KR102176469B1 - 요법에 사용하기 위한 항-아드레노메둘린 (adm) 항체 또는 항-adm 항체 단편 또는 항-adm 비-ig 스캐폴드 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용의 주제는 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이고, 여기서 상기 항체 또는 상기 단편 또는 스캐폴드는 각각 비-중화 항체, 항체 단편 또는 비-Ig 스캐폴드이다. 본 개시내용의 주제는 또한 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이고, 여기서 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 아드레노메둘린 안정화 항체 단편 또는 ADM 안정화 비-Ig 스캐폴드이고/이거나, 상기 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 ADM의 생물활성을 80% 이하, 또는 50% 이하로 차단한다.

Description

요법에 사용하기 위한 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-IG 스캐폴드 {ANTI-ADRENOMEDULLIN (ADM) ANTIBODY OR ANTI-ADM ANTIBODY FRAGMENT OR AN ANTI-ADM NON-IG SCAFFOLD FOR USE IN THERAPY}
본 발명의 주제는 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이고, 여기서 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는 비-중화 항체이다.
본 발명의 주제는 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이고, 여기서 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는
· 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 ADM 안정화 항체 단편 또는 ADM 안정화 비-Ig 스캐폴드이고/이거나,
· 상기 ADM 안정화 항체 또는 아드레노메둘린 안정화 항체 단편 또는 ADM 안정화 비-Ig 스캐폴드는 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단한다.
상기 진술된 것은 ADM 생물활성을 각각 80% 이하 또는 50% 이하로 차단한다는 의미이고, 따라서 ADM 안정화 항체 또는 항체 단편 또는 비-Ig 스캐폴드인 각각의 ADM 결합제에 의한 ADM 생물활성의 제한된 차단 또는 ADM 생물활성의 감소로서 이해해야 한다. 함축적으로, 이것은 ADM 생물활성이 남아있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 80% 이하의 ADM 생물활성을 차단하는 경우에, 즉 약 20% 잔류 ADM 생물활성이 존재한다. 50% 이하의 ADM 생물활성을 차단하는 경우에, 즉 약 50% 잔류 ADM 생물활성이 존재한다.
본 발명의 주제는 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이고, 여기서 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는 인간 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 주제는 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이고, 여기서 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는 인간 아드레노메둘린의 N-말단 단부 (aa 1)에 결합한다.
펩티드 아드레노메둘린 (ADM)은 인간 크롬친화세포종으로부터 단리된, 52개 아미노산을 포함하는 신규한 혈압저하 펩티드로서 1993년에 처음으로 설명되었다 (서열 21) (문헌 [Kitamura, K., et al., "Adrenomedullin: A Novel Hypotensive Peptide Isolated From Human Pheochromocytoma", Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 192 (2), pp. 553-560 (1993)]). 같은 해에, 185개 아미노산을 포함하는 전구체 펩티드를 코딩하는 cDNA 및 상기 전구체 펩티드의 완전한 아미노산 서열이 또한 설명되었다. 특히, N-말단에서 21개 아미노산의 신호 서열을 포함하는 전구체 펩티드를 "프리프로아드레노메둘린" (pre-proADM)으로서 칭한다. 본 설명에서, 명시된 모든 아미노산 위치는 대체로 185개 아미노산을 포함하는 pre-proADM에 관련된다. 펩티드 아드레노메둘린 (ADM)은 52개 아미노산 (서열 21)을 포함하고 pre-proADM의 아미노산 95 내지 146을 포함하는 펩티드이다 (이로부터 단백질 분해에 의한 절단에 의해 형성된다). 지금까지, pre-proADM의 절단에서 형성된 펩티드 단편의 실질적으로 단지 몇몇의 단편만, 특히 생리학적 활성 펩티드 아드레노메둘린 (ADM) 및 "PAMP" (pre-proADM에서 신호 펩티드의 21개 아미노산에 이어지는 20개 아미노산 (22-41)을 포함하는 펩티드)가 보다 정확하게 특성 결정되었다. 1993년에 ADM의 발견 및 특성 결정이 집중적인 연구 활동을 촉발하였고, 그 결과는 다양한 검토 논문에 요약되어 있고, 본 설명의 맥락에서 특히 ADM에 집중된 "펩티드"의 논점에서 발견되는 논문을 특히 참조한다 (문헌 [Editorial, Takahashi, K., "Adrenomedullin: from a pheochromocytoma to the eyes", Peptides, Vol. 22, p.1691 (2001)] 및 [Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, Vol. 22, pp.1693-1711 (2001)]). 추가의 검토는 문헌 [Hinson, et al., "Adrenomedullin, a Multifunctional Regulatory Peptide", Endocrine Reviews, Vol. 21(2), pp.138-167 (2000)]에서 발견된다. 지금까지의 학술 조사에서, 특히 ADM은 다기능성 조절 펩티드로서 여겨질 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이것은 글리신에 의해 연장된 불활성 형태로 순환혈로 방출된다 (문헌 [Kitamura, K., et al., "The intermediate form of glycine-extended adrenomedullin is the major circulating molecular form in human plasma", Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 244(2), pp.551-555 (1998), 초록 부분만]). 또한, ADM에 특이적이고 아마도 ADM의 효과를 조정하는 결합 단백질이 존재한다 (문헌 [Pio, R., et al., "Complement Factor H is a Serum-binding Protein for adrenomedullin, and the Resulting Complex Modulates the Bioactivities of Both Partners", The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276(15), pp.12292-12300 (2001)]). 지금까지의 연구에서 일차적으로 중요한 ADM 및 PAMP의 생리학적 효과는 혈압에 미치는 영향이었다.
따라서, ADM은 효과적인 혈관확장물질이고, 따라서 혈압저하 효과를 ADM의 C-말단 부분 내의 특정 펩티드 절편과 연관시키는 것이 가능하다. pre-proADM으로부터 형성된 상기 언급된 추가의 생리학적 활성 펩티드 PAMP도 ADM과 상이한 작용 메카니즘을 갖는 것으로 보이지만, 마찬가지로 혈압저하 효과를 나타내는 것으로 추가로 밝혀졌다 (상기 언급한 검토 문헌에 추가로 문헌 [Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, Vol. 22, pp.1693-1711 (2001)] 및 [Hinson, et al., "Adrenomedullin, a Multifunctional Regulatory Peptide", Endocrine Reviews, Vol. 21(2), pp.138-167 (2000)], 또한 [Kuwasako, K., et al., "Purification and characterization of PAMP-12 (PAMP-20) in porcine adrenal medulla as a major endogenous biologically active peptide", FEBS Lett, Vol. 414(1), pp.105-110 (1997), 초록 부분만], [Kuwasaki, K., et al., "Increased plasma proadrenomedullin N-terminal 20 peptide in patients with essential hypertension", Ann. Clin. Biochem., Vol. 36 (Pt.5), pp.622-628 (1999), 초록 부분만] 또는 [Tsuruda, T., et al., "Secretion of proadrenomedullin N-terminal 20 peptide from cultured neonatal rat cardiac cells", Life Sci., Vol. 69(2), pp.239-245 (2001), 초록 부분만] 및 EP-A2 0 622 458 참조). 많은 병리학적 상태에서 순환혈 및 다른 생물학적 액체 내에서 측정할 수 있는 ADM의 농도가 건강한 대조군 사람에서 발견된 농도를 유의하게 초과하는 것으로 추가로 밝혀졌다. 따라서, 울혈성 심부전, 심근 경색, 신장 질환, 고혈압 장애, 당뇨병 환자에서, 쇼크의 급성기에, 및 패혈증 및 패혈성 쇼크에서 ADM 수준은 상이한 정도이기는 하지만 유의하게 증가된다. PAMP 농도는 또한 몇몇의 상기 병리학적 상태에서 증가하지만, 혈장 수준은 ADM에 비해 더 낮다 (문헌 [Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, Vol. 22, pp. 1693-1711 (2001); page 1702]). 또한, 비정상적으로 높은 농도의 ADM은 패혈증에서 관찰되고, 패혈성 쇼크에서 최고 농도가 관찰될 것으로 알려져 있다 (문헌 [Eto, T., "A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides", Peptides, Vol. 22, pp. 1693-1711 (2001)] 및 [Hirata, et al., "Increased Circulating Adrenomedullin, a Novel Vasodilatory Peptide, in Sepsis", Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol 81(4), pp. 1449-1453 (1996)], [Ehlenz, K., et al., "High levels of circulating adrenomedullin in severe illness: Correlation with C-reactive protein and evidence against the adrenal medulla as site of origin", Exp Clin Endocrinol Diabetes, Vol. 105, pp. 156-162 (1997)], [Tomoda, Y., et al., "Regulation of adrenomedullin secretion from cultured cells", Peptides, Vol. 22, pp. 1783-1794 (2001)], [Ueda, S., et al., "Increased Plasma Levels of Adrenomedullin in Patients with Systemic Inflammatory Response Syndrome", Am. J. Respir. Crit. Care Med., Vol. 160, pp. 132-136 (1999)] 및 [Wang, P., "Adrenomedullin and cardiovascular responses in Sepsis", Peptides, Vol. 22, pp. 1835-1840 (2001)] 참조).
또한, 진단 목적, 특히 패혈증 진단, 심장 진단 및 암 진단을 위해 생물학적 액체에서 아드레노메둘린 면역반응성을 확인하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에 따르면, 전체 프리-프로아드레노메둘린의 아미노산 (45-92)을 함유하는 프로아드레노메둘린의 중앙 영역의 부분 펩티드는 특히 미드(mid)-proADM의 서열을 특이적으로 인지하는 적어도 하나의 표지된 항체를 이용하는 면역검정으로 측정한다 (WO2004/090546).
WO-A1 2004/097423에는 심혈관 장애의 진단, 예상, 및 치료를 위한, 아드레노메둘린에 대한 항체의 용도가 기재되어 있다. 또한, ADM 수용체를 차단함으로써 질환을 치료하는 것도 당업계에서 설명된 바 있고 (예를 들어 WO-A1 2006/027147, PCT/EP2005/012844), 상기 질환은 패혈증, 패혈성 쇼크, 심혈관 질환, 감염, 피부 질환, 내분비 질환, 대사 질환, 위장 질환, 암, 염증, 혈액 질환, 호흡기 질환, 근골격 질환, 신경 질환, 비뇨기 질환일 수 있다.
패혈증의 초기에 대해 ADM이 심장 기능 및 간, 비장, 신장 및 소장에서의 혈액 공급을 개선함이 보고되었다. ADM-중화 항체는 패혈증의 초기 동안 이전에 언급된 효과를 중화한다 (문헌 [Wang, P., "Adrenomedullin and cardiovascular responses in sepsis", Peptides, Vol. 22, pp. 1835-1840 (2001)]).
패혈증의 후기, 즉 패혈증의 활력감퇴기에, ADM은 패혈성 쇼크 환자의 사망과 강하게 연관되는 위험 인자를 구성한다 (문헌 [Schuetz et al., "Circulating Precursor levels of endothelin-1 and adrenomedullin, two endothelium-derived, counteracting substances, in sepsis", Endothelium, 14:345-351, (2007)]). 위독한 환자, 예를 들어 매우 후기의 패혈증에서의 진단 및 치료 방법, 및 위독한 환자의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 혈관 수축 활성을 갖는 엔도텔린 및 엔도텔린 효능제의 용도가 WO-A1 2007/062676에 기재되어 있다. 엔도텔린 및/또는 엔도텔린 효능제 대신에, 또는 이와 조합하여, 아드레노메둘린 길항제, 즉 예를 들어 그의 관련 수용체를 차단함으로써 아드레노메둘린의 혈관확장 작용을 억제하거나 약화시키는 분자, 또는 아드레노메둘린의 그의 수용체에 대한 결합을 억제하는 물질 (예를 들어, 특이적 결합제, 예컨대 아드레노메둘린에 결합하여 그의 수용체 결합 부위를 차단하는 항체; "면역 중화")을 사용하는 것이 WO-A1 2007/062676에 추가로 기재되어 있다. 상기 용도, 또는 후속적인 또는 선행하는 별개의 사용을 포함하는 조합된 용도는 특정한 경우에 예를 들어 치료 성공을 개선하기 위해 또는 바람직하지 않은 생리적 스트레스 또는 부작용을 방지하기 위해 바람직한 것으로 설명되었다. 따라서, 중화 ADM 항체는 패혈증의 후기에 패혈증을 치료하기 위해 사용될 수 있음이 보고된다.
ADM-결합-단백질-1과 조합한 ADM의 투여는 당업계에 패혈증 및 패혈성 쇼크의 치료를 위한 것으로 설명되었다. ADM 및 ADM-결합-단백질-1을 사용한 패혈증 동물의 치료는 패혈증의 후기로의 이행을 억제한다고 가정된다. 살아있는 유기체에서 ADM 결합 단백질 (보체 인자 H)은 상기 유기체의 순환계에 높은 농도로 존재함을 유의하여야 한다 (문헌 [Pio et al.: Identification, characterization, and physiological actions of factor H as an Adrenomedullin binding Protein present in Human Plasma; Microscopy Res. and Technique, 55:23-27 (2002)] 및 [Martinez et al.; Mapping of the Adrenomedullin-Binding domains in Human Complement factor H; Hypertens Res Vol. 26, Suppl (2003), S56-59]).
본 발명에 따르면, ADM-결합-단백질-1은 ADM-결합-단백질-1 (보체 인자 H)로도 언급될 수 있다.
따라서, ADM의 투여는 예를 들어 패혈증과 같은 질환의 초기에 유용할 수 있지만, 패혈증의 후기에는 유해할 수 있다. 항-ADM 항체의 투여시에는 그 반대일 수 있다. 또한, ADM 또는 항-ADM 항체의 적용시에 용량이 중요할 수 있다.
다른 질환에 대해, ADM의 차단은 특정 정도로 유익할 수 있다. 그러나, 특정량의 ADM이 여러 생리적 기능에 필요하기 때문에 ADM이 완전히 중화되면 유해할 수 있다. 많은 보고서에서, ADM의 투여가 특정 질환에 유용할 수 있음이 강조되었다. 이와 대조적으로, 다른 보고서에서 ADM은 특정 병태에서 투여될 때 치명적일 수 있는 것으로 보고되었다. 선행 기술의 단점은 본 발명에서 제공되는 항-ADM 항체 또는 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드를 사용하여 극복될 수 있다.
본 발명의 주제는 의약으로서 사용하기 위한 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 아드레노메둘린에 결합하는 항-ADM 항체 단편 또는 아드레노메둘린에 결합하는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이고, 여기서 상기 항체 또는 상기 단편 또는 상기 스캐폴드는 비-중화 항체 또는 단편 또는 스캐폴드이다.
도 1a:
항체 포맷의 예시 - Fv 및 scFv-변이체
도 1b:
항체 포맷의 예시 - 이종 융합체 및 이기능성 항체
도 1c:
항체 포맷의 예시 - 2가 항체 및 이중특이적 항체
도 2:
hADM 1-52 (서열 21)
mADM 1-50 (서열 22)
인간 ADM의 aa 1-21 (서열 23)
인간 ADM의 aa 1-42 (서열 24)
인간 ADM의 aa 43-52 (서열 25)
인간 ADM의 aa 1-14 (서열 26)
인간 ADM의 aa 1-10 (서열 27)
인간 ADM의 aa 1-6 (서열 28)
성숙 인간 ADM의 aa 1-32 (서열 29)
성숙 뮤린 ADM의 aa 1-40 (서열 30)
성숙 뮤린 ADM의 aa 1-31 (서열 31)
도 3:
a: 인간 ADM의 용량 반응 곡선. 최대 cAMP 자극은 100% 활성화로 조정되었다.
b: 5.63 nM hADM의 존재 하에 인간 ADM 22-52 (ADM-수용체 길항제)의 용량/억제 곡선.
c: 5.63 nM hADM의 존재 하에 CT-H의 용량/억제 곡선.
d: 5.63 nM hADM의 존재 하에 MR-H의 용량/억제 곡선.
e: 5.63 nM hADM의 존재 하에 NT-H의 용량/억제 곡선.
f: 마우스 ADM의 용량 반응 곡선. 최대 cAMP 자극은 100% 활성화로 조정되었다.
g: 0.67 nM mADM의 존재 하에 인간 ADM 22-52 (ADM-수용체 길항제)의 용량/억제 곡선.
h: 0.67 nM mADM의 존재 하에 CT-M의 용량/억제 곡선.
i: 0.67 nM mADM의 존재 하에 MR-M의 용량/억제 곡선.
j: 0.67 nM mADM의 존재 하에 NT-M의 용량/억제 곡선.
k: F(ab)2 NT-M 및 Fab NT-M에 의한 ADM의 억제를 보여준다.
l: F(ab)2 NT-M 및 Fab NT-M에 의한 ADM의 억제를 보여준다.
도 4:
본 도면은 전형적인 hADM 용량/신호 곡선을 보여준다. 100 ㎍/mL 항체 NT-H의 존재 하에 hADM 용량 신호 곡선도 보여준다.
도 5:
본 도면은 NT-H 항체의 부재 및 존재 하에 인간 혈장 (시트레이트) 내에서 hADM의 안정성을 보여준다.
도 6:
Fab와 상동성 인간 프레임워크 서열의 정렬.
도 7:
본 도면은 NT-M을 사용한 초기 및 후기 치료에 대한 노르아드레날린 요구치를 보여준다.
도 8:
본 도면은 NT-M을 사용한 초기 및 후기 치료 후에 요 생산을 보여준다.
도 9:
본 도면은 NT-M을 사용한 초기 및 후기 치료 후에 유체 균형을 보여준다.
도 10:
전기영동 운동성 이동 검정 (EMSA)에 의해 분석된 B 세포 내의 핵 인자 카파-경쇄 유전자 인핸서 (NF-κB)의 간 조직 활성화. #는 비히클에 비해 p<0.001을 나타낸다.
도 11:
시간 경과에 따른 혈청 크레아티닌의 전개. 평균+/-SEM을 제시한다.
도 12:
시간 경과에 따른 혈액 요소 질소 (BUN)의 전개. 평균+/-SEM을 제시한다.
도 13:
시간 경과에 따른 내인성 크레아티닌 클리어런스의 전개. 평균+/-SEM을 제시한다.
도 14:
시간 경과에 따른 Na+의 분획 분비의 전개. 평균+/-SEM을 제시한다.
도 15:
추출된 총 신장 단백질에 비교하여 측정된 각질세포-유래 케모카인 (KC) 수준. 백색 상자그림 (box-plot)은 비히클을 사용하여 얻어진 결과를 보여주고, 회색 상자그림은 NT-M을 사용한 치료 후 얻어진 결과를 보여준다.
도 16:
추출된 총 간 단백질에 비교하여 결정된 각질세포-유래 케모카인 (KC) 수준. 백색 상자그림은 비히클을 사용하여 얻어진 결과를 보여주고, 회색 상자그림은 NT-M을 사용한 치료 후 얻어진 결과를 보여준다.
도 17:
혈장 IL-6 수준. 백색 상자그림은 비히클을 사용하여 얻어진 결과를 보여주고, 회색 상자그림은 NT-M을 사용한 치료 후 얻어진 결과를 보여준다.
도 18:
혈장 IL-10 수준. 백색 상자그림은 비히클을 사용하여 얻어진 결과를 보여주고, 회색 상자그림은 NT-M을 사용한 치료 후 얻어진 결과를 보여준다.
도 19:
혈장 각질세포-유래 케모카인 (KC) 수준. 백색 상자그림은 비히클을 사용하여 얻어진 결과를 보여주고, 회색 상자그림은 NT-M을 사용한 치료 후 얻어진 결과를 보여준다.
도 20:
혈장 단핵구 화학주성 단백질-1 (MCP-1) 수준. 백색 상자그림은 비히클을 사용하여 얻어진 결과를 보여주고, 회색 상자그림은 NT-M을 사용한 치료 후 얻어진 결과를 보여준다.
도 21:
혈장 TNF-알파 수준. 백색 상자그림은 비히클을 사용하여 얻어진 결과를 보여주고, 회색 상자그림은 NT-M을 사용한 치료 후 얻어진 결과를 보여준다.
도 22:
시간 경과에 따른 혈액 요소 질소 (BUN)의 전개. 평균+/-SEM을 제시한다.
도 23:
시간 경과에 따른 혈청 크레아티닌의 전개. 평균+/-SEM을 제시한다.
도 24:
시간 경과에 따른 내인성 크레아티닌 클리어런스의 전개. 평균+/-SEM을 제시한다.
명세서 전체에서, 본 발명에 따른 "항체", 또는 "항체 단편" 또는 "비-Ig 스캐폴드"는 ADM에 결합할 수 있고, 따라서 ADM에 대해 작용하고, 따라서 "항-ADM 항체", "항-ADM 항체 단편", 또는 "항-ADM 비-Ig 스캐폴드"로 언급될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 항-ADM 항체, 항-ADM 항체 단편, 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 순환 ADM에 결합할 수 있고, 따라서 순환 ADM에 대해 작용한다.
구체적인 실시양태에서, 상기 항-ADM 항체, 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 비-중화 항체, 단편 또는 비-Ig 스캐폴드이다. 중화 항-ADM 항체, 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 ADM의 생물활성을 거의 100%, 적어도 90% 초과, 바람직하게는 적어도 95% 초과로 차단할 것이다.
이와 대조적으로, 비-중화 항-ADM 항체, 또는 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 ADM의 생물활성을 100% 미만, 바람직하게는 95% 미만, 바람직하게는 90% 미만, 보다 바람직하게는 80% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 50% 미만 (기준선 값)으로 차단한다. 이것은 비-중화 항-ADM 항체, 또는 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드에 결합된 ADM의 잔류 생물활성이 0% 초과, 바람직하게는 5% 초과, 바람직하게는 10% 초과, 보다 바람직하게는 20% 초과, 보다 바람직하게는 50% 초과일 것임을 의미한다. 이것은 ADM 생물활성을 각각 80% 이하 또는 50% 이하로 차단한다는 의미이고, 따라서 항-ADM 항체 또는 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드인 각각의 ADM 결합제에 의한 ADM 생물활성의 제한된 차단으로서 이해해야 한다.
상기 ADM의 생물활성의 제한된 차단은 심지어 항체, 항체 단편 또는 비-Ig 스캐폴드의 과량의 농도에서도 발생하는 것으로 이해되었고, 이것은 ADM에 대한 과량의 항체, 단편 또는 스캐폴드를 의미한다. 상기 제한된 차단은 ADM 결합제 자체의 고유한 특성이다. 이것은 상기 항체, 단편 또는 스캐폴드의 최대 억제가 각각 80% 또는 50%임을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항-ADM 항체, 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 ADM의 생물활성을 적어도 5% 차단할 것이다. 이것은 - 함축적으로 - 약 95%의 잔류 ADM 생물활성이 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명의 주제는 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편이고, 상기 항체 또는 단편은
· 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편이고/이거나,
· 상기 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편은 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단한다.
본 발명의 주제는 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편이고, 상기 항체 또는 단편은 인간 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 주제는 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편이고, 상기 항체 또는 단편은 인간 아드레노메둘린의 N-말단 단부에 결합한다.
상기 맥락에서, 예를 들어 ADM의 생물활성을 80% 미만으로 차단하는, 간결함을 위해 본원에서 "비-중화" 항-ADM 항체, 항체 단편, 또는 비-Ig 스캐폴드로서 집합적으로 언급되는 "비-중화 항-ADM 활성"을 갖는 항체, 또는 항체 단편 또는 비-Ig 스캐폴드인 분자(들)은
- CRLR (칼시토닌 수용체 유사 수용체) 및 RAMP3 (수용체-활성 변형 단백질 3)로 이루어진 기능성 인간 재조합 ADM 수용체를 발현하는 진핵 세포주의 배양액에 첨가시에 동시에 첨가되는 인간 합성 ADM 펩티드의 작용을 통해 세포주에 의해 생산되는 cAMP의 양을 감소시키는 ADM에 결합하는 분자 또는 분자들로서 규정되고, 여기서 상기 첨가된 인간 합성 ADM은 분석되는 비-중화 항체의 부재 하에 cAMP 합성의 자극 최대치의 1/2을 유도하는 양으로 첨가되고, ADM에 결합하는 상기 분자(들)에 의한 cAMP의 감소는 분석되는 ADM에 결합하는 비-중화 분자(들)이 분석되는 비-중화 항체를 사용하여 얻을 수 있는 cAMP 합성의 최대 감소를 얻기 위해 필요한 양보다 10배 더 많은 양으로 첨가될 경우에도 80% 이하인 정도로 발생한다.
동일한 정의가 다른 범위, 즉 95%, 90%, 50% 등에도 적용된다.
생물활성은 그의 상호작용 후에 생체내에서 또는 시험관내에서 (예를 들어 검정에서) 살아있는 유기체 또는 조직 또는 장기 또는 기능 단위에 대해 물질이 보이는 효과로서 규정된다. ADM 생물활성의 경우에, 이것은 인간 재조합 아드레노메둘린 수용체 cAMP 기능성 검정에서 ADM의 효과일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 생물활성은 아드레노메둘린 수용체 cAMP 기능성 검정을 통해 규정된다. 상기 검정에서 ADM의 생물활성을 결정하기 위해 다음 단계를 수행할 수 있다:
- 용량 반응 곡선은 상기 인간 재조합 아드레노메둘린 수용체 cAMP 기능성 검정에서 ADM을 사용하여 작성한다.
- cAMP 자극 최대치의 1/2의 ADM-농도를 계산할 수 있다.
- 일정한 cAMP-자극 최대치의 1/2의 ADM-농도에서 용량 반응 곡선 (100 ㎍/ml 이하의 최종 농도)은 각각 ADM 안정화 항체 또는 아드레노메둘린 안정화 항체 단편 또는 아드레노메둘린 안정화 비-Ig 스캐폴드에 의해 작성한다.
상기 ADM 생물학적 검정에서 50%의 최대 억제는 상기 항-ADM 항체 또는 상기 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 상기 항-아드레노메둘린 비-Ig 스캐폴드가 각각 생물활성을 기준선 값의 50%로 차단함을 의미한다. 상기 ADM 생물학적 검정에서 80%의 최대 억제는 상기 항-ADM 항체 또는 상기 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 상기 항-아드레노메둘린 비-Ig 스캐폴드가 각각 ADM의 생물활성을 80%까지 차단함을 의미한다. 이것은 ADM 생물활성을 80% 이하까지 차단한다는 의미이다. 이것은 약 20%의 잔류 ADM 생물활성이 존재함을 의미한다.
그러나, 본원 명세서에 의해 및 상기 맥락에서 본원에 개시된 항-ADM 항체, 항-ADM 항체 단편, 및 항-ADM 비-Ig 스캐폴드와 관련하여 표현 "ADM의 생물활성을 차단한다"는 단지 ADM의 생물활성을 감소시키는, 바람직하게는 순환 ADM 생물활성을 100%로부터 최대 20%의 잔류 ADM 생물활성으로 감소시키는, 바람직하게는 ADM 생물활성을 100%로부터 50%의 잔류 ADM 생물활성으로 감소시키는 것으로 이해되어야 하지만; 어떠한 경우에도, 상기 상세히 설명한 바와 같이 결정될 수 있는 잔류하는 ADM 생물활성이 존재한다.
ADM의 생물활성은 실시예 2에 따른 인간 재조합 아드레노메둘린 수용체 cAMP 기능성 검정 (아드레노메둘린 생물학적 검정)으로 결정할 수 있다.
항-아드레노메둘린 (ADM) 항체는 ADM에 특이적으로 결합하는 항체이고, 항-아드레노메둘린 항체 단편은 ADM 항체의 단편이고, 상기 단편은 ADM에 특이적으로 결합한다. 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 ADM에 특이적으로 결합하는 비-Ig 스캐폴드이다. ADM에 대한 특이적 결합은 또한 다른 항원에 대한 결합을 허용한다. 이것은 상기 특이성이, 그에 대해 항체가 생성된 폴리펩티드 이외의 다른 폴리펩티드와 항체가 교차반응할 수 있다는 것을 배제하지 않는 것임을 의미한다. 또한, 이것은 본 발명에 따른 항-ADM 항체 단편, 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드의 특이성에도 적용된다.
놀랍게도, 비-중화 항-ADM 항체 또는 비-중화 항-ADM 항체 단편 또는 비-중화 항-ADM 비-Ig 스캐폴드가 중화 항체보다 유의한 치료상 이점을 제공함이 입증되었다.
하나의 구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 항-아드레노메둘린 항체 또는 상기 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 아드레노메둘린 안정화 항체 단편 또는 아드레노메둘린 안정화 비-Ig 스캐폴드이다.
ADM의 반감기 (체류 시간의 1/2)는 ADM의 정량을 위한 면역검정을 사용하여 각각 ADM 안정화 항체 또는 아드레노메둘린 안정화 항체 단편 또는 아드레노메둘린 안정화 비-Ig 스캐폴드의 부재 및 존재 하에 인간 혈장에서 결정될 수 있다.
다음 단계를 수행할 수 있다:
- ADM을 각각 ADM 안정화 항체 또는 아드레노메둘린 안정화 항체 단편 또는 아드레노메둘린 안정화 비-Ig 스캐폴드의 부재 및 존재 하에 인간 시트레이트 혈장에 희석할 수 있고, 24℃에서 인큐베이션할 수 있다.
- 분취액을 선택된 시점 (예를 들어 24시간 내)에 채취하고, -20℃에서 동결함으로써 상기 분취액 내에서 ADM의 분해를 중지시킬 수 있다.
- ADM의 양은 선택된 검정이 안정화 항체에 의해 영향받지 않으면 직접 hADM 면역검정에 의해 결정될 수 있다. 별법으로, 분취액은 변성제 (예를 들어 HCl)로 처리될 수 있고, 샘플을 청정화한 후 (예를 들어 원심분리에 의해), pH를 중화시키고, ADM 면역검정에 의해 ADM을 정량할 수 있다. 별법으로, 비-면역검정 기술 (예를 들어 rpHPLC)이 ADM-정량을 위해 사용될 수 있다.
- ADM의 반감기는 각각 ADM 안정화 항체 또는 아드레노메둘린 안정화 항체 단편 또는 아드레노메둘린 안정화 비-Ig 스캐폴드의 부재 및 존재 하에 인큐베이션된 ADM에 대해 계산될 수 있다.
- 반감기의 향상은 ADM 안정화 항체 또는 아드레노메둘린 안정화 항체 단편 또는 아드레노메둘린 안정화 비-Ig 스캐폴드의 부재 하에 인큐베이션된 ADM에 비교하여 안정화된 ADM에 대해 계산된다.
ADM의 반감기의 2배 증가는 반감기의 100%의 향상이다. 반감기 (체류 시간의 1/2)는 특정 화학물질 또는 약물의 농도가 특정 유체 또는 혈액 내의 그의 기준선 농도의 1/2로 저하되기 위해 소요되는 시간으로서 규정된다.
혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (체류 시간의 1/2)의 결정을 위해 사용될 수 있는 검정은 실시예 3에 설명되어 있다.
본 발명에 따른 항체는 항원에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질이다. 인정된 이뮤노글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파 (IgA), 감마 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타 (IgD), 엡실론 (IgE) 및 뮤 (IgM) 불변 영역 유전자, 및 무수한 이뮤노글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 전장 이뮤노글로불린 경쇄의 길이는 일반적으로 약 25 Kd 또는 214개 아미노산이다. 전장 이뮤노글로불린 중쇄의 길이는 일반적으로 약 50 Kd 또는 446개 아미노산이다. 경쇄는 NH2-말단에서 가변 영역 유전자에 의해 (약 110개 아미노산 길이), COOH-말단에서 카파 또는 람다 불변 영역 유전자에 의해 코딩된다. 중쇄는 유사하게 가변 영역 유전자 (약 116개 아미노산 길이) 및 다른 불변 영역 유전자 중의 하나에 의해 코딩된다.
항체의 기본적인 구조 단위는 일반적으로 이뮤노글로불린 쇄의 2개의 동일한 쌍 (각각의 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖는다)으로 이루어진 사량체이다. 각각의 쌍에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 항원에 결합하고, 불변 영역은 이펙터 기능을 매개한다. 또한, 이뮤노글로불린은 예를 들어 Fv, Fab, 및 F(ab')2, 및 이기능성 하이브리드 (hybrid) 항체 및 단일쇄를 비롯한 다양한 다른 형태로 존재한다 (예를 들어, 문헌 [Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105, 1987]; [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883, 1988]; [Bird et al., Science 242:423-426, 1988]; [Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed., 1984]; [Hunkapiller and Hood, Nature 323:15-16, 1986] 참조). 이뮤노글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 불리는 3개의 초가변 영역이 개재된 프레임워크 (framework) 영역을 포함한다 (문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983] 참조). 상기에서 알 수 있는 바와 같이, CDR은 1차적으로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 면역 복합체는 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 모노클로날 항체, 키메라 (chimeric) 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체, 또는 기능성 항체 단편이다.
키메라 항체는 일반적으로 그의 경쇄 및 중쇄 유전자가 상이한 종에 속하는 이뮤노글로불린 가변 및 불변 영역 유전자로부터 유전공학에 의해 제조된 항체이다. 예를 들어, 모노클로날 항체로부터의 유전자의 가변 절편은 인간 불변 절편, 예컨대 카파 및 감마 1 또는 감마 3에 연결될 수 있다. 한 예에서, 치료 키메라 항체는 따라서 마우스 항체로부터의 가변 또는 항원-결합 도메인 및 인간 항체로부터의 불변 또는 이펙터 도메인으로 이루어진 하이브리드 단백질이지만, 다른 포유동물 종이 사용될 수 있거나, 또는 가변 영역은 분자 기술에 의해 생산될 수 있다. 키메라 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 5,807,715를 참조한다. "인간화" 이뮤노글로불린은 인간 프레임워크 영역 및 비-인간 (예컨대 마우스, 래트, 또는 합성) 이뮤노글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 이뮤노글로불린이다. CDR을 제공하는 비-인간 이뮤노글로불린은 "공여자"로 언급되고, 프레임워크를 제공하는 인간 이뮤노글로불린은 "수용자"로 언급된다. 한 실시양태에서, 모든 CDR은 인간화 이뮤노글로불린에서 공여자 이뮤노글로불린으로부터 유래된다. 불변 영역은 존재할 필요는 없지만, 존재할 경우, 인간 이뮤노글로불린 불변 영역과 실질적으로, 즉 적어도 약 85-90%, 예컨대 약 95% 또는 그 초과로 동일하여야 한다. 따라서, 가능하게는 CDR을 제외한 인간화 이뮤노글로불린의 모든 부분은 천연 인간 이뮤노글로불린 서열의 대응하는 부분과 실질적으로 동일하다. "인간화 항체"는 인간화 경쇄 및 인간화 중쇄 이뮤노글로불린을 포함하는 항체이다. 인간화 항체는 CDR을 제공하는 공여자 항체와 동일한 항원에 결합한다. 인간화 이뮤노글로불린 또는 항체의 수용자 프레임워크는 공여자 프레임워크로부터 얻은 아미노산에 의한 제한된 수의 치환을 가질 수 있다. 인간화 또는 다른 모노클로날 항체는 항원 결합 또는 다른 이뮤노글로불린 기능에 대해 실질적으로 효과를 갖지 않는 추가의 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예시적인 보존적 치환은 예컨대 다음과 같다: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr. 인간화 이뮤노글로불린은 유전공학에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,585,089 참조). 인간 항체는 경쇄 및 중쇄 유전자가 인간에서 기원하는 것인 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 관심있는 항체를 분비하는 인간 B 세포를 불멸화 (immortalization)시킴으로써 생산될 수 있다. 불멸화는 예를 들어 EBV 감염에 의해 또는 인간 B 세포를 골수종 또는 하이브리도마 세포와 융합시켜 트리오마 (trioma) 세포를 생산함으로써 수행될 수 있다. 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 방법에 의해 생산될 수 있거나 (예를 들어, 도워 (Dower) 등의 PCT 공개 WO91/17271; 맥카퍼티 (McCafferty) 등의 PCT 공개 WO92/001047; 및 윈터 (Winter)의 PCT 공개 WO92/20791 참조), 또는 인간 조합 모노클로날 항체 라이브러리로부터 선택될 수 있다 (모르포시스 (Morphosys) 웹사이트 참조). 인간 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 (transgenic) 동물을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 롱버그 (Lonberg) 등의 PCT 공개 WO93/12227; 및 쿠처라파티 (Kucherlapati)의 PCT 공개 WO91/10741 참조).
따라서, 항-ADM 항체는 당업계에 공지된 포맷 (format)을 가질 수 있다. 그 예는 인간 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, CDR-이식된 (grafted) 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 재조합 방식으로 생산된 항체, 예를 들어 IgG, 일반적인 전장 이뮤노글로불린, 또는 적어도 중쇄 및/또는 경쇄의 F-가변 도메인을 함유하는 항체 단편, 예를 들어 화학적으로 커플링된 항체 (항원 결합 단편), 비제한적인 예를 들어 Fab-단편, 예를 들어 Fab 미니바디 (minibody), 단일쇄 Fab 항체, 에피토프 태그 (tag)를 갖는 1가 Fab 항체, 예를 들어 Fab-V5Sx2; CH3 도메인으로 이량체화된 2가 Fab (미니-항체); 예를 들어 이종성 도메인의 도움에 의한 다량체화를 통해, 예를 들어 dHLX 도메인의 이량체화를 통해 형성된 2가 Fab 또는 다가 Fab, 예를 들어 Fab-dHLX-FSx2; F(ab')2-단편, scFv-단편, 다량체화된 다가 및/또는 다중특이적 scFv-단편, 2가 및/또는 이중특이적 디아바디 (diabody), BITE® (이중특이적 T-세포 인게이저 (engager)), 삼기능성 항체, 예를 들어 G 이외의 상이한 클래스로부터의 다가 항체; 단일-도메인 항체, 예를 들어 낙타류 또는 어류 이뮤노글로불린 및 다른 많은 이뮤노글로불린으로부터 유래된 나노바디 (nanobody)이다.
항-ADM 항체 이외에, 다른 생체중합체 스캐폴드가 표적 분자와 복합체화하는 것으로 잘 알려져 있고, 고도로 표적 특이적인 생체중합체의 생성을 위해 사용되고 있다. 그 예는 압타머 (aptamer), 스피에겔머 (spiegelmer), 안티칼린 및 코노톡신이다. 항체 포맷의 예시에 대해서는, 도 1a, 1b 및 1c를 참조한다.
바람직한 실시양태에서, 항-ADM 항체 포맷은 Fv 단편, scFv 단편, Fab 단편, scFab 단편, F(ab)2 단편 및 scFv-Fc 융합 단백질을 포함하는 군으로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체 포맷은 scFab 단편, Fab 단편, scFv 단편 및 그의 생체이용성 최적화된 접합체, 예컨대 PEG화된 단편을 포함하는 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 포맷 중의 하나는 scFab 포맷이다.
비-Ig 스캐폴드는 단백질 스캐폴드일 수 있고, 리간드 또는 항원에 결합할 수 있기 때문에 항체 모방체로서 사용될 수 있다. 비-Ig 스캐폴드는 테트라넥틴-기반 비-Ig 스캐폴드 (예를 들어 US 2010/0028995에 기재된), 피브로넥틴 스캐폴드 (예를 들어 EP 1266 025에 기재된); 리포칼린-기반 스캐폴드 (예를 들어 WO 2011/154420에 기재된); 유비퀴틴 스캐폴드 (예를 들어 WO 2011/073214에 기재된), 전달 스캐폴드 (예를 들어 US 2004/0023334에 기재된), 단백질 A 스캐폴드 (예를 들어 EP 2231860에 기재된), 안키린 반복체 기반 스캐폴드 (예를 들어 WO 2010/060748에 기재된), 미세단백질, 바람직하게는 시스틴 노트 (knot)를 형성하는 미세단백질 스캐폴드 (예를 들어 EP 2314308에 기재된), Fyn SH3 도메인 기반 스캐폴드 (예를 들어 WO 2011/023685에 기재된) EGFR-A-도메인 기반 스캐폴드 (예를 들어 WO 2005/040229에 기재된) 및 쿠니츠 (Kunitz) 도메인 기반 스캐폴드 (예를 들어 EP 1941867에 기재된)를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 다음과 같이 생산될 수 있다:
Balb/c 마우스를 제0일 및 제14일에 100 ㎍ ADM-펩티드-BSA-접합체 (100 ㎕ 완전 프로인트 (Freund) 아주반트 (adjuvant) 내에 유화됨) 및 제21일 및 제28일에 50 ㎍ (100 ㎕ 불완전 프로인트 아주반트 내에 유화됨)으로 면역화하였다. 융합 실험을 수행하기 3일 전에, 동물에게 100 ㎕ 염수에 용해된 50 ㎍의 접합체를 복강내 주사 1회 및 정맥내 주사 1회로 투여하였다.
면역화된 마우스로부터의 비장세포 및 골수종 세포주 SP2/0의 세포를 37℃에서 30s 동안 1 ml 50% 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 융합시켰다. 세척 후에, 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다. 하이브리드 클론은 HAT 배지 [20% 소 태아 혈청 및 HAT-보충제로 보충한 RPMI 1640 배양 배지]에서 성장시킴으로써 선택하였다. 2주 후에, HAT 배지를 3회 계대배양을 위해 HT 배지로 교체한 후, 정상 세포 배양 배지로 복귀시켰다.
세포 배양 상청액을 융합 3주 후에 항원 특이적 IgG 항체에 대해 1차 스크리닝하였다. 양성 시험된 미세배양액을 증식을 위해 24-웰 플레이트에 옮겼다. 재시험 후에, 선택된 배양액을 클로닝하고, 제한-희석 기술을 사용하여 재클로닝하고, 이소형을 결정하였다 (또한, 문헌 [Lane, R.D. (1985) A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas. J. Immunol. Meth. 81: 223-228]; [Ziegler, B. et al., (1996) Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies, Horm. Metab. Res. 28: 11-15] 참조).
항체를 다음 절차에 따라 파지 디스플레이에 의해 생산할 수 있다:
인간 나이브 (naive) 항체 유전자 라이브러리 HAL7/8을 아드레노메둘린 펩티드에 대한 재조합 단일쇄 F-가변 도메인 (scFv)의 단리를 위해 사용하였다. 항체 유전자 라이브러리는 2개의 상이한 스페이서 (spacer)를 통해 아드레노메둘린 펩티드 서열에 연결된 비오틴 태그를 함유하는 펩티드의 사용을 포함한 패닝 (panning) 전략으로 스크리닝하였다. 비-특이적으로 결합된 항원 및 스트렙타비딘 결합된 항원을 사용한 패닝 라운드의 혼합을 비-특이적 결합제의 배경을 최소화하기 위해 사용하였다. 제3 라운드의 패닝으로부터 용리된 파지를 모노클로날 scFv 발현 이. 콜라이 균주의 생성을 위해 사용하였다. 상기 클론 균주의 배양으로부터 얻은 상청액을 항원 ELISA 시험에 직접 사용하였다 (또한, 문헌 [Hust, M., Meyer, T., Voedisch, B., Ruelker, T., Thie, H., El-Ghezal, A., Kirsch, M.I., Schuette, M., Helmsing, S., Meier, D., Schirrmann, T., Dubel, S., 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology 152, 159-170]; [Schuette, M., Thullier, P., Pelat, T., Wezler, X., Rosenstock, P., Hinz, D., Kirsch, M.I., Hasenberg, M., Frank, R., Schirrmann, T., Gunzer, M., Hust, M., Duebel, S., 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625] 참조).
뮤린 항체의 인간화는 다음 절차에 따라 수행될 수 있다: 뮤린 기원의 항체의 인간화를 위해, 항체 서열을 상보성 결정 영역 (CDR) 및 항원과 프레임워크 영역 (FR)의 구조적 상호작용에 대해 분석한다. 구조적 모델링 (modeling)을 기초로 하여, 인간 기원의 적절한 FR이 선택되고, 뮤린 CDR 서열이 인간 FR 내로 이식된다. FR 서열의 종 변경에 의해 제거된 구조적 상호작용을 다시 얻기 위해 CDR 또는 FR의 아미노산 서열의 변이가 도입될 수 있다. 상기 구조적 상호작용의 회복은 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한 무작위 방법에 의해 또는 분자 모델링에 의해 안내되는 유도 방법을 통해 달성될 수 있다 (문헌 [Almagro JC, Fransson J., 2008. Humanization of antibodies. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:1619-33]).
바람직한 실시양태에서, ADM 항체 포맷은 Fv 단편, scFv 단편, Fab 단편, scFab 단편, F(ab)2 단편 및 scFv-Fc 융합 단백질을 포함하는 군으로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 항체 포맷은 scFab 단편, Fab 단편, scFv 단편 및 그의 생체이용성 최적화된 접합체, 예컨대 PEG화된 단편을 포함하는 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 포맷 중의 하나는 scFab 포맷이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 항-ADM 항체, 항-ADM 항체 단편, 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 전장 항체, 항체 단편, 또는 비-Ig 스캐폴드이다.
바람직한 실시양태에서, 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-아드레노메둘린 비-Ig 스캐폴드는 ADM에 함유된 적어도 5개 아미노산 길이의 에피토프에 작용하고 결합할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-아드레노메둘린 비-Ig 스캐폴드는 ADM에 함유된 적어도 4개 아미노산 길이의 에피토프에 작용하고 결합할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적인 실시양태에서, 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 아드레노메둘린에 결합하는 항-ADM 항체 단편 또는 아드레노메둘린에 결합하는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 의약으로서 사용하기 위해 제공되고, 여기서 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는 ADM-결합-단백질-1 (보체 인자 H)이 아니다.
본 발명의 하나의 구체적인 실시양태에서, 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 아드레노메둘린에 결합하는 항-ADM 항체 단편 또는 아드레노메둘린에 결합하는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 의약으로서 사용하기 위해 제공되고, 여기서 상기 항체 또는 항체 단편 또는 비-Ig 스캐폴드는 하기 서열 24를 갖는 성숙 인간 ADM의 aa 1-42의 서열 내의 바람직하게는 적어도 4개 또는 적어도 5개 아미노산의 영역에 결합한다:
서열 24
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA.
본 발명의 하나의 구체적인 실시양태에서, 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 아드레노메둘린에 결합하는 항-ADM 항체 단편 또는 아드레노메둘린에 결합하는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 의약으로서 사용하기 위해 제공되고, 여기서 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는 하기 서열 23을 갖는 성숙 인간 ADM의 aa 1-21의 서열 내의 바람직하게는 적어도 4개 또는 적어도 5개 아미노산의 영역에 결합한다:
서열 23
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC.
따라서, 본 발명의 구체적인 실시양태에서, 상기 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21) 내에 위치하는 ADM의 영역에 결합한다 (도 2 참조).
또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 항-항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 아드레노메둘린의 N-말단 단부 (aa 1)를 인식하고 결합한다. N-말단 단부는 항체 결합에 필수적인 아미노산 1, 즉 서열 21 또는 23의 "Y"를 의미한다. 상기 항-ADM 항체 또는 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 N-말단 연장된 또는 N-말단 변형된 아드레노메둘린 또는 N-말단 분해된 아드레노메둘린에 결합하지 않는 것이다.
또한, 본 발명에 따른 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편을 사용하는 것이 바람직하고, 여기서 상기 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편은 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 ADM 안정화 아드레노메둘린 항체 단편이다. 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 체류 시간의 1/2의 결정을 위해 사용될 수 있는 검정은 실시예 3에 설명되어 있다.
또한, 본 발명에 따른 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편을 사용하는 것이 바람직하고, 여기서 상기 항체 또는 상기 아드레노메둘린 항체 단편은 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단한다.
바람직한 실시양태에서, 조절성 항체 또는 조절성 아드레노메둘린 항체 단편은 패혈증의 치료에 사용된다. 조절성 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편은 초기 패혈증에서 ADM의 생물활성을 향상시키고, 후기 패혈증에서 ADM의 손상 효과를 감소시킨다. "조절성" 항체 또는 조절성 아드레노메둘린 항체 단편은 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키고, ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편이다.
본 발명에 따른 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항-ADM 항체 또는 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 하기 서열 25를 갖는 ADM의 C-말단 부분인 ADM의 aa 43-52에 결합하지 않는다:
PRSKISPQGY-NH2
(서열 25).
구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 조절성 항-ADM 항체 또는 조절성 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 조절성 항-아드레노메둘린 비-Ig 스캐폴드는 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위해, 예를 들어 대상체의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 예방 또는 치료 또는 예방에 사용하기 위한 대상체의 처치를 위해 사용된다.
그러한 조절성 항-ADM 항체 또는 조절성 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 조절성 항-아드레노메둘린 비-Ig 스캐폴드는 패혈증의 치료에 특히 유용할 수 있다. 조절성 항-ADM 항체 또는 조절성 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 조절성 항-아드레노메둘린 비-Ig 스캐폴드는 초기 패혈증에서 ADM의 생물활성을 향상시키고, 후기 패혈증에서 ADM의 손상 효과를 감소시킨다.
"조절성" 항체 또는 조절성 아드레노메둘린 항체 단편 또는 조절성 아드레노메둘린 비-Ig 스캐폴드는 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키고, ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 항체 또는 항체 단편 또는 비-Ig 스캐폴드이고, 여기서 ADM의 생물활성은 적어도 5%로 차단된다. 반감기 및 생물활성의 차단과 관련된 상기 값은 상기 값을 결정하기 위한 이전에 언급된 검정과 관련하여 이해되어야 한다. 상기 조절성 항체 또는 조절성 아드레노메둘린 항체 단편 또는 조절성 아드레노메둘린 비-Ig 스캐폴드는 ADM에 결합하는 항체 또는 항체 단편 또는 비-Ig 스캐폴드임이 이해되어야 한다.
ADM 생물활성의 차단은 80% 이하를 의미하고, 따라서 20%의 잔류 ADM 생물활성이 존재함이 강조되어야 한다. 이것은 50% 이하의 ADM 생물활성의 차단, 따라서 잔류 50%의 ADM 생물활성에도 적용된다.
본 발명의 주제는 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이고, 여기서 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는
- 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 아드레노메둘린 안정화 항체 단편 또는 ADM 안정화 비-Ig 스캐폴드이고/이거나
- 상기 항-아드레노메둘린 항체 또는 상기 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 상기 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단한다.
상기 언급된 것은 ADM 생물활성을 각각 80% 이하 또는 50% 이하로 차단한다는 의미이고, 따라서 각각 ADM 안정화 항체 또는 항체 단편 또는 비-Ig 스캐폴드인 각각의 ADM 결합제에 의한 ADM 생물활성의 제한된 차단으로서 이해해야 한다.
상기 조절성 항체 또는 조절성 아드레노메둘린 항체 단편 또는 조절성 아드레노메둘린 비-Ig 스캐폴드는 투여가 용이해진다는 이점을 제공한다. 아드레노메둘린 생물활성의 부분적 차단 또는 부분적 감소와 생체내에서 반감기의 증가 (아드레노메둘린 생물활성의 증가)의 조합은 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-아드레노메둘린 비-Ig 스캐폴드 투여의 유용한 간단함을 제공한다. 과량의 내인성 아드레노메둘린의 상황 (최대 자극, 후기 패혈증, 쇼크, 활력감퇴기)에서, 활성 저하 효과는 항체 또는 단편 또는 스캐폴드의 주요 영향으로서, 아드레노메둘린의 (부정적인) 효과를 제한한다. 낮은 또는 정상 내인성 아드레노메둘린 농도의 경우에, 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드의 생물학적 효과는 저하 (부분적으로 차단함으로써) 및 아드레노메둘린 반감기 증가에 의한 증가의 조합이다. 반감기 효과가 차단 효과보다 더 크면, 내인성 아드레노메둘린의 순수한 생물학적 활성은 초기 패혈증 (낮은 아드레노메둘린, 과활력기)에서 유익하게 증가된다. 따라서, 비-중화 및 조절성 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-아드레노메둘린 비-Ig 스캐폴드는 ADM의 생물활성을 특정 생리학적 범위 내에 유지하기 위한 ADM 생물활성 완충제처럼 작용한다.
따라서, 예를 들어 패혈증에서 항체/단편/스캐폴드의 용량은 두 패혈증 병기 (초기 및 후기) 모두가 조절성 효과의 경우에 과량의 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드 치료로부터 도움을 받기 때문에 과도한 농도로부터 선택될 수 있다. 과량은 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드 농도가 예를 들어 패혈증의 후기 (쇼크) 동안의 내인성 아드레노메둘린보다 더 높음을 의미한다. 이것은 조절성 항체 또는 조절성 항체 단편 또는 조절성 비-Ig 스캐폴드의 경우에 패혈증에서의 용량이 다음과 같을 수 있음을 의미한다:
패혈성 쇼크에서 아드레노메둘린의 농도는 226+/-66 fmol/ml이고 (문헌 [Nishio et al., "Increased plasma concentrations of adrenomedullin correlate with relaxation of vascular tone in patients with septic shock.", Crit Care Med. 1997, 25(6):953-7), 항체 또는 단편 또는 스캐폴드의 등몰 농도는 42.5 ㎍/l (혈액), (6 리터 (혈액 부피)/80 kg (체중)을 기초로 하여) 3.2 ㎍/kg (체중)이다. 과량은 적어도 2배의 (평균) 패혈성 쇼크 아드레노메둘린 농도, 적어도 > 3 ㎍ 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드/kg (체중), 바람직한 적어도 6.4 ㎍ 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드/kg (체중)을 의미한다. >10 ㎍ 항-아드레노메둘린 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-DM 비-Ig 스캐폴드/kg (체중)이 바람직하고, >20 ㎍/kg이 보다 바람직하고, >100 ㎍ 이 가장 바람직하다. 이것은 패혈성 쇼크 이외의 다른 중증 및 급성 병태에도 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 한 실시양태에서, 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 단일특이적이다. 단일특이적 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 단일특이적 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 단일특이적 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 상기 항체 또는 항체 단편 또는 비-Ig 스캐폴드가 표적 ADM 내의 바람직하게는 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산을 포함하는 하나의 특이적인 영역에 결합함을 의미한다. 단일특이적 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 단일특이적 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 단일특이적 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 모두 동일한 항원에 대한 친화도를 갖는 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ADM에 결합하는 항-ADM 항체 또는 항체 단편은 단일특이적 항체이다. 단일특이적은 상기 항체 또는 항체 단편이 표적 ADM 내의 바람직하게는 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산을 포함하는 하나의 특이적인 영역에 결합함을 의미한다. 단일특이적 항체 또는 단편은 모두 동일한 항원에 대한 친화도를 갖는 항체 또는 단편이다. 모노클로날 항체는 단일특이적이지만, 단일특이적 항체는 또한 통상적인 생식 세포로부터 생산되는 것 이외의 다른 수단에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체 또는 그의 단편이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항-ADM 항체 또는 항-ADM 항체 단편은 인간 또는 인간화 항체이거나 또는 이로부터 유래된다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 하나 이상의 (뮤린) CDR은 인간 항체 또는 항체 단편 내로 이식된다.
본 발명의 주제는 한 측면에서 ADM에 결합하는 인간 CDR-이식된 항체 또는 그의 항체 단편이고, 여기서 인간 CDR-이식된 항체 또는 그의 항체 단편은 다음 서열 1, 서열 2, 및/또는 서열 3을 포함하는 항체 중쇄 (H쇄)를 포함하고/하거나, 다음 서열 4, 서열 5, 및/또는 서열 6을 포함하는 항체 경쇄 (L쇄)를 추가로 포함한다:
서열 1
GYTFSRYW
서열 2
ILPGSGST
서열 3
TEGYEYDGFDY
서열 4
QSIVYSNGNTY
서열 5
RVS
서열 6
FQGSHIPYT.
본 발명의 하나의 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 주제는 ADM에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편이고, 여기서 중쇄는 다음 서열 1, 서열 2, 및 서열 3으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 경쇄는 다음 서열 4, 서열 5, 및 서열 6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함한다:
서열 1
GYTFSRYW
서열 2
ILPGSGST
서열 3
TEGYEYDGFDY
서열 4
QSIVYSNGNTY
서열 5
RVS
서열 6
FQGSHIPYT.
본 발명의 보다 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 주제는 ADM에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편이고, 여기서 중쇄는 다음 서열 1, 서열 2, 또는 서열 3을 포함하고, 경쇄는 다음 서열 4, 서열 5, 또는 서열 6을 포함한다:
서열 1
GYTFSRYW
서열 2
ILPGSGST
서열 3
TEGYEYDGFDY
서열 4
QSIVYSNGNTY
서열 5
RVS
서열 6
FQGSHIPYT.
매우 구체적인 실시양태에서, ADM 항체는 서열 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 14를 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 친화도 상수가 10-7 M보다, 바람직하게는 10-8 M보다, 보다 바람직하게는 10-9 M보다, 가장 바람직게는 10-10 M보다 크도록 하는 인간 ADM에 대한 친화도를 보인다. 당업자는 보다 높은 용량의 화합물을 적용함으로써 보다 낮은 친화도를 보상하는 것이 고려될 수 있음을 알고 있고, 상기 측정치는 본 발명의 범위를 벗어나도록 유도하지 않는 것이다. 친화도 상수는 실시예 1에 설명된 방법에 따라 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 단편은 본원에 설명된 바와 같이 사용하기 위해 다른 작용제와, 예를 들어 소위 ADM-결합 단백질과 조합으로 사용될 수 있다.
용어 "ADM 결합 단백질"은 ADM-결합-단백질-1 (보체 인자 H)를 포함함이 강조되어야 하지만, 이것은 본 발명에 따른 비-중화 및/또는 조절성 항-ADM 항체, 항체 단편, 또는 비-Ig 스캐폴드를 반영하지 않는다,
바람직한 실시양태에서, 항-ADM 항체 또는 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태 동안 사망 위험을 감소시키기 위해 사용된다.
본 발명에 따른 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태는 중증 감염, 예를 들어 수막염, 전신 염증 반응 증후군 (SIRS), 패혈증; 다른 질환, 예를 들어 당뇨병, 암, 급성 및 만성 혈관 질환, 예를 들어 심부전, 심근 경색, 졸중, 아테롬성동맥경화증; 쇼크, 예를 들어 패혈성 쇼크 및 장기 기능장애, 예를 들어 신장 기능장애, 간 기능장애, 화상, 수술, 외상 중독, 화학요법 손상을 포함하는 군으로부터 선택되는 질환 또는 병태일 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는 패혈증 및 패혈성 쇼크, 즉 후기 패혈증 동안 사망 위험을 감소시키기 위해 특히 유용하다.
한 실시양태에서, 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 본 발명에 따른 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료 또는 예방에서 사용되고, 여기서 상기 환자는 ICU 환자이다. 또 다른 실시양태에서, 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 본 발명에 따른 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료 또는 예방에서 사용되고, 여기서 상기 환자는 위독하다. 위독은 사망이 가능하거나 임박한 질환 또는 상태에 있는 환자를 의미한다.
본 발명에 따른 항체, 항체 단편 및 비-Ig 스캐폴드는 질환 또는 병태를 예방 또는 치료하기 위해, 예를 들어 대상체의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 예방 또는 치료에 사용하기 위해 대상체의 처치를 위해 사용될 수 있다. 그러한 질환은 중증 감염, 예를 들어 예를 들어 수막염, 전신 염증 반응 증후군 (SIRS), 패혈증; 다른 질환, 예들 들어 당뇨병, 암, 급성 및 만성 혈관 질환, 예를 들어 심부전, 심근 경색, 졸중, 아테롬성동맥경화증; 쇼크, 예를 들어 패혈성 쇼크 및 장기 기능장애, 예를 들어 신장 기능장애, 간 기능장애, 화상, 수술, 외상을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는 패혈증 및 패혈성 쇼크, 즉 후기 패혈증 동안 사망 위험을 감소시키기 위해 특히 유용하다.
아래에서 SIRS, 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크에 대한 임상 기준이 규정될 것이다.
1) 다음 증상 중 적어도 2개를 특징으로 하는 전신 염증성 숙주 반응 (SIRS)
· 환자는 저혈압을 보인다 (평균 동맥압은 < 65 mm Hg).
· 상승된 혈청 락테이트 수준: > 4 mmol/L
· 혈당 > 7.7 mmol/L (당뇨가 없을 때)
· 중심 정맥압은 8-12 mm Hg 내에 해당하지 않는다.
· 요 배출량은 < 0.5 mL x kg-1 x hr-1이다.
· 중심 정맥 (상대 정맥) 산소 포화는 < 70%이거나 또는 혼합 정맥 < 65%이다.
· 심박수는 > 90 맥박/min이다.
· 온도 < 36℃ 또는 > 38℃.
· 호흡 속도 > 20/min.
· 백혈구 계수 < 4 또는 > 12x109/L (백혈구); >10% 미성숙 호중구.
2) 패혈증
1) 하에 언급된 적어도 2개의 증상 다음에, 다음과 같은 새로운 감염에 대한 추가의 임상 기미의 존재:
· 기침/가래/흉통
· 복통/팽창/설사
· 선 (line) 감염
· 심내막염
· 배뇨장애
· 경부 강직을 동반한 두통
· 봉와직염/상처/관절 감염
· 임의의 감염에 대한 양성 미생물학적 소견
3) 중증 패혈증
패혈증이 환자에서 나타나고, 다음과 같은 임의의 장기 기능장애에 대한 추가의 임상 기미의 존재:
· 수축기 혈압 < 90/평균; < 65 mmHG
· 락테이트 > 2 mmol/L
· 빌리루빈 > 34 μmol/L
· 요 배출량: 2 h 동안 < 0.5 mL/kg/h
· 크레아티닌 >177 μmol/L
· 혈소판 < 100x109/L
· SpO2: O2를 제공하지 않으면 > 90%.
4) 패혈성 쇼크
3) 하에 언급된 말초 장기 기능장애의 적어도 하나의 징후가 나타난다. 패혈성 쇼크는 치료에 반응하지 않는 불응성 저혈압이 존재하고 정맥내 투여용 유체 단독으로는 환자의 혈압을 저혈압이 되지 않도록 유지하기에는 불충분할 경우에 진단되고, 본 발명에 따른 항-ADM 항체 또는 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드를 투여한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 환자는 SIRS, 중증 감염, 패혈증, 쇼크, 예를 들어 패혈성 쇼크로 고통받지 않는다. 상기 중증 감염은 예를 들어, 수막염, 전신 염증 반응 증후군 (SIRS), 패혈증, 중증 패혈증, 및 쇼크, 예를 들어 패혈성 쇼크를 나타낸다. 이와 관련하여, 중증 패혈증은 패혈증이 상기 환자에서 나타나고, 다음과 같은 임의의 장기 기능장애에 대한 추가의 임상 기미가 존재함을 특징으로 한다:
· 수축기 혈압 < 90/평균; < 65 mmHG
· 락테이트 > 2 mmol/L
· 빌리루빈 > 34 μmol/L
· 요 배출량: 2 h 동안 < 0.5 mL/kg/h
· 크레아티닌 > 177 μmol/L
· 혈소판 < 100x109/L
· SpO2: O2를 제공하지 않으면 > 90%.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 급성 질환 또는 급성 병태는 패혈증, 중증 패혈증이 아니거나, SIRS가 아니거나, 쇼크 또는 패혈성 쇼크가 아니다.
또 다른 실시양태에서, 상기 급성 질환 또는 급성 병태는 패혈증이 아니다.
본 발명에 따른 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는 본원에 설명된 바와 같이 사용하기 위해 다른 작용제와, 예를 들어 소위 ADM 결합 단백질과 조합으로 사용될 수 있다. ADM 결합 단백질은 또한 상기 환자의 순환계 내에 자연적으로 존재한다.
용어 "ADM 결합 단백질"은 ADM-결합-단백질-1 (보체 인자 H)를 포함함이 강조될 것이지만, 이것은 본 발명에 따른 비-중화 및/또는 조절성 항-ADM 항체, 항체 단편, 또는 비-Ig 스캐폴드를 반영하지 않는다.
본 발명의 주제는 추가로 본 발명에 따른 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이고, 여기서 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는 추가의 활성 성분과 조합으로 사용될 것이다.
본 발명의 주제는 또한 예를 들어, 1차 의약으로서 사용된 또 다른 활성 약물과 조합으로 사용될 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이고, 여기서 상기 조합은 상기 환자의 순환, 특히 상기 환자의 전신 순환을 안정화시키기 위해 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
1차 의약은 상기 질환 또는 병태의 1차 원인에 대해 작용하는 의약을 의미한다. 상기 1차 의약은 감염의 경우에 항생제일 수 있다.
이전에 언급된 조합의 구체적인 실시양태에서, 상기 조합은 혈관수축제, 예를 들어 카테콜아민과 조합으로 사용될 것이고, 여기서 상기 추가의 조합은 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 만성 또는 급성 질환 또는 만성 병태가 있는 상기 환자는 혈관수축제의 투여, 예를 들어 카테콜아민 투여를 받을 환자의 필요를 특징으로 한다.
따라서, 하나의 구체적인 실시양태에서 본 발명의 주제는 혈관수축제의 치료, 예를 들어 카테콜아민 치료를 필요로 하는 환자의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 ADM 결합 단백질 및/또는 추가의 활성 성분과 조합으로 사용될 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이다.
상기 언급된 조합의 구체적인 실시양태에서, 상기 조합은 정맥내 투여한 유체와 조합으로 사용될 것이고, 여기서 상기 조합은 순환, 특히 전신 순환을 안정화시키기 위해 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 순환을 안정화시킬 필요가 있는 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태가 있는 상기 환자는 정맥내 유체를 투여받아야 하는 환자의 필요를 특징으로 한다.
따라서, 하나의 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 주제는 정맥내 유체를 필요로 하는 환자의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 ADM 결합 단백질 및/또는 추가의 활성 성분과 조합한 항-아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이다. 이것은 환자가 전신 유체 균형을 조절하기 위해 정맥내 유체를 필요로 한다는 의미이다.
용어 ADM 결합 단백질은 또한 ADM-결합-단백질-1 (보체 인자 H)를 나타내는 것이 강조될 것이지만, 이것은 본 발명에 따른 비-중화 및 조절성 항-ADM 항체, 항-ADM 항체 단편, 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드가 아니다.
본 발명에 따라, ADM-결합-단백질-1은 또한 ADM-결합-단백질-1 (보체 인자 H)로서 칭할 수 있다.
상기 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드, 또는 ADM 결합 단백질 및/또는 추가의 활성 성분과 그의 조합물은 순환을 안정화시키기 위해, 특히 전신 순환을 안정화시키기 위해 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료에서 혈관수축제, 예를 들어 카테콜아민 및/또는 정맥내 투여한 유체와 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 주제는 또한 TNF-알파-항체와 조합으로 사용될 본 발명에 따른 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig이다. TNF-알파-항체는 환자의 치료를 위해 상업적으로 이용가능하다.
바람직한 실시양태에서, 항-ADM 항체 또는 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 환자의 상기 만성 또는 급성 질환 동안 사망 위험을 감소시키기 위해 사용되고, 여기서 상기 질환은 패혈증, 당뇨병, 암, 급성 및 만성 혈관 질환, 예를 들어 심부전, 쇼크, 예를 들어 패혈성 쇼크 및 장기 기능장애, 예를 들어 신장 기능장애로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따른 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는 패혈증 및 패혈성 쇼크, 즉 후기 패혈증 동안 사망 위험을 감소시키기 위해 특히 유용하다.
본 발명의 항체, 항체 단편, 스캐폴드 및 조합물은:
· 장기 기능장애 또는 장기 부전, 특히 신장 기능장애 또는 신부전의 예방을 위해, 및/또는
· 순환을 안정화시키기 위해, 예를 들어 상기 환자의 혈관수축제, 예를 들어 카테콜아민 요구치를 감소시키기 위해, 및/또는
· 상기 환자에서 유체 균형을 조절하기 위해,
· 상기 환자에 대한 사망 위험을 감소시키기 위해
환자의 만성 또는 급성 질환의 치료 또는 예방에서 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 본 발명에 따른 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료 또는 예방에서 사용되고, 여기서 상기 환자는 ICU 환자이다. 또 다른 실시양태에서, 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드는 본 발명에 따른 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료 또는 예방에서 사용되고, 여기서 상기 환자는 위독하다. 위독한 것은 사망이 가능하거나 임박한 질환 또는 상태에 있는 환자를 의미한다.
본 발명의 주제는 추가로 본 발명에 따른 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-ADM 항체 또는 항-아드레노메둘린 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드이고, 여기서 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드는 ADM 결합 단백질과 조합으로 사용될 것이다.
본 발명의 주제는 추가로 본 발명에 따른 항-ADM 항체 또는 항-ADM 항체 단편 또는 항-ADM 비-Ig 스캐폴드를 포함하는 제약 제제이다.
본 발명의 주제는 추가로 본 발명에 따른 제약 제제이고, 여기서 상기 제약 제제는 용액, 바람직하게는 사용 준비형 (ready-to-use) 용액이다.
상기 제약 제제는 근육내 투여될 수 있다. 상기 제약 제제는 혈관내 투여될 수 있다. 상기 제약 제제는 주입을 통해 투여될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 주제는 추가로 본 발명에 따른 제약 제제이고, 여기서 상기 제약 제제는 사용 전에 재구성해야 하는 건조된 상태로 존재한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 주제는 추가로 본 발명에 따른 제약 제제이고, 여기서 상기 제약 제제는 동결 건조된 상태로 존재한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 제제는 근육내, 혈관내, 또는 주입을 통해 투여될 수 있고, 바람직하게는 환자에게 전신 투여된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 제제는 환자에게 전신 투여될 것이다.
본 발명의 범위 내의 추가의 실시양태를 아래에 제시한다;
1. 액체 균형의 조절을 위해 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
2. 제1항에 있어서, 항체 포맷이 Fv 단편, scFv 단편, Fab 단편, scFab 단편, (Fab)2 단편 및 scFv-Fc 융합 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 아드레노메둘린의 N-말단 단부 (aa1)를 인식하고 결합하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 ADM 안정화 항체 단편인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 패혈증, 당뇨병, 암, 심부전, 쇼크 및 신장 기능장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 ICU 환자인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키고 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 조절성 항체 또는 단편인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 제약 제제.
11. 제10항에 있어서, 상기 제약 제제가 용액, 바람직하게는 사용 준비형 용액인 제약 제제.
12. 제10항에 있어서, 상기 제약 제제가 동결 건조된 상태로 존재하는 것인 제약 제제.
13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제약 제제가 근육내 투여되는 것인 제약 제제.
14. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제약 제제가 혈관내 투여되는 것인 제약 제제.
15. 제14항에 있어서, 상기 제약 제제가 주입을 통해 투여되는 것인 제약 제제.
본 발명의 범위 내의 추가의 실시양태를 아래에 제시한다.
1. 유체 균형의 조절을 위해 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
2. 제1항에 있어서, 상기 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드가 비-중화 ADM 항체 또는 비-중화 아드레노메둘린 항체 단편 또는 비-중화 ADM 비-IG 스캐폴드인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 환자에서 부종을 예방하거나 감소시키기 위해 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 포맷이 Fv 단편, scFv 단편, Fab 단편, scFab 단편, (Fab)2 단편 및 scFv-Fc 융합 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 스캐폴드가 아드레노메둘린의 N-말단 단부 (aa1)를 인식하고 결합하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 ADM 안정화 항체 단편 또는 ADM 안정화 비-IG 스캐폴드인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 SIRS, 패혈증, 당뇨병, 암, 심부전, 쇼크 및 신장 기능장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 ADM 또는 그의 항체 단편에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 단편인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편으로서,
여기서 중쇄는 다음 서열 1, 서열 2, 또는 서열 3을 포함하고, 경쇄는 다음 서열 4, 서열 5, 또는 서열 6을 포함한다:
서열 1
GYTFSRYW
서열 2
ILPGSGST
서열 3
TEGYEYDGFDY
서열 4
QSIVYSNGNTY
서열 5
RVS
서열 6
FQGSHIPYT.
11. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 다음 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, ADM 또는 그의 항체 단편에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 단편:
Figure 112019097756626-pat00001
Figure 112019097756626-pat00002
12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 ICU 환자인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키고 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 조절성 항체 또는 단편 또는 스캐폴드인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 카테콜아민 및/또는 정맥내 투여한 유체와 조합으로 사용될, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
15. ADM 결합 단백질 및/또는 추가의 활성 성분과 조합으로 사용될, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드 또는 제12항에 따른 조합물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편 또는 스캐폴드를 포함하는 제약 제제.
17. 제16항에 있어서, 상기 제약 제제가 용액, 바람직하게는 사용 준비형 용액인 제약 제제.
18. 제16항에 있어서, 상기 제약 제제가 동결 건조된 상태로 존재하는 것인 제약 제제.
19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 제약 제제가 근육내 투여되는 것인 제약 제제.
20. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 제약 제제가 혈관내 투여되는 것인 제약 제제.
21. 제20항에 있어서, 상기 제약 제제가 주입을 통해 투여되는 것인 제약 제제.
본 발명의 범위 내의 추가의 실시양태를 아래에 제시한다:
1. 순환을 안정화시키기 위해 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 상기 환자의 카테콜아민 요구치를 감소시키는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 포맷이 Fv 단편, scFv 단편, Fab 단편, scFab 단편, (Fab)2 단편 및 scFv-Fc 융합 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 아드레노메둘린의 N-말단 단부 (aa1)을 인식하고 결합하는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키는 ADM 안정화 항체인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키고 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 조절성 ADM 항체 또는 조절성 아드레노메둘린 항체 단편인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 패혈증, 당뇨병, 암, 급성 및 만성 혈관 질환, 예를 들어 심부전, 쇼크, 예를 들어 패혈성 쇼크 및 장기 기능장애, 예를 들어 신장 기능장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 제약 제제.
11. 제10항에 있어서, 상기 제약 제제가 용액, 바람직하게는 사용 준비형 용액인 제약 제제.
12. 제10항에 있어서, 상기 제약 제제가 동결 건조된 상태로 존재하는 것인 제약 제제.
13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제약 제제가 근육내 투여되는 것인 제약 제제.
14. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제약 제제가 혈관내 투여되는 것인 제약 제제.
15. 제14항에 있어서, 상기 제약 제제가 주입을 통해 투여되는 것인 제약 제제.
본 발명의 범위 내의 추가의 실시양태를 아래에 제시한다:
1. 순환을 안정화시키기 위해 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 상기 환자의 혈관수축제 요구치, 예를 들어 카테콜아민 요구치를 감소시키는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드가 비-중화 ADM 항체 또는 비-중화 아드레노메둘린 항체 단편 또는 비-중화 ADM 비-IG 스캐폴드인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 포맷이 Fv 단편, scFv 단편, Fab 단편, scFab 단편, (Fab)2 단편 및 scFv-Fc 융합 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 아드레노메둘린의 N-말단 단부 (aa1)를 인식하고 결합하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 단편 또는 스캐폴드인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키고 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 조절성 ADM 항체 또는 조절성 아드레노메둘린 항체 단편 또는 스캐폴드인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 ADM 또는 그의 항체 단편에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 단편인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편으로서,
여기서 중쇄는 다음 서열 1, 서열 2, 또는 서열 3을 포함하고, 경쇄는 다음 서열 4, 서열 5, 또는 서열 6을 포함한다:
서열 1
GYTFSRYW
서열 2
ILPGSGST
서열 3
TEGYEYDGFDY
서열 4
QSIVYSNGNTY
서열 5
RVS
서열 6
FQGSHIPYT.
11. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 다음 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, ADM 또는 그의 항체 단편에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 단편:
Figure 112019097756626-pat00003
Figure 112019097756626-pat00004
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 SIRS, 패혈증, 당뇨병, 암, 급성 및 만성 혈관 질환, 예를 들어 심부전, 쇼크, 예를 들어 패혈성 쇼크 및 장기 기능장애, 예를 들어 신장 기능장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 카테콜아민 및/또는 정맥내 투여한 유체와 조합으로 사용될, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
14. ADM 결합 단백질 및/또는 추가의 활성 성분과 조합으로 사용될, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드 또는 제10항에 따른 조합물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편 또는 비-IG 스캐폴드를 포함하는 제약 제제.
16. 제15항에 있어서, 상기 제약 제제가 용액, 바람직하게는 사용 준비형 용액인 제약 제제.
17. 제15항에 있어서, 상기 제약 제제가 동결 건조된 상태로 존재하는 것인 제약 제제.
18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 제약 제제가 근육내 투여되는 것인 제약 제제.
19. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제약 제제가 혈관내 투여되는 것인 제약 제제.
20. 제16항에 있어서, 상기 제약 제제가 주입을 통해 투여되는 것인 제약 제제.
본 발명의 범위 내의 추가의 실시양태를 아래에 제시한다:
1. 항체 또는 단편이 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 단편이고/이거나 상기 항체가 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 것인, 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
2. 항체 또는 단편이 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 100% 향상시키고 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 조절성 ADM 항체 또는 단편인, 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하는 것인, 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
4. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 단편이 아드레노메둘린의 N-말단 단부에 결합하는 것인, 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 단편이 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 단편인, 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 단편이 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 것인, 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 SIRS, 패혈증, 패혈성 쇼크, 당뇨병, 암, 심부전, 쇼크, 장기 부전, 신장 기능장애, 급성 액체 균형장애 (dysbalance), 및 저혈압으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 패혈성 쇼크 또는 패혈증인, 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 상기 환자의 액체 균형을 조절하는 것인, 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 장기 기능장애 또는 장기 부전의 예방을 위해 사용되는 것인, 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
11. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 신장 기능장애 또는 신부전의 예방을 위해 사용되는 것인, 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 순환을 안정화시키기 위해 사용되는 것인, 환자에서 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
13. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 상기 환자의 카테콜아민 요구치를 감소시키는 것인, 환자에서 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자에 대한 사망 위험의 감소를 위해 환자에서 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 적어도 3 ㎍/kg 체중의 용량으로 투여될 수 있는 것인, 환자에서 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 제약 조성물.
본 발명의 범위 내의 추가의 실시양태를 아래에 제시한다:
1. 비-중화 항체인, 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
2. 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 단편 또는 스캐폴드이고/이거나, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 것인, 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
3. 항체 또는 단편이 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 100% 향상시키고 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 조절성 ADM 항체 또는 단편 또는 스캐폴드인, 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하는 것인, 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
5. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 단편 또는 스캐폴드가 아드레노메둘린의 N-말단 단부에 결합하는 것인, 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 단편 또는 상기 스캐폴드가 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 단편인, 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 ADM 비-Ig 스캐폴드.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 제약 물질로서 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 병태가 중증 감염, 예를 들어 수막염, 전신 염증 반응 증후군 (SIRS), 패혈증; 다른 질환, 예를 들어 당뇨병, 암, 급성 및 만성 혈관 질환, 예를 들어 심부전, 심근 경색, 졸중, 아테롬성동맥경화증; 쇼크, 예를 들어 패혈성 쇼크 및 장기 기능장애, 예를 들어 신장 기능장애, 간 기능장애, 화상, 수술, 외상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 ADM 비-Ig 스캐폴드.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 패혈성 쇼크 또는 패혈증인, 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 ADM 또는 그의 항체 단편에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 단편인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편으로서,
여기서 중쇄는 다음 서열 1, 서열 2, 또는 서열 3 중 적어도 하나를 포함하고, 경쇄는 다음 서열 4, 서열 5, 또는 서열 6 중 적어도 하나를 포함한다:
서열 1
GYTFSRYW
서열 2
ILPGSGST
서열 3
TEGYEYDGFDY
서열 4
QSIVYSNGNTY
서열 5
RVS
서열 6
FQGSHIPYT.
11. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 다음 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, ADM 또는 그의 항체 단편에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 단편:
Figure 112019097756626-pat00005
Figure 112019097756626-pat00006
Figure 112019097756626-pat00007
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태가 있는 환자에서 유체 균형을 조절하기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태가 있는 환자에서 장기 기능장애 또는 장기 부전을 예방하거나 감소시키기 위한 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
14. 제10항에 있어서, 장기가 신장 또는 간인, 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태가 있는 환자에서 순환을 안정화시키기 위한 아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
16. 제15항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 상기 환자의 카테콜아민 요구치를 감소시키는 것인, 환자에서 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관수축제, 예를 들어 카테콜아민과 조합으로 사용될 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내 투여용 유체와 조합으로 사용될 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, TNF-알파-항체와 조합으로 사용될 아드레노메둘린 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 적어도 3 ㎍/kg 체중의 용량으로 투여될 수 있는 것인, 환자의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 비-Ig-스캐폴드.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편 또는 스캐폴드를 포함하는 제약 조성물.
22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 또는 급성 질환 또는 만성 병태의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 비-Ig-스캐폴드.
23. 제22항에 있어서, 상기 질환이 패혈증인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 비-Ig-스캐폴드.
본 발명의 범위 내의 추가의 실시양태를 아래에 제시한다:
1. 환자에 대한 사망 위험의 감소를 위해 환자의 중증 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
2. 제1항에 있어서, 항체 포맷이 Fv 단편, scFv 단편, Fab 단편, scFab 단편, (Fab)2 단편 및 scFv-Fc 융합 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 아드레노메둘린의 N-말단 단부 (aa1)를 인식하고 결합하는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 단편인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 패혈증, 당뇨병, 암, 심부전, 쇼크 및 신장 기능장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 ICU 환자인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, SIRS, 패혈증, 패혈성 쇼크, 장기 부전, 신부전, 액체 균형장애 및 저혈압으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유해 사건을 예방함으로써 사망 위험이 감소되는 것인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 ADM 결합 단백질과 조합으로 사용될, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 제약 제제.
12. 제11항에 있어서, 상기 제약 제제가 용액, 바람직하게는 사용 준비형 용액인 제약 제제.
13. 제11항에 있어서, 상기 제약 제제가 동결 건조된 상태로 존재하는 것인 제약 제제.
14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 제약 제제가 근육내 투여되는 것인 제약 제제.
15. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 제약 제제가 혈관내 투여되는 것인 제약 제제.
16. 제15항에 있어서, 상기 제약 제제가 주입을 통해 투여되는 것인 제약 제제.
본 발명의 범위 내의 추가의 실시양태를 아래에 제시한다:
1. 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 비-중화 ADM 항체 또는 비-중화 아드레노메둘린 항체 단편 또는 비-중화 ADM 비-Ig 스캐폴드인, 환자에 대한 사망 위험의 감소를 위해 환자의 중증 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
2. 제1항에 있어서, 항체 포맷이 Fv 단편, scFv 단편, Fab 단편, scFab 단편, (Fab)2 단편 및 scFv-Fc 융합 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 아드레노메둘린의 N-말단 단부 (aa1)를 인식하고 결합하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 단편 또는 스캐폴드인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 것인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 중증 감염, 예를 들어 수막염, 전신 염증 반응 증후군 (SIRS), 패혈증; 다른 질환, 예를 들어 당뇨병, 암, 급성 및 만성 혈관 질환, 예를 들어 심부전, 심근 경색, 졸중, 아테롬성동맥경화증; 쇼크, 예를 들어 패혈성 쇼크 및 장기 기능장애, 예를 들어 신장 기능장애, 간 기능장애; 화상, 수술, 외상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 SIRS, 중증 감염, 패혈증, 쇼크, 예를 들어 패혈성 쇼크로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 ICU 환자인, 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, SIRS, 패혈증, 쇼크, 예를 들어 패혈성 쇼크, 급성 및 만성 혈관 질환, 예를 들어 급성 심부전, 심근 경색, 졸중; 장기 부전, 예를 들어, 신부전, 간부전, 유체 균형장애 및 저혈압으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유해 사건을 예방함으로써 사망 위험이 감소되는 것인, 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 ADM 또는 그의 항체 단편에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 단편인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편으로서,
여기서 중쇄는 다음 서열 1, 서열 2, 또는 서열 3을 포함하고, 경쇄는 다음 서열 4, 서열 5, 또는 서열 6을 포함한다:
서열 1
GYTFSRYW
서열 2
ILPGSGST
서열 3
TEGYEYDGFDY
서열 4
QSIVYSNGNTY
서열 5
RVS
서열 6
FQGSHIPYT.
12. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 다음 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, ADM 또는 그의 항체 단편에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 단편:
Figure 112019097756626-pat00008
Figure 112019097756626-pat00009
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관수축제, 예를 들어 카테콜아민 및/또는 정맥내 투여한 유체와 조합으로 사용될, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
14. ADM 결합 단백질 및/또는 추가의 활성 성분과 조합으로 사용될, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드 또는 제10항에 따른 조합물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편 또는 스캐폴드를 포함하는 제약 제제.
16. 제15항에 있어서, 상기 제약 제제가 용액, 바람직하게는 사용 준비형 용액인 제약 제제.
17. 제15항에 있어서, 상기 제약 제제가 동결 건조된 상태로 존재하는 것인 제약 제제.
18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 제약 제제가 근육내 투여되는 것인 제약 제제.
19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 제약 제제가 혈관내 투여되는 것인 제약 제제.
20. 제19항에 있어서, 상기 제약 제제가 주입을 통해 투여되는 것인 제약 제제.
21. 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 아드레노메둘린, 바람직하게는 인간 ADM의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하는 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
22. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 아드레노메둘린의 N-말단 단부 (aa 1)를 인식하고 결합하는 것인 항체 또는 단편 또는 스캐폴드.
본 발명의 범위 내의 추가의 실시양태를 아래에 제시한다:
1. 장기 기능장애 또는 장기 부전의 예방을 위해 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
2. 제1항에 있어서, 상기 장기가 신장인, 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
3. 제1항에 있어서, 항체 포맷이 Fv 단편, scFv 단편, Fab 단편, scFab 단편, (Fab)2 단편 및 scFv-Fc 융합 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 아드레노메둘린의 N-말단 단부 (aa1)를 인식하고 결합하는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 단편이 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 단편인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 패혈증, 당뇨병, 암, 심부전, 및 쇼크로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 ICU 환자인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 t1/2 (체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키고 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 조절성 항체 또는 단편인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 제약 제제.
12. 제11항에 있어서, 상기 제약 제제가 용액, 바람직하게는 사용 준비형 용액인 제약 제제.
13. 제11항에 있어서, 상기 제약 제제가 동결 건조된 상태로 존재하는 것인 제약 제제.
14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 제약 제제가 근육내 투여되는 것인 제약 제제.
15. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 제약 제제가 혈관내 투여되는 것인 제약 제제.
16. 제15항에 있어서, 상기 제약 제제가 주입을 통해 투여되는 것인 제약 제제.
본 발명의 범위 내의 추가의 실시양태를 아래에 제시한다:
1. 환자에서 장기 기능장애의 예방 또는 감소 또는 장기 부전의 예방을 위해 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료에 사용하기 위한 아드레노메둘린 (ADM) 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
2. 제1항에 있어서, 상기 장기가 신장 또는 간인, 만성 또는 급성 질환 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-Ig 스캐폴드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드가 비-중화 ADM 항체 또는 비-중화 아드레노메둘린 항체 단편 또는 비-중화 ADM 비-IG 스캐폴드인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 포맷이 Fv 단편, scFv 단편, Fab 단편, scFab 단편, (Fab)2 단편 및 scFv-Fc 융합 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 아드레노메둘린의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 아드레노메둘린의 N-말단 단부 (aa1)를 인식하고 결합하는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 단편 또는 스캐폴드가 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키는 ADM 안정화 항체 또는 단편 또는 스캐폴드인, ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 것인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 패혈증, 당뇨병, 암, 심부전, 및 쇼크로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 ADM 또는 그의 항체 단편에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 단편인 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편이고,
여기서 중쇄는 다음 서열 1, 서열 2, 또는 서열 3을 포함하고, 경쇄는 다음 서열 4, 서열 5, 또는 서열 6을 포함한다:
서열 1
GYTFSRYW
서열 2
ILPGSGST
서열 3
TEGYEYDGFDY
서열 4
QSIVYSNGNTY
서열 5
RVS
서열 6
FQGSHIPYT.
11. 제10항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 다음 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, ADM 또는 그의 항체 단편에 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 단편:
Figure 112019097756626-pat00010
Figure 112019097756626-pat00011
Figure 112019097756626-pat00012
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편 또는 스캐폴드가 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 >50%, 가장 바람직하게는 >100% 향상시키고 ADM의 생물활성을 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만으로 차단하는 조절성 항체 또는 단편 또는 스캐폴드인, 환자의 만성 또는 급성 질환의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관수축제, 예를 들어 카테콜아민 및/또는 정맥내 투여한 유체와 조합으로 사용될, 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드.
14. ADM 결합 단백질 및/또는 추가의 활성 성분과 조합으로 사용될, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 환자의 만성 또는 급성 질환 또는 급성 병태의 치료에 사용하기 위한 ADM 항체 또는 아드레노메둘린 항체 단편 또는 ADM 비-IG 스캐폴드 또는 제13항에 따른 조합물.
15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 제약 제제.
16. 제14항에 있어서, 상기 제약 제제가 용액, 바람직하게는 사용 준비형 용액인 제약 제제.
17. 제14항에 있어서, 상기 제약 제제가 동결 건조된 상태로 존재하는 것인 제약 제제.
18. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 제약 제제가 근육내 투여되는 것인 제약 제제.
19. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 제약 제제가 혈관내 투여되는 것인 제약 제제.
20. 제18항에 있어서, 상기 제약 제제가 주입을 통해 투여되는 것인 제약 제제.
실시예
본 발명에 따른 실시예 부분의 항체, 항체 단편 및 비-Ig 스캐폴드는 ADM에 결합하고, 따라서 항-ADM 항체/항체 단편/비-Ig 스캐폴드로서 간주해야 함이 강조될 것이다.
실시예 1
항체의 생성 및 그들의 친화도 상수의 결정
몇몇 인간 및 뮤린 항체를 생산하고, 그들의 친화도 상수를 결정하였다 (표 1 및 2 참조).
면역화를 위한 펩티드/접합체: 소 혈청 알부민 (BSA)에의 펩티드의 접합을 위한 추가의 N-말단 시스테인 (선택된 ADM-서열 내에 시스테인 잔기가 존재하지 않으면) 잔기를 갖는, 면역화를 위한 펩티드를 합성하였다 (표 1 참조) (제이피티 테크놀로지스 (JPT Technologies, 독일 베를린)). 술포링크-커플링 겔 (페르비오-사이언스 (Perbio-science, 독일 본))을 사용함으로써 펩티드를 BSA에 공유 연결하였다. 커플링 절차는 페르비오의 매뉴얼에 따라 수행하였다.
뮤린 항체를 다음 방법에 따라 생성하였다:
Balb/c 마우스를 제0일 및 제14일에 100 ㎍ 펩티드-BSA-접합체 (100 ㎕ 완전 프로인트 아주반트 내에 유화됨), 및 제21일 및 제28일에 50 ㎍ (100 ㎕ 불완전 프로인트 아주반트 내에 유화됨)으로 면역화하였다. 융합 실험을 수행하기 3일 전에, 동물에게 100 ㎕ 염수에 용해된 50 ㎍의 접합체를 복강내 주사 1회 및 정맥내 주사 1회로 투여하였다.
면역화된 마우스로부터의 비장세포 및 골수종 세포주 SP2/0의 세포를 37℃에서 30s 동안 1 ml 50% 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 융합시켰다. 세척 후에, 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다. 하이브리드 클론은 HAT 배지 [20% 소 태아 혈청 및 HAT-보충제로 보충한 RPMI 1640 배양 배지]에서 성장시킴으로써 선택하였다. 2주 후에, HAT 배지를 3회 계대배양을 위해 HT 배지로 교체한 후, 정상 세포 배양 배지로 복귀시켰다.
세포 배양 상청액을 융합 3주 후에 항원 특이적 IgG 항체에 대해 1차 스크리닝하였다. 양성 시험된 미세배양액을 증식을 위해 24-웰 플레이트에 옮겼다. 재시험 후에, 선택된 배양액을 클로닝하고, 제한-희석 기술을 사용하여 재클로닝하고, 이소형을 결정하였다 (또한, 문헌 [Lane, R.D. "A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas", J. Immunol. Meth. 81: 223-228, (1985)]; [Ziegler, B. et al., "Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies", Horm. Metab. Res. 28: 11-15 (1996)] 참조).
마우스 모노클로날 항체 생산:
항체를 표준 항체 생산 방법을 통해 생산하고 (문헌 [Marx et al., Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121, 1997]), 단백질 A를 통해 정제하였다. 항체 순도는 SDS 겔 전기영동 분석에 기반하여 >95%이었다.
인간 항체
인간 항체는 다음 절차에 따라 파지 디스플레이에 의해 생산하였다:
인간 나이브 항체 유전자 라이브러리 HAL7/8을 아드레노메둘린 펩티드에 대한 재조합 단일쇄 F-가변 도메인 (scFv)의 단리를 위해 사용하였다. 항체 유전자 라이브러리는 2개의 상이한 스페이서를 통해 아드레노메둘린 펩티드 서열에 연결된 비오틴 태그를 함유하는 펩티드의 사용을 포함한 패닝 전략으로 스크리닝하였다. 비-특이적으로 결합된 항원 및 스트렙타비딘 결합된 항원을 사용한 패닝 라운드의 혼합을 비-특이적 결합제의 배경을 최소화하기 위해 사용하였다. 제3 라운드의 패닝으로부터 용리된 파지를 모노클로날 scFv 발현 이. 콜라이 균주의 생성을 위해 사용하였다. 상기 클론 균주의 배양으로부터 얻은 상청액을 항원 ELISA 시험에 직접 사용하였다 (또한, 문헌 [Hust, M., Meyer, T., Voedisch, B., Ruelker, T., Thie, H., El-Ghezal, A., Kirsch, M.I., Schuette, M., Helmsing, S., Meier, D., Schirrmann, T., Dubel, S., 2011. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. Journal of Biotechnology 152, 159-170]; [Schuette, M., Thullier, P., Pelat, T., Wezler, X., Rosenstock, P., Hinz, D., Kirsch, M.I., Hasenberg, M., Frank, R., Schirrmann, T., Gunzer, M., Hust, M., Duebel, S., 2009. Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus. PLoS One 4, e6625] 참조).
양성 클론은 항원에 대한 양성 ELISA 신호, 및 스트렙타비딘 코팅된 미세역가 플레이트에 대해 음성에 기반하여 선택하였다. 추가의 특성 결정을 위해, scFv 개방 해독 프레임을 발현 플라스미드 pOPE107 (문헌 [Hust et al., J. Biotechn. 2011]) 내로 클로닝하고, 고정된 금속 이온 친화도 크로마토그래피를 통해 배양 상청액으로부터 포획하고, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
친화도 상수
아드레노메둘린에 대한 항체의 친화도를 결정하기 위해, 고정된 항체에 대한 아드레노메둘린의 결합의 운동학을 비아코어 (Biacore) 2000 시스템 (지이 헬쓰케어 유럽 게엠베하 (GE Healthcare Europe GmbH, 독일 프라이부르크))을 사용하는 무표지 표면 플라스몬 공명에 의해 결정하였다. 제조자의 지시 (마우스 항체 포획 키트; 지이 헬쓰케어)에 따라 CM5 센서 표면에 고밀도로 공유 연결된 항-마우스 Fc 항체를 사용하여 항체의 가역적 고정화를 수행하였다 (문헌 [Lorenz et al., "Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy"; Antimicrob Agents Chemother. 2011 January; 55(1): 165-173]).
모노클로날 항체를 각각 인간 및 뮤린 ADM의 아래 도시된 ADM 영역에 대해 생성시켰다. 다음 표는 추가의 실험에 사용된 얻어진 항체의 선택을 나타낸다. 선택은 표적 영역에 기반하였다:
Figure 112019097756626-pat00013
다음은 추가로 얻은 모노클로날 항체의 목록이다:
항-ADM-항체의 목록
Figure 112019097756626-pat00014
Figure 112019097756626-pat00015
효소 소화에 의한 항체 단편의 생성:
Fab 및 F(ab)2 단편의 생성은 뮤린 전장 항체 NT-M의 효소에 의한 소화에 의해 이루어졌다. a) 펩신-기반 F(ab)2 제조 키트 (피어스 (Pierce) 44988) 및 b) 파파인-기반 Fab 제조 키트 (피어스 44985)를 사용하여 항체 NT-M을 소화시켰다. 단편화 절차는 공급자에 의해 제공된 지시에 따라 수행하였다. 소화는 F(ab)2-단편화의 경우에 37℃에서 8 h 동안 수행하였다. Fab-단편화 소화는 각각 16 h 동안 수행하였다.
Fab 생성 및 정제를 위한 절차:
수지를 0.5 ml의 소화 완충제로 세척하고, 컬럼을 5000 x g에서 1분 동안 원심분리함으로써 고정된 파파인을 평형화시켰다. 그 후, 완충제를 폐기하였다. 탈염 컬럼은 저장 용액을 제거하고, 이를 소화 완충제로 세척하고, 그 후 이를 각각 1000 x g에서 2분 동안 원심분리함으로써 준비하였다. 0.5 ml의 제조된 IgG 샘플을 평형화시킨 고정된 파파인을 함유하는 회전 컬럼 튜브에 첨가하였다. 소화 반응액의 인큐베이션 시간은 37℃에서 테이블탑 로커 (tabletop rocker) 상에서 16 h 동안 이루어졌다. 컬럼을 5000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 고정된 파파인으로부터 소화물을 분리시켰다. 그 후, 수지를 0.5 ml PBS로 세척하고, 5000 x g에서 1분 동안 원심분리하였다. 총 샘플 부피가 1.0 ml이 되도록 세척액 분획을 소화된 항체에 첨가하였다. NAb 단백질 A 컬럼을 실온에서 PBS 및 IgG 용리 완충제로 평형화시켰다. 컬럼을 1분 동안 원심분리하여 저장 용액 (0.02% 나트륨 아지드를 함유함)을 제거하고, 2 ml의 PBS를 첨가하여 평형화시키고, 다시 1분 동안 원심분리하고, 관통액을 폐기하였다. 샘플을 컬럼에 적용하고, 뒤집어서 재현탁시켰다. 인큐베이션은 10분 동안 회전시켜 혼합하면서 실온에서 이루어졌다. 컬럼을 1분 동안 원심분리하고, Fab 단편을 갖는 관통액을 저장하였다.
(참고문헌: [Coulter, A. and Harris, R. (1983) J. Immunol. Meth. 59, 199-203]; [Lindner I. et al. (2010) {alpha} 2-Macroglobulin inhibits the malignant properties of astrocytoma cells by impeding {beta}-catenin signaling. Cancer Res. 70, 277-87]; [Kaufrnann B. et al. (2010) Neutralization of West Nile virus by cross-linking of its surface proteins with Fab fragments of the human monoclonal antibody CR4354. PNAS. 107, 18950-5]; [Chen X. et al. (2010) Requirement of open headpiece conformation for activation of leukocyte integrin αχβ2. PNAS. 107, 14727-32]; [Uysal H. et al. (2009) Structure and pathogenicity of antibodies specific for citrullinated collagen type II in experimental arthitis. J. Exp. Med. 206, 449-62]; [Thomas G.M. et al. (2009) Cancer cell-derived microparticles bearing P-selectin glycoprotein ligand 1 accelerate thrombus formation in vivo. J. Exp. Med. 206, 1913-27]; [Kong F. et al. (2009) Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. J. Cell Biol. 185, 1275-84])
F(ab') 2 단편의 생성 및 정제를 위한 절차:
수지를 0.5 ml의 소화 완충제로 세척하고, 컬럼을 5000 x g에서 1분 동안 원심분리함으로써 고정된 펩신을 평형화시켰다. 그 후, 완충제를 폐기하였다. 탈염 컬럼은 저장 용액을 제거하고, 이를 소화 완충제로 세척하고, 그 후 이를 각각 1000 x g에서 2분 동안 원심분리함으로써 준비하였다. 0.5 ml의 제조된 IgG 샘플을 평형화시킨 고정된 펩신을 함유하는 회전 컬럼 튜브에 첨가하였다. 소화 반응액의 인큐베이션 시간은 37℃에서 테이블탑 로커 상에서 16 h 동안 이루어졌다. 컬럼을 5000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 고정된 파파인으로부터 소화물을 분리시켰다. 그 후, 수지를 0.5 mL PBS로 세척하고, 5000 x g에서 1분 동안 원심분리하였다. 총 샘플 부피가 1.0 ml이 되도록 세척액 분획을 소화된 항체에 첨가하였다. NAb 단백질 A 컬럼을 실온에서 PBS 및 IgG 용리 완충제로 평형화시켰다. 컬럼을 1분 동안 원심분리하여 저장 용액 (0.02% 나트륨 아지드를 함유함)을 제거하고, 2 ml의 PBS를 첨가하여 평형화시키고, 다시 1분 동안 원심분리하고, 관통액을 폐기하였다. 샘플을 컬럼에 적용하고, 뒤집어서 재현탁시켰다. 인큐베이션은 10분 동안 회전시켜 혼합하면서 실온에서 이루어졌다. 컬럼을 1분 동안 원심분리하고, Fab 단편을 갖는 관통액을 저장하였다.
(참고문헌: [Mariani, M., et al. (1991) A new enzymatic method to obtain high-yield F(ab')2 suitable for clinical use from mouse IgG1. Mol. Immunol. 28: 69-77]; [Beale, D. (1987) Molecular fragmentation: Some applications in immunology. Exp Comp Immunol 11:287-96]; [Ellerson, J.R., et al. (1972) A fragment corresponding to the CH2 region of immunoglobulin G (IgG) with complement fixing activity. FEBS Letters 24(3):318-22]; [Kerbel, R.S. and Elliot, B.E. (1983) Detection of Fc receptors. Meth Enzymol 93:113-147]; [Kulkarni, P.N., et al. (1985) Conjugation of methotrexate to IgG antibodies and their F(ab')2 fragments and the effect of conjugated methotrexate on tumor growth in vivo. Cancer Immunol Immunotherapy 19:211-4]; [Lamoyi, E. (1986) Preparation of F(ab')2 Fragments from mouse IgG of various subclasses. Meth Enzymol 121:652-663]; [Parham, P., et al. (1982) Monoclonal antibodies: purification, fragmentation and application to structural and functional studies of class I MHC antigens. J Immunol Meth 53: 133-73]; [Raychaudhuri, G., et al. (1985) Human IgG1 and its Fc fragment bind with different affinities to the Fc receptors on the human U937, HL-60 and ML-1 cell lines. Mol Immunol 22(9):1009-19]; [Rousseaux, J., et al. (1980) The differential enzyme sensitivity of rat immunoglobulin G subclasses to papain and pepsin. Mol Immunol 17:469-82]; [Rousseaux, J., et al. (1983) Optimal condition for the preparation of Fab and F(ab')2 fragments from monoclonal IgG of different rat IgG subclasses. J Immunol Meth 64:141-6]; [Wilson, K.M., et al. (1991) Rapid whole blood assay for HIV-1 seropositivity using an Fab-peptide conjugate. J Immunol Meth 138:111-9]).
NT-H-항체 단편 인간화
항체 단편은 CDR-이식 방법에 의해 인간화시켰다 (문헌 [Jones, P.T., Dear, P.H., Foote, J., Neuberger, M.S., and Winter, G. (1986) Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 321, 522-525]).
인간화 서열을 달성하기 위해 다음 단계를 수행하였다:
총 RNA 추출: 퀴아젠 (Qiagen) 키트를 사용하여 NT-H 하이브리도마로부터 총 RNA를 추출하였다.
제1 라운드 RT-PCR: 퀴아젠® 원스텝 RT-PCR 키트 (Cat No. 210210)를 사용하였다. RT-PCR은 중쇄 및 경쇄에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 수행하였다. 각각의 RNA 샘플에 대해, 12개의 개별 중쇄 및 11개의 경쇄 RT-PCR 반응은 가변 영역의 리더 (leader) 서열을 덮는 축퇴 정방향 프라이머 혼합물을 사용하여 설정하였다. 역방향 프라이머는 중쇄 및 경쇄의 불변 영역 내위 위치하였다. 프라이머 내로 제한 부위를 조작하지 않았다.
반응액 설정: 5x 퀴아젠® 원스텝 RT-PCR 완충제 5.0 ㎕, dNTP 믹스 (10 mM의 각각의 dNTP 함유) 0.8 ㎕, 프라이머 세트 0.5 ㎕, 퀴아젠® 원스텝 RT-PCR 효소 믹스 0.8 ㎕, 주형 RNA 2.0 ㎕, RNase-비함유 물을 20.0 ㎕까지, 총 부피 20.0 ㎕.
PCR 조건: 역전사: 50℃, 30 min; 초기 PCR 활성화: 95℃, 15 min.
사이클링: 20 사이클의 94℃, 25 sec; 54℃, 30 sec; 72℃, 30 sec; 최종 연장: 72℃, 10 min.
제2-라운드 반-네스티드 (semi-nested) PCR: 제1-라운드 반응으로부터 RT-PCR 생성물을 제2-라운드 PCR에서 추가로 증폭시켰다. 12개의 개별 중쇄 및 11개의 경쇄 RT-PCR 반응을 항체 가변 영역에 특이적인 반-네스티드 프라이머 세트를 사용하여 설정하였다.
반응액 설정: 2x PCR 믹스 10 ㎕; 프라이머 세트 2 ㎕; 제1-라운드 PCR 생성물 8 ㎕; 총 부피 20 ㎕; 하이브리도마 항체 클로닝 리포트.
PCR 조건: 95℃에서 5 min의 초기 변성; 25 사이클의 95℃에서 25 sec, 57℃에서 30 sec, 68℃에서 30 sec; 최종 연장 68℃에서 10 min.
PCR이 끝난 후, PCR 반응 샘플을 아가로스 겔 상으로 전개시켜 증폭된 DNA 단편을 가시화한다. 네스티드 RT-PCR에 의해 증폭된 15 초과의 클로닝된 DNA 단편을 서열 결정한 후, 여러 마우스 항체 중쇄 및 경쇄를 클로닝하였고 적절한 것으로 보였다. 단백질 서열 정렬 및 CDR 분석으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 확인한다. 상동성 인간 프레임워크 서열과 정렬시킨 후, 가변 중쇄에 대한 생성되는 인간화 서열은 다음과 같다: 도 6 참조 (가변 중쇄 내의 위치 26, 40 및 55 상의 아미노산, 및 가변 경쇄 내의 위치 40 상의 아미노산은 결합 특성을 위해 중요하므로, 이들은 뮤린 기원으로 복귀될 수 있다. 생성되는 후보물을 아래에 도시한다) (문헌 [Padlan, E.A. (1991) A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties. Mol. Immunol. 28, 489-498]; [Harris, L. and Bajorath, J. (1995) Profiles for the analysis of immunoglobulin sequences: Comparison of V gene subgroups. Protein Sci. 4,306-310]).
항체 단편 서열에 대한 주석 (서열 7-14): 순서대로 배열한 CDR 1, 2, 3을 굵게 문자로 하고 밑줄치고; 불변 영역을 이탤릭체로 나타내고; 힌지 영역을 굵은 문자로 강조하고, 히스티딘 태그를 굵은 이탤릭체 문자로 강조하고; 프레임워크 점 돌연변이는 회색 문자-배경을 갖는다.
Figure 112019097756626-pat00016
Figure 112019097756626-pat00017
실시예 2
항-ADM-생물활성에 대한 선택된 항-ADM-항체의 효과
ADM-생물활성에 대한 선택된 ADM-항체의 효과를 인간 재조합 아드레노메둘린 수용체 cAMP 기능성 검정 (아드레노메둘린 생물검정)으로 시험하였다.
인간 재조합 아드레노메둘린 수용체 cAMP 기능성 검정 (아드레노메둘린 생물검정)에서 인간 또는 마우스 아드레노메둘린을 표적으로 하는 항체의 시험
재료:
세포주: CHO-K1
수용체: 아드레노메둘린 (CRLR + RAMP3)
수용체 등록 번호 세포주: CRLR: U17473; RAMP3: AJ001016.
항생제가 없는 배지 내에서 시험에 앞서 성장시킨 인간 재조합 아드레노메둘린 수용체를 발현하는 CHO-K1 세포 (FAST-027C)를 PBS-EDTA (5 mM EDTA)로 부드럽게 씻어내어 탈착시키고, 원심분리에 의해 회수하고 검정 완충제 (KRH: 5 mM KCl, 1.25 mM MgSO4, 124 mM NaCl, 25 mM HEPES, 13.3 mM 글루코스, 1.25 mM KH2PO4, 1.45 mM CaCl2, 0.5 g/l BSA) 내에 재현탁시켰다.
용량 반응 곡선은 참조 효능제 (hADM 또는 mADM)과 평행으로 수행하였다.
길항제 시험 (96 웰):
길항제 시험을 위해, 6 ㎕의 참조 효능제 (인간 (5.63 nM) 또는 마우스 (0.67 nM) 아드레노메둘린)를 상이한 길항제 희석으로 6 ㎕의 시험 샘플과; 또는 6 ㎕ 완충제와 혼합하였다. 실온에서 60 min 동안 인큐베이션 후에, 12 ㎕의 세포 (2,500 세포/웰)를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 30 min 동안 인큐베이션하였다. 용해 완충제를 첨가한 후, HTRF 키트 (시스-바이오 인터내셔널 (Cis-Bio International), cat n°62AM2 PEB)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 DeltaF의 백분율을 추정할 것이다. hADM 22-52를 참조 길항제로서 사용하였다.
항체 시험 cAMP-HTRF 검정
항-h-ADM 항체 (NT-H, MR-H, CT-H)를 다음 최종 항체 농도: 100 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 4 ㎍/ml, 0.8 ㎍/ml, 0.16 ㎍/ml에서 5.63 nM 인간 ADM 1-52의 존재 하에 인간 재조합 아드레노메둘린 수용체 (FAST-027C) cAMP 기능성 검정으로 길항제 활성에 대해 시험하였다.
항-m-ADM 항체 (NT-M, MR-M, CT-M)을 다음 최종 항체 농도: 100 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 4 ㎍/ml, 0.8 ㎍/ml, 0.16 ㎍/ml에서 0.67 nM 마우스 ADM 1-50의 존재 하에 인간 재조합 아드레노메둘린 수용체 (FAST-027C) cAMP 기능성 검정으로 길항제 활성에 대해 시험하였다. 데이터를 상대적인 억제 대 길항제 농도로 그래프로 그렸다 (도 3a 내지 3l 참조). 개별 항체에 대한 최대 억제를 표 3에 제공한다.
Figure 112019097756626-pat00018
실시예 3
항-ADM 항체에 의한 hADM의 안정화에 대한 데이터
인간 ADM 항체에 의한 인간 ADM의 안정화 효과를 hADM 면역검정을 이용하여 시험하였다.
인간 아드레노메둘린의 정량을 위한 면역검정
사용된 기술은 아크리디늄 에스테르 표지에 기반한 샌드위치 (sandwich) 코팅된 튜브 발광 면역검정이었다.
표지된 화합물 (추적물질 (tracer)): 100 ㎍ (100 ㎕) CT-H (PBS, pH 7.4 중 1 mg/ml, 아드레노메드 아게 (AdrenoMed AG, 독일))를 10 ㎕ 아크리디늄 NHS-에스테르 (아세토니트릴 중 1 mg/ml, 인벤트 게엠베하 (InVent GmbH, 독일)) (EP 0353971)와 혼합하고, 실온에서 20 min 동안 인큐베이션하였다. 표지된 CT-H를 ㅂ바이오-실 (Bio-Sil)® SEC 400-5 (바이오-라드 래보러토리즈, 인크. (Bio-Rad Laboratories, Inc., 미국)) 상에서 겔-여과 HPLC에 의해 정제하였다. 정제된 CT-H를 300 mmol/L 인산칼륨, 100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Na-EDTA, 5 g/L 소 혈청 알부민, pH 7.0 내에 희석시켰다. 최종 농도는 200 ㎕당 표지된 화합물의 약 800,000 상대 광 단위 (RLU) (약 20 ng 표지된 항체)이었다. 아크리디늄 에스테르 화학발광은 Auto-Lumat LB 953 (베르톨드 테크놀로지스 게엠베하 앤 코. 카게 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG))을 사용하여 측정하였다.
고체상: 폴리스티렌 튜브 (그라이너 바이오-원 인터내셔널 아게 (Greiner Bio-One International AG, 오스트리아))를 MR-H (아드레노메드 아게, 독일) (1.5 ㎍ MR-H/0.3 mL 100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L TRIS/HCl, pH 7.8)로 코팅하였다 (실온에서 18 h). 5% 소 혈청 알부민으로 차단시킨 후, 튜브를 PBS, pH 7.4로 세척하고, 진공 건조시켰다.
보정:
검정은 250 mmol/L NaCl, 2 g/L Triton X-100, 50 g/L 소 혈청 알부민, 20 tabs/L 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 다이아그노스틱스 아게 (Roche Diagnostics AG, 스위스)) 중의 hADM (바켐 아게 (BACHEM AG, 스위스))의 희석액을 사용하여 보정하였다.
hADM 면역검정:
50 ㎕의 샘플 (또는 보정물질 (calibrator))을 코팅된 튜브 내로 피펫팅하고, 표지된 CT-H (200 ㎕)을 첨가한 후에, 튜브를 4℃에서 4 h 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 추적물질은 세척 용액 (20 mM PBS, pH 7.4, 0.1% Triton X-100)으로 5회 (각각 1 ml) 세척함으로써 제거하였다.
튜브-결합된 화학발광은 LB 953을 사용함으로써 측정하였다.
도 4는 전형적인 hADM 용량/신호 곡선을 보여준다. 100 ㎍/mL 항체 NT-H의 존재 하에 hADM 용량 신호 곡선도 보여준다.
NT-H는 설명된 hADM 면역검정에 영향을 미치지 않았다.
인간 아드레노메둘린의 안정성:
인간 ADM을 인간 시트레이트 혈장 내에 희석하고 (최종 농도 10 nM), 24℃에서 인큐베이션하였다. 선택된 시점에서, -20℃에서 동결시켜 hADM의 분해를 중지시켰다. NT-H (100 ㎍/ml)의 존재 및 부재 하에 인큐베이션을 수행하였다. 남아있는 hADM을 상기 설명된 hADM 면역검정을 이용하여 정량하였다.
도 5는 NT-H 항체의 존재 및 부재 하에 인간 혈장 (시트레이트) 내의 hADM의 안정성을 보여준다. hADM 단독의 반감기는 7.8 h이고, NT-H의 존재 하에 반감기는 18.3 h이었다 (2.3배 더 높은 안정성).
실시예 4
패혈증 사망률 (초기 치료)
동물 모델
12-15주령 수컷 C57Bl/6 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈 (Charles River Laboratories, 독일))를 연구를 위해 사용하였다. 가벼운 이소플루란 마취 하에 복막염을 수술에 의해 유도하였다. 복강의 좌측 상부 사분면 (맹장의 정상 위치) 내에 절개를 하였다. 맹장을 노출시키고, 봉합을 소장의 삽입부에서 멀리하면서 단단한 결찰실을 맹장 주위에 놓았다. 24-게이지 바늘을 사용하여 맹장 내로 하나의 천공 상처를 만들고, 소량의 맹장 내용물을 상처를 통해 짜냈다. 맹장을 복강 내에 다시 넣고, 개복술 부위를 닫았다. 마지막으로, 동물을 음식 및 물에 자유롭게 접근하도록 하면서 그들의 케이지에 돌려보냈다. 유체 대체물로서 500 ㎕ 염수를 s.c. 제공하였다.
화합물 (NT-M, MR-M, CT-M)의 적용 및 용량
마우스를 CLP 직후에 치료하였다 (초기 치료). CLP는 맹장 결찰 및 천공 (CLP)에 대한 약어이다.
연구군
3개의 화합물을 비히클 (vehicle)에 대하여 및 대조 화합물 처리에 대하여 시험하였다. BUN (혈청 혈액 요소 질소 시험) 결정을 위해 1일 후에 채혈을 위해 각각의 군은 5마리 마우스를 포함하였다. 각각의 군당 추가로 10마리 마우스를 4일에 걸쳐 추적하였다.
군 처리 (10 ㎕/g 체중) 용량/추적 조사:
1 NT-M, 0.2 mg/ml, 4일에 걸쳐 생존.
2 MR-M, 0.2 mg/ml, 4일에 걸쳐 생존.
3 CT-M, 0.2 mg/ml, 4일에 걸쳐 생존.
4 비-특이적 마우스 IgG, 0.2 mg/ml, 4일에 걸쳐 생존.
5 대조군 - PBS, 10 ㎕/g 체중, 4일에 걸쳐 생존.
임상 화학
신장 기능에 대한 혈액 요소 질소 (BUN) 농도를 기준선 및 CLP 후 제1일에 측정하였다. 혈액 샘플을 가벼운 에테르 마취 하에 모세관을 사용하여 해면정맥동으로부터 얻었다. 측정은 AU 400 올림푸스 (Olympus) 멀티분석기를 사용하여 수행하였다. 4일 사망률을 표 4에 제공한다. 평균 BUN 농도를 표 5에 제공한다.
Figure 112019097756626-pat00019
Figure 112019097756626-pat00020
표 4로부터, NT-M 항체가 사망률을 상당히 감소시켰음을 알 수 있다. 4일 후에, NT-M 항체로 치료할 때 마우스의 70%가 생존하였다. MR-M 항체로 치료할 때 동물의 30%가 생존하였고, CT-M 항체로 치료할 때 동물의 10%가 4일 후에 생존하였다. 이와 반대로, 비특이적 마우스 IgG로 치료할 때 4일 후에 모든 마우스가 죽었다. PBS (인산염 완충 염수)를 마우스에 투여한 대조군에서 동일한 결과를 얻었다.
혈액 요소 질소 또는 BUN 시험은 신장 기능을 평가하고, 신장 질환을 진단하는 것을 돕고, 급성 또는 만성 신장 기능장애 또는 부전이 있는 환자를 모니터링하기 위해 사용된다. S-BUN 시험의 결과는 NT-M 항체가 신장을 보호하기 위해 가장 효과적이었음을 밝혀주었다.
패혈증 사망률 (후기 치료)
동물 모델
12-15주령 수컷 C57Bl/6 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 독일)를 연구를 위해 사용하였다. 가벼운 이소플루란 마취 하에 복막염을 수술에 의해 유도하였다. 복강의 좌측 상부 사분면 (맹장의 정상 위치) 내에 절개를 하였다. 맹장을 노출시키고, 봉합을 소장의 삽입부에서 멀리하면서 단단한 결찰실을 맹장 주위에 놓았다. 24-게이지 바늘을 사용하여 맹장 내로 하나의 천공 상처를 만들고, 소량의 맹장 내용물을 상처를 통해 짜냈다. 맹장을 복강 내에 다시 넣고, 개복술 부위를 닫았다. 마지막으로, 동물을 음식 및 물에 자유롭게 접근하도록 하면서 그들의 케이지에 돌려보냈다. 유체 대체물로서 500 ㎕ 염수를 s.c. 제공하였다.
화합물 (NT-M FAB2)의 적용 및 용량
NT-M FAB2를 비히클에 대하여 및 대조 화합물 처리에 대하여 시험하였다. 완전한 패혈증 발병, CLP 6시간 후에 치료를 수행하였다 (후기 치료). 각각의 군은 4마리 마우스를 포함하고, 4일에 걸쳐 추적하였다.
군 처리 (10 ㎕/g 체중) 용량/추적 조사;
연구군
1 NT-M, FAB2 0.2 mg/ml, 4일에 걸쳐 생존.
2 대조군: 비-특이적 마우스 IgG, 0.2 mg/ml, 4일에 걸쳐 생존.
3 비히클: - PBS 10 ㎕/g 체중, 4일에 걸쳐 생존.
Figure 112019097756626-pat00021
표 6으로부터, NT-M FAB2 항체가 사망률을 상당히 감소시켰음을 알 수 있다. 4일 후에, NT-M FAB2 항체로 치료할 때 마우스의 75%가 생존하였다. 이와 반대로, 비-특이적 마우스 IgG로 치료할 때 4일 후에 모든 마우스가 죽었다. PBS (인산염 완충 염수)를 마우스에 투여한 대조군에서 동일한 결과를 얻었다.
실시예 5
항생제 치료 및 카테콜아민을 통한 순환 안정화 및 유체 균형의 조절에 대한 CLP-동물에서 항-ADM 항체의 점증적 효과.
동물 모델
본 연구에서, 수컷 C57Bl/6 마우스 (8-12주령, 22-30 g)를 이용하였다. 맹장 결찰 및 천공 (CLP)에 의해 유도한 복수미생물 패혈증을 패혈성 쇼크를 연구하기 위한 모델로서 사용하였다 (문헌 [Albuszies G, et al: Effect of increased cardiac output on hepatic and intestinal microcirculatory blood flow, oxygenation, and metabolism in hyperdynamic murine septic shock. Crit Care Med 2005;33:2332-8], [Albuszies G, et al: The effect of iNOS deletion on hepatic gluconeogenesis in hyperdynamic murine septic shock. Intensive Care Med 2007;33:1094-101], [Barth E, et al: Role of iNOS in the reduced responsiveness of the myocardium to catecholamines in a hyperdynamic, murine model of septic shock. Crit Care Med 2006;34:307-13], [Baumgart K, et al: Effect of SOD-1 over-expression on myocardial function during resuscitated murine septic shock. Intensive Care Med 2009;35:344-9], [Baumgart K, et al: Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled H2S in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med 2010;38:588-95], [Simkova V, et al: The effect of SOD-1 over-expression on hepatic gluconeogenesis and whole-body glucose oxidation during resuscitated, normotensive murine septic shock. Shock 2008;30:578-84], [Wagner F, et al.: Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock, im Druck], [Wagner F, et al: Effects of intravenous H2S after murine blunt chest trauma: a prospective, randomized controlled trial, Crit Care 2011, submittes for publication]).
칭량한 후, 마우스를 120 ㎍/g 케타민, 1.25 ㎍/g 미다졸람 및 0.25 ㎍/g 펜타닐의 복강내 주사에 의해 마취시켰다. 수술 절차 동안, 체온을 37-38℃에서 유지하였다. 맹장에 접근하기 위해 1 cm 중간선 복부 절개를 수행하였다. 이어서, 맹장을 기부에 가깝게 3-0 실크 타이로 결찰시키고, 18-게이지 바늘을 사용한 단일 천공을 적용하였다. 맹장을 되돌려 넣고, 절개를 다시 닫았다 (4-0 타이). 수술 전후 액체 손실을 보충하기 위해, 진통제로서 1 ㎍/g 부프레노르핀을 함유한 0.5 ml 젖산화 링거 (Ringer's) 용액을 등쪽 진피에 피하 주사하였다. 항생작용을 위해, 마우스에게 하지를 통해 세프트리악손 30 ㎍/g 및 클린다마이신 30 ㎍/g을 피하 주사하였다.
CLP 수술 후에, 동물을 물 및 음식을 자유롭게 접근하도록 하면서 적당히 가온한 환경에서 유지하였다.
액체 요구치는 글루코스 4 ㎍/g 및 부프레노르핀 1 ㎍/g을 함유하는 0.5 ml 젖산화 링거 용액의 등쪽 피하 주사에 의해 보장하였고, 이것은 이소플루란에 의한 단기 마취 후에 8시간 주기로 적용하였다. 추가로, 하지를 통한 세프트리악손 30 ㎍/g 및 클린다마이신 30 ㎍/g의 피하 주사에 의해 항생작용을 유지하였다.
시험 물질의 투여
초기 치료
CLP 수술 및 절개 봉합 직후에, 시험 물질 항체 NT-M을 2 mg/kg 체중의 투여량 (투여 부피 88-120 ㎕)에 대해 음경 정맥 내로 주사를 통해 인산염 완충 염수 (PBS) 내의 500 ㎍/ml의 농도로 적용하였다 (5마리 동물).
후기 치료
완전한 패혈증 발병, CLP 수술 15.5 h 후에, 동물을 상기 설명된 바와 같이 마취시키고, NT-M을 2 mg/kg 체중의 투여량 (투여 부피 88-120 ㎕)에 대해 음경 정맥 내로 주사를 통해 인산염 완충 염수 (PBS) 내의 500 ㎍/ml의 농도로 적용하였다 (3마리 동물).
대조군 (6마리 동물)에게 CLP 수술 직후에 항체 없이 상응하는 양의 비히클 PBS 용액을 투여하였다 (4 ㎕/g, 88-120 ㎕).
연구군 및 실험 설정
집중 치료 모니터링 하의 뮤린 패혈성 쇼크 모델:
3, 5 및 6마리 동물의 3개의 군을 모니터링하였다. 제1군 (5마리 동물)에게 항체 NT-M을 CLP 15.5 h 후에 투여하고, 제2군에게 항체 NT-M을 CLP 수술 직후에 투여하고, 제3군에게 대등한 양의 PBS (4 ㎕/g)를 투여하였다. CLP 후의 16시간 인큐베이션 (복수미생물 패혈증이 진행하도록 하기 위해) 후에, 집중 치료 요법에 대등한 개입 및 모니터링과 함께 실험을 계속하였다. 따라서, 칭량한 후에, CLP 수술 부분에 설명된 바와 같이 동물을 마취하였다 (치료 전에 마취한 후기 치료한 동물 제외). 나머지 실험 동안 체온을 37-38℃로 유지하였다. 기관절개 및 삽관 후에, 호흡을 모니터링하고, 실험 동물 폐 인공호흡기 플렉시벤트 (Flexivent)® (엠카 테크놀로지스 (Emka Technologies), FiO2 0.5, PEEP 10 H2O, VT 8 ㎕/g, I:E 1:1.5, AF 70-140, 온도에 따라)에 의해 지지하였다.
케타민 30 ㎍/gxh 및 펜타닐 0.3 ㎍/gxh의 연속 주입으로 캐눌라를 설치한 우외경정맥을 통해 실험 내내 마취를 유지하였다. 추가로, 심박수 및 평균 동맥압 (MAP)의 연속 모니터링을 위해 우측 총경동맥에 캐눌라를 설치하였다. 콜로이드 (80 ㎕/gxh, 헥스텐드(Hextend)®)의 정맥내 (경정맥) 주입을 통해 평균 동맥압을 MAP > 65 mmHg로 유지하고, 필요한 경우에 혈관수축제로서 노르아드레날린을 콜로이드 내에 용해시켰다. 크레아티닌의 결정을 위해 0 및 4시간에 캐눌라를 설치한 경동맥으로부터 혈액 샘플 (120 ㎕)을 취하였다. 방광을 천공하고, 방광 카테터를 통해 요를 수집하였다. 실험은 6시간 후에 또는 그 이전에는 혈관수축제 투여로 MAP>65 mmHg (경정맥)이 유지될 수 없는 경우에 종결되었다.
측정된 파라미터
다음 파라미터를 측정하고 분석하였다: 노르아드레날린의 총 소비 (㎍ NA/g), 노르아드레날린의 소비율 (㎍ NA/g/h), 실험 동안 수집한 요의 총 부피, 실험의 끝에서 크레아티닌 농도 (㎍/mL) 및 평균 크레아티닌 클리어런스 (㎕/min).
Figure 112019097756626-pat00022
대조군으로서 총 6마리 마우스에 비특이적 마우스 IgG를, CLP 직후에 5마리 마우스의 군에 NT-뮤린 항체를 (초기 치료), 또는 CLP 15.5 h 후에 3마리 마우스의 군에 NT-뮤린 항체를 (후기 치료) 투여한 후 카테콜아민 요구치를 측정하였다.
카테콜아민 요구치의 감소는 순환의 안정화에 대한 척도이다. 따라서, 데이터는 ADM 항체, 특히 NT-M 항체가 순환의 상당한 안정화 및 카테콜아민 요구치의 상당한 감소를 일으킴을 보여준다. 순환-안정화 효과는 초기 치료 (CLP 직후) 및 완전한 패혈증 발병 후 치료 (후기 치료)에서 주어졌다 (도 7 참조).
유체 균형의 조절
소생술에서 초기에 및 4일에 걸쳐 점증적으로 보다 긍정적인 유체 균형은 패혈성 쇼크에서 사망 위험 증가와 연관된다. 액체 균형의 제어는 패혈증이 있는 환자의 질환의 경과에 극도로 중요하다 (문헌 [s. Boyd et al., 2011]). 위중한 환자의 액체 균형을 제어하는 것은 집중 치료 의약에서 실질적인 도전 과제로 남아있다. 표 8에서 볼 수 있는 바와 같이, NT-M 항체를 사용하는 CLP 후의 마우스 (실험 절차는 "동물 모델"을 참조한다)의 치료는 배설된 요의 총 부피를 향상시킨다. 배설된 요는 비-치료 마우스에 비해 NT-M-치료 동물에서 약 3배 더 많다. 긍정적인 치료 효과는 초기 및 후기 치료에 모두 주어졌다. 유체 균형은 또한 초기 및 후기 치료 모두에서 약 20-30% 개선되었다. 따라서, 데이터는 ADM 항체의 사용, 특히 NT ADM 항체의 사용이 환자에서 유체 균형을 조절하기 위해 유리함을 보여준다 (표 8, 및 도 8 및 9 참조).
Figure 112019097756626-pat00023
신장 기능의 개선
급성 신부전만 있는 환자들 사이에서 45% 사망률에 비해, 급성 신부전 및 패혈증의 조합은 70% 사망률과 연관된다 (문헌 [Schrier and Wang, "Mechanisms of Disease Acute Renal Failure and Sepsis"; The New England Journal of Medicine; 351:159-69; 2004]). 크레아티닌 농도 및 크레아티닌 클리어런스는 신장 기능(장애)을 모니터링하기 위한 표준 실험실 파리미터이다 (문헌 [Jacob, "Acute Renal Failure", Indian J. Anaesth.; 47(5): 367-372; 2003]). 상기 설명된 동물 실험 (초기 치료)으로부터 크레아티닌 및 크레아티닌 클리어런스 데이터를 표 9에 제공한다.
Figure 112019097756626-pat00024
대조군 패혈증 동물에 비해, NT-M 치료의 결과로서 크레아티닌 농도는 42% 저하하였고, 크레아티닌 클리어런스는 100% 초과로 개선하였다 (표 9). 데이터는 ADM-항체, 특히 NT-M의 투여가 신장 기능의 개선을 일으킴을 보여준다.
간 염증 상태의 개선
대조 동물 및 초기 치료한 동물에 대한 간 조직을 균질화하고, 용해 완충제 내에서 용해시켰다. 세포 추출액 제조를 위해, 세포를 재현탁시키고, 얼음 상에서 용해시키고, 원심분리하였다. 상청액 (단백질 추출액)을 -80℃에서 저장하였다. B 세포 내의 핵 인자 카파-경쇄 유전자 인핸서 (NF-κB)의 활성화를 전기영동 운동성 이동 검정 (EMSA) 1.2를 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 결정하였다. 세포 추출액 (10 ㎍)을 폴리-독시-이노시닉-데옥시-시티딘산 (폴리-dI-dC) 및 NF-κB (HIV κBsite)를 함유하는 32P-표지된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 (비오머스 (Biomers, 독일 울름)) (5'-GGATCCTCAACAGAGGGGACTTTCCGAGGCCA-3')과 함께 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 복합체를 천연 폴리아크릴아미드 겔에서 분리시키고, 건조시키고, X-선 필름에 노출시켰다. 포스포르이미저 (phosphorimager) 및 영상 분석기 소프트웨어 (AIDA 영상 분석기; 레이테스트 (Raytest))를 사용하여 밀도측정기에 의해 방사성 표지된 NF-κB를 정량하였다. 개별 겔 사이의 비교를 위해, 각각의 밴드의 강도를 수술 장비 및 CLP를 겪지 않은 동시에 로딩시킨 대조군 동물에 관련시켰다. 따라서, EMSA 데이터는 대조군 값에 비해 증가 배수로서 표현한다. 통계학: 달리 진술하지 않으면 모든 데이터를 중앙값 (범위)로서 제시한다. 2개의 군 사이의 차이는 쌍이 아닌 (unpaired) 샘플에 대한 만-휘트니 (Mann-Whitney) 순위 합 검정으로 분석하였다. 결과: NT-M으로 치료한 동물은 비히클 동물 (2.92 (2.50-3.81))에 비해 유의하게 약화된 간 조직 NF-κB 활성화 (2.27 (1.97-2.53))을 보여주었다 (p<0.001) (도 10 참조).
참고문헌:
1. Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V; Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35(4):396-402.
2. Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabo C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K: Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71(6):1659-67.
실시예 6
항체 NT-M의 생체내 부작용 결정
12-15주령 수컷 C57Bl/6 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 독일)를 연구를 위해 사용하였다. 6마리 마우스를 (10 ㎕/g 체중) 용량의 NT-M 0.2 mg/ml로 치료하였다. 대조군으로서, 6마리 마우스를 (10 ㎕/g 체중) PBS로 처리하였다. 생존 및 신체 상태를 14일 동안 모니터링하였다. 사망률은 두 군 모두에서 0이고, NT-M군 및 대조군 사이에 신체 상태의 차이는 없었다.
실시예 7
겐타미신-유도된 신독성
비-패혈성 급성 신장 손상 모델이 확립되었고, 이것은 겐타미신에 의해 유도된 신독성을 이용한다 (문헌 [Chiu PJS. Models used to assess renal functions. Drug Develop Res 32:247-255, 1994]). 상기 모델을 사용하여 항-아드레노메둘린 항체를 사용한 치료가 신장 기능을 개선할 수 있는지 평가하였다.
실험을 다음과 같이 수행하였다:
Figure 112019097756626-pat00025
체중 250±20 g의 8마리 수컷 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley) 래트의 군을 이용하였다. 동물에게 연속 7일 동안 겐타미신으로 120 mg/kg i.m.로 시험접종하였다 (1군 및 2군). 시험 화합물 (항-아드레노메둘린 항체 NT-M) 및 비히클 (인산염 완충 염수)을 제0일에 겐타미신 5 min 전에 정맥내 주사한 후, 제2, 4, 및 6일에 주사하였다. 체중 및 임상 징후를 매일 모니터링하였다. 얼음 상에서 24시간 요 수집을 제0, 2, 및 6일에 수행하였다. 요 시료를 Na+ 및 K+, 및 크레아티닌의 농도에 대해 검정하였다. 임상 화학시험을 위한 혈액 샘플을 제1일 (겐타미신 전), 제3일 (겐타미신 전), 및 제7일에 수집하였다. 혈청 전해질 (Na+ 및 K+), 크레아티닌, 및 BUN을 신장 기능을 평가하기 위해 모니터링한 주요 분석물이었다. 혈장 샘플을 EDTA 튜브 내에 수집하였다 (제1 및 3일: 100 ㎕; 제7일: 120 ㎕). 크레아티닌 클리어런스를 계산하였다. 요 부피, 요 전해질, 및 크레아티닌을 동물 체중 100 g당 배설된 양으로서 표현한다. 모든 동물을 제7일에 희생시켰다. 신장을 칭량하였다.
요 수집. 동물을 개별 케이지에 넣고, 여기서 요를 제0일, 제2일, 및 제6일에 24 h 동안 수집하였다. 요 부피, 요 Na+, K+, 및 크레아티닌을 측정하였다.
크레아티닌 클리어런스 (CCr)를 다음과 같이 계산하였다:
CCr (ml/24 h) = [UCr (mg/ml) x V (ml/24 h)] / SCr (mg/ml).
나트륨 (Na+)의 24-hr 요 배설을 다음과 같이 계산하였다:
UNaV (μEq/24 h) = UNa (μEq/ml) x V (ml/24 h).
NAG 및 NGAL의 24-hr 요 배설을 유사하게 계산하였다.
Na+의 분획 배설 (FENa), 또는 최종 요로 배설된 여과된 나트륨의 백분율은 요세관 Na+ 재흡수 기능의 척도이다. 이것은 다음과 같이 산출하였다:
FENa (%) = 100 x [UNa (μEq/ml) x V (ml/24 h)] / PNa (μEq/ml) X CCr (ml/24 h).
항-아드레노메둘린 항체를 사용한 치료는 제7일에 비히클에 비해 신장 기능의 여러 척도를 개선하였다: 혈청 크레아티닌 1.01 mg/dL (NT-M) 대 1.55 mg/dL (비히클) (도 11), BUN 32.08 mg/dL (NT-M) 대 52.41 mg/dL (비히클) (도 12), 내인성 크레아티닌 클리어런스 934.43 mL/24 h (NT-M) 대 613.34 mL/24 h (비히클) (도 13), Na+의 분획 배설 0.98% (NT-M) 대 1.75% (비히클) (도 14).
실시예 8
상기 설명된 마우스 CLP 모델에서, 신장 기능의 여러 파라미터에 대한 항-아드레노메둘린 항체 NT-M을 사용한 치료의 효과를 조사하였다.
NT-M은 각각 3- 및 2배 더 높은 이뇨 및 크레아티닌 클리어런스를 유발하고, 결국 실험의 끝에 보다 낮은 크레아티닌, 요소, 및 NGAL 혈액 농도를 유발하였다 (표 10 참조). 더욱이, 신장 내의 각질세포-유래 케모카인 (KC) 농도는 NT-M을 사용한 치료에 의해 유의하게 저하되었다 (도 15).
Figure 112019097756626-pat00026
실험을 다음과 같이 수행하였다:
크레아티닌, 요소, 및 호중구 젤라티나제-연관 리포칼린 (NGAL)
혈액 NGAL 농도는 시판 ELISA (마우스 NGAL, RUO 042, 바이오포르토 다이아그노스틱스 에이/에스 (BioPorto Diagnostics A/S, 덴마크 겐토프테)를 이용하여 측정하였다. 요소 및 크레아티닌 농도는 내부 표준물로서 2H3-크레아티닌 (씨디엔 이소토프스 (CDN isotopes, 캐나다 퀘백주 뿌왕뜨 끌레흐)) 및 메틸우레아 (플루카 케미칼리엔 (FlukaChemikalien, 스위스 부크스))를 사용하여 모세관 컬럼 (Otima-5MS, 마쉐리-나겔 (Macherey-Nagel, 독일 드티렌) 기체 크로마토그래피/질량 분광계 시스템 (애질런트 (Agilent) 5890/5970, 독일 뵈블링엔)으로 측정하였다. 아세토니트릴로 탈단백질화하고, 원심분리하고, 증발시켜 건조시킨 후, 상청액을 포름산 내에 재구성하고, 약한 음이온 교환 컬럼 (WCX, 페노메넥스 (Phenomenex, 독일 아샤펜부르크) 상에서 추출하였다. 아세토니트릴 + N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드 및 N-(tert-부틸디메틸실릴)-N-메틸트리플루오로아세트아미드는 각각 우레아 tert-부틸-디메틸실릴- 및 크레아티닌트리메틸실릴-유도체의 형성을 허용한다. 요소 및 크레아티닌 분석물과 내부 표준물에 대해 각각 이온 m/z 231 및 245, 및 m/z 329 및 332이 모니터링되었다. 요 배출량과 혈장 및 요 크레아티닌 농도로부터, 크레아티닌 클리어런스를 표준식을 이용하여 계산하였다.
샘플 제조
-80℃에서 저장한 신장을 PBS 내에서 균질화기로 파괴하고, 전체 세포 용해물을 위한 2-배 농축한 완충제 (100 mM Tris pH 7.6; 500 mM NaCl; 6 mM EDTA; 6 mM EGTA; 1% Triton-X-100; 0.5% NP 40; 10% 글리세롤; 프로테아제 억제제 (β-글리세롤포스페이트 2 mM; DTT 4 mM; 류펩틴 20 μM; 나트륨오르토바나데이트 0.2 mM))로 용해시키고, 후속적으로 원심분리하였다. 전체 세포 용해물을 상청액으로부터 얻고; 세포 잔류물로 이루어지는 펠렛을 폐기하였다. 단백질의 양을 상업적으로 이용가능한 단백질 검정 (바이오-라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 이용하여 광도계로 결정하고, 최종 단백질 농도가 4 ㎍/㎕이 되는 방식으로 시료를 조정하였다. 멀티플렉스- 및 EMSA 분석을 위한 샘플을 EMSA 완충제 (10 mM Hepes; 50 mM KCl; 10% 글리세롤; 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT)로 1:1 희석하고, 면여글롯을 위한 샘플을 2-배 샘플 완충제 (2% SDS; 125 mM Tris-HCl (25℃에서 pH 6.8); 10% 글리세롤; 50 mM DTT; 0.01% 브로모페놀 블루)로 1:1 희석하였다.
각질세포-유래 케모카인 (KC) 농도의 수준을 마우스 멀티플렉스 시토카인 키트 (바이오-플렉스 프로 (Bio-Plex Pro) 시토카인 검정, 바이오-라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 이용하여 결정하였고, 검정은 제조자의 지시에 따라 바이오-플렉스 서스펜션 어레이 시스템을 사용함으로써 수행하였다 (또한, 문헌 [Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402]; 및 [Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook 0, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabo C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667] 참조). 간단히 설명하면, 적절한 시토카인 표준물 및 샘플을 필터 플레이트에 첨가하였다. 샘플을 형광-표지된 마이크로비드에 화학적으로 부착된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 예비혼합된 검출 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 후속적으로 스트렙타비딘-피코에리트린을 첨가하였다. 이어서, 비드를 재현탁시키고, 시토카인 반응 혼합물을 바이오-플렉스 단백질 어레이 판독기를 사용하여 정량하였다. 데이터를 재조합 시토카인 표준물로부터 작성된 표준 곡선을 이용하여 바이오-플렉스 매니저 소프트웨어 4.1에 의해 자동으로 처리하고 분석하였다. 검정의 검출 한계 미만의 수준은 통계 목적을 위해 제로로 설정하였다.
실시예 9
상기 설명된 마우스 CLP 모델에서, 간에 대한 항-아드레노메둘린 항체 NT-M을 사용한 치료의 효과를 조사하였다.
NT-M은 간에서 각질세포-유래 케모카인 (KC) 농도의 유의한 저하를 일으켰다 (도 16).
각질세포-유래 케모카인 (KC)의 측정은 실시예 8 (신장)과 유사하게 수행하였다.
실시예 10
상기 설명된 마우스 CLP 모델에서, 혈액 순환 (혈장) 내의 여러 시토카인 및 케모카인에 대한 항-아드레노메둘린 항체 NT-M을 사용한 치료의 효과를 조사하였다.
시토카인 및 케모카인 농도
종양 괴사 인자 (TNF)-α, 인터류킨 (IL)-6, 단핵구 화학주성 단백질 (MCP)-1, 및 각질세포-유래 케모카인 (KC) 농도의 혈장 수준을 마우스 멀티플렉스 시토카인 키트 (바이오-플렉스 프로 시토카인 검정, 바이오-라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 이용하여 결정하였고, 검정은 제조자의 지시에 따라 바이오-플렉스 서스펜션 어레이 시스템을 사용함으로써 수행하였다 (또한, 문헌 [Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402]; 및 [Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoefrl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabo C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667] 참조). 간단히 설명하면, 적절한 시토카인 표준물 및 샘플을 필터 플레이트에 첨가하였다. 샘플을 형광-표지된 마이크로비드에 화학적으로 부착된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 예비혼합된 검출 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 후속적으로 스트렙타비딘-피코에리트린을 첨가하였다. 이어서, 비드를 재현탁시키고, 시토카인 반응 혼합물을 바이오-플렉스 단백질 어레이 판독기를 사용하여 정량하였다. 데이터를 재조합 시토카인 표준물로부터 작성된 표준 곡선을 이용하여 바이오-플렉스 매니저 소프트웨어 4.1에 의해 자동으로 처리하고 분석하였다. 검정의 검출 한계 미만의 수준은 통계 목적을 위해 제로로 설정하였다.
종양 괴사 인자 (TNF)-α, 인터류킨 (IL)-6 및 IL-10, 단핵구 화학주성 단백질 (MCP)-1, 및 각질세포-유래 케모카인 (KC)의 혈장 수준 및 신장 조직 농도를 상업적으로 이용가능한 "멀티플렉스 시토카인 키트" (바이오-플렉스 프로 프로시젼 프로 시토카인 검정, 바이오-라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 이용하여 결정하였고, 이것은 하나의 단일 샘플로부터 여러 파라미터를 수집할 수 있도록 한다. 검정의 개별 작업 단계를 제조자의 지시에 따라 수행하였다 (또한, 문헌 [Wagner F, Wagner K, Weber S, Stahl B, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Asfar P, Calzia E, Senftleben U, Gebhard F, Georgieff M, Radermacher P, Hysa V. Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock. Shock 2011;35:396-402]; 및 [Wagner F, Scheuerle A, Weber S, Stahl B, McCook O, Knoferl MW, Huber-Lang M, Seitz DH, Thomas J, Asfar P, Szabo C, Moller P, Gebhard F, Georgieff M, Calzia E, Radermacher P, Wagner K. Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice. J Trauma 2011;71:1659-1667] 참조).
간단히 설명하면, 형광-표지된 미세구 ("비드")를 96-웰 플레이트에 첨가한 후, 2회 세척 단계, 내부 표준물의 첨가 및 혈장- 및 신장 균질물 샘플의 첨가를 수행하였다. 후속적인 인큐베이션 동안, 단일 시토카인이 폴리스티렌-비드에 부착된 항체에 결합한다. 단일 시토카인의 검출을 위한을 시토카인-특이적인 비오틴-표지된 항체의 첨가, 및 추가의 인큐베이션 시간 후에, 후속적으로 피코에리트린-표지된 스트렙타비딘을 첨가하였다. 이어서, 추가의 인큐베이션 시간 후에, 비드를 재현탁시키고, 플레이트를 특이적 유동 세포측정기 (바이오-플렉스 서스펜션 어레이 시스템, 바이오-라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 측정할 수 있었다. 데이터를 재조합 시토카인 표준물로부터 작성된 표준 곡선을 이용하여 바이오-플렉스 매니저 소프트웨어 4.1에 의해 자동으로 처리하고 분석하였다. 혈장 수준에 대해, 농도는 pg * mL-1 단위로 제공하고, 신장 균질물의 농도를 적절한 단백질 농도로 전환시키고 pg * mg-1 단백질로 제공하였다.
NT-M은 IL-6 (도 17), IL-10 (도 18), 각질세포-유래 케모카인 (KC) (도 19), 단핵구 화학주성 단백질-1 (MCP-1) (도 20), TNF-알파 (도 21)의 혈장 농도를 유의하게 저하시켰다.
실시예 11
허혈/재관류-유도된 급성 신장 손상
또 다른 비-패혈성 급성 신장 손상 모델을 확립하였고, 여기서 급성 신장 손상을 허혈/재관류에 의해 유도시킨다 (문헌 [Nakamoto M, Shapiro JI, Shanley PF, Chan L, and Schrier RW. In vitro and in vivo protective effect of atriopeptin III on ischemic acute renal failure. J ClinInvest 80:698-705, 1987.], [Chintala MS, Bernardino V, and Chiu PJS. Cyclic GMP but not cyclic AMP prevents renal platelet accumulation following ischemia-reperfusion in anesthetized rats. J PharmacolExpTher 271:1203-1208, 1994]). 상기 모델을 항-아드레노메둘린 항체를 사용한 치료가 신장 기능을 개선할 수 있는지 평가하기 위해 사용하였다.
실험을 다음과 같이 수행하였다:
래트에서 허혈/재관류에 의해 유도된 급성 신장 손상에 대한 NT-M의 효과
연구 설계:
Figure 112019097756626-pat00027
체중 250 내지 280 g의 8마리 수컷 스프라그-돌리 래트를 사용하였다. 동물 12-hr 명/암 사이클로 유지하고, 표준 식이를 제공하고 증류수를 자유롭게 먹게 하였다. 동물에게 수술 30 min 전에 (제0일) 유체 보충제 (0.9% NaCl 및 5% 덱스트로스/1:1, 10 ml/kg p.o.)를 제공하였다. 래트를 펜토바비탈 (50 mg/kg, i.p.)로 마취시켰다. 중간선 절개를 통해 복강을 노출시킨 후, 헤파린 (100 U/kg, i.v.)을 정맥내 투여하고, 혈관 클램프를 사용하여 양쪽 신장 동맥을 45 min 동안 폐쇄하였다. 신장 클립의 제거 직후에, 혈액 재관류를 나타내는 색상 변화를 보장하기 위해 추가로 1 min 동안 신장을 관찰하였다. 시험 화합물 (NT-M) 및 비히클 (인산염 완충 염수)을 재관류 5 min 전에 정맥내 주사한 후, 제1 및 2일에 매일 주사하였다.
요 수집. 제 -1일에 허혈/재관류 24 h 전에 (-24 h 내지 0 h), 및 재관류 후 제0일 (0-24h), 제1일 (24-48h) 및 제2일 (48-72h)에 얼음 상에서 24-h 요 수집을 개시하였다.
혈액 수집: 혈장 크레아티닌/Na+/K+, 및 BUN의 결정을 위해 0.4 ml 혈액을 0 h (I RI 수술 전), 24 h (비히클 또는 TA 전), 48h (비히클 또는 TA 전) 및 72 h에 꼬리 정맥을 통해 EDTA 튜브 내로 수집하였고; 2 ml 혈액을 말단에서 대정맥을 통해 수집하였다.
동물을 개별 케이지에 넣고, 여기서 요를 제0일에 재관류 후에 제 -1일 (-24h-0h), 제0일 (0-24h), 제1일 (24-48h) 및 제2일 (48-72h)에 24 h 동안 수집하였다. 요 부피, 요 Na+, K+, 및 크레아티닌을 측정하였다.
크레아티닌 클리어런스 (CCr)를 다음과 같이 계산하였다:
CCr (ml/24 h) = [UCr (mg/ml) x V (ml/24 h)] / PCr (mg/ml).
나트륨 (Na+)의 24-hr 요 배설을 다음과 같이 계산하였다:
UNaV (μEq/24 h) = UNa (μEq/ml) x V (ml/24 h).
Na+의 분획 배설 (FENa), 또는 최종 요로 배설된 여과된 나트륨의 백분율은 요세관 Na+ 재흡수 기능의 척도이다. 이것은 다음과 같이 산출하였다:
FENa (%) = 100 x [UNa (μEq/ml) x V (ml/24 h)] / PNa (μEq/ml) X CCr (ml/24 h).
항-아드레노메둘린 항체를 사용한 치료는 신장 기능의 여러 척도를 개선하였다:
혈액 요소 질소 (BUN)는 비히클 군에서 강한 증가를 보였고 (0 h: 17.49 mg/dL, 24 h: 98.85 mg/dL, 48 h: 109.84 mg/dL, 72 h: 91.88 mg/dL), 이것은 NT-M 치료에서는 덜 뚜렷하였다 (0 h: 16.33 mg/dL, 24 h: 84.2 mg/dL, 48 h: 82.61 mg/dL, 72 h: 64.54 mg/dL) (도 22).
혈청 크레아티닌은 유사하게 전개하였다: 비히클 군 (0 h: 0.61 mg/dL, 24 h: 3.3 mg/dL, 48 h: 3.16 mg/dL, 72 h: 2.31 mg/dL), NT-M 군: (0 h: 0.59 mg/dL, 24 h: 2.96 mg/dL, 48 h: 2.31 mg/dL, 72 h: 1.8 mg/dL) (도 23).
내인성 크레아티닌 클리어런스는 제1일에 크게 하락하였고, 그 후 비히클 군보다 NT-M군에서 더 우수하게 개선되었다. 비히클 군: (0 h: 65.17 mL/h, 24 h: 3.5 mL/h, 48 h: 12.61 mL/h, 72 h: 20.88 mL/h), NT-M군: (0 h: 70.11 mL/h, 24 h: 5.84 mL/h, 48 h: 21.23 mL/h, 72 h: 26.61 mL/h) (도 24).
SEQUENCE LISTING <110> AdrenoMed AG <120> Anti-Adrenomedullin (ADM) antibody or anti-ADM antibody fragment or an anti-ADM non-Ig scaffold for use in therapy <130> B75017EP <160> 33 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Val Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 225 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly 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Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His 210 215 220 His 225 <210> 11 <211> 225 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His 210 215 220 His 225 <210> 12 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Val Leu Leu Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 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100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 14 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 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<210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe 1 5 10 15 Gly Thr Cys <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln 1 5 10 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Cys Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Asn His 1 5 10 <210> 21 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys 1 5 10 15 Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln 20 25 30 Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser 35 40 45 Pro Gln Gly Tyr Asn His 50 <210> 22 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe 1 5 10 15 Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu Thr 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln 35 40 45 Gly Tyr Asn His 50 <210> 23 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys 1 5 10 15 Arg Phe Gly Thr Cys 20 <210> 24 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys 1 5 10 15 Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln 20 25 30 Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala 35 40 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Asn His 1 5 10 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly 1 5 10 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Tyr Arg Gln Ser Met Asn 1 5 <210> 29 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys 1 5 10 15 Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln 20 25 30 <210> 30 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe 1 5 10 15 Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu Thr 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala 35 40 <210> 31 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe 1 5 10 15 Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu 20 25 30 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115

Claims (22)

  1. 서열 23인 아드레노메둘린 (ADM)의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하는 인간 또는 인간화 CDR-이식된(CDR-grafted) 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열 23인 아드레노메둘린의 N-말단 단부 (aa 1)에 결합하는 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혈청, 혈액, 혈장 내의 아드레노메둘린의 반감기 (t1/2; 체류 시간의 1/2)를 적어도 10%, 적어도 50%, >50%, 또는 >100% 향상시키는 ADM 안정화 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편인, 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, ADM의 생물활성을 80% 미만 또는 50% 미만으로 차단하는 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단일특이적 항체 또는 항체 단편인 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편인 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 서열 1, 서열 2 및 서열 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 중쇄 (H쇄), 하기 서열 4, 서열 5 및 서열 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 경쇄 (L쇄), 또는 둘 모두를 포함하는:
    서열 1
    Figure 112020023228070-pat00028

    서열 2
    Figure 112020023228070-pat00029

    서열 3
    Figure 112020023228070-pat00030

    서열 4
    Figure 112020023228070-pat00031

    서열 5
    Figure 112020023228070-pat00032

    서열 6
    Figure 112020023228070-pat00033
    ,
    인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하고:
    서열 1
    Figure 112020023228070-pat00034

    서열 2
    Figure 112020023228070-pat00035

    서열 3
    Figure 112020023228070-pat00036
    ,
    경쇄가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는:
    서열 4
    Figure 112020023228070-pat00037

    서열 5
    Figure 112020023228070-pat00038

    서열 6
    Figure 112020023228070-pat00039
    ,
    인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄가 하기 서열을 포함하고:
    서열 1
    Figure 112019097756626-pat00040

    서열 2
    Figure 112019097756626-pat00041

    서열 3
    Figure 112019097756626-pat00042
    ,
    경쇄가 하기 서열을 포함하는:
    서열 4
    Figure 112019097756626-pat00043

    서열 5
    Figure 112019097756626-pat00044

    서열 6
    Figure 112019097756626-pat00045
    ,
    인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 14를 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 갖는 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 친화도 상수가 10-7 M보다 크도록 하는 인간 ADM에 대한 친화도를 보이는 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  12. 제1항 또는 제2항에 따른 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편을 포함하고, 용액인, 제약 제제.
  13. 제1항 또는 제2항에 따른 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편을 포함하고, 사용 전에 재구성해야 하는 건조된 상태로 존재하는, 제약 제제.
  14. 제1항 또는 제2항에 따른 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편을 포함하는, TNF-알파 항체와 조합하여 사용되기 위한 제약 제제.
  15. 제11에 있어서, TNF-알파 항체와 조합하여 사용되기 위한 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  16. 서열 23인 아드레노메둘린 (ADM)의 N-말단 부분 (aa 1-21)에 결합하고, 하기 서열 1, 서열 2 및 서열 3을 포함하는 항체 중쇄 (H쇄)를 포함하고:
    서열 1
    Figure 112020023228070-pat00046

    서열 2
    Figure 112020023228070-pat00047

    서열 3
    Figure 112020023228070-pat00048
    ,
    하기 서열 4, 서열 5 및 서열 6을 포함하는 항체 경쇄 (L쇄)를 포함하고:
    서열 4
    Figure 112020023228070-pat00049

    서열 5
    Figure 112020023228070-pat00050

    서열 6
    Figure 112020023228070-pat00051
    ,
    모노클로날 항체 또는 항체 단편인,
    인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  17. 제16항에 있어서, 친화도 상수가 10-7 M보다 크도록 하는 인간 ADM에 대한 친화도를 보이는 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편.
  18. 제16항 또는 제17항에 따른 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편을 포함하고, 용액인, 제약 제제.
  19. 제16항 또는 제17항에 따른 인간 또는 인간화 CDR-이식된 항-ADM 항체 또는 그의 항-ADM 항체 단편을 포함하고, 사용 전에 재구성해야 하는 건조된 상태로 존재하는, 제약 제제.
  20. 제19항에 있어서, TNF-알파 항체와 조합하여 사용되기 위한 제약 제제.
  21. 삭제
  22. 삭제
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