CN112094324B - 一种卡贝缩宫素的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于多肽药物制备方法领域，涉及卡贝缩宫素的合成方法，包括以下步骤：(1)以Rink Amide‑MBHA Resin为载体，溶胀处理后，依次将保护的Gly、保护的Leu、保护的Pro、保护的Cys、保护的Asn、保护的Gln、保护的Ile和保护的Tyr缩合反应偶联至溶胀Rink Amide‑MBHA Resin，干燥得肽树脂1；(2)肽树脂1与乙烯基乙酸反应，得肽树脂2；(3)肽树脂2裂解得卡贝缩宫素中间体I；(4)卡贝缩宫素中间体I环化反应后获得卡贝缩宫素。所述合成方法反应选择性高、反应快、副产物和杂质少、收率高，且安全环保，简单易操作。

Description

一种卡贝缩宫素的合成方法
技术领域
本发明属于多肽药物制备方法领域，涉及卡贝缩宫素的合成方法。
背景技术
卡贝缩宫素(Carbetocin)为一种环状多肽，是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物。
卡贝缩宫素的分子式为C45H69N11O12S，分子量为998.17，化学名称为：去氨-2-氧-甲基酪氨酸-1-к缩宫素，结构为：
Figure BDA0002691768220000011
卡贝缩宫素在硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。卡贝缩宫素的临床和药理特性与天然产生的催产素类似。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。
中国专利申请CN 201110001400.0、CN 201410331088.5、CN 201610189424.6、CN201610728294.9公开的卡贝缩宫素合成路线，直链肽环化方式是通过羧基与氨基缩合形成酰胺键来实现，这样的技术路线需要用到巯基修饰的特殊氨基酸，合成成本较高，不利于大规模商业化生产。
中国专利申请CN 201310392663.8、CN 201310412014.X、CN 201410076731.4、CN201410461695.3、CN 201510001735.0、CN 201510848044.4、CN 201610328262.X公开的卡贝缩宫素合成路线，直链肽环化方式是通过半胱氨酸侧链上的巯基与直链肽肽末端的卤素发生消去反应实现的，该反应副产物和杂质较多，同时反应时间较长，环化反应通常超过20小时，工艺的延续性较差，不利于后续纯化工艺开展，同时工艺总体收率较低。
发明内容
本发明针对上述卡贝缩宫素制备方法的不足之处，提供一种卡贝缩宫素新的合成方法，通过在多肽N端引入乙烯基乙酸，利用半胱氨酸侧链巯基与烯烃双键发生自由基加成反应，完成卡贝缩宫素直链肽的环化，该反应选择性高、反应快、副产物和杂质少、收率高，且安全环保，简单易操作。
本发明的一个方面是提供一种卡贝缩宫素的合成方法，包括以下步骤：
(1)以Rink Amide-MBHA Resin为载体，溶胀处理后，依次将保护的Gly、保护的Leu、保护的Pro、保护的Cys、保护的Asn、保护的Gln、保护的Ile和保护的Tyr缩合反应偶联至溶胀Rink Amide-MBHA Resin，干燥得肽树脂1；
(2)肽树脂1与乙烯基乙酸反应，得肽树脂2，其结构如下：CH2＝CH-CH2-CO-Tyr(me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin；
(3)肽树脂2裂解得卡贝缩宫素中间体I，其结构如下：
CH2＝CH-CH2-CO-Tyr(me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2；
(4)卡贝缩宫素中间体I环化反应后获得卡贝缩宫素。
作为优选，所述步骤(1)的方法包括以下步骤：
将Rink Amide-MBHA Resin溶胀，脱保护，洗涤后；以其作为固相载体，加入保护的Gly、缩合剂和催化剂，保护的Gly进行缩合反应偶联到溶胀Rink Amide-MBHA Resin，脱保护，洗涤后；继续通过固相合成法依次将保护的Leu、保护的Pro、保护的Cys、保护的Asn、保护的Gln、保护的Ile和保护的Tyr缩合反应偶联至树脂，干燥得肽树脂1；
所述缩合剂选自以下一种或多种：EDC、DIC、DCC、HATU、HBTU、HCTU、PyBop、PyAop；
所述催化剂选自以下一种或多种：HOBt、NMM。
作为优选，所述Rink Amide-MBHA Resin载体的替代度为0.5-1.0mmol/g。
作为优选，所述保护的Gly、保护的Leu、保护的Pro、保护的Cys、保护的Asn、保护的Gln、保护的Ile和保护的Tyr如下：
Fmoc-Gly-OH或Boc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH或Boc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH或Boc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Tyr(Me)-OH。
作为优选，所述步骤(2)的方法包括以下步骤：
依次加入乙烯基乙酸、催化剂、缩合剂与肽树脂1反应，肽树脂1、乙烯基乙酸、催化剂、缩合剂的质量比为1:(2.5-3.5):(5.5-6.5):(2.5-3.5)得肽树脂2；
所述缩合剂选自以下一种或多种：EDC、DIC、DCC、HATU、HBTU、HCTU、PyBop、PyAop；
所述催化剂选自以下一种或多种：HOBt、NMM。
作为优选，步骤(2)中，加入缩合剂后反应50-80min。
作为优选，步骤(3)的裂解反应包括以下步骤：
肽树脂2加入裂解液于20-40℃反应2-5小时，过滤，滤液滴加到沉淀液中，滴加完毕后静置1-3小时，过滤，滤饼洗涤、干燥得卡贝缩宫素中间体I。
作为优选，所述裂解液为三异丙基硅烷和三氟乙酸分别以体积百分比2-5％和95-98％形成的混合液，所述沉淀液为乙醚、石油醚、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚中的一种或多种。
作为优选，所述环化反应包括以下步骤：
卡贝缩宫素中间体I加入40-60％(v/v)乙腈水溶液中溶解，依次加入二硫苏糖醇或β-巯基乙醇、偶氮二异丁腈，然后调节溶液pH为8.5-9.5，在20-40℃下反应1-2小时，最后调节pH为6.8-7.2以终止反应，过滤得卡贝缩宫素。
作为优选，所述卡贝缩宫素中间体I、二硫苏糖醇或β-巯基乙醇、偶氮二异丁腈的摩尔比为1:(0.8-1.2):(0.4-0.6)。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明通过缩合反应在多肽N端引入乙烯基乙酸作为环化反应位点之一，采用二硫苏糖醇或β-巯基乙醇、偶氮二异丁腈，使得半胱氨酸侧链巯基与烯烃双键发生自由基加成反应，可在2个小时内完成卡贝缩宫素直链肽的环化，大大提高了环化反应效率；
(2)本发明的卡贝缩宫素合成方法，工艺选择性高，反应过程中产生的杂质较少，获得的卡贝缩宫素粗品纯度高于90％；
(3)采用本发明的卡贝缩宫素合成方法，产品后续纯化工艺简单，综合生产成本显著降低，后续纯化后有关物质含量均符合卡贝缩宫素国家药典标准；
(4)本工艺反应是在水溶液体系中进行的，且无需其他复杂的催化剂，工艺绿色环保。
附图说明
图1为本发明实施例1制备卡贝缩宫素的工艺流程图。
具体实施方式
在下文中，针对本发明的卡贝缩宫素的合成方法将描述一些实施方式，然而，这些实施方式是示例性的，本发明公开内容不限于此。
本发明使用的缩写具有如下含义：
Fmoc：芴甲氧羰基，Boc：叔丁氧羰基，ACN：乙腈，
EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，DIC：N，N-二异丙基碳二亚胺，DCC：二环己基碳二亚胺，HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，HCTU：6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯，PyBop：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，PyAop：(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐，
HOBt：1-羟基苯并三唑，NMM：N-甲基吗啉，
DCM：二氯甲烷，DMF：N，N-二甲基甲酰胺，pip：哌啶，
TIS：三异丙基硅烷，TFA：三氟乙酸，
AIBN：偶氮二异丁腈，DTT：二硫苏糖醇，
Tyr：酪氨酸，Me：甲基，Ile：异亮氨酸，Gln：谷氨酰胺，
Asn：天冬酰胺，Cys：半光氨酸，Pro：脯氨酸，Leu：亮氨酸，
Gly：甘氨酸，Trt：三苯甲基。
本发明一些实例中的卡贝缩宫素的合成方法，包括以下步骤：
(1)以Rink Amide-MBHA Resin为载体，溶胀处理后，依次将保护的Gly、保护的Leu、保护的Pro、保护的Cys、保护的Asn、保护的Gln、保护的Ile和保护的Tyr缩合反应偶联至溶胀Rink Amide-MBHA Resin，干燥得肽树脂1；
(2)肽树脂1与乙烯基乙酸反应，得肽树脂2，其结构如下：CH2＝CH-CH2-CO-Tyr(me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin；
(3)肽树脂2裂解得卡贝缩宫素中间体I，其结构如下：
CH2＝CH-CH2-CO-Tyr(me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2；
(4)卡贝缩宫素中间体I环化反应后获得卡贝缩宫素。
在合成过程中，需要对偶联过程及脱保护过程进行监控以确保反应完全进行，在本文中，例举使用Kaiser test法监控，Kaiser test法监控仅作为示例，不做为限定。
Kaiser test法：抽取少量反应后载体，洗涤后，加入Kaiser试剂，Kaiser试剂包括A试剂：5％茚三酮乙醇溶液、B试剂：80％苯酚乙醇溶液和C试剂：吡啶溶液，在100-120℃下加热2-4分钟，取出观察。在偶联过程中，如载体检测结果呈阴性(淡黄色或透明状)，则表示偶联反应完成，如树脂呈阳性(蓝色或深蓝色)，则表示反应未完成；脱保护过程检测判断依据则相反，若检测后载体呈阳性(蓝色或深蓝色)，则表示脱保护完成。
所述步骤(1)的方法包括以下步骤：
a.Rink Amide-MBHA Resin溶胀
Rink Amide-MBHA Resin加入DCM溶胀1-5小时，DCM的加入量为10-50ml/g，用DMF洗涤，然后加入哌啶/N，N-二甲基甲酰胺反应20-50min脱保护，哌啶/N，N-二甲基甲酰胺的哌啶体积含量为10-30v/v％，脱保护后依次用DMF、甲醇、DMF洗涤。
所采用的Rink Amide-MBHA Resin载体的替代度优选为0.5-1.0mmol/g。
b.保护的Gly、保护的Leu、保护的Pro、保护的Cys、保护的Asn、保护的Gln、保护的Ile和保护的Tyr偶联
DMF溶解保护的Gly和催化剂，溶胀Rink Amide-MBHA Resin中加入缩合剂，冰水浴预活化后，加入溶解有保护的Gly和催化剂的DMF溶液，反应40-80min后，用Kaiser test法判断是否反应完全。
所述缩合剂选自以下一种或多种：EDC、DIC、DCC、HATU、HBTU、HCTU、PyBop、PyAop；
所述催化剂选自以下一种或多种：HOBt、NMM。
缩合剂和催化剂的组合可以为：EDC+HOBT，DIC+HOBT，DCC+HOBT，HATU+NMM，HBTU+NMM，HCTU+NMM，PyBop+NMM，PyAop+NMM。
反应完全后，依次用DMF、甲醇、DMF洗涤，然后加入哌啶/N，N-二甲基甲酰胺反应20-50min脱保护(脱保护以Kaiser test法判断反应是否完全)，哌啶/N，N-二甲基甲酰胺的哌啶体积含量为10-30v/v％，脱保护后依次用DMF、甲醇、DMF洗涤。
同上步骤，依次将保护的Leu、保护的Pro、保护的Cys、保护的Asn、保护的Gln、保护的Ile和保护的Tyr偶联至树脂，干燥得肽树脂1。
所述保护的Gly为Fmoc-Gly-OH或Boc-Gly-OH，保护的Leu为Fmoc-Leu-OH或Boc-Leu-OH，保护的Pro为Fmoc-Pro-OH或Boc-Pro-OH，保护的Cys为Fmoc-Cys(Trt)-OH，保护的Asn为Fmoc-Asn(Trt)-OH、保护的Gln为Fmoc-Gln(Trt)-OH、保护的Ile为Fmoc-Ile-OH和保护的Tyr为Fmoc-Tyr(Me)-OH。
步骤(2)的方法包括以下步骤：
肽树脂1先用DCM溶胀1-5小时，DCM的加入量为5-30ml/g，洗涤后，缓慢滴加乙烯基乙酸于溶胀肽树脂1中，搅拌均匀，再将催化剂滴加入上述混合物中，边滴加边搅拌，最后将缩合剂滴加到上述反应液中，肽树脂1、乙烯基乙酸、催化剂、缩合剂的质量比为1：(2.5-3.5)：(5.5-6.5)：(2.5-3.5)，所述缩合剂选自以下一种或多种：EDC、DIC、DCC、HATU、HBTU、HCTU、PyBop、PyAop；所述催化剂选自以下一种或多种：HOBt、NMM。反应50-80min后，用Kaiser test法判断是否反应完全。反应完全后，依次用DMF、甲醇洗涤，干燥得肽树脂2，其结构如下：
CH2＝CH-CH2-CO-Tyr(me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-RinkAmide-MBHA Resin。
步骤(3)的方法包括以下步骤：
向肽树脂2加入裂解液。于20-40℃反应2-5小时，过滤，滤液滴加到沉淀液中，同时伴随高速搅拌，使沉淀物快速分散开。滴加完毕后静置1-3小时，过滤，滤饼洗涤、干燥得卡贝缩宫素中间体I，其结构如下：CH2＝CH-CH2-CO-Tyr(me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2；
所采用的裂解液优选为TIS和TFA分别以体积百分比2-5％和95-98％形成的混合液，裂解液的加入量为5-10ml/g肽树脂2；所述沉淀液为为乙醚、石油醚、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚中的一种或多种，沉淀液与裂解液的体积比为(6-10)：1。
步骤(4)的方法包括以下步骤：
卡贝缩宫素中间体I加入40-60％(v/v)乙腈水溶液中溶解，加入DTT或β-巯基乙醇充分溶解后，再加入AIBN，搅拌溶解，然后调节溶液pH为8.5-9.5，在20-40℃下反应1-2小时，在反应过程中利用高效液相色谱监测环化进度，最后调节pH为6.8-7.2以终止反应，过滤得卡贝缩宫素。
卡贝缩宫素中间体I在乙腈水溶液中的浓度优选为1-5mg/ml，卡贝缩宫素中间体I、DTT或β-巯基乙醇、AIBN的摩尔比优选为1：(0.8-1.2)：(0.4-0.6)。
实施例1
本实施例1的卡贝缩宫素合成工艺如图1所示，具体为：
(1)Rink Amide-MBHA Resin溶胀
计算并称取100mmol Rink Amide-MBHA Resin(替代度为0.8mmol/g)，倒入反应釜，以20ml/g的量加入DCM，静置溶胀3小时。
洗涤：DMF洗2次，每次用量1.0L，每次洗涤时间不少于2min。
脱保护：加入1.0L 20v/v％哌啶/DMF，搅拌30分钟后，抽干反应溶液，此时反应终止。
洗涤：DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF再洗2次，每次用量1.0L，每次洗涤时间不少于2min。
(2)Fmoc-Gly-OH的偶联
称取Fmoc-Gly–OH：89.25g，HOBt：40.54g，DIC：47.33ml。
用300ml DMF溶解Fmoc-Gly-OH和HOBt，溶胀Rink Amide-MBHA Resin中缓慢加入DIC，进行冰水浴预活化，活化5分钟后，加入溶解有Fmoc-Gly-OH和HOBt的DMF溶液，边加边搅拌。反应1小时后，取样检测，将取出的树脂载体用甲醇洗涤2次，加入Kaiser试剂，置于恒温检测器上120℃加热3分钟，取出观察，如树脂呈淡黄色或透明，则表示反应完成，此时可以抽去反应液，中断反应，否则，则需要继续反应。得Fmoc-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.0L，每次洗涤时间不少于2min。
脱保护：加入1.0L 20％哌啶/DMF，搅拌30分钟后，抽干反应溶液，此时反应终止。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF 2次，每次用量1.0L，每次洗涤时间不少于2min。
获得NH2-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
(3)Fmoc-Leu-OH的偶联
称取Fmoc-Leu-OH：106.02g，HOBt 40.54g，DIC：47.33ml。
用300ml DMF溶解Fmoc-Leu-OH和HOBt，NH2-Gly-Rink Amide-MBHA Resin树脂中缓慢加入DIC，进行冰水浴预活化，活化5分钟后，加入溶解有Fmoc-Leu-OH和HOBt的DMF溶液，边加边搅拌。反应1小时后，取样检测。将取出的树脂用甲醇洗涤2次，加入Kaiser试剂，置于恒温检测器上120℃加热3分钟，取出观察，如树脂呈淡黄色或透明，则表示反应完成，此时可以抽去反应液，中断反应，否则，则需要继续反应。得Fmoc-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.0L，每次洗涤时间不少于2min。
脱保护：加入1.0L 20％哌啶/DMF，搅拌30分钟后，抽干反应溶液，此时反应终止。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF 2次，每次用量1.0L，每次洗涤时间不少于2min。
获得NH2-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
(4)Fmoc-Pro-OH的偶联
称取Fmoc-Pro-OH：60.51g，HOBt：40.54g，DIC：47.33ml。
用400ml DMF溶解Fmoc-Pro-OH和HOBt，NH2-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin树脂中缓慢加入DIC，进行冰水浴预活化，活化5分钟后，加入溶解有Fmoc-Pro-OH和HOBt的DMF溶液，边加边搅拌。反应1小时后，取样检测。将取出的树脂用甲醇洗涤2次，加入Kaiser试剂，置于恒温检测器上120℃加热3分钟，取出观察，如树脂呈淡黄色或透明，则表示反应完成，此时可以抽去反应液，中断反应，否则，则需要继续反应。得Fmoc-Pro-Leu-Gly-RinkAmide-MBHA Resin。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.0L，每次洗涤时间不少于2min。
脱保护：加入1.0L 20％哌啶/DMF，搅拌30分钟后，抽干反应溶液，此时反应终止。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.0L，每次洗涤时间不少于2min。
获得NH-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
(5)Fmoc-Cys(Trt)-OH的偶联
称取Fmoc-Cys(Trt)-OH：175.71g，HOBt：40.54g，DIC：47.33ml。
用400ml DMF溶解Fmoc-Cys(Trt)-OH和HOBt，NH-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHAResin树脂中缓慢加入DIC，进行冰水浴预活化，活化5分钟后，加入溶解有Fmoc-Cys(Trt)-OH和HOBt的DMF溶液，边加边搅拌。反应1小时后，取样检测。将取出的树脂用甲醇洗涤2次，加入Kaiser试剂，置于恒温检测器上120℃加热3分钟，取出观察，如树脂呈淡黄色或透明，则表示反应完成，此时可以抽去反应液，中断反应，否则，则需要继续反应。得Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.5L，每次洗涤时间不少于2min。
脱保护：加入1.2L 20％哌啶/DMF，搅拌30分钟后，抽干反应溶液，此时反应终止。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.5L，每次洗涤时间不少于2min。
获得NH2-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
(6)Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联
称取Fmoc-Asn(Trt)-OH：179.01g，HOBt：40.54g，DIC：47.33ml。
用400ml DMF溶解Fmoc-Asn(Trt)-OH和HOBt，NH2-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-RinkAmide-MBHA Resin树脂中缓慢加入DIC，进行冰水浴预活化，活化5分钟后，加入溶解有Fmoc-Asn(Trt)-OH和HOBt的DMF溶液，边加边搅拌。反应1小时后，取样检测。将取出的树脂用甲醇洗涤2次，加入Kaiser试剂，置于恒温检测器上120℃加热3分钟，取出观察，如树脂呈淡黄色或透明，则表示反应完成，此时可以抽去反应液，中断反应，否则，则需要继续反应。得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.5L，每次洗涤时间不少于2min。
脱保护：加入1.3L 20％哌啶/DMF，搅拌30分钟后，抽干反应溶液，此时反应终止。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.5L，每次洗涤时间不少于2min。
获得NH2-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
(7)Fmoc-Gln(Trt)-OH的偶联
称取Fmoc-Gln(Trt)-OH：183.21g，HOBt：40.54g，DIC：47.33ml。
用400ml DMF溶解Fmoc-Gln(Trt)-OH和HOBt，NH2-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin树脂中缓慢加入DIC，进行冰水浴预活化，活化5分钟后，加入溶解有Fmoc-Asn(Trt)-OH和HOBt的DMF溶液，边加边搅拌。反应1小时后，取样检测。将取出的树脂用甲醇洗涤2次，加入Kaiser试剂，置于恒温检测器上120℃加热3分钟，取出观察，如树脂呈淡黄色或透明，则表示反应完成，此时可以抽去反应液，中断反应，否则，则需要继续反应。得Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.5L，每次洗涤时间不少于2min。
脱保护：加入1.5L 20％哌啶/DMF，搅拌30分钟后，抽干反应溶液，此时反应终止。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.5L，每次洗涤时间不少于2min。
获得NH2-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
(8)Fmoc-Ile-OH的偶联
称取Fmoc-Ile-OH：106.02g，HOBt：40.54g，DIC：47.33ml。
用500ml DMF溶解Fmoc-Ile-OH和HOBt，NH2-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin树脂中缓慢加入DIC，进行冰水浴预活化，活化5分钟后，加入溶解有Fmoc-Ile-OH和HOBt的DMF溶液，边加边搅拌。反应1小时后，取样检测。将取出的树脂用甲醇洗涤2次，加入Kaiser试剂，置于恒温检测器上120℃加热3分钟，取出观察，如树脂呈淡黄色或透明，则表示反应完成，此时可以抽去反应液，中断反应，否则，则需要继续反应。得Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.5L，每次洗涤时间不少于2min。
脱保护：加入1.5L 20％哌啶/DMF，搅拌30分钟后，抽干反应溶液，此时反应终止。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.5L，每次洗涤时间不少于2min。
获得NH2-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHAResin。
(9)Fmoc-Tyr(me)-OH的偶联
称取Fmoc-Tyr(me)-OH：125.10g，HOBt：40.54g，DIC：47.33ml。
用500ml DMF溶解Fmoc-Tyr(me)-OH和HOBt，NH2-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin树脂中缓慢加入DIC，进行冰水浴预活化，活化5分钟后，加入溶解有Fmoc-Tyr(me)-OH和HOBt的DMF溶液，边加边搅拌。反应1小时后，取样检测。将取出的树脂用甲醇洗涤2次，加入Kaiser试剂，置于恒温检测器上120℃加热3分钟，取出观察，如树脂呈淡黄色或透明，则表示反应完成，此时可以抽去反应液，中断反应，否则，则需要继续反应。得Fmoc-Tyr(me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DMF洗2次，每次用量1.5L，每次洗涤时间不少于2min。
脱保护：加入1.5L 20％哌啶/DMF，搅拌30分钟后，抽干反应溶液，此时反应终止。
洗涤：抽干，DMF洗2次，甲醇洗2次，DCM洗2次，每次用量1.5L，每次洗涤时间不少于2min。
洗涤后彻底干燥，获得肽树脂1：NH2-Tyr(me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
(10)乙烯基乙酸的缩合
投料质量比：肽树脂1：乙烯基乙酸：NMM：DIC＝1：3：6：3
往肽树脂1中以15ml/g的量加入DCM，静置溶胀1小时，然后将乙烯基乙酸缓慢滴加到溶胀后的肽树脂1中，充分搅拌均匀，再将NMM缓慢滴加到上述混合物中，边加料边搅拌，最后将DIC滴加到上述反应液中，使其充分反应。反应60分钟后，取样检测。将取出的树脂用甲醇洗涤2次，加入Kaiser试剂，置于恒温检测器上120℃加热3分钟，取出观察，如树脂呈淡黄色或透明，则表示反应完成，此时可以抽去反应液，中断反应，否则，则需要继续反应。
反应结束后，抽去滤液，保留树脂，洗涤：抽干，DCM洗2次，甲醇洗4次，每次用量1.5L，每次洗涤时间不少于2min。
洗涤后于30-40℃条件下，减压干燥1小时，得肽树脂2：CH2＝CH-CH2-CO-Tyr(me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide-MBHA Resin。
(11)肽树脂2裂解
裂解液配比：TIS：TFA＝4％：96％(v:v)
裂解液用量：按照约8ml每克肽树脂2的标准配制裂解液
沉淀液用量：乙醚：裂解液＝8：1(v/v)。
向肽树脂2加入裂解液，室温下反应3小时，反应结束后将混合物用3#砂芯过滤，弃去树脂，滤液缓慢滴加到乙醚中，同时伴随高速旋转，使沉淀物快速分散开。滴加完后静置1小时，随后过滤，弃去滤液，保留滤饼，用乙醚洗涤滤饼。压实滤饼，挤出滤饼中的残留溶剂，将滤饼转移至不锈钢托盘，分散，并置于30-40℃、0.08-0.1MPa的干燥箱中，干燥24小时，得卡贝缩宫素中间体I，其结构如下：
CH2＝CH-CH2-CO-Tyr(me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2。
(12)卡贝缩宫素中间体I环化
环化溶液：乙腈：纯化水＝1：1(v/v)
环化浓度：卡贝缩宫素中间体Ⅰ：环化溶液＝3mg/ml(w/v)
AIBN投料摩尔比：AIBN：卡贝缩宫素中间体I＝0.5：1
DTT投料摩尔比：DTT：卡贝缩宫素中间体I＝1：1。
将卡贝缩宫素中间体I加入环化溶液(乙腈水溶液)中溶解，再加入DTT，充分溶解，再加入AIBN，搅拌至溶解，再加入无水碳酸钾调节pH至9.0后，控制温度25-30℃之间，反应2小时，同时，在反应过程中利用高效液相色谱监测环化进度。反应结束后，加入冰醋酸溶液调节pH至7.0以终止反应，再用3#砂芯过滤得卡贝缩宫素粗品。
卡贝缩宫素粗品的收率为89.8％，HPLC分析得粗品卡贝缩宫素纯度为92.6％。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (8)

1.一种卡贝缩宫素的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以Rink Amide-MBHA Resin为载体，溶胀处理后，依次将保护的Gly、保护的Leu、保护的Pro、保护的Cys、保护的Asn、保护的Gln、保护的Ile和保护的Tyr缩合反应偶联至溶胀Rink Amide-MBHA Resin，干燥得肽树脂1；
（2）肽树脂1与乙烯基乙酸反应，得肽树脂2，其结构如下：
CH2=CH-CH2-CO-Tyr（me）-Ile-Gln（Trt）-Asn（Trt）-Cys（Trt）-Pro-Leu-Gly-RinkAmide-MBHA Resin；
（3）肽树脂2裂解得卡贝缩宫素中间体I，其结构如下：
CH2=CH-CH2-CO-Tyr（me）-Ile-Gln（Trt）-Asn（Trt）-Cys（Trt）-Pro-Leu-Gly-NH2；
（4）卡贝缩宫素中间体I环化反应后获得卡贝缩宫素；
所述步骤（2）的方法包括以下步骤：依次加入乙烯基乙酸、催化剂、缩合剂与肽树脂1反应，肽树脂1、乙烯基乙酸、催化剂、缩合剂的质量比为1:（2.5-3.5）:（5.5-6.5）:（2.5-3.5），得肽树脂2；
所述缩合剂选自以下一种或多种：EDC、DIC、DCC、HATU、HBTU、HCTU、PyBop、PyAop；
所述催化剂选自以下一种或多种：HOBt、NMM；
加入缩合剂后反应50-80min。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述步骤（1）的方法包括以下步骤：
将Rink Amide-MBHA Resin溶胀，脱保护，洗涤后；以其作为固相载体，加入保护的Gly、缩合剂和催化剂，保护的Gly进行缩合反应偶联到溶胀Rink Amide-MBHA Resin，脱保护，洗涤后；继续通过固相合成法依次将保护的Leu、保护的Pro、保护的Cys、保护的Asn、保护的Gln、保护的Ile和保护的Tyr缩合反应偶联至树脂，干燥得肽树脂1；
所述缩合剂选自以下一种或多种：EDC、DIC、DCC、HATU、HBTU、HCTU、PyBop、PyAop；
所述催化剂选自以下一种或多种：HOBt、NMM。
3.根据权利要求1或2所述的合成方法，其特征在于，所述Rink Amide-MBHA Resin载体的替代度为0.5-1.0 mmol/g。
4.根据权利要求1或2所述的合成方法，其特征在于，所述保护的Gly、保护的Leu、保护的Pro、保护的Cys、保护的Asn、保护的Gln、保护的Ile和保护的Tyr如下：
Fmoc-Gly-OH或Boc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH或Boc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH或Boc-Pro-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Tyr（Me）-OH。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤（3）的裂解反应包括以下步骤：
肽树脂2加入裂解液于20-40℃反应2-5小时，过滤，滤液滴加到沉淀液中，滴加完毕后静置1-3小时，过滤，滤饼洗涤、干燥得卡贝缩宫素中间体I。
6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述裂解液为三异丙基硅烷和三氟乙酸分别以体积百分比2-5%和95-98%形成的混合液，所述沉淀液为乙醚、石油醚、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述步骤（4）的环化反应包括以下步骤：
卡贝缩宫素中间体I加入40-60%（v/v）乙腈水溶液中溶解，依次加入二硫苏糖醇或β-巯基乙醇、偶氮二异丁腈，然后调节溶液pH为8.5-9.5，在20-40℃下反应1-2小时，最后调节pH为6.8-7.2以终止反应，过滤得卡贝缩宫素。
8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，所述卡贝缩宫素中间体I、二硫苏糖醇或β-巯基乙醇、偶氮二异丁腈的摩尔比为1:（0.8-1.2）:（0.4-0.6）。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591403A (zh) * 2022-04-14 2022-06-07 新发药业有限公司 基于液相环合的卡贝缩宫素制备方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2115543B1 (es) * 1996-08-06 1999-02-16 Lipotec Sa Procedimiento para la obtencion de carbetocina y sus sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables o complejos de la misma.
CN103467573A (zh) * 2013-09-02 2013-12-25 深圳翰宇药业股份有限公司 一种卡贝缩宫素的制备方法
CN104086631A (zh) * 2014-07-10 2014-10-08 成都天台山制药有限公司 卡贝缩宫素和制法
CN106854235A (zh) * 2015-12-08 2017-06-16 深圳翰宇药业股份有限公司 一种固相片段法合成卡贝缩宫素
WO2017175233A1 (en) * 2016-04-04 2017-10-12 Davuluri Ramamohan Rao Process for large scale liquid phase synthesis of carbetocin and its novel intermediates
CN110343149A (zh) * 2019-07-25 2019-10-18 成都诺和晟泰生物科技有限公司 一种环肽药物卡贝缩宫素的合成方法
CN110437312A (zh) * 2019-08-15 2019-11-12 翔宇药业股份有限公司 一种制备卡贝缩宫素的环保工艺
CN111217892A (zh) * 2019-07-26 2020-06-02 翔宇药业股份有限公司 卡贝缩宫素的合成方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2115543B1 (es) * 1996-08-06 1999-02-16 Lipotec Sa Procedimiento para la obtencion de carbetocina y sus sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables o complejos de la misma.
CN103467573A (zh) * 2013-09-02 2013-12-25 深圳翰宇药业股份有限公司 一种卡贝缩宫素的制备方法
CN104086631A (zh) * 2014-07-10 2014-10-08 成都天台山制药有限公司 卡贝缩宫素和制法
CN106854235A (zh) * 2015-12-08 2017-06-16 深圳翰宇药业股份有限公司 一种固相片段法合成卡贝缩宫素
WO2017175233A1 (en) * 2016-04-04 2017-10-12 Davuluri Ramamohan Rao Process for large scale liquid phase synthesis of carbetocin and its novel intermediates
CN110343149A (zh) * 2019-07-25 2019-10-18 成都诺和晟泰生物科技有限公司 一种环肽药物卡贝缩宫素的合成方法
CN111217892A (zh) * 2019-07-26 2020-06-02 翔宇药业股份有限公司 卡贝缩宫素的合成方法
CN110437312A (zh) * 2019-08-15 2019-11-12 翔宇药业股份有限公司 一种制备卡贝缩宫素的环保工艺

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
巯基-乙烯基加成反应合成含硅聚合物的研究进展;胡笛等;《高分子通报》;20111015(第10期);第111~119页 *

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