PL194997B1

PL194997B1 - Sposób wytwarzania octanu amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L- -tyrozylo-D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny

Info

Publication number: PL194997B1
Application number: PL339111A
Authority: PL
Inventors: Krzysztof Bańkowski; Teresa Wachal; Elżbieta Frąckiewicz; Tadeusz Majewski; Jacek Cybulski; Wiesław Szelejewski
Original assignee: Inst Farmaceutyczny
Priority date: 2000-03-21
Filing date: 2000-03-21
Publication date: 2007-07-31
Also published as: PL339111A1

Abstract

Sposób wytwarzania octanu amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozylo-D- -(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny, znanego pod nazwą goserelina, przez kondensację metodą azydkową, znamienny tym, że kondensacji poddaje się fragment pentapeptydowy A stanowiący hydrazyd L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozyny z fragmentem pentapeptydowym B stanowiącym benzotriazolilan amidu D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny, który otrzymuje się poddając amid Na-benzyloksykarbonylo-L-prolilo-azaglicyny reakcji wodorowania wobec Pd na węglu jako katalizatorze w obecności N-hydroksybenzotriazolu, kondensując otrzymany benzotriazolilan amidu L-prolilo-azaglicyny za pomocą dicykloheksylokarbodiimidu z Na-benzyloksykarbonylo-L-argininą do benzotriazolilanu amidu Na-benzyloksykarbonylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny, z którego usuwa się osłonę Na-benzyloksykarbonylową przez katalityczne wodorowanie wobec Pd na węglu, a następnie łącząc otrzymany benzotriazolila amidu L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny z Na-benzyloksykarbonylo-L-leucyną metodą dicykloheksylokarbodiimidową z dodatkiem N-hydroksybenzotriazolu, poddając otrzymany benzotriazolilan amidu Na-benzyloksykarbonylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny wodorowaniu wobec Pd na węglu jako katalizatorze i do otrzymanego benzotriazolilanu amidu L-leucylo-L- -arginylo-L-prolilo-azaglicyny przyłączając resztę Na-benzyloksykarbonylo-D-(O-t-butylo)-seryny metodą dicykloheksylokarbodiimidową z dodatkiem N-hydroksybenzotriazolu i uwodarniając katalitycznie wobec Pd na węglu jako katalizatorze otrzymany benzotriazolilan amidu Na-benzyloksykarbonylo-D-(O-t-butylo)- -serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny, zaś produkt kondensacji fragmentów A i B w postaci surowego benzotriazolilanu amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozylo-D-(O-t-butylo)- serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny przeprowadza się w octan i oczyszcza za pomocą dwustopniowej chromatografii.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania octanu amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozylo-D-(0-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny, analogu hormonu uwalniającego gonadotropinę (GnRH-, znanego pod nazwą goserelina.

Sposób wytwarzania gosereliny znany jest z polskich opisów patentowych nr 104362 i 108860 oraz z publikacji A.S. Dutta, J.Barrington, J.A. Furr, M.B. Giles, B. Valcaccia, J.Med.Chem. 1918-1024 (1978-. Związek otrzymuje się przez połączenie dwu fragmentów peptydowych - tetrapeptydowego i heksapeptydowego, przeprowadzając kondensację metodą azydkową z pełnym blokowaniem wszystkich grup funkcyjnych bocznych aminokwasów, a mianowicie blokując funkcję guanidylową reszty argininy poprzez utworzenie wiązania kowalencyjnego z grupą nitrową, a funkcję hydroksylową tyrozyny zabezpieczając w postaci grupy benzylowej. Zastosowanie tego typu zabezpieczenia wymaga, niezależnie od metody prowadzenia syntezy, odblokowania łańcuchów bocznych aminokwasów po zakończeniu syntezy oraz oczyszczania surowego produktu reakcji poprzez kilkukrotną chromatografię podziałową na żelu Sephadex G-25. W przykładach wykonania ilustrujących powyższe opisy patentowe nie zamieszczono dokładnych danych odnośnie czystości otrzymanej gosereliny.

W literaturze patentowej, na przykład w polskim opisie patentowym nr 167 504 ujawniono także opis syntezy gosereliny w fazie stałej na specjalnie modyfikowanej żywicy.

Celem wynalazku było uzyskanie amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozylo-D-(O-t-butylo--serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny w postaci octanu o wysokiej czystości, odpowiedniej do sporządzania farmaceutycznych postaci leków, podawanych w postaci iniekcji, implantów podskórnych lub spray'ów donosowych.

Okazało się, że cel ten można osiągnąć kondensując odpowiednie fragmenty peptydowe bez zabezpieczania grup bocznych łańcuchów aminokwasów i nie stosując oczyszczania peptydów otrzymywanych w cyklu kolejnych reakcji wydłużania łańcucha obu fragmentów peptydowych, przeprowadzając otrzymany w wyniku kondensacji surowy polipeptyd w octan i oczyszczając go dopiero po kondensacji fragmentów peptydowych.

Strategia łączenia fragmentów peptydowych metodą azydkową, w której wszystkie grupy funkcyjne w łańcuchach bocznych aminokwasów takich jak tyrozyna, seryna, histydyna, tryptofan pozostają nieblokowane natomiast reszta guanidylowa argininy blokowana jest poprzez protonowanie N-hydroksy-benzotriazolem, znana jest z polskich patentów dotyczących otrzymywania analogów LHRH: z patentu nr 161 342 dla luliberyny, nr 170 653 dla busereliny i nr 167 139 dla przeznaczonego do syntezy busereliny octanu tetrapeptydu Z-D-Ser(Bu---Leu-Arg(HOBt--Pro-NHEt. Wszystkie te syntezy charakteryzuje niedogodność ograniczająca możliwość ich szerokiego stosowania, a mianowicie konieczność wstępnego oczyszczania fragmentów peptydowych metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym i przeprowadzenie ich w octan przed finalną kondensacją, a następnie powtórnego oczyszczania metodą chromatograficzną surowego peptydu końcowego. Mimo dwukrotnego oczyszczania czystość finalnego produktu nie jest zadawalająca i wynosi na przykład w przypadku busereliny 96,6% (HPLC-.

Istota sposobu wytwarzania octanu amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozylo-D-(O-t-butylo--serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny na drodze kondensacji metodą azydkową według wynalazku polega na tym, że poddaje się kondensacji fragment pentapeptydowy A stanowiący hydrazyd L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozyny z fragmentem pentapeptydowym B stanowiącym benzotriazolilan amidu D-(O-t-butylo--serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny z wytworzeniem surowego benzotriazolilanu amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozylo-D-(O-t-butylo--serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny, który następnie przeprowadza się w octan i jednocześnie oczyszcza za pomocą dwustopniowej chromatografii.

Fragmenty pentapeptydowe A i B otrzymuje się metodą przyłączania kolejnych aminokwasów i wydłużania łańcucha peptydowego, z zastosowaniem znanych w chemii peptydów procedur, kondensując w roztworze odpowiednie aminokwasy lub grupy aminokwasów w obecności czynnika kondensującego, który stanowią na przykład karbodiimidy.

Fragment pentapeptydowy B, który stanowi benzotriazolilan amidu D-(O-t-butylo--serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny otrzymuje się wychodząc z amidu N“-benzyloksykarbonylo-L-prolilo-azaglicyny poddając go reakcji wodorowania w obecności N-hydroksybenzotriazolu, kondensując otrzymany benzotriazolilan amidu L-prolilo-azaglicyny za pomocą dicykloheksylokarbodiimidu z N“-benzyloksykarbonylo-L-argininą do benzotriazolilanu amidu N“-benzyloksykarbonylo-L-arginyloPL 194 997 B1

-L-prolilo-azaglicyny, z którego usuwa się osłonę N“-benzyloksykarbonylową przez katalityczne wodorowanie, a następnie łącząc otrzymany benzotriazolilanu amidu L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny z N“-benzyloksykarbonylo-L-leucyną metodą dicykloheksylokarbodiimidową z dodatkiem N-hydroksybenzotriazolu, następnie poddaje się otrzymany benzotriazolilan amidu N“-benzyloksykarbonylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny wodorowaniu i do produktu benzotriazolilanu amidu L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny przyłącza resztę N“-benzyloksykarbonylo-D-(O-t-butylo)-seryny metodą dicykloheksylokarbodiimidową z dodatkiem N-hydroksybenzotriazolu i uwodarnia otrzymany benzotriazolilan amidu N“-benzyloksykarbonylo-D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny.

Korzystny sposób otrzymywania fragmentu pentapeptydowego B jest następujący. Jako związek wyjściowy stosuje się amid N“-benzyloksykarbonylo-L-prolilo-azaglicyny, którego synteza opisana w polskim opisie patentowym nr 108860 i polega na łączeniu N“-benzyloksykarbonylo-L-proliny z amidem azaglicyny (semikarbazydem) metodą dicykloheksylokarbodiimidową (DCC) z N-hydroksybenzotriazolem (HOBt) w dimetyloformamidzie (DMF). Metodą tą otrzymuje się produkt z wydajnością 53,9%. W sposobie według wynalazku związek ten otrzymuje się metodą mieszanych bezwodników z chloromrówczanem izobutylu w dimetyloformamidzie z wydajnością 87,3% po krystalizacji z wody.

Uzyskany amid N“-benzyloksykarbonylo-L-prolilo-azaglicyny poddaje się wodorowaniu wobec katalizatora, na przykład 10%Pd/C w roztworze DMF w temperaturze 40-50°C w obecności HOBt aby uniknąć cyklizacji produktu. Otrzymany z wydajnością ilościową benzotriazolilan amidu L-proliloazaglicyny kondensuje się za pomocą DCC z N“-benzyloksy-karbonylo-L-argininą w DMF do benzotriazolilanu amidu N“-benzyloksykarbonylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny. Związek ten poddaje się wodorolizie wobec katalizatora (na przykład 10% Pd/C) w roztworze metanolowym w temperaturze 35-40°C i otrzymany z ilościową wydajnością benzotriazolilan amidu L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny łączy się z N“-benzyloksykarbonylo-L-leucyną metodą DCC/ HOBt w dimetyloformamidzie do benzotriazolilanu amidu N“-benzyloksykarbonylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny. Po usunięciu z tego produktu grupy benzyloksykarbonylowej na drodze katalitycznego wodorowania wobec katalizatora (10% Pd/C) w roztworze metanolowym w temperaturze pokojowej, otrzymuje się benzotriazolilanu amidu L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny. Ten produkt sprzęga się z N“-benzyloksykarbonylo-D-(O-t-butylo)-seryną metodą DCC/ HOBt w dimetyloformamidzie otrzymując blokowany pentapetyd: benzotriazolilan amidu N“-benzyloksykarbonylo-D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginyloL-prolilo-azaglicyny. Ze związku tego usuwa się grupę benzyloksykarbonylową na drodze katalitycznego wodorowania wobec katalizatora (Pd/C) w roztworze metanolowym w temperaturze 30-40°C, otrzymując benzotriazolilan amidu D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny.

W sposobie według wynalazku N“-benzyloksykarbonylowe pochodne tri-, tetra- i pentapeptydu tworzące się w wyniku przedłużania łańcucha peptydowego oczyszcza się jedynie poprzez proste ekstrakcje, natomiast zasadniczo nie oczyszcza się powstających w wyniku wodorowania pochodnych di-, tri-, tetra- i pentapeptydu z wolną grupą aminową. Grupa ta jest częściowo sprotonowana nadmiarem N-hydroksybenzotriazolu co nie ma wpływu na przebieg dalszych reakcji kondensacji. Taki sposób postępowania znacznie upraszcza oraz przyśpiesza przebieg syntezy.

Postęp reakcji i czystość produktów przejściowych kontroluje się metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).

W końcowej reakcji kondensacji metodą azydkową stosuje się surowy benzotriazolilan amidu D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny - fragment B o czystości około 70% (wg. HPLC). Stwierdzono, że zastosowanie amidu D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-proliloazaglicyny w postaci soli benzotriazolilowej nie przeszkadza w kondensacji metodą azydkową; co więcej - składnik aminowy nie wymaga dokładnego oczyszczania metodami chromatograficznymi przed reakcją. Unika się w ten sposób żmudnego i kosztownego etapu oczyszczania.

Hydrazyd pentapeptydu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozyny stanowiący fragment A otrzymuje się w znany z techniki sposób, analogiczny do zaproponowanego w publikacji E.Masiukiewicz, B.Rzeszotarska, S.Wiejak; Polish J. Chem. 69, 674-680 (1975).

Przed kondensacją obu fragmentów polipeptydowych metodą azydkową hydrazyd pentapeptydu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozyny (fragment A) przeprowadza się w azydek, dodając do roztworu tego związku w dimetyloformamidzie azotyn alkilu i roztwór chlorowodoru w tetrahydrofuranie w temperaturze poniżej -10°C. Następnie dodaje się w obniżonej temperaturze nieoczyszczany fragment B oraz trietyloaminę i reakcję kontynuuje przez około 70 godzin. Po zatężeniu mieszaniny reakcyjnej uzyskany surowy octan amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L4

PL 194 997 B1

-serylo-L-tyrozylo-D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny w postaci soli N-benzotriazolilowej poddaje się dwuetapowemu oczyszczaniu.

Wstępne chromatograficzne oczyszczanie gosereliny przeprowadza się metodą flash chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Korzystny układ rozpuszczalników eluujących stanowi chloroform metanol kwas octowy. W wyniku chromatografii uzyskuje się goserelinę w postaci octanu. Zawartość octanu gosereliny we frakcjach sprawdza się metodą analitycznej chromatografii HPLC i łączy się oddzielnie oraz zagęszcza pod zmniejszonym ciśnieniem frakcje zawierające ponad 80% octanu gosereliny i frakcje zawierające 40-75% octanu gosereliny. Ilość tak wyizolowanego octanu gosereliny odpowiada łącznej wydajności kondensacji i oczyszczania około 46%. Materiał o niższej zawartości octanu gosereliny zawraca się do powtórnego procesu oczyszczania metodą flash chromatografii.

Wstępnie oczyszczony octan gosereliny z poprzedniego etapu poddaje się w znany z polskiego zgłoszenia patentowego P-308973 sposób preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC w układzie odwróconych faz, stosując jako fazę ruchomą gradientowy układ rozpuszczalników, z których pierwszy stanowi wodny roztwór kwasu octowego o stężeniu 0,5 do 2% obj., a drugi składa się z 50 do 100% obj. polarnego rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą, 0 do 49,5% obj. wody i 0 do 2% obj. kwasu octowego. Zawartość produktu we frakcjach sprawdza się metodą analitycznej chromatografii HPLC. Łączy się oddzielnie frakcje dające po odparowaniu acetonitrylu pod zmniejszonym ciśnieniem, rozcieńczeniu wodą i liofilizacji octan gosereliny o czystości około 80-95%, oraz oddzielnie najczystsze frakcje, które po odparowaniu acetonitrylu pod zmniejszonym ciśnieniem, rozcieńczeniu wodą i liofilizacji dają octan gosereliny o czystości ponad 98% (wg. HPLC). Jednorodność związku potwierdzają badania chromatograficzne (TLC) przeprowadzone w kilku układach chromatograficznych, poprawne wyniki analizy aminokwasowej oraz właściwe widmo masowe (pik molekularny).

Sposób według wynalazku pozwala na uniknięcie szeregu zbędnych i pracochłonnych etapów oczyszczania produktów pośrednich, co wpływa na skrócenie czasu syntezy i zwiększenie wydajności cennego produktu w stosunku do rozwiązań znanych ze stanu techniki.

Sposób według wynalazku umożliwia otrzymanie octanu amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozylo-D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny o czystości ponad 98% z wydajnością około 20% w przeliczeniu na fragment pentapeptydowy B. Ponadto uzyskuje się wydajność około 18% w przeliczeniu na fragment peptydowy B octanu amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozylo-D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny o czystości rzędu 85-90%, która to frakcja zawracana jest do procesu, wpływając na zwiększenie wydajności sumarycznej.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady.

W przykładach zastosowano następujące skróty:

pGlu: kwas paraglutaminowy

His: L-histydyna

Trp: L-tryptofan

Ser: L-seryna

Tyr: L-tyrozyna

Leu: L-leucyna

Arg: L-arginina

Pro: L-prolina

Azgly: azaglicyna (H2N-NH-COOH) t-Bu: tert-butyl

HOBt: N-hydroksybenzotriazol

Z: N“-benzyloksykarbonyl

DCC: dicykloheksylokarbodiimid.

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie amidu N“-benzyloksykarbonylo-L-prolilo-azaglicyny (Z-Pro-Azgly-NH2)

N“-benzyloksykarbonylo-L-prolinę (99,8 g, 0,4 mola) rozpuszczono w dimetyloformamidzie (300 ml), dodano trietyloaminę (55 ml, 0,4 mola) i roztwór oziębiono do temperatury - 20°C. Następnie mieszając wkroplono chloromrówczan izobutylu (52 ml, 0,4 mola) i po 4 minutach dodano zimny roztwór chlorowodorku semikarbazydu (azaglicyny) (55,8 g, 0,5 mola) i trietyloaminy (9,5 ml, 0,5 mola) w 300 ml DMF. Po jednogodzinnym mieszaniu w 0°C i jednogodzinnym mieszaniu w temperaturze

PL 194 997 B1 pokojowej odsączono chlorowodorek trietyloaminy, przemyto go 25 ml DMF i przesącz z przemywem zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt krystalizowano z wody. Otrzymano 106,8 g amidu N“-benzyloksykarbonylo-L-prolilo-azaglicyny (Z-Pro-Azgly-NH₂) w postaci białego krystalicznego osadu. Wydajność (87,3%). Temp. topn. 181-182°C. Związek jednorodny (TLC na płytkach z żelem krzemionkowym, Rf 0,74 w układzie etanol : chloroform = 4:1).

P rz yk ł a d 2. Wytwarzanie benzotriazolilanu amidu D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny (D-Ser(Bu‘)-Leu-Arg(HOBt)-Pro-Azgly-NH₂)

30,6 g (0,1 mola) Z-Pro-Azgly-NH2 rozpuszczono w 200 ml DMF dodano wodzian N-hydroksybenzotriazolu 15,32 g (0,1 mola), 2 g 10%Pd/C i wodorowano 5 godzin mieszając w temperaturze 40-50°C. Katalizator odsączono przez warstwę Celitu (4 g) i DMF odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt zadano 100 ml metanolu, który odparowano uzyskując produkt, benzotriazolilan amidu L-prolilo-azaglicyny (HOBt · Pro-Azgly-NH2), w postaci białej pianki. Związek jednorodny (TLC na płytkach z żelem krzemionkowym, Rf 0,10 w układzie etanol : chloroform = 4:1).

Z-Arg 27,72 g (90 mM) i HOBt Pro-Azgly-NH2 (35,1 g) rozpuszczono w 250 ml DMF i dodano 13,8 g (90 mM) wodzianu N-hydroksybenzotriazolu. Roztwór oziębiono do temperatury -5°C i dodano oziębiony do temperatury 0°C roztwór 20,4 g (99 mM) dicykloheksylokarbodiimidu w 50 ml DMF. Reakcję prowadzono mieszając przez 1 godzinę w temperaturze -5°C i w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Odsączono osad dicykloheksylomocznika, rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując olej, który rozpuszczono w 900 ml n-butanolu i przemywano kolejno nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (3 x 300 ml) i solanką (100 ml). Warstwę butanolową wysuszono bzw. siarczanem magnezu i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Lepką piankę odparowano dwukrotnie z metanolem (2 x 300 ml) otrzymując 49,5 g benzotriazolilanu amidu N“-benzyloksykarbonylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny (Z-Arg (HOBt)-Pro-Azgly-NH2). Wydajność około 80%, czystość >90% (oznaczona metodą HPLC). TLC: jedna główna plama na płytkach z żelem krzemionkowym, Rf 0,25 w układzie aceton : woda = 4:1).

21,0 g Z-Arg (HOBt)-Pro-Azgly-NH2 rozpuszczono w 100 ml metanolu, dodano 2,2 g 10%Pd/C i wodorowano 3 godziny mieszając w temperaturze 40-50°C. Katalizator odsączono przez warstwę Celitu (4 g) i DMF odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt zadano 100 ml metanolu, który odparowano uzyskując produkt, benzotriazolilan amidu L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny (Arg(HOBt)-ProAzgly-NH2) w postaci białej pianki. TLC: jedna główna plama na płytkach z żelem krzemionkowym, Rf 0,05 w układzie aceton : woda = 4:1).

Z-Leu (20,0 g, 78 mM) i Arg (HOBt)-Pro-Azgly-NH2 (31,0 g, około 67 mM) rozpuszczono w 150 ml DMF i dodano 12,0 g (78 mM) wodzianu N-hydroksybenzotriazolu. Roztwór oziębiono do temperatury -5°C i dodano oziębiony do temperatury 0°C roztwór 16,5 g (80 mM) dicykloheksylokarbodiimidu w 50 ml DMF. Reakcję prowadzono mieszając przez 1 godzinę w temperaturze -5°C i w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Odsączono osad dicykloheksylomocznika, rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując olej, który rozpuszczono w 700 ml n-butanolu i przemywano kolejno nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (3 x 200 ml) i solanką (80 ml). Warstwę butanolową wysuszono bzw. siarczanem magnezu i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskany olej rozpuszczono w chloroformie i powoli wkroplono, mieszając, do 2 l eteru dietylowego. Po oziębieniu osad odsączono, dodano 200 ml bezwodnego metanolu i odparowano. Otrzymano 44,2 g benzotriazolilanu amidu N“-benzyloksykarbonylo-L-leucylo-L-arginylo-L-proliloazaglicyny (Z-Leu-Arg(HOBt)-Pro-Azgly-NH2) w postaci białej pianki. Wydajność około 90%, czystość > 85% (oznaczona metodą HPLC). TLC: jedna główna plama na płytkach z żelem krzemionkowym, Rf 0,25 w układzie chloroform : metanol : kwas octowy : woda = 60:18:2:3).

Z-Leu-Arg(HOBt)-Pro-Azgly-NH2 (43,0 g, ok. 60 mM) rozpuszczono w 200 ml metanolu, dodano 3 g 10%Pd/C i wodorowano 3 godziny mieszając w temperaturze pokojowej. Katalizator odsączono przez warstwę Celitu (4 g) i DMF odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 32,4 g benzotriazolilanu amidu L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny (Leu-Arg(HOBt)-Pro-Azgly-NH2) w postaci białej pianki. Wydajność około 90%, czystość > 65% (oznaczona metodą HPLC). TLC: główna plama na płytkach z żelem krzemionkowym, Rf 0,02 w układzie w układzie chloroform : metanol : kwas octowy : woda = 60:18:2:3).

^Z-^D-^Ser(Bu‘) (^9,08 g, ³¹ mlM) ^Leu-Ar^g(^HOBt)-^Pro-Az^gly-^NH2 (^{23,1 g} o czystości ⁶⁵% w^gHPLC, 41 mM) i 4,75 g (31 mM) wodzianu N-hydroksybenzotriazolu rozpuszczono w 130 ml DMF. Roztwór oziębiono do temperatury -5°C po czym dodano do niego oziębiony do temperatury 0°C roztwór 8,45 g (41 mM) dicykloheksylokarbodiimidu w 30 ml DMF. Reakcję prowadzono mieszając przez

PL 194 997 B1 godzinę w temperaturze -5°C i w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Odsączono osad dicykloheksylomocznika, rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując olej, który rozpuszczono w 300 ml n-butanolu i przemywano kolejno nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (3 x 50 ml) i solanką (50 ml). Warstwę butanolową wysuszono bzw. siarczanem magnezu i po zagęszczeniu wkroplono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano olej, który zadano octanem etylu (100 ml) i po oziębieniu odsączono osad. Osad rozpuszczono w bzw. metanolu i odparowano do białej pianki. Otrzymano 26,4 g benzotriazolilanu amidu N“-benzyloksykarbonylo-D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny (Z-D-Ser(Bu‘)-Leu-Arg (HOBt)-Pro-Azgly-NH2) w postaci białej pianki. Wydajność 26,4 g, około 95%, czystość ok. 69% oznaczona metodą HPLC). TLC: główna plama na płytkach z żelem krzemionkowym, Rf 0,35 w układzie chloroform : metanol :

: kwas octowy : woda = 60:18:2:3).

^{26 g} (o^k. ³⁰ mM) ^Z-^D-^Ser(Bu‘)-^Leu-^Ar^g (^HOBt)-^Pro-Az^gly-^NH2 (o czystości okoto ⁶⁹%) rozpuszczono w 100 ml metanolu, dodano 3 g 10%Pd/C i wodorowano 4 godziny mieszając w temperaturze pokojowej. Katalizator odsączono przez warstwę Celitu (4 g) i DMF odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 20,3 g benzotriazolilanu amidu D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginyloL-prolilo-azaglicyny (D-Ser(Bu‘)-Leu-Arg(HOBt)-Pro-Azgly-NH2) w postaci białej pianki. Wydajność około 95%, czystość około 66% oznaczona metodą HPLC). TLC: główna plama na płytkach z żelem krzemionkowym, Rf 0,16 w układzie chloroform:metanol:kwas octowy : woda = 60:18:2:3) i Rf 0,56 w układzie chloroform : metanol : kwas octowy : woda = 60:45:6:14).

P r z y k ł a d 3. Wytwarzanie octanu gosereliny (p-Glu-His-trp-Tyr-D-Ser(Bu‘)-Leu-Arg (HOBt)-Pro-Azgly-NH2 · CH3COOH)

Do oziębionej do temperatury -10°C zawiesiny 30,64 g (36,6 mM) hydrazydu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozyny w 300 ml dimetyloformamidu dodano mieszając roztwór suchego chlorowodoru w czterohydrofuranie (35,5 ml, 6,8 N, 248 mM). Po obniżeniu temperatury do -20°C dodano 5,1 ml (36,6 mM) azotanu izoamylu i całość mieszano w temperaturze -20°C przez 45 minut po czym temperaturę obniżono do -55°C i wkroplono 34,3 ml (248 mM) trietyloaminy i dodano ^{29,6 g} (⁶⁶% w^{g HPL}^ ^27,7 m^M) ^D-^Ser(Bu‘)-^Leu-^Ar^g (^HOBt)-^Pro-Az^gly-^NH2. ^Cato^ść mtoszano w temperaturze -12°C przez 72 godziny po czym odsączono osad i przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze poniżej 45°C. Otrzymano 90 g surowego materiału zawierającego około 30-40% gosereliny.

Otrzymany surowy materiał (45 g) rozpuszczono w 50 ml układu chloroform : metanol : kwas octowy = 60:45:10 naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym do flash chromatografii (70-230 mesh) 500 g, wysokość słupa żelu 28 cm) zrównoważoną układem chloroform/metanol/kwas octowy = 60/45/10 i produkt eluowano pod niewielkim ciśnieniem z szybkością od około kilkunastu do około 40 mililitrów na minutę kolejno układami: chloroform/metanol/kwas octowy = 60/45/10; chloroform/metanol/kwas octowy = 60/45/20 i chloroform/metanol/ 80% kwas octowy = 60/45/20. Czystość octanu gosereliny we frakcjach sprawdzano metodą analitycznej chromatografii HPLC i łączono oddzielnie a następnie zagęszczano pod zmniejszonym ciśnieniem frakcje zawierające ponad 80% gosereliny oraz frakcje zawierające 40-75% gosereliny. Otrzymano 8,36 g gosereliny o czystości 82% oraz 3,1 g gosereliny o czystości 55% (wg. HPLC). Ilość tak wyizolowanej gosereliny odpowiada łącznej wydajności kondensacji i oczyszczania około 50% (licząc na wyjściowy aminokomponent). Materiał o niższej zawartości gosereliny zawracano do powtórnego procesu oczyszczania metodą flash chromatografii.

Octan gosereliny 17,5 g (wstępnie oczyszczony, o czystości 82% wg. HPLC) poddano preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC na kolumnie Waters RP-18 w układzie odwróconych faz stosując jako fazę ruchomą A mieszaninę woda/kwas octowy/acetonitryl i jako fazę B mieszaninę metanol/woda/acetonitryl/ kwas octowy. Zawartość gosereliny we frakcjach sprawdzano metodą analitycznej chromatografii HPLC. Łączono oddzielnie frakcje dające po odparowaniu acetonitrylu pod zmniejszonym ciśnieniem, rozcieńczeniu wodą i liofilizacji materiał o czystości około 80-95% (zawartość gosereliny około 18% licząc na wybrany do syntezy fragment B) oraz oddzielnie najczystsze frakcje, które po odparowaniu acetonitrylu pod zmniejszonym ciśnieniem, rozcieńczeniu wodą i liofilizacji dają octanu gosereliny o czystości 98,8% (wg. HPLC)/ (zawartość gosereliny około 20% licząc na brany do syntezy fragment B)).

TLC w następujących układach rozpuszczalników: Rf = 0,22 (chloroform : metanol : kwas octowy : woda = 50:30:2,5:5), Rf = 0,46 (chloroform : metanol : kwas octowy : woda = 60:45:6:14), Rf = 0,25-0,30 (n-butanol : kwas octowy : woda (górna faza) = 4:1:5);

PL 194 997 B1

[a]D²⁴ = - 47,4° (c=0,1 (m/v, 1% kwas octowy);

Widmo masowe (LSIMS) : obliczono ^1269/4, znaleziono ¹²⁷⁰ (M+H⁺)^;

Analiza aminokwasów: Glu 1,17; His 1,00; Trp 0,68 (rozkł.); Ser 1,78 (rozkł.); Tyr 1,03; Leu 1,12; Arg 1,00; Pro 1,05.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania octanu amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozylo-D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny, znanego pod nazwą goserelina, przez kondensację metodą azydkową, znamienny tym, że kondensacji poddaje się fragment pentapeptydowy A stanowiący hydrazyd L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozyny z fragmentem pentapeptydowym B stanowiącym benzotriazolilan amidu D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny, który otrzymuje się poddając amid N“-benzyloksykarbonylo-L-proliloazaglicyny reakcji wodorowania wobec Pd na węglu jako katalizatorze w obecności N-hydroksybenzotriazolu, kondensując otrzymany benzotriazolilan amidu L-prolilo-azaglicyny za pomocą dicykloheksylokarbodiimidu z N“-benzyloksykarbonylo-L-argininą do benzotriazolilanu amidu N“-benzyloksykarbonylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny, z którego usuwa się osłonę N“-benzyloksykarbonylową przez katalityczne wodorowanie wobec Pd na węglu, a następnie łącząc otrzymany benzotriazolilan amidu L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny z N“-benzyloksykarbonylo-L-leucyną metodą dicykloheksylokarbodiimidową z dodatkiem N-hydroksybenzotriazolu, poddając otrzymany benzotriazolilan amidu N“-benzyloksykarbonylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny wodorowaniu wobec Pd na węglu jako katalizatorze i do otrzymanego benzotriazolilanu amidu L-leucylo-L-arginylo-L-proliloazaglicyny przyłączając resztę N“-benzyloksykarbonylo-D-(O-t-butylo)-seryny metodą dicykloheksylokarbodiimidową z dodatkiem N-hydroksybenzotriazolu i uwodarniając katalitycznie wobec Pd na węglu jako katalizatorze otrzymany benzotriazolilan amidu N“-benzyloksykarbonylo-D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny, zaś produkt kondensacji fragmentów A i B w postaci surowego benzotriazolilanu amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozylo-D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny przeprowadza się w octan i oczyszcza za pomocą dwustopniowej chromatografii.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako fragment B w reakcjj kondensacjj stosuje się surowy amid D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny w formie soli z N-hydroksybenzotriazolem.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dwustopniowe chromatograficzne oczyszczanie benzotriazolilanu amidu L-piroglutamylo-L-histydylo-L-tryptofylo-L-serylo-L-tyrozylo-D-(O-t-butylo)-serylo-L-leucylo-L-arginylo-L-prolilo-azaglicyny obejmuje przeprowadzenie flash chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym, a następnie preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w układach zawierających kwas octowy.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że amid N^c^-^t^enż^y4c^k^i^y^k^ć^r^t^ony^k^-^L^-^p^r^oilk^azaglicyny wytwarza się metodą mieszanych bezwodników z chloromrówczanem izobutylu.