CN109438560B - 一种布舍瑞林的液相合成方法 - Google Patents

一种布舍瑞林的液相合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物合成领域，是一种布舍瑞林的液相合成方法，所述的布舍瑞林是由五肽片段Pyr‑His‑Trp‑Ser‑Tyr‑OH与四肽片段D‑Ser（Otbu）‑Leu‑Arg‑Pro‑NHEt在催化剂的作用下缩合而成。本发明采用5+4的片段合成法，可直接将五肽片段Pyr‑His‑Trp‑Ser‑Tyr‑OH和四肽片段D‑Ser（Otbu）‑Leu‑Arg‑Pro‑NHEt在催化剂2‑碘‑4‑甲氧基‑苯硼酸及直径4Å的分子筛的作用下缩合成布舍瑞林，催化剂可循环回收套用。本发明方法不但避免了5+4片段合成中各类缩合试剂的使用，缩短了合成周期、避免了传统方法中苛刻的反应条件，而且收率高、产品纯度好、易于纯化、成本低、反应条件温和、适合于工业化生产。

Description

一种布舍瑞林的液相合成方法
技术领域
本发明涉及一种化合物的制备方法，具体涉及布舍瑞林的液相合成方法。
背景技术
布舍瑞林是一种促性腺素释放激素（GnRH）类似物，其结构序列为：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OTbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt。其结构式如下所示：
Figure 730999DEST_PATH_IMAGE002
目前合成布舍瑞林的方法有固相法、液相法还有固液结合法。固相合成方法主要是国内的专利报道，涉及到不同的全保护肽的策略选择，然后通过不同的保护剂脱除法进行脱保护获得产品。深圳翰宇制药布舍瑞林制备方法（申请号201410185283.1），采用His(Trt)、Tyr(Bzl)、Arg(NO2)的保护策略，先用金属催化剂Pd催化脱除Bzl和NO2，再用5%的TFA脱除保护剂，进行纯化后得到成品。中国公开专利文献（申请号201010256054.6）报道一种固相制备布舍瑞林的方法：先合成全保护九肽，然后进行乙胺化，最后脱除保护剂得到布舍瑞林产品。以上两种方法最后脱除侧脸保护剂，会导致部分Ser的侧链保护剂脱除而生成杂质。中国公开专利文献（申请号201510005951.2）采用的保护策略为His(Trt)、Tyr(Bzl)、Arg(NO2)，脱保护方法采用TFA脱除酸敏感保护剂Trt，再用Pd催化剂脱除Bzl和NO2保护剂。存在一个问题，用TFA脱保护剂，必将使得Ser(Otbu)侧链损失，形成杂质。中国公开专利文献（申请号 201410269996.6）采用了片段法合成全保护肽，最终氢化得到布舍瑞林。但是该方法也未摆脱常规缩合方法，导致成本偏高，且产生较多的杂质，不易纯化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的上述缺陷，提供了一种适合放大生产、收率高、纯度好的布舍瑞林液相合成方法，采用了5+4的片段合成法。
本发明所要解决的技术方案是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种布舍瑞林的液相合成方法，其特点是：所述的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt是在液相条件下由五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH与四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt在催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4Å的分子筛作用下缩合反应、脱保护而成。
进一步地，所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH由以下步骤合成：首先合成R1-Pyr的活化酯，再与羧基端保护His(R2)反应，生成R1-Pyr-His(R2)；合成R1-Pyr-His(R2)的活化酯，与羧基端保护Trp(R3) -R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)的活化酯，与羧基端保护Ser(R4) -R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)的活化酯，与NH2-Tyr(R5)-R11反应，得到R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH。
所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH还可以由以下步骤合成：首先合成Tyr(R5)-R11，再与α氮端保护的R12-Ser(R4)反应，生成R12-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11，脱保护，与α氮端保护的R13-Trp(R3)反应，生成R13-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11，脱保护，与α氮端保护的R14-His(R2)反应，生成R14-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11，脱保护，与α氮端保护的R1-Pyr反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11，最后进行皂化，得到五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH。
上述五肽片段的合成步骤中，R1可以为BOC、Z、Fmoc或H；R2可以为BOC、Z、Bzl、Trt、Tos、Bom、Dnp或H；R3可以为BOC、For、H或Z；R4可以为Bzl、H、Tbu、Z、Boc或Tos；R5可以为Bzl、H、Tbu、2，6-di-Cl-Bzl、Me、Z或2-Cl-Z；R11为R11为OME、OEt、Otbu、苄酯、酯类或者有机盐、无机盐；R12可以为BOC、Z或Fmoc；R13可以为BOC、Z或Fmoc；R14可以为BOC、Z或Fmoc。
进一步地，所述的四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R8-Pro-NHEt，脱保护，再与α氮端保护、侧链R7保护的R9-Arg(R7)-OH反应，生成α氮端保护的R9-Arg(R7)-Pro-NHEt；脱保护，与α氮端保护的R10-Leu-OH反应，生成α氮端保护的R10-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；脱保护，与R6-D-Trp-OH反应，生成R6-D-Trp-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt。
所述的四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R6-D-Ser(R4)的活化酯，然后与羧基端保护Leu-R11反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu；合成R6-D-Ser(R4)-Leu的活化酯，与羧基端保护Arg(R7) -R11反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)；合成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)的活化酯，与Pro-NHEt反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt。
所述的四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R6-D-Ser(R4)的活化酯，然后与羧基端保护Leu-R11反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu；合成R6-D-Ser(R4)-Leu的活化酯，与羧基端保护Arg(R7) -R11反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)；合成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)的活化酯，与Pro-R11反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-OH；生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-OH与NH2Et，生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt。
上述四肽片段的合成步骤中，R6可以为BOC、Z或Fmoc；R7可以为BOC、(BOC)2、PBF、TOS、NO2、H、PMC、HCL、ADOC或Mts；R8可以为BOC、Z或Fmoc；R9可以为BOC、Z或Fmoc R10可以为BOC、Z或Fmoc。R11为OME、OEt、Otbu、苄酯、者有机盐、无机盐。
本发明中的名词说明如下：
R1-Pyr为氨基R1保护的焦谷氨酸；
His(R2)为侧链R2保护的组氨酸；
Trp(R3)为侧链R3保护的色氨酸；
Ser(R4)为侧链R4保护的丝氨酸；
Tyr(R5)为侧链R5保护的酪氨酸；
Leu为亮氨酸；
Arg(R7)为侧链R7保护的精氨酸；
Pro为脯氨酸；
R14-His(R2)为α氮端R14保护、侧链R2保护的组氨酸；
R13-Trp(R3)为α氮端R13保护、侧链R3保护的色氨酸；
R12-Ser(R4)为α氮端R12保护、侧链R4保护的丝氨酸；
Tyr(R5)为侧链R5保护的酪氨酸；
NH2-His(R2)-R11为羧基端R11保护、侧链R2保护的组氨酸；
NH2-Trp(R3)-R11为羧基端R11保护、侧链R3保护的色氨酸；
NH2-Ser(R4)-R11为羧基端R11保护、侧链R4保护的丝氨酸；
Tyr(R5)-R11为羧基端R11保护、侧链R5保护的酪氨酸；
NH2Et为乙基氨；
R8-Pro为α氮端R8保护的脯氨酸；
R9-Arg(R5)为α氮端R9保护、侧链R5保护的精氨酸；
R10-Leu为α氮端R10保护的亮氨酸；
R6-D-Ser(R4)为α氮端R6保护、D型-侧链R4保护的丝氨酸。
与现有技术相比，本发明方法采用5+4的片段合成法，可直接将五肽片段和四肽片段在催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4Å的分子筛作用下缩合形成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt。本发明方法可以同时开展两个片段的合成，耗时只要逐个偶联的一半，不但避免了5+4片段合成中各类缩合试剂的使用，缩短了合成周期、避免了传统方法中苛刻的反应条件，而且收率高、产品纯度好、易于纯化、成本低、反应条件温和、适合于工业化生产。
附图说明
图1为实施例合成的布舍瑞林的质谱图。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1、一种布舍瑞林的液相合成方法，所述的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OTbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt是在液相条件下由五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11与四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt在催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4Å的分子筛的作用下缩合反应、脱保护而成；
其中：R1为BOC、Z、Fmoc或H；
R2为BOC、Z、Bzl、Trt、Tos、Bom、Dnp或H；
R3为BOC、For、H或Z；
R4为Bzl、H、Tbu、Z、Boc或Tos；
R5为Bzl、H、Tbu、2，6-di-Cl-Bzl、Me、Z或2-Cl-Z；
R6为BOC、Z或Fmoc；
R7为BOC、(BOC) 2、PBF、TOS、NO2、H、PMC、HCL、ADOC或Mts。
所述的缩合反应通过催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4Å的分子筛催化反应完成，通过混合酸酐完成缩合反应。
所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11由以下步骤合成：首先合成Tyr(R5)-R11，再与α氮端保护的R12-Ser(R4)反应，生成R12-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11，脱保护，与α氮端保护的R13-Trp(R3)反应，生成R13-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11，脱保护，与α氮端保护的R14-His(R2)反应，生成R14-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11，脱保护，与α氮端保护的R1-Pyr反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11，得到五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH；
其中：R11为OME、OEt、Otbu、苄酯、酯类或者有机盐、无机盐；
R12为BOC、Z或Fmoc；
R13为BOC、Z或Fmoc；
R14为BOC、Z或Fmoc。
所述的四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R8-Pro-NHEt，脱保护，再与α氮端保护、侧链R7保护的R9-Arg(R7)-OH反应，生成α氮端保护的R9-Arg(R7)-Pro-NHEt；脱保护，与α氮端保护的R10-Leu-OH反应，生成α氮端保护的R10-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；脱保护，与R6-D-Ser(R4)-OH反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；
其中：R8为BOC、Z或Fmoc；
R9为BOC、Z或Fmoc；
R10为BOC、Z或Fmoc。
实施例2、一种布舍瑞林的液相合成方法，所述的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OTbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt是在液相条件下由五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11与四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt在催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4Å的分子筛的作用下缩合反应、脱保护而成；
其中：R1为BOC、Z、Fmoc或H；
R2为BOC、Z、Bzl、Trt、Tos、Bom、Dnp或H；
R3为BOC、For、H或Z；
R4为Bzl、H、Tbu、Z、Boc或Tos；
R5为Bzl、H、Tbu、2，6-di-Cl-Bzl、Me、Z或2-Cl-Z；
R6为BOC、Z或Fmoc；
R7为BOC、(BOC) 2、PBF、TOS、NO2、H、PMC、HCL、ADOC或Mts。
所述的缩合反应通过催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4Å的分子筛催化反应完成，通过活化酯反应完成缩合反应。
所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH由以下步骤合成：首先合成R1-Pyr的活化酯，再与羧基端保护His(R2) -R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)；合成R1-Pyr-His(R2)的活化酯，与羧基端保护Trp(R3)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)的活化酯，与羧基端保护Ser(R4) -R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)；合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)的活化酯，与NH2-Tyr(R5)-R11反应，得到R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH；
其中：R11为OME、OEt、Otbu、苄酯、酯类或者有机盐、无机盐。
所述的四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R6-D-Ser(R4)的活化酯，然后与羧基端保护Leu-R11反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu；合成R6-D-Ser(R4)-Leu的活化酯，与羧基端保护Arg(R7) -R11反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)；合成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)的活化酯，与Pro-NHEt反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；
或者，所述的四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt由以下步骤合成：首先合成R6-D-Ser(R4)的活化酯，然后与羧基端保护Leu-R11反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu；合成R6-D-Ser(R4)-Leu的活化酯，与羧基端保护Arg(R7) -R11反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)；合成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)的活化酯，与Pro-R11反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-OH；生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-OH与NH2Et，生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；最后脱去R6保护得到四肽片段D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt；
实施例3，一种布舍瑞林的液相合成方法实验：
一、合成五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH
1、Boc-Pyr-His(trt)-OH的合成：
溶液1：称取100毫摩的Boc-Pyr-OH、120毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取120毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取130毫摩的NH2- His(trt)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸300ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体。
HPLC纯度：大于95.5%，收率为92.4%。
2、Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-OH的合成：
溶液1：称取100毫摩的Boc-Pyr-His(trt)-OH、120毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取120毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取130毫摩的NH2-Trp(boc)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸300ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体。
HPLC纯度：大于95.2%，收率为88.5%。
3、Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-OH的合成：
溶液1：称取100毫摩的Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-OH、120毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取120毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取130毫摩的NH2-Ser(tbu)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸300ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体。
HPLC纯度：大于93.3%，收率为85.5%。
4、Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-OH的合成：
溶液1：称取100毫摩的Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-OH、120毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取120毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取130毫摩的NH2-Tyr(tbu)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸300ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体。
HPLC纯度：大于92.8%，收率为83.4%。MS=1478.5
二、合成四肽片段D-Ser(OTbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt
1、Fmoc-Pro-NHEt的合成
称取Fmoc-Pro-OH(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中，用55毫升DMF溶解，之后加入HOSU(22mmol)，冰水浴下加入DCC(22mmol)的DMF溶液20毫升，室温下反应4小时，滤除沉淀，将溶液浓缩至40毫升，加入浓乙胺水溶液20毫升，室温下反应过夜，点板反应完成，滤除沉淀，将溶液除去，用大量乙酸乙酯溶解，用稀碱洗涤，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，得到浅黄色固体(Fmoc-Pro-NHEt)。
HPLC纯度：大于93.1%，收率为93.2％。
2、Fmoc-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成
称取Fmoc-Pro-NHEt(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/DMF为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(NH2-Pro-NHEt)。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Fmoc-Arg(NO2)-OH(20mmol)，NH2-Pro-NHEt(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到浅黄色固体(Fmoc-Arg(NO2)-Pro-NHEt)。
HPLC纯度：大于92.2%，收率为91.6％。
3、Fmoc-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成
称取Fmoc-Arg(NO2)-Pro-NHEt(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/DMF为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(NH2-Arg(NO2)-Pro-NHEt)。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Fmoc-Leu-OH(20mmol)，NH2-Arg(NO2)-Pro-NHEt(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到固体(Fmoc-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt)。
HPLC纯度：大于93%，收率为90％
4、Fmoc-D-Ser(otbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成
称取Fmoc-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/DMF为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(NH2-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt)。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Fmoc-D-Ser(otbu)-OH(20mmol)，NH2-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt(20mmol)，HOSU(22mmol)，用无水DMF40毫升溶解，在冰水浴下加入DCC(22mmol)后，在室温下搅拌2小时，检测反应完全。抽滤除去反应产生的沉淀，减压浓缩除去DMF，之后用大量乙酸乙酯溶解，用NaHCO3洗涤，用稀盐酸洗涤，饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯，得到固体(Fmoc-D-Ser(otbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt)。
HPLC纯度：大于94.5%，收率为88.1％
5、D-Ser(otbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成
称取Fmoc-D-Ser(otbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt(20mmol)置于100毫升的圆底烧瓶中加入哌啶/DMF为25％的溶液30毫升，在室温下反应30分钟，检测反应完全，加入大量乙醚，析出大量沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤数次，干燥，得到白色固体产品(NH2-D-Ser(otbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt)。
HPLC纯度：大于93.5%，收率为91％ 。
三、Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(otbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成
在50毫升的圆底烧瓶中加入Boc-Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-OH (20mmol)， 在室温下加入脱保护试剂（TFA：苯甲硫醚：水：EDT=92:4:2:2）200ml，室温下裂解1.5小时，将裂解液倒入预先冷却好的（0℃）无水乙醚中，搅拌沉降3小时，离心，用无水乙醚洗涤5次，真空干燥，得到白色固体, Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH。
在50毫升的圆底烧瓶中加入Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH(20mmol)，用无水DMF40毫升溶解，加入NH2-D-Ser(otbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt (20mmol)的DMF溶液20毫升，加入2-碘-4-甲氧基-苯硼酸(0.1mmol)和直径4Å的分子筛（2g），加入磁子后在室温下搅拌2小时，检测反应完全。过滤回收分子筛，慢慢滴加饱和碳酸氢钠溶液100ml，产生大量白色沉淀，过滤得到白色产品，用100ml纯水打浆洗涤白色沉淀，过滤并合并滤液。白色产品为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(otbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt。
HPLC纯度：大于90.3%，收率为85.5%
滤液浓缩除去水分，得到白色沉淀，过滤除去DMF，固体用3ml水溶解，用稀柠檬酸调节pH值至2-3，产生大量白色沉淀，过滤，纯水洗涤，回收催化剂。
四、Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(otbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成
称取20毫摩的Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(otbu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt置于100ml的氢化反应釜中，加入四氢呋喃60ml加入5%的Pd/C催化剂0.1g，氢气置换釜内空气，置换3次后，加压至2MPa，室温反应15h，HPLC检测反应结束。过滤回收催化剂备用。旋蒸除去溶剂，获得白色固体。采用制备柱对产品进行纯化制备。HPLC纯度：大于99.5%，收率为85.1%MS＝1239.4223，其
质谱图参照图1。

Claims (6)

1.一种布舍瑞林的液相合成方法，其特征在于：所述的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D- Ser(OTbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt是在液相条件下由五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)- Ser(R4)-
Tyr(R5)-R11与四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt在催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼
酸和直径4Å的分子筛的作用下缩合反应、脱保护而成；
其中：R1为BOC 、Z、Fmoc或H;
R2为BOC、Z、Bzl、Trt、Tos、Bom、Dnp或H;
R3为BOC、For、H或Z;
R4为Bzl、H、Tbu、Z、Boc或Tos;
R5为Bzl、H、Tbu、2,6-di-Cl-Bzl、Me、Z或2-Cl-Z;
R6为BOC、Z或Fmoc;
R7为BOC、(BOC)2、PBF、TOS、NO2、H、PMC、HCL、ADOC或Mts;
所述的缩合反应通过催化剂2-碘-4-甲氧基-苯硼酸和直径4Å的分子筛催化反应完成。
2.如权利要求1 所述布舍瑞林的液相合成方法，其特征在于：所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11由以下步骤合成：首先合成Tyr(R5)-R11,再与α氮端 保护的R12 - Ser(R4)反应，生成R12 - Ser(R4) - Tyr(R5) -R11,脱保护，与α氮端保护的R13- Trp(R3)反应，生成R13-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11,脱保护，与α氮端保护的R14-His(R2) 反应，生成R14-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-R11,脱保护，与α氮端保护的R1-Pyr反 应，生成R1 -Pyr -His(R2) -Trp(R3)- Ser(R4) -Tyr(R5)-R11,得到五肽片段R1-Pyr -His(R2) -Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH;
其中：R11为OME、OEt、Otbu、苄酯、酯类或者有机盐、无机盐；
R12为BOC、Z或Fmoc;
R13为BOC、Z或Fmoc;
R14为BOC、Z或Fmoc。
3.如权利要求1 所述布舍瑞林的液相合成方法，其特征在于：所述的五肽片段R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH 由以下步骤合成：首先合成R1-Pyr 的活化酯，再与羧 基端保护 His(R2)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2);合成R1-Pyr-His(R2) 的活化酯，与羧基 端保护 Trp(R3)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3);合成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3) 的活 化酯，与羧基端保护Ser(R4)-R11反应，生成R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)- Ser(R4);合成R1-Pyr-
His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4) 的活化酯，与NH2-Tyr(R5)-R11反应，得到R1-Pyr-His(R2)-Trp(R3)-Ser(R4)-Tyr(R5)-OH;
其中：R11为OME、OEt、Otbu、苄酯、酯类或者有机盐、无机盐。
4.如权利要求1 所述布舍瑞林的液相合成方法，其特征在于；所述的四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt 由以下步骤合成：首先合成R8-Pro-NHEt,脱保护，再与a氮端保护、侧链R7保护的R9-Arg(R7)-OH反应，生成α氮端保护的R9-Arg(R7)-Pro-NHEt;脱保护，与α氮端保护的R10-Leu-OH反应，生成α氮端保护的R10-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt;脱保护，与R6-D- Ser(R4)-OH反应，生成R6-D- Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt;
最后脱去R6保护得到四肽片段D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt;
其中：R8为BOC、Z或Fmoc;
R9为BOC、Z或Fmoc;
R10为BOC、Z或Fmoc。
5.如权利要求1 所述布舍瑞林的液相合成方法，其特征在于：所述的四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt 由以下步骤合成：首先合成R6-D-Ser(R4) 的活化酯，然后与 羧基端保护Leu-R11反应，生成 R6-D-Ser(R4)-Leu; 合成R6-D-Ser(R4)-Leu 的活化酯，与羧 基端保护 Arg(R7)-R11反应，生成R6-D-Ser(R4) -Leu-Arg(R7);合成R6-D-Ser(R4)-Leu- Arg(R7) 的活化酯，与Pro-NHEt反应，生成R6-D- Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt;最后脱去R6保护得到四肽片段D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt;
其中：R11为OME、OEt、Otbu、苄酯、酯类或者有机盐、无机盐。
6.如权利要求1所述布舍瑞林的液相合成方法，其特征在于：所述的四肽片段R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt 由以下步骤合成：首先合成R6-D-Ser(R4) 的活化酯，然后与 羧基端保护Leu-R11反应，生成R6-D- Ser(R4)-Leu;合成R6-D- Ser(R4)-Leu的活化酯，与羧 基端保护Arg(R7) - R11 反应，生成R6-D- Ser(R4) -Leu -Arg(R7);合成R6-D-Ser(R4) -Leu -Arg(R7) 的活化酯，与Pro-R11 反应，生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-OH;生成R6-D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-OH与NH2Et,生成R6-D- Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt;最后脱
去R6保护得到四肽片段D-Ser(R4)-Leu-Arg(R7)-Pro-NHEt;
其中：R11为OME、OEt、Otbu、苄酯、酯类或者有机盐、无机盐。
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