CN101759777B - 一种戈舍瑞林的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种纯液相片段法合成戈舍瑞林的新方法。一种戈舍瑞林的合成方法，所述的戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2是由五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH与四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2在缩合剂的存在下缩合而成。本发明采用5+4的片段合成法，可直接将五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH和四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2在缩合剂的存在下缩合成戈舍瑞林。本方法不但缩短了合成周期、避免了传统方法中苛刻的反应条件，而且收率高、产品纯度好、成本低、反应条件温和、适合于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种纯液相片段法合成戈舍瑞林的新方法。
背景技术
戈舍瑞林(goserelin)是一种长效促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)，近年来日益广泛地运用于妇科领域。其化合物化学式为：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(TBU)-Leu-Arg-Pro-AZGLY-NH2，结构式如下：
戈舍瑞林的合成方法主要包括固相合成和液相合成两种。
固相合成中需要使用大量的昂贵的多肽树脂，这给企业的大规模生产带来了成本的压力，不仅如此，在最后切肽的工序中，叔丁基很容易在酸性条件下被脱除，将生成其他杂质产物。
从现有的各种资料研究状况来看，液相合成布舍瑞林是现阶段各大公司和学校科研机构的主要方法。例如：
专利WO97/48726中就报导了类似化合物的液相合成方法，采用了2+4+3的片段合成法。三个肽片段分别为：二肽片段为Pyr-His-OH，四肽片段为Trp-Ser-Tyr-X-Oet(X为D-Leu，D-Trp，D-Val)，三肽为Leu-Arg-Pro-NHEt。然后，通过制备二肽片段的HONB活化酯与四肽片段缩合，得到目标六肽化合物。通过将六肽造化得到游离羧基，之后再次制备六肽片段的HONB活化酯，然后和三肽缩合，得到目的九肽产品。但是由于在此过程中都采用HONB活化酯，操作相对比较复杂，从而导致收率下降，不适合工业化生产。
专利EP1008656报导了另外一种液相合成此类化合物的方法，也是采用了片段缩合法，但是采用的是3+2+4的片段法。三个多肽片段分别为：三肽片段Pyr-His-Trp-OR，二肽片段Z-Ser-Tyr-OR1，四肽片段为X-Leu-Arg-Pro-NHEt(D-Leu，D-Trp，D-Val)。然后通过2+4合成Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-NHEt(或者Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2)，最后，Pyr-His-Trp-OR与六肽片段缩合，在次缩合过程中的创新点在于使用了蛋白酶催化剂，但是最大的问题也正是在于使用酶催化后产物不易提纯。
另外，还有文献报导了利用迭氮化合物来合成此类化合物的方法。在文献biochemical andbiophysical research communications 1978，Vol 81，NO2，Page382-390中提到的4+3+2片段缩合法，就是采用了迭氮化合物法来片段缩合的。步骤如下：1、合成Z-Pro-X(X为Azgly-NH2，-NHEt)，然后合成二肽片段Boc-Arg(NO2)-Pro-X；2、合成Z-Tyr(Bzl)-B-Leu-Ome(B为D-Phe，D-Ser(Tbu))；3、合成Pyr-A-Trp-Ser-Ome(A为His，D-Phe)。然后，通过迭氮化合物法先将二肽和三肽缩合成Z-Tyr(Bzl)-B-Leu-Arg(NO2)-Pro-X，最后再次通过迭氮化合物法先将五肽和四肽缩合成Pyr-A-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-B-Leu-Arg(NO2)-Pro-X。虽然，采用迭氮化合物法能够有效的抑制消旋，但是由于迭氮化合物法在缩合的时候，反应条件比较苛刻，反应十分危险，所以不利于产业化生产。
在文献Journal of Medicinal Chemistry 1978，Vol21，NO10，Page1018～1024中，报导了另外一种采用迭氮化合物来合成此类化合物的方法。采用的是2+2+3+2的合成策略，具体步骤如下：1、合成二肽片段Pyr-His-Ome；2、合成二肽片段Z-Trp-Ser-Ome；3、合成三肽片段Z-Tyr(Bzl)-A-Leu-Ome(其中A为：Gly，Ser，D-Phe，D-Tyr(Ome)，D-Ser(Tbu))；4、合成Boc-Arg(NO2)-Pro-C(其中C为-Azgly-NH2，-NHEt，-Gly)；最后，将这些片段通过迭氮化合物法串联缩合起来，形成Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-A-Leu-Arg-Pro-C，但是它也存在着迭氮化合物合成法的通病，不适合产业化生产。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种适合放大生产、收率高、纯度好的戈舍瑞林合成方法，采用了5+4的片段合成法。
一种戈舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2是由五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH与四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2在缩合剂的存在下缩合而成。其合成线路如图1所示。
进一步地，所述的缩合剂优选为氯甲酸叔丁酯。
上述五肽片段中的OH可以用OMe、OH、OET、OBzl或OTbu替代。
进一步地，所述的五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH由以下步骤合成：首先合成Tyr(R5)-OMe，再与α氮端保护的R12-Ser(R4)反应，生成R12-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，脱保护，与α氮端保护的R13-Trp(R3)反应，生成R13-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，脱保护，与α氮端保护的R14-His(R2)反应，生成R14-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，脱保护，与α氮端保护的R1-Pyr反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，最后进行皂化和脱除侧链保护基，得到五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH。其合成线路如图2所示。
所述的五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH还可以由以下步骤合成：首先合成R1-Pyr的活化酯，再与羧基端保护His(R2)反应，生成R1-Pyr-His(R2)；合成R1-Pyr-His(R2)的活化酯，与羧基端保护Trp(R3)反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)的活化酯，与羧基端保护Ser(R4)反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)的活化酯，与羧基端保护Tyr(R5)反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，最后进行皂化和脱除侧链保护基，得到五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH。其合成线路如图3所示。
上述五肽片段的合成步骤中，R1可以为BOC、Z、Fmoc或H；R2可以为BOC、Z、Bzl、Trt、Tos、Bom、Dnp或H；R3可以为BOC、For、H或Z；R4可以为Bzl、H、Tbu、Z、Boc或Tos；R5可以为Bzl、H、Tbu、2，6-di-Cl-Bzl、Me、Z或2-Cl-Z；R11可以为无机盐或有机物；R12可以为BOC、Z或Fmoc；R13可以为BOC、Z或Fmoc；R14可以为BOC、Z或Fmoc。
进一步地，所述的四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2由以下步骤合成：首先合成R8-Pro-AZgly-NH2，脱保护，然后与α氮端保护、侧链R7保护的R9-Arg(R7)-OH反应，生成α氮端保护的R9-Arg(R7)-Pro-AZgly-NH2；脱保护，与α氮端保护的R10-Leu-OH反应，生成α氮端保护的R10-Leu-Arg(R7)-Pro-AZgly-NH2；脱保护，与R6-D-Ser(Tbu)-OH反应，生成R6-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg(R7)-Pro-AZgly-NH2；最后脱保护得四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2。其合成线路如图4所示。
所述的四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2还可以由以下步骤合成：首先合成R6-D-Ser(Tbu)的活化酯，然后与羧基端保护Leu反应，生成R6-D-Ser(Tbu)-Leu；合成R6-D-Ser(Tbu)-Leu的活化酯，与羧基端保护Arg(R7)反应，生成R6-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg(R7)；合成R6-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg(R7)的活化酯，与Pro-AZgly-NH2反应，生成R6-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg(R7)-Pro-AZgly-NH2；最后脱保护得四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2。其合成线路如图5所示。
上述四肽片段的合成步骤中，R6可以为BOC、Z或Fmoc；R7可以为BOC、(BOC)2、PBF、TOS、NO2、H、PMC、HCL、ADOC或Mts；R8可以为BOC、Z或Fmoc；R9可以为BOC、Z或Fmoc；R10可以为BOC、Z或Fmoc。
本发明方法适合于Pyr-A-Trp-Ser-Tyr-B-Leu-Arg-Pro-C此类化合物的合成，其中A可以为His、D-Phe；B可以为Gly、Ser、D-Phe、D-Tyr(Ome)、D-Ser(Tbu)；C可以为-Azgly-NH2，-NHEt，-Gly。在合成过程中，各种氨基酸保护基的变化，也不影响此方法的应用。
采用本发明方法5+4的片段合成法，可直接将五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH和四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2在缩合剂的存在下缩合成Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2。本方法不但缩短了合成周期、避免了传统方法中苛刻的反应条件，而且收率高、产品纯度好、成本低、反应条件温和、适合于工业化生产。
附图说明
图1是本发明一种实施方式的合成线路示意图；
其中：R1-Pyr为氨基R1保护的焦谷氨酸
His(R2)为侧链R2保护的组氨酸
Trp(R3)为侧链R3保护的色氨酸
Ser(R4)为侧链R4保护的丝氨酸
Tyr(R5)为侧链R5保护的酪氨酸
R6-D-Ser(Tbu)为D型-侧链(叔丁基)保护-氨基R6保护的丝氨酸
Leu 为亮氨酸
Arg(R7)为侧链R7保护的精氨酸
Pro 为脯氨酸
图2是五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH的一种合成线路示意图；
其中：R1-Pyr 为氨基R1保护的焦谷氨酸；
R14-His(R2)为α氮端R14保护、侧链R2保护的组氨酸；
R13-Trp(R3)为α氮端R13保护、侧链R3保护的色氨酸；
R12-Ser(R4)为α氮端R12保护、侧链R4保护的丝氨酸；
Tyr(R5)-R15为侧链R5保护的酪氨酸；
X为对硝基酯、OSU、ONB或OBT。
图3是五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH的另一种合成线路示意图；
其中：R1-Pyr为氨基R1保护的焦谷氨酸；
NH2-His(R2)-R16为羧基端R14保护、侧链R2保护的组氨酸；
NH2-Trp(R3)-R17为α氮端R13保护、侧链R3保护的色氨酸；
NH2-Ser(R4)-R18为α氮端R12保护、侧链R4保护的丝氨酸；
Tyr(R5)-R15为侧链R5保护的酪氨酸；
X为对硝基酯、OSU、ONB或OBT。
图4是四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2的一种合成线路示意图；
其中：R8-Pro为α氮端R8保护的脯氨酸；
R9-Arg(R5)为α氮端R9保护、侧链R5保护的精氨酸；
R10-Leu为α氮端R10保护的亮氨酸；
R6-D-Ser(Tbu)为α氮端R6保护、D型-侧链(叔丁基)保护的丝氨酸；
X为对硝基酯、OSU、ONB或OBT。
图5是四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2的另一种合成线路示意图；
其中：R8-Pro为α氮端R8保护的脯氨酸；
R9-Arg(R5)为α氮端R9保护，侧链R5保护的精氨酸；
R10-Leu为α氮端R10保护的亮氨酸；
R6-D-Ser(Tbu)为α氮端R6保护，D型-侧链(叔丁基)保护的丝氨酸；
X为对硝基酯、OSU、ONB或OBT。
图6是戈舍瑞林粗产品的HPLC谱图。
图7是纯化后戈舍瑞林产品的HPLC谱图。
具体实施方式
称取Fmoc-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe(20mmol)置于50毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/DMF为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(NH2-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe)。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Pyr-OH(20mmol)，NH2-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe)。
HPLC纯度：大于92％，收率为81％MS＝975(M+)。
5、Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH的合成
称取Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe(20mmol)置于50毫升的圆底烧瓶中加入2N的氢氧化钠溶液20ml和甲醇20ml，在室温下搅拌1小时，检测反应完全。加入稀酸调节PH值为2～6之间，出现大量的白色沉淀，过滤，干燥，得到白色产品(Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OH)。
将Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OH溶于6N/L的HCl/THF溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色产品(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH)。
HPLC纯度：大于93％，收率为90％MS＝705(M+1)。
实施例2合成四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2
1、Boc-Pro-AZgly-NH2的合成
称取Boc-Pro-OH(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中，用55毫升DMF溶解，之后加入HOSU(22mmol)，冰水浴下加入DCC(22mmol)的DMF溶液20毫升，室温下反应4小时，滤除沉淀，将溶液浓缩至40毫升，加入浓乙胺水溶液20毫升，室温下反应过夜，点板反应完成，滤除沉淀，将溶液除去，用乙酸乙酯溶解，用稀碱洗涤，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，得到浅黄色固体(Boc-Pro-AZgly-NH2)。
HPLC纯度：大于92％，收率为81％MS＝273(M+)。
2、Boc-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2的合成
称取Boc-Pro-AZgly-NH2(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入6N/L的HCl/THF溶
实施例1：合成五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH
1、Fmoc-Ser(Tbu)-Tyr-OMe的合成：
在50毫升的圆底烧瓶中加入Fmoc-Ser(Tbu)-OH(20mmol)，NH2-Tyr-OMe(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(Fmoc-Ser(Tbu)-Tyr-OMe)。
HPLC纯度：大于90％，收率为93％MS＝561(M+)。
2、Fmoc-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe的合成：
称取Fmoc-Ser(Tbu)-Tyr-OMe(20mmol)置于50毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/DMF为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色产品(NH2-Ser(Tbu)-Tyr-OMe)。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Fmoc-Trp(Boc)-OH(20mmol)，NH2-Ser(Tbu)-Tyr-OMe(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(Fmoc-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe)。
HPLC纯度：大于91％，收率为85％MS＝847(M+)。
3、Fmoc-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe的合成：
称取Fmoc-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe(20mmol)置于50毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/DMF为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色产品(NH2-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe)。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Fmoc-His(Boc)-OH(20mmol)，NH2-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(Fmoc-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe)。
HPLC纯度：大于89％，收率为86％MS＝1084(M+)。
4、Pyr-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(Tbu)-Tyr-OMe的合成液20毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，减压浓缩除去HCl/THF溶液，残留物中加入乙酸乙酯溶解，再减压浓缩除去乙酸乙酯，如此重复数次，直到除尽HCl，得NH2-Pro-AZgly-NH2。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Boc-Arg(NO2)-OH(20mmol)，NH2-Pro-AZgly-NH2(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(Boc-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2)。
HPLC纯度：大于93％，收率为85％MS＝483(M+)。
3、Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2的合成
称取Boc-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入6N/L的HCl/THF溶液20毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，减压浓缩除去HCl/THF溶液，残留物中加入乙酸乙酯溶解，再减压浓缩除去乙酸乙酯，如此重复数次，直到除尽HCl，得NH2-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Z-Leu-OH(20mmol)，NH2-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到固体(Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2)。
HPLC纯度：大于90％，收率为88％MS＝599(M+Na)。
4、Z-Ser(Tbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2的合成
称取Z-Leu-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入38.5％的HBr/ACOH溶液20毫升，在室温下反应15分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(NH2-Leu-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2)。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Z-Ser(Tbu)-OH(20mmol)，NH2-Leu-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到固体(Z-Ser(Tbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2)。
HPLC纯度：大于92％，收率为79％ MS＝765(M+)。
5、Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2的合成
称取Z-Ser(Tbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-AZgly-NH2(20mmol)置于250毫升的圆底烧瓶中加入10％Pd/C(1g)，甲醇100毫升，在室温下0.3MP情况下，反应4天，检测反应完全，滤除Pd/C，旋干得到白色固体(Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2)。
HPLC纯度：大于95％，收率为97％MS＝584(M+1)。
实施例3 合成Pyr-His-Typ-Ser-Tyr-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2
在50毫升的圆底烧瓶中加入Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH(20mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰盐浴下加入氯甲酸叔丁酯(8ml)，反应5-20分钟，加入NH2-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2(20mmol)的DMF溶液20毫升，在冰盐浴下反应30分钟，在室温下搅拌12小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，得到浅黄色粗产品(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2)。
HPLC纯度：大于85％，收率为70％MS＝1269(M+)。戈舍瑞林粗产品HPLC谱图如图6所示。
实施例4产品纯化
此过程共分为4个步骤：样品前处理、纯化、冻干、包装。
1、样品前处理
PH调整：使用稀TFA水溶液调整PH在1.0-3.5之间
过滤：使用直径＝300mm、孔径＝0.45um微孔滤膜过滤
2、纯化条件
2.1制备柱：15cm X 30cm柱Kromasil 10um C18反相色谱填料颗粒
2.2流动相：A：0.1％TFA水溶液 B：ACN
时间(分钟) 流动相B％ 流速(ml/min)
0 5％ 250
10 25％ 400
100 50％ 400
2.3上样
平衡：用约2个柱体积5％B流动相，平衡柱子10分钟
上样量：5g目的肽
上样流速：250ml/min
检测波长：230nm
同时监测压强
2.4收样
执行梯度洗脱，当主峰流出时开始收集馏分，直到检测器吸光度小于0.1AU时或者主峰流出后达到主要拐点时停止。同时用反向HPLC监测各馏分纯度。本方法得到的产品纯度达到98.5％以上纯度。
2.5浓缩
通过旋转蒸发仪浓缩馏分
3、冻干
冻干盘：使用大铁盘(厚度＜1cm)
预冻时间：在冷阱中预冻7h以上
冷冻干燥机冻干
4、包装
冻干成干粉后，分装于洁净容器内。
纯化后戈舍瑞林产品的HPLC谱图如图7所示。
Claims (2)
1.一种戈舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的戈舍瑞林Pyr-His- Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2是由五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH与四肽片段D-Ser(Tbu)-Leu-Arg- Pro- AZgly-NH2在缩合剂的存在下缩合而成；所述的五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH由以下步骤合成：首先合成R1-Pyr的活化酯，再与羧基端保护His(R2)反应，生成R1-Pyr-His(R2)；合成R1-Pyr-His(R2)的活化酯，与羧基端保护Trp(R3)反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)的活化酯，与羧基端保护Ser(R4)反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)的活化酯，与羧基端保护Tyr(R5)反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，最后进行皂化和脱除侧链保护基，得到五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH，其中R1为BOC、Z、Fmoc或H；R2为BOC、Z、Bzl、Trt、Tos、Bom、Dnp或H；R3为BOC、For、H或Z；R4为Bzl、H、Tbu、Z、Boc或Tos；R5为Bzl、H、Tbu、2,6-di-Cl-Bzl、Me、 Z或 2-Cl-Z。
2.如权利要求1所述戈舍瑞林的合成方法，其特征在于所述的缩合剂为氯甲酸叔丁酯。
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