CN112409458A - 一种卡贝缩宫素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽合成技术领域，特别涉及一种卡贝缩宫素的制备方法。该制备方法包括以下步骤：依次将Gly、Leu、Pro、Cys(CH2CH2CH2CO2R1)、Asn(R2)、Gln(R3)、Ile、Tyr(Me)偶联至氨基树脂上，得到Fmoc‑全保护肽树脂；脱除Fmoc保护基和R1，将多肽树脂进行缩合，得到环化的卡贝缩宫素肽树脂；裂解，沉淀，得到粗肽；将粗肽进行分离纯化，冷冻干燥。本发明R1基团可以在温和的条件下脱除，使肽链不会在脱除R1的时候从树脂上脱落。本发明成功的在树脂上通过形成酰胺键而成环，成环的效率高，速度快，收率高，有利于规模化工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，特别涉及一种卡贝缩宫素的制备方法。
背景技术
醋酸卡贝缩宫素(Acatate Carbetocin)，商品名：巧特欣，化学名称：(2S)-N-[(2S)-1-[(2-amino-2-oxoethyl)amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]-1-[(3R,6S,9S,12S,15S)-6-(2-amino-2-oxoethyl)-9-(3-amino-3-oxopropyl)-12-[(2S)-butan-2-yl]-15-[(4-methoxyphenyl)methyl]-5,8,11,14,17-pentaoxo-1-thia-4,7,10,13,16-pentazacycloicosane-3-carbonyl]pyrrolidine-2-carboxamide，氨基酸序列为：[Butyry-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys]-Pro-Leu-Gly-NH2，分子式：C45H69N11O12S，分子量：988.16，CAS：37025-55-1，化学结构式：
卡贝缩宫素(Carbetocin)是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物。硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。不论是静脉注射还是肌肉注射卡贝缩宫素后，子宫迅速收缩，可在2分钟内达到一个明确强度。单剂量静脉注射卡贝缩宫素对子宫的活性作用可持续大约1个小时，因此足以预防刚生产后的产后出血。产后给予卡贝缩宫素后，在收缩的频率与幅度方面都比催产素为长。卡贝缩宫素还有很好的安全性，在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰，因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。
卡贝缩宫素结构与天然缩宫素的结构不同之处是其N-端的环状结构：天然缩宫素是通过两个半胱氨酸的侧链巯基形成二硫键成环，而卡贝缩宫素将N-末端的半胱酸用丁酸替代后与另一个半胱氨酸的侧链巯基形成硫醚键成环，因为硫醚键比二硫键更稳定，不易被酶降解，所以卡贝缩宫素比缩宫素更稳定性，生物活性更强。
由于卡贝缩宫素的化学结构独特，导致其合成难度大。目前报道的卡贝缩宫素合成方法收率低或采用的试剂昂贵，生产成本高。卡贝缩宫素及其类似物的制备方法早期主要是液相合成法，这些方法的操作复杂，不利于工业生产、应用价值不高。
欧洲专利ES2115543，该专利公开了固液相结合的合成方法，这个方法主要是：通过常规的固相多肽合成法，采用HOBt/DIC体系得到4-氯丁基-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-PAL-Nle-pMBHA，然后用比例为8:1:1(v/v)的三氟乙酸/十二硫醇/H2O裂解2小时，得到线性肽4-氯丁基-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2，线性肽用1：1(v/v)的乙腈和水作溶剂，用1MNaOH调pH＝9，环化得到卡贝缩宫素。它所用的碱还包括LiOH，NaHCO3，DIEA，DMAP。但是在液相氧化的过程中，分子内的硫醚键形成难度大，分子间的二硫键却极易形成，导致粗品收率极低，不利于工业化生产。
捷克专利CS8605461，先用固相多肽合成法合成Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-O-树脂，然后裂解得到Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2,再将其氢化，得到Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2，再跟4-溴丁酸反应，得到Ile-Gln-Asn-Cys(C3H6COOH)-Pro-Leu-Gly-NH2，再跟X-Tyr(OMe)-OH反应，脱保护，环化得到卡贝缩宫素。该方法涉及氢化反应脱除Cys侧链的Bzl保护基，需要在高压条件下进行，危险系数高，不利于放大生产。
中国专利CN200910106889.0公布了一种固相制备卡贝缩宫素的方法，该方案通过固相合成法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，得到卡贝缩宫素前体肽-氨基树脂；用三苯基膦钯脱掉半胱氨酸侧链烯丙基保护基，加入有机碱，氯化锂，环化，裂解，纯化、冻干得到精卡贝缩宫素，该方法中脱侧链烯丙基保护基的试剂价格昂贵，不利于大规模生产。
中国专利CN201110151928.6公布了一种卡贝缩宫素的制备方法，其采用新型的巯基保护氨基酸Fmoc-Cys((CH2)3COOAll)，该方法中脱侧链烯丙基保护基的试剂价格也很昂贵，不利于大规模生产。
中国专利CN201110001400.0公布了一种多肽合成卡贝缩宫素的制备方法，该方法采用固相合成法合成线性卡贝缩宫素前体肽，然后将其液相环化，该方法中的环化需要在极稀溶剂(10-4-10-5mol/L)中进行，产生大量废液，同时易产生多聚物，具有环化效率不高，后续处理复杂等缺点。
中国专利CN102796178A公布了一种卡贝缩宫素的制备方法，该方法采用新型的巯基保护氨基酸Fmoc-Cys((CH2)3COOCH2CH2CN)作为原料，该原料价格昂贵，并且Fmoc-Cys((CH2)3COOCH2CH2CN)保护副反应多，不利于大规模生产。
中国专利CN 104592362 A公布了一种卡贝缩宫素的合成工艺，将Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH及四氯丁酸依次Rink Amide-AM Resin偶联反应，直至合成卡贝缩宫素线性肽树脂；裂解后获得的卡贝缩宫素线性粗肽，液相环化成卡贝缩宫素粗品，分离纯化制得卡贝缩宫素。在液相氧化的过程中加入巯基还原剂TCEP·HCl，以防止分子间形成二硫键，但是该方法液相氧化的时间较长，易生成杂质，且TCEP·HCl价格昂贵，过量投料，成本高昂，不利于规模化生产。
综合研究以往的专利文献的，可以发现其中有诸多的技术问题，比如卡贝缩宫素固相成环中，使用昂贵的催化剂或脱保护试剂。卡贝缩宫素的液相成环中，容易生成分子间聚合物，反应体积大，杂质多，后处理复杂等缺点。这些问题都不利于卡贝缩宫素的大规模工业化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种卡贝缩宫素的制备方法。该制备方法成本低廉、步骤精简，收率大且纯度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种卡贝缩宫素的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)采用Fmoc固相合成策略，依次将Gly、Leu、Pro、Cys(CH2CH2CH2CO2R1)、Asn(R2)、Gln(R3)、Ile、Tyr(Me)偶联至氨基树脂上，得到Fmoc-全保护肽树脂，即Fmoc-Tyr(Me)-Ile-Gln(R3)-Asn(R2)-Cys(CH2CH2CH2CO2R1)-Pro-Leu-Gly-氨基树脂；
(2)脱除Fmoc-全保护肽树脂的Fmoc保护基和R1，得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln(R3)-Asn(R2)-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-氨基树脂；
(3)将步骤(2)所得多肽树脂进行缩合，得到环化的卡贝缩宫素肽树脂；
(4)将环化的卡贝缩宫素肽树脂采用切割液进行裂解，再在乙醚或叔丁基甲醚中沉淀，得到卡贝缩宫素粗肽；
(5)采用制备型反相高效液相色谱系统将卡贝缩宫素粗肽进行分离纯化，冷冻干燥，获得卡贝缩宫素。
作为优选，步骤(1)中，氨基树脂选自Rink Amide-AM树脂、Sieber Amide树脂、PALAmide树脂、Knorr树脂、Knorr-2-Chlorotrityl树脂或Rink Amide-MBHA树脂。
作为优选，氨基树脂的取代值为0.05～5.0mmol/g，树脂的颗粒大小为5～500目。
优选地，氨基树脂的取代值为0.5～1.0mmol/g，树脂的颗粒大小为100～300目。
作为优选，R1为2-Chlorotrityl(2-Cl-Trt)、2,4-Dimethoxybenzyl(Dmb)、2-Phenylisopropyl(2-PhiPr)或5-Phenyl-3,4-ethylenedioxythenyl Derivatives(PhenylEDOTn)中的任意一种。
作为优选，R2或R3为2,4,6-Trimethoxybenzyl(Tmob)、9-Xanthenyl(Xan)、Trityl(Trt)、4-Methyltrityl(Mtt)、Cyclopropyldimethylcarbinyl(Cpd)或4,4′-Dimethoxybenzhydryl(Mbh)中的任意一种。
作为优选，步骤(1)中偶联或步骤(3)中缩合所用偶联剂为以下八种混合物中的任选一种：
X试剂、HATU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、HBTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、HCTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂与DIC按摩尔比为1:(1～5)混合；
X试剂与EDC·HCl按摩尔比为1:(1～5)混合；
X试剂、PyAOP与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、PyBOP与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
X试剂、TBTU与Y试剂按摩尔比为1:1:(1～5)混合；
其中，X试剂为HOBt或HOAt，Y试剂为DIEA或NMM。
在本发明具体实施例中，偶联剂为HOBt与DIC按摩尔比为1:(1～1.5)的混合物。
作为优选，步骤(2)中R1的脱除试剂为体积百分比0.1％～5.0％的TFA–DCM溶液。
优选地，步骤(2)中R1的脱除试剂为体积百分比1％～4％的TFA–DCM溶液。
作为优选，步骤(1)中，按照1:(1.1～20):(1.1～100)的摩尔比分别称取溶胀后的氨基树脂、Fmoc-氨基酸、缩合试剂；
以DMF溶解并活化Fmoc-氨基酸和缩合试剂，再将所得氨基酸活化液加入到溶胀后的氨基树脂中，连接Fmoc-氨基酸，得到Fmoc-氨基酸-氨基树脂；
连接下一个氨基酸之前，用含有1％～50％v/v哌啶的DMF溶液脱Fmoc保护基1～10次，每次脱保护的时间分别为1～20min，每次连接上一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都需要用DMF洗涤树脂1～20次。
优选地，步骤(1)中，按照1:(3～4):(6.6～8.8)的摩尔比分别称取溶胀后的氨基树脂、Fmoc-氨基酸、缩合试剂；
以DMF溶解并活化Fmoc-氨基酸和缩合试剂，再将所得氨基酸活化液加入到溶胀后的氨基树脂中，连接Fmoc-氨基酸，得到Fmoc-氨基酸-氨基树脂；
连接下一个氨基酸之前，用含有20％v/v哌啶的DMF溶液脱Fmoc保护基2次，每次脱保护的时间分别为5min、15min，每次连接上一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都需要用DMF洗涤树脂6次。
作为优选，步骤(1)中偶联或步骤(3)中缩合的反应温度为0～50℃，反应时间为0.1～10.0小时。
优选地，步骤(1)中偶联或步骤(3)中缩合的反应温度为25～30℃，反应时间为3小时。
作为优选，步骤(4)中，裂解所用试剂为以下三种方式中的任一种：
(1)TFA：苯酚：水：苯甲硫醚：EDT按照82.5：5：5：5：2.5的体积比混合；
(2)TFA：EDT：TIS：间甲酚按照92.5：2.5：2.5：2.5的体积比混合；
(3)TFA：苯甲硫醚：EDT：苯甲醚按照90：5：3：2的体积比混合。
作为优选，步骤(4)中，裂解为：将肽树脂与切割液以1g：(1～100)mL的比例混合，0～50℃机械搅拌反应1～24h；然后将反应液过滤，加入-50～20℃的乙醚或叔丁基甲醚中进行沉淀，离心后收集沉淀物，用乙醚或叔丁基甲醚洗涤沉淀物1～20次，0～50℃减压干燥至恒重，得到卡贝缩宫素粗肽。
优选地，步骤(4)中，裂解为：将肽树脂与切割液以1g：(1～100)mL的比例混合，30℃机械搅拌反应3h；然后将反应液过滤，加入冰乙醚或叔丁基甲醚中进行沉淀，离心后收集沉淀物，用乙醚或叔丁基甲醚洗涤沉淀物3次，30℃减压干燥至恒重，得到卡贝缩宫素粗肽。
作为优选，步骤(4)与步骤(5)之间还包括：以1～20％v/v的醋酸水溶液溶解卡贝缩宫素粗肽，再以0.1～10.0μm的微孔滤膜过滤。
优选地，步骤(4)与步骤(5)之间还包括：以10％v/v的醋酸水溶液溶解卡贝缩宫素粗肽，再以0.22μm的微孔滤膜过滤。
作为优选，步骤(5)中，制备型反相高效液相色谱系统的填料为反相-C1、C4、C8、C18、Phenly或CN中的任意一种；制备型反相高效液相色谱系统的流动相A选自TFA、醋酸盐、硫酸盐、磷酸盐、高磷酸盐、柠檬酸盐中的任意一种缓冲盐或几种缓冲盐的混合物，流动相A的浓度为1～500mmoL/L。
在本发明提供的具体实施例中，流动相A为50mmoL/L醋酸铵或0.5％磷酸。
作为优选，缓冲盐的pH值为2.0～8.0。
优选地，缓冲盐的pH值为4.0～5.0。
作为优选，步骤(5)中，制备型反相高效液相色谱系统的流动相B为甲醇、乙醇或乙腈中的任意一种或几种。
作为优选，步骤(5)中，制备型反相高效液相色谱系统的洗脱梯度为1个梯度的变化时长为(3-15min)
优选地，步骤(5)中，制备型反相高效液相色谱系统的洗脱梯度为1个梯度的变化时长为/(3-8min)。
作为优选，步骤(5)中分离纯化与冷冻干燥之间还包括转盐的步骤，卡贝缩宫素为卡贝缩宫素三氟醋酸盐或卡贝缩宫素醋酸盐。
本发明提供了一种卡贝缩宫素的制备方法。该制备方法包括以下步骤：采用Fmoc固相合成策略，依次将Gly、Leu、Pro、Cys(CH2CH2CH2CO2R1)、Asn(R2)、Gln(R3)、Ile、Tyr(Me)偶联至氨基树脂上，得到Fmoc-全保护肽树脂；脱除Fmoc-全保护肽树脂的Fmoc保护基和R1，得到多肽树脂；将步骤(2)所得多肽树脂进行缩合，得到环化的卡贝缩宫素肽树脂；将环化的卡贝缩宫素肽树脂采用切割液进行裂解，再在乙醚或叔丁基甲醚中沉淀，得到卡贝缩宫素粗肽；采用制备型反相高效液相色谱系统将卡贝缩宫素粗肽进行分离纯化，冷冻干燥，获得卡贝缩宫素。本发明具有的有益效果为：
本发明所述的卡贝缩宫素制备方法，尤其是卡贝缩宫素的固相成环方法，以Fmoc-Linker-氨基树脂为起始原料，从C端到N端依次连接八个具有Fmoc-保护基的氨基酸。其中Cys采用Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOR1)-OH，最后一个氨基酸使用Fmoc-Tyr(Me)-OH。脱去最后一个Fmoc保护基，并脱去Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOR1)-OH侧链的R1保护基，获得保护的卡贝缩宫素肽树脂。再加入偶联试剂，使Cys侧链的CH2CH2CH2COOH和Tyr末端的-NH2在树脂上形成酰胺键，完成固相成环。本发明中所使用的Fmoc-Cys(CH2CH2CH2COOR1)-OH，其中的R1基团可以在温和的条件下脱除，使肽链不会在脱除R1的时候从树脂上脱落。本发明所使用的方法工艺路线简单，避免了固相片段缩合的诸多问题，避免了其他固相成环的不足之处，也避免了液相成环过程中反应体积大，产率低，易形成聚合杂质的缺点。本发明成功的在树脂上通过形成酰胺键而成环，成环的效率高，速度快，有利于规模化工业生产。
本发明制得的粗肽的纯度达到85％以上，且粗肽产率大，最终的精肽总收率在80％以上，有利于规模化工业生产。
附图说明
图1为实施例1粗肽的HPLC图谱，图2为实施例1精肽的HPLC图谱；
图3为实施例2粗肽的HPLC图谱，图4为实施例2精肽的HPLC图谱；
图5为对比例1粗肽的HPLC图谱，图6为对比例1精肽的HPLC图谱；
图7为对比例2粗肽的HPLC图谱，图8为对比例2精肽的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种卡贝缩宫素的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
说明书或权利要求书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc：9-芴甲氧羰基；
DCM：二氯甲烷；
DMF：N,N-二甲基甲酰胺；
Piperidine：六氢吡啶/哌啶；
HOAt：N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；
HOBt：1-羟基苯并三唑；
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯；
HBTU：苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯；
HCTU：6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯；
TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸；
NMM：N-甲基吗啉；
PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基；
PyAOP：(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
DIEA：N,N-二异丙基乙胺；
DIC：N,N’-二异丙基碳二亚胺；
EDC·HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)；
TCEP·HCl：三(2-羧乙基)膦盐酸盐；
MeOH：甲醇；
TFA：三氟醋酸；
TIS：三异丙基硅烷。
本发明提供的卡贝缩宫素的制备方法中所用原料、试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(1)Fmoc-Gly-Amide-AM-树脂的制备
称取39.2g(20.0mmol)Fmoc-Rink-Amide AM树脂(取代值为0.51mmol/g)，置于带夹套的1000mL多肽固相合成器中，加入400mL DMF溶胀两次，每次1小时。树脂溶胀完全后抽去DMF，用400mL 20％(DMF/v)的Piperidine/DMF溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为5min和15min，再用400mL DMF洗涤6次，抽去DMF。用200mL DMF溶解17.8g(60.0mmol)Fmoc-Gly-OH和8.1g(60.0mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴5～15min，再加入11.20mL(72mmol)DIC，活化5～15min后将混合溶液加入到固相反应器中，下鼓氮气加机械搅拌反应3h，以恒温循环水控制反应温度为25～30℃。茚三酮检验呈阴性，抽去反应液，再用400mL DMF洗涤6次，抽干DMF即得Fmoc-Gly-Amide-AM-树脂。
(2)Fmoc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2CO2(2-Cl-Trt))-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂的制备
将上述制备的Fmoc-Gly-Amide-AM-树脂置于多肽固相合成器中，脱除Fmoc保护基之后，用200mL DMF溶解21.2g(60.0mmol)Fmoc-Leu-OH和8.1g(60.0mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴5～15min，再加入11.20mL(72mmol)DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，下鼓氮气加机械搅拌反应3h，以恒温循环水控制反应温度为25～30℃。茚三酮检验呈阴性，抽去反应液，再用400mL DMF洗6次，抽干DMF即得Fmoc-Leu-Gly-AM-树脂。脱Fmoc保护基和DMF洗涤的操作同(1)。
按照卡贝缩宫素氨基酸序列重复上述操作，依据表1的量称取氨基酸和缩合剂，加入200mL DMF溶解Fmoc-氨基酸和HOBt，冰浴5～15min，再加入DIC，然后依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(CH2CH2CH2CO2(2-Cl-Trt))-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Tyr(Me)-OH，即得Fmoc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2CO2(2-Cl-Trt))-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂。
表1每种氨基酸和缩合剂的用量
(3)H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂的制备
用400mL 20％(v/v)的Piperidine/DMF溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为5min和15min，再用400mL DMF洗涤4次，抽去DMF。再用400mL DCM洗涤4次，抽去DCM。加入800mL1.0％TFA/DCM，搅拌反应2小时，抽去1.0％TFA/DCM；再加入800mL 1.0％TFA/DCM，搅拌反应1小时，抽去0.1％TFA/DCM；用400mL DCM洗涤3次，再用400mL DMF洗涤3次，抽干DMF即得H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂。
(4)卡贝缩宫素肽树脂的制备
称取8.1g HOBt，用300mLDMF溶解后加入H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂，再加入11.20mL(72mmol)DIC，下鼓氮气加机械搅拌反应3h，以恒温循环水控制反应温度为25～30℃。茚三酮检验呈阴性，抽去反应液；如果茚三酮检验呈阳性，则重复上述操作，直到茚三酮检验呈阴性。用400mL DMF洗涤3次，再用400mL DCM洗涤3次，再用300mL MeOH洗涤3次，将甲醇抽干，即得卡贝缩宫素肽树脂。
(5)卡贝缩宫素粗肽的制备
将上述制备的卡贝缩宫素肽树脂置于1000mL圆底烧瓶中，加入800mL切割液(TFA/苯酚/水/thioanisole/EDT按照82.5/5/5/5/2.5的体积比混合)，30℃油浴加热，机械搅拌反应3h。然后将反应液过滤至15L冰乙醚中沉淀，离心后收集沉淀，以冰乙醚洗涤沉淀物3次，30℃减压干燥至恒重，得到卡贝缩宫素粗肽20.2g，粗肽纯度为81.33％(图1)。
(6)卡贝缩宫素精肽的制备
取上述20.2g卡贝缩宫素粗肽，用10％冰醋酸/水溶解至400mL，0.22μm的滤膜过滤，而后用制备型HPLC纯化。流动相A为50mM醋酸铵(醋酸调节pH＝4.00)，流动相B为乙腈，制备填料为反相C18，洗脱梯度为22％～42％(0-60min)，HPLC检测收集的馏分，将纯度≥98％，单杂≤0.5％的样品转醋酸盐。收集纯度≥99.0％的转盐样品，旋蒸冻干后得16.50g醋酸卡贝缩宫素，精肽检测纯度为99.71％，最大单杂为0.07％(图2)。
20mmol的合成规模，理论应得19.76g卡贝缩宫素，实际得16.50g，实际总收率为83.50％。
实施例2
(1)Fmoc-Gly-Amide-AM-树脂的制备
称取31.25g(30.0mmol)Fmoc-Rink-Amide AM树脂(取代值为0.96mmol/g)，置于带夹套的1000mL多肽固相合成器中，加入400mL DMF溶胀两次，每次1小时。树脂溶胀完全后抽去DMF，用400mL 20％(v/v)的Piperidine/DMF溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为5min和15min，再用400mL DMF洗涤6次，抽去DMF。用200mL DMF溶解40.4g(120.0mmol)Fmoc-Gly-OH和16.2g(120.0mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴5～15min，再加入22.40mL(144mmol)DIC，活化5～15min后将混合溶液加入到固相反应器中，下鼓氮气加机械搅拌反应3h，以恒温循环水控制反应温度为25～30℃。茚三酮检验呈阴性，抽去反应液，再用400mL DMF洗涤6次，抽干DMF即得Fmoc-Gly-Amide-AM-树脂。
(2)Fmoc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2CO2(2-Cl-Trt))-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂的制备
将上述制备的Fmoc-Gly-Amide-AM-树脂置于多肽固相合成器中，脱除Fmoc保护基之后，用200mL DMF溶解42.4g(120.0mmol)Fmoc-Leu-OH和16.2g(120.0mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴5～15min，再加入22.40mL(144mmol)DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，下鼓氮气加机械搅拌反应3h，以恒温循环水控制反应温度为25～30℃。茚三酮检验呈阴性，抽去反应液，再用400mL DMF洗6次，抽干DMF即得Fmoc-Leu-Gly-AM-树脂。脱Fmoc保护基和DMF洗涤的操作同(1)。
按照卡贝缩宫素氨基酸序列重复上述操作，依据表2的量称取氨基酸和缩合剂，加入200mL DMF溶解Fmoc-氨基酸和HOBt，冰浴5～15min，再加入DIC，然后依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(CH2CH2CH2CO2(Dmb))-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Tyr(Me)-OH，即得Fmoc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2CO2(Dmb))-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂。
表2每种氨基酸和缩合剂的用量
(3)H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂的制备
用400mL 20％(v/v)的Piperidine/DMF溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为5min和15min，再用400mL DMF洗涤4次，抽去DMF。再用400mL DCM洗涤4次，抽去DCM。加入800mL4.0％TFA/DCM，搅拌反应2小时，抽去4.0％TFA/DCM；再加入800mL4.0％TFA/DCM，搅拌反应1小时，抽去4.0％TFA/DCM；用400mL DCM洗涤3次，再用400mL DMF洗涤3次，抽干DMF即得H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂。
(4)卡贝缩宫素肽树脂的制备
称取16.2g HOBt，用300mLDMF溶解后加入到H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂中，再加入22.4mL(144mmol)DIC，下鼓氮气加机械搅拌反应3h，以恒温循环水控制反应温度为25～30℃。茚三酮检验呈阴性，抽去反应液；如果茚三酮检验呈阳性，则重复上述操作，直到茚三酮检验呈阴性。用400mL DMF洗涤3次，再用400mL DCM洗涤3次，再用300mL MeOH洗涤3次，将甲醇抽干，即得卡贝缩宫素肽树脂。
(5)卡贝缩宫素粗肽的制备
将上述制备的卡贝缩宫素肽树脂置于1000mL圆底烧瓶中，加入800mL切割液(TFA：EDT：TIS：间甲酚按照92.5：2.5：2.5：2.5体积比混合)，30℃油浴加热，机械搅拌反应3h。然后将反应液过滤至25L冰的甲基叔丁基醚中沉淀，离心后收集沉淀，以冰乙醚洗涤沉淀物3次，30℃减压干燥至恒重，得到卡贝缩宫素粗肽30.5g，粗肽纯度为84.49％(图3)。
(6)卡贝缩宫素精肽的制备
取上述30.5g卡贝缩宫素粗肽，用10％冰醋酸/水溶解，0.22μm的滤膜过滤，而后用制备型HPLC纯化。流动相A为0.5％磷酸(氨水调节pH＝5.00)，流动相B为乙腈，制备填料为反相C8，洗脱梯度为20％～45％(0-60min)，HPLC检测收集的馏分，将纯度≥98％，单杂≤0.5％的样品转醋酸盐。收集纯度≥99.0％转盐样品，旋蒸冻干后得25.2g醋酸卡贝缩宫素，精肽检测纯度为99.75％，最大单杂为0.06％(图4)。
30mmol的合成规模，理论应得29.64g卡贝缩宫素，实际得25.20g，实际总收率为85.02％。
对比例1
(1)Fmoc-Gly-Amide-AM-树脂的制备
称取27.78g(20.0mmol)Fmoc-Rink-Amide AM树脂(取代值为0.72mmol/g)，置于带夹套的1000mL多肽固相合成器中，加入300mL DMF溶胀两次，每次1小时。树脂溶胀完全后抽去DMF，用300mL 20％(v/v)的Piperidine/DMF溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为5min和15min，再用300mL DMF洗涤6次，抽去DMF。用200mL DMF溶解17.8g(60.0mmol)Fmoc-Gly-OH和8.1g(60.0mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴5～15min，再加入11.20mL(72mmol)DIC，活化5min后将混合溶液加入到固相反应器中，下鼓氮气加机械搅拌反应3h，以恒温循环水控制反应温度为25～30℃。茚三酮检验呈阴性，抽去反应液，再用300mL DMF洗涤6次，抽干DMF即得Fmoc-Gly-Amide-AM-树脂。
(2)Cl-(CH2)3CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂的制备
将上述制备的Fmoc-Gly-Amide-AM-树脂置于多肽固相合成器中，脱除Fmoc保护基之后，用200mL DMF溶解21.2g(60.0mmol)Fmoc-Leu-OH和8.1g(60.0mmol)HOBt，超声振荡溶解后，冰浴5～15min，再加入11.20mL(72mmol)DIC，活化5～15min后将混合溶液加入到固相反应器中，下鼓氮气加机械搅拌反应3h，以恒温循环水控制反应温度为25～30℃。茚三酮检验呈阴性，抽去反应液，再用300mL DMF洗6次，抽干DMF即得Fmoc-Leu-Gly-AM-树脂。脱Fmoc保护基和DMF洗涤的操作同(1)。
按照卡贝缩宫素氨基酸序列重复上述操作，依据表3的量称取氨基酸和缩合剂，加入200mL DMF溶解Fmoc-氨基酸和HOBt，冰浴5～15min，再加入DIC，然后依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH和Cl-(CH2)3COOH，即得Cl-(CH2)3CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂。
表3每种氨基酸和缩合剂的用量
(3)Cl-(CH2)3CO-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2的制备
将上述制备的Cl-(CH2)3CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Amide-AM-树脂置于1000mL圆底烧瓶中，加入600mL切割液(TFA/苯酚/水/苯甲硫醚/EDT按照82.5/5/5/5/2.5的体积比混合)，30℃油浴加热，机械搅拌反应3h。然后将反应液过滤至15L冰乙醚中沉淀，离心后收集沉淀，以冰乙醚洗涤沉淀物3次，30℃减压干燥至恒重，得到卡贝缩宫素线性粗肽20.50g。
(4)称取20.50上述制备的卡贝缩宫素线性粗肽，溶于3000mL 1％的氨水中，加入200mL DMSO，室温下机械搅拌反应3小时，HPLC在线监控，线性肽反应完全，但是在反应的过程中，逐渐有絮状物析出。用冰醋酸调节pH为3.0～4.0，得到卡贝缩宫素粗肽反应液，其中的主峰纯度为23.92％(图5)。
终止反应后，取出少量反应液，离心得沉淀物，分析结果证实沉淀物为分子间聚合物。
(5)用0.22μm的滤膜过滤上述的反应液，而后用制备型HPLC纯化。流动相A为50mM醋酸铵(醋酸调节pH＝4.00)，流动相B为乙腈，制备填料为反相C18，洗脱梯度为22％～32％(0-60min)，HPLC检测收集的馏分，将纯度≥98％，单杂≤0.5％的样品转盐。收集纯度≥98.0％的转盐样品，旋蒸冻干后得6.56g醋酸卡贝缩宫素，精肽检测纯度为98.74％，最大单杂为0.31％(图6)。
20mmol的合成规模，理论应得19.76g卡贝缩宫素，实际得3.18g，实际总收率为16.09％。
对比例2
(1)按照上述的对比例3的步骤1～3制取20mmol的卡贝缩宫素线性粗肽，得21.00g。
(2)称取21.00g上述制备的卡贝缩宫素线性粗肽，溶于1000mL 1％的氨水中，室温下机械搅拌反应，HPLC监控环化程度，72h后线性肽反应完全。但是在反应的过程中，逐渐有絮状物析出。用冰醋酸调节pH为3.0～4.0，得到卡贝缩宫素粗肽反应液，其中的主峰纯度为23.36％(图7)。
终止反应后，取出少量反应液，离心得沉淀物，分析结果证实沉淀物为分子间聚合物。
(3)用0.22μm的滤膜过滤上述的反应液，而后用制备型HPLC纯化。流动相A为50mM醋酸铵(醋酸调节pH＝4.00)，流动相B为乙腈，制备填料为反相C18，洗脱梯度为22％～32％(0-60min)，HPLC检测收集的馏分，将纯度≥98％，单杂≤0.5％的样品转盐。收集纯度≥98.0％的转盐样品，旋蒸冻干后得6.56g醋酸卡贝缩宫素，精肽检测纯度为98.74％，最大单杂为0.31％(图8)。
(4)20mmol的合成规模，理论应得19.76g卡贝缩宫素，实际得2.80g，实际总收率为14.17％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，同时给出了对比实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种卡贝缩宫素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用Fmoc固相合成策略，依次将Gly、Leu、Pro、Cys(CH2CH2CH2CO2R1)、Asn(R2)、Gln(R3)、Ile、Tyr(Me)偶联至氨基树脂上，得到Fmoc-全保护肽树脂，即Fmoc-Tyr(Me)-Ile-Gln(R3)-Asn(R2)-Cys(CH2CH2CH2CO2R1)-Pro-Leu-Gly-氨基树脂；
(2)脱除Fmoc-全保护肽树脂的Fmoc保护基和R1，得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln(R3)-Asn(R2)-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-氨基树脂；
(3)将步骤(2)所得多肽树脂进行缩合，得到环化的卡贝缩宫素肽树脂；
(4)将环化的卡贝缩宫素肽树脂采用切割液进行裂解，再在乙醚或叔丁基甲醚中沉淀，得到卡贝缩宫素粗肽；
(5)采用制备型反相高效液相色谱系统将卡贝缩宫素粗肽进行分离纯化，冷冻干燥，获得卡贝缩宫素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氨基树脂选自RinkAmide-AM树脂、Sieber Amide树脂、PAL Amide树脂、Knorr树脂、Knorr-2-Chlorotrityl树脂或Rink Amide-MBHA树脂；所述氨基树脂的取代值为0.05～5.0mmol/g，树脂的颗粒大小为5～500目。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述R1为2-Cl-Trt、Dmb、2-PhiPr或PhenylEDOTn中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，R2或R3为Tmob、Xan、Trt、Mtt、Cpd或Mbh中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中R1的脱除试剂为体积百分比0.01％～10.0％的TFA–DCM溶液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，制备型反相高效液相色谱系统的填料为反相-C1、C4、C8、C18、Phenly或CN中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，制备型反相高效液相色谱系统的流动相A选自TFA、醋酸盐、硫酸盐、磷酸盐、高磷酸盐、柠檬酸盐中的任意一种缓冲盐或几种缓冲盐的混合物，所述流动相A的浓度为1～500mmoL/L，所述缓冲盐的pH值为2.0～8.0。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述制备型反相高效液相色谱系统的流动相B为甲醇、乙醇、乙腈中的任意一种或几种。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述制备型反相高效液相色谱系统的洗脱梯度为1个梯度的变化时长为(3～15min)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中分离纯化与冷冻干燥之间还包括转盐的步骤，所述卡贝缩宫素为卡贝缩宫素三氟醋酸盐或卡贝缩宫素醋酸盐。
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