CN102869678A

CN102869678A - Il-17结合化合物及其医药用途

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Publication number: CN102869678A
Application number: CN2010800494355A
Authority: CN
Inventors: D·格拉布洛夫斯基; M·赛拉斯梅尔科; F·穆尔朗; S·S·布拉克; J·贝钦格; N·巴恩齐格; S·巴泰
Original assignee: Covagen AG
Current assignee: Cilag GmbH International
Priority date: 2009-08-27
Filing date: 2010-08-24
Publication date: 2013-01-09
Also published as: JP2015187146A; CA2772162C; RU2550272C2; JP5868318B2; AU2010288542A1; IL218354A0; NZ598351A; US20160368957A1; EP2470556B1; CA2772162A1; US9376477B2; AU2010288542B2; MX2012002428A; EP2470556A1; WO2011023685A1; BR112012004314A2; US20130005659A1; RU2012111597A; JP2013502910A

Abstract

本发明涉及新的IL-17抑制多肽、相应融合蛋白、组合物及其医药用途。

Description

IL-17结合化合物及其医药用途

本发明涉及新的IL-17抑制多肽、相应的融合蛋白、组合物及其医药用途。

发明背景

CD4+T细胞通过协助适应性或先天性免疫系统的其它细胞而在指导免疫应答中起重要作用。在早先研究中，鉴定了两类CD4+T细胞(Th1和Th2)。新近鉴定了CD4+T细胞的新亚组，即Th17谱系。Th17细胞似乎进化为适应性免疫系统的分支，专门用于针对Th1或Th2免疫未完全涵盖的胞外细菌以及一些真菌和微生物的增强的宿主保护。

Th17细胞是在发现新的细胞因子家族即IL-17家族(目前已知其包括6个成员(IL-17A-F))的背景下而鉴定的。IL-17(先前称为CTLA-8)主要由Th17细胞表达并且将其命名为IL-17A以表明它是该细胞因子家族的创建成员。IL-17成员与其它目前已知的哺乳动物蛋白无序列同源性并且因此构成不同的细胞因子家族。从IL-17F晶体结构推导出的IL-17家族成员的结构特征表明，与许多细胞因子类似，每一家族成员可能作为同二聚体产生，但结构相似性暗示可存在异二聚体。最近鉴定了由活化的人CD4+T细胞表达的IL-17A和IL-17F的异二聚体，其通过IL-17RA/IL-17RC复合物进行信号转导(Wright J.F等.(2008)J.of Immunol.，181，第2799-2805页)。

对在慢性炎性过程中作为中心介质(mediator)以及在若干类型的自身免疫病况(先前认为这些是Th1介导的)中作为主要病原性效应物的Th17细胞的鉴定预示将出现新的治疗方法(Weaver T等.(2008)Annu.Rev.Immunol.，25，第821-852页)。事实上，促炎细胞因子IL-17主要由Th17细胞表达并且在类风湿性关节炎(RA)患者的滑液中以升高的水平存在，并且已显示参与早期RA的发展。此外，IL-17是TNF-α和IL-1的强有力诱导物，后者主要导致受影响患者的骨侵蚀以及非常疼痛的后果(Lubberts E.(2008)Cytokine，41，第84-91页)。此外，IL-17的不适当或过度产生与以下各种其他疾病和病症的病理相关：例如骨关节炎、骨植入物松弛、急性移植排斥(Antonysamy等.，(1999)J.Immunol，162，第577-584页；van Kooten等.(1998)J.Am.Soc.Nephrol.，9，第1526-1534页)、败血病、脓毒性休克或内毒素性休克、变态反应、哮喘(Molet等.(2001)J.Allergy Clin.Immunol.，108，第430-438页)、骨丢失、牛皮癣(Teunissen等.(1998)J.Invest.Dermatol，111，第645-649页)、局部缺血、系统性硬化病(Kurasawa等.(2000)Arthritis Rheum.，43，第2455-2463页)、中风和其它炎性病症。

因此，抗-IL-17化合物具有作为抗炎剂的潜能，这是与许多体内研究(其证明中和IL-17减轻炎性过程例如关节炎)一致的治疗方法。例如，在关节炎的初期期间在免疫接种方案后启动的IL-17受体-IgG1-Fc融合蛋白对内源性IL-17的早期中和抑制实验性关节炎的发作(Lubberts等.(2001)J.Immunol.，167，第1004-1013页)。此外，在动物模型中在胶原诱导的关节炎发作后，用中和抗-IL-17抗体的治疗减少关节炎症、软骨破坏和骨侵蚀(Lubberts等.(2004)Arthritis andRheumatism，50；650-659)。组织学分析证实用抗-IL-17抗体治疗后关节炎症被抑制，并且系统性IL-6水平显著降低。相比之下，使用表达鼠IL-17的腺病毒载体过表达系统性以及局部的IL-17，加速了胶原诱导的关节炎(CIA)发作并且加剧了位点处的滑液炎症(Lubberts等.(2001)J.Immunol.，167，第1004-1013页以及Lubberts等.(2002)，Inflamm.Res.51，第102-104页)。

虽然抗体通常用于分析、纯化、诊断和治疗目的，这是由于它们易于制备、对实际上任何所需靶抗原的高亲和力和特异性，但它们仍有许多严重缺点，例如需要复杂的哺乳动物细胞生产系统、依赖于二硫键稳定性、一些抗体片段易于聚集、溶解度有限以及最后但并非最不重要的，它们(即使人源化时)可引发非合乎需要的免疫应答。结果，最近出现如下集中关注：开发小的球状蛋白，将其作为用于产生新类别多用途的结合蛋白的支架。为产生多样性和靶特异性，通常使具有合适生物物理性质的蛋白框架的表面组分(例如胞外环)组合地突变，用于产生蛋白质文库，以筛查目标靶结合特异性(Binz，H.K.，和Pluckthun，A.(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16，459-469)。

这些非免疫球蛋白-来源的结合剂统称为“支架(scaffold)”(SkerraA.(2000)J.Mol.Recognit.13，167-187)。在过去的10至15年内，已提出多于50种的不同蛋白支架，该领域最先进的方法是(如GebauerM和Skerra A.(2009)Curr Opinion in Chemical Biology 13：245-255中总结的)：亲合体(affibody)(基于葡萄球菌蛋白A的Z-结构域)、Kunitz型结构域、adnectin(基于人纤连蛋白的第10个结构域)、anticalin(源自脂质运载蛋白)、DARPin(源自锚蛋白重复序列蛋白)、avimer(基于多聚化的LDLR-A)、affitin(基于来自极端嗜热古细菌的Sac7d)和源自人Fyn SH3结构域的Fynomer。

通常，SH3结构域存在于多种参与细胞信号转导的蛋白中(Musacchio等.(1994)Prog.Biophys.Mol.Biol.61；283-297)。这些结构域在蛋白质内不占据固定位置并且可独立地表达和纯化。目前已知存在多于1000种结构域，其中有约300种人SH3结构域(Musacchio A.(2003)Advances in Protein Chemistry.61；211-268)。尽管SH3结构域之间存在极大序列多样性，但它们全部共有保守折叠：由两个反-平行β-片层形成的紧凑β桶(Musacchio A.(2003)Advances in Protein Chemistry.61；211-268)。通常，SH3结构域结合含有PXXP核心-结合基序的富含脯氨酸的肽(Ren等.(1993)Science259；1157-1161)，但也已描述了非常规SH3结合位点的实例(Kark-kainen等.(2006)EMBO Rep.7；186-191)。迄今为止大多数已测序的SH3结构域的总长为约60至65个氨基酸，但由于连接二级结构的主要保守元件的环中的插入片段，它们中的一些可具有多达85个氨基酸(Koyama等.(1993)Cell 72(6)；945-952)。不同SH3结构域的比对揭示了负责形成适当结构以及识别规范的富含脯氨酸基序的保守氨基酸残基(Larson等.(2000)Protein Science 9；2170-2180)。

最近本发明人证明Fyn SH3结构域是用于产生结合蛋白的特别引人关注的支架(“Fynomer”)，因为它(i)可以可溶形式在细菌中大量表达，(ii)是单体的并且当储存在溶液中时不聚集，(iii)非常稳定(T_m70.5℃)，(iii)缺少半胱氨酸残基，和(iv)是人源的，其特征为氨基酸序列从小鼠至人完全保守，并且因此是非免疫原性的(Grabulovski等.(2007)JBC，282，第3196-3204页)。

本发明的目标是提供新的IL-17A结合分子，特别为对IL-17A具有高特异性以及高亲和力的结合分子。另一目标是提供适合研究、诊断和医学治疗，优选用于治疗和/或预防IL-17A-介导的疾病和医学病症的药物中的用途的IL-17A-结合分子，优选IL-17抑制剂。

意想不到的是，上述目标通过包含选自以下的氨基酸序列的多肽而解决：

(i)(G/E)VTLFVALYDY-(X)_a-D-(X)_b-SFHKGEKF-(X)_c-I-(X)_d-G-(X)_e-WW-(X)_f-A-(X)_g-SLTTG-(X)_hGYIPSNYVAPVDSIQ(I)

其中a至h为0至20，

优选a为1至10，更优选2至8，最优选6；

优选b为0至5，更优选1至3，最优选1；

优选c为0至5，更优选1至3，最优选1；

优选d为1至10，更优选3至9，最优选5或7；

优选e为0至5，更优选1至3，最优选1；

优选f为0至5，更优选1至3，最优选1；

优选g为0至5，更优选1至3，最优选1；

优选h为0至6，更优选1至3，最优选1或2；

(ii)与(i)具有至少至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；

(iii)由与编码(i)的核酸的互补链杂交的核酸编码的氨基酸序列，优选在严格条件下杂交；

(iv)可通过至少一个氨基酸的取代、添加和/或缺失而得到的(i)至(iii)的片段或功能衍生物，

其中所述多肽结合IL-17A。

上述通式(I)是人Fyn SH3支架的重复和广泛突变分析以及基于IL-17A结合的选择的结果。

标为X的位置可因氨基酸类型以及氨基酸数目而大不相同。优选地，X无一是半胱氨酸。X的优选氨基酸数目由a至h的下标表示，其全部优选为0至20，更优选0或1至10。

在天然人Fyn SH3中，(X)_a和(X)_d将分别与RT环和Src环相关。优选但非必需的是，(X)_a和(X)_d提供环结构。已知典型的环结构包括2个至不止20个氨基酸(Larson等.(2000)Protein Science 9；2170-2180)。因此，优选(X)_a和/或(X)_d具有2至20个氨基酸。优选a为1至10，更优选2至8，最优选为6。优选d为1至10，更优选3至9，最优选为5或7。优选(X)_a为TAFWPG，更优选为VAFWPG，最优选为KAFWPG。优选(X)_d为LNSSE，更优选为TRTSD或LHTSD，最优选为LRTSD。

(X)_b、(X)_c、(X)_e、(X)_f和(X)_g彼此独立地优选为0至5，更优选为1至3，最优选为1。(X)_h优选为0至6，更优选1至3，最优选为1。

在最优选的实施方案中，式(I)为：

(G/E)VTLFVALYDY-(X)₆-D-(X)₁-SFHKGEKF-(X)₁-I-(X)_5-7-G-(X)₁-WW-(X)₁-A-(X)₁-SLTTG-(X)_1-2GYIPSNYVAPVDSIQ(Ia)

当然，式(I)的氨基酸序列中存在许多变异，这仍将允许本发明多肽的IL-17A结合。因此，本发明还涵盖包含与(i)具有至少50、60或70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。

本文使用的术语氨基酸序列之间的“氨基酸序列同一性”意指涉及生物化学技术人员通常并且广泛使用的比对和比较技术。两个氨基酸序列的氨基酸序列同一性可通过常用的比对方法和工具来确定。例如为确定任意多肽相对式(I)氨基酸序列的氨基酸序列同一性程度，可采用SIM局部相似性程序(Xiaoquin Huang和Webb Miller，″ATime-Efficient，Linear-Space Local Similarity Algorithm.″Advances inApplied Mathematics，第12卷：337-357，1991.)，这可从作者及其研究所免费获得(也可参见万维网：http://www.expasy.org/-tools/sim-prot.html)；就多重比对分析而言，可使用ClustalW(Thompson等，CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting，position-specific gap penalties andweight matrix choice.“，Nuclei Acids Res.，22(22)：4673-4680，1994.)。优选地，本发明多肽、片段或功能衍生物与式(I)氨基酸序列的氨基酸序列同一性程度相对式(I)的完整序列来确定。

此外，本发明还涵盖包含由与编码(i)的核酸的互补链(优选在严格条件下)杂交的核酸编码的氨基酸序列的多肽。换言之，由本发明多肽涵盖的氨基酸序列优选由其编码核酸间接限定，该核酸仍必须能与编码式(I)氨基酸序列的核酸的互补链杂交。在本领域中，核酸是否彼此杂交通常通过特定比对和比较工具以及通过实验来确定。在现有技术中，除了用于确定在严格条件下一种核酸与特别参考的核酸序列杂交的能力的常用和/或标准实验方案(例如Sambrook和Russell，Molecular cloning：A laboratory manual(3卷)，2001)之外，优选通过用比对工具，例如BLASTN(Altschul等.，J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)和LALIGN比对工具来比较编码目标多肽的任意核酸与编码式(I)氨基酸序列的核酸序列的互补链，从而分析并确定在严格条件下这两种核苷酸序列杂交的能力。最优选地，编码疑似为本发明多肽的目标多肽的核酸与编码式(I)氨基酸序列的核酸的互补链杂交的能力在以下条件下用DNA印迹测定来证实：在45℃下的6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在65℃下于0.2x SSC，0.1％SDS中洗涤。

此外，本发明涵盖包含上述本发明氨基酸序列中任一种的片段、优选功能片段、或功能衍生物的多肽。

因此，术语“本发明的多肽或氨基酸序列”还涵盖具有上述鉴定性质(即结合IL-17A)的本发明多肽或氨基酸序列的功能片段和衍生物。本发明多肽或氨基酸序列的功能衍生物意欲涵盖任何氨基酸序列和/或其化学衍生物(非天然氨基酸等同物、糖基化、化学衍生)，其具有基本上足够可及的氨基酸残基或非天然等同物以证明结合IL-17A。本发明多肽或氨基酸序列的功能衍生物中，可缺失、修饰、插入和/或取代一个或多个氨基酸。此外，在″功能衍生物″的背景下，插入是指一个或多个氨基酸插入到上述非衍生化的结合蛋白中。优选(越来越优选)的是，功能衍生物不包括多于5、4、3、2个，或也不包括多于1个氨基酸的改变(即缺失、修饰、插入和/或取代的氨基酸)。在另一实施方案中，优选(越来越优选)的是，多肽或氨基酸序列的全部氨基酸中，不多于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或不多于1％被改变(即是缺失、修饰、插入和/或取代的氨基酸)。衍生物中的取代可为保守或非保守取代，但优选保守取代。在一些实施方案中，取代还包括天然存在氨基酸与非天然存在氨基酸的交换。保守取代包括用另一具有与被取代氨基酸相似的化学性质的氨基酸来取代氨基酸。优选地，保守取代是选自以下的取代：(i)用不同的碱性氨基酸来取代碱性氨基酸；(ii)用不同的酸性氨基酸来取代酸性氨基酸；(iii)用不同的芳族氨基酸来取代芳族氨基酸；(iv)用不同的非极性、脂族氨基酸来取代非极性、脂族氨基酸；和(v)用不同的极性、不带电氨基酸来取代极性、不带电氨基酸。碱性氨基酸选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。酸性氨基酸选自天冬氨酸或谷氨酸。芳族氨基酸选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。非极性、脂族氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸。极性、不带电氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。与保守氨基酸取代相比，非保守氨基酸取代是一个氨基酸与任何氨基酸的交换，其不属于上述(i)至(v)的保守取代。若功能衍生物包括缺失，则衍生物中，一个或数个存在于参考多肽中的氨基酸被除去。然而，缺失不应过于广泛而使衍生物包含总数少于3个、优选少于4个、更优选少于5个以及最优选少于6个的氨基酸。如上所述，本发明多肽或氨基酸序列的氨基酸也可被修饰，例如化学修饰。例如，多肽的氨基酸的侧链或自由氨基端或羧基端可被修饰，例如通过糖基化、酰胺化、磷酸化、泛素化等来进行。如本领域熟知的，化学修饰还可发生在体内，例如在宿主细胞中。例如，合适的化学修饰基序，例如存在于多肽的氨基酸序列中的糖基化序列基序将致使多肽被糖基化。在本发明所有提及功能衍生物的实施方案中，须理解的是，具有本文上述限定的式(I)的氨基酸序列是其中引入功能衍生物的起始分子。在插入和具有相同序列的两个起始分子(只是第一分子中X_a等于4，而在第二分子中X_a等于5)的情况下，若到例如X_a的C-末端中的插入在第一分子中是两个氨基酸，而在第二分子中是一个氨基酸，那么将产生具有相同长度以及可能相同氨基酸序列的分子。

本发明多肽结合IL-17A，优选人IL-17A。优选地，它们特异性结合IL-17A，即它们不结合其它细胞因子或者结合程度低得多，优选低至至少2、5、10、50、100、500或1000分之一。用于确定本发明多肽的结合特异性的示例性以及优选的ELISA测定在实施例6和7中提供。

在优选的实施方案中，本发明多肽特异性地以高结合亲和力结合人以及食蟹猴(cynomolgus)IL-17A。

在另外的优选的实施方案中，本发明多肽具有与人IL-17A的特异性(体内和/或体外)结合亲和力，优选K_D为10^-7至10^-12M、更优选10^-8至10^-12M、最优选低于10^-12M。例如并且还优选的，本发明多肽的结合亲和力可通过下述实施例2来确定。

在最优选的实施方案中，本发明多肽选自附于说明书的SEQ IDNO：1至119或其功能衍生物。

在优选的实施方案中，本发明多肽不仅结合而且实际上抑制IL-17A(功能)。该能力在实施例3和10中证明，其中证明了多肽响应加入IL-17A而抑制人皮肤成纤维细胞中IL-6的诱导的能力。

此外，本发明多肽在溶液中具有高的稳定性，例如在4℃下它们在单纯磷酸缓冲盐水中在至少6个月内是稳定的(参见实施例4)。

然而，稳定性不局限于体外组合物，而是还已在静脉内注射本发明多肽的小鼠中被证明(参见实施例5和12)。

总之，本发明多肽非常适合用于研究、诊断和医疗应用。

除取代IL-17A抗体之外，它们还得以设计新且较小免疫原性的融合蛋白，用于体内和体外药物和诊断应用。因此，在第二方面，本发明涉及融合蛋白，其包含与药学上和/或诊断上的活性组分融合的本发明多肽。

如上所述，本发明的融合蛋白可包含非多肽组分，例如非肽接头、非肽配体，例如用于治疗上或诊断上相关的放射性核素。

优选地，所述活性组分是选自以下的细胞因子：IL-2、IL-12、TNF-α、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-10、IL-15、IL-24、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、LIF、CD80、B70、TNFβ、LT-β、CD-40配体、Fas-配体、TGF-β、IL-1α和IL-1β。

在另一优选的实施方案中，所述活性组分是毒性化合物，优选小的有机化合物或多肽，更优选选自以下的毒性化合物：加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱(maytansinoid)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、埃斯波霉素(esperamicin)、达内霉素(dynemicin)、可达菌素(kedarcidin)、maduropeptin、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、auristatin、蓖麻毒蛋白-A链、蒴莲根毒蛋白II(modeccin)、截短的假单胞菌外毒素A、白喉毒素和重组白树毒蛋白(recombinant gelonin)。

在另一优选的实施方案中，本发明的融合蛋白为这样的融合蛋白，其中所述活性组分为优选选自以下的趋化因子：IL-8、GROα、GROβ、GROγ、ENA-78、LDGF-PBP、GCP-2、PF4、Mig、IP-10、SDF-1α/β、BUNZO/STRC33、I-TAC、BLC/BCA-1、MIP-1α、MIP-1β、MDC、TECK、TARC、RANTES、HCC-1、HCC-4、DC-CK1、MIP-3α、MIP-3β、MCP-1-5、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、I-309、MPIF-1、6Ckine、CTACK、MEC、淋巴细胞趋化蛋白(Lymphotactin)和CXXXC趋化因子(Fractalkine)。

在又一优选的实施方案中，本发明多肽或融合蛋白含有人工氨基酸。

在本发明融合蛋白的另外的优选实施方案中，所述活性组分为荧光染料，优选选自以下的组分：Alexa Fluor或Cy染料(Berlier等，“Quantitative Comparison of Long-wavelength Alexa Fluor Dyes to CyDyes：Fluorescence of the Dyes and Their Bioconjugates”，J.Histochem.Cytochem.51(12)：1699-1712，2003.)；光敏剂，优选光毒的红色荧光蛋白KillerRed(Bulina等.(2006)Nat Biotechnol.，24，95-99)或血卟啉；前凝血剂因子，优选组织因子；用于前药活化的酶，优选选自羧肽酶、葡糖醛酸糖苷酶和葡糖苷酶的酶；来自以下的放射性核素：γ-发射同位素，优选^99mTc、¹²³I、¹¹¹In，或者正电子发射体，优选¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、¹²⁴I，或者β-发射体，优选¹³¹I、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁶⁷Cu，或α-发射体，优选²¹³Bi、²¹¹At。

在另一优选的实施方案中，本发明多肽可直接或通过化学接头连接本文上述限定的一种或多种非-多肽组分。

在本发明融合蛋白的更优选实施方案中，所述活性组分为一个或多个功能Fc结构域，优选一个或多个人功能Fc结构域(参见例如SEQ ID NO：117-119和SEQ ID NO：130)，其允许延长本发明IL-17A结合多肽的体内半衰期，并且其中的一些将哺乳动物的免疫应答指向本发明的融合蛋白多肽组分的特异性靶结合位点，例如在治疗、预防和/或诊断应用中。本发明多肽可与一个或多个功能Fc结构域的N-或C-端或者与一个或多个Fc结构域的N-和C-端两者融合。优选本发明融合蛋白包括与一个或多个(优选一个)Fc结构域的至少一侧(优选N-端)融合的本发明多肽的多聚体，优选四聚体、三聚体或最优选二聚体。在这一方面，注意的是，命名为(2C1)₂-Fc的Fynomer-Fynomer-Fc融合蛋白证明了多聚体的多肽-Fc融合物的优点，其对IL-17A具有比相应单体2C1-Fc融合蛋白更高的亲和力，如下述实施例2中图3e和3f以及表II证明的。因此，本发明优选的实施方案涉及多聚体的多肽-Fc融合蛋白。

抗体的″功能Fc结构域”是技术人员熟知的术语并且基于抗体的木瓜蛋白酶切割来定义。根据其重链恒定区的氨基酸序列，将免疫球蛋白分为以下类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可再分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。依据重链恒定区，将不同类别的免疫球蛋白分别称为[α]、[δ]、[ε]、[γ]和[μ]。抗体的功能Fc结构域直接参与基于补体激活、C1q结合以及Fc受体结合的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。4种人IgG同种型结合不同的受体，例如新生儿Fc受体、激活的Fc γ受体、FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIIa、抑制性受体FcγRIIb，以及具有不同亲和力的C1q，从而产生非常不同的活性。已知激活和抑制人抗体Fc结构域的受体的亲和力可经工程改造和改变(参见Strohl W.(2009)Curr Opin Biotechnol，20，第685-691页)。如上所述，因此本发明包括Fc融合物，其允许延长本发明IL-17A结合多肽的体内半衰期，并且其包含人源的功能Fc结构域，优选人IgG1抗体的功能Fc结构域(参见例如SEQ ID NO：117-119以及SEQ ID NO：130)。

在本发明融合蛋白的更优选实施方案中，活性组分是一个或多个具有激活或沉默效应物功能的IgG1工程改造的人功能Fc结构域，优选一个或多个具有沉默效应物功能的IgG1工程改造的人功能Fc结构域，以及最优选一个或多个具有沉默效应物功能且在L234和L235中突变的IgG1工程改造的人功能Fc结构域(参见例如SEQ IDNO：131-135)，依据Kabat的EU索引(EU index)来编号(参见JohnsonG和Wu T.T.(2000)Nucleic Acids Res.28，第214-218页)。

又一优选的实施方案涉及如上述的本发明多肽或融合蛋白，还包含调节血清半衰期的组分，优选选自聚乙二醇(PEG)、免疫球蛋白和白蛋白-结合肽的组分。

此外，优选本发明的融合蛋白包含上述本发明IL-17A结合多肽的任一种，优选选自SEQ ID NO：117至119以及SEQ ID NO：130-135或其功能衍生物的那些。

注意的是，本发明的多肽或融合蛋白优选本发明多肽的单体但还涵盖多聚体，优选四聚体、更优选三聚体或最优选二聚体。

本发明的多肽和融合蛋白可通过许多常规且熟知的技术中的任一种来制备，例如普通的有机合成策略、固相辅助合成技术或通过市售的自动合成仪。在另一方面，它们还可通过单独的常规重组技术或与常规合成技术组合的常规重组技术来制备。

在这一方面，本发明的其它方面涉及(i)编码本发明多肽或融合蛋白的核酸，(ii)包含所述核酸的载体，和(iii)包含所述多核苷酸和/或所述载体的宿主细胞。

优选地，本发明涉及分离并纯化的核酸，其包括

(i)编码本发明多肽，优选编码式(I)的氨基酸序列，更优选编码(G/E)VTLFVALYDY-(X)₆-D-(X)-SFHKGEKF-(X)₁-I-(X)_5-7-G-(X)₁-WW-(X)-A-(X)-SLTTG-(X)_1-2-GYIPSNYVAPVDSIQ的核酸；

(ii)与(i)的核酸序列具有至少60或70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％序列同一性的序列的核酸；

(iii)与(i)或(ii)的核酸互补链杂交的核酸；

(iv)核酸，其中所述核酸可通过(i)、(ii)或(iii)的核酸之一的取代、添加和/或缺失而得到；

(v)与编码本发明多肽的(i)的核酸的互补链杂交的(i)至(iv)的核酸中任一种的片段。

更优选地，本发明的核酸包括编码如上所述的多肽或融合蛋白的核酸。在这一方面，理解的是，上述核酸(i)至(v)中任一种优选编码结合IL-17A并更优选抑制IL-17A功能的多肽。

本发明的核酸可为DNA、RNA、PNA及其任何其它类似物。载体和宿主细胞可为适合目的的任何常规类型，例如本发明多肽和/或融合蛋白的制备，治疗上有用的载体和宿主细胞，例如用于基因治疗。技术人员将能从大量的现有技术中选择那些核酸、载体和宿主细胞，并且通过常规方法以及无需过度负担来确定它们针对所需目的的具体适合性。

优选地，核酸有效连接(operably linked)至启动子，优选连接至选自以下原核启动子的启动子：T5启动子/lac操纵基因元件、T7启动子/lac操纵基因元件，或选自以下真核启动子的启动子：hEF1-HTLV、CMV enh/hFerL启动子。

还优选的是，本发明的重组载体是包含本发明核酸并且优选能产生本发明多肽或融合蛋白的载体。优选这样的载体选自pQE载体、pET载体、pFUSE载体、pUC载体、YAC载体、噬菌粒载体、噬菌体载体、用于基因治疗的载体例如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒。

此外，本发明涉及包含本发明核酸和/或载体的宿主细胞。

此外，本发明涵盖特异性结合本发明多肽或融合蛋白的抗体。若抗体结合融合蛋白，则它特异性结合其由本发明多肽或融合表位组成的一部分，即部分地由本发明多肽组成和部分地由药学上和/或诊断上的活性组分组成的抗体的结合位点，其优选为多肽或肽。抗体可为多克隆或单克隆抗体。本文使用的术语“抗体”不仅指完整的抗体分子，还指抗原-结合片段，例如Fab、F(ab’)₂、Fv和单链Fv片段。还包括嵌合抗体，优选人源化抗体。此类抗体作为用于区分任意蛋白和本发明多肽的研究工具是有用的。另一方面涉及表达本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

因为本发明的多肽和融合蛋白证明了IL-17A-结合和抑制性质以及储存和体内稳定性，所以本发明的另一方面涉及包含本发明的多肽或融合蛋白、核酸和/或重组载体以及任选的药学上可接受的载体的药物组合物。术语药物组合物还意欲涵盖用于体内使用的诊断组合物。

本发明的药物组合物可用任何常规方法制备。在实现治疗患有下文指出的疾病的受试者中，本发明的至少一种化合物可用任何形式或方式给予，其使治疗性多肽或其治疗性片段以有效量而生物可利用的，包括口服或胃肠外途径。例如，本发明的组合物可经皮下、肌内、静脉内、通过吸入等给予。制备制剂领域的本领域技术人员可容易地依据所选产品的具体性质、待治疗的疾病或病症、疾病或病症的阶段以及其它相关情况选择适当的给予形式和方式(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(1990))。合适的载体或赋形剂可为可作为活性成分的溶媒或介质的液体物质。合适的载体或赋形剂为本领域熟知并且包括，例如稳定剂、抗氧化剂、pH-调节物质、控释赋形剂等。本发明的组合物优选以冻干形式提供。就即刻给予而言，将其溶于合适的水性载体例如注射用无菌水或无菌的缓冲生理盐水。若希望产生更大体积用于经输注而非推注给予，则有利的是，在最后制备时将人血清白蛋白或患者自身的肝素化血液掺入溶剂中。或者，制剂可经皮下给予。存在过量的生理上惰性蛋白例如人血清白蛋白，可防止由吸收至用于输注溶液的容器和输液管的壁上而导致的药学上有效多肽的损失。若使用白蛋白，合适的浓度为盐水溶液的0.5至4.5％重量。

本发明的IL-17A-结合和抑制多肽特别可用于治疗和/或预防IL-17A-和/或Th17相关疾病或医学病症。因此，本发明的又一方面涉及本发明的多肽或融合蛋白、核酸和/或重组载体用于医药用途的用途，即用于制备药物的用途，所述药物优选用于治疗和/或预防疾病或医学病症，优选选自IL-17A和/或Th17相关疾病或医学病症。

在优选的实施方案中，本发明的医药用途涉及治疗和/或预防选自以下的疾病或医学病症：炎性、自身免疫和/或骨丢失相关疾病和病症。

在最优选的实施方案中，所述炎性、自身免疫和/或骨丢失相关疾病和病症选自关节炎、优选类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)、反应性关节炎、牛皮癣关节炎、肠病性关节炎(enterophathic arthritis)和变形性关节炎、风湿性疾病、脊椎关节病、强直性脊椎炎、莱特尔综合征(Reiter syndrome)、超敏反应(包括呼吸道超敏反应和皮肤超敏反应)、变态反应、系统性红斑狼疮、炎性肌肉病症、多软骨炎、硬皮病(sclerodoma)、韦格纳肉芽肿病(Wegner granulomatosis)、皮肌炎、史-约综合征(Steven-Johnsonsyndrome)、慢性活动性肝炎、重症肌无力、牛皮癣、特发性口炎性腹泻、自身免疫炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病(Crohn′sdisease)、肠易激综合征、内分泌性眼病、格雷夫斯病(Gravesdisease)、结节病、局部缺血、系统性硬化病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、自身免疫血液病症、溶血性贫血、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血、特发性血小板减少症、色素层炎(前眼色素层炎和后色素层炎)、干性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、间质性肺纤维化、肾小球性肾炎(具有和不具有肾病综合征)、特发性肾病综合征或微小病变肾病、肿瘤、皮肤炎症的炎性疾病、角膜炎症、肌炎、骨植入物松弛(loosening of boneimplants)、急性移植物排斥、代谢紊乱、动脉粥样硬化、糖尿病，和血脂障碍(dislipidemia)、骨丢失、骨关节炎、骨质疏松症、呼吸道阻塞疾病或呼吸道炎性疾病的牙周疾病、哮喘、支气管炎、尘肺病、肺气肿、急性及超急性炎性反应、涉及IL-17A-介导的TNF-α的疾病、急性感染、败血症、感染性休克、内毒素性休克、成年呼吸窘迫综合征、脑膜炎、肺炎、严重烧伤、恶病质、衰竭综合征、中风、疱疹性基质性角膜炎(herpetic stromal keratitis)以及干眼疾病。上述说明的全部疾病和医学病症具有的共同点是它们的起因和/或症状均为IL-17A-和/或Th-17相关的。

用于治疗和/或预防疾病或医学病症，优选选自IL-17A-和/或Th17-相关的疾病或医学病症，更优选上文列举的疾病或医学病症的本发明化合物，即多肽、融合蛋白、核酸、载体和宿主细胞的给予量和方式当然将因下列因素而不同：本发明特定的多肽或融合蛋白抑制剂、单个患者组或患者、另外的医学上有效化合物的存在情况以及接受治疗的病症的性质和严重程度。然而，目前优选的是，应给予预防性和/或治疗性使用剂量为约0.01mg至约20mg/千克体重、优选约0.1mg至约5mg/千克体重。优选地，预防性和/或治疗性使用的给予频率在以下范围内：约每周两次至约每3月一次、优选约每2周一次至约每10周一次、更优选每4至8周一次。本发明的IL-17A-结合多肽和融合蛋白合宜地并优选地经胃肠外、静脉内(优选给予到肘前或其它外周静脉中)、肌内或皮下给予。IL-17A-结合多肽还可作为滴眼剂局部递送。优选的对患者的预防性和/或治疗性治疗涉及每月一次至每2至3月一次或频率更低地给予本发明多肽。

因此，本发明还涉及治疗方法，其中将药理学上有效量的上述药物组合物给予有需要的患者，优选患有IL-17A-和/或Th17-相关疾病或医学病症，更优选患有上文说明的疾病或医学病症之一的患者。本文使用的术语“治疗”涉及疾病或医学病症的预防性和/或治疗性治疗。

本发明的IL-17A-结合多肽和融合蛋白可作为单独有效成分给予，或与其它药物(例如免疫抑制剂或免疫调节剂或其它抗炎剂)联合给予，例如作为其它药物的佐剂或与其它药物组合，例如用于治疗或预防上述疾病。例如，本发明的IL-17A-结合多肽和融合蛋白可与以下组合使用：免疫抑制单克隆抗体，例如对白细胞受体(例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或其配体)具有亲和力的单克隆抗体；其它免疫调节化合物，例如具有CTLA4或其突变体至少一部分胞外域(例如与非-CTLA4蛋白序列连接的CTLA4或其突变体的至少胞外部分(例如CTLA4Ig(例如命名为ATCC 68629)或其突变体，例如LEA29Y))的重组结合分子；粘着分子抑制剂，例如LFA-I拮抗物、ICAM-I或-3拮抗物、VCAM-4拮抗物或VLA-4拮抗物。此外，本发明的多肽和融合蛋白可与以下组合使用：DMARD，例如金盐(Gold salts)、柳氮磺吡啶(sulphasalazine)、抗疟药(antimalarias)、甲氨喋呤(methotrexate)、D-青霉胺(D-penicillamine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、麦考酚酸(mycophenolic acid)、环孢霉素A、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、二甲胺四环素(minocycline)、来氟米特(leflunomide)、糖皮质激素；钙依赖磷酸酶抑制剂，例如环孢菌素A或FK 506；淋巴细胞再循环的调节剂，例如FTY720和FTY720类似物；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素(rapamycin)、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573或TAFA-93；具有免疫抑制性质的子囊霉素(ascomycin)，例如ABT-281、ASM981等；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤(azathioprene)；甲氨喋呤；来氟米特；咪唑立宾(mizoribine)、麦考酚酸；麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil)；15-脱氧精胍菌素(15-deoxyspergualine)或其免疫抑制同源物、类似物或衍生物；或化疗剂，例如紫杉醇、吉西他滨(gemcitabine)、顺铂(cisplatinum)、多柔比星(doxorubicin)或5-氟尿嘧啶；抗-TNF剂，例如针对TNF的单克隆抗体，例如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、CDP870，或TNF-RI或TNF-RII的受体构建体，例如依那西普(Etanercept)、PEG-TNF-RI；促炎细胞因子的阻断剂，IL-1阻断剂，例如阿那白滞素(Anakinra)或IL-1阱(trap)、AAL160、ACZ 885、IL-6阻断剂；蛋白酶的抑制剂或激活剂，例如金属蛋白酶、抗-IL-15抗体、抗-IL-6抗体、抗-IL-23抗体、抗-IL-22抗体、抗-IL-21抗体、抗-IL-12抗体、抗-IFN-γ抗体、抗-IFN-α抗体、抗-CD20抗体，NSAID，例如阿斯匹林或抗感染剂。当然，所列举的用于同时给予的药剂是非限制性且不完整的。

通过下列实施例中的说明进一步描述本发明，无一实施例将被理解为限制如所附权利要求书概述的本发明范围。

附图

图1显示本发明IL-17-结合多肽的实施方案的SDS PAGE分析：(a)B1_2(SEQ ID No：39)(第1道)、E4(SEQ ID NO：57)(第2道)、2C1(SEQ ID NO：107)(第3道)、E4-Fc(SEQ ID NO：117)(第4道：非还原条件，第5道：还原条件)、2C1-Fc(SEQ ID NO：118)(第6道：非还原条件，第7道：还原条件)的SDS PAGE；(b)[(2C1)2-Fc](SEQ ID NO：119)(第1道：非还原条件，第2道：还原条件)的SDSPAGE。根据参考分子量全范围蛋白标记物(marker)来估计(2C1)2-Fc的分子量(未显示)。

图2显示本发明IL-17A-结合多肽的尺寸排阻色谱图(SEC)：(a)克隆B1_2(SEQ ID NO：39)、(b)E4(SEQ ID NO：57)、(c)2C1(SEQID NO：107)、(d)E4-Fc(SEQ ID NO：117)、(e)SEC-峰纯化的E4-Fc(在纯化后的40天后进行分析并且在4℃于PBS中储存)、(f)2C1-Fc(SEQ ID NO：118)、(g)(2C1)2-Fc(SEQ ID NO：119)。

图3描述本发明IL-17A-结合多肽的BIAcore传感图：(a)克隆B1_2(SEQ ID NO：39)、(b)E4(SEQ ID NO：57)、(c)2C1(SEQ ID NO：107)、(d)E4-Fc(SEQ ID NO：117)、(e)2C1-Fc(SEQ ID NO：118)、f)(2C1)₂-Fc(SEQ ID NO：119)。

图4描述IL-17A抑制细胞测定的结果：(a)在用IL-17A孵育NHDF细胞后IL-6的剂量依赖性诱导。(b)Fyn SH3来源的IL-17结合剂和IL-17A受体-Fc嵌合体剂量依赖性抑制NHDF细胞中IL-17A-诱导的IL-6产生。(c)与b)相同，Fyn SH3野生型蛋白用作无IL-17A结合亲和力的对照蛋白。(d)XTT-测定：存活的细胞能将四唑盐XTT代谢生成有色产物。在我们的实验中，在用IL-17A、IL-17A和Fyn SH3结合剂、或IL-17A以及IL-17R-Fc嵌合体孵育24小时后所有细胞是存活的。

图5描述用命名为G3(SEQ ID NO：34)的本发明IL-17A-结合多肽在纯化后一天(在4℃储存于PBS中)进行的尺寸排阻色谱。采用Superdex 75(GE Healthcare)柱进行色谱。

图6描述用命名为G3(SEQ ID NO：34)并储存在4℃(a)和-20℃(b)多于6个月的本发明IL-17A-结合多肽进行的尺寸排阻色谱。

图7显示小鼠中命名为E4-Fc(SEQ ID NO：117)的本发明IL-17A-结合多肽的药代动力学数据：(a)绘制血清中E4-Fc浓度对比静脉内注射后时间的图像，(b)与(a)相同，但用半对数显示。最后4个时间点用于计算最终半衰期(50.6小时)。

图8显示命名为2C1(SEQ ID NO：107)的本发明多肽的结合特异性的表。吸光度结果涉及使用不同靶蛋白进行的ELISA：人IL-17A、人IL-17F、mIL-17A(鼠IL-17A)、TNF-α(人肿瘤坏死因子α)、BSA(牛血清白蛋白)、卵白蛋白(母鸡蛋清)、IL-6(人白细胞介素6)。

图9显示本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽的特异性。在ELISA中使用不同IL-17家族成员、不同物种的IL-17A以及其它不相关的抗原，并将本发明2C1(SEQ ID NO：107)的FynSH3-来源的多肽作为结合剂。本发明2C1(SEQ ID NO：107)的FynSH3-来源的多肽仅结合人和食蟹猴IL-17A。未能检测到与任何其它抗原的结合。在图右边(虚线右边)，显示对人IL-17C的ELISA信号，其通过在另一天用人IL-17A对照而测定。图例：hIL-17A：人白细胞介素17A，hIL-17B：人白细胞介素17B，hIL-17D：人白细胞介素17D，hIL-17E：人白细胞介素17E，hIL-17F：人白细胞介素17F，小鼠IL-17A：小鼠白细胞介素17A，大鼠IL-17A：大鼠白细胞介素17A，犬IL-17A：犬白细胞介素17A，cyno Il-17A：食蟹猴白细胞介素17A，EDB：纤连蛋白的外结构域B，hIL-6：人白细胞介素6，hTNF α：人肿瘤坏死因子α，卵白蛋白：来自鸡蛋清的白蛋白，BSA：牛血清白蛋白阴性对照：没有抗原用于包被，hIL-17C：人白细胞介素17C。

图10描述在用食蟹猴IL-17A(由包涵体再折叠的)包被的芯片上的本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽的Biacore传感图。

图11显示Fc融合蛋白的SDS PAGE分析。第1道：完整范围的彩色蛋白标记物(GE Healthcare)，第2道：2C1-Fc(SEQ ID NO：130)，第3道：完整范围的彩色蛋白标记物(GE Healthcare)，第4道：2C1-m5-Fc(LALA)(SEQ ID NO：133)，第5道：2C1-m10-Fc(LALA)(SEQID NO：134)，第6道：2C1-m15-Fc(LALA)(SEQ ID NO：135)，第7道：2C1-m5E-Fc(LALA)(SEQ ID NO：132)，第8道：2C1-Fc(LALA)(SEQID NO：131)。

图12显示与4℃下在PBS中储存的标准对照2C1-Fc(SEQ IDNO：130)(x)相比，在37℃下人血清中储存5天后结合IL-17A的2C1-Fc(SEQ ID NO：130)(·)的ELISA。

图13显示在单次静脉内注射到小鼠中后，2C1-Fc(LALA)(SEQID NO：131)在不同时间点的血清浓度。将哺乳动物细胞中产生的2C1-Fc(LALA)融合蛋白(SEQ ID NO：131)经静脉内(iv)(n＝5)注射(40μg/动物)到小鼠中。PK图的最后4个时间点用于计算2C1-Fc融合蛋白的最终半衰期(53小时)。

图14显示急性炎症模型中本发明抗-IL-17Fyn SH3-来源的多肽2C1(SEQ ID NO：107)抑制人IL-17A诱导的KC产生。经皮下注射3μg人IL-17A(IL-17)、PBS(PBS)、3μg人IL-17A与17μg本发明单体Fyn SH3-来源的多肽2C1(SEQ ID NO：107)(IL-17+2C1)、3μg人IL-17A与16μg野生型Fyn SH3单体(IL-17+野生型)、仅17μg本发明单体Fyn SH3-来源的多肽2C1(SEQ ID NO：107)(2C1)或仅16μg野生型Fyn SH3单体(野生型)的2小时后，取血液样品并定量小鼠-血清中的KC水平。显示4只小鼠/组的平均KC水平(±SD)，只有野生型对照组(不含或含IL-17A的Fyn SH3)除外，其中显示3只小鼠的平均水平(±SD)。

图15描述急性炎症模型中2C1-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：130)抑制人IL-17A诱导的KC产生。静脉内注射2C1-Fc/IL-17：44μg的2C1-Fc(SEQ ID NO：130)，随后皮下注射3μg人IL-17A。在给予IL-17A 2小时后，从小鼠中取血液样品并且通过ELISA测量KC血清水平。如下进行对照实验：PBS/IL-17：静脉内注射PBS，随后皮下注射IL-17；2C1-Fc/PBS：静脉内注射2C1-Fc(SEQ ID NO：130)，随后皮下注射BPS；PBS/PBS：静脉内注射PBS，随后皮下注射PBS；显示3-5只小鼠/组的平均KC水平(±SD)。

实施例

实施例1：如通过单克隆噬菌体ELISA测定的，本发明Fyn SH3-来源的多肽结合IL-17A。

方法

将编码SEQ ID NO：1至116中所示氨基酸序列的DNA克隆到噬菌粒载体pHEN1中，如Grabulovski等(Grabulovski等.(2007)JBC，282，第3196-3204页)中对FYN SH3文库所述。按照标准实验方案进行噬菌体的制备(Viti，F等.(2000)Methods Enzymol.326，480-505)。含噬菌体的单克隆细菌上清液用于ELISA：将生物素化的IL-17A(购自R&D Systems，依据制造商的说明用NHS-PEO4-生物素(Pierce)进行生物素化)固定在链霉抗生物素-包被的孔(StreptaWells，High Bind，Roche)上，在用PBS、2％牛奶(Rapilait，Migros，Switzerland)封闭后，施用20μl的PBS、10％牛奶和80μl的噬菌体上清液。在孵育1h并洗涤后，用抗-M13-HRP抗体缀合物(GE Healthcare)检测结合的噬菌体。通过加入BM蓝色POD底物(Roche)来进行过氧化物酶活性的检测，并且通过加入1M H₂SO₄终止反应。通过DNA测序来验证结合剂的DNA序列(BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒，ABI PRISM3130 Genetic Analyzer，Applied Biosystems)。

结果

Fyn SH3-来源的IL-17A结合剂的氨基酸序列示于如序列表中所附的SEQ ID NO：1至116中。

实施例2：本发明的Fyn SH3-来源的多肽高亲和力地结合人重组IL-17A。

该实施例显示不同形式的Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽的克隆及表达，以及通过尺寸排阻色谱和表面等离振子共振实验来表征这些多肽。

a)Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽的克隆及表达

将选择的Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽(克隆B1_2：SEQ IDNO：39，克隆E4：SEQ ID NO：57和克隆2C1：SEQ ID NO：107)克隆到胞质表达载体pQE-12中并且表达以及纯化，如Grabulovski等(Grabulovski等.(2007)JBC，282，第3196-3204页)描述的。

b)克隆并表达与人IgG1抗体的Fc部分融合的Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽

对克隆E4和2C1(SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：107)进行克隆并且表达为含人IgG1抗体的Fc部分的融合蛋白(参见下文的程序；SEQ ID NO：117和118)。此外，克隆具有10个氨基酸的接头的2C1二聚体[(2C1)₂-Fc]并表达为Fc融合蛋白(SEQ ID NO：119)。

使用引物fm5(5’ATCGGGA-TCCGACAAAACTCACACATGCC3’，SEQ ID NO：121)和fm6(5’TACGAAGCT-TTCATTTACCCGGAGACAGGG 3’，SEQ ID NO：122)并且将市售pFUSE-hIgG1-Fc2(Invivogen)真核载体用作模板，PCR扩增人IgG1的Fc部分。用BamHI/HindIII消化所得PCR产物，并且与先前用相同酶消化的pASK-IBA2载体(IBA-Biotagnology)连接，从而产生新的载体pAF。

用fm7(5’ATATCACCATGGGGCCGGAGTGACACTCTTT-GTGGCCCTTTATG 3’，SEQ ID NO：123)和fm8(5’CGTAGGA-TCCCTGGATAG-AGTCAACTGGAGC 3’，SEQ ID NO：124)，PCR扩增克隆E4和2C1(SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：107)的遗传信息。为制备与Fc融合的2C1二聚体，将2C1DNA模板用于两次独立的PCR。在第一反应中，使用引物47b.fo(5’AGA GCC ACC TCC GCCTGA ACC GCC TCC ACC CTG GAT AGA GTC AAC TGG AGC CAC3’，SEQ ID NO：125)和52.ba(5’GAC TAA CGA GAT CGC GGA TCCGGA GTG ACA CTC TTT GTG GCC CTT TAT 3’，SEQ ID NO：126)，并且在第二PCR中，使用引物48b.ba(5’GGT GGA GGC GGT TCAGGC GGA GGT GGC TCT GGA GTG ACA CTC TTT GTG GCC CTTTAT 3’，SEQ ID NO：127)和51.fo(5’ATC CCA AGC TTA GTG ATGGTG ATG GTG ATG CAG ATC CTC TTC TGA GAT GAG TTT TTGTTC ACC CTG GAT AGA GTC AAC TGG AGC CAC 3’，SEQ ID NO：128)。

用PCR将两个DNA片段组合，在两结构域之间产生具有10个氨基酸接头(GGGGSGGGGS，SEQ ID NO：120)的2C1同二聚体。如针对2C1单体所描述的使用引物fm7和fm8进一步扩增所得DNA片段。随后用NcoI/BamHI消化所得PCR产物并且将其克隆到双重消化的周质表达载体pAF中。将质粒电穿孔到大肠杆菌TG1中并且用0.2μg/ml无水四环素诱导蛋白质表达。将细菌培养物在25℃下于旋转摇床中培养过夜，并且在单个蛋白A-亲和色谱步骤中从周质级分纯化Fynomer-Fc融合蛋白。用20μl的蛋白质溶液进行SDSPAGE(Invitrogen)分析。

c)尺寸排阻色谱(SEC)

使用Superdex 75柱(10/300)或Superdex 75Short Column(5/150)(GE Healthcare)在FPLC系统上进行尺寸排阻色谱(SEC)。

d)亲和力测量

使用BIAcore 3000仪器(Biacore)进行亲和力测量。为分析生物素化IL-17A与单体的Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽之间，以及生物素化IL-17A与E4-Fc(SEQ ID NO：117)之间的相互作用，使用链霉抗生物素SA芯片(Biacore)并分别固定化1300和510RU生物素化IL-17A。运行缓冲液为PBS、0.1％NaN₃和表面活性剂P20(Biacore)。以20μl/min的流速并且注射不同浓度Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽来测量相互作用。为分析IL-17A与2C1-Fc融合物以及(2C1)₂-Fc融合物之间的相互作用，将CM5芯片(Biacore)用2900RU山羊抗-人IgG Fc-特异性抗体(Jackson Immunoresearch)包被。运行缓冲液为HBS-EP(Biacore)。通过以10μl/min的流速注射约250至275RU Fc融合蛋白，随后通过以30μl/min的的流速注射不同浓度的IL-17A(R&D Systems)来测量相互作用。使用BIA评估3.2RC1软件评估相互作用的所有动力学数据(各自的kon/koff)。

e)结果

在未优化条件下在摇瓶中，本发明单体的Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽的表达产率范围为60至85mg/升细菌培养物。Fc-融合蛋白的表达产率为0.2至0.4mg/升(表I)。Fc-融合蛋白具有所附SEQID NO：117至119中列举的序列。

表I.在未优化条件下在摇瓶中，大肠杆菌中的细菌培养物在纯化后的表达产率

克隆

SEQ ID NO：

表达产率(mg/L)

B1_2	39	65
			E4	57	85
2C1	107	60
			E4-Fc	117	0.4
2C1-Fc	118	0.3
			[(2C1)₂-Fc]	119	0.2

图1显示所示纯化的蛋白质的SDS PAGE分析。

尺寸排阻色谱(SEC)图证明所有构建体主要洗脱为单个、单体峰(参见图2)。如Fyn SH3-来源的结合蛋白的先前研究中已观察到的(Grabulovski等.(2007)JBC，282，第3196-3204页)，约8kDa蛋白的主峰比预期洗脱得晚。就本发明的Fc-融合蛋白而言，在单个步骤蛋白A-琼脂糖纯化后，进行尺寸排阻色谱的第二纯化步骤，从而产生单体蛋白，如图2e中融合蛋白E4-Fc(SEQ ID NO：117)所显示的。当在4℃储存于PBS中时，E4-Fc(SEQ ID NO：117)在至少40天内稳定。

通过在BIAcore芯片上的实时相互作用分析来分析结合性质(图3)，显示所选IL-17A-结合多肽和融合蛋白的下列解离常数(K_D)：

表II

克隆	SEQ ID NO：	K_D
			B1_2	39	117nM
E4	57	31nM
			2C1	107	5nM
E4-Fc	117	5nM
			2C1-Fc	118	305pM
[(2C1)₂-Fc]	119	180pM

实施例3：IL-17A抑制细胞测定

IL-17A以剂量依赖性方式诱导成纤维细胞中IL-6的产生(Yao等.(1995)Immunity，3，第811-821页)。在各种浓度的Fyn SH3突变体或人IL-17A受体-Fc嵌合体存在或不存在下，通过用重组IL-17A刺激人皮肤成纤维细胞来测试所示Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽和融合蛋白的抑制活性。在刺激24h后，取细胞培养物上清液并且用ELISA测定IL-6。此外，使用XTT试剂进行比色试验以便证明在单独用IL-17A或用IL-17A和本发明Fyn SH3-来源的抑制性IL-17A-结合多肽，或IL-17A和IL-17R-Fc嵌合体孵育24h后细胞是活的。只有存活且具有代谢活性的细胞能够将四唑盐XTT还原为甲

的橙色化合物(Scudiero等.(1988)，Cancer Res.48，第4827-4833页)。

方法

为除去内毒素，将所示蛋白质溶液用Acrodisc Mustang E膜(VWR)过滤3次。在过滤后，含有本发明的抑制性Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽的蛋白质溶液的内毒素水平小于0.1EU/ml，如通过鲎变形细胞溶解物(LAL)试验(PYROGENT Single test Gel Clot LALAssay(Lonza))测定的。

将400μl含约1x10⁴正常人皮肤成纤维细胞(PromoCell，NHDF-c，C12300)的细胞悬浮液分配在每孔(24孔板，Nunc或TPP)中，并且在37℃下培养24小时(培养基：成纤维细胞生长培养基C-23010，PromoCell)。吸出上清液并且在将不同浓度的本发明Fyn SH3来源的IL-17A-结合多肽或IL-17A受体Fc嵌合体(RnD Systems)与含有IL-17A(RnD Systems)的培养基(终浓度为50ng/ml)混合后，向每孔加入350μl的相应溶液(抑制剂溶液和含有IL-17A的培养基之间的混合比是1∶3)。作为阳性对照，将PBS与含有IL-17A的培养基(“无抑制剂”)以1∶3的比率混合，并且作为阴性对照，将PBS仅与培养基(“无IL-17A”)以1∶3的比率混合。为测定IL-17A-依赖性IL-6的产生，使用含有IL-17A的培养基(IL-17A的终浓度为10、25和50ng/ml)并且与PBS以3∶1的比率混合。在37℃下孵育24小时后，吸出上清液并且依据制造商的说明用ELISA测定IL-6浓度(IL-6ELISA试剂盒，R&DSystems)。在吸出上清液后，随即加入含有XTT的培养基(CellProliferation Kit II，Roche)并且依据制造商的说明测定细胞存活力。

用下式确定IL-17A抑制的百分比：

结果

用不同浓度的IL-17A孵育正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)。图4(a)显示对IL-6的IL-17A剂量依赖性诱导。在下一步中，NHDF细胞用IL-17A(50ng/ml)和不同浓度的所示本发明Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽或IL-17A受体-Fc嵌合体来孵育(图4(b))。观察到克隆2C1(SEQ ID NOD：107)和E4(SEQ ID NO：57)两者均抑制IL-17A诱导的IL-6产生，其中IC₅₀值分别为约1nM和6nM。IL-17A受体-Fc嵌合体据报道的IC₅₀值为500pM(R&D Systems)。在该实验中，得到约1nM的值。该测定描述了三个独立实验的代表性结果。为进一步证明抑制IL-6的产生是特异性IL-17A中和的结果，在IL-17A存在下，将细胞用作为与结合特异性无关的蛋白质的Fyn SH3野生型结构域孵育(Grabulovski等.(2007)JBC，282，第3196-3204页)(图4(c))。如预期的，未观察到抑制IL-6的产生，而克隆2C1(SEQ IDNOD：107)能够抑制IL-17A-诱导的I1-6产生。图4(d)显示XTT测定，这证实在用本发明Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽(以750nM的浓度)和IL-17受体(10nM)孵育24小时后，所有细胞均活的。

实施例4：稳定性

旨在用于治疗性应用的任何生物化合物的关键方面是当储存在溶液中时，其稳定性及对聚集的抗性。本发明Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽是特别有用的药物和诊断候选物，因为已证明它们储存在4℃或-20℃下于单纯磷酸缓冲盐水中时在至少6个月内稳定。

方法

在纯化后，将本发明IL-17A-结合多肽的蛋白质溶液在4℃和-20℃下储存6个月。为分析蛋白质稳定性和聚集状态，将蛋白质溶液过滤(Millex GP，0,22μm，Millipore)并且使用Superdex 75 ShortColumn(5/150)(GE Healthcare)在

FPLC系统上进行尺寸排阻色谱(SEC)。

结果

产生Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽G3(SEQ ID NO：34)，表达产率为123mg/L，并且从尺寸排阻色谱柱中主要洗脱为单峰(参见图5)。

G3(SEQ ID NO：34)的稳定性和聚集抗性通过在4℃和-20℃将蛋白质储存在PBS中来评价。6个月后，通过尺寸排阻色谱来检验蛋白质状态。测量结果未显示任何聚集或降解的迹象。储存6个月后的洗脱图示于图6中。

实施例5：体内半衰期

本发明E4-Fc(SEQ ID NO：117)的融合蛋白的体内半衰期通过用ELISA测量在单次静脉内注射后，在不同时间点小鼠血清中E4-Fc(SEQ ID NO：117)的浓度来测定。

方法

E4-Fc(SEQ ID NO：117)的克隆和表达在实施例2中描述。将200μl 3.3μM(0.22mg/ml)的E4-Fc(SEQ ID NO：117)溶液经静脉内注射到5只小鼠(C57BL/6，Charles River)中。在7分钟、20分钟、1h、2h、4h、8h、24h以及48h后，用毛细管Microvette CB 300(Sarstedt)从隐静脉取出约20μl血液。在9500x g下将血液样品离心10分钟并且将血清储存在-20°直至进行ELISA分析。使用具有已知浓度的连续稀释E4-Fc(SEQ ID NO：117)，通过ELISA测定血清中的E4-Fc(SEQ ID NO：117)浓度：将50μl生物素化IL-17A(30nM)(R&D Systems，依据制造商的说明使用NHS-PEO4-生物素(Pierce)来生物素化)加入链霉抗生物素-包被的孔(Reactibind，Pierce)中，并且在用PBS、4％牛奶(Rapilait，Migros，Switzerland)封闭后，加入45μlPBS、4％牛奶和5μl血清样品。在1h孵育和洗涤后，用蛋白A-HRP缀合物(Sigma)检测结合的Fc融合蛋白。通过添加QuantaRed增强的化学发光HRP底物(Pierce)来检测过氧化物酶活性。在544nm(激发)和590nm(发射)的5至10分钟后测量荧光强度。根据在不同时间点测定的血清(n≥3每时间点，最后一个时间点除外：n＝1)中E4-Fc(SEQ ID NO：117)的浓度以及消除阶段所得的斜率k(在半对数标度中绘制)，使用公式t^1/2＝ln2/-k来计算E4-Fc(SEQ ID NO：117)的半衰期。

结果

根据消除期(β期，最后4个时间点)计算的本发明E4-Fc(SEQ IDNO：117)的融合蛋白的半衰期为50.6小时(参见图7)。

实施例6：用于确定IL-17A-结合多肽和融合蛋白的结合特异性的ELISA

方法

将靶蛋白人IL-17F(R&D systems)、鼠IL-17A(R&D Systems)、人TNF-α(Thermo Scientific)、人IL-6(R&D Systems)、牛血清白蛋白(Sigma)和卵白蛋白(Sigma)包被在MaxiSorp板(Nunc)上过夜(每一靶标为100μl，浓度为5μg/ml)。用PBS将孔洗涤3次并且在用200μlPBS、4％牛奶(Rapilait，Migros)封闭以及在用PBS的洗涤步骤(如上)后，将终浓度为50nM的50μl 2C1(SEQ ID No：107)与50μl抗-myc抗体(9E10，自制，贮存液为OD＝2并且于PBS，2％牛奶中1∶250稀释)一起加入孔中。在孵育后，用PBS将孔洗涤3次并且将100μl以1∶1000于PBS、2％牛奶中稀释的抗-小鼠-HRP免疫缀合物(Sigma)加入孔中。在室温下将96-孔板孵育1h并且随后用PBS、0.1％吐温洗涤3次，随后仅用PBS洗涤3次。通过添加100μl的BM蓝色POD底物(Roche)来进行比色检测并且用60μl 1M H₂SO₄终止反应。

结果

如ELISA所示，克隆2C1(SEQ ID No：107)以高度特异性方式结合人IL-17A并且不与任何其它测试的蛋白质交叉反应(图8)。对于IL-17F，观察到超过本底的小信号，但当探测2C1与IL-17F包被的BIAcore芯片时，未测定可检测的结合(数据未显示)。

实施例7：本发明Fyn SH3-来源的多肽特异性并且高亲和力地结合人和食蟹猴IL-17A

方法

a)特异性

为测定本发明IL-17A-结合多肽的结合特异性，使用以下靶蛋白(相比实施例6更多的靶蛋白)：

-人IL-17A(R&D Systems)

-人IL-17B(Peprotech)

-人IL-17C(R&D Systems)

-人IL-17D(Peprotech)

-人IL-17E(Peprotech)

-人IL-17F(Abd Serotec)

-小鼠IL-17A(R&D Systems)

-大鼠IL-17A(Akron Biotech)

-犬IL-17A(R&D Systems)

-食蟹猴(macaca fascicularis)IL-17A(大肠杆菌中自制，不含信号肽，具有C-端甘氨酸残基，其后带有6个his的标签，从包涵体再折叠，SEQ ID NO：129)

-纤连蛋白的外结构域B(自制，大肠杆菌；参见Carnemolla等.(1996)Int J Cancer，68(3)，第397-405页)

-人IL-6(R&D Systems)

-人TNFα(Thermo Scientific)

-卵白蛋白(Sigma)

-BSA(Sigma)

将靶蛋白包被在MaxiSorp板(Nunc)上过夜(每一靶标为100μl，浓度为10μg/ml)。用PBS将孔洗涤3次并且在室温下用200μlPBS、4％牛奶(Rapilait，Migros)封闭1小时以及随后用PBS的洗涤步骤(如上)后，将终浓度为80nM的50μl本发明2C1(SEQ ID No：107)的Fyn SH3-来源的多肽与50μl抗-myc抗体9E10(自制，贮存液的OD＝2并且于PBS，2％牛奶中1∶250稀释)一起加入孔中。在孵育后，用PBS将孔洗涤3次并且将100μl以1∶1000于PBS、2％牛奶中稀释的抗-小鼠-HRP免疫缀合物(Sigma)加入孔中。在室温下将96-孔板孵育1h并且随后用PBS、0.1％吐温洗涤3次，随后仅用PBS洗涤3次。通过添加100μl的BM蓝色POD底物(Roche)来进行比色检测并且用60μl 1M H₂SO₄终止反应。

b)与食蟹猴IL-17A的亲和力测量

使用BIAcore 3000仪器(Biacore)进行亲和力测量。为分析食蟹猴IL-17A与本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽之间的相互作用，用6900RU食蟹猴IL-17A包被CM5芯片(Biacore)。运行缓冲液为HBS-EP(Biacore)。以20μl/min的流速并且注射不同浓度的本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽来测量相互作用。使用BIA评估3.2RC1软件评估相互作用的所有动力学数据(各自的kon/koff)。

结果

如ELISA所示，本发明2C1(SEQ ID No：107)的Fyn SH3-来源的多肽以高度特异性方式结合人和食蟹猴IL-17A，并且不与任何其它测试的蛋白质交叉反应(图9)。

就食蟹猴IL-17A而言，用Biacore并使用大肠杆菌中产生的食蟹猴IL-17A(从包涵体再折叠)，来测量对本发明2C1(SEQ IDNO：107)的单体Fyn SH3-来源的多肽的亲和力。发现2C1以11nM的K_D结合食蟹猴IL-17A(图10)。

实施例8：哺乳动物细胞中与人IgG1抗体的Fc部分以及与修饰的Fc部分融合的本发明Fyn SH3-来源的多肽的表达

本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽与IgG1的Fc部分(2C1-Fc，SEQ ID NO：130)遗传上地融合，并且在HEK EBNA细胞中表达。还将本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽克隆为与人IgG1的修饰Fc部分的遗传融合物，包括突变L234A(在第234位氨基酸处为丙氨酸而非亮氨酸)和L235A并且在HEK EBNA细胞中表达(2C1-Fc(LALA)，SEQ ID NO：131)。此外，制备以下4个在本发明Fyn SH3-来源的多肽与Fc部分之间具有不同接头长度的2C1-Fc(LALA)融合蛋白变体：

●(SEQ ID NO：132)“2C1-m5E-Fc(LALA)”；铰链区5个氨基酸的延伸：EPKSS接头

●(SEQ ID NO：133)“2C1-m5-Fc(LALA)”；5个氨基酸的延伸，GGGGS接头

●(SEQ ID NO：134)“2C1-m10-Fc(LALA)”；10个氨基酸的延伸，GGGGS)₂接头

●(SEQ ID NO：135)“2C1-m15-Fc(LALA)”；15个氨基酸的延伸，(GGGGS)₃接头

方法

“2C1-Fc”的克隆：与人IgG1抗体(SEQ ID NO：130)的Fc部分融合的本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽：将编码克隆2C1(SEQ ID NO：107)的基因用作模板，并且使用引入限制位点EcoRI和BglII的引物SB3(5’CGA ATT CGG GAG TGA CACTCT TTG TGG CCC 3’，SEQ ID NO：136)和SB4(5’GAA GAT CTCTGG ATA GAG TCA ACT GGA GCC 3’，SEQ ID NO：137)来扩增。将所得PCR产物用EcoRI和BglII消化并且将其克隆到先前双重消化的pFUSE-hIgG1-Fc2载体(Invivogen)中。为将该Fc融合物克隆到pCEP4载体(Invitrogen)中，将所得含编码2C1-Fc融合物的基因的pFUSE载体用作模板，并且用引入HindIII和BamHI限制位点的引物SB5(5’CCC AAG CTT GGG ATG GGC TAC AGG ATG CAA CTCCTG TC 3’，SEQ ID NO：138)和SB6(5’CGG GAT CCT CAT TTACCC GGA GAC AGG GAG 3’，SEQ ID NO：139)扩增。在用HindIII/BamHI消化后，将插入物与先前双重消化的pCEP4载体连接，从而产生含有SEQ ID NO：130的遗传信息的质粒。

“2C1-Fc(LALA)”的克隆：与人IgG1抗体的修饰的Fc部分(L234A，L235A)融合的本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽(产生SEQ ID NO：131)

将上述含有2C1-Fc(SEQ ID NO：130)的遗传信息的质粒用作两次PCR反应的模板。在第一反应中，使用引物SB5和SB7(5’ACTGAC GGT CCC CCC GCG GCT TCA GGT GCT GGG CAC 3’，SEQ IDNO：140)。在第二次PCR中，使用引物SB8(5’GCC GCG GGGGGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CC 3’，SEQ ID NO：141)和SB6。如上所述，进行将两片段作为模板的PCR组合，用BamHI和HindIII消化所得PCR产物并与经消化的pCEP4载体连接。

“2C1-m5E-Fc(LALA)”(SEQ ID NO：132)的克隆：与人IgG1抗体的修饰Fc部分(L234A，L235A)通过5个氨基酸的接头EPKSS融合的本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽。

将上述含有2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)的遗传信息的质粒用作两次PCR的模板。在第一反应中，使用引物SB5和“Ba_2C1_R_EPKSS”(5’GCT GCT TTT CGG TTC CTG GAT AGAGTC AAC TGG AGC CAC 3’，SEQ ID NO：142)。在第二反应中，使用引物SB6和“Ba_Hinge_F_EPKSS”(5’GAA CCG AAA AGC AGCGAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG 3’，SEQ ID NO：143)。如上所述，进行将两片段作为模板的PCR组合，用BamHI和HindIII消化所得PCR产物并与经消化的pCEP4载体连接。

“2C1-m5-Fc(LALA)”(SEQ ID NO：133)的克隆：与人IgG1抗体的修饰Fc部分(L234A，L235A)通过5个氨基酸的接头GGGGS融合的本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽

将上述含有2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)的遗传信息的质粒用作两次PCR的模板。在第一反应中，使用引物SB5和47c.fo(5’TGA ACC GCC TCC ACC CTG GAT AGA GTC AAC TGG AGC CAC3’，SEQ ID NO：144)。在第二反应中，使用引物SB6和“Ba_Hinge_F_5aaGS-接头”(5’GGT GGA GGC GGT TCA GAC AAAACT CAC ACA TGC CCA CCG 3’，SEQ ID NO：145)。如上所述，进行将两片段作为模板的PCR组合，用BamHI和HindIII消化所得PCR产物并与经消化的pCEP4载体连接。

“2C1-m10-Fc(LALA)”(SEQ ID NO：134)的克隆：与人IgG1抗体的修饰Fc部分(L234A，L235A)通过10个氨基酸的接头(GGGGS)₂融合的本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽

将上述含有2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)的遗传信息的质粒用作两次PCR的模板。在第一反应中，使用引物SB5和47b.fo(5’AGA GCC ACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC CTG GAT AGAGTC AAC TGG AGC CAC 3’，SEQ ID NO：146)。在第二反应中，使用引物SB6和“Ba_Hinge_F_10aaGS-接头”(5’GGT GGA GGC GGTTCA GGC GGA GGT GGC TCT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCACCG 3’，SEQ ID NO：147)。如上所述，进行将两片段作为模板的PCR组合，用BamHI和HindIII消化所得PCR产物并与经消化的pCEP4载体连接。

“2C1-m15-Fc(LALA)”(SEQ ID NO：135)的克隆：与人IgG1抗体(L234A，L235A)的修饰Fc部分通过15个氨基酸接头(GGGGS)₃融合的本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽

将上述含有2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)的遗传信息的质粒用作两次PCR的模板。在第一反应中，使用引物SB5和47.fo.corr(5’TGA TCC GCC ACC GCC AGA GCC ACC TCC GCC TGA ACCGCC TCC ACC CTG GAT AGA GTC AAC TGG AGC CAC 3’，SEQ IDNO：148)。在第二反应中，使用引物SB6和“Ba_Hinge_F_15aaGS-接头”(5’GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGCGGT GGC GGA TCA GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG 3’，SEQ ID NO：149)。如上所述，进行将两片段作为模板的PCR组合，用BamHI和HindIII消化所得PCR产物并与经消化的pCEP4载体连接。

为表达融合蛋白，使用无内毒素超大量制备试剂盒(Qiagen)来纯化相应的质粒并且将质粒用于HEK EBNA细胞(ATCC No CRL-10852)的瞬时转染。以30％汇合接种HEK EBNA细胞，24小时后进行转染。临转染前，用DMEM/5％FCS/penstrep(Invitrogen)更换培养基。将60μg DNA用于转染150cm²的贴壁细胞。将DNA和PEI(25kDa，来自Polysciences)以1∶3的比率混合并且涡旋10秒。随后，在室温下将DNA/PEI混合物孵育10分钟并且随后将其加入HEKEBNA细胞。在24小时后，用CD-CHO/HT/L-谷氨酰胺/Penstrep(Invitrogen)更换培养基并且在37℃含5％CO₂下孵育。在96小时后收集细胞培养物上清液。

为纯化蛋白质，将细胞培养物上清液上样到蛋白A-琼脂糖亲和柱。随后，用PBS来洗涤柱，随后是使用0.1M甘氨酸pH 2.7的蛋白质洗脱。经洗脱的蛋白质随后透析到PBS中。若需要，进行第二纯化步骤，以便用Triton-X114除去内毒素(

等.(2007)JPharm Pharmaceut Sci，10(3)，第388-404页)。

结果

可表达并纯化本发明Fyn SH3-来源的Fc融合物。图11显示Fc融合蛋白的SDS PAGE分析。

实施例9：本发明Fyn SH3-来源的多肽在人血清中稳定

蛋白质药物应在血清中稳定某一段时间，以便能引发患者中的药效作用。在该实施例中，测试2C1-Fc(SEQ ID NO：130)的血清稳定性。

方法

制备3ml含10μg/ml 2C1-Fc(SEQ ID NO：130)的人血清(Sigma)溶液并将其置于37℃的培养箱中。在所示的时间点移出200μl样品并且将其冷冻在-20℃直至实验结束。5天后，用收集的样品进行ELISA，4℃储存于PBS中的2C1-Fc样品(SEQ ID NO：130)用作对照标准品。

为进行ELISA，将IL-17A(R&D Systems)包被在MaxiSorp板(Nunc)上过夜(100μl，5μg/ml)。用PBS将孔洗涤3次，在用200μlPBS、4％牛奶(Rapilait，Migros)封闭以及用PBS的洗涤步骤(如上)后，加入100μl包含稀释于PBS、2％牛奶中的2C1-Fc(SEQ ID NO：130)(以所示浓度)的试样。在孵育后，用PBS将孔洗涤3次，随后加入100μl以1∶1000于PBS、2％牛奶中稀释的蛋白A-HRP(Sigma)。在室温下将96-孔板孵育1h并且随后用PBS、0.1％吐温洗涤3次，随后仅用PBS洗涤3次。通过添加100μl的BM蓝色POD底物(Roche)来进行比色检测，并且用60μl 1M H₂SO₄终止反应。

结果

在37℃下于人血清中储存5天后，2C1-Fc(SEQ ID NO：130)基本上能与在4℃于PBS中储存的2C1-Fc(SEQ ID NO：130)一样好地结合其靶IL-17A，这表明2C1-Fc(SEQ ID NO：130)在37℃下于人血清中稳定(图12).

实施例10：本发明Fyn SH3-来源的多肽在体外抑制IL-17A

在该测定中，对所示本发明Fyn SH3-来源的多肽在体外抑制IL-17A的能力进行测试。细胞测定类似于本发明实施例3中描述的细胞测定，主要区别在于：IL-17A以1ng/ml的低浓度(与实施例3中的50ng/ml相比)与TNFα(50pg/ml)一起使用。

方法

所测试的本发明Fyn SH3-来源的IL-17A-结合多肽的内毒素水平小于0.1EU/ml，如通过鲎变形细胞溶解物(LAL)试验(PYROGENTSingle test Gel Clot LAL Assay(Lonza))测定的。

正常人皮肤成纤维细胞(NHDF，PromoCell Inc.，NHDF-c，C12300)用于IL-17A抑制细胞测定。将人IL-17A(R&D Systems)与人肿瘤坏死因子-α(TNF-α，Thermo Fisher Scientific)一起加入细胞培养基，以剂量依赖性方式诱导NHDF细胞产生IL-6。使用市售ELISA试剂盒(R&D Systems，DuoSet ELISA System试剂盒(DY206))，通过ELISA在细胞培养物上清液中定量释放到细胞培养基(PromoCell，C-23010)中的IL-6。

将10⁴正常人皮肤成纤维细胞(PromoCell，NHDF-c，C12300)分配在每孔(24孔板，Nunc或TPP)中，并且在37℃下培养24小时(培养基：成纤维细胞生长培养基C-23010，PromoCell)。吸出上清液，并且在将不同浓度的本发明Fyn SH3来源的IL-17A-结合多肽或IL-17A受体Fc嵌合体(RnD Systems)与含有IL-17A(RnD Systems)和TNF α(Thermo Scientific)的培养基(终浓度为1ng/ml的IL-17A和50pg/mlTNF α)混合后，向每孔加入350μl的相应溶液，重复三份(抑制剂溶液与含细胞因子的培养基之间的混合比为1∶23)。对照孔包括不含Fyn SH3-来源的多肽(仅PBS)、仅IL-17A、仅TNF-α以及仅培养基的孵育。在37℃孵育24小时后，吸出上清液并且依据制造商的说明通过ELISA(IL-6ELISA试剂盒，R&D Systems)来测定ELISA吸光度(与IL-6浓度相关联)。

结果

用恒定浓度的IL-17A(1ng/ml)和TNF α(50pg/ml)以及用不同浓度的市售IL-17A受体-Fc嵌合体或用以下不同浓度的本发明FynSH3-来源的多肽来孵育NHDF细胞：

-2C1(SEQ ID NO：107)

-2C1-Fc(SEQ ID NO：130)

-2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)

-2C1-m5E-Fc(LALA)(SEQ ID NO：132)

-2C1-m5-Fc(LALA)(SEQ ID NO：133)

-2C1-m10-Fc(LALA)(SEQ ID NO：134)

-2C1-m15-Fc(LALA)(SEQ ID NO：135)

表III显示从数个用所示本发明Fyn SH3-来源的多肽进行的细胞测定中所得到IC₅₀值的均值。用2C1-m15-Fc(LALA)(SEQ ID NO：135)得到最佳IC₅₀值(0.11nM)。

表III.从若干细胞测定得到的本发明Fyn SH3-来源的多肽的IC₅₀值的均值。

实施例11：2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)的体内半衰期

本发明2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)的融合蛋白的体内半衰期通过测量在单次静脉内注射后，在不同时间点小鼠血清中2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)浓度来测定。

方法

将2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)溶液(0.2mg/ml)静脉内注射到5只小鼠(C57BL/6，Charles River)中，每只小鼠200μl。在所示时间点后，用毛细管Microvette CB 300(Sarstedt)从隐静脉取出约20μl血液。在9500x g下将血液样品离心10分钟并且将血清储存在-20°直至进行ELISA分析。使用具有已知浓度的连续稀释2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)，通过ELISA测定血清中的2C1-Fc(LALA)(SEQID NO：131)浓度：将50μl生物素化IL-17A(30nM)(R&D Systems，依据制造商的说明使用NHS-PEO4-生物素(Pierce)来生物素化)加入链霉抗生物素-包被的孔(Reactibind，Pierce)中，并且在用PBS、4％牛奶(Rapilait，Migros，Switzerland)封闭后，加入45μl PB S、4％牛奶和5μl血清样品。在1h孵育和洗涤后，用蛋白A-HRP缀合物(Sigma)险测结合的Fc融合蛋白。通过添加QuantaRed增强的化学发光HRP底物(Pierce)来检测过氧化物酶活性。在544nm(激发)和590nm(发射)的5至10分钟后测量荧光强度。根据在不同时间点测定的血清(小鼠数n＝5/时间点)中2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)的浓度以及消除阶段所得的斜率k(在半对数标度中绘制)，使用公式t^1/2＝ln2/-k来计算2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)的半衰期。

结果

根据消除期(β期，最后4个时间点)计算的本发明2C1-Fc(LALA)(SEQ ID NO：131)的融合蛋白的半衰期为53小时(参见图13)。

实施例12本发明Fyn SH3-来源的多肽在体内中和人IL-17A

人IL-17A能结合并刺激小鼠IL-17受体，这导致小鼠KC(CXCL1)趋化因子的升高以及随后的分泌(Allan B等.(2007)Eli Lilly，US的WO2007/070750)。在皮下注射IL-17A(3μg)后2小时，与约100pg/ml KC基础水平相比，观察到的血清中KC水平在500至1000pg/ml之间。

方法

a)使用本发明2C1(SEQ ID NO：107)的单体Fyn SH3来源的多肽来体内中和IL-17A

将本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽(17μg)与3μg人IL-17A(R&D Systems)共同注射(皮下)到C57BL/6小鼠中，并且在注射2小时后，用毛细管Microvette CB 300(Sarstedt)从隐静脉取血液样品。在9500x g下将血液样品离心10分钟，并且将血清储存在-20°直至进行ELISA分析。血清中的KC水平通过使用市售的Quantikine小鼠CLCL1/KC试剂盒(R&D Systems)来测定。对照组包括用IL-17A和Fyn SH3野生型结构域(作为与结合特异性无关的蛋白质)(参见Grabulovski等.(2007)JBC，282，第3196-3204页)注射的小鼠、仅用PBS注射的小鼠、仅用IL-17A注射的小鼠、仅用本发明2C1(SEQ ID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽注射的小鼠或仅给予Fyn SH3野生型蛋白的小鼠。

b)使用2C1-Fc融合物(SEQ ID NO：130)的体内中和：

将本发明2C1-Fc(SEQ ID NO：130)的Fyn SH3-来源的多肽(44μg/小鼠)静脉内注射到C57BL/6小鼠中。在20-60分钟后，经皮下注射3μg/小鼠的人IL-17A(R&D Systems)，并且在IL-17A注射2小时后，用毛细管Microvette CB 300(Sarstedt)从隐静脉取血液样品。在9500x g下将血液样品离心10分钟，然后将血清储存在-20°直至进行ELISA分析。血清中的KC水平使用市售的Quantikine小鼠CLCL1/KC试剂盒(R&D Systems)来测定。对照组包括用PBS(静脉内)和IL-17A(皮下)注射的小鼠、仅用PBS(静脉内和皮下)注射的小鼠以及静脉内注射本发明2C1-Fc(SEQ ID NO：130)的Fyn SH3-来源的多肽并随后用PBS(皮下)注射的小鼠。

结果

在将人IL-17A经皮下注射到小鼠中后，动物过表达称为KC的趋化因子。小鼠血清中KC水平的升高可通过ELISA来测量。注射本发明Fyn SH3-来源的多肽防止KC上调。

a)

将IL-17A和本发明单体的Fyn SH3-来源的多肽2C1(SEQ IDNO：107)经皮下共同注射到小鼠(C57BL/6)中。因为本发明2C1(SEQID NO：107)的Fyn SH3-来源的多肽的抑制性质，在该组中KC水平未升高，它们仍保持几乎与基础水平相当的低水平。为证明抑制KC的产生是由于特异性IL-17A的中和，用IL-17A和野生型Fyn SH3结构域(其对IL-17A无结合亲和力)共同注射小鼠；在这些小鼠中，KC水平与仅接受IL-17A的组中的一样高。图14显示从该实验得到的结果。

b)

在这第二个急性炎症实验中，经静脉内注射本发明2C1-Fc(SEQID NO：130)的Fyn SH3-来源的多肽，随后经皮下注射IL-17A。如上述a)中，本发明Fyn SH3-来源的多肽防止血清中KC水平的上调。图15显示2C1-Fc(SEQ ID NO：130)在体内抑制IL-17A。

Claims

1.一种包含选自以下的氨基酸序列的多肽：

(i)(G/E)VTLFVALYDY-(X)_a-D-(X)_b-SFHKGEKF-(X)_c-I-(X)_d-G-(X)_e-WW-(X)_f-A-(X)_g-SLTTG-(X)_hGYIPSNYVAPVDSIQ (I)

其中a至h为0至20，

优选a为1至10、更优选2至8、最优选6；

优选b为0至5、更优选1至3、最优选1；

优选c为0至5、更优选1至3、最优选1；

优选d为1至10、更优选3至9、最优选5或7；

优选e为0至5、更优选1至3、最优选1；

优选f为0至5、更优选1至3、最优选1；

优选g为0至5、更优选1至3、最优选1；

优选h为0至6、更优选1至3、最优选1或2；

(ii)与(i)具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；

其中所述多肽结合IL-17A。

2.权利要求1的多肽，所述多肽具有与人IL-17A的特异性结合亲和力，优选K_D为10^-7至10^-12M、更优选10^-8至10^-12M、最优选低于10^-12M。

3.权利要求1或2的多肽，所述多肽选自SEQ ID NO：1至119或其功能衍生物。

4.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含与药学上和/或诊断上的活性组分融合的权利要求1至3中任一项的多肽。

5.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为细胞因子，优选选自IL-2、IL-12、TNF-α、IFN α、IFN β、IFN γ、IL-10、IL-15、IL-24、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、LIF、CD80、B70、TNF β、LT-β、CD-40配体、Fas-配体、TGF-β、IL-1α和IL-1β。

6.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为毒性化合物，优选小的有机化合物或多肽，更优选选自以下的毒性化合物：加利车霉素、美登木素生物碱、新制癌菌素、埃斯波霉素、达内霉素、可达菌素、maduropeptin、多柔比星、柔红霉素、auristatin、蓖麻毒蛋白-A链、蒴莲根毒蛋白II、截短的假单胞菌外毒素A、白喉毒素和重组白树毒素。

7.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为趋化因子，优选选自IL-8、GRO α、GRO β、GROγ、ENA-78、LDGF-PBP、GCP-2、PF4、Mig、IP-10、SDF-1α/β、BUNZO/STRC33、I-TAC、BLC/BCA-1、MIP-1α、MIP-1β、MDC、TECK、TARC、RANTES、HCC-1、HCC-4、DC-CK1、MIP-3α、MIP-3β、MCP-1-5、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、I-309、MPIF-1、6Ckine、CTACK、MEC、淋巴细胞趋化蛋白和CXXXC趋化因子。

8.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为荧光染料，优选选自Alexa Fluor或Cy染料的组分。

9.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为光敏剂，优选光毒的红色荧光蛋白`KillerRed或血卟啉。

10.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为前凝血剂因子，优选组织因子。

11.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为用于前药活化的酶，优选选自羧肽酶、葡糖醛酸糖苷酶和葡糖苷酶的酶。

12.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为来自以下的放射性核素：γ-发射同位素，优选^99mTc、¹²³I、¹¹¹In，或者正电子发射体，优选¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、¹²⁴I，或者β-发射体，优选¹³¹I、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁶⁷Cu，或者α-发射体，优选²¹³Bi、²¹¹At。

13.权利要求4的融合蛋白，其中所述组分为功能Fc结构域，优选人功能Fc结构域，更优选包含多聚体的、优选二聚体的权利要求1至3中任一项的多肽的人功能Fc结构域。

14.前述权利要求中任一项的多肽或融合蛋白，其还包含调节血清半衰期的组分，优选选自聚乙二醇(PEG)、免疫球蛋白和白蛋白-结合肽的组分。

15.权利要求4至14中任一项的融合蛋白，其包含权利要求1至3中任一项的多肽。

16.包含选自SEQ ID NO：1至119或其功能衍生物的多肽的融合蛋白。

17.权利要求1至3中任一项的多肽或权利要求4至16中任一项的融合蛋白，所述融合蛋白包含权利要求1至3中任一项多肽的多聚体，优选二聚体或三聚体。

18.一种分离并纯化的核酸，其包含

(i)编码权利要求1或2的多肽，优选编码(G/E)VTLFVALYDY-(X)₆-D-(X)-SFHKGEKF-(X)₁-I-(X)_5-7-G-(X)₁-WW-(X)-A-(X)-SLTTG-(X)_1-2-GYIPSNYVAPVDSIQ的核酸；

(ii)具有与(i)的核酸序列有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％序列同一性的序列的核酸；

(iii)与(i)或(ii)的核酸的互补链杂交的核酸；

(v)与编码权利要求1或2的多肽的(i)的核酸的互补链杂交的(i)至(iv)的核酸中任一种的片段。

19.权利要求18的核酸，所述核酸编码权利要求1至17中任一项的多肽或融合蛋白。

20.权利要求18或19的核酸，其中所述核酸为DNA、PNA或RNA。

21.权利要求18至20中任一项的核酸，其中所述核酸有效连接至启动子，优选连接至选自以下原核启动子的启动子：T5启动子/lac操纵基因元件、T7启动子/lac操纵基因元件，或选自以下真核启动子的启动子：hEF1-HTLV、CMV enh/hFerL启动子。

22.一种重组载体，所述重组载体包含权利要求18至21中任一项的核酸，其中所述载体优选能够产生权利要求1至17中任一项的多肽或融合蛋白。

23.权利要求22的重组载体，其选自pQE载体、pET载体、pFUSE载体、pUC载体、YAC载体、噬菌粒载体、噬菌体载体、用于基因治疗的载体例如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒。

24.一种宿主细胞，其包含前述权利要求中任一项的核酸和/或载体。

25.一种抗体，其特异性结合权利要求1至3中任一项的多肽。

26.一种杂交瘤细胞系，其表达权利要求26的单克隆抗体。

27.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的多肽或融合蛋白、核酸和/或重组载体以及任选的药学上可接受的载体。

28.前述权利要求中任一项的多肽或融合蛋白、核酸和/或重组载体用于制备药物的用途，所述药物优选用于治疗和/或预防选自IL-17A-和Th17-相关疾病或医学病症的疾病或医学病症。

29.权利要求28的用途，其中所述疾病或医学病症选自炎性、自身免疫性和/或骨丢失相关的疾病和医学病症。

30.权利要求28和30的用途，其中所述疾病或医学病症选自关节炎、优选类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎、反应性关节炎、牛皮癣关节炎、肠病性关节炎和变形性关节炎、风湿性疾病、脊椎关节病、强直性脊椎炎、莱特尔综合征、超敏反应(包括呼吸道超敏反应和皮肤超敏反应)、变态反应、系统性红斑狼疮、炎性肌肉病症、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、皮肌炎、史-约综合征、慢性活动性肝炎、重症肌无力、牛皮癣、特发性口炎性腹泻、自身免疫炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠易激综合征、内分泌性眼病、格雷夫斯病、结节病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、自身免疫血液病症、溶血性贫血、再生障碍性贫血、单纯红细胞性贫血、特发性血小板减少症、色素层炎(前眼色素层炎和后色素层炎)、干性角膜结膜炎、春季角膜结膜炎、间质性肺纤维化、肾小球性肾炎(具有和不具有肾病综合征)、特发性肾病综合征或微小病变肾病、肿瘤、皮肤炎性疾病、角膜炎症、肌炎、骨植入物松弛、代谢紊乱、动脉粥样硬化、糖尿病，和血脂障碍、骨丢失、骨关节炎、骨质疏松症、呼吸道阻塞疾病或呼吸道炎性疾病的牙周疾病、哮喘、支气管炎、尘肺病、肺气肿、急性及超急性炎性反应、涉及IL-17A-介导的TNF-α的疾病、急性感染、感染性休克、内毒素性休克、成年呼吸窘迫综合征、脑膜炎、肺炎、严重烧伤、恶病质、衰竭综合征、中风、疱疹性基质性角膜炎以及干眼疾病。