JP2013502910A - 新規なil−17結合化合物およびその医薬用途 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図10
Description
(i)(G/E)VTLFVALYDY−(X)a−D−(X)b−SFHKGEKF−(X)c−I−(X)d−G−(X)e−WW−(X)f−A−(X)g−SLTTG−(X)hGYIPSNYVAPVDSIQ (I)
式中、a〜hは0〜20であり、
好ましくは、aは1〜10であり、より好ましくは2〜8であり、最も好ましくは6であり;
好ましくは、bは0〜5であり、より好ましくは1〜3であり、最も好ましくは1であり;
好ましくは、cは0〜5であり、より好ましくは1〜3であり、最も好ましくは1であり;
好ましくは、dは1〜10であり、より好ましくは3〜9であり、最も好ましくは5または7であり;
好ましくは、eは0〜5であり、より好ましくは1〜3であり、最も好ましくは1であり;
好ましくは、fは0〜5であり、より好ましくは1〜3であり、最も好ましくは1であり;
好ましくは、gは0〜5であり、より好ましくは1〜3であり、最も好ましくは1であり;
好ましくは、hは0〜6であり、より好ましくは1〜3であり、最も好ましくは1または2である;
(ii)(i)に対して、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列;
(iii)好ましくはストリンジェントな条件下で、(i)をコードする核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸によってコードされる、アミノ酸配列;
(iv)少なくとも1つのアミノ酸の置換、付加および/または欠失によって誘導し得る、(i)〜(iii)の断片または機能性誘導体、
ここで、前記のポリペプチドはIL−17Aに結合する。
(G/E)VTLFVALYDY−(X)6−D−(X)1−SFHKGEKF−(X)1−I−(X)5−7−G−(X)1−WW−(X)1−A−(X)1−SLTTG−(X)1−2GYIPSNYVAPVDSIQ (Ia)
(i)本発明のポリペプチドをコードする核酸、好ましくは式(I)のアミノ酸配列をコードする核酸、より好ましくは
(G/E)VTLFVALYDY−(X)6−D−(X)−SFHKGEKF−(X)1−I−(X)5−7−G−(X)1−WW−(X)−A−(X)−SLTTG−(X)1−2−GYIPSNYVAPVDSIQ
をコードする核酸;
(ii)(i)の核酸配列に対して、少なくとも60%または70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を持つ配列を有する核酸;
(iii)(i)または(ii)の核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸;
(iv)核酸であって、前記の核酸が、(i)、(ii)または(iii)の核酸のうちの1つの置換、付加および/または欠失によって誘導し得る、核酸;
(v)(i)〜(iv)の核酸のいずれか1つの断片であって、本発明によるポリペプチドをコードする(i)の核酸の相補鎖にハイブリダイズする、断片
を含む、単離または精製核酸を対象とする。
方法
配列番号1〜116で示されるアミノ酸配列をコードするDNAを、グラブロフスキ(Grabulovski)らにおけるFYN SH3ライブラリについて記載された通り(グラブロフスキら、(2007年)JBC,282,3196−3204頁)ファージミドベクターpHEN1にクローニングした。ファージ産生は、標準的プロトコル(ヴィティ(Viti),Fら(2000年)Methods Enzymol.326,480−505頁)に従って実施した。ファージを含有するモノクローナル細菌上澄をELISAに使用した:ビオチン化IL−17A(R&Dシステムズ(Systems)より購入、ビオチン化は、NHS−PEO4−ビオチン(ピアス(Pierce))を用い、メーカーの使用説明書に従って実施した)を、ストレプトアビジンでコートしたウェル(ストレプタウェルズ(StreptaWells)、ハイバインド(High Bind)、ロシュ(Roche))上に固定化し、PBS、2%ミルク(ラピライト(Rapilait)、ミグロス(Migros)、スイス)でブロッキングした後、20μlのPBS、10%ミルクおよび80μlのファージ上澄を適用した。1時間インキュベーションし、洗浄した後、結合したファージを抗M13−HRP抗体複合体(GEヘルスケア(Healthcare))で検出した。ペルオキシダーゼ活性の検出は、BMブルーPOD基質(ロシュ)を加えることによって行い、1M H2SO4を加えて反応を停止した。バインダーのDNA配列は、DNAシークエンシングによって検証した(ビッグダイ・ターミネーター(BigDye Terminator) v3.1 サイクル・シークエンシング・キット、ABI PRISM 3130遺伝子分析器、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems))。
Fny SH3−由来IL−17Aバインダーのアミノ酸配列は、配列表中に付記した通りの、配列番号1〜116で示される。
この実施例は、種々の形態のFyn SH3由来IL−17A結合ポリペプチドのクローニングおよび発現、および、これらのポリペプチドのサイズ排除クロマトグラフィーおよび表面プラスモン共鳴による特性評価を示す。
選択したFyn SH3由来IL−17A結合ポリペプチド(クローンB1_2:配列番号39、クローンE4:配列番号57およびクローン2C1:配列番号107)を、グラブロフスキ(Grabulovski)ら(グラブロフスキら(2007年)JBC,282,3196−3204頁)に記載の通り、細胞質発現ベクターにクローニングし、発現および精製した。
クローンE4および2C1(配列番号57および107)をクローニングし、ヒトIgG1抗体のFc部分との融合タンパク質として発現させた(手順は、以下参照;配列番号117および118)。さらに、10個のアミノ酸リンカーを有する2C1二量体[(2C1)2−Fc]をクローニングし、Fc融合タンパク質として発現させた(配列番号119)。
PCR増幅した。得られたPCR産物をBamHI/HindIIIで消化し、以前に同じ酵素で消化したpASK−IBA2ベクター(IBA−バイオタグノロジー(Biotagnology))と連結し、新たなベクターpAFを得た。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、AEKTA FPLCシステムで、スーパーデックス75カラム(10/300)またはスーパーデックス75ショートカラム(5/150)(GEヘルスケア(Healthcare))を用いて実施した。
親和性測定は、バイアコア(BIAcore)3000装置(バイアコア)を用いて実施した。ビオチン化IL−17Aと単量体Fyn SH3由来IL−17A結合ポリペプチドとの間の相互作用分析、およびビオチン化IL−17AおよびE4−Fc(配列番号117)との間の相互作用分析には、ストレプトアビジンSAチップ(バイアコア(Biacore))を、それぞれ固定化した1300および510 RUビオチン化IL−17Aと共に使用した。ランニングバッファーは、PBS、0.1%NaN3および界面活性剤P20(バイアコア)であった。相互作用は、流速20ml/分で、種々の濃度のFyn SH3由来IL−17A結合ポリペプチドを注入して測定した。IL−17Aと2C1−Fc融合体との間、およびIL−17Aと(2C1)2−Fc融合体との間の相互作用分析のため、CM5チップ(バイアコア)を、2900 RUのヤギ抗ヒトIgG Fc特異的抗体(ジャクソン・イムノリサーチ(Jackson Immunoresearch))でコートした。ランニングバッファーは、HBS−EP(バイアコア)であった。相互作用は、約250〜275 RUのFc融合タンパク質を流速10μl/分で注入し、その後、種々の濃度のIL−17A(R&Dシステムズ(R&D Systems))を流速30μl/分で注入することによって測定した。相互作用の速度論的データ(個別のkon/koff)は全て、BIAエバリュエーション3.2RC1ソフトウェアを用いて評価した。
本発明の単量体Fyn SH3由来IL−17A結合ポリペプチドの発現収率は、振とうフラスコ中、非最適化条件下で、細菌培養物1リットル中60〜85mgであった。Fc融合タンパク質は、収率0.2〜0.4mg/l(表I)で発現した。Fc融合タンパク質の配列は、付記の通りの配列番号117〜119に列記する。
IL−17Aは、線維芽細胞においてIL−6の産生を投与量依存的に誘導する(ヤオ(Yao)ら(1995年)Immunity,3,811−821頁)。表示したFyn SH3−誘導IL−17A結合ポリペプチドおよび融合タンパク質の阻害活性は、ヒト皮膚線維芽細胞を、種々の濃度のFyn SH3変異体またはヒトIL−17A受容体Fcキメラの非存在または存在下、組み換えIL−17Aで刺激することによって試験した。刺激の24時間後に、細胞培養上澄を採取し、ELISAでIL−6について分析した。加えて、細胞が、IL−17A単独、またはIL−17Aおよび本発明のFyn SH3由来阻害IL−17A結合ポリペプチド、またはIL−17AおよびIL−17R−Fcキメラと共に24時間インキュベーションした後に、生存していたことを実証するために、XTT試薬を用いて比色試験を実施した。生存し、代謝的に活性な細胞のみが、テトラゾリウム塩XTTを、橙色化合物であるホルマザンに還元する能力がある(スクディエロ(Scudiero)ら(1988年),Cancer Res.48,4827−4833頁)。
エンドトキシンを除去するため、表示したタンパク質溶液を、アクロディスク・ムスタング(Acrodisc Mustang)Eメンブレン(VWR)で3回濾過した。濾過の後、本発明の阻害性Fyn SH3由来IL−17A結合ポリペプチドを含有するタンパク質溶液のエンドトキシンレベルは、カブトガニ血球抽出物(LAL)試験(パイロジェント(PYROGENT)単一検査ゲル凝集LAL分析(ロンザ(Lonza)))によって定量したところ、0.1EU/ml未満であった。
正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)をIL−17Aと種々の濃度でインキュベーションした。図4(a)は、IL−6のIL−17A用量依存性誘導を示す。次の工程において、NHDF細胞を、IL−17A(50ng/ml)および種々の濃度の表示した本発明のFyn SH3誘導IL−17A結合ポリペプチドまたはIL−17A受容体−Fcキメラと共にインキュベーションした(図4(b))。クローン2C1(配列番号107)およびE4(配列番号57)の両者がIL−17A誘導IL−6産生を阻害し、IC50値はそれぞれ約1nMおよび6nMであったことが観察された。IL−17A受容体−Fcキメラは、IC50値が500pMであることが報告されている(R&Dシステムズ(Systems))。この実験では、約1nMの値が得られた。この分析は、3つの独立した実験の代表的な結果を表す。IL−6産生の阻害が特異的なIL−17A中和の結果であることをさらに実証するために、細胞を、IL−17Aの存在下で結合特異性に無関係のタンパク質としてFyn SH3wtドメイン(グラブロフスキ(Grabulovski)ら(2007年)JBC,282,3196−3204頁)と共にインキュベーションした(図4(c))。予想した通り、IL−6産生の阻害は観察されず、一方、クローン2C1(配列番号107)はIL−17A−誘導IL−6産生を阻害する能力があった。図4(d)にXTT分析を示すが、これは、全ての細胞が、本発明のFyn SH3−由来IL−17A結合ポリペプチド(濃度750nM)およびIL−17受容体(10nM)と共に24時間インキュベーションした後、生存能力があったことを確認する。
治療的適応を目的とする全ての生体化合物の極めて重要な様相は、溶液中に保管した場合の、その安定性および凝集耐性である。本発明のFyn SH3由来IL−17A結合ポリペプチドは、単純なリン酸緩衝生理食塩水中、4℃または−20℃で少なくとも6ヶ月間保管した際に安定であることが判っていることから、特に有用な薬剤および診断薬候補である。
本発明のIL−17A結合ポリペプチドのタンパク質溶液を、精製後、4℃または−20℃で6ヶ月間保管した。タンパク質の安定性および凝集状態を分析するため、タンパク質溶液を濾過し(ミレックス(Millex)GP、0.22μm、ミリポア(Millipore))、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を、AEKTA FPLCシステムでスーパーデックス75ショートカラム(5/150)(GEヘルスケア(Healthcare))を用いて実施した。
Fyn SH3由来IL−17A結合ポリペプチドG3(配列番号34)が発現収率123mg/Lで産生され、サイズ排除クロマトグラフィーカラムから主に単一のピークとして溶出された(図5参照)。
本発明の融合タンパク質E4−Fc(配列番号117)のインビボ半減期を、ELISAにより、単回静注後の種々の時点でマウス血清中のE4−Fc(配列番号117)濃度を測定することによって定量した。
E4−Fc(配列番号117)のクローニングおよび発現を実施例2に記載する。E4−Fc(配列番号117)の3.3μM(0.22mg/ml)溶液200μlを5匹のマウス(C57BL/6、チャールス・リバー(Charles River))に静注射した。7分後、20分後、1、2、4、8、24および48時間後に、約20μlの血液を伏在静脈からキャピラリーであるマイクロベッテ(Microvette)CB300(サーステッド(Sarstedt))で採取した。血液サンプルを9500xgで10分間遠心分離し、ELISAを実施するまで、血清を−20℃で保管した。濃度が分っているE4−Fc(配列番号117)の希釈系列を用いて、血清中のE4−Fc(配列番号117)濃度をELISAによって定量した:50μlのビオチン化IL−17A(30nM)(R&Dシステムズ(Systems)、メーカーの使用説明書に従って、NHS−PEO4−ビオチン(ピアス(Pierce))を用いてビオチン化)を、ストレプトアビミンでコートしたウェル(リアクチバインド(Reactibind)、ピアス)に添加し、PBS、4%ミルク(ラピライト(Rapilait)、ミグロス(Migros)、スイス)でブロッキングした後、45μlのPBS、4%ミルクおよび5μlの血清サンプルを添加した。1時間インキュベーションし、洗浄した後、結合したFc融合タンパク質をプロテインA−HRP複合体(シグマ(Sigma))で検出した。ペルオキシダーゼ活性は、クアンタレッドを強化した化学蛍光HRP基質(ピアス)を添加することによって検出した。蛍光強度は、544nm(励起)および590nm(発光)で5〜10分後に測定した。種々の時点で血清中(各時点n≧3、最終時点:n=1を除く)定量したE4−Fc(配列番号117)濃度および得られた排出相の傾きk(片対数目盛りにプロット)から、E4−Fc(配列番号117)の半減期を、式t1/2=ln2/−kを用いて計算した。
排出相(β相、最後の4回の測定時点)から計算した、本発明の融合タンパク質E4−Fc(配列番号117)の半減期は、50.6時間であった(図7参照)。
方法
標的タンパク質である、ヒトIL−17F(R&Dシステムズ(Systems))、マウスIL−17A(R&Dシステムズ)、ヒトTNFα(サーモ・サイエンティフィック(Thermo Scientific))、ヒトIL−6(R&Dシステムズ)、ウシ血清アルブミン(シグマ(Sigma))およびオボアルブミン(シグマ)を、マキシソープ(MaxiSorp)プレート(ヌンク(Nunc))に一晩コートした(濃度5μg/mlの各標的を100μl)。ウェルをPBSで3回洗浄し、200μlのPBS、4%ミルク(ラピライト(Rapilait)、ミグロス(Migros))でブロッキングし、PBSでの洗浄工程(上記の通り)の後、50μlの2C1(配列番号107)を最終濃度50nMで、50μlの抗myc抗体(9E10、自家製造、OD=2の貯蔵溶液をPBS、2%ミルクで1:250に希釈)と共にウェルに添加した。インキュベーションした後、ウェルをPBSで3回洗浄し、PBS、2%ミルクで1:1000に希釈した、100μlの抗マウスHRP免疫抱合体(シグマ)をウェルに添加した。96穴プレートを室温で1時間インキュベーションした後、PBS、0.1%Tweenで3回洗浄し、その後、PBSのみで3回洗浄した。100μlのBMブルーPOD基質(ロシュ)を加えて比色検出を行い、60μlの1M H2SO4で反応を停止した。
クローン2C1(配列番号107)は高特異性でヒトIL−17Aに結合し、ELISAで示した通り、他の被験タンパク質のいずれとも交差反応しなかった(図8)。IL−17Fについてバックグラウンド上に小さなシグナルが観察されたが、2C1がIL−17Fをコートしたバイアコア(BIAcore)チップにプローブ結合した場合、検出可能な結合は測定されなかった(データは示さず)。
方法
a)特異性
本発明のIL−17A結合ポリペプチドの結合特異性を定量するため、以下の標的タンパク質を使用した(実施例6より多い標的タンパク質)。
- ヒトIL−17A(R&Dシステムズ(Systems))
- ヒトIL−17B(ペプロテック(Peprotech))
- ヒトIL−17C(R&Dシステムズ)
- ヒトIL−17D(ペプロテック)
- ヒトIL−17E(ペプロテック)
- ヒトIL−17F(アブド・セロテック(Abd Serotec))
- マウスIL−17A(R&Dシステムズ)
- ラットIL−17A(アクロン・バイオテック(Akron Biotech))
- イヌIL−17A(R&Dシステムズ)
- カニクイザル(macaca fascicularis)IL−17A(E.Coliにおいて自家製造、単一ペプチドなし、C−末端グリシン残基の後、ヘキサヒスチジンタグを用いる、抱合体からリフォールディング、配列番号129)
- フィブロネクチンのエクストラドメインB(自家製造、E.coli;カルネモッラ(Carnemolla)ら(1996年)Int J Cancer,68(3),397−405頁参照)
- ヒトIL−6(R&Dシステムズ)
- ヒトTNFα(サーモ・サイエンティフィック(Thermo Scientific))
- オボアルブミン(シグマ(Sigma))
- BSA(シグマ)
親和性測定は、バイアコア(BIAcore)3000装置(バイアコア)を用いて実施した。カニクイザルIL−17Aと本発明のFyn SH3由来ポリペプチド2C1(配列番号107)との間の相互作用分析のため、CM5チップ(バイアコア)を6900 RUのカニクイザルIL−17Aでコートした。ランニングバッファーはHBS−EP(バイアコア)であった。相互作用は、流速20μl/分で種々の濃度の本発明のFyn SH3由来IL−17A結合ポリペプチド2C1(配列番号107)を注入することによって測定した。相互作用の速度論的データ(個別のkon/koff)は全て、BIAエバリュエーション3.2RC1ソフトウェアを用いて評価した。
本発明のFyn SH3由来ポリペプチド2C1(配列番号107)は、ヒトおよびカニクイザルIL−17Aに高特異性で結合し、ELISAで示した通り、他の被験タンパク質のいずれとも交差反応しなかった(図9)。
本発明のFyn SH3由来ポリペプチド2C1(配列番号107)を、IgG1のFc部分(2C1−Fc、配列番号130)に遺伝子的に融合させ、HEK EBNA細胞で発現させた。本発明のFyn SH3由来ポリペプチド2C1(配列番号107)は、変異体L234A(アミノ酸234位のロイシンに代わりアラニン)およびL235Aを含む、ヒトIgG1の修飾Fc部分への遺伝的融合としてもクローニングし、HEK EBNA細胞で発現した(2C1−Fc(LALA)、配列番号131)。さらに、本発明のFyn SH3由来ポリペプチドとFc部分との間のリンカーの長さが異なる、2C1−Fc(LALA)融合タンパク質の以下の4つの変異体を産生した:
・(配列番号133)“2C1−m5−Fc(LALA)”;5個のアミノ酸の伸長:GGGGSリンカー
・(配列番号134)“2C1−m10−Fc(LALA)”;10個のアミノ酸の伸長:(GGGGS)2リンカー
・(配列番号135)“2C1−m15E−Fc(LALA)”;15個のアミノ酸の伸長:(GGGGS)3リンカー
“2C1−Fc”のクローニング:ヒトIgG1抗体のFc部分に融合した、本発明のFyn SH3由来ポリペプチド2C1(配列番号107)、(配列番号130):クローン2C1(配列番号107)をコードする遺伝子をテンプレートとして用い、プライマーSB3(5’CGA ATT CGG GAG TGA CAC TCT TTG TGG CCC 3’、配列番号136)およびSB4(5’GAA GAT CTC TGG ATA GAG TCA ACT GGA GCC 3’、配列番号137)を用いて増幅して、制限部位EcoRIおよびBgIIIを導入した。得られたPCR産物を、EcoRIおよびBgIIIで消化し、先に二重消化したpFUSE−hlgG1−Fc2ベクター(インビボジェン(Invivogen))中にクローニングした。このFc融合体をpCEP4ベクター(インビトロジェン(Invitrogen))中にクローニングするため、2C1−Fc融合体をコードする遺伝子を含有する、得られたpFUSEベクターをテンプレートとして用い、プライマーSB5(5’CCC AAG CTT GGG ATG GGC TAC AGG ATG CAA CTC CTG TC 3’、配列番号138)およびSB6(5’CGG GAT CCT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG 3’、配列番号139)を用いて増幅して、HindIIIおよびBamHI制限部位を導入した。HindIII/BamHIで消化した後、挿入物を、先に二重消化したpCEP4ベクターに連結して、配列番号130の遺伝情報を含有するプラスミドを得た。
2C1−Fc(配列番号130)の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを2つのPCR反応のテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーSB5およびSB7(5’ACT GAC GGT CCC CCC GCG GCT TCA GGT GCT GGG CAC 3’、配列番号140)を使用した。第二のPCRでは、プライマーSB8(5’GCC GCG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CC 3’、配列番号141)およびSB6を使用した。テンプレートとして両断片を有するPCRアセンブリを実施し、得られたPCR産物をBamHIおよびHindIIIで消化し、上述の通り、消化したpCEP4ベクターと連結した。
2C1−Fc(LALA)(配列番号131)の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを、2回のPCRにテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーSB5および“Ba_2C1_R_EPKSS”(5’GCT GCT TTT CGG TTC CTG GAT AGA GTC AAC TGG AGC CAC 3’、配列番号142)を使用した。第二の反応では、プライマーSB6および“Ba_Hinge_F_EPKSS”(5’GAA CCG AAA AGC AGC GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG 3’、配列番号143)を使用した。テンプレートとして両断片を有するPCRアセンブリを実施し、得られたPCR産物をBamHIおよびHindIIIで消化し、上述の通り、消化したpCEP4ベクターと連結した。
2C1−Fc(LALA)(配列番号131)の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを、2回のPCRにテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーSB5および47c.fo(5’TGA ACC GCC TCC ACC CTG GAT AGA GTC AAC TGG AGC CAC 3’、配列番号144)を使用した。第二の反応では、プライマーSB6および“Ba_Hinge_F_5aaGS−リンカー”(5’GGT GGA GGC GGT TCA GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG 3’、配列番号145)を使用した。テンプレートとして両断片を有するPCRアセンブリを実施し、得られたPCR産物をBamHIおよびHindIIIで消化し、上述の通り、消化したpCEP4ベクターと連結した。
2C1−Fc(LALA)(配列番号131)の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを、2回のPCRにテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーSB5および47b.fo(5’AGA GCC ACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC CTG GAT AGA GTC AAC TGG AGC CAC 3’、配列番号146)を使用した。第二の反応では、プライマーSB6および“Ba_Hinge_F_10aaGS−リンカー”(5’GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG 3’、配列番号147)を使用した。テンプレートとして両断片を有するPCRアセンブリを実施し、得られたPCR産物をBamHIおよびHindIIIで消化し、上述の通り、消化したpCEP4ベクターと連結した。
2C1−Fc(LALA)(配列番号131)の遺伝情報を含有する上記のプラスミドを、2回のPCRにテンプレートとして使用した。第一の反応では、プライマーSB5および47.fo.corr(5’TGA TCC GCC ACC GCC AGA GCC ACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC CTG GAT AGA GTC AAC TGG AGC CAC 3’、配列番号148)を使用した。第二の反応では、プライマーSB6および“Ba_Hinge_F_15aaGS−リンカー”(5’GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCA GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG 3’、配列番号149)を使用した。テンプレートとして両断片を有するPCRアセンブリを実施し、得られたPCR産物をBamHIおよびHindIIIで消化し、上述の通り、消化したpCEP4ベクターと連結した。
本発明のFyn SH3由来Fc融合体を発現および精製することができた。図11は、Fc融合タンパク質のSDS PAGE分析を示す。
タンパク質薬は、患者に薬力学的効果を与え得るため、一定期間、血清中で安定であるべきである。この実施例では、2C1−Fc(配列番号130)の血清安定性を試験する。
10μg/mlの2C1−Fc(配列番号130)を含有するヒト血清(シグマ(Sigma))の3mlの溶液を調製し、37℃のインキュベーター中に置いた。指示した時点で200μlのサンプルを除き、実験の終了まで−20℃に凍結させた。5日後、回収したサンプルでELISAを実施したが、対照標準としてPBS中4℃で保管した2C1−Fcサンプル(配列番号130)を使用した。
ヒト血清中、37℃で5日間の保管期間の後、2C1−Fc(配列番号130)は、PBS中4℃で保管した2C1−Fc(配列番号130)と同様に、実質的にその標的であるIL−17Aに結合することができたが、このことは、2C1−Fc(配列番号130)がヒト血清中37℃で安定であることを示唆する(図12)。
この分析では、本発明の指示したFyn SH3由来ポリペプチドについて、インビトロでIL−17Aを阻害する能力を試験した。細胞分析は、本発明の実施例3に記載した細胞分析と同様であり、主な違いは、IL−17Aを1ng/mlの低濃度(実施例3の50ng/mlと比較して)でTNFαと共に用いることである。
試験した本発明のFyn−SH3由来IL−17A結合ポリペプチドのエンドトキシンレベルは、カブトガニ血球抽出物(LAL)試験(パイロジェント(PYROGENT)単一検査ゲル凝集LAL(ロンザ(Lonza)))によって測定したところ、0.1EU/ml未満であった。
NHDF細胞を、一定の濃度のIL−17A(1ng/ml)およびTNFα(50pg/ml)、並びに種々の濃度の市販のIL−17A受容体Fcキメラまたは種々の濃度の以下の本発明のFyn SH3由来ポリペプチドと共にインキュベーションした:
- 2C1(配列番号107)
- 2C1−Fc(配列番号130)
- 2C1−Fc(LALA)(配列番号131)
- 2C1−m5E(LALA)(配列番号132)
- 2C1−m5−Fc(LALA)(配列番号133)
- 2C1−m10−Fc(LALA)(配列番号134)
- 2C1−m15−Fc(LALA)(配列番号135)
本発明の融合タンパク質2C1−Fc(LALA)(配列番号131)のインビボの半減期を、単回静注後の種々の時点でマウス血清中の2C1−Fc(LALA)(配列番号131)の濃度を測定することにより定量した。
2C1−Fc(LALA)(配列番号131)溶液(0.2mg/ml)を、5匹のマウス(C57BL/6、チャールス・リバー(Charles River))に、各マウス200μlを静注した。指示した時点で、約20μlの血液を伏在静脈からキャピラリーであるマイクロベッテ(Microvette)CB300(サーステッド(Sarstedt))で採取した。血液サンプルを9500xgで10分間遠心分離し、ELISA分析を実施するまで、血清を−20℃で保管した。濃度が分っている2C1−Fc(LALA)(配列番号131)希釈系列を用いて、2C1−Fc(LALA)(配列番号131)の血清中の濃度をELISAによって定量した:50μlのビオチン化IL−17A(30nM)(R&Dシステムズ(Systems)、メーカーの使用説明書に従って、NHS−PEO4−ビオチン(ピアス(Pierce))を用いてビオチン化)を、ストレプトアビミンでコートしたウェル(リアクチバインド(Reactibind)、ピアス)に添加し、PBS、4%ミルク(ラピライト(Rapilait)、ミグロス(Migros)、スイス)でブロッキングした後、45μlのPBS、4%ミルクおよび5μlの血清サンプルを添加した。1時間インキュベーションし、洗浄した後、結合したFc融合タンパク質をプロテインA−HRP複合体(シグマ(Sigma))で検出した。ペルオキシダーゼ活性は、クアンタレッド(QuantaRed)を強化した化学蛍光HRP基質(ピアス)を添加することによって検出した。蛍光強度は、544nm(励起)および590nm(発光)で5〜10分後に測定した。種々の時点で血清中(各時点でマウス数n=5)定量した2C1−Fc(LALA)(配列番号131)の濃度および得られた排出相の傾きk(片対数目盛りにプロット)から、2C1−Fc(LALA)(配列番号131)の半減期を、式t1/2=ln2/−kを用いて計算した。
排出相(β相、最後から4回目の時点)から計算された、本発明の融合タンパク質2C1−Fc(LALA)(配列番号131)の半減期は、53時間であった(図13参照)。
ヒトIL−17Aは、マウスIL−17受容体に結合および刺激することができ、マウスKC(CXCL1)ケモカインの上昇およびその後の分泌を導く(アラン(Allan)B.ら(2007年)WO2007/070750,米国イーライ・リリー(Eli Lilly))。KC基礎レベルがおよそ100pg/mlであることと比較して、皮下IL−17A注射(3μg)の2時間後に観察されたKCレベルは、血清中、500および1000pg/mlの間であった。
a)本発明の単量体Fyn SH3由来ポリペプチド2C1(配列番号107)を用いる、インビボでのIL−17Aの中和
本発明のFyn SH3由来ポリペプチド2C1(配列番号107)(17μg)を、3μgのヒトIL−17A(R&Dシステムズ(Systems))とC57BL/6マウスに混注(皮下)し、注射の2時間後に、血液サンプルを、伏在静脈からキャピラリーであるマイクロベッテ(Microvette)CB300(サーステッド(Sarstedt))で採取した。血液サンプルを9500xgで10分間遠心分離し、ELISA分析を実施するまで、血清を−20℃で保管した。血清中のKCレベルは、市販のクアンティカイン(Quantikine)マウスCLCL1/KCキット(R&Dシステムズ)を用いて定量した。対照群は、結合特異性に関与しないタンパク質としてIL−17AおよびFyn SH3wtドメインを注射したマウス(グラブロフスキ(Grabulovski)ら(2007年)JBC,282,3196−3204頁参照)、PBSのみ、IL−17Aのみ、本発明のFyn SH3由来ポリペプチド2C1(配列番号107)のみを注射したマウス、またはFyn SH3wtタンパク質のみを投与したマウスであった。
本発明のFyn SH3由来ポリペプチド2C1−Fc(配列番号130)(44μg/マウス)を、C57BL/6マウスに静注した。20〜60分後、ヒトIL−17A(R&Dシステムズ(Systems))を3μg/マウス皮下注射し、IL−17A注射の2時間後に、血液サンプルを、伏在静脈からキャピラリーであるマイクロベッテ(Microvette)CB300(サーステッド(Sarstedt))で採取した。血液サンプルを9500xgで10分間遠心分離し、ELISA分析を実施するまで、血清を−20℃で保管した。血清中のKCレベルは、市販のクアンティカイン(Quantikine)マウスCLCL1/KCキット(R&Dシステムズ)を用いて定量した。対照群は、PBS(静注)およびIL−17A(皮下注)、PBSのみ(静注および皮下注)、および、本発明のFyn SH3由来ポリペプチド2C1−Fc(配列番号130)静注の後PBS(皮下注)したマウスであった。
ヒトIL−17Aをマウスに皮下注射した後、動物はKCと呼ばれるケモカインを過剰発現する。マウスの血清中、KCレベルの上昇はELISAによって測定し得る。本発明のFyn SH3由来ポリペプチドの注射により、KCのアップレギュレーションが阻止された。
IL−17Aおよび本発明の単量体Fyn SH3由来ポリペプチド2C1(配列番号107)をマウス(C57BL/6)に混注した。本発明の単量体Fyn SH3由来ポリペプチド2C1(配列番号107)の阻害特性のため、KCレベルはこの群において上昇せず、低いままであって、ほぼ基礎レベルと同等であった。KC産生の阻害が特異的IL−17A中和によることを実証するため、マウスにIL−17Aと野生型Fyn SH3ドメイン(IL−17Aに対する結合活性を有しない)を混注したが;これらのマウスでは、KCレベルはIL−17Aのみを投与した群と同程度の高さであった。図14は、この実験で得られた結果を示す。
この第二の急性炎症実験において、本発明のFyn SH3由来ポリペプチド2C1−Fc(配列番号130)を静注し、その後、IL−17Aを皮下注射した。上記a)の通り、本発明のFyn SH3由来ポリペプチドは、血清中のKCレベルのアップレギュレーションを阻止した。図15は、2C1−Fc(配列番号130)によるインビボでのIL−17Aの阻害を示す。
Claims (30)
- 下記よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記のポリペプチドがIL−17Aに結合する、ポリペプチド:
(i)(G/E)VTLFVALYDY−(X)a−D−(X)b−SFHKGEKF−(X)c−I−(X)d−G−(X)e−WW−(X)f−A−(X)g−SLTTG−(X)hGYIPSNYVAPVDSIQ (I)
式中、a〜hは0〜20であり、
好ましくは、aは1〜10であり、より好ましくは2〜8であり、最も好ましくは6であり;
好ましくは、bは0〜5であり、より好ましくは1〜3であり、最も好ましくは1であり;
好ましくは、cは0〜5であり、より好ましくは1〜3であり、最も好ましくは1であり;
好ましくは、dは1〜10であり、より好ましくは3〜9であり、最も好ましくは5または7であり;
好ましくは、eは0〜5であり、より好ましくは1〜3であり、最も好ましくは1であり;
好ましくは、fは0〜5であり、より好ましくは1〜3であり、最も好ましくは1であり;
好ましくは、gは0〜5であり、より好ましくは1〜3であり、最も好ましくは1であり;
好ましくは、hは0〜6であり、より好ましくは1〜3であり、最も好ましくは1または2である;
(ii)(i)に対して、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列;
(iii)(i)をコードする核酸の相補鎖に、好ましくはストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする核酸によってコードされる、アミノ酸配列;
(iv)少なくとも1つのアミノ酸の置換、付加および/または欠失によって誘導し得る、(i)〜(iii)の断片または機能性誘導体。 - 請求項1に記載のポリペプチドであって、ヒトIL−17Aに対する特異的な結合親和性を有し、好ましくはKDが10−7〜10−12M、より好ましくは10−8〜10−12M、最も好ましくは10−12M未満のヒトIL−17Aに対する特異的な結合親和性を有する、ポリペプチド。
- 配列番号1〜119よりなる群またはその機能性誘導体から選択される、請求項1または2のポリペプチド。
- 薬学的および/または診断学的有効成分に融合した請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
- 前記の成分がサイトカインであり、好ましくは、IL−2、IL−12、TNF−α、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL−10、IL−15、IL−24、GM−CSF、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−11、IL−13、LIF、CD80、B70、TNFβ、LT−β、CD−40リガンド、Fasリガンド、TGF−β、IL−1αおよびIL−1βよりなる群から選択される、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記の成分が毒性化合物であり、好ましくは低分子有機化合物またはポリペプチドであり、より好ましくは、カリケアマイシン、マイタンシノイド、ネオカルチノスタチン、エスペラマイシン、ジネマイシン、ケダルシジン、マデュロペプチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アウリスタチン、リシンA鎖、モデクシン、切断性緑膿菌外毒素A、ジフテリア毒素および組換えゲロニンよりなる群から選択される毒性化合物である、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記の成分がケモカインであり、好ましくは、IL−8、GROα、GROβ、GROγ、ENA−78、LDGF−PBP、GCP−2、PF4、Mig、IP−10、SDF−1α/β、BUNZO/STRC33、I−TAC、BLC/BCA−1、MIP−1α、MIP−1β、MDC、TECK、TARC、RANTES、HCC−1、HCC−4、DN−CK1、MIP−3α、MIP−3β、MCP−1−5、エオタキシン、エオタキシン−2、I−309、MPIF−1、6Ckine、CTACK、MEC、リンホタクチンおよびフラクタルカインよりなる群から選択される、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記の成分が蛍光色素であり、好ましくはアレクサフルオルまたはCy色素から選択される成分である、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記の成分が光増感剤であり、好ましくは光毒性赤色蛍光タンパク質キラーレッドまたはヘマトポルフィリンである、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記の成分が凝血促進因子であり、好ましくは組織因子である、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記の成分がプロドラッグ活性化酵素であり、好ましくは、カルボキシペプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼよりなる群から選択される酵素である、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記の成分が、γ放射性アイソトープの群からの放射性核種、好ましくは99mTc、123I、111Inであるか、または、ポジトロン放射体の群からの放射性核種、好ましくは18F、64Cu、68Ga、86Y、124Iであるか、または、β放射体の群からの放射性核種、好ましくは131I、90Y、177Lu、67Cuであるか、または、α放射体の群からの放射性核種、好ましくは213Bi、211Atである、請求項4に記載の融合タンパク質。
- 前記の成分が機能性Fcドメインであり、好ましくはヒト機能性Fcドメインであり、より好ましくは、請求項1〜3のいずれかの多量体ポリペプチド、好ましくは二量体ポリペプチドを含むヒト機能性Fcドメインである、請求項4に記載の融合タンパク質。
- さらに、血中半減期を調節する成分、好ましくは、ポリエチレングリコール(PEG)、免疫グロブリンおよびアルブミン結合ペプチドよりなる群から選択される成分を含む、請求項1〜13のいずれかに記載のポリペプチドまたは融合タンパク質。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のポリペプチドを含む、請求項4〜14のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 配列番号1〜119からよりなる群から選択されるポリペプチドまたはその機能性誘導体を含む、融合タンパク質。
- 請求項1〜3のいずれかのポリペプチドの多量体、好ましくは二量体または三量体を含む、請求項1〜3のいずれかのポリペプチドまたは請求項4〜16のいずれかの融合タンパク質。
- 下記を含む、単離され、精製された核酸:
(i)請求項1または2に記載のポリペプチドをコードする核酸、好ましくは
(G/E)VTLFVALYDY−(X)6−D−(X)−SFHKGEKF−(X)1−I−(X)5−7−G−(X)1−WW−(X)−A−(X)−SLTTG−(X)1−2−GYIPSNYVAPVDSIQ
をコードする核酸;
(ii)(i)の核酸配列に対して、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性をもつ配列を有する核酸;
(iii)(i)または(ii)の核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸;
(iv)核酸であって、前記の核酸が、(i)、(ii)または(iii)の核酸のうちの1つの置換、付加および/または欠失によって誘導し得る、核酸;
(v)(i)〜(iv)の核酸のいずれか1つの断片であって、請求項1または2に記載のポリペプチドをコードする(i)の核酸の相補鎖にハイブリダイズする、断片。 - 請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする、請求項18の核酸。
- 前記の核酸がDNA、PNAまたはRNAである、請求項18または19の核酸。
- 前記の核酸がプロモータに、好ましくは、T5プロモータ/lacオペレータエレメント、T7プロモータ/lacオペレータエレメントよりなる原核生物プロモータの群、またはhEF1−HTLV、CMV enh/hFerLプロモータよりなる真核生物プロモータの群から選択されるプロモータに、動作可能に連結されている、請求項18〜20のいずれか一項の核酸。
- 組換えベクターであって、請求項18〜21のいずれか一項の核酸を含み、ベクターは好ましくは請求項1〜17のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは融合タンパク質を生産ことができる、組換えベクター。
- 請求項22に記載の組換えベクターであって、pQEベクター、pETベクター、pFUSEベクター、pUCベクター、YACベクター、ファージミドベクター、ファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等の遺伝子治療に使用されるベクターよりなる群から選択される、組換えベクター。
- 前記請求項のいずれかに記載の核酸および/またはベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
- 請求項26に記載のモノクローナル抗体を発現する、ハイブリドーマ細胞株。
- 前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド若しくは融合タンパク質、核酸および/または組換えベクター、および薬学的に許容される担体を含んでいてもよい、医薬組成物。
- 前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド若しくは融合タンパク質、核酸および/または組換えベクターの、医薬の、好ましくは、IL−17A−およびTh17−関連疾患または医学的状態よりなる群から選択される疾患または医学的状態の治療および/または予防のための医薬の製造のための、使用。
- 疾患または医学的状態が、炎症性、自己免疫および/または骨量減少関連疾患および医学的状態から選択される、請求項28の使用。
- 疾患または医学的状態が、関節炎、好ましくは関節リウマチ、慢性進行性関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎および変形性関節炎、リウマチ性疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、ライター症候群、過敏症(気道過敏症および皮膚過敏症の両者を含む)、アレルギー、全身性エリテマトーデス、炎症性筋疾患、多発性軟骨炎、浮腫性硬化症、ヴェーゲナー肉芽腫、皮膚筋炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群、内分泌性眼症、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病(1型糖尿病)、自己免疫性血液疾患、溶血性貧血、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少症、ブドウ膜炎(前部および後部)、乾性角結膜炎、春季カタル、間質性肺線維症、糸宮体腎炎(ネフローゼ症候群を伴う、および、伴わず)、特発性ネフローゼ症候群または微小変化ネフロパシー、腫瘍、皮膚の炎症性疾患、角膜炎、筋炎、骨インプラントの弛緩、代謝異常、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および脂質異常症、骨量の減少、変形性関節症、骨粗しょう症、閉塞性または炎症性気道疾患の歯周病、喘息、気管支炎、塵肺、肺気腫、急性および超急性炎症反応、IL−17A介在性TNF−α関連疾患、急性感染症、敗血性ショック、内毒素性ショック、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、肺炎、重度の熱傷、悪液質消耗症候群、脳卒中、ヘルペス性間質性角膜炎およびドライアイ疾患よりなる群から選択される、請求項28および30に記載の使用。
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