。
适于治疗的对象的实例可包括具有不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病的那些；正进行针对不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病的治疗的那些；以及已经历针对不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病的处理或治疗的那些，包括不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病正在缓解之中的对象。
所述对象的实例可包括患有以下任意疾病或者处于患有以下任意疾病的风险之中的那些：多肌炎、血管炎综合征、巨细胞性动脉炎、大动脉炎、复发性、多软骨炎、获得性血友病A、斯蒂尔病、成年型斯蒂尔病、淀粉样蛋白A淀粉样变性、风湿性多肌痛、脊椎关节炎、肺动脉高血压、移植物抗宿主病、自身免疫性心肌炎、接触性超敏反应(接触性皮炎)、胃食管反流病、红皮病、白塞病、肌萎缩侧索硬化、移植、视神经脊髓炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、恶性类风湿性关节炎、抗药性类风湿性关节炎、视神经脊髓炎、川崎病、多关节性或全身性幼年型特发性关节炎、银屑病、慢性阻塞性肺病(COPD)、卡斯尔曼病、哮喘、变应性哮喘、变应性脑脊髓炎、关节炎、慢性进行性关节炎、反应性关节炎、银屑病关节炎、肠病性关节炎、变形性关节炎、风湿性疾病、脊椎关节病、强直性脊柱炎、莱特尔综合征、超敏反应(包括气道超敏反应和皮肤超敏反应二者)、变态反应、系统性红斑狼疮(SLE)、皮肤红斑狼疮、麻风结节性红斑、舍格伦综合征、炎性肌病、多软骨炎、韦氏肉芽肿病、皮肌炎、史-约综合征、慢性活动性肝炎、重症肌无力、特发性口炎性腹泻、自身免疫性炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠易激综合征、内分泌性眼病、硬皮病、格雷夫斯病、结节病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、阴道炎、直肠炎、胰岛素依赖型糖尿病、胰岛素抵抗型糖尿病、幼年型糖尿病(I型糖尿病)、自身免疫性血液病、溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞性贫血、特发性血小板减少(ITP)、自身免疫性葡萄膜炎、葡萄膜炎(前葡萄膜炎和后葡萄膜炎)、干燥性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、间质性肺纤维化、肾小球肾炎(具有和不具有肾病综合征)、特发性肾病综合征或微小病变性肾病、炎性皮肤病、角膜炎症、肌炎、骨植入物松动、代谢病、动脉粥样硬化、血脂异常、骨脱失、骨关节炎、骨质疏松症、阻塞性或炎性气道疾病的牙周病、支气管炎、尘肺病、肺气肿、急性和超急性炎性反应、急性感染、感染性休克、内毒素性休克、成人型呼吸窘迫综合征、脑膜炎、肺炎、恶病质消耗综合征、卒中、疱疹性基质性角膜炎、干眼病、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、吉兰-巴雷综合征、僵人综合征、桥本甲状腺炎、自身免疫性甲状腺炎、脑脊髓炎、急性风湿热、交感性眼炎、肺出血肾炎综合征、系统性坏死性血管炎、抗磷脂综合征、艾迪生病、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、疱疹样皮炎、特应性皮炎、湿疹性皮炎、阿弗他溃疡、扁平苔藓、自身免疫性脱发、白癜风、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、恶性贫血、感音神经性听力丧失、特发性双侧进行性感音神经性听力丧失、I型或II型自身免疫性多腺性综合征、免疫性不育或免疫介导的不育。
所述对象的实例还可包括不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病的风险提高的那些。候选对象例如具有不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病；或者正用针对不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病的治疗或药物进行治疗。候选对象还包括会从针对不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病的治疗受益或者需要该治疗的对象。
“处于风险之中”的对象通常可对不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病具有提高的风险因素。处于风险之中的对象的具体实例可包括已具有不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病的那些。处于风险之中的对象的实例还可包括开处方进行针对不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病的处理或治疗的那些。处于风险之中的对象的实例还可包括具有以下风险因素的那些：例如家族史(例如，遗传倾向性)、性别、生活方式(饮食、吸烟)、职业(医疗和临床人员、农业和牲畜工作者)或环境因素(变应原暴露)。
根据本发明，包含融合多肽的组合物可以以剂量单位形式包装以便于施用和剂量一致。本文中使用的“剂量单位形式”指适于作为单位剂量治疗的物理离散单位；每个单位包含经计算产生期望处理或治疗(例如，有益)效果的量的与载体、赋形剂、稀释剂或载剂联合的组合物。单位剂量形式可根据以下因素而不同，包括但不限于所采用的具体组合物、所治疗的病症或疾病、需实现的效果以及待治疗的对象。示例性单位剂量的范围为约25至250、250至500、500至1,000、1,000至2,500、2,500至5,000、5,000至25,000或5,000至50,000pg；约50至500、500至5,000、5,000至25,000或25,000至50,000ng；约50至500、500至5,000、5,000至25,000或25,000至50,000μg；约25至250、250至500、500至1,000、1,000至2,500、2,500至5,000、5,000至25,000或5,000至50,000mg；以及约1至5、5至10、10至25、25至50、50至100、100至250、250至500、500至1,000、1,000至2,500或2,500至5,000克。
如本文中所述，融合多肽及其组合物可以以多种剂量和量以及频率体外、离体接触或提供或者体内向对象施用或递送。例如，可以以例如有效量或足够量作为单剂量或作为多剂量施用或递送融合多肽或其组合物以提供预期效果。示例性剂量的范围为连续地、隔日地或间歇地约25-250、250至500、500至1,000、1,000至2,500、2,500至5,000、5,000至25,000或5,000至50,000pg/kg；约50至500、500至5,000、5,000至25,000或25,000至50,000ng/kg；约50至500、500至5,000、5,000至25,000或25,000至50,000μg/kg；以及约25至250、250至500、500至1,000、1,000至2,500、2,500至5,000、5,000至25,000或5,000至50,000mg/kg。
可在同一天或连续地、隔日地或者间歇地施用组合物的单次或多次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次)施用或剂量。例如，包含融合多肽的组合物可每日、隔日地、每两周、每周、每月、每两月或每年施用1、2、3、4次或更多次。包含融合多肽的组合物可施用任何合适的持续时间，例如1小时或更短，例如30分钟或更短、15分钟或更短、5分钟或更短、或者1分钟或更短的时间。
包含融合多肽的组合物可在症状或发生以下之前、基本同时或者约1至60分钟、数小时(例如，在1、2、3、4、5、6、8、12、24小时内)或数天(1、2、3、4、5、6、7、7至14、14至21、21至28、28至45、45至60或60至90天)内施用于对象：不期望或异常免疫性应答、病症或疾病，炎性应答、病症或疾病，炎症，自身免疫性应答、病症或疾病。
包含融合多肽的组合物可通过任何途径经全身性施用、区域性施用或局部施用来施用。例如，包含融合多肽的组合物可如下全身性、区域性或局部施用：注射、输注、经口(例如，摄入或吸入)、表面(topically)、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、皮内、皮下、腔内、颅内、经皮(表面)、肠胃外，例如经黏膜或直肠内(灌肠)导管，或者光学地施用。本发明的融合多肽、组合物、方法和用途包括通过经(微)包封递送系统来施用或包装成用于施用的植入物的药物制剂。
本发明还提供了药盒(kit)，其包含本发明的融合多肽(FynomAb)并且包装成合适的包装材料。药盒可任选地包括标签或包装插页，其包括其中组分的说明或者其中组分的体外、体内或离体使用说明。示例性的说明包括方法、处理方案或治疗方案的说明。
药盒可包含组分的集合，例如两种或更多种组合物，每种组合物包含不同的双特异性融合多肽，或者一种组合物包含双特异性融合多肽而一种组合物包含另一治疗上可用的组合物(例如，抗增殖或免疫增强药物)。术语“包装材料”指容纳药盒的组分的物理结构。包装材料可使组分维持无菌，并且可由通常用于此目的的材料(例如，纸、波纹纤维(corrugated fiber)、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶或管)制成。
药盒可包含标签或插页。标签或插页可以是“印刷物”，例如纸或纸板，或者单独的或者固定于组分、药盒或包装材料(例如，盒)，或者贴附于包含药盒组分的安瓿、管或小瓶。标签或插页可以是计算机可读介质、光盘(例如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD)、MP3、磁带或电子存储介质(例如RAM和ROM)或者这些的杂合体(例如磁/光学存储介质)、FLASH介质或记忆型卡。
标签或插页可包含其中一种或更多种组分、剂量、活性成分的临床药理学(包括作用机制、药物代谢动力学(PK)和药效学(PD))的标示信息。标签或插页可包含标示生产商信息、批号、生产商地址和日期的信息。
标签或插页可包含药盒组分可应用于的状况、病症、疾病或症状的信息。标签或插页可包括对临床医生或对象在方法、处理方案或治疗方案中使用一种或更多种药盒组分的说明。说明可包括剂量、频率或持续时间以及用于实施本文中所述的任意方法、处理方案或治疗方案的说明。因此，本发明的药盒可额外包含用于实施本文中所述的本发明的任意方法和用途的标签或说明。
标签或插页可包括有关组分可提供的任何益处(例如预防或治疗益处)的信息。标签或插页可包括有关潜在不良副作用的信息，例如对对象或临床医生关于不适合使用特定组合物的情况的提醒。不良副作用还可发生在对象已经、将或目前正服用一种或更多种其他与该组合物不相容的药物，或对象已经、将或目前正经历其他与该组合物不相容的处理方案或治疗方案时，因此说明可包括有关此类不相容性的信息。
药盒可额外包含其他组分。药盒的每种组分可封装在单独容器内，并且不同容器全部可在单个包装内。本发明的药盒可设计成用于冷藏。本发明的药盒还可设计成包含表达本发明的融合多肽的宿主细胞，或者设计成包含编码融合多肽的核酸。可将药盒中的细胞维持在合适的储存条件下直至准备使用细胞。例如，包含一种或更多种细胞的药盒可包含合适的细胞储存介质，使得可解冻并培养细胞。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管可使用与本文中所述的那些类似或等同的方法和材料来实施或测试本发明，但是在本文中描述了合适的方法和材料。
本文中引用的所有申请、出版物、专利以及其他参考文献、GenBank引文和ATCC引文均通过引用以其整体并入。如有冲突，将以说明书(包括定义)为准。
除非上下文另外明确指出，本文中使用的没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。因此，例如提及“融合多肽(FynomAb)”或“靶标(例如，IL-17a或IL-6R)”可包括一个/种或多个/种这样的融合多肽、靶标等。
本文中使用的数值在本文件通篇通常以范围形式示出。范围形式的使用仅仅是为了方便和简洁，并且除非上下文另外明确指出，否则不应解释为对本发明范围的硬性限制。因此，除非上下文另外明确指出，否则范围明确包括所有可能的子范围、在该范围内的所有单独数值以及在这些范围内的所有数值或数值范围(包括整数)，在范围内的分数值或整数。不管范围的宽度并且在所有的情形下，这一结构均适用于本专利文件通篇。因此，例如，提及的90％至100％的范围包括91％至99％、92％至98％、93％至95％、91％至98％、91％至97％、91％至96％、91％至95％、91％至94％、91％至93％等。提及的90％至100％的范围还包括91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％等，以及91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％等，92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％等。
另外，提及的1至5,000倍的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍等，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5倍等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5倍等，以及在这样的范围内的任何数值范围，例如1至2、5至10、10至50、50至100、100至500、100至1000、500至1000、1000至2000、1000至5000等。在另一个实例中，提及的KD 10-5M至约KD 10-13M的范围包括在这些值内或涵盖这些值的任何数值或范围。
还如本文中所用，本文件通篇公开了一系列范围。一系列范围的使用包括提供另一范围的较高和较低范围的组合。不管范围的宽度并且在所有的情形下，这一结构均适用于本专利文件通篇。因此，例如，提及的一系列范围例如5至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至75、75至100、100至150、150至200等包括例如以下范围：5至20、5至30、5至40、5至50、5至75、5至100、5至150、5至200，和10至30、10至40、10至50、10至75、10至100、10至150、10至171，以及20至40、20至50、20至75、20至100、20至150、20至200等。
本文中通过使用肯定语言描述多个实施方案来一般性地公开本发明。本发明还特别地包括其中排除特定主题(全部地或部分地，例如物质或材料、方法步骤和条件、方案、操作、测定或分析)的实施方案。因此，即使本文中未在本发明不包括的内容方面对本发明进行一般性表述，但本文中仍公开了未明确包括在本发明中的方面。
已对本发明的多个实施方案进行了描述。然而，将理解，可进行多种改变而不偏离本发明的精神和范围。因此，以下实施例旨在举例说明而非限制权利要求书中所述的本发明的范围。
实施例
实施例1
如通过单克隆裂解液ELISA所确定的，本发明的Fyn SH3衍生多肽与IL-17A结合。
方法
用于产生结合IL-17a的fynomer的方法在PCT/EP2013/069481中进行了描述。简言之，使用重组IL-17A(R&D Systems)作为抗原并使用标准噬菌体展示作为选择技术来分离IL-17A特异性的Fyn-SH3衍生结合蛋白(Grabulovski D.等，(2007)J Biol Chem 282，第3196-3204页；Viti，F.等(2000)Methods Enzymol.326，480-505)。在选择过程期间富集本发明的Fyn SH3衍生多肽，即携带n-src环序列“STHEYE”的1L3-B09。1L3-B09与IL-17A结合并且发现与非糖基化IL-17A相比，其一样良好地抑制糖基化IL-17A。为了获得具有较高亲和力的Fyn SH3衍生IL-17A结合剂，使用1L3-B09作为模板进行亲和力成熟。使n-src环序列“STHEYE”保持不变并且将其与随机化的RT环库(6个氨基酸残基，表示为(X1)(X2)(X3)(X4)(X5)(X6))组合。亲和力成熟文库生成的方法与用随机化RT环克隆原始
Figure GDA0001875602890000501
文库所述的基本相同(Schlatter等(2012)mAbs，4(4)第497-50页中的“文库0”)。
在原始和亲和力成熟选择之后，通过裂解液ELISA来筛选与IL-17A结合的经富集的Fyn SH3衍生多肽。将编码Fyn SH3衍生结合蛋白的DNA克隆到细菌表达载体pQE12(Qiagen)中，使得所得构建体携带C端myc-六组氨酸标签，如Grabulovski等(Grabulovski等(2007)JBC，282，第3196-3204页)中所示。如Bertschinger等(Bertschinger等(2007)Protein Eng Des Sel 20(2)：第57-68页)中所述，以96孔模式在大肠杆菌(E.coli)的细胞溶质中表达多肽，并制备200μl澄清裂解液/孔。简言之，从琼脂板挑选经转化的细菌菌落并在圆底96孔板(Nunc，目录号163320)中含有100μg/ml氨苄青霉素和0.1％(w/v)葡萄糖的200μl 2xYT培养基中进行培养。在于37℃和200r.p.m.下培养3小时之后，通过添加1mMIPTG(Applichem，Germany)来诱导蛋白质表达。在旋转振荡器中表达蛋白质过夜(200r.p.m.，30℃)。随后，将96孔板以1800g离心10分钟并弃掉上清液。将细菌沉淀物重悬于含有1mg/ml溶菌酶的200μl裂解缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑，pH 8.0)中，并在冰上放置30分钟。此后，通过在水浴中进行超声处理来裂解细菌细胞(6次破裂，每次10秒)，然后在1800g下离心10分钟。将单克隆细菌裂解液用于ELISA：将生物素化IL-17A(在HEK EBNA细胞中内部产生，根据生产商的说明用NHS-PEO4-生物素(Pierce)进行生物素化)固定在经链霉亲和素包被的孔(StreptaWells，High Bind，Roche)上，并且在用PBS封闭之后，施加2％乳(Rapilait，Migros，Switzerland)、50μl PBS、含有6μg/ml抗myc抗体9E10(终浓度3μg/ml)的4％乳和50μl细菌裂解液。在孵育1小时并洗涤之后，用抗鼠HRP抗体缀合物(Sigma)检测结合的Fyn SH3衍生多肽。通过添加BM蓝POD底物(Roche)来进行过氧化物酶活性的检测，并通过添加1M H2SO4来终止反应。通过DNA测序来验证特异性结合剂的DNA序列。
结果
7条代表性IL-17A结合fynomer序列(SEQ ID NO：1至7)的序列如下：
SEQ ID NO：1(1L3-B9)：
Figure GDA0001875602890000511
SEQ ID NO：2(11L0-C06)：
Figure GDA0001875602890000512
SEQ ID NO：3(11L5-B06)：
Figure GDA0001875602890000513
SEQ ID NO：4(11L6-F03)：
Figure GDA0001875602890000514
SEQ ID NO：5(11L9-C09)：
Figure GDA0001875602890000515
SEQ ID NO：6(11L10-A05)：
Figure GDA0001875602890000521
SEQ ID NO：7(11L11-A09)：
Figure GDA0001875602890000522
通过将四种(4种)单独的抗IL-17A结合fynomer与IL-6R结合抗体托珠单抗之重链的C端(COVA801、COVA803、COVA805、COVA807)或轻链的C端(COVA802、COVA804、COVA806、COVA808)融合来产生八种(8种)不同的fynomer-抗体(FynomAb)融合物(参见表1)。
表1：FynomAb说明
FynomAb Fynomer 形式 MW(kDa) pI
Actemra - 亲本 145.0 8.62
COVA801 11L0-C06 HC，C端 161.6 8.23
COVA802 11L0-C06 LC，C端 161.6 8.23
COVA803 11L5-B06 HC，C端 161.5 8.09
COVA804 11L5-C06 LC，C端 161.5 8.09
COVA805 11L9-C09 HC，C端 161.6 7.65
COVA806 11L9-C09 LC，C端 161.6 7.65
COVA807 11L10-A05 HC，C端 161.4 8.09
COVA808 11L10-A05 LC，C端 161.4 8.09
HC：重链；LC：轻链；pI：等电点；MW：分子量；kDa：千道尔顿
该研究评估这些不同FynomAb的生化和功能特征以及药物代谢动力学特性。评估了数个不同批次的COVA801-808 FynomAb。由瞬时或稳定转染CHO细胞产生FynomAb。用于小鼠和食蟹猴(cyno)PK研究的FynomAb由稳定的CHO细胞系产生。
实施例2
蛋白质表达和纯化
制备四个单独批次的FynomAb，并在下文记载的研究中进行评价。两个批次的物质来源于经瞬时转染的CHO细胞。内部产生(generated in house)的物质批次来源于如下文所述使用Lonza表达载体的稳定CHO库。
Actemra(托珠单抗)的重链和轻链序列从CAS数据库获得，并且还在US 2011/0076275 A1中确认为序列#15。对该序列进行修饰以将356-358位氨基酸DEL突变成EEM。这是由G1m1同种异型突变成nG1m1并且可潜在地降低免疫原性。
Actemra(托珠单抗)重链序列(SEQ ID NO：8)(CDR以粗体表示)
Figure GDA0001875602890000531
Actemra(托珠单抗)轻链序列(SEQ ID NO：9)(CDR以粗体表示)
Figure GDA0001875602890000532
托珠单抗重链和轻链的这些序列被密码子优化成用于CHO表达并且合成基因。向每个基因的5’端添加信号序列(Hc ss＝MEWSWVFLFFLSVTTGVHS；Lc ss＝MSVPTQVLGLLLLWLTDARC)。通过四条fynomer序列各自放置于托珠单抗重链或轻链的C端来构建FynomAb融合蛋白，其中在其之间具有15个氨基酸的接头(GGGGSx3)。这构建了产生八种FynomAb所需的基因。将合成的基因克隆到Lonza pEE 12.4(重链)和6.4(轻链)载体中。然后，将这些载体组合以产生表达托珠单抗的重链和轻链组合以及全部八种FynomAb分子的单一表达载体。
表2：具有fynomer序列的FynomAb说明
Figure GDA0001875602890000541
Figure GDA0001875602890000551
用托珠单抗和八种FynomAb载体中每一种的线性化DNA核转染(Amaxa)CHO-K1-SV细胞。将这些细胞置于MSX选择中并在成对的静态瓶中培养，直至回收培养物。一旦回收到细胞，就将其转移至摇瓶，并立即冷冻或者扩大至生产瓶以用于大规模蛋白质表达。
纯化第一轮的生产瓶以用于产生用于内部小鼠PK研究以及用于体外测定的物质。稍后，解冻这些相同库的冷冻培养物并在需要更多蛋白质来进行食蟹猴PK研究时扩增。
通过AlphaLISA和Western印迹来量化表达水平。稳定库的表达水平的范围为约100至500mg/L。将生产瓶培养10天，之后收获，过滤，并与蛋白酶抑制剂一起冷冻。将一些低表达库“冷捕获”并分选：染色细胞表面上的抗体，然后通过流式细胞术来分选细胞以捕获最高产生的细胞用于进行培养和生产。在收获之后，通过0.2μM真空过滤器过滤来自稳定库的上清液(0.5至8.0L)，并添加蛋白酶抑制剂片(Sigma，目录#P2714，1片/100mL上清液)，之后冷冻或储存在4℃下。
使用HiTrap MabSelect SuRe柱(1或5mL柱；有时多个串联)以5至20mL/分钟的流量上样来在无菌条件下初始纯化所有FynomAb产生细胞系的上清液。用PBS洗涤柱，直至达到基线A280读数，之后用pH 3.0甘氨酸洗脱。
针对每种FynomAb制备的不同批次的CHO稳定物质以及蛋白质产量列于表3中。
表3：所产生的FynomAb和托珠单抗的产量
Figure GDA0001875602890000561
Figure GDA0001875602890000571
Figure GDA0001875602890000581
实施例3
SDS-PAGE分析
对三个单独批次的每种FynomAb和托珠单抗进行SDS-PAGE分析。使用Tris-甘氨酸SDS样品和运行缓冲液(running buffer)在4％至20％Tris-甘氨酸梯度凝胶上于还原和非还原两种条件下对5微克的每种蛋白质进行电泳。将凝胶用考马斯亮蓝(SimplyBlueSafeStain，Invitrogen)染色过夜并用蒸馏水脱色至足够清晰。结果示于图1中(瞬时CHO物质的SDS-PAGE分析)、图2和图3中(针对小鼠PK研究制备的稳定CHO物质的SDS-PAGE分析)。
实施例4
分析型HPLC-SEC
通过分析型HPLC-SEC来评估三个单独批次的FynomAb。一个批次的瞬时CHO物质，以及另两个批次由稳定转染的CHO细胞系内部产生。将10微克的每种FynomAb蛋白以1mL/分钟的流量进样到使用PBS作为流动相的Zenix-C SEC-300柱(Sepax Technologies)上。监测A280下的吸光度。与Actemra相比，fynomer的存在不同程度地减慢FynomAb的洗脱，推测这归因于固相和fynomer之间的次级相互作用。观察到可溶性聚集体为在FynomAb主峰之前洗脱的峰，并且在重链融合构建体COVA801、COVA803、COVA805和COVA807中最明显。
轻链融合物(COVA802、COVA804、COVA806和COVA808FynomAb)具有清晰得多的SEC谱，其中对COVA804或COVA806FynomAb未观察到聚集体。这些数据与现有数据一致，现有数据也显示轻链融合物具有可溶性聚集体较不明显的更为清晰的SEC谱。
实施例5
人IL-17A和人IL-6R的亲和力测量
为了确定FynomAb与人IL-17A和人IL-6R结合的亲和力和动力学参数，将抗人抗体与GLM芯片胺偶联(amine coupled)。然后，捕获COVA801-808FynomAb或对照抗体作为配体，并使IL-17A或IL-6R流动作为分析物。利用PBST作为流动相，并用100mM HCl的两次15秒注射来实现再生。使用苏金单抗(secukinumab)作为IL-17A结合的阳性对照并作为IL-6R结合的阴性对照。使用托珠单抗和/或Actemra作为IL-6R结合的阳性对照并作为IL-17A结合的阴性对照。
使用苏金单抗作为IL-17A结合的阳性对照并作为IL-6R结合的阴性对照。苏金单抗的VH和VL链如下：
可变轻链(SEQ ID NO：33)
信号序列(加有下划线)，可变结构域(κ)(以粗体表示)
Figure GDA0001875602890000591
可变轻链(SEQ ID NO：34)
信号序列(加有下划线)，可变结构域(κ)(以粗体表示)
Figure GDA0001875602890000601
使用托珠单抗和/或Actemra作为IL-6R结合的阳性对照并作为IL-17A结合的阴性对照。
IL-17A结合
COVA801-808 FynomAb以及苏金单抗(阳性对照和参照)和托珠单抗或Actemra(阴性对照)的IL-17A结合的代表性感应图(sensorgram)示于图4中。来自多批每种FynomAb和苏金单抗的多项研究的动力学结合数据的总结概括于表4中。所示感应图针对COVA801-808、单独批次的托珠单抗(toc)、市售Actemra和苏金单抗(sec)。
拟合动力学与其他数据值相当良好地一致，并且大部分构建体与苏金单抗具有近似的表观KD。与FynomAb的复杂缔合混淆了对结合IL17A的评估，如FynomAb数据组中的结合显著偏离1∶1而苏金单抗数据组中则没有可知。看来在延长的解离阶段下更容易观察到发生IL-17A的显著重结合。因此，报道的FynomAb/IL-17A相互作用的动力学和亲和力值应仔细解读。尽管COVA807和COVA808具有较低的KD值，但是这两种FynomAb的IL-17A结合显著偏离1∶1可解释其明显更高的亲和力。我们观察到COVA807 FynomAb在IL-17A功能性测定中具有较差的功能活性(参见，下文的HT29 IL-17A功能性测定数据)。
表4：FynomAb与人IL-17A结合的SPR数据的总结
Figure GDA0001875602890000602
由于FynomAb构建体与重组IL-17A同二聚体的复杂缔合，进行简单结合ELISA来研究COVA804和COVA806对人IL-17A的特异性和相对亲和力。简言之，将PBS中的1μg/mL重组人IL-17A包被在ELISA板上，之后用BSA封闭并与0至10μg/mL受试抗体或FynomAb一起孵育。使用与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人抗体以使用TMB来检测结合。与IL-17A的浓度-响应结合的结果在四个研究之间高度可再现，其中代表性的研究示于图5中。通过ELISA来评估COVA804(804)、COVA806(806)和苏金单抗(sec)与人IL-17A的结合。使用Actemra作为IL-17A结合的阴性对照。不同构建体的EC50值如下：苏金单抗＝0.36±0.12nM；COVA804＝1.02±0.24nM；COVA806＝0.98±0.23nM。因此，这些数据支持SPR数据，其证明FynomAb COVA804和COVA806与苏金单抗对IL-17A具有类似的亲和力。
IL-6R结合
COVA801-808 FynomAb以及托珠单抗或Actemra(阳性对照和参照)和苏金单抗(阴性对照)的IL-6R结合的代表性感应图示于图6中。如图6中所示，通过SPR来评估FynomAb/IL6R相互作用非常具有可重现性，并且可用经典的Langmuir拟合来容易地建模相互作用。所示感应图针对COVA801-808、单独批次的托珠单抗(toc)、市售Actemra和苏金单抗(sec)。来自多批每种FynomAb和托珠单抗的多项研究的动力学结合数据的总结概括于表5中。这些数据显示，轻链或重链的C端存在Fynomer不影响IL-6R与亲本抗体的结合。所有的FynomAb彼此以及针对亲本抗体托珠单抗均表现出非常类似的结合动力学。
表5：FynomAb与人IL-6R结合的SPR数据的总结
Figure GDA0001875602890000611
实施例6
HT-29 IL-17A抑制测定
为了评估COVA801-808 FynomAb针对人IL-17A的生物活性，在不同浓度(100nM至6pM)的每种FynomAb存在下用IL-17A(1.9nM)刺激HT-29细胞(ATCC，#HTB-38)。使用苏金单抗作为阻断IL-17A功能的阳性对照。对于每种条件，添加20,000个活细胞，并在平底96孔板中于37℃和5％CO2下孵育48小时。每种条件以一式两份方式进行测试。
用IL17A刺激HT29细胞导致Groα产生并释放到细胞上清液中。然后，使用来自R&DSystems的DuoSet ELISA试剂盒(DY275)通过ELISA来测量上清液中的Groα浓度。根据生产商的手册来进行ELISA(不同之处在于所有抗体均以1∶200使用)。
将一式两份结果的平均值与标准偏差一起绘图，并使用GraphPad
Figure GDA0001875602890000623
中的四参数剂量响应抑制函数来计算IC50值。来自使用三个不同批次的COVA801-808 FynomAb的多项研究的代表性数据示于图7至9中。由代表性数据计算的IC50值示于表6中。所有的FynomAb均对IL-17A显示出与参照苏金单抗类似的活性，并且所有的FynomAb在较高浓度下均能够实现完全阻断。COVA806一致地对IL-17A显示出效力最高的活性，并且一致地比苏金单抗更有效。
表6A
Figure GDA0001875602890000621
图6B
Figure GDA0001875602890000622
图6C
Figure GDA0001875602890000631
实施例7
HEK-BlueTM IL-6R抑制测定
为了评估COVA801-808构建体中抗IL-6R部分的生物活性，在不同浓度(500nM至0.2nM)的FynomAb存在下用IL-6(15pM)刺激HEK Blue IL-6细胞(Invivogen，hkb-il6)。在添加IL-6之前，将抑制剂与细胞一起孵育30分钟。作为对照，使用仅培养基或含有IL-6(15pM)培养基。此外，使用托珠单抗或Actemra作为IL-6R阻断的阳性对照。对于每份样品，添加50,000个活细胞并在96孔板的孔中于37℃，5％CO2下孵育20至24小时。每种条件以一式三份进行测试。
向细胞添加IL-6导致IL-6R信号传导途径受到刺激，其激活STAT3诱导型SEAP报道基因。使用HEK-BlueTM检测试剂(Invivogen，hb-det2)根据生产商的手册来测量上清液中的SEAP。
将一式三份结果的平均值与标准偏差一起绘图。使用GraphPad
Figure GDA0001875602890000632
中的四参数剂量-响应抑制函数来计算IC50值。来自使用三个不同批次的COVA801-808 FynomAb的多项研究的代表性数据示于下图10至12中。由代表性数据计算的IC50值示于表7中。来自全部三个批次的所有FynomAb均显示出与商品级Actemra和托珠单抗类似的IL-6R阻断。这些数据与其他数据类似，并且表明托珠单抗骨架Ab上IL-17A结合fynomer的存在不影响这些FynomAb的IL-6R阻断活性。
表7A
Figure GDA0001875602890000641
图7B
Figure GDA0001875602890000642
图7C
Figure GDA0001875602890000643
实施例8
血清稳定性测定
为了评估每种FynomAb在人血清中的稳定性，将COVA801-808 FynomAb各自以10μg/ml的浓度在90％人血清(Sigma#H4522)中于37℃下孵育6天，然后在夹心ELISA(sandwichELISA)中测试以评估FynomAb是否保留其与IL-17A和IL-6R二者结合的能力。在于PBS或人血清中孵育之后，使用夹心ELISA来评估FynomAb的同时结合。夹心ELISA的设置示于图13中。
简言之，将人IL17A以在PBS中的5μg/ml包被在Maxisorp 96孔板上，将FynomAb样品在1％BSA/PBST中以5倍从50nM稀释至0.003nM并添加至板。然后，向每个含有FynomAb的孔添加His标记的人IL-6R，并用抗His-HRP mAb显色。然后，将板洗涤，使用TMB底物(Sigma#T0440)显色并用酸终止。将一式三份实验的平均值与标准偏差一起绘图(参见图14)。
更具体地，在以下条件(a至d)下孵育COVA801-808 FynomAb，然后在图10中概括的ELISA中评估双重结合活性的保留：a)在PBS中进行稀释并立即测定(PBS，第0天)；b)在PBS中进行稀释并在4℃下储存6天(PBS，第6天)；c)在90％人血清中进行稀释并立即测定(人血清，第0天)；d)在90％人血清中进行稀释并在37℃下孵育6天(人血清，第6天)。
将一个单独的对照样品组在PBS中于4℃下孵育6天(PBS，第6天)。将另一对照样品组在人血清中稀释并立即用于测定(人血清，第0天)。人血清第0天样品的目的是为了评估人血清的存在是否会影响FynomAb同时与其两种靶标结合的能力。如图14中所示，将FynomAb在人血清中储存6天不降低其结合活性(与人血清第0天相比)，表明8种FynomAb全部在人血清中都稳定。如图15中所示，COVA804和COVA806的双重结合活性在人血清存在下不受影响。
实施例9
IL-6R和IL-17A的同时结合
数据显示，COVA801-808 FynomAb全部均能够同时与人IL-17A和人IL-6R结合。
进行基于细胞的流式细胞术测定来证明COVA801-808 FynomAb可同时与细胞表面上的IL-6R和可溶性IL-17A结合。在该测定中，使用在表面上表达人IL-6R的HEK Blue IL-6细胞(Invivogen hkb-i16)。简言之，将COVA801-808 FynomAb(或对照)各自以不同的浓度(300nM至5pM)与HEK-Blue IL-6细胞(或HEK-293细胞作为阴性对照)一起孵育60分钟。在这第一孵育之后，使用与Alexa488荧光团(Invitrogen A11013)缀合的抗人IgG抗体来检测构建体与IL-6R的结合。
结果示于图16中。将HEK-Blue-IL6细胞(IL6R+)或HEK-293细胞(IL6R-)与指定的FynomAb一起孵育，之后与抗人IgG-Alexa488一起孵育以检测结合于细胞表面的FynomAb，或者与生物素化IL-17A加链霉亲和素APC一起孵育以评估同时结合。使用托珠单抗作为IL-6R结合的阳性对照并作为IL-17A结合的阴性对照。
图16A、C、E、G、I、K、M和O中的数据显示所有8种FynomAb构建体以及托珠单抗均与在细胞表面上表达人IL-6R的HEK-Blue IL-6细胞结合，但是没有构建体与在细胞表面上不表达人IL-6R的对照HEK-293细胞结合。为了检测与细胞表面IL-6R和可溶性人IL-17A的同时结合，进行单独的研究，其中在与每种构建体第一孵育之后，与生物素化IL-17A(R&D317-ILB)进行第二孵育，之后与链霉亲和素-别藻蓝蛋白(APC；eBioscience 17-4317)进行孵育。如图16B、D、F、H、J、L和P中所示，所有8种FynomAb均显示与细胞表面IL-6R和可溶性IL-17A同时结合。如所预期的，托珠单抗能够与HEK Blue IL-6细胞表面上表达的IL-6R结合，但不与可溶性IL-17A结合。
实施例10
双特异性FynomAb在IL-17A和IL-6R二者存在下的功能性测定
图15和16中的数据显示FynomAb可同时与人IL-17A和人IL-6R结合。然而，不清楚FynomAb中mAb部分的IL-6R结合是否影响fynomer结合并抑制其配体IL-17A的能力。为了解决这一问题，我们在可溶性IL-6R存在下进行了HT-29IL-17A功能性测定以查看FynomAb的IL-6R结合是否会降低其对IL-17A的结合和功能活性。完全如上所述进行HT-29IL-17A测定，不同之处在于在过量可溶性IL-6R存在和不存在两种情况下进行该测定。简言之，在过量可溶性IL-6R(20nM)存在和不存在下将滴定量的COVA804或COVA806与IL-17A(1.9nM)混合，然后将这些混合物添加至IL-17A应答性细胞系HT-29。然后，如上所述在48小时后通过ELISA测量GROα的释放。使用苏金单抗作为IL-17A阻断的阳性对照。
结果示于图17中。在滴定量的COVA804或COVA806存在下用重组人IL-17A单独(上图)或者人IL-17A和可溶性人IL-6R(下图)刺激HT-29细胞，并通过ELISA来评估GROα产生。使用苏金单抗作为IL-17A阻断的阳性对照。
如图17和表8中所示，COVA804和COVA806二者均显示在过量可溶性IL-6R存在下IL-17A诱导的GROα产生被阻断，并且在IL-6R存在和不存在下观察到近似的IC50值。这些数据表明，IL-6R的结合不影响FynomAb中fynomer部分结合并抑制IL-17A的能力。
图8
Figure GDA0001875602890000671
进行类似的研究以评估FynomAb在IL-17A存在下的IL-6R阻断(参见图18)。完全如上所述进行HEK-Blue IL-6R抑制测定，不同之处在于在20nM重组人IL-17A存在和不存在两种情况下进行该测定。使用20nM浓度是因为较高浓度的IL-17A导致在该细胞系中可通过IL-6的IL-17A诱导而强烈激活STAT3诱导型SEAP报道基因。简言之，在不同浓度的FynomAbCOVA803或COVA804存在下用IL-6(15pM)刺激HEK Blue IL-6细胞。在添加IL-6之前，在20nMIL-17A存在或不存在下将抑制剂与细胞预孵育30分钟。使用COVA803和COVA804是因为这些FynomAb包含与重链或轻链融合的相同fynomer。比较COVA803和COVA804与托珠单抗(内部产生)在IL-17A存在或不存在下阻断IL-6信号传导的能力。
如图18和表9中所示，IL-17A的存在不影响FynomAb和托珠单抗阻断通过IL-6R的信号传导的能力。在存在和不存在IL-17A这两种情况下获得近似的IC50值。这些数据表明，FynomAb中fynomer部分(连接于亲本Ab的重链或轻链)的IL-17A结合不影响FynomAb结合并抑制IL-6R的能力。
表9
Figure GDA0001875602890000681
实施例11
fynomer多肽以高亲和力与糖基化人IL-17A结合
该实施例示出了IL-17A结合fynomer多肽的表达产量以及通过尺寸排阻色谱和表面等离子体共振研究对这些多肽的表征。
亲和力测量
使用BIAcore T200仪器(GE Healthcare)来进行亲和力测量。对于糖基化IL-17A(在HEK EBNA细胞中内部产生)和单体IL-17A结合fynomer多肽之间的相互作用分析，使用Series S CM5芯片(GE Healthcare)，其中使用胺偶联试剂盒(GE healthcare)来固定2000RU IL-17A。运行缓冲液是包含0.05％Tween 20的PBS。以30μl/分钟的流量并进样不同浓度的IL-17A结合fynomer多肽来测量相互作用。使用BIAcore T200评价软件来评价相互作用的所有动力学数据。
结合特性
在BIAcore芯片上通过实时相互作用分析来分析结合特性，揭示所选IL-17A结合fynomer多肽的以下解离常数(KD)：
表10.fynomer IL-17A结合多肽与重组人糖基化IL-17A(在HEKEBNA细胞中产生)的结合的动力学常数
Figure GDA0001875602890000682
实施例11的数据在WO2014/044758(PCT/EP2013/069481)中公开。
实施例12
fynomer多肽抑制糖基化IL-17A
已测试了克隆1L3-B09(SEQ ID NO：1)和对IL-17A具有最高结合亲和力的五种fynomer多肽(11L0-C06、11L5-B06、11L6-F03、11L9-C09、11L10-A05，SEQ ID NO：2至6)抑制IL-17A的能力。通过在不同浓度的IL-17A结合fynomer多肽不存在或存在下用重组的糖基化IL-17A(在HEK EBNA细胞中内部(in-house)产生)和重组TNFα(Thermo FisherScientific)刺激人真皮成纤维细胞来测试指定IL-17A结合fynomer多肽的抑制活性。在24小时的刺激之后取得细胞培养上清液，并通过ELISA来确定上清液中的IL-6浓度。结果表明，IL-17A结合fynomer多肽能够特异性地抑制糖基化IL-17A。
方法
对于内毒素去除，将蛋白质溶液用Acrodisc Mustang E膜(VWR)过滤三次。如通过鲎变形细胞裂解物(Limulus amebocyte lysate，LAL)测试(PYROGENT单测试胶凝LAL测定(Lonza))所确定的，在过滤之后，含有抑制性IL-17A结合fynomer多肽的蛋白质溶液的内毒素水平低于0.1EU/ml。每个孔(96孔板，TPP或Corning)分配含有约3900个正常人真皮成纤维细胞(PromoCell，NHDF-c，C12300)的100μl细胞悬液。并在37℃下培养24小时(培养基：成纤维细胞生长培养基C-23010，PromoCell)。抽吸上清液，将不同浓度的IL-17A结合fynomer多肽与含有IL-17A和TNFα的培养基(终浓度分别为1ng/ml和50pg/ml)混合，之后每个孔添加100μl的对应溶液。作为对照，将PBS与含有IL-17A/TNFα的培养基(阳性对照＝“无抑制剂”)混合，以及将培养基与仅单一细胞因子IL-17A或TNFα混合(后者为“TNFα对照”孔)。作为阴性对照，将PBS与仅培养基混合。对于比较，还使用相同的条件使用非糖基化IL-17A(R&D Systems)来进行该测定。在于37℃下孵育24小时之后，将上清液用于ELISA以使用IL-6ELISA试剂盒根据生产商的说明(IL-6ELISA试剂盒，R&D Systems)来确定IL-6浓度。将抑制百分比绘图并使用软件Prism 5来计算IC50值。用下式来确定IL-17A抑制的百分比：
Figure GDA0001875602890000701
结果
将正常人真皮成纤维细胞与IL-17A/TNFα和不同浓度的指定IL-17A结合fynomer多肽一起孵育。观察到fynomer多肽抑制糖基化IL-17A。IC50值示于表11中。
表11.针对IL-17A结合fynomer多肽获得的抑制糖基化IL-17A的IC50值
Figure GDA0001875602890000702
指定IL-17A结合fynomer多肽抑制糖基化和非糖基化IL-17A二者的剂量依赖性抑制曲线示于图19中。
发现，与非糖基化IL-17A相比，IL-17A结合fynomer多肽能够以类似的效力完全抑制糖基化IL-17A。相比较于WO2011/023685中先前所述的Fyn SH3衍生IL-17A结合多肽，这是一种有利的特性。
图20示出了WO2011/023685中所述的Fyn SH3衍生IL-17A结合多肽的三个实例。
Fyn SH3衍生IL-17结合剂2C1(WO2011/023685中的SEQ ID NO：107)、Fyn SH3衍生IL-17结合剂A1_2(WO2011/023685中的SEQ ID NO：53)和Fyn SH3衍生IL-17结合剂B1_2(“B1”)(WO2011/023685中的SEQ ID NO：39)甚至在高浓度下也未完全抑制糖基化IL-17A，和/或显示在糖基化和非糖基化IL-17A之间在抑制效力(IC50值)方面具有大的差异。
实施例13
实施例13中的数据在WO2014/044758(PCT/EP2013/069481)中公开。
fynomer多肽11L11-A09抑制糖基化IL-17A
方法
已测试了fynomer 11L11-A09抑制IL-17A的能力。研究条件与上文针对其他fynomer多肽所述的相同。
结果
将正常人真皮成纤维细胞与IL-17A/TNFα和不同浓度的fynomer多肽11L11-A09一起孵育。观察到11L11-A09以66nM的IC50值抑制糖基化IL-17A(表12)。
表12.针对IL-17A结合fynomer多肽1L11-A09获得的抑制糖基化IL-17A的IC50值
Figure GDA0001875602890000711
图21示出了fynomer多肽11L11-A09的剂量依赖性抑制曲线。11L11-A09以相当的效力和功效抑制糖基化和非糖基化IL-17A二者。
实施例14
在C57BL/6小鼠中的药物代谢动力学研究
为了有助于排名COVA801-808 FynomAb，在C57BL/6小鼠中评估所有8种FynomAb的药物代谢动力学特性。
给药和取血样
如下进行表示为COVA801、COVA802、COVA803、COVA804、COVA805、COVA806、COVA807、COVA808的FynomAb和托珠单抗的药物代谢动力学特性的确定：通过ELISA来测量在单次眶后注射之后于不同时间点取得的小鼠血清中的浓度。基于个体体重，向6至8周龄的雌性C56BL/6小鼠(Charles River，USA)静脉内注射10mg/kg剂量。每组由5只小鼠组成。在眶后注射后30分钟、6小时、24小时、48小时、96小时、144小时、192小时、240小时和288小时从尾静脉(尾部静脉)抽取血液。将血液收集在血液管凝固活化剂微量采血管(microvette)(CB300，Sarstedt)中，并通过在10,000rpm下离心10分钟来制备血清。将血清储存在-20℃下直至分析。
IL-6R和IL-17A ELISA
在高结合Nunc ELISA板(Thermo Scientific，456537)上分别使用固定化人IL-17α(Cell Signaling Technologies，8928BF)和重组人IL-6Rα(R&D Systems，Inc.227-SR/CF)通过ELISA来确定受试FynomAb和托珠单抗的血清浓度。将二者在PBS中以5mg/ml于4℃下包被过夜。将板在PBS+0.05％Tween(PBST)中洗涤并用经在PBST中稀释至1％的BSA(Fischer Scientific，37525)封闭2小时。对于每只小鼠和每个时间点，在封闭剂稀释剂中制备血清的800、4,000和20,000倍稀释物。如下制备每种FynomAb的对应标准物：从4nM开始以2倍滴定度在封闭剂稀释剂中制备连续稀释物(4nM至0.03125nM)。向板添加50μl的标准物(一式两份)和血清稀释物(一式三份)并在RT下孵育1小时。将板用PBST洗涤3次并与50μl经以1∶5,000稀释的过氧化物酶-AfffiniPure山羊抗人IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch，109-035-003)一起在RT下孵育1小时。将板用PBST洗涤3次。向所有孔添加50μl TMB液体底物(Sigma-Aldrich Inc.，T0440-1L)。将板孵育3分钟，并用50μl终止溶液终止。在405nM下记录吸光度值(PHERAstar Plus)。
数据分析
使用标准曲线和4参数拟合分析(X值对数，Y值线性)来计算每只小鼠的血清浓度。对于每个时间点和小鼠，将一式三份实验的平均nM血清浓度乘以对应的稀释因子，然后转换成ug/ml浓度。计算每个时间点和3个稀释因子的STDEV和％CV。选择具有最低％CV并且最佳代表标准曲线的线性部分的一个值作为每个时间点的值。对这些值进行药物代谢动力学参数分析(Phoenix 64，WinNonlin 6.3)。使用非房室PK分析(模型类型：Plasma(200-202)，计算方法：线性梯形线性插值)来计算半衰期(小时)、曲线下面积(AUC；小时＊ug/ml)、分布体积(Vz；ml)和清除率(Cl；ml/小时)。每只小鼠的标准曲线基于均匀加权和最佳拟合λZ计算，在回归中需要至少3个数据点，并且不包括Cmax。
结果
每种FynomAb和托珠单抗的血清浓度和药物代谢动力学参数示于表13至21中。尽管使用IL-6R和IL-17A两种ELISA来计算血清浓度和PK参数，但是在此仅示出了IL-6R数据。然而，由IL-17A ELISA数据确定得到近似的血清浓度和PK参数。因此，两种不同ELISA方法的血清浓度相对于时间曲线对每种FynomAb而言看起来非常相似(参见图22至25)。该数据表明FynomAb在体内稳定并且其与IL-6R和IL-17A二者结合的能力得以保留。一般来说，来自该药物代谢动力学研究的结果与相同小鼠品系的现有数据一致。
表13A和13B：托珠单抗的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。
表13A
Figure GDA0001875602890000731
表13B
Figure GDA0001875602890000732
表14A和14B：COVA801的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表14A
Figure GDA0001875602890000741
表14B
Figure GDA0001875602890000742
表15A和15B：COVA802的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表15A
Figure GDA0001875602890000751
表15B
Figure GDA0001875602890000752
表16A和16B：COVA803的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表16A
Figure GDA0001875602890000761
表16B
Figure GDA0001875602890000762
表17A和17B：COVA804的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表17A
Figure GDA0001875602890000771
表17B
Figure GDA0001875602890000772
表18A和18B：COVA805的血清浓度和PK参数
(A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表18A
Figure GDA0001875602890000781
表18B
Figure GDA0001875602890000782
表19A和19B：COVA806的血清浓度和PK参数
(A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表19A
Figure GDA0001875602890000791
图19B
Figure GDA0001875602890000792
表20A和20B：COVA807的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表20A
Figure GDA0001875602890000801
表20B
Figure GDA0001875602890000802
表21A和21B：COVA808的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表21A
Figure GDA0001875602890000811
表21B
Figure GDA0001875602890000812
图22示出了COVA801和COVA802的相对于时间绘制的平均血清浓度。
以托珠单抗(IL-6R ELISA)作为比较物示出了COVA801和COVA802的如通过IL6R或IL-17A ELISA确定的平均血清浓度+/-标准偏差(STDEV)。
图23示出了COVA803和COVA804的相对于时间绘制的平均血清浓度。
以托珠单抗(IL-6R ELISA)作为比较物示出了COVA803和COVA804的如通过IL6R或IL-17A ELISA确定的平均血清浓度+/-标准偏差(STDEV)。
图24示出了COVA805和COVA806的相对于时间绘制的平均血清浓度。
以托珠单抗(IL-6R ELISA)作为比较物示出了COVA805和COVA806的如通过IL6R或IL-17A ELISA确定的平均血清浓度+/-标准偏差(STDEV)。
图25示出了COVA807和COVA808的相对于时间绘制的平均血清浓度。
以托珠单抗(IL-6R ELISA)作为比较物示出了COVA807和COVA808的如通过IL6R或IL-17A ELISA确定的平均血清浓度+/-标准偏差(STDEV)。
实施例15
食蟹猴中的药物代谢动力学研究
给药、取血样
如下进行表示为COVA801、COVA802、COVA803、COVA804、COVA806、COVA808的FynomAb和托珠单抗的药物代谢动力学特性的确定：通过ELISA来测量在单次静脉内(i.v.)注射之后于不同时间点取得的食蟹猴血清中的浓度。基于个体体重，雄性和雌性猴静脉内注射5mg/kg剂量。每组由4只猴组成。在静脉内注射后5分钟、30分钟、2小时、6小时、24小时、第3天、第4天、第5天、第7天、第10天、第13天、第17天、第22天和第27天抽取血液。将血液收集在没有任何抗凝剂的管中，并通过在10,000rpm下离心1至2分钟来制备血清。将血清储存在-80℃下直至分析。
IL-6R和IL-17A ELISA
根据上文针对小鼠PK研究所概述的相同方案通过ELISA来确定受试FynomAb和托珠单抗的血清浓度。
数据分析
使用标准曲线和4参数拟合分析(X值对数，Y值线性)来计算每只猴的血清浓度。对于每个时间点和每只猴，将一式两份实验的平均nM血清浓度乘以对应的稀释因子，然后转换为ug/ml。计算每个时间点和3个稀释因子的STDEV和％CV。选择最佳代表标准曲线之线性部分的具有最低％CV的一个值作为每个时间点的值。对这些值进行药物代谢动力学参数分析(Phoenix 64，WinNonlin 6.3)。使用非房室PK分析(模型类型：Plasma(200-202)，计算方法：线性梯形线性插值)来计算半衰期(h)、曲线下面积(AUC；h＊ug/ml)、分布体积(Vz；ml)和清除率(Cl；ml/h)。每只猴的标准曲线基于均匀加权和最佳拟合λZ计算，在回归中需要至少3个数据点，并且不包括Cmax。
结果
每种FynomAb和托珠单抗的血清浓度和药物代谢动力学参数示于表22至28中。尽管使用IL-6R和IL-17A两种ELISA来计算血清浓度和PK参数，但是在此仅示出了IL-6R数据。然而，由IL-17A ELISA数据确定得到近似的血清浓度和PK参数。因此，两种不同ELISA方法的血清浓度相对于时间曲线对每种FynomAb而言看起来非常相似(参见图26至29)。这再次表明FynomAb在体内稳定并且其与IL-6R和IL-17A二者结合的能力得以保留。
一般来说，所有的FynomAb均显示出有利的PK特性，因为没有FynomAb从循环中迅速清除。COVA804显示具有最有利的PK特性，其中最佳AUC与托珠单抗非常近似。
表22A至22B：食蟹猴中托珠单抗的血清浓度和PK参数。
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。
表22A
Figure GDA0001875602890000831
表22B
Figure GDA0001875602890000841
表23A至23B：食蟹猴中COVA801的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表23A
Figure GDA0001875602890000842
表23B
Figure GDA0001875602890000851
表24A至24B：食蟹猴中COVA802的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表24A
Figure GDA0001875602890000852
表24B
Figure GDA0001875602890000861
表25A至25B：食蟹猴中COVA803的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表25A
Figure GDA0001875602890000862
表25B
Figure GDA0001875602890000871
表26A至26B：食蟹猴中COVA804的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表26A
Figure GDA0001875602890000872
表26B
Figure GDA0001875602890000881
表27A至27B：食蟹猴中COVA806的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表27A
Figure GDA0001875602890000882
表27B
Figure GDA0001875602890000891
表28A至28B：食蟹猴中COVA808的血清浓度和PK参数
A)示出了如通过ELISA(IL-6R)确定的每个时间点的血清浓度。还描绘了平均值和标准偏差(STDEV)。(B)重要药物代谢动力学参数例如半衰期、分布体积(Vz)、清除率(Cl)和曲线下面积(AUC)的总结。所述参数使用A中所示的血清浓度来计算。由IL-17A ELISA确定得到近似的血清浓度和PK参数。
表28A
Figure GDA0001875602890000892
表28B
Figure GDA0001875602890000901
图26示出了食蟹猴中COVA801和COVA802的相对于时间绘制的平均血清浓度。在图26中，以托珠单抗(IL-6R ELISA)作为比较物示出了COVA801和COVA802的如通过IL6R或IL-17A ELISA确定的平均血清浓度+/-标准偏差(STDEV)。
图27示出了食蟹猴中COVA803和COVA804的相对于时间绘制的平均血清浓度。在图27中，以托珠单抗(IL-6R ELISA)作为比较物示出了COVA803和COVA804的如通过IL6R或IL-17A ELISA确定的平均血清浓度+/-标准偏差(STDEV)。
图28示出了食蟹猴中COVA806的相对于时间绘制的平均血清浓度。在图28中，以托珠单抗(IL-6R ELISA)作为比较物示出了COVA806的如通过IL6R或IL-17A ELISA确定的平均血清浓度+/-标准偏差(STDEV)。
图29示出了食蟹猴中COVA808的相对于时间绘制的平均血清浓度。在图29中，以托珠单抗(IL-6R ELISA)作为比较物示出了COVA808的如通过IL6R或IL-17A ELISA确定的平均血清浓度+/-标准偏差(STDEV)。
实施例总结
本文中公开的数据表明，所有8种FynomAb均可结合并功能性地阻断IL-17A和IL-6R二者。所有8种构建体均对IL-17A和IL-6R具有非常相似的亲和力且在基于细胞的测定中具有相似的功能活性，并且轻链fynomer融合物(表示为COVA802、COVA804、COVA806和COVA808的FynomAb)具有更佳的SEC谱且较不易于聚集。
Figure IDA0001114736960000011
Figure IDA0001114736960000021
Figure IDA0001114736960000031
Figure IDA0001114736960000041
Figure IDA0001114736960000051
Figure IDA0001114736960000061
Figure IDA0001114736960000071
Figure IDA0001114736960000081
Figure IDA0001114736960000091
Figure IDA0001114736960000101
Figure IDA0001114736960000111
Figure IDA0001114736960000121
Figure IDA0001114736960000131
Figure IDA0001114736960000141
Figure IDA0001114736960000151
Figure IDA0001114736960000161
Figure IDA0001114736960000171
Figure IDA0001114736960000181
Figure IDA0001114736960000191
Figure IDA0001114736960000201
Figure IDA0001114736960000211
Figure IDA0001114736960000221
Figure IDA0001114736960000231
Figure IDA0001114736960000241
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Figure IDA0001114736960000261
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Figure IDA0001114736960000291
Figure IDA0001114736960000301
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Figure IDA0001114736960000331
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Figure IDA0001114736960000351
Figure IDA0001114736960000361
Figure IDA0001114736960000371
Figure IDA0001114736960000381
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Figure IDA0001114736960000401
Figure IDA0001114736960000411
Figure IDA0001114736960000421
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Figure IDA0001114736960000451
Figure IDA0001114736960000461
Figure IDA0001114736960000471

Claims (20)

1.双特异性融合多肽，其包含：
(1)fynomer序列，其由选自以下的氨基酸序列组成：
Figure FDA0002719644260000011
以及
(2)与白介素-6受体(IL-6R)结合的抗体或其子序列，
其中所述fynomer序列与所述抗体或其子序列缀合，并且所述融合多肽与IL-17a和IL-6R二者结合并抑制IL-17a和IL-6R二者活性。
2.权利要求1所述的融合多肽，其中所述fynomer序列与糖基化IL-17a结合，并且从而抑制IL-17受体功能或信号传导。
3.权利要求1所述的融合多肽，其中所述fynomer序列与糖基化IL-17a结合的结合亲和力(Kd)为1至200nM。
4.权利要求1所述的融合多肽，其中与如SEQ ID NO:1中所示的fynomer序列对糖基化IL-17a的结合亲和力相比，如SEQ ID NO:2至7中所示的fynomer序列对糖基化IL-17a具有更大的结合亲和力。
5.权利要求1所述的融合多肽，其中所述fynomer序列与结合IL-6R的所述抗体或其子序列的重链或轻链序列缀合。
6.权利要求5所述的融合多肽，其中所述fynomer序列与结合IL-6R的所述抗体或其子序列的重链序列的氨基端或羧基端缀合。
7.权利要求5所述的融合多肽，其中所述fynomer序列与结合IL-6R的所述抗体或其子序列的轻链序列的氨基端或羧基端缀合。
8.权利要求1所述的融合多肽，其中所述fynomer序列通过接头与结合IL-6R的所述抗体或其子序列的重链或轻链序列缀合。
9.权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽与IL-17a结合并且同时与IL-6R结合。
10.权利要求1所述的融合多肽，其中结合IL-6R的所述抗体或其子序列包含具有以下CDR1-3的重链：SDHAWS、YISYSGITTYNPSLKS、和SLARTTAMDY；以及具有以下CDR1-3的轻链：RASQDISSYLN、YTSRLHS、和QQGNTLPYT。
11.权利要求10所述的融合多肽，其中结合IL-6R的所述抗体包含与以下重链序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：
Figure FDA0002719644260000021
以及与以下轻链序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：
Figure FDA0002719644260000022
其中结合IL-6R的所述抗体或其子序列包含具有以下CDR1-3的重链：SDHAWS、YISYSGITTYNPSLKS、和SLARTTAMDY；以及具有以下CDR1-3的轻链：RASQDISSYLN、YTSRLHS、和QQGNTLPYT。
12.权利要求11所述的融合多肽，其中结合IL-6R的所述抗体或其子序列包含成对重链和轻链，所述重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:12并且所述轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:13。
13.权利要求10所述的融合多肽，其中结合IL-6R的所述抗体或其子序列包含选自以下的成对重链和轻链序列：
以下重链序列
Figure FDA0002719644260000031
以及
以下轻链序列
Figure FDA0002719644260000032
以下重链序列
Figure FDA0002719644260000033
以及
以下轻链序列
Figure FDA0002719644260000034
以下重链序列
Figure FDA0002719644260000041
以及
以下轻链序列
Figure FDA0002719644260000042
以下重链序列
Figure FDA0002719644260000043
以及
以下轻链序列
Figure FDA0002719644260000044
以下重链序列
Figure FDA0002719644260000051
以及
以下轻链序列
Figure FDA0002719644260000052
以下重链序列
Figure FDA0002719644260000053
以及
以下轻链序列
Figure FDA0002719644260000054
以下重链序列
Figure FDA0002719644260000061
以及
以下轻链序列
Figure FDA0002719644260000062
以下重链序列
Figure FDA0002719644260000063
以及
以下轻链序列
Figure FDA0002719644260000064
14.权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽与人IL-17a或IL-6R结合。
15.权利要求1所述的融合多肽，其中所述多肽是分离的或经纯化的。
16.药物组合物，其包含权利要求1至15中任一项所述的融合多肽。
17.权利要求1至15中任一项所述的融合多肽用于制备用于治疗自身免疫性疾病或病症的药物的用途。
18.权利要求17所述的用途，其中所述自身免疫性疾病或病症是影响肌肉、骨骼、神经系统、结缔组织、内分泌系统、皮肤、气道或肺系统、胃肠系统、眼系统或循环系统的自身免疫性疾病或病症。
19.权利要求17所述的用途，其中所述自身免疫性疾病或病症选自：银屑病、关节炎、和葡萄膜炎。
20.权利要求19所述的用途，其中所述关节炎是类风湿性关节炎。
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