CN101165067B - 肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法 - Google Patents
肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101165067B CN101165067B CN2006100220670A CN200610022067A CN101165067B CN 101165067 B CN101165067 B CN 101165067B CN 2006100220670 A CN2006100220670 A CN 2006100220670A CN 200610022067 A CN200610022067 A CN 200610022067A CN 101165067 B CN101165067 B CN 101165067B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- resin
- fmoc
- solid phase
- peptide
- adrenomedullin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 108010078680 adrenomedullin (27-52) Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 42
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 42
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 26
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Natural products OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical group ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 12
- 102000004379 Adrenomedullin Human genes 0.000 claims description 10
- 101800004616 Adrenomedullin Proteins 0.000 claims description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- ULCUCJFASIJEOE-NPECTJMMSA-N adrenomedullin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]1C(N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CSSC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)[C@@H](C)O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 ULCUCJFASIJEOE-NPECTJMMSA-N 0.000 claims description 10
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 9
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 7
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 7
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 claims description 7
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102100026651 Pro-adrenomedullin Human genes 0.000 claims description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims description 5
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 3
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims description 3
- 239000006210 lotion Substances 0.000 claims description 3
- YFJAIURZMRJPDB-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpiperidin-4-amine Chemical compound CN(C)C1CCNCC1 YFJAIURZMRJPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000006340 racemization Effects 0.000 claims description 3
- LMFSWMAJOLQYOI-UHFFFAOYSA-K CNC.O=C=C1C2=NN=NC2=CC=C1.[B+3].[F-].[F-].[F-].F Chemical compound CNC.O=C=C1C2=NN=NC2=CC=C1.[B+3].[F-].[F-].[F-].F LMFSWMAJOLQYOI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 229960004217 benzyl alcohol Drugs 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- -1 hydroxymethyl phenoxy methyl Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 claims description 2
- 238000009991 scouring Methods 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 abstract description 6
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 abstract description 4
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 abstract description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108090000932 Calcitonin Gene-Related Peptide Proteins 0.000 description 4
- FODJWPHPWBKDON-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 FODJWPHPWBKDON-IBGZPJMESA-N 0.000 description 3
- WDGICUODAOGOMO-DHUJRADRSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-5-oxo-5-(tritylamino)pentanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)CC(=O)NC(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 WDGICUODAOGOMO-DHUJRADRSA-N 0.000 description 3
- UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000001582 osteoblastic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- ZPGDWQNBZYOZTI-SFHVURJKSA-N (2s)-1-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZPGDWQNBZYOZTI-SFHVURJKSA-N 0.000 description 2
- REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](COC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 REITVGIIZHFVGU-IBGZPJMESA-N 0.000 description 2
- JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]phenyl]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C)=CC=C1C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N 0.000 description 2
- QXVFEIPAZSXRGM-DJJJIMSYSA-N (2s,3s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-methylpentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QXVFEIPAZSXRGM-DJJJIMSYSA-N 0.000 description 2
- 102100038518 Calcitonin Human genes 0.000 description 2
- 102000004414 Calcitonin Gene-Related Peptide Human genes 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000003053 piperidines Chemical class 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGNIYGNGCNXHTR-SFHVURJKSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-methylbutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UGNIYGNGCNXHTR-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=CC=C1 SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- KJYAFJQCGPUXJY-UMSFTDKQSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-oxo-4-(tritylamino)butanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C(=O)NC(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 KJYAFJQCGPUXJY-UMSFTDKQSA-N 0.000 description 1
- HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N (2s)-5-[[amino-[(2,2,4,6,7-pentamethyl-3h-1-benzofuran-5-yl)sulfonylamino]methylidene]amino]-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)NS(=O)(=O)C1=C(C)C(C)=C2OC(C)(C)CC2=C1C HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N 0.000 description 1
- LZOLWEQBVPVDPR-VLIAUNLRSA-N (2s,3r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]butanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H]([C@H](OC(C)(C)C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 LZOLWEQBVPVDPR-VLIAUNLRSA-N 0.000 description 1
- NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CC#N.OC(=O)C(F)(F)F PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000027119 gastric acid secretion Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003746 solid phase reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010671 solid-state reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开的肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法，其特征在于首先将保护氨基酸Fmoc-Ala-OH按照Fmoc多肽固相合成的方法接到树脂上，然后继续将余下的保护氨基酸依次逐个连接，再后用切肽试剂将合成的粗肽切下，最后将粗肽分离提纯即得目标肽肾上腺髓质素(27-52)。本发明反应条件温和、速率快、副反应少、提纯更容易，产率高，且由于没有采用氟化氢作为切肽试剂，还避免了对设备的腐蚀和对环境的污染。
Description
技术领域
本发明属于多肽的固相合成方法及应用技术领域，具体涉及一种肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法。
背景技术
肾上腺髓质素(adrenomedullin，ADM)是正常人体肾上腺内的表达，其在骨组织中也有高表达，并由成骨细胞分泌。
肾上腺髓质素经过人们(Corni sh J，Callon KE，Coy DH，Jiang NY，Xiao L，CooperGJ，et al.Adrenomedullin is a potent stimulator of osteoblastic activity invitro and in vivo.Am J Physiol 1997；273：E1113-20)研究发现，它与治疗骨质疏松症的药物降钙素基因的相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)间的同源性为24％，应属于CGRP家族的成员；人的ADM是由52个氨基酸残基组成，第16和21位半胱氨酸残基构成了一个链内二硫键的环状结构，这个结构特点对其生物活性作用非常重要，但提示该环状结构不是促成骨细胞增殖所必需的，而促成骨细胞增殖活性区最短是保存在如下的肾上腺髓质素(27-52)的序列中：
HO-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-H
且去除此环状结构的肽链片段的肾上腺髓质素(27-52)因失去了其对心血管系统、肺、血小板、胃酸分泌等的影响，还可避免其作为成骨药物时对人体其它系统产生的不良作用(Eguchi S，Hirata Y，Iwasaki H，Sato K，Watanabe TX，Inui T，etal.Structure-activity relationship of adrenomedullin，a novel vasodilatorypeptide，in cultured rat vascular smooth muscle cells. Endocrinology1994；135：2454-8；Cornish J. Adrenomedullin--a regulator of bone formation.Regulatory Peptides[Regul Pept]，2003Apr 15；Vol.112(1-3)，pp.79-86)。Cornish等(Cornish J，Callon KE，Coy DH，Jiang NY，Xiao L，Cooper GJ，etal.Adrenomedullin is a potent stimulator of osteoblastic activity in vitro andin vivo.Am J Physiol 1997；273：E1113-20)还通过其在体外成骨细胞培养液的研究，发现ADM(27-52)含量为0.1nmol/L时，就能刺激成骨细胞增殖。
而现有的合成肾上腺髓质素(27-52)的方法主要为Boc(叔丁氧羰基)多肽固相合成法(Cornish J，Callon KE，Coy DH，Jiang NY，Xiao L，Cooper GJ，etal.Adrenomedullin is a potent stimulator of osteoblastic activity in vitro andin vivo.Am J Physiol 1997；273：E1113-20)，虽然该方法所用的Boc保护氨基酸价格较低，但是存在着如下不足：
1、由于合成过程中需反复用酸脱除保护基，然后用氟化氢把肽段从树脂上裂解下来，因而反应条件剧烈，不可避免地会引起副反应，且使其中某些侧链保护基不稳定，导致已延长的肽链从固相支持物上的逐步损失，产率低，并使Asp(天门冬氨酸)、Lys(赖氨酸)等氨基酸残基的侧链发生变化等。
2、由于副反应产物产生较多，增大了提纯难度。
3、由于所使用氟化氢为强酸，腐蚀性强，不仅要缩短设备使用寿命，而且污染环境。
发明内容
本发明的目的是克服已有技术存在的不足，提供一种新的肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法。
本发明提供的新的肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法，其特征在于首先将保护氨基酸Fmoc-Ala-OH按照Fmoc(芴甲氧羰基)多肽固相合成的方法接到树脂上，然后继续将余下的保护氨基酸依次逐个连接，再后用切肽试剂将合成的粗肽切下，最后将粗肽分离提纯即得目标肽肾上腺髓质素(27-52)。
其中将保护氨基酸Fmoc-Ala-OH按照Fmoc多肽固相合成的方法接到树脂上是先将树脂用溶剂在室温下溶胀0.5～2h抽滤，然后将保护氨基酸Fmoc-Ala-OH、碳二亚氨类缩合剂、缩合剂4-二甲氨基哌啶，按树脂的摩尔倍数计为1.0～4.4∶1.0～4.4∶0.1～1.0的配比溶于以树脂重量计为5～40mL/g溶剂中，并将其与树脂一起在室温下搅拌反应4～72h，用洗涤液洗涤，再后用脱保护液脱除Fmoc保护基后再次洗涤，最后抽干到恒重或直接将购得的Fmoc-Ala-树脂先用溶剂在室温下溶胀0.5～2h抽滤，再用脱保护液脱除Fmoc保护基后洗涤，最后抽干到恒重；
继续将余下的保护氨基酸依次逐个连接是按ADM(27-52)的序列由C端向N端延伸，且每个保护氨基酸的连接步骤是首先将抗消旋缩合剂、脲鎓或磷鎓类缩合剂、缩合剂二异丙基乙胺和相应的保护氨基酸残基，按树脂的摩尔倍数计为1.0～4.4∶1.0～4.4∶1.0～4.4∶1.0～3.0的配比加入到脱除了Fmoc保护基的-Ala-树脂中，并加入以树脂重量计为5～40mL/g溶剂，在室温下缩合0.5～6h，然后用洗涤剂洗涤，再后用脱保护液脱除Fmoc保护基并用洗涤剂洗涤，随后重复进行缩合-洗涤-脱保护-洗涤过程直到第26个氨基酸连接完毕，所不同的是每一步循环连接的氨基酸所对应的保护氨基酸不同，每个对应的保护氨基酸均可直接购得，其中所用保护氨基酸的摩尔倍数优选1.5～2.5；
用切肽试剂将合成的粗肽切下是先将用三氟乙酸-苯甲硫醚-二巯基乙醇-苯甲醇按体积比为80～97∶1～10∶1～5∶1～5配制的切肽试剂，以树脂重量计为8～60ml/g加入，并在冰水浴下搅拌反应1～12h后过滤，然后用三氟乙酸按树脂重量计用2～8ml/g洗树脂2～5次，洗液并入滤液中进行蒸发浓缩，再加入沉淀剂沉淀，分离，残留物冷冻干燥得粗肽。
至于将粗肽分离提纯即得目标肽肾上腺髓质素(27-52)是先将粗肽用浓度为1～6mmol/L溶剂如重蒸水、50％醋酸或盐酸溶液溶解，经滤膜过滤后，用C-18柱和洗脱剂0.1％三氟乙酸水溶液和0.1％三氟乙酸-乙腈溶液梯度洗脱后得到目的肽。
上述方法中所用树脂为对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂或对-烷氧基苯甲醇树脂；所用溶剂为二氯甲烷或N-甲基吡咯烷酮；所用碳二亚氨类缩合剂为二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺；所用洗涤液为N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、甲醇中的至少一种；所用脱保护液为体积比20％或50％的吡啶与二甲基甲酰胺混合液；所用抗消旋缩合剂为1-羟基苯并三氮唑；所用脲鎓或磷鎓类缩合剂为1-羟基-苯并-三氮唑四甲基六氟磷酸盐或1-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐；所用沉淀剂为冰乙醚。
本发明与已有技术相比，具有以下优点：
1、由于本发明是采用Fmoc(芴甲氧羰基)多肽固相合成方法来合成肾上腺髓质素(27-52)，其中使用的α-氨基的保护基是Fmoc，Fmoc不仅对酸稳定，而且易与碱作用，本发明选用了碱性化合物(吡啶与二甲基甲酰胺)作脱保护剂，因而使其反应条件温和、副反应少、产率高，同时，Fmoc基团还有特征性紫外吸收，易于监测控制反应的进行。
2、由于本发明在第一肽Fmoc-Ala-OH接树脂时采用了碳二亚氨类缩合剂/4-二甲氨基哌啶为缩合催化剂，因而使其反应速率快、产率高、副反应少。
3、由于本发明在接肽过程中采用了抗消旋缩合剂、脲鎓或磷鎓类缩合剂、缩合剂二异丙基乙胺作为缩合催化剂进行接肽反应，因而不仅使其结合率高、反应时间短、副产物少，而且还可减少消旋。
4、由于本发明在第一肽Fmoc-Ala-OH接树脂时反应体系未采用二甲基甲酰胺做溶剂，因而避免了其对羟基树脂与Fmoc氨基酸的成酯反应产生的抑制，提高了缩合率。
5、由于本发明副反应产物产生较少，因而提纯更容易。
6、由于本发明没有采用氟化氢作为切肽试剂，因而避免了其对设备腐蚀和对环境的污染。
具体实施方式
下面给出实施例以对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明所作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为第一肽接树脂。
称取0.25mmol(234mg)对-烷氧基苯甲醇树脂置于固相反应器中，用二氯甲烷浸泡2h后抽滤，然后将1mmol Fmoc-Ala-OH，1mmol二环己基碳二亚胺，0.1mmol 4-二甲氨基哌啶溶于6mL的N-甲基吡咯烷酮中，加入固相反应器与对-烷氧基苯甲醇树脂一起在室温下反应2h，反应结束后，用二氯甲烷每次3ml洗涤5次，再后加入4ml 20％哌啶/二甲基甲酰胺混合溶液，摇动反应0.5h，抽滤，再用N-甲基吡咯烷酮每次2ml洗涤5次、二氯甲烷每次2ml洗涤5次以及甲醇每次3ml洗涤5次，并重复上述洗涤-脱保护-洗涤两次，最后将反应物抽干到恒重。
实施例2
本实施例为第二肽的合成。
首先向有上步反应所获树脂的固相反应器中加入按树脂的摩尔倍数计为1∶1∶1配制的1-羟基苯并三氮唑、1-羟基-苯并-三氮唑四甲基六氟磷酸盐、二异丙基乙胺的缩合试剂2mL(浓度0.45mol/L)和0.5mmolFmoc-His(Trt)-OH，并加入6ml N-甲基吡咯烷酮，在室温下缩合2h，然后用用二氯甲烷每次3ml洗涤5次，再后加入4ml 20％哌啶/二甲基甲酰胺混合溶液，摇动反应0.5h，抽滤，再用N-甲基吡咯烷酮每次2ml洗涤5次、二氯甲烷每次2ml洗涤5次以及甲醇每次3ml洗涤5次，并重复上述洗涤-脱保护-洗涤两次，最后将反应物抽干到恒重。
实施例3～26
这部分实施例是在实施例2的基础上继续合成第三肽～第二十六肽的实施例。
由于这些实施例除加入的保护氨基酸不同外，其合成流程和控制条件因与实施例2完全相同，故略去不述。值得说明的是其加入的保护氨基酸均为0.5mmol，且加入的保护氨基酸依次为：
Fmoc-Gln(Trt)-OH；
Fmoc-Ile-OH；
Fmoc-Tyr(tBu)-OH；
Fmoc-Gln(Trt)-OH；
Fmoc-Phe-OH；
Fmoc-Thr(tBu)-OH；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH；
Fmoc-Lys-(Boc)-OH；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH；
Fmoc-Lys-(Boc)-OH；
Fmoc-Asp(OtBu)-OH；
Fmoc-Asn(Trt)-OH；
Fmoc-Val-OH；
Fmoc-Ala-OH；
Fmoc-Pro-OH；
Fmoc-Arg(Pbf)-OH；
Fmoc-Ser(tBu)-OH；
Fmoc-Lys-(Boc)-OH；
Fmoc-Ile-OH；
Fmoc-Ser(tBu)-OH；
Fmoc-Pro-OH；
Fmoc-Gln(Trt)-OH；
Fmoc-Gly-OH；
Fmoc-Tyr(tBu)-OH；
实施例27
本实施例为从树脂上切肽，以获得粗肽。
首先取按体积比为90∶5∶3∶2配制的三氟乙酸-苯甲硫醚-二巯基乙醇-苯甲醇切肽试剂10ml加入到已合成的树脂肽中，然后放入冰水浴下搅拌反应1h后过滤，再将过滤后的树脂用1.5ml三氟乙酸洗3次，洗液并入滤液，放入旋转蒸发仪中进行蒸发浓缩，在浓缩液中加入20ml冰乙醚，析出白色粉末状物体，分离沉淀物，再用冰乙醚如此操作3次，将沉淀物冷冻干燥得粗肽60mg。
实施例28
本实施例为粗肽提纯，以获得目的肽。
首先将所获粗肽溶于40ml重蒸水，然后用0.5um膜过滤，将滤液放入Waters高效液相色谱仪中，通过C18柱(6mm×150mm，粒径5μm，孔径30nm)用洗脱液A：0.1％三氟乙酸水溶液，洗脱液B：0.1％三氟乙酸/乙腈溶液进行梯度洗脱，洗脱梯度30％B～50％B，洗脱时间15min，流速为1mL/min。纯化后获多肽冻干粉42mg。
Claims (5)
1.肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法，其特征在于该方法的合成步骤为：
1)将保护氨基酸Fmoc-Ala-OH按照Fmoc多肽固相合成的方法接到树脂上，具体操作是先将树脂用溶剂在室温下溶胀0.5～2h抽滤，然后将保护氨基酸Fmoc-Ala-OH、碳二亚氨类缩合剂、缩合剂4-二甲氨基哌啶，按树脂的摩尔倍数计为1.0～4.4∶1.0～4.4∶0.1～1.0的配比溶于以树脂重量计为5～40mL/g溶剂中，并将其与树脂一起在室温下搅拌反应0.5～12h，用洗涤液洗涤，再后用脱保护液脱除Fmoc保护基后再次洗涤，最后抽干到恒重或直接将购得的Fmoc-Ala-树脂先用溶剂在室温下溶胀0.5～2h抽滤，再用脱保护液脱除Fmoc保护基后洗涤，最后抽干到恒重；
2)继续将余下的保护氨基酸依次逐个连接是按ADM(27-52)的序列由C端向N端延伸，且每个保护氨基酸的连接步骤是首先将抗消旋缩合剂、脲鎓或磷鎓类缩合剂、缩合剂二异丙基乙胺和相应的保护氨基酸残基，按树脂的摩尔倍数计为1.0～4.4∶1.0～4.4∶1.0～4.4∶1.0～3.0的配比加入到脱除了Fmoc保护基的-Ala-树脂中，并加入以树脂重量计为5～40mL/g溶剂，在室温下缩合0.5～6h，然后用洗涤剂洗涤，再后用脱保护液脱除Fmoc保护基并用洗涤剂洗涤，随后重复进行缩合-洗涤-脱保护-洗涤过程直到第26个氨基酸连接完毕；
3)用切肽试剂将合成的粗肽切下的具体操作是先将用三氟乙酸-苯甲硫醚-二巯基乙醇-苯甲醇按体积比为80～97∶1～10∶1～5∶1～5配制的切肽试剂，以树脂重量计为8～60ml/g加入，并在冰水浴下搅拌反应1～12h后过滤，然后用三氟乙酸按树脂重量计用2～8ml/g洗树脂2～5次，洗液并入滤液中进行蒸发浓缩，再加入沉淀剂沉淀，分离，残留物冷冻干燥得粗肽；
4)将粗肽分离提纯即得目标肽肾上腺髓质素(27-52)，
其中所用溶剂为二氯甲烷或N-甲基吡咯烷酮；所用碳二亚氨类缩合剂为二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺；所用抗消旋缩合剂为1-羟基苯并三氮唑；所用脲鎓或磷鎓类缩合剂为1-羟基-苯并-三氮唑四甲基六氟磷酸盐或1-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐；所用脱保护液为体积比20％或50％的吡啶与二甲基甲酰胺混合液。
2.按照权利要求1所述的肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法，其特征在于所用保护氨基酸按树脂的摩尔倍数为1.5～2.5。
3.按照权利要求1或2所述的肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法，其特征在于所用树脂为对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂或对-烷氧基苯甲醇树脂；所用洗涤液为N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、甲醇中的至少一种。
4.按照权利要求1或2所述的肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法，其特征在于所用沉淀剂为冰乙醚。
5.按照权利要求3所述的肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法，其特征在于所用沉淀剂为冰乙醚。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2006100220670A CN101165067B (zh) | 2006-10-19 | 2006-10-19 | 肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2006100220670A CN101165067B (zh) | 2006-10-19 | 2006-10-19 | 肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101165067A CN101165067A (zh) | 2008-04-23 |
| CN101165067B true CN101165067B (zh) | 2011-04-20 |
Family
ID=39333936
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2006100220670A Expired - Fee Related CN101165067B (zh) | 2006-10-19 | 2006-10-19 | 肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101165067B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102047443B1 (ko) * | 2011-11-16 | 2019-11-25 | 아드레노메드 아게 | 요법에 사용하기 위한 항-아드레노메둘린 (adm) 항체 또는 항-adm 항체 단편 또는 항-adm 비-ig 스캐폴드 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1508152A (zh) * | 2002-12-17 | 2004-06-30 | 常州市第四制药厂有限公司 | 生长抑素全合成新方法 |
-
2006
- 2006-10-19 CN CN2006100220670A patent/CN101165067B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1508152A (zh) * | 2002-12-17 | 2004-06-30 | 常州市第四制药厂有限公司 | 生长抑素全合成新方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Cornish J,等.Adrenomedullin is a potent stimulator of osteoblastic activity invitro and in vivo.AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM273 6.1997,273(6),E1113-E1120. |
| Cornish J,等.Adrenomedullin is a potent stimulator of osteoblastic activity invitro and in vivo.AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM273 6.1997,273(6),E1113-E1120. * |
| 刘振南等.Fmoc固相合成法.广西民族学院学报（自然科学版）5 2.1999,5(2),109-112. |
| 刘振南等.Fmoc固相合成法.广西民族学院学报(自然科学版)5 2.1999,5(2),109-112. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101165067A (zh) | 2008-04-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8969296B2 (en) | TGFP-CAP peptide and its uses | |
| EP0406428B1 (en) | Peptide derivatives and their use | |
| JP3266311B2 (ja) | 新規ポリペプチドおよびこれを用いる抗ｈｉｖ剤 | |
| US4607023A (en) | Natriuretic | |
| DK2421887T3 (en) | A process for the preparation of degarelix | |
| JP5384342B2 (ja) | 癌のような変更された細胞遊走に関連する障害の治療のための薬理学的活性を有するペプチド | |
| CN101759777B (zh) | 一种戈舍瑞林的合成方法 | |
| CN101747426B (zh) | 一种合成普兰林肽的方法 | |
| CN101563364A (zh) | 促胰岛素肽合成 | |
| CN107383171A (zh) | 一种通过二次环化固相合成普卡那肽的方法 | |
| CN104910269B (zh) | 一种合成特立帕肽的方法 | |
| JPH04288020A (ja) | トロンボスポンジン様活性を有するペプチド類の治療学的使用 | |
| CN101735308A (zh) | 一种布舍瑞林的合成方法 | |
| CN104822702A (zh) | α-MSH和γ-MSH类似物 | |
| CN109734794A (zh) | 一种阿巴帕肽的制备方法 | |
| CN101492494A (zh) | 整合素配体环肽类似物及其环化方法 | |
| CA2095360A1 (en) | Modified hexa- and heptapeptide anaphylatoxin receptor ligands | |
| CN101085809B (zh) | 巴替非班及其类似物的合成与制备工艺 | |
| CN101165067B (zh) | 肾上腺髓质素(27-52)的固相合成方法 | |
| CN109096388A (zh) | 一种特立帕肽的制备方法 | |
| JP5611322B2 (ja) | 形質転換成長因子の活性を有するペプチド及びその用途 | |
| EP0246795A2 (en) | Synthetic natriuretic peptides | |
| JP2002508392A (ja) | シクロペプチド誘導体 | |
| EP0413839A1 (en) | GHRH analogs | |
| CN108484735A (zh) | 一类广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110420 Termination date: 20131019 |