CN116675741B - 一种中间体在制备戈舍瑞林中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中间体在制备戈舍瑞林中的用途,涉及医药多肽类原料药的化学合成技术领域,包括:取固相合成法制得的中间体,经过氢化获得片段,与缺失片段缩合得到戈舍瑞林;中间体结构通式为:Pyr‑His(R1)‑Trp‑Ser(R2)‑Tyr(Cbz)‑Xaa1‑Xaa2‑Xaa3‑Xaa4‑OH;式中,上述Xaa1选自D‑Ser(tBu)或不存在,Xaa2选自Leu或不存在,Xaa3选自Arg(NO2)或不存在,Xaa4选自Pro或不存在;其中,R1为Trt或不存在,R2为Bzl或不存在。本发明提供的中间体用于制备戈舍瑞林,反应条件温和,获得产品的收率高,且纯度也更优。
Description
技术领域
本发明属于医药类多肽原料药的化学合成技术领域,具体涉及一种中间体在制备戈舍瑞林中的用途。
背景技术
戈舍瑞林( Buserelin) 是根据促性腺激素释放激素( GnRH) 改造的多肽类药物,结构式为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser( tBu) -Leu-Arg-Pro-NHET。可促使LH、FSH 和性激素分泌增加,其促进LH 和FSH 释放的作用效力分别为天然促黄体生成激素释放激素的19 倍和26 倍。临床主要用于前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜异位症、子宫肌瘤等的治疗。给药途径为注射剂和鼻腔喷雾剂。现已知的合成方法一般采用液相法,固相分段合成法和固相全合成法,存在合成步骤多,工艺复杂情况。故希望可以开发一种简易的工艺合成戈舍瑞林。
目前采用固相合成的专利主要为几篇国内专利,各专利方法围绕保护基策略和脱保护方法,总结这些专利都是先合成一个全保护肽然后再通过不同方法脱除保护基。根据结构,可能有保护基的位点有His、Ser、Tyr和Arg的侧链。翰宇药业制备戈舍瑞林的专利(申请号2010102560546)采用His(Trt)、Ser(Trt)、Arg(HCl)的保护策略,脱保护试剂为5%TFA二氯甲烷溶液;翰宇药业制备戈舍瑞林的专利(申请号2012101553667)采用His(Trt)、Ser(Trt)、Tyr(Bzl)、Arg(NO2)的保护策略,脱保护方法为氢转移反应;宁波三生药业制备戈舍瑞林的专利(申请号2013105577788)采用的保护策略为His (Trt)、Ser(Bzl)、Tyr(Bzl)、Arg(NO2)的保护策略,脱除条件为甲醇或乙醇溶液中钯碳催化氢解;承德医学院制备戈舍瑞林的专利(申请号2014101852831)采用的保护策略为His(Trt)、Tyr(Bzl)、Arg(NO2),脱保护分两步首先采用氢转移反应脱除Bzl和NO2,然后再用约15%TFA二氯甲烷溶液脱除Trt;苏州天马医药制备戈舍瑞林的专利(申请号2015100059512)采用的保护策略为His(Trt)、Tyr(Bzl)、Arg(NO2),脱保护方法也分两步首先用20%TFA二氯甲烷溶液脱除。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中间体在制备戈舍瑞林中的用途,该中间体用于制备戈舍瑞林,反应条件温和,杂质少,获得产品的收率高,且纯度也更优,更有利于放大生产。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为:
一种基于中间体制备戈舍瑞林的方法,包括:采用固相合成法制备获得中间体,经过氢化获得片段,再与缺失片段缩合得到戈舍瑞林或者戈舍瑞林中间产物;上述戈舍瑞林中间产物再经过切割获得戈舍瑞林;
上述中间体结构通式包括:
Pyr-His(R1)-Trp-Ser(R2)-Tyr(Cbz)-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-OH;
式中,所述Xaa1选自D-Ser(tBu)或不存在, Xaa2选自Leu或不存在,Xaa3选自Arg(NO2)或不存在,Xaa4选自Pro或不存在;
其中,R1为Trt或不存在,R2为Bzl或不存在。本发明提供的制备方法中,采用片段合成方法,以特定的中间体结构为基准成功合成戈舍瑞林,中间体结构中的Tyr的侧链保护基为Cbz,利用氢化反应可一步去除成功,避免了许多副反应的发生,减少杂质产生,有效提高目的肽的收率,产物纯度也相对较高,并且操作起来方便可行,反应条件温和,中间体可以跟踪控制,整个过程更有利于放大生产。
优选地,中间体结构中侧链修饰Cbz的Tyr的物料结构为:
。
优选地,缺失片段选自H-Azagly-NH2、H-Pro-Azagly-NH2、H-Arg-Pro-Azagly-NH2、H-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2或H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2中的一种。
优选地,氢化过程中催化剂选自钯类催化剂或者镍类催化剂。
优选地,钯类催化剂选自氢氧化钯、钯碳、氯化钯、醋酸钯或四三苯基磷钯中的一种。
优选地,镍类催化剂选自雷尼镍(Reniy Ni)。
优选地,缩合过程中缩合剂包括HBTU、HATU、HCTU、Pybop、PyBrop或DEPBT中的一种与NMM的组合。
优选地,缩合剂包括DIC、DCC或EDCI中任一种与HOBt、HOAt、HOSu、HOOBt、Oxyma或DMAP中任一种的组合。
更优选地,缩合剂还包括聚合物基缩合剂。
需要说明的是,聚合物基缩合剂由氰乙酸乙酯与烯丙基硫脲或4-丙烯基硫代氨基脲通过交换反应再经过肟化反应获得聚合单体,经聚合后与卤代物进行酯化反应获得。本发明采用氰乙酸乙酯与烯丙基硫脲或4-丙烯基硫代氨基脲反应再经肟化反应获得聚合单体,之后再聚合获得聚合物基缩合剂,表现出更佳的催化活性,能够更好地促进反应的发生,提高产物的纯度和收率;并且其具有聚合物溶解度差的特点,直接过滤便可从溶液中分离回收,再加工后依然表现出优异的催化活性,具有更佳的循环使用稳定性,重复利用更好,有效提高原子经济性。其原因可能在于,在聚合物结构中引入更多活性基,通过氢键等分子间作用力使得聚合物网络结构更加均匀,具有缩合活性的活性位点分布更均匀,能够充分的与原料接触,促进反应的发生。将其应用于戈舍瑞林的制备工艺中,有效促进缩合反应的发生,反应发生程度更高,获得的戈舍瑞林产物的纯度和产率得到明显提升。
优选地,上述聚合物基缩合剂的制备方法,包括:
S1:取氰乙酸乙酯与烯丙基硫脲或4-丙烯基硫代氨基脲通过交换反应获得中间产物A;
S2:取中间产物A经过肟化反应获得中间产物B;
S3:取中间产物B在引发剂条件下聚合获得中间产物C;
S4:取中间产物C与卤代物进行酯化反应获得聚合物基缩合剂。
进一步具体的,上述聚合物基缩合剂的制备方法,包括:
S1:取氰乙酸乙酯加入四氢呋喃溶解,加入烯丙基硫脲或4-丙烯基硫代氨基脲,室温下搅拌8~10h,浓缩,加入二氯甲烷,搅拌后二氯甲烷相用0.8~1.2M浓度的盐酸洗涤,再用饱和食盐水洗涤,分液后干燥、浓缩得到中间产物A;
S2:取亚硝酸钠加入水,搅拌均匀后加入中间产物A,之后滴加95~98wt%浓度的磷酸,并于低于25℃温度下在1~2h内滴加完毕,之后控制温度40~45℃反应0.5~1.5h,然后升温至45~50℃反应,并采用TLC检测确认反应完成,接着加入35~37wt%浓度的盐酸,搅拌冷却至0℃,并保温1.5~2.5h,抽滤,固体用冰水洗涤,烘干得到中间产物B;
S3:取偶氮二异丁腈加入乙腈,回流搅拌条件下滴加中间产物B的乙腈溶液,滴加完毕后回流反应1~2h,之后冷却至室温,过滤、乙腈洗涤,烘干得到中间产物C;
S4:取中间产物C溶于DMF中,加入N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐,然后滴加三乙胺,继续搅拌3~5h,过滤、甲醇洗涤,烘干得到聚合物基缩合剂。
优选地,步骤S1中,氰乙酸乙酯与四氢呋喃的固液比为0.15~0.25g:1mL;烯丙基硫脲或4-丙烯基硫代氨基脲与氰乙酸乙酯的摩尔比为0.95~1.05:1;二氯甲烷与四氢呋喃的体积比为0.5~0.8:1。
优选地,步骤S2中,亚硝酸钠与水的固液比为0.1~0.2g:1mL;中间产物A与亚硝酸钠的质量比为1.5~2.5:1;磷酸与亚硝酸钠的质量比为1.4~1.7:1;盐酸与亚硝酸钠的质量比为1~1.5:1。
优选地,步骤S3中,偶氮二异丁腈与乙腈的固液比为1g:90~110mL;中间产物B的乙腈溶液的浓度为0.3~0.4g:1mL;中间产物B与偶氮二异丁腈的质量比为110~120:1。
优选地,中间产物C与DMF的固液比为0.2~0.3g:1mL;N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐与中间产物C的质量比为1.5~1.8:1;三乙胺与N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐的质量比为0.3~0.4:1。
优选地,切割过程中切割溶液为酸性溶液;所述酸性溶液选自醋酸、柠檬酸或低浓度酸中的一种。
优选地,低浓度酸选自硫酸、盐酸、磺酸、三氟乙酸或高氯酸中的至少一种。
进一步具体的,基于中间体制备戈舍瑞林的方法,包括:
1)取中间体在催化剂条件下氢化获得片段;
2)取片段与缺失片段在缩合剂条件下反应获得戈舍瑞林或戈舍瑞林中间产物;其中,戈舍瑞林中间产物在酸性溶液中裂解获得戈舍瑞林。
优选地,中间体与催化剂的质量比为8~12:1。
优选地,片段与缺失片段的摩尔比为1:1~1.5。
优选地,戈舍瑞林制备过程中反应温度为-20~60℃,优选地,反应温度为0~40℃。
优选地,戈舍瑞林制备过程中各反应过程在溶剂中进行,所用溶剂选自DCM、THF、乙酸乙酯、乙腈、DMF、DMSO和NMP中的单一或者多种。
本发明还公开了上述中间体在制备戈舍瑞林中的用途。
相比于现有技术,本发明具有如下有益效果:
本发明以特定的中间体结构为基准成功合成戈舍瑞林,中间体结构中的Tyr的侧链保护基为Cbz,利用氢化反应可一步去除成功,避免了许多副反应的发生,有效提高目的肽的收率,产物纯度也相对较高,并且操作起来方便可行,反应条件温和。同时,本发明采用氰乙酸乙酯与烯丙基硫脲或4-丙烯基硫代氨基脲反应再经肟化反应获得聚合单体,之后再聚合获得聚合物基缩合剂,表现出更佳的催化活性,能够更好地促进反应的发生;将其应用于戈舍瑞林的制备工艺中,有效促进缩合反应的发生,反应发生程度更高,获得的戈舍瑞林产物的纯度和产率得到明显提升。
因此,本发明提供了一种中间体在制备戈舍瑞林中的用途,该中间体用于制备戈舍瑞林,反应条件温和,杂质少,获得产品的收率高,且纯度也更优,更有利于放大生产。
附图说明
图1为本发明实施例中制备的戈舍瑞林的高效液相色谱测试结果;
图2为本发明实施例中制备的中间产物C、聚合物基缩合剂的红外测试结果。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细描述,但是应当理解,这些实施例仅用于举例说明本发明以帮助理解的本发明的公开内容,而不是对本发明范围的限制,并且本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
本发明对下述实施例中原料的来源没有特别限制,以本领域技术人员熟知的制备方法制备或市售购买均可。
本发明中涉及的英文缩写所对应的中文名称见下表:
英文缩写 | 中文名称 | 英文缩写 | 中文名称 |
Pro | 脯氨酸 | HOSu | N-羟基丁二酰亚胺 |
Leu | 亮氨酸 | DCM | 二氯甲烷 |
Arg | 精氨酸 | DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
Tyr | 酪氨酸 | NMM | N-甲基吗啉 |
Ser | 丝氨酸 | DIPEA | N,N-二异丙基乙胺 |
Trp | 色氨酸 | DIC | 二异丙基碳二亚胺 |
His | 组氨酸 | HOBt | 1-羟基苯并三氮唑 |
Pyr | 焦谷氨酸 | DMAP | 对二甲氨基吡啶 |
Fmoc | 9-芴甲氧羰基 | DCC | 二环己基碳二亚胺 |
tBu | 叔丁基 | TFA | 三氟乙酸 |
Bzl | 苄基 | HOAt | 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑 |
Cbz | 苄氧羰基 | PyBrop | 溴-三吡咯烷基磷代六氟磷酸酯 |
Trt | 三苯甲基 | HOOBt | 3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮 |
HBTU | 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐 | EDC·HCl | 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 |
HCTU | 6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯 | PyBOP | 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷 |
DEPBT | 3-(二乙氧基邻酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮 | HATU | 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 |
需要说明的是,本发明实施例所用序列一至序列二十均采用本领域技术人员常规理解的固相合成法制备获得。其中,以序列一Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH的合成方法为例,具体制备过程如下:
1)Fmoc-Pro-树脂制备:
取2-CTC树脂(替代度为0.90mmol/g)12.5mmol,加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,并溶胀树脂30min,抽干;加入Fmoc-Pro-OH 25mmol,加入二氯甲烷(DCM)120mL,在加入DIEA 8.7mL,25℃条件下反应3h,加入甲醇12.5mL,反应5min;过滤,将树脂用二氯甲烷(DCM)120mL洗涤2次,甲醇120mL洗涤2次,DMF120mL洗涤2次。
加入20%Pip/DMF溶液130mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液130mL洗涤6次,抽干得到Fmoc-Pro-CTC树脂;
2)带保护九肽树脂Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-树脂的制备:
取10mmol Fmoc-Pro-CTC树脂加入多肽反应柱中,用DMF溶胀30min,抽干;加入20%哌啶/DMF溶液50mL,氮气吹拂反应10min,DMF洗涤3次,抽干,茚三酮检测显红褐色;取Fmoc-Arg(NO2)-OH 30mmol,HOBt 30mmol于100mL烧杯中,降温至2-8℃,加入DMF溶液50mL,DIC30mmol静置反应20min,并将100mL烧杯中溶液加入到上述固相合成反应器中,搅拌反应1.5h,反应完成。树脂用DMF溶液洗涤三次,每次130mL;洗涤完成后,加入20%Pip/DMF溶液130mL,搅拌反应30min,抽滤,除去脱保护液,然后用DMF溶液65mL洗涤6次,抽干;按照同样的方法依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(Cbz)-OH、Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His-OH和H-Pyr-OH,得到带保护九肽树脂,甲醇收缩树脂3次,抽干溶剂,抽真空过夜,得干燥带保护九肽树脂;
3)序列一Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH的制备:
取将上述带保护九肽树脂30g加入30%的TFE/DCM溶液400mL,30℃条件下搅拌反应30min,过滤,除去树脂,得到滤液,滤液拉干得到序列一。
本发明实施例中所用H-Azagly-NH2、H-Pro-Azagly-NH2、H-Arg-Pro-Azagly-NH2、H-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2或H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2,该残缺片段可以固相合成也可以液相合成。其中,以H-Arg-Pro-Azagly-NH2的合成为例,其制备方法具体参考申请号为2018105475946的专利文献。
实施例1:
戈舍瑞林的制备方法:
1)片段一Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-OH的制备:
取序列一10g,加入100mL的EA/MEOH溶液,再加入1g Pd/C,(26±2)℃水浴条件下反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,过滤旋干得到片段一,收率97.8%,纯度70%;
2)戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2的制备:
取片段一10g、H-Azagly-NH2·HCl 1.1g、HOBT 1.33g混合,加入100mL DMF溶解,冰浴降温至10℃时加入1.25g DIC、0.99g NMM,之后冰浴条件下搅拌反应10min,然后升温至(26±2)℃反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用100mL饱和NaHCO3和EA搅拌10min生成大量固体,过滤,用大量EA淋洗后,滤液用分液漏斗萃取,水相再用50mL EA萃取一次,合并EA相,用饱和NaHCO3洗一次、水洗两次、饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,过滤蒸干得戈舍瑞林(色谱图如图1所示,并由质谱确定其结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2),收率95.5%,纯度58%,有37%羧基端原料成环。
实施例2:
戈舍瑞林的制备方法与实施例1的区别在于:片段一的制备方法不同,具体为采用本实施例制备的序列二替代序列一,片段一的收率93.0%,纯度68%。
序列二为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH。
实施例3:
戈舍瑞林的制备方法:
1)片段二Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-OH的制备:
取序列三Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH10g,加入100mL的EA/MEOH溶液,再加入1g Pd/C,(26±2)℃水浴条件下反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,过滤旋干得到片段二,收率92.1% ,纯度71%;
2)戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2的制备:
取片段二10g、H-Azagly-NH20.92g、HOBT 1.11g混合,加入100mLDMF溶解,冰浴降温至10℃时加入1.04g DIC、0.83g NMM,之后冰浴条件下搅拌反应10min,然后升温至(26±2)℃反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用100mL饱和NaHCO3和EA搅拌10min生成大量固体,过滤,用大量EA淋洗后,滤液用分液漏斗萃取,水相再用50mL EA萃取一次,合并EA相,用饱和NaHCO3洗一次、水洗两次、饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,过滤蒸干得中间体S,收率94.3%,纯度90%;
按照固液比为1g:10mL的比例取中间体S加入TFA/DCM(5%TFA+95%DCM)混合溶液,35℃水浴搅拌反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用甲基叔丁基醚沉降,固体离心洗涤3次后,真空干燥得戈舍瑞林(由质谱确定其结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2),收率95.2%,纯度93%。
实施例4:
戈舍瑞林的制备方法与实施例3的区别在于:片段二的制备方法不同,具体为采用本实施例制备的序列四替代序列三,片段二的收率97.2%,纯度72%。
序列四为Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH。
实施例5:
戈舍瑞林的制备方法:
1)片段三Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-OH的制备:
取序列五Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-OH 10g,加入100mL的EA/MEOH溶液,再加入1g Pd/C,(26±2)℃水浴条件下反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,过滤旋干得到片段三,收率97.5%,纯度75%;
2)戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2的制备:
取片段三10g、H-Pro-Azagly-NH21.85g、HOBT 1.45g混合,加入100mLDMF溶解,冰浴降温至10℃时加入1.35g DIC、1.09g NMM,之后冰浴条件下搅拌反应10min,然后升温至(26±2)℃反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用100mL饱和NaHCO3和EA搅拌10min生成大量固体,过滤,用大量EA淋洗后,滤液用分液漏斗萃取,水相再用50mL EA萃取一次,合并EA相,用饱和NaHCO3洗一次、水洗两次、饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,过滤蒸干得戈舍瑞林(由质谱确定其结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2),收率96.7%,纯度61%,有35%羧基端原料成环。
实施例6:
戈舍瑞林的制备方法与实施例5的区别在于:片段三的制备方法不同,具体为采用本实施例提供的序列六替代序列五,片段三的收率95.2%,纯度75%。
序列六为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-OH。
实施例7:
戈舍瑞林的制备方法:
1)片段四Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-OH的制备:
取序列七Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-OH10g,加入100mL的EA/MEOH溶液,再加入1g Pd/C,(26±2)℃水浴条件下反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,过滤旋干得到片段四,收率94.9%,纯度60%;
2)戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2的制备:
取片段四10g、H-Pro-Azagly-NH21.52g、HOBT 1.19g混合,加入100mLDMF溶解,冰浴降温至10℃时加入1.11g DIC、0.89g NMM,之后冰浴条件下搅拌反应10min,然后升温至(26±2)℃反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用100mL饱和NaHCO3和EA搅拌10min生成大量固体,过滤,用大量EA淋洗后,滤液用分液漏斗萃取,水相再用50mL EA萃取一次,合并EA相,用饱和NaHCO3洗一次、水洗两次、饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,过滤蒸干得中间体S,收率98.8%,纯度90%;
按照固液比为1g:10mL的比例取中间体S加入甲酸溶液,35℃水浴搅拌反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用甲基叔丁基醚沉降,固体离心洗涤3次后,真空干燥得戈舍瑞林(由质谱确定其结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2),收率83.3%,纯度60%,有30%的甲酰化。
实施例8:
戈舍瑞林的制备方法与实施例7的区别在于:片段四的制备方法不同,具体为采用本实施例提供的序列八替代序列七,片段四的收率96%,纯度63%。
序列八为Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-OH。
实施例9:
戈舍瑞林的制备方法:
1)片段五Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-OH的制备:
取序列九Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-OH 10g,加入100mL的EA/MEOH溶液,再加入1g Pd/C,(26±2)℃水浴条件下反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,过滤旋干得到片段三,收率92.5%,纯度95%;
2)戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2的制备:
取片段五10g、H-Arg-Pro-Azagly-NH24.11g、HOBT 1.69g混合,加入100mLDMF溶解,冰浴降温至10℃时加入1.58g DIC、1.26g NMM,之后冰浴条件下搅拌反应10min,然后升温至(26±2)℃反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用100mL饱和NaHCO3和EA搅拌10min生成大量固体,过滤,用大量EA淋洗后,滤液用分液漏斗萃取,水相再用50mL EA萃取一次,合并EA相,用饱和NaHCO3洗一次、水洗两次、饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,过滤蒸干得戈舍瑞林(由质谱确定其结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2),收率90.7%,纯度45%,有15%产物同分异构体,35%羧基端原料成环。
实施例10:
布舍瑞林的制备方法与实施例9的区别在于:片段五的制备方法不同,具体为采用本实施例提供的序列十替代序列九,片段五的收率95.2%,纯度96%。
序列十为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-OH。
实施例11:
1)片段六Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu- OH的制备:
取序列十一Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-OH 10g,加入100mL的EA/MEOH溶液,再加入1g Pd/C,(26±2)℃水浴条件下反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,过滤旋干得到片段六,收率94.9%,纯度97%;
2)戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2的制备:
取片段六10g、H-Arg-Pro-Azagly-NH23.28g、HOBT 1.35g混合,加入100mLDMF溶解,冰浴降温至10℃时加入1.26g DIC、1.01g NMM,之后冰浴条件下搅拌反应10min,然后升温至(26±2)℃反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用100mL饱和NaHCO3和EA搅拌10min生成大量固体,过滤,用大量EA淋洗后,滤液用分液漏斗萃取,水相再用50mL EA萃取一次,合并EA相,用饱和NaHCO3洗一次、水洗两次、饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,过滤蒸干得中间体S,收率93.7%,纯度70%,有24%产物同分异构体;
按照固液比为1g:10mL的比例取中间体S加入TFA/DCM(10%TFA+90%DCM)混合溶液,35℃水浴搅拌反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用甲基叔丁基醚沉降,固体离心洗涤3次后,真空干燥得戈舍瑞林(由质谱确定其结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2),收率101%,纯度80%。
实施例12:
戈舍瑞林的制备方法与实施例11的区别在于:片段六的制备方法不同,具体为采用本实施例提供的序列十二替代序列十一,片段六的收率94.4%,纯度93%。
序列十二为Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-Leu-OH。
实施例13:
戈舍瑞林的制备方法:
1)片段七Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-OH的制备:
取序列十三Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-OH 10g,加入100mL的EA/MEOH溶液,再加入1g Pd/C,(26±2)℃水浴条件下反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,过滤旋干得到片段七,收率98.7%,纯度95%;
2)戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2的制备:
取片段七10g、H-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH26.27g、HOBT 1.92g混合,加入100mLDMF溶解,冰浴降温至10℃时加入1.79g DIC、1.43g NMM,之后冰浴条件下搅拌反应10min,然后升温至(26±2)℃反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用100mL饱和NaHCO3和EA搅拌10min生成大量固体,过滤,用大量EA淋洗后,滤液用分液漏斗萃取,水相再用50mLEA萃取一次,合并EA相,用饱和NaHCO3洗一次、水洗两次、饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,过滤蒸干得戈舍瑞林(由质谱确定其结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2),收率90.7%,纯度60%,25%羧基端原料成环,有10%产物同分异构体。
实施例14:
戈舍瑞林的制备方法与实施例13的区别在于:片段七的制备方法不同,具体为采用本实施例提供的序列十四替代序列十三,片段七的收率98.8%,纯度96%。
序列十四为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-OH。
实施例15:
1)片段八Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-OH的制备:
取序列十五Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-OH 10g,加入100mL的EA/MEOH溶液,再加入1g Pd/C,(26±2)℃水浴条件下反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,过滤旋干得到片段八,收率98.7%,纯度94%;
2)戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2的制备:
取片段八10g、H-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH24.87g、HOBT 1.49g混合,加入100mLDMF溶解,冰浴降温至10℃时加入1.39g DIC、1.11g NMM,之后冰浴条件下搅拌反应10min,然后升温至(26±2)℃反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用100mL饱和NaHCO3和EA搅拌10min生成大量固体,过滤,用大量EA淋洗后,滤液用分液漏斗萃取,水相再用50mLEA萃取一次,合并EA相,用饱和NaHCO3洗一次、水洗两次、饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,过滤蒸干得中间体S,收率86.37%,纯度82%,有13%产物同分异构体;
按照固液比为1g:10mL的比例取中间体S加入TFA/DCM(10%TFA+90%DCM)混合溶液,35℃水浴搅拌反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用甲基叔丁基醚沉降,固体离心洗涤3次后,真空干燥得戈舍瑞林(由质谱确定其结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2)。
实施例16:
戈舍瑞林的制备方法与实施例15的区别在于:片段八的制备方法不同,具体为采用本实施例提供的序列十六替代序列十五,片段八的收率95.5%,纯度98%。
序列十六为Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Cbz)-D-Ser(tBu)-OH。
实施例17:
戈舍瑞林的制备方法:
1)片段九Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH的制备:
取序列十七Pyr-His-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Cbz)-OH 10g,加入100mL的EA/MEOH溶液,再加入1g Pd/C,(26±2)℃水浴条件下反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,过滤旋干得到片段九,收率96%,纯度95%;
2)戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2的制备:
取片段九10g、H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH29.98g、HOBT 2.30g混合,加入100mLDMF溶解,冰浴降温至10℃时加入2.15g DIC、1.72g NMM,之后冰浴条件下搅拌反应10min,然后升温至(26±2)℃反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用100mL饱和NaHCO3和EA搅拌10min生成大量固体,过滤,用大量EA淋洗后,滤液用分液漏斗萃取,水相再用50mL EA萃取一次,合并EA相,用饱和NaHCO3洗一次、水洗两次、饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,过滤蒸干得戈舍瑞林(由质谱确定其结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2),收率90%,纯度75%,5%羧基端原料成环,有10%产物同分异构体。
实施例18:
戈舍瑞林的制备方法与实施例17的区别在于:片段九的制备方法不同,具体为采用本实施例提供的序列十八替代序列十七,片段九的收率95.2%,纯度96%。
序列十八为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Cbz)-OH。
实施例19:
1)片段十Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-OH的制备:
取序列十九Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Cbz)-OH 10g,加入100mL的EA/MEOH溶液,再加入1g Pd/C,(26±2)℃水浴条件下反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,过滤旋干得到片段十,收率96.2%,纯度96%;
2)戈舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2的制备:
取片段十10g、H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH27.42g、HOBT 1.71g混合,加入100mLDMF溶解,冰浴降温至10℃时加入1.60g DIC、1.28g NMM,之后冰浴条件下搅拌反应10min,然后升温至(26±2)℃反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用100mL饱和NaHCO3和EA搅拌10min生成大量固体,过滤,用大量EA淋洗后,滤液用分液漏斗萃取,水相再用50mL EA萃取一次,合并EA相,用饱和NaHCO3洗一次、水洗两次、饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,过滤蒸干得中间体S,收率93.75%,纯度90%,有5%产物同分异构体;
按照固液比为1g:10mL的比例取中间体S加入TFA/DCM(10%TFA+90%DCM)混合溶液,35℃水浴搅拌反应,并采用TLC检测确认原料反应完全后,反应液用甲基叔丁基醚沉降,固体离心洗涤3次后,真空干燥得戈舍瑞林(由质谱确定其结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2)。
实施例20:
布舍瑞林的制备方法与实施例19的区别在于:片段十的制备方法不同,具体为采用本实施例提供的序列二十替代序列十九,片段十的收率94.7%,纯度97%。
序列二十为Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Cbz)-OH。
实施例21:
戈舍瑞林的制备方法与实施例1的区别在于:
步骤2)中采用本实施例制备的聚合物基缩合剂替代HOBT/DIC,与片段一的摩尔比为1.2:1。
聚合物基缩合剂的制备:
S1:取氰乙酸乙酯加入四氢呋喃溶解,加入烯丙基硫脲,室温下搅拌9h,浓缩,加入二氯甲烷,搅拌后二氯甲烷相用1M浓度的盐酸洗涤,再用饱和食盐水洗涤,分液后干燥、浓缩得到中间产物A;1H NMR(500MHz,CDCl3):5.17、5.34(dd,2H,-CH2),6.03(m,1H,-CH),4.61(d,2H,-CH2),3.33(s ,2H,-CH2);其中,氰乙酸乙酯与四氢呋喃的固液比为0.22g:1mL;烯丙基硫脲与氰乙酸乙酯的摩尔比为1:1;二氯甲烷与四氢呋喃的体积比为0.65:1;
S2:取亚硝酸钠加入水,搅拌均匀后加入中间产物A,之后滴加98wt%浓度的磷酸,并于低于25℃温度下在2h内滴加完毕,之后控制温度45℃反应1h,然后升温至50℃反应,并采用TLC检测确认反应完成,接着加入37wt%浓度的盐酸,搅拌冷却至0℃,并保温2h,抽滤,固体用冰水洗涤,烘干得到中间产物B;1H NMR(500MHz,CDCl3):5.15、5.31(dd,2H,-CH2),5.97(m,1H,-CH),4.58(d,2H,-CH2);其中,亚硝酸钠与水的固液比为0.14g:1mL;中间产物A与亚硝酸钠的质量比为2.1:1;磷酸与亚硝酸钠的质量比为1.56:1;盐酸与亚硝酸钠的质量比为1.3:1;
S3:取偶氮二异丁腈加入乙腈,回流搅拌条件下滴加中间产物B的乙腈溶液,滴加完毕后回流反应1.5h,之后冷却至室温,过滤、乙腈洗涤,烘干得到中间产物C;其中,偶氮二异丁腈与乙腈的固液比为1g:100mL;中间产物B的乙腈溶液的浓度为0.36g:1mL;中间产物B与偶氮二异丁腈的质量比为114:1;
S4:取中间产物C溶于DMF中,加入N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐,然后滴加三乙胺,继续搅拌4h,过滤、甲醇洗涤,烘干得到聚合物基缩合剂;其中,中间产物C与DMF的固液比为0.26g:1mL;N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐与中间产物C的质量比为1.64:1;三乙胺与N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐的质量比为0.35:1。
实施例22:
戈舍瑞林的制备方法与实施例21的区别在于:步骤2)中聚合物基缩合剂为本实施例制备的。
聚合物基缩合剂的制备与实施例21的区别在于:步骤S1中采用等摩尔量的4-丙烯基硫代氨基脲替代烯丙基硫脲。
实施例23:
戈舍瑞林的制备方法与实施例21的区别在于:步骤2)中聚合物基缩合剂为本实施例制备的。
聚合物基缩合剂的制备与实施例21的区别在于:步骤S1中采用等摩尔量的3-氨基-1-丙醇乙烯基醚替代烯丙基硫脲。
试验例1:
实施例1、实施例21~23中制备的戈舍瑞林的纯度与产率如表1所示:
表1 产物纯度和产率测试结果
样品 | 纯度/% | 产率/% |
实施例1 | 95.5 | 58 |
实施例21 | 97.1 | 62.5 |
实施例22 | 98.4 | 65.7 |
实施例23 | 96.2 | 60.3 |
从表1中数据分析可知,实施例21和实施例22中制备的聚合物基缩合剂应用于戈舍瑞林的制备,制备产物的纯度和产率明显高于实施例1,表明采用烯丙基硫脲或4-丙烯基硫代氨基脲作为原料制备获得聚合物剂缩合剂,能够进一步增强缩合剂的缩合活性,能够更好地促进缩合反应进行,提升戈舍瑞林的制备纯度和收率。
试验例2:
性能表征
红外表征
将样品与溴化钾混合压片之后,采用傅里叶红外光谱进行红外测试。波长范围4000~500cm-1。
对实施例21制备的中间产物C以及聚合物基缩合剂、实施例22制备的聚合物基缩合剂进行上述测试,结果如图2所示。从图中分析可知,实施例21制备的中间产物C的红外光谱中,在2800~3000cm-1范围内出现亚甲基的红外特征吸收峰,在2240cm-1附近出现氰基的红外特征吸收峰,在1670cm-1附近出现C=O键的红外特征吸收峰,在1640cm-1附近出现C=N键的红外特征吸收峰,在1565cm-1附近出现酰胺II带的红外特征吸收峰,在1467cm-1、1395cm-1、1120cm-1附近出现硫脲基团的红外特征吸收峰,在1285cm-1附近出现C-N键的红外特征吸收峰,以上结果表明实施例21中中间产物C成功制备。相比于中间产物C的红外测试结果,在实施例21制备的聚合物基缩合剂的红外光谱中,在3400~3500cm-1范围内羟基的吸收峰基本消失,在1000cm-1附近出现N-O键的红外特征吸收峰,表明实施例21中聚合物基缩合剂成功制备。相比于实施例21制备的聚合物基缩合剂的红外测试结果,在实施例22制备的聚合物基缩合剂的红外光谱中,980cm-1附近出现N-N键的红外特征吸收峰,表明实施例22中聚合物基缩合剂成功制备。
缩合剂活性测定
H-Pro-Azagly-NH2的合成:
取Fmoc-Pro-OH 12.6g加入100 mL DMF中溶解,冰水浴条件下加入EDC·HCl8.6g,HOBt 6.0g,NMM 12.46 mL,完全溶解后缓慢加入H-Azagly-NH2·HCl 5.0 g,加入完毕后在25℃条件下反应,并采用TLC监控反应,待反应完全后,加入六倍体积量放入5%磷酸水溶液中和,然后水相加入DCM 400mL萃取,DCM有机相依次用200mL水、200 mL饱和食盐水洗涤,之后采用无水硫酸钠干燥,过滤,减压旋蒸除去DCM,真空干燥得到Fmoc-Pro-Azagly-NH2粗品;接着加入20% PiP/DMF 150 mL,26℃下反应2h,减压旋蒸除去溶剂,之后加入乙醚100mL,析出油状物采用石油醚-乙醚混合液(v:v=2:1)150mL洗涤三次,析出固体,过滤、乙醚洗涤、真空干燥得到H-Pro-Azagly-NH2粗品,经过制备色谱柱纯化得到H-Pro-Azagly-NH2。
采用等摩尔量的实施例21~实施例23制备的聚合物基缩合剂替代EDC/HOBt进行上述测试,结果如表2所示:
表2 产物收率测试结果
样品 | 收率(%) |
实施例21 | 88.7 |
实施例22 | 90.3 |
实施例23 | 85.7 |
EDC/HOBt | 84.7 |
从表2中数据分析可知,采用实施例21和实施例22制备的聚合物基缩合剂进行氨基酸缩合,获得产物的收率明显高于实施例23和EDC/HOBt的,表明采用烯丙基硫脲或4-丙烯基硫代氨基脲作为原料制备获得聚合物剂缩合剂,能够进一步增强缩合剂的缩合活性,能够更好地促进缩合反应进行,提升产物收率。
回收再利用性能测定
取上述缩合反应结束后的聚合物基缩合剂,用水洗涤2次,然后用甲醇打浆洗涤2次,过滤,滤饼烘干;之后再进行实施例21中的步骤S4操作,获得回收的聚合物基缩合剂,再进行上述缩合剂反应活性测定,计算收率下降率,结果如表3所示:
表3 回收再利用测试结果
样品 | 收率下降率(%) |
实施例21 | 9.5 |
实施例22 | 8.4 |
实施例23 | 12.7 |
从表3中数据分析可知,回收再制备的实施例21和实施例22中的聚合物基缩合剂再次使用,产物的收率下降率明显低于实施例23,表明采用烯丙基硫脲或4-丙烯基硫代氨基脲作为原料制备获得聚合物剂缩合剂,能够进一步增强缩合剂的循环使用稳定性,能够更好地促进缩合反应进行,更好地实现对大分子基团的重复利用,提高原子经济性。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术,故在此不再详细赘述。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种基于中间体制备戈舍瑞林的方法,包括:采用固相合成法制备获得中间体,经过氢化获得片段,再与缺失片段缩合得到戈舍瑞林或者戈舍瑞林中间产物;所述戈舍瑞林中间产物再经过切割获得戈舍瑞林;
所述中间体结构通式包括:
Pyr-His(R1)-Trp-Ser(R2)-Tyr(Cbz)-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-OH;
式中,所述Xaa1选自D-Ser(tBu)或不存在, Xaa2选自Leu或不存在,Xaa3选自Arg(NO2)或不存在,Xaa4选自Pro或不存在;
其中,R1为Trt或不存在,R2为Bzl或不存在;
所述缩合过程中缩合剂包括聚合物基缩合剂;所述聚合物基缩合剂由氰乙酸乙酯与烯丙基硫脲或4-丙烯基硫代氨基脲通过交换反应再经过肟化反应获得聚合单体,经聚合后与卤代物进行酯化反应获得;
所述聚合物基缩合剂的制备方法,包括:
S1:取氰乙酸乙酯与烯丙基硫脲或4-丙烯基硫代氨基脲通过交换反应获得中间产物A;
S2:取中间产物A与亚硝酸钠、95~98wt%浓度的磷酸混合经过肟化反应获得中间产物B;
S3:取中间产物B在引发剂偶氮二异丁腈条件下聚合获得中间产物C;
S4:取中间产物C与N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐在三乙胺条件下酯化反应获得聚合物基缩合剂。
2.根据权利要求1所述的基于中间体制备戈舍瑞林的方法,其特征在于,所述中间体结构中侧链修饰Cbz的Tyr的物料结构为:
。
3.根据权利要求1所述的基于中间体制备戈舍瑞林的方法,其特征在于,所述缺失片段选自H-Azagly-NH2、H-Pro-Azagly-NH2、H-Arg-Pro-Azagly-NH2、H-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2或H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2中的一种。
4.根据权利要求1所述的基于中间体制备戈舍瑞林的方法,其特征在于,所述氢化过程中催化剂选自钯类催化剂或者镍类催化剂。
5.根据权利要求1所述的基于中间体制备戈舍瑞林的方法,其特征在于,所述切割过程中切割溶液为酸性溶液;所述酸性溶液选自醋酸、柠檬酸或低浓度酸中的一种;所述低浓度酸选自硫酸、盐酸、磺酸、三氟乙酸或高氯酸中的至少一种。
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