TW201922798A - 靶向rankl的治療性抗體 - Google Patents

靶向rankl的治療性抗體 Download PDF

Info

Publication number
TW201922798A
TW201922798A TW107137807A TW107137807A TW201922798A TW 201922798 A TW201922798 A TW 201922798A TW 107137807 A TW107137807 A TW 107137807A TW 107137807 A TW107137807 A TW 107137807A TW 201922798 A TW201922798 A TW 201922798A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
antigen
binding fragment
rankl
seq
Prior art date
Application number
TW107137807A
Other languages
English (en)
Inventor
劉潔穎
競 李
Original Assignee
中國大陸商上海藥明生物技術有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司 filed Critical 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司
Publication of TW201922798A publication Critical patent/TW201922798A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本發明提供了RANKL之單株抗體，特別是高親和力之RANKL人源化單株抗體。本發明還提供與人、食蟹猴及小鼠之RANKL交叉反應之功能性單株抗體。本發明進一步提供了本發明之抗體之胺基酸序列、選殖或表現載體、宿主細胞及用於表現或分離抗體之方法、鑑定抗體之表位。還提供包含本發明抗體之治療組合物。本發明還提供了利用抗RANKL抗體治療癌症及其他疾病之方法。

Description

靶向RANKL的治療性抗體
本發明一般係關於針對RankL之抗體及其組合物，以及使用抗RankL抗體治療與骨損失相關之疾病之療法。
NF kappa-B配位體(RANKL)之受體激活劑，亦稱為骨保護素配位體(OPGL)及腫瘤壞死因子配位體超家族成員11(TNFSF11)，係TNF超家族之成員(Anderson DM 等人， Nature 390 (6656): 175-179 )。RANKL可以在細胞表面或以可溶形式表現(Findlay DM 等人， Osteoporos Int 22 (10): 2597-2602 )。藉由與破骨細胞及其前驅體上之受體RANK結合，介導破骨細胞之形成、活化及存活(Hsu H 等人， Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Mar 30; 96(7):3540-2545 )。越來越多之證據亦表明，腫瘤細胞在骨內相互作用，刺激RANK-RANKL系統之受體激活劑，導致癌症誘發之骨質破壞(Roodman GD, N Engl J Med 2004;350:1655 ‑ 1664 )。
早期動物研究證明了RANKL作為治療破骨細胞介導之骨損失之治療目標之潛力(Lacey DL 等人， Cell. 1998; 93:165-176; Ann E. Kearns 等人， Endocrine Reviews 29(2):155-192 )。使用OPG Fc融合蛋白(一種內源性RNAKL抑制劑)之動物研究及臨床試驗提供了RANKL在骨重建中至關重要之有力證據(Ann E. Kearns 等人， Endocrine Reviews 29(2):155-192; Bekker PJ, J Bone Miner Res. 2001; 16: 348-360 )。
Denosumab係一種經FDA批准之RANKL全人單株抗體，其臨床研究顯示椎骨、非椎骨及髖部骨折明顯減少，且提供了與絕經後骨質疏鬆症女性使用denosumab相符之證據(David W. Dempster, Clin Ther. 2012; 34:521-536 )。三項關鍵之隨機III期試驗亦表明，Denosumab在預防骨骼相關事件(SRE)方面優於唑來膦酸，對晚期癌症骨轉移患者具有良好之安全性及便利性(Clin Ther. 2012; 34:521-536; Prasad Narayanan, Journal of Cancer. 2013; 2(4): 272-277 )。
本發明提供分離之抗體，特別是單株抗體或人源化單株抗體。
在一個態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段與人、猴及小鼠RANKL結合。
在一個態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段
a) 結合於人RANKL，KD 為6.98E-10 M以下；並且
b) 結合於猴RANKL，KD 為5.32E-11 M以下。
前述抗體或抗原結合片段具有下列性質中之至少一種：
a) 結合於人RANKL，KD 為6.98E-10 M至6.33E-11 M，並且結合於猴RANKL，KD 為5.32E-11 M至9.03E-12 M；
b) 抑制RANKL介導之細胞功能；
c) 抑制RAW細胞分化成破骨細胞樣細胞。
本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其包含一個胺基酸序列，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14所組成之群中之序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%之同源性，
其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其包含一個胺基酸序列，該胺基酸序列選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14所組成之群中之序列，
其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 重鏈可變區，其具有之胺基酸序列與選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及7所組成之群中之序列具有至少70%、80%、90%或95%之同源性；以及
b) 輕鏈可變區，其具有之胺基酸序列與選自由SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13及14所組成之群中之序列具有至少70%、80%、90%或95%之同源性，
其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，包含：
a) 重鏈可變區，其具有之胺基酸序列選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及7所組成之群中之序列；以及
b) 輕鏈可變區，其具有之胺基酸序列選自由SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13及14所組成之群中之序列，
其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
在各種實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：
a)具有選自SEQ ID NO：1之胺基酸序列之重鏈可變區；及
b)具有選自SEQ ID NO：8之胺基酸序列輕鏈之可變區，
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL；
或抗體或其抗原結合片段包括：
a)具有選自SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈可變區；及
b)具有選自SEQ ID NO：9之胺基酸序列之輕鏈可變區，
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL；
或抗體或其抗原結合片段包括：
a)具有選自SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈可變區；及
b)具有選自SEQ ID NO：10之胺基酸序列之輕鏈可變區，
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL；
或抗體或其抗原結合片段包括：
a)具有選自SEQ ID NO：4之胺基酸序列之重鏈可變區；及
b)具有選自SEQ ID NO：11之胺基酸序列之輕鏈可變區，
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL；
或抗體或其抗原結合片段包括：
a)具有選自SEQ ID NO：5之胺基酸序列之重鏈可變區；及
b)具有選自SEQ ID NO：12之胺基酸序列之輕鏈可變區
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL；
或抗體或其抗原結合片段包括：
a)具有選自SEQ ID NO：6之胺基酸序列之重鏈可變區；及
b)具有選自SEQ ID NO：13之胺基酸序列之輕鏈可變區，
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL；
或抗體或其抗原結合片段包括：
a)具有選自SEQ ID NO：7之胺基酸序列之重鏈可變區；及
b)具有選自SEQ ID NO：14之胺基酸序列之輕鏈可變區，
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL；
該抗體之序列示於表1和序列表中。
表 1 抗體之胺基酸序列
在另一態樣中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，包含互補決定區(CDR)，其具有之胺基酸序列選自由SEQ ID NO：15-36所組成之群中之序列，
其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
另一態樣，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，包含：
包含CDR1、CDR2和CDR3序列之重鏈可變區；以及
包含CDR1、CDR2和CDR3序列之輕鏈可變區，
其中重鏈可變區CDR3序列包含選自由SEQ ID NO：15、16、17所組成之群中之胺基酸序列及其保守性修飾，
其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
較佳地，其中前述抗體或其抗原結合片段之該輕鏈可變區CDR3序列包含選自由SEQ ID NO：18、19、20、21所組成之群中之胺基酸序列及其保守性修飾。
較佳地，其中前述抗體或其抗原結合片段之該重鏈可變區CDR2序列包含選自由SEQ ID NO：22、23、24、25所組成之群中之胺基酸序列及其保守性修飾。
較佳地，其中前述抗體或其抗原結合片段之該輕鏈可變區CDR2序列包含選自由SEQ ID NO：26、27、28、29所組成之群中之胺基酸序列及其保守性修飾。
較佳地，其中前述抗體或其抗原結合片段之該重鏈可變區CDR1序列包含選自由SEQ ID NO：30、31、32所組成之群中之胺基酸序列及其保守性修飾。
較佳地，本發明之抗體，其中前述抗體或其抗原結合片段之該輕鏈可變區CDR1序列包含選自由SEQ ID NO：33、34、35、36所組成之群中之胺基酸序列及其保守性修飾。
在更佳之實施例中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL並且包含：包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區；及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中：
a)重鏈可變區CDR1序列包含選自SEQ ID NO：30、31和32之胺基酸序列之胺基酸序列，該CDR2序列包含選自SEQ ID NO：22、23、24及25之胺基酸序列之胺基酸序列，該CDR3序列包含選自SEQ ID NO：15、16及17之胺基酸序列之胺基酸序列；
b)及輕鏈可變區CDR1序列包含選自SEQ ID NO：33、34、35及36之胺基酸序列之胺基酸序列，CDR2序列包含選自SEQ ID NO：26、27、28及29之胺基酸序列之胺基酸序列，CDR3序列包含選自SEQ ID NO：18、19、20及21之胺基酸序列之胺基酸序列，
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
較佳之抗體或其抗原結合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：30之重鏈可變區CDR1；
b)包含SEQ ID NO：22之重鏈可變區CDR2；
c)包含SEQ ID NO：15之重鏈可變區CDR3；
d)包含SEQ ID NO：33之輕鏈可變區CDR1；
e)包含SEQ ID NO：26之輕鏈可變區CDR2；
f)包含SEQ ID NO：18之輕鏈可變區CDR3；
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
另一種較佳之抗體或其抗原結合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：31之重鏈可變區CDR1；
b)包含SEQ ID NO：23之重鏈可變區CDR2；
c)包含SEQ ID NO：16之重鏈可變區CDR3；
d)包含SEQ ID NO：34之輕鏈可變區CDR1；
e)包含SEQ ID NO：27之輕鏈可變區CDR2；
f)包含SEQ ID NO：19之輕鏈可變區CDR3；
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
另一種較佳之抗體或其抗原結合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：32之重鏈可變區CDR1；
b)包含SEQ ID NO：24之重鏈可變區CDR2；
c)包含SEQ ID NO：17之重鏈可變區CDR3；
d)包含SEQ ID NO：35之輕鏈可變區CDR1；
e)包含SEQ ID NO：28之輕鏈可變區CDR2；
f)包含SEQ ID NO：20之輕鏈可變區CDR3；
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
另一種較佳之抗體或其抗原結合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：30之重鏈可變區CDR1；
b)包含SEQ ID NO：25之重鏈可變區CDR2；
c)包含SEQ ID NO：15之重鏈可變區CDR3；
d)包含SEQ ID NO：36之輕鏈可變區CDR1；
e)包含SEQ ID NO：29之輕鏈可變區CDR2；
f)包含SEQ ID NO：21之輕鏈可變區CDR3；
其中抗體特異性結合RANKL。
另一種較佳之抗體或其抗原結合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：30之重鏈可變區CDR1；
b)包含SEQ ID NO：22之重鏈可變區CDR2；
c)包含SEQ ID NO：15之重鏈可變區CDR3；
d)包含SEQ ID NO：33之輕鏈可變區CDR1；
e)包含SEQ ID NO：26之輕鏈可變區CDR2；
f)包含SEQ ID NO：18之輕鏈可變區CDR3；
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
另一種較佳之抗體或其抗原結合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：31之重鏈可變區CDR1；
b)包含SEQ ID NO：23之重鏈可變區CDR2；
c)包含SEQ ID NO：16之重鏈可變區CDR3；
d)包含SEQ ID NO：34之輕鏈可變區CDR1；
e)包含SEQ ID NO：27之輕鏈可變區CDR2；
f)包含SEQ ID NO：19之輕鏈可變區CDR3；
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
另一種較佳之抗體或其抗原結合片段包括：
a)包含SEQ ID NO：32之重鏈可變區CDR1；
b)包含SEQ ID NO：24之重鏈可變區CDR2；
c)包含SEQ ID NO：17之重鏈可變區CDR3；
d)包含SEQ ID NO：35之輕鏈可變區CDR1；
e)包含SEQ ID NO：28之輕鏈可變區CDR2；
f)包含SEQ ID NO：20之輕鏈可變區CDR3；
其中抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
該抗體之CDR序列顯示在表2及序列表中。
表 2 抗體之CDR序列
本發明之抗體可以係嵌合抗體。
本發明之抗體可以係人源化抗體。
本發明之抗體可以係完全人抗體。
本發明之抗體可以係大鼠抗體。
本發明之抗體或抗原結合片段具有下列性質中之至少一種：
a) 結合於人RANKL，KD 為6.98E-10 M至6.33E-11 M，及結合於猴RANKL，KD 為5.32E-11 M至9.03E-12 M；
b) 抑制RANKL介導之細胞功能；
c) 抑制RAW細胞分化成破骨細胞樣細胞。
在另一態樣中，本發明提供了編碼抗體或其抗原結合片段之核酸分子。
本發明提供選殖或表現載體，其包含編碼抗體之核酸分子或其抗原結合片段。
本發明還提供了包含一種以上選殖或表現載體之宿主細胞。
在另一態樣中，本發明提供了一種方法，包括培養上述宿主細胞並分離抗體；其中，藉由在具有人RankL蛋白之小鼠中免疫來製備抗體。
本發明提供了包含人免疫球蛋白重鏈及輕鏈轉基因之轉基因動物諸如小鼠，其中該動物表現本發明之抗體。
本發明提供了由本發明之動物製備之雜交瘤，其中雜交瘤產生該抗體。
在又一態樣中，本發明提供一種藥物組合物，包含如本發明所述之抗體或其抗原結合片段，以及一種以上藥學可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。
本發明提供一種用於製備抗RANKL抗體或其抗原結合片段之方法，包括：
(a) 提供：
(i) 一個重鏈可變區之抗體序列，其包含選自由SEQ ID NO：30-32所組成之群中之CDR1序列，選自由SEQ ID NO：22-25所組成之群中之CDR2序列以及選自由SEQ ID NO：15-17所組成之群中之CDR3序列；及/或
(ii) 一個輕鏈可變區之抗體序列，其包含選自由SEQ ID NO：33-36所組成之群中之CDR1序列，選自由SEQ ID：26-29所組成之群中之CDR2序列以及選自由SEQ ID NO：18-21所組成之群中之CDR3序列；並且
(b) 將改變之抗體序列表現成蛋白質。
本發明還提供了預防或治療受試者之骨損失相關疾病之方法，該方法包括給需要之受試者投與治療有效量之本發明之上述抗體或抗原結合片段。
本發明還提供預防或治療受試者之骨損失相關疾病之群合方法，包括給予需要之受試者治療有效量之本發明之上述抗體或抗原結合片段，並給予受試者治療有效量之免疫檢查點抗體。
本發明中之免疫檢查點抗體包括CTLA-4抗體、PD-1抗體或PD-L1抗體。
本發明還提供了該抗體或其抗原結合片段在製備用於預防或治療與骨損失相關之疾病之藥物中之用途。
該疾病包括克羅恩病、男性不育症、慢性腎病、痛風、類風濕性關節炎、神經性厭食症、重型地中海貧血症、狀腺功能亢進症或癌症。
該癌症係選自黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌及直腸癌。
發明之有益效果
本發明中揭示之抗體具有高結合親和力，特異性結合人及猴RANKL蛋白；有效預防或治療與骨損失相關之疾病。
其中一種抗體不僅與人及猴RANKL結合，而且還與鼠RANKL結合，這可大大促進其在小鼠腫瘤模型中之功效之臨床前驗證。
相關申請之交叉引用
本申請案主張2017年10月27日提交之PCT專利申請序列號PCT/CN2017/108054之權益及優先權，其全部內容藉由引用整體併入本文。
下面藉由具體實施方式及實驗資料對本發明作進一步之說明。儘管為了清楚之目的，在下文中使用了專用術語，但此等術語並不意味著定義或限制本發明之範圍。
術語「核因子-κB配位體之受體激活劑」、「RANKL」、「TNF相關之激活誘導之細胞因子」、「TRANCE」、「骨保護素配位體」、「OPGL」、「破骨細胞分化因子」、「ODF」術語可互換使用，包括變體、同種型、人RANKL之物種同源物或其他物種之RANKL，以及具有至少一個具有RANKL之共同表位之類似物。
如本文中所使用，術語「抗體」包括完整抗體及任何抗原結合片段(亦即「抗原結合部分」)或其單鏈。「抗體」係指包含至少兩條重鏈(H)及兩條輕鏈(L)並由二硫鍵相互連接之蛋白質，或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為VH)及重鏈恆定區構成。重鏈恆定區由三個結構域，CH1，CH2及CH3構成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為VL)及輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL構成。VH及VL區可以進一步細分成：稱為互補決定區(CDR)之高變區，以及穿插分佈之稱為構架區(FR)之更保守區域。每個VH及VL由三個CDR和四個FR構成，自胺基末端至羧基末端以下面之順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈之可變區包含與抗原相互作用之結合結構域。
在本申請案中所用之術語「抗體」係指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，並且包括其包含之抗原結合位點之任何多肽，而不管其係在活體外還是活體內產生。該術語包括但不限於，多株、單株、單特異性、多特異性、非特異性、人源化、單鏈、嵌合、合成、重組、雜合、突變、嫁接之抗體。術語「抗體」還包括抗體片段，例如Fab、F(ab')2、FV、scFv、Fd、dAb及其他保留抗原結合功能之抗體片段，亦即，能夠與RANKL特異性結合。通常情況下，此類片段將包括抗原結合片段。
術語「抗原結合片段」、「抗原結合結構域」及「結合片段」係指一種抗體分子，其包含負責抗體與抗原之間特異結合之胺基酸。例如，在抗原較大之情況下，抗原結合片段可能只結合抗原之一部分。抗原分子中負責與抗原結合片段特異性相互作用之部分被稱為「表位」或「抗原決定簇」。
抗原結合片段通常包括抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)，然而，它不一定必須包括兩者。例如，一個所謂之Fd抗體片段僅由VH結構域構成，但仍保留了完整抗體之一些抗原結合功能。
上述術語「表位」定義為抗原決定簇，其特異性結合/識別結合片段。結合片段可以特異性與針對目標結構獨特之構象或連續表位進行結合/相互作用，例如人類RANKL及鼠源RANKL。構象或不連續表位之特徵在於多肽抗原在一級序列中是分離之兩個或多個離散之胺基酸殘基，但多肽摺疊成天然蛋白/抗原時是一起聚集在分子之表面上。構成表位之兩個或多個離散之胺基酸殘基存在於一個或多個多肽鏈之獨立部分。當多肽鏈摺疊成三維結構，此等殘基聚集在分子表面以構成表位。與此相反，由兩個或多個離散之胺基酸殘基組成之連續或線性表位，其存在於多肽鏈之單個線性區段。
本文中所描述之術語「交叉反應性」係指對人類、猴及/或鼠源(小鼠或大鼠)相同目標分子之抗原片段之結合。因此，「交叉反應性」應被理解為與在不同物種中表現之相同分子X之種屬間反應。識別人RANKL、猴及/或鼠RANKL(小鼠或大鼠)之單株抗體之交叉反應特異性可藉由FACS分析判定。
如本文所用，術語「受試者」包括任何人或非人動物。術語「非人動物」包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類動物、羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。除非特別指出，術語「患者」或「受試者」可以互換使用。
術語「治療」和「治療方法」係指治療性治療及預防性/預防措施。彼等需要治療者包括已具有特定醫學病症，以及彼等可能最終獲得該病症之個體。
術語「保守性修飾」，亦即，不顯著影響或改變由該核苷酸序列編碼或包含該胺基酸序列之抗體結合特性之核苷酸及胺基酸序列修飾物。這類保守性序列修飾物包括核苷酸及胺基酸取代、添加及缺失。可以藉由本領域已知之標準技術，如定點突變及PCR介導之突變將修飾引入序列。保守性胺基酸取代包括這種取代，其中胺基酸殘基被具有相似側鏈之胺基酸殘基所取代。具有相似側鏈之胺基酸殘基家族已在本領域進行定義。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)，酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)，不帶電荷之極性側鏈(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)，非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蛋胺酸)，β分支之側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香側鏈(例如，酪胺酸、苯丙 胺酸、色胺酸、組胺酸)。
下述實例中之實驗方法，如無特殊說明，均為習知方法。
實例
實例 1 ： 抗體產生
1. 免疫及抗體雜交瘤之產生
1.1 免疫
Balb/c小鼠大約每3天透過足墊注射人RankL蛋白。注射6次後進行第一力價測試。
1.2 血清力價偵測
ELISA測定用於量測小鼠血清中抗體之力價。為了量測抗體之力價，將板(Nunc)在4℃下以1 μg/ mL之人RankL包被過夜，然後在室溫下用封閉緩衝液(1×PBS/2%BSA)封閉1小時。在封閉緩衝液中以1:100稀釋開始以1:3滴定大鼠血清，並在室溫下溫育1小時。然後洗滌平板，隨後與第二抗體山羊抗小鼠IgG Fc HRP一起溫育1小時。洗滌後，加入TMB底物，用2M HCl終止相互作用。使用酶標儀(Molecular Device)讀取450 nm處之吸光度。
藉由ELISA測定法測定血清中抗原特異性抗體之力價。選擇血清力價為312500或更高之小鼠進行雜交瘤融合。
2. 雜交瘤之產生
在無菌條件下自免疫小鼠收集淋巴結及脾，並使用Ficoll-Paque PLUS梯度離心製備淋巴細胞。然後使用電融合裝置(BTX ECM2001)將分離之細胞與骨髓瘤細胞P3以1:1之比例融合。融合後將細胞轉移至1/2 HA培養基。每96孔板接種5×105 個細胞。
3. 抗體篩選
雜交瘤上清液用於初篩。然後藉由ELISA阻斷測定篩選抗原特異性雜交瘤。
藉由ELISA之結合測定：將板(Nunc)在4℃下以1 μg/mL之人RankL包被過夜。封閉和洗滌後，將雜交瘤上清液轉移至平板中並在室溫下溫育1小時。然後洗滌平板，隨後與第二抗體山羊抗小鼠IgG Fc HRP一起溫育1小時。洗滌後，加入TMB底物，用2M HCl終止相互作用。使用酶標儀(Molecular Device)讀取450 nm處之吸光度。
藉由ELISA阻斷測定：將板(Nunc)在4℃下用5 μg/mL之Rank-Fc融合蛋白包被過夜。將雜交瘤上清液與250 ng/mL RankL-His混合，並在4℃下溫育過夜。Prolia用作陽性對照。封閉及洗滌後，將混合物加入板中並溫育1小時。然後洗滌平板，隨後與抗His Ab-HRP一起溫育。洗滌後，加入TMB底物，用2M HCl終止相互作用，使用酶標儀(Molecular Device)讀取450 nm處之吸光度。
選擇可阻斷人Rank配位體與人Rank結合之抗體用於進一步表徵。自雜交瘤上清液中純化具有結合及阻斷活性之所選抗體。同時，亞純系選擇之雜交瘤系。藉由結合及阻斷ELISA測定驗證雜交瘤亞純系，並且還偵測其同種型。
4. 亞純系
將每個選擇之細胞株之雜交瘤細胞以0.5、1和5個細胞/孔之密度接種在96孔板中。挑選單個純系並在結合ELISA中測試。選擇每個雜交瘤系之三個亞純系並冷凍。
5. 抗體純化
在將pH調節至7.0後，將收穫之雜交瘤上清液上樣至蛋白A管柱(MabSelect SuRe，GE)。藉由甘胺酸溶離抗體，然後立即使用1M Tris中和。藉由Nano Drop(Thermal-Fisher)測試抗體濃度。藉由SDS-PAGE(Invitrogen，NuPAGE4%-12%Bis-Tris Gel)及HPLC-SEC(Agilent)評估蛋白質之純度。
6. 抗體同種型
藉由ELISA鑑定抗體同種型。將板(Nunc)用1 μg/mL之山羊抗小鼠IgG1/抗小鼠IgG2a/抗小鼠IgG2b/抗小鼠IgG3/抗小鼠IgM抗體在4℃下包被過夜。封閉及洗滌後，將雜交瘤上清液轉移至包被之板上並在室溫下溫育1小時。然後將板與第二抗體山羊抗小鼠κHRP或山羊抗小鼠λHRP(Southern Biotech)一起溫育45分鐘。洗滌後，加入TMB底物，用2M HCl終止相互作用。使用酶標儀(Molecular Device)讀取450 nm處之吸光度。
鼠抗體之同種型如表3所示。
表 3. 鼠抗體之同種型
7. 抗體序列
使用Trizol試劑(Invitrogen-15596018)自雜交瘤細胞中提取RNA。 使用5'-RACE套組(Takara-28001488)擴增cDNA，然後使用3'-簡併引子及3'-接頭引子(ExTaq：Takara-RR001B)進行PCR擴增。將PCR片段插入pMD18-T載體(Takara-D101C)中，並送測序(Shanghai Biosune)。
鼠抗RankL抗體之可變區胺基酸序列示於表4中，可變區DNA序列示於表5中。
表 4. 鼠抗RankL抗體之可變區胺基酸序列
劃線序列分別係CDR1-3。
表 5. 鼠抗RankL抗體之可變區DNA序列
實例 2 ： 鼠源抗體之表徵
1. ELISA 結合
抗體WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_5.20及WBP114_7.80表現出亞奈莫耳結合活性，並且它們的EC50 值與Prolia相當。結合EC50 與最大結合值總結在表6及圖1中。
表 6. 抗體之ELISA結合
2. 阻斷測定
抗體WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_5.20及WBP114_7.80可以阻斷RANKL與RANK之結合。WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1及WBP114_7.80顯示出與Prolia相當之阻斷活性。抑制IC50 值總結在表7及圖2中。
表 7. 抗體阻斷分析
3. 對小鼠 RNAKL 之交叉結合活性
將ELISA板(Nunc)用小鼠RankL以5 μg/ mL在4℃下包被過夜。封閉及洗滌後，加入1 μg/mL抗體樣品或Prolia並溫育1小時。然後洗滌平板，隨後與第二抗體抗小鼠IgG Fc HRP /抗人IgG Fc HRP(Bethyl)一起溫育1小時。洗滌後，加入TMB底物，用2M HCl終止相互作用。 使用酶標儀(Molecular Device)讀取450 nm處之吸光度。藉由ELISA偵測與鼠RANKL之結合。抗體WBP114_5.20可以與鼠RANKL結合(圖3)，EC50 為0.067 nM。WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_7.80及Prolia不與小鼠RANKL結合(資料未顯示)。
4. NF-kB 報導基因測定
使用含有RANK及NF-kB-luc之工程化HK293細胞株量測抗體中和RANKL介導之細胞功能之能力。
將293F細胞以5×105 細胞/mL之密度重懸於FreeStyle 293表現培養基(Invitrogen-12338)中。將1 mL/孔之293F細胞懸浮液轉移至24孔板中。將pG1-NF-kB載體在Opti-MEM I Reduced Serum Medium (Invitrogen-31985)中稀釋。將PlasFect稀釋於Opti-MEM I Reduced Serum Medium中。溫育5分鐘後，將稀釋之pG1-NF-kB與PlasFect組合。輕輕混合並在室溫下溫育20分鐘。將混合物加入細胞中並在37℃溫育過夜。
將轉染之293F-pG1-NF-kB細胞以5000個細胞/孔之密度接種在96孔板(Corning 3916)中之FreeStyle 293表現培養基中。將RANKL與各種濃度之抗體之混合物在4℃下預溫育30分鐘並加入細胞中。RANKL之終濃度為300 ng/mL。在37℃溫育24小時後，向每個孔中加入50 μL/孔Nano-Glo螢光素酶(Promega-N1120)並在室溫下溫育5分鐘(避光)。藉由MD SpectraMax M5e讀取螢光。抑制率計算為[V(RANKL)-V(樣品)]/[V(RANKL)-V(空白)]×100%。V(RANKL)=(細胞+ RANKL)之RFU，V(樣品)=(細胞+ RANKL + Ab)之RFU，V(空白)=細胞之RFU。
量測抗體對RANKL誘導型螢光素酶活性之抑制(圖4)。抑制IC50 值總結在表4中。抗體WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_7.80顯示出與Prolia相當之抑制活性。抗體WBP114_5.20之抑制活性略低於Prolia(表8)。
表8. NF-kB報導基因測定
5. RAW264.7 細胞分化測定
使用RAW細胞分化測定檢查抗體對破骨細胞形成之抑制。RANKL可以刺激RAW細胞分化為破骨細胞樣細胞，並且可以藉由抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性來量測分化。
將RAW264.7細胞以2×104 個細胞/孔之密度接種在96孔板中的含有10%FBS之DMEM培養基中。將板在37℃下溫育過夜。將RANKL與各種濃度之抗體之混合物加入細胞中。RANKL之終濃度為100 ng/mL。4或5天後，除去培養基，向細胞中加入60 μL裂解緩衝液(0.1 M檸檬酸、0.1 M檸檬酸三鈉鹽、0.1%Triton X-100)。除去40 μL上清液，並使用TRAP測定套組(Beyotime Biotechnology，貨號P0332)偵測酒石酸抗性酸性磷酸酶。藉由MD SpectraMax M5e在405 nm處讀板。按照下式計算抑制率：[V(RANKL)-V(樣品)]/[V(RANKL)-V(空白)] ×100%(V(RANKL)=(細胞+ RANKL)之RFU，V(樣品)=(細胞+ RANKL + Prolia)之RFU，V(空白)=細胞之RFU。
計算抑制率(圖5)，並且將抑制IC50 總結在表9中。
表 9. RAW264.7細胞分化測定
6. SPR 之親和力
藉由Biacore測試所選抗體對人及食蟹猴RANKL之動力學結合親和力。使用Biacore T200(GE)藉由SPR測定偵測對人及食蟹猴RankL之抗體結合親和力。將每種抗體捕獲在蛋白A固定之CM5感測器晶片(GE)上或直接固定至晶片上。將不同濃度之人或食蟹猴RankL以30 μL/分鐘之流速注射至感測器晶片上。在每個結合循環後，藉由甘胺酸(pH 1.5)再生晶片。
自測試感測器中減去空白表面和緩衝通道之傳感圖。使用Langmiur分析藉由1:1模型擬合實驗資料。使用34 KDa之分子量來計算分析物之莫耳濃度。
6.1. 對人類RANKL之親和力
SPR結果顯示抗體WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_7.80對人RANKL之親和力高於Prolia。WBP114_5.20之親和力略低於Prolia。
表 10. 對人類RANKL之親和力
6.2 對食蟹猴RANKL之親和力
表11. 對食蟹猴RANKL之親和力
7. 表位聯合
藉由ELISA將抗體與Prolia結合。將ELISA板(Nunc)用Prolia在4℃下包被過夜。自10 μg/mL開始連續稀釋抗體，並與20 ng/mL RankL-His蛋白混合。封閉及洗滌後，將混合物加入板中並溫育1小時。然後洗滌平板，隨後與第二抗體抗His HRP一起溫育。洗滌後，加入TMB底物，用2M HCl終止相互作用。使用酶標儀(Molecular Device)讀取450 nm處之吸光度。
在針對Prolia之競爭性ELISA測定中測試抗體WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_5.20及WBP114_7.80(圖6)。與Prolia相比，WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1及WBP114_7.80在相同或非常接近之表位與RANKL結合。基於競爭性ELISA結果及不同之交叉反應性質，抗體WBP114_5.20可以與Prolia在不同或部分重疊之表位上與RANKL結合。
實例 3 ： 人源化抗體之產生
1. 重組嵌合抗體之產生
將每種鼠抗體之V區DNA選殖至含有人恆定區基因之pcDNA3.3載體中。用編碼抗體重鏈及輕鏈之質體轉染HEK293細胞。藉由除去細胞並過濾來收穫來自轉染細胞之上清液。藉由蛋白A管柱(MabSelect SuRe，GE)純化抗體，並將緩衝液交換至PBS中。藉由Nanodrop偵測抗體濃度。藉由SDS-PAGE(Invitrogen，NuPAGE4%-12%Bis-Tris Gel)及HPLC-SEC(Agilent)評估純度。
2. 人源化
「Best Fit」方法用於人源化抗體輕鏈及重鏈。對於輕鏈，對相應V基因之胺基酸序列進行內部人種系V基因資料庫之比對。藉由使用Kabat CDR定義小鼠CDR序列，替換頂部命中之人CDR序列來衍生人源化VL基因之序列。對於重鏈，衍生出4個人源化序列。對於輕鏈，得至第一序列。藉由對人種系V基因資料庫之小鼠框架進行比對來創建三個額外之序列。使用擴展CDR定義框架，其中Kabat CDR1在N末端延伸5個胺基酸。前三次命中用於獲得人源化VH基因之序列。對人源化基因進行反向轉譯，對哺乳動物表現進行密碼子優化，並藉由GeneArt Costum Gene Synthesis(Life Technologies)合成。將合成基因重新選殖至IgG表現載體中，表現並純化。人源化抗RankL抗體之可變區序列示於表12及13中。
表 12. 人源化抗RankL抗體之可變區胺基酸序列
表 13. 人源化抗RankL抗體之可變區DNA序列
實例 4 ： 人源化抗體之表徵
1. ELISA 結合
人源化抗體WBP1141-5.2.1-z1-IgG4及WBP1141-7.80-z1-IgG4表現出與Prolia相當之結合活性。結合EC50 值總結於表14中。
表 14. 人源化抗體之ELISA結合
2. 阻斷實驗
人源化抗體可以阻斷RANKL與RANK之結合。WBP1141-5.2.1-z1-IgG4及WBP1141-7.80-z1-IgG4顯示出與Prolia相當之阻斷活性。抑制IC50 值總結在表15中。
表15. 人源化抗體之阻斷實驗
3. SPR 親和力
藉由Biacore測試人源化抗體對人及食蟹猴RANKL之動力學結合親和力。
3.1對人類RankL之親和力
人源化抗體WBP1141-5.2.1-z1-IgG4及WBP1141-7.80-z1-IgG4維持其對人RankL之原始親和力。WBP1141-5.2.1-z1-IgG4及WBP1141-7.80-z1-IgG4對人RankL之親和力比Prolia高10倍以上(表16)。
表 16.對人類RANKL之親和力
3.2對食蟹猴RANKL之親和力
人源化抗體WBP1141-5.2.1-z1-IgG4及WBP1141-7.80-z1-IgG4顯示出對食蟹猴RankL之皮莫耳親合力。
表 19. 對食蟹猴RANKL之親和力
4. NF-kB 報導基因測定
量測抗體對RANKL誘導型螢光素酶活性之抑制(圖9)。抑制IC50 值總結在表17中。人源化抗體WBP1141-5.2.1-z1-IgG4及WBP1141-7.80-z1-IgG4顯示出比Prolia稍好之抑制活性。
表17. NF-kB 報導基因分析
5. RAW264.7 細胞分化測試
量測人源化抗體對RAW264.7細胞分化之抑制(圖10)，並且IC50 值總結在表18中。人源化抗體WBP1141-5.2.1-z1-IgG4及WBP1141-7.80-z1-IgG4顯示出與Prolia相當之抑制活性。
表 18. RAW264.7 細胞分化測試
圖1示出抗體WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_5.20、WBP114_7.80及Prolia與人RANKL之結合。
圖2示出WBP114.5.2.1、WBP114_5.14.1、WBP114_5.20、WBP114_7.80及Prolia之阻斷測定。
圖3示出抗體WBP114_5.20與小鼠RANKL之依賴性結合。
圖4示出所選抗體之NF-κB報導基因測定。
圖5示出所選抗體之RAW264.7細胞分化測定。
圖6顯示針對Prolia之所選抗體之表位聯合。
圖7顯示了人源化抗體之ELISA結合測定。
圖8顯示了人源化抗體之ELISA阻斷測定。
圖9顯示了人源化抗體之NF-κB報導基因測定。
圖10顯示人源化抗體之RAW264.7細胞分化測定。

Claims (31)

  1. 一種抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段結合於人、猴及小鼠RANKL。
  2. 一種抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段 a) 結合於人RANKL，KD 為6.98E-10 M以下；並且 b) 結合於猴RANKL，KD 為5.32E-11 M以下。
  3. 如請求項2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段具有下列性質中之至少一種： a) 結合於人RANKL，KD 為6.98E-10 M至6.33E-11 M，並且結合於猴RANKL，KD 為5.32E-11 M至9.03E-12 M； b) 抑制RANKL介導之細胞功能； c) 抑制RAW細胞分化成破骨細胞樣細胞。
  4. 一種抗體或其抗原結合片段，其包含一個胺基酸序列，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14所組成之群中之序列具有至少70%、80%、90%、95%或99%之同源性， 其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
  5. 一種抗體或其抗原結合片段，其包含一個胺基酸序列，該胺基酸序列選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14所組成之群中之序列， 其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
  6. 一種抗體或其抗原結合片段，包含： a) 重鏈可變區，其具有之胺基酸序列與選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及7所組成之群中之序列具有至少70%、80%、90%或95%之同源性；以及 b) 輕鏈可變區，其具有之胺基酸序列與選自由SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13及14所組成之群中之序列具有至少70%、80%、90%或95%之同源性， 其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
  7. 一種抗體或其抗原結合片段，包含： a) 重鏈可變區，其具有之胺基酸序列選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及7所組成之群中之序列；以及 b) 輕鏈可變區，其具有之胺基酸序列選自由SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13及14所組成之群中之序列， 其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
  8. 一種抗體或其抗原結合片段，包含互補決定區(CDR)，其具有之胺基酸序列選自由SEQ ID NO：15-36所組成之群中之序列， 其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
  9. 一種抗體或其抗原結合片段，包含： 包含CDR1、CDR2和CDR3序列之重鏈可變區；以及 包含CDR1、CDR2和CDR3序列之輕鏈可變區， 其中重鏈可變區CDR3序列包含選自由SEQ ID NO：15-17所組成之群中之胺基酸序列及其保守性修飾， 其中該抗體或抗原結合片段特異性結合RANKL。
  10. 如請求項9之抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區CDR3序列包含選自由SEQ ID NO：18-21所組成之群中之胺基酸序列及其保守性修飾。
  11. 如請求項9或10之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區CDR2序列包含選自由SEQ ID NO：22-25所組成之群中之胺基酸序列及其保守性修飾。
  12. 如請求項9至11中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區CDR2序列包含選自由SEQ ID NO：26-29所組成之群中之胺基酸序列及其保守性修飾。
  13. 如請求項9至12中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區CDR1序列包含選自由SEQ ID NO：30-32所組成之群中之胺基酸序列及其保守性修飾。
  14. 如請求項9至13中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區CDR1序列包含選自由SEQ ID NO：33-36所組成之群中之胺基酸序列及其保守性修飾。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或大鼠抗體。
  16. 4至15中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段具有下列性質中之至少一種： a) 結合於人RANKL，KD 為6.98E-10 M至6.33E-11 M，及結合於猴RANKL，KD 為5.32E-11 M至9.03E-12 M； b) 抑制RANKL介導之細胞功能； c) 抑制RAW細胞分化成破骨細胞樣細胞。
  17. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至16中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  18. 一種選殖或表現載體，其包含如請求項17之核酸分子。
  19. 一種宿主細胞，其包含一個以上如請求項18之選殖或表現載體。
  20. 一種用於生產如請求項1至16中任一項之抗體之方法，包括培養如請求項19之宿主細胞，並且分離該抗體。
  21. 如請求項20之方法，其中該抗體係藉由將人RankL蛋白免疫接種小鼠而製備。
  22. 一種轉基因動物，包含人免疫球蛋白重鏈及輕鏈轉基因，其中該動物表現如請求項1至16中任一項之抗體。
  23. 一種自如請求項22之大鼠製備之雜交瘤，其特徵在於，該雜交瘤產生如請求項1至16中任一項之抗體。
  24. 一種藥物組合物，包含如請求項1至16中任一項之抗體或其抗原結合片段，以及一種以上藥學可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。
  25. 一種用於製備抗RANKL抗體或其抗原結合片段之方法，包括： (a) 提供： (i) 一個重鏈可變區之抗體序列，其包含選自由SEQ ID NO：30-32所組成之群中之CDR1序列，選自由SEQ ID NO：22-25所組成之群中之CDR2序列以及選自由SEQ ID NO：15-17所組成之群中之CDR3序列；及/或 (ii) 一個輕鏈可變區之抗體序列，其包含選自由SEQ ID NO：33-36所組成之群中之CDR1序列、選自由SEQ ID：26-29所組成之群中之CDR2序列以及選自由SEQ ID NO：18-21所組成之群中之CDR3序列；並且 (b) 將改變之抗體序列表現成蛋白質。
  26. 一種預防或治療受試者之骨損失相關疾病之方法，包括給需要之受試者投與治療有效量之如請求項1至16中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  27. 一種預防或治療受試者之骨損失相關疾病之群合方法，包括給需要之受試者投與治療有效量之如請求項1至16中任一項之抗體或其抗原結合片段，並給予受試者治療有效量之免疫檢查點抗體。
  28. 如請求項26或27之方法，其中該免疫檢查點抗體包括CTLA-4抗體、PD-1抗體或PD-L1抗體。
  29. 一種如請求項1至16中任一項之抗體或其抗原結合片段在製備用於預防或治療與骨損失相關之疾病之藥物中的用途。
  30. 如請求項26至28中任一項之方法，如請求項29之用途，其中該疾病包括克羅恩病、男性不育症、慢性腎病、痛風、類風濕性關節炎、神經性厭食症、重型地中海貧血症、甲狀腺功能亢進症或癌症。
  31. 如請求項30之方法或用途，其中該癌症係選自由黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌及直腸癌所組成之群。
TW107137807A 2017-10-27 2018-10-25 靶向rankl的治療性抗體 TW201922798A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2017108054 2017-10-27
??PCT/CN2017/108054 2017-10-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201922798A true TW201922798A (zh) 2019-06-16

Family

ID=66246441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107137807A TW201922798A (zh) 2017-10-27 2018-10-25 靶向rankl的治療性抗體

Country Status (3)

Country Link
CN (4) CN109721656B (zh)
TW (1) TW201922798A (zh)
WO (1) WO2019080909A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021115465A1 (en) * 2019-12-13 2021-06-17 Biosion Inc. Antibodies binding rankl and uses thereof
CN111793135A (zh) * 2020-05-11 2020-10-20 廊坊天光生物技术有限公司 一种用于检测血清中rankl含量的抗体对及其用途
CN117264071B (zh) * 2023-11-22 2024-03-22 江苏迈威康新药研发有限公司 一种抗rankl单克隆抗体或其衍生物的结合剂及其应用
CN117285637B (zh) * 2023-11-22 2024-03-22 江苏迈威康新药研发有限公司 一种抗独特型抗体及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105189551B (zh) * 2013-03-14 2021-03-05 埃派斯进有限公司 抗-rankl抗体及其使用方法
EP3085709B1 (en) * 2014-12-28 2019-08-21 Genor Biopharma Co., Ltd Humanized anti-human rankl antibody, pharmaceutical composition and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN116514970A (zh) 2023-08-01
CN116375866A (zh) 2023-07-04
CN109721656B (zh) 2022-10-18
CN116041513A (zh) 2023-05-02
CN109721656A (zh) 2019-05-07
WO2019080909A1 (en) 2019-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI754800B (zh) 新型抗ox40/pd-l1雙特異性抗體分子、新型抗vegf/gitr雙特異性抗體分子及其用途
TWI718206B (zh) Pd-l1抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
US20200079850A1 (en) Pd-1/lag3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
TW201910351A (zh) 抗tigit抗體
CN106232626B (zh) 结合人大麻素1(cb1)受体的抗体
US11525005B2 (en) Anti-CD40 antibody, antigen binding fragment thereof and medical use thereof
US11578133B2 (en) Antibodies targeting CD137 and methods of use thereof
TW201922798A (zh) 靶向rankl的治療性抗體
KR20150002679A (ko) 브라디키닌 b1 수용체 리간드에 대한 항체
WO2018156785A1 (en) Pd-1/tim-3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
US20240309087A1 (en) Anti-cd112r antibody and use thereof
US11505611B2 (en) FGFR3 antibodies and methods of use
WO2021143914A1 (zh) 一种激活型抗ox40抗体、生产方法及应用
JP2017512772A (ja) Ｌｇ１〜３に特異的な抗ラミニン４抗体
TWI842044B (zh) 抗pvrig/抗tigit雙特異性抗體和應用
US20240343803A1 (en) Anti-Pvrig/Anti-Tigit Bispecific Antibodies And Applications Thereof
TW202200615A (zh) 用於治療和預防患者的crs之方法
EP3999113A1 (en) Anti-pd-l1 antibodies
WO2023040940A1 (zh) Pvrig/tigit结合蛋白联合免疫检查点抑制剂用于治疗癌症
US20200190192A1 (en) Pd-1/tim-3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
TW202035457A (zh) 靶向cd137的抗體及其使用方法
WO2024078558A1 (zh) 抗cd100抗体及其用途
TWI833227B (zh) 靶向pd-l1和cd73的特異性結合蛋白及其應用
WO2024179567A1 (zh) Fap/4-1bb/cd40结合分子及其医药用途
TW202436358A (zh) Ｆａｐ／４－１ｂｂ／ｃｄ４０結合分子及其醫藥用途