CN105254701A - 一种德舍瑞林的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种德舍瑞林的合成方法，所述的德舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt是由五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH与四肽片段D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt在缩合剂的存在下缩合而成。本发明采用5+4的片段合成法，可直接将五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH和四肽片段D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt在缩合剂的存在下缩合成德舍瑞林。本方法不但缩短了合成周期、避免了传统方法中苛刻的反应条件，而且收率高、产品纯度好、成本低、反应条件温和、适合于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种纯液相片段法合成德舍瑞林的新方法。
背景技术
德舍瑞林(Deslorelin)，其化合物化学式为：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHET，结构式如下：
德舍瑞林的合成方法主要是固相合成。
固相合成中需要使用大量的昂贵的多肽树脂，这给企业的大规模生产带来了成本的压力，不仅如此，在最后切肽的工序中，叔丁基很容易在酸性条件下被脱除，将生成其他杂质产物。
从现有的各种资料研究状况来看，液相合成德舍瑞林是现阶段各大公司和学校科研机构的主要方法。例如：
国内专利CN201410184663.3采用了固液相结合的方法合成德舍瑞林，但是相对时间较长、固相合成杂质较多、纯化难度较高、受到固相设备的限制，产业化放大也存在问题。
专利WO97/48726中就报导了类似化合物的液相合成方法，采用了2+4+3的片段合成法。三个肽片段分别为：二肽片段为Pyr-His-OH，四肽片段为Trp-Ser-Tyr-X-Oet(X为D-Leu，D-Trp，D-Val)，三肽为Leu-Arg-Pro-NHEt。然后，通过制备二肽片段的HONB活化酯与四肽片段缩合，得到目标六肽化合物。通过将六肽造化得到游离羧基，之后再次制备六肽片段的HONB活化酯，然后和三肽缩合，得到目的九肽产品。但是由于在此过程中都采用HONB活化酯，操作相对比较复杂，从而导致收率下降，不适合工业化生产。
专利EP1008656报导了另外一种液相合成此类化合物的方法，也是采用了片段缩合法，但是采用的是3+2+4的片段法。三个多肽片段分别为：三肽片段Pyr-His-Trp-OR，二肽片段Z-Ser-Tyr-OR1，四肽片段为X-Leu-Arg-Pro-NHEt(D-Leu，D-Trp，D-Val)。然后通过2+4合成Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-NHEt(或者Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-AZgly-NH2)，最后，Pyr-His-Trp-OR与六肽片段缩合，在次缩合过程中的创新点在于使用了蛋白酶催化剂，但是最大的问题也正是在于使用酶催化后产物不易提纯。
另外，还有文献报导了利用迭氮化合物来合成此类化合物的方法。在文献biochemicalandbiophysicalresearchcommunications1978，Vol81，NO2，Page382-390中提到的4+3+2片段缩合法，就是采用了迭氮化合物法来片段缩合的。步骤如下：1、合成Z-Pro-X(X为Azgly-NH2，-NHEt)，然后合成二肽片段Boc-Arg(NO2)-Pro-X；2、合成Z-Tyr(Bzl)-B-Leu-Ome(B为D-Phe，D-Trp)；3、合成Pyr-A-Trp-Ser-Ome(A为His，D-Phe)。然后，通过迭氮化合物法先将二肽和三肽缩合成Z-Tyr(Bzol)-B-Leu-Arg(NO2)-Pro-X，最后再次通过迭氮化合物法先将五肽和四肽缩合成Pyr-A-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-B-Leu-Arg(NO2)-Pro-X。虽然，采用迭氮化合物法能够有效的抑制消旋，但是由于迭氮化合物法在缩合的时候，反应条件比较苛刻，反应十分危险，所以不利于产业化生产。
在文献JournalofMedicinalChemistry1978，Vol21，NO10，Page1018～1024中，报导了另外一种采用迭氮化合物来合成此类化合物的方法。采用的是2+2+3+2的合成策略，具体步骤如下：1、合成二肽片段Pyr-His-Ome；2、合成二肽片段Z-Trp-Ser-Ome；3、合成三肽片段Z-Tyr(Bzl)-A-Leu-Ome(其中A为：Gly，Ser，D-Phe，D-Tyr(Ome)，D-Trp)；4、合成Boc-Arg(NO2)-Pro-C(其中C为-Azgly-NH2，-NHEt，-Gly)；最后，将这些片段通过迭氮化合物法串联缩合起来，形成Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-A-Leu-Arg-Pro-C，但是它也存在着迭氮化合物合成法的通病，不适合产业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术的上述缺陷，提供了一种适合放大生产、收率高、纯度好的德舍瑞林合成方法，采用了5+4的片段合成法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种德舍瑞林的合成方法，其特点是：所述的德舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt是由五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH与四肽片段R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt在缩合剂的存在下缩合、脱保护而制成；
其中：
R1选自BOC、Z、Fmoc或H；
R2选自BOC、Z、Bzl、Trt、Tos、Bom、Dnp或H；
R3选自BOC、For、H或Z；
R4选自Bzl、H、Tbu、Z、Boc或Tos；
R5选自Bzl、H、Tbu、2，6-di-Cl-Bzl、Me、Z或2-Cl-Z；
R6选自BOC、Z或Fmoc；
R7选自BOC、(BOC)2、PBF、TOS、NO2、H、PMC、HCL、ADOC或Mts。
本发明所述德舍瑞林的合成方法，进一步优选的技术方案是：所述的缩合反应通过硫苄酯转酯反应完成，或者通过混合酸酐完成缩合反应，或者通过活化酯反应完成缩合反应。
本发明所述德舍瑞林的合成方法，进一步优选的技术方案是：所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH由以下步骤合成：首先合成Tyr(R5)-OMe，再与α氮端保护的R12-Ser(R4)反应，生成R12-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，脱保护，与α氮端保护的R13-Trp(R3)反应，生成R13-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，脱保护，与α氮端保护的R14-His(R2)反应，生成R14-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，脱保护，与α氮端保护的R1-Pyr反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，最后进行皂化，得到五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH；
其中：R12选自BOC、Z或Fmoc；R13选自BOC、Z或Fmoc；R14选自BOC、Z或Fmoc。
本发明所述德舍瑞林的合成方法，进一步优选的技术方案是：所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH由以下步骤合成：首先合成R1-Pyr的活化酯，再与羧基端保护His(R2)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)；合成R1-Pyr-His(R2)的活化酯，与羧基端保护Trp(R3)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)的活化酯，与羧基端保护Ser(R4)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)的活化酯，与NH2-Tyr(R5)--R11反应，得到R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH；
其中：R11选自OME、OEt、Otbu、苄酯、有机盐、无机盐。
本发明所述德舍瑞林的合成方法，进一步优选的技术方案是：所述的四肽片段R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R8-Pro-NHEt，脱保护，再与α氮端保护、侧链R7保护的R9-Arg(R7)-OH反应，生成α氮端保护的R9-Arg(R7)-Pro-NHEt；脱保护，与α氮端保护的R10-Leu-OH反应，生成α氮端保护的R10-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；脱保护，与R6-D-Trp-OH反应，生成R6-D-Trp-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；
其中：R8选自BOC、Z或Fmoc；R9选自BOC、Z或Fmoc；R10选自BOC、Z或Fmoc。
本发明所述德舍瑞林的合成方法，进一步优选的技术方案是：所述的四肽片段R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R6-D-Trp(R3)的活化酯，然后与羧基端保护R6-Leu-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu；合成R6-D-Trp(R3)-Leu的活化酯，与羧基端保护Arg(R7)-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)；合成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)的活化酯，与Pro-NHEt反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；
所述的R11选自OME、OEt、Otbu、苄酯、有机盐、无机盐。
本发明所述德舍瑞林的合成方法，进一步优选的技术方案是：所述的四肽片段R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R6-D-Trp(R3)的活化酯，然后与羧基端保护R6-Leu-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu；合成R6-D-Trp(R3)-Leu的活化酯，与羧基端保护Arg(R7)-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)；合成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)的活化酯，与Pro-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-OH；生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-OH与NH2Et，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；
所述的R11选自OME、OEt、Otbu、苄酯、有机盐、无机盐。
本发明所述德舍瑞林的合成方法，进一步优选的技术方案是：所述的缩合剂优选为氯甲酸叔丁酯。
本发明所述德舍瑞林的合成方法，进一步优选的技术方案是：所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH中的OH可以用OMe、OET、OBzl或OTbu替代。
本发明方法适合于Pyr-A-Trp-Ser-Tyr-B-Leu-Arg-Pro-C此类化合物的合成，其中A可以为His、D-Phe；B可以为Gly、Ser、D-Phe、D-Tyr(Ome)、D-Trp；C可以为-Azgly-NH2，-NHEt，-Gly。在合成过程中，各种氨基酸保护基的变化，也不影响此方法的应用。
本发明方法中，相关名词说明如下：
R1-Pyr为氨基R1保护的焦谷氨酸；
His(R2)为侧链R2保护的组氨酸；
Trp(R3)为侧链R3保护的色氨酸；
Ser(R4)为侧链R4保护的丝氨酸；
Tyr(R5)为侧链R5保护的酪氨酸；
Leu为亮氨酸；
Arg(R7)为侧链R7保护的精氨酸；
Pro为脯氨酸；
R14-His(R2)为α氮端R14保护、侧链R2保护的组氨酸；
R13-Trp(R3)为α氮端R13保护、侧链R3保护的色氨酸；
R12-Ser(R4)为α氮端R12保护、侧链R4保护的丝氨酸；
Tyr(R5)-R15为侧链R5保护的酪氨酸；
NH2-His(R2)-R16为羧基端R16保护、侧链R2保护的组氨酸；
NH2-Trp(R3)-R17为α氮端R13保护、侧链R3保护的色氨酸；
NH2-Ser(R4)-R18为α氮端R12保护、侧链R4保护的丝氨酸；
Tyr(R5)-R15为侧链R5保护的酪氨酸；
NH2Et为乙基氨；
R8-Pro为α氮端R8保护的脯氨酸；
R9-Arg(R5)为α氮端R9保护、侧链R5保护的精氨酸；
R10-Leu为α氮端R10保护的亮氨酸；
R6-D-Trp(R3)为α氮端R6保护、D型-侧链R3保护的丝氨酸；
X为对硝基酯、OSU、ONB或OBT。
本发明方法采用5+4的片段合成法，可直接将五肽片段和四肽片段在缩合剂的存在下缩合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt。本方法可以同时开展两个片段的合成，耗时只要逐个偶联的一半，不但缩短了合成周期、避免了传统方法中苛刻的反应条件，而且收率高、产品纯度好、成本低、反应条件温和、适合于工业化生产。
附图说明
图1是德舍瑞林粗产品HPLC谱图；
图2是纯化后德舍瑞林产品的HPLC谱图；
图3是德舍瑞林产品的质谱图。
具体实施方式
实施例1，一种德舍瑞林的合成方法：所述的德舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt是由五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH与四肽片段R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt在缩合剂的存在下缩合、脱保护而制成；
其中：
R1选自BOC、Z、Fmoc或H；
R2选自BOC、Z、Bzl、Trt、Tos、Bom、Dnp或H；
R3选自BOC、For、H或Z；
R4选自Bzl、H、Tbu、Z、Boc或Tos；
R5选自Bzl、H、Tbu、2，6-di-Cl-Bzl、Me、Z或2-Cl-Z；
R6选自BOC、Z或Fmoc；
R7选自BOC、(BOC)2、PBF、TOS、NO2、H、PMC、HCL、ADOC或Mts。
实施例2，实施例1所述德舍瑞林的合成方法中：所述的缩合反应通过硫苄酯转酯反应完成，或者通过混合酸酐完成缩合反应，或者通过活化酯反应完成缩合反应。
实施例3，实施例1所述德舍瑞林的合成方法中：述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH由以下步骤合成：首先合成Tyr(R5)-OMe，再与α氮端保护的R12-Ser(R4)反应，生成R12-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，脱保护，与α氮端保护的R13-Trp(R3)反应，生成R13-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，脱保护，与α氮端保护的R14-His(R2)反应，生成R14-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，脱保护，与α氮端保护的R1-Pyr反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，最后进行皂化，得到五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH；
其中：R12选自BOC、Z或Fmoc；R13选自BOC、Z或Fmoc；R14选自BOC、Z或Fmoc。
实施例4，实施例1所述德舍瑞林的合成方法中：所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH由以下步骤合成：首先合成R1-Pyr的活化酯，再与羧基端保护His(R2)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)；合成R1-Pyr-His(R2)的活化酯，与羧基端保护Trp(R3)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)的活化酯，与羧基端保护Ser(R4)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)的活化酯，与NH2-Tyr(R5)--R11反应，得到R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH；
其中：R11选自OME、OEt、Otbu、苄酯、有机盐、无机盐。
实施例5，实施例1－4中任何一项所述德舍瑞林的合成方法中：所述的四肽片段R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R8-Pro-NHEt，脱保护，再与α氮端保护、侧链R7保护的R9-Arg(R7)-OH反应，生成α氮端保护的R9-Arg(R7)-Pro-NHEt；脱保护，与α氮端保护的R10-Leu-OH反应，生成α氮端保护的R10-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；脱保护，与R6-D-Trp-OH反应，生成R6-D-Trp-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；
其中：R8选自BOC、Z或Fmoc；R9选自BOC、Z或Fmoc；R10选自BOC、Z或Fmoc。
实施例6，实施例1－4中任何一项所述德舍瑞林的合成方法中：所述的四肽片段R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R6-D-Trp(R3)的活化酯，然后与羧基端保护R6-Leu-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu；合成R6-D-Trp(R3)-Leu的活化酯，与羧基端保护Arg(R7)-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)；合成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)的活化酯，与Pro-NHEt反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；
所述的R11选自OME、OEt、Otbu、苄酯、有机盐、无机盐。
实施例7，实施例1－4中任何一项所述德舍瑞林的合成方法中：所述的四肽片段R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R6-D-Trp(R3)的活化酯，然后与羧基端保护R6-Leu-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu；合成R6-D-Trp(R3)-Leu的活化酯，与羧基端保护Arg(R7)-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)；合成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)的活化酯，与Pro-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-OH；生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-OH与NH2Et，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；
所述的R11选自OME、OEt、Otbu、苄酯、有机盐、无机盐。
实施例8，实施例1所述德舍瑞林的合成方法中：所述的缩合剂为氯甲酸叔丁酯。
实施例9，实施例1所述德舍瑞林的合成方法中：所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH中的OH用OMe、OET、OBzl或OTbu替代。
实施例10：合成五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH实验：
1、Boc-Pyr-His(trt)-OH的合成：
溶液1：称取100毫摩的Boc-Pyr-OH、120毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取120毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用。
溶液3：称取130毫摩的NH2-His(trt)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用。
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸300ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体。
HPLC纯度：大于98，收率为92%。
2、Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-OH的合成：
溶液1：称取100毫摩的Boc-Pyr-His(trt)-OH、120毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取120毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用。
溶液3：称取130毫摩的NH2-Trp(boc)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用。
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸300ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体。
HPLC纯度：大于94%，收率为88%。
3、Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-OH的合成：
溶液1：称取100毫摩的Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-OH、120毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取120毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取130毫摩的NH2-Ser(tbu)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸300ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体。
HPLC纯度：大于91%，收率为83%。
4、Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-OH的合成：
溶液1：称取100毫摩的Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-OH、120毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取120毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用。
溶液3：称取130毫摩的NH2-Tyr(tbu)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用。
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸300ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体。
HPLC纯度：大于91%，收率为80%。MS=1478.5
实施例11，合成四肽片段D-Trp(boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt实验：
1、Fmoc-Pro-NHEt的合成
称取Fmoc-Pro-OH(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中，用55毫升DMF溶解，之后加入HOSU(22mmol)，冰水浴下加入DCC(22mmol)的DMF溶液20毫升，室温下反应4小时，滤除沉淀，将溶液浓缩至40毫升，加入浓乙胺水溶液20毫升，室温下反应过夜，点板反应完成，滤除沉淀，将溶液除去，用大量乙酸乙酯溶解，用稀碱洗涤，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，得到浅黄色固体(Fmoc-Pro-NHEt)。
HPLC纯度：大于92%，收率为81％。
2、Fmoc-Arg(pbf)-Pro-NHEt的合成
称取Fmoc-Pro-NHEt(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/DMF为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(NH2-Pro-NHEt)。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Fmoc-Arg(pbf)-OH(20mmol)，NH2-Pro-NHEt(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(Fmoc-Arg(pbf)-Pro-NHEt)。
HPLC纯度：大于93%，收率为85％。
3、Fmoc-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt的合成
称取Fmoc-Arg(pbf)-Pro-NHEt(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/DMF为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(NH2-Arg(pbf)-Pro-NHEt)。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Fmoc-Leu-OH(20mmol)，NH2-Arg(pbf)-Pro-NHEt(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到固体(Fmoc-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt)。
HPLC纯度：大于93%，收率为90％
4、Fmoc-D-Trp(boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt的合成
称取Fmoc-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/DMF为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(NH2-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt)。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Fmoc-D-Trp(boc)-OH(20mmol)，NH2-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到固体(Fmoc-D-Trp(boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt)。
HPLC纯度：大于94%，收率为82％MS=950.6
5、D-Trp(boc)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成
称取Fmoc-D-Trp(boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/DMF为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(NH2-D-Trp(boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt)。
HPLC纯度：大于94%，收率为93％。
实施例12，Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成实验：
在50毫升的圆底烧瓶中加入Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-OH(20mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰盐浴下加入苄硫醇(24mmol)，再慢慢滴加DCC（24mmol）的DMF溶液，反应5-20分钟，之后室温下反应2小时，点板确定反应结束。过滤除去DCU沉淀，滤液旋蒸除去，加入大量乙酸乙酯（600毫升）溶解，用5%的NaHCO3水溶液50毫升洗涤三次，饱和食盐水洗涤3次，干燥，旋蒸除去溶剂，得到粉末状固体。固体用40毫升无水DMF溶解，加入NH2-D-Trp(boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt(20mmol)的DMF溶液20毫升，在室温下搅拌12小时，检测反应完全。减压浓缩除去DMF，得到浅黄色粗产品(Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Trp(boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt)。
称取20毫摩的Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Trp(boc)-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt置于2L的反应釜中，在室温下加入脱保护试剂（TFA：苯甲硫醚：水：EDT=92:4:2:2）200ml，室温下裂解1.5小时，将裂解液倒入预先冷却好的（0℃）无水乙醚中，搅拌沉降3小时，离心，用无水乙醚洗涤5次，真空干燥，得到白色固体。
HPLC纯度：大于87%，收率为85%MS＝1282.5（如图3所示）。德舍瑞林粗产品HPLC谱图如图1示。
德舍瑞林粗产品的纯化：此过程共分为4个步骤：样品前处理、纯化、冻干、包装
1、样品前处理
PH调整：使用稀TFA水溶液调整PH在1.0-3.5之间
过滤：使用直径＝300mm、孔径＝0.45um微孔滤膜过滤
2、纯化条件
2.1制备柱：15cmX30cm柱Kromasil10umC18反相色谱填料颗粒
2.2流动相：A：0.1％TFA水溶液B：ACN
时间(分钟)流动相B％流速(ml/min)
05％250
1027％400
10052％400
2.3上样
平衡：用约2个柱体积5％B流动相，平衡柱子10分钟
上样量：5g目的肽
上样流速：250ml/min
检测波长：230nm
同时监测压强
2.4收样
执行梯度洗脱，当主峰流出时开始收集馏分，直到检测器吸光度小于0.1AU时或者主峰流出后达到主要拐点时停止。同时用反向HPLC监测各馏分纯度。本方法得到的产品纯度达到98.0％以上纯度。
2.5浓缩
通过旋转蒸发仪浓缩馏分
3、冻干
冻干盘：使用大铁盘(厚度＜1cm)
预冻时间：在冷阱中预冻7h以上
冷冻干燥机冻干
4、包装
冻干成干粉后，分装于洁净容器内。
纯化后德舍瑞林产品的HPLC谱图如图2所示。
Claims (9)
1.一种德舍瑞林的合成方法，其特征在于：所述的德舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt是由五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH与四肽片段R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt在缩合剂的存在下缩合、脱保护而制成；
其中：
R1选自BOC、Z、Fmoc或H；
R2选自BOC、Z、Bzl、Trt、Tos、Bom、Dnp或H；
R3选自BOC、For、H或Z；
R4选自Bzl、H、Tbu、Z、Boc或Tos；
R5选自Bzl、H、Tbu、2，6-di-Cl-Bzl、Me、Z或2-Cl-Z；
R6选自BOC、Z或Fmoc；
R7选自BOC、(BOC)2、PBF、TOS、NO2、H、PMC、HCL、ADOC或Mts。
2.根据权利要求1所述德舍瑞林的合成方法，其特征在于：所述的缩合反应通过硫苄酯转酯反应完成，或者通过混合酸酐完成缩合反应，或者通过活化酯反应完成缩合反应。
3.根据权利要求1所述德舍瑞林的合成方法，其特征在于：所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH由以下步骤合成：首先合成Tyr(R5)-OMe，再与α氮端保护的R12-Ser(R4)反应，生成R12-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，脱保护，与α氮端保护的R13-Trp(R3)反应，生成R13-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，脱保护，与α氮端保护的R14-His(R2)反应，生成R14-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，脱保护，与α氮端保护的R1-Pyr反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OMe，最后进行皂化，得到五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH；
其中：R12选自BOC、Z或Fmoc；R13选自BOC、Z或Fmoc；R14选自BOC、Z或Fmoc。
4.根据权利要求1所述德舍瑞林的合成方法，其特征在于：所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH由以下步骤合成：首先合成R1-Pyr的活化酯，再与羧基端保护His(R2)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)；合成R1-Pyr-His(R2)的活化酯，与羧基端保护Trp(R3)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)的活化酯，与羧基端保护Ser(R4)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)的活化酯，与NH2-Tyr(R5)--R11反应，得到R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH；
其中：R11选自OME、OEt、Otbu、苄酯、有机盐、无机盐。
5.根据权利要求1所述德舍瑞林的合成方法，其特征在于：所述的四肽片段R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R8-Pro-NHEt，脱保护，再与α氮端保护、侧链R7保护的R9-Arg(R7)-OH反应，生成α氮端保护的R9-Arg(R7)-Pro-NHEt；脱保护，与α氮端保护的R10-Leu-OH反应，生成α氮端保护的R10-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；脱保护，与R6-D-Trp-OH反应，生成R6-D-Trp-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；
其中：R8选自BOC、Z或Fmoc；R9选自BOC、Z或Fmoc；R10选自BOC、Z或Fmoc。
6.根据权利要求1所述德舍瑞林的合成方法，其特征在于：所述的四肽片段R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R6-D-Trp(R3)的活化酯，然后与羧基端保护R6-Leu-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu；合成R6-D-Trp(R3)-Leu的活化酯，与羧基端保护Arg(R7)-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)；合成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)的活化酯，与Pro-NHEt反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；
所述的R11选自OME、OEt、Otbu、苄酯、有机盐、无机盐。
7.根据权利要求1所述德舍瑞林的合成方法，其特征在于：所述的四肽片段R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R6-D-Trp(R3)的活化酯，然后与羧基端保护R6-Leu-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu；合成R6-D-Trp(R3)-Leu的活化酯，与羧基端保护Arg(R7)-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)；合成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)的活化酯，与Pro-R11反应，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-OH；生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-OH与NH2Et，生成R6-D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Trp(R3)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；
所述的R11选自OME、OEt、Otbu、苄酯、有机盐、无机盐。
8.根据权利要求1所述德舍瑞林的合成方法，其特征在于：所述的缩合剂为氯甲酸叔丁酯。
9.根据权利要求1所述德舍瑞林的合成方法，其特征在于：所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH中的OH用OMe、OET、OBzl或OTbu替代。
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