CN110386964A - 一种亮丙瑞林的固液合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种亮丙瑞林的固液合成方法，包括如下步骤：采用HMBA linker偶联AM Resin得到HMBA Linker AM Resin，再将液相合成的二肽应用到固相合成中，得到全保护的肽树脂；将肽树脂用乙胺溶液胺解得到末端乙胺化的全保护肽，经三氟乙酸脱保护得到粗肽；将粗肽经过高效液相色谱制备得到高质量的精肽。本发明提供的亮丙瑞林的固液合成方法有效解决了现有技术偶联不稳定的问题，避免了二酮哌嗪副反应，保证了固相合成的收率及粗肽的纯度，简化了反应操作，提高了收率，并且避免了现有工艺报道液相缩合乙胺盐酸盐的消旋副反应；与现有技术相比反应操作简单、原料投入少、成本低、收率高，容易达到产业化的要求，具有广泛的市场前景。

Description

一种亮丙瑞林的固液合成方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的合成方法，特别涉及一种亮丙瑞林的固液合成方法。
背景技术
亮丙瑞林，英文名Leuprorelin，化学名：5-氧代-脯氨酰-组氨酰-色氨酰-丝氨酰-酪氨酰-D-亮氨酰-亮氨酰-精氨酰-N-乙基-脯氨酰胺，CAS号：53714-56-0，肽序：H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5，分子式：C59H84N16O12，分子量：1209.41。
亮丙瑞林是一种促性腺激素释放激素类似物，主要作用于垂体前叶，大剂量应用初期可以引起一过性黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)释放增多，后期则导致垂体敏感性降低，使LH、FSH和性激素分泌减少。亮丙瑞林用于治疗相关性激素病症，包括：晚期前列腺癌、子宫内膜异位、中枢性性早熟症。
原研厂家武田化工发表专利US4008209，专利中的方法是将Boc-Pro-OH通过三乙胺连接到氯甲基聚苯乙(Merrified)树脂上，采取Boc路线依次连接完相应的氨基酸后，在低温下用乙胺胺解树脂，用甲醇提取全保护肽后，浓缩至干，再经HF(氟化氢气体)脱除侧链保护基团得到目的产物。此种通过Boc策略合成肽树脂，每一步的脱保护均需要用到强腐蚀性、强酸性的三氟乙酸溶液，以及树脂的裂解需用到高危试剂氟化氢，故危险系数高、三废处理量大、收率低、成本高，不利于工业化放大。
国内专利CN1865280A提到采取Wang树脂或CTC树脂及专利CN101538315B提到的HMPB-AM树脂为起始原料，按照Fmoc策略，依次偶联带保护基团的氨基酸，获得保护九肽树脂，用三氟乙酸裂解得到脱侧链保护基团的线性肽，再与乙胺缩合得到亮丙瑞林粗品。这些方法主要存在以下缺陷：采取CTC树脂为起始树脂，Fmoc固相合成策略，由于CTC Resin本身的不稳定性，批次间偶联收率不稳定，不利于工业化放大；采取Wang Resin或者HMPB-AM树脂为起始树脂，Fmoc固相合成策略合成全保护九肽，无法避免二酮哌嗪副反应(DKP副反应)，偶联过程中造成肽链脱落，显著降低收率，成本高，无法进行工业化生产。裂解的全保护肽采用液相合成的方法与乙胺盐酸盐缩合，副反应产生的杂质不易制备纯化，降低产品的收率。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、成本低、收率高、易达到产业化要求的亮丙瑞林合成工艺，本发明主要解决现有技术偶联不稳定，以及合成中因二酮哌嗪副反应导致的合成收率及粗肽纯度低的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案，包括以下步骤：
1.在缩合剂作用下，由Fmoc-Leu-OH与HOPFP在缩合剂作用下得到Fmoc-Leu-OPFP；Fmoc-Leu-OPFP与H-Arg(Pbf)-OH在碱作用下反应生成Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH；
2.以AM Resin为起始树脂，与HMBA Rinker偶联后得到HMBA AM Resin，再与保护氨基酸Fmoc-Pro-OH缩合得到Fmoc-Pro-HMBA AM Resin；
3.用20％的哌啶/DMF溶液脱保护后得到H-Pro-HMBA AM Resin，再与Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH缩合得到Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-HMBA AM Resin；
4.采取Fmoc/tBu固相合成策略，进行程序反应，依次进行缩合反应偶联保护氨基酸，得到肽全保护树脂；
5.用乙胺溶液胺解肽全保护树脂，得到碳端乙胺化的全保护肽；
6.全保护肽用酸性试剂脱保护后得到粗肽；
7.粗肽用纯化水溶解后，经过反相C18填料高效液相色谱柱纯化、转盐、浓缩、冷冻干燥，得到产品亮丙瑞林醋酸盐。
所述的缩合剂选自HOBt/HOAT、DIC/DCC/EDC.HCl、HATU/HBTU/HCTU、PyBOP/PyAOP中的任意组合。
所述的碱选自DIEA、吡啶、碳酸氢钠、碳酸钠、吗啡林、氢氧化钠中任何一种。
所述的起始树脂AM Resin的替代度1.5mmol/g～3.0mmol/g。
所述的HMBA Linker结构为4-羟甲基苯甲酸同系物，可以选自下列结构中任何一种：
所述保护氨基酸的投料量比值为1.5～3.0eq，氨基酸和缩合剂等的比为1：1.1。
所述的乙胺溶液溶剂可选自甲醇溶液、乙醇溶液、四氢呋喃溶液、水溶液中的任何一种；
所述乙胺溶液浓度为20％-75％。
所述的全保护肽用酸性试剂可选自三氟乙酸/捕获剂/抗氧化剂的组合溶液、氯化氢的四氢呋喃溶液、氯化氢的乙酸乙酯溶液中的任何一种。
与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
本发明以HMBA Linker为链接剂来固相合成全保护肽，解决了现有技术偶联不稳定的问题；液相合成二肽用于固相合成，避免了二酮哌嗪副反应(DKP副反应)，保证了固相合成的收率及粗肽的纯度；以乙胺溶液胺解，不仅简化了反应操作，提高了收率，并且避免了现有工艺报道液相缩合乙胺盐酸盐的消旋副反应。
本发明所述工艺，以较简便的工艺步骤实现了同时在粗肽纯度、控制杂质含量和总收率方面具有较高水平，与现有技术相比反应操作简单、原料投入少、成本低、收率高，容易达到产业化的要求，具有广泛的市场前景。
附图说明
图1为本发明合成方法流程图；
图2为本发明粗肽的HPLC图；
图3为本发明精肽的HPLC图；
图4为本发明产品质谱图；
图5为对比例1制备得到粗肽的HPLC图；
图6为对比例1制备得到精肽的HPLC图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明。实施例不应限定为对保护范围的限制。
本发明涉及的英文缩写对应的中文名称如表1所示：
表1本发明涉及的英文缩写对应的中文名称
实施例1：参照图1，Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH的合成
称取，Fmoc-Leu-OH 100g、HOPFP 52.08g，加入二氯甲烷500mL搅拌溶解，降温至0℃。称取DCC 58.38g加入二氯甲烷400mL中，搅拌溶解，降温至0℃，滴加加入到上述溶液中。溶液在0℃搅拌反应24h，过滤，固体用二氯甲烷300mL洗涤两次，真空浓缩干燥得到白色固体直接用于下步反应。
将上述固体溶解在600mL四氢呋喃中，降温至0～5℃，加入DIEA 52.24g，将H-Arg(Pbf)-OH用50％的THF/水1.8L溶解后滴加到上述溶液中，滴加完毕，继续反应3h。反应完毕，用硫酸氢钾调pH 4-7。加入2.4L乙酸乙酯萃取2次，合并有机层，用5％的硫酸氢钾水溶液3L洗涤3次，饱和食盐水1.2L洗涤1次，无水硫酸钠干燥，真空干燥，得到白色固体198.38g，收率92.02％。
实施例2：参照图1，HMBA AM Resin的制备
称取AM Resin(90.00g,1.65mmol/g)用500mLDMF洗涤1次，抽干，500mL DMF溶胀2h，抽干。
称取45.19g HMBA Linker(n＝1,m＝0)，44.14g HOBt，用200mL DMF溶解，冰浴下加入41.23g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温常温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，500mL/次/min，抽干。
实施例3：参照图1，HMBA AM Resin的制备
称取AM Resin(90.00g,1.65mmol/g)用500mLDMF洗涤1次，抽干，500mL DMF溶胀2h，抽干。
称取58.07g HMBA Linker(n＝1,m＝4)，52.16g HOBt，用200mL DMF溶解，冰浴下加入53.79g DCC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温常温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，500mL/次/min，抽干。
实施例4：参照图1，HMBA AM Resin的制备
称取AM Resin(90.00g,1.65mmol/g)用500ml DMF洗涤1次，抽干，500mL DMF溶胀2h，抽干。
称取70.14g HMBA Linker(n＝2,m＝5)，52.16g HOAT，用200mL DMF溶解，冰浴下加入71.12g HBTU于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温常温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，500mL/次/min，抽干。
实施例5：参照图1，HMBA AM Resin的制备
称取AM Resin(90.00g,1.65mmol/g)用500mLDMF洗涤1次，抽干，500mL DMF溶胀2h，抽干。
称取95.08g HMBA Linker(n＝6,m＝7)，52.16g HOAT，用200mL DMF溶解，冰浴下加入53.79g HCTU于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温常温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，500mL/次/min，抽干。
实施例6：参照图1，Fmoc-Pro-HMBA AM Resin的制备
称取125.25g Fmoc-Pro-OH，55.17g HOBt用200mL DMF溶解澄清后，冰浴下加入51.54g DIC于溶液中活化约5min，倒入实施例2制备的反应柱中。室温常温下搅拌反应24h，24h后抽去反应液，500mL DMF洗涤3次，再分别用500mLMeOH和500mL/次DCM各洗涤3次，取出树脂，烘干，得到Fmoc-Pro-HMBA AM Resin，替代度为1.78mmol/g。
实施例7：参照图1，Fmoc-Pro-HMBA AM Resin的制备
称取125.25g Fmoc-Pro-OH，55.17g HOBt用200mL DMF溶解澄清后，冰浴下加入56.12g DCC于溶液中活化约5min，倒入实施例3制备的反应柱中。室温常温下搅拌反应24h，24h后抽去反应液，500mL DMF洗涤3次，再分别用500mLMeOH和500mL/次DCM各洗涤3次，取出树脂，烘干，得到Fmoc-Pro-HMBA AM Resin，替代度为1.68mmol/g。
实施例8：参照图1，Fmoc-Pro-HMBAAM Resin的制备
称取125.25g Fmoc-Pro-OH，57.32g HOAT用200mL DMF溶解澄清后，冰浴下加入63.91g HBTU于溶液中活化约5min，倒入实施例4制备的反应柱中。室温常温下搅拌反应24h，24h后抽去反应液，500mL DMF洗涤3次，再分别用500mLMeOH和500mL/次DCM各洗涤3次，取出树脂，烘干，得到Fmoc-Pro-HMBAAM Resin，替代度为1.71mmol/g。
实施例9：参照图1，Fmoc-Pro-HMBAAM Resin的制备
称取125.25g Fmoc-Pro-OH，57.32g HOAT用200mL DMF溶解澄清后，冰浴下加入61.12g HCTU于溶液中活化约5min，倒入实施例5制备的反应柱中。室温常温下搅拌反应24h，24h后抽去反应液，500mL DMF洗涤3次，再分别用500mLMeOH和500mL/次DCM各洗涤3次，取出树脂，烘干，得到Fmoc-Pro-HMBAAM Resin，替代度为1.79mmol/g。
实施例10：参照图1，肽树脂的制备
取实施例6中Fmoc-Pro-HMBAAM Resin(100mmol)加入固相反应柱中，用DMF 800mL溶胀30min，抽干。
加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，800mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH(190.49g)，HOBt(37.15g)用800mL DMF溶解，冰浴下加入34.71g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温常温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，800mL/次/min，抽干。
按照此脱保护操作和保护氨基酸偶联操作依次偶联Fmoc-D-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-O，Fmoc-His(Trt)-OH，H-Pyr-OH，得到全保护肽肽树脂270g。
实施例11：参照图1，肽树脂的制备
取实施例7中Fmoc-Pro-HMBAAM Resin(100mmol)加入固相反应柱中，用DMF 800mL溶胀30min，抽干。
加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，800mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH(190.49g)，HOBt(37.15g)用800mL DMF溶解，冰浴下加入38.17g DCC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温常温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，800mL/次/min，抽干。
按照此脱保护操作和保护氨基酸偶联操作依次偶联Fmoc-D-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-O，Fmoc-His(Trt)-OH，H-Pyr-OH，得到全保护肽肽树脂270g。
实施例12：参照图1，肽树脂的制备
取实施例8中Fmoc-Pro-HMBAAM Resin(100mmol)加入固相反应柱中，用DMF 800mL溶胀30min，抽干。
加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，800mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH(190.49g)，HOAT(38.16g)用800mL DMF溶解，冰浴下加入43.61g HBTU于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温常温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，800mL/次/min，抽干。
按照此脱保护操作和保护氨基酸偶联操作依次偶联Fmoc-D-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-O，Fmoc-His(Trt)-OH，H-Pyr-OH，得到全保护肽肽树脂270g。
实施例13：参照图1，肽树脂的制备
取实施例9中Fmoc-Pro-HMBAAM Resin(100mmol)加入固相反应柱中，用DMF 800mL溶胀30min，抽干。
加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，800mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH(190.49g)，HOAT(38.16g)用800mL DMF溶解，冰浴下加入42.87g HCTU于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温常温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，800mL/次/min，抽干。
按照此脱保护操作和保护氨基酸偶联操作依次偶联Fmoc-D-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-O，Fmoc-His(Trt)-OH，H-Pyr-OH，得到全保护肽肽树脂270g。
实施例14：参照图1，胺解得到末端乙胺化的全保护肽
按照胺解液比例配制胺解溶液2.7L，在室温常温下加入实施例10制得的肽树脂270g，密闭反应瓶，室温常温搅拌反应24h。反应完毕过滤，树脂用溶液洗涤3次，每次200mL，合并滤液，浓缩。浓缩液中加入异丙醚，沉降，洗涤，干燥，得到碳端乙胺化的全保护肽白色固体186g。
实施例15：参照图1，脱保护得到亮丙瑞林粗品
配置TFA：TIS：水＝95：2.5：2.5(体积比)1.9L，降温至0℃，加入实施例14制得的末端乙胺化的全保护肽186g，在0-5℃搅拌30min，恢复室温搅拌反应1.5h。反应完毕，倒入19L冰异丙醚中沉降，洗涤，离心，干燥得到亮丙瑞林粗肽146g，标定内含亮丙瑞林79.67g，合成收率65.45％，纯度82.82％。HPLC图谱如图2所示，特征峰结果如表2所示。
表2实施例15亮丙瑞林粗肽的特征峰峰表
峰# 保留时间 面积 面积％
1 3.994 4769 0.02
2 4.142 33125 0.11
3 4.310 12733 0.04
4 4.605 51853 0.18
5 4.919 38159 0.13
6 5.874 141026 0.48
7 6.383 35712 0.12
8 7.115 464352 1.57
9 7.525 30500 0.10
10 8.439 174575 0.59
11 10.174 66497 0.22
12 10.883 8865 0.03
13 11.267 72828 0.25
14 12.386 21932 0.07
15 13.178 63442 0.21
16 13.856 990030 3.35
17 14.868 137270 0.46
18 15.795 112357 0.38
19 16.542 212430 0.72
20 17.938 360261 1.22
21 18.583 35027 0.12
22 19.725 24487480 82.82
23 20.883 28468 0.10
24 21.703 73748 0.25
25 23.012 48515 0.16
26 24.250 81875 0.28
27 26.425 114150 0.39
28 26.900 191868 0.65
29 28.536 1227802 4.15
30 31.077 7818 0.03
31 32.236 19078 0.06
32 34.825 31164 0.11
33 39.223 187087 0.63
总计 29566793 100.00
实施例16：参照图1，脱保护得到亮丙瑞林粗品
实施例11制得的全保护肽肽树脂参照实施例14和实施例15的方法制备粗肽。
干燥得到亮丙瑞林粗肽178g，标定内含亮丙瑞林63.97g，合成收率63.12％，纯度82.65％。HPLC图谱与特征峰结果与实施例15相似。
实施例17：参照图1，脱保护得到亮丙瑞林粗品
实施例12制得的全保护肽肽树脂参照实施例14和实施例15的方法制备粗肽。
干燥得到亮丙瑞林粗肽174g，标定内含亮丙瑞林80.2g，合成收率61.67％，纯度83.10％。HPLC图谱与特征峰结果与实施例15相似。
实施例18：参照图1，脱保护得到亮丙瑞林粗品
实施例13制得的全保护肽肽树脂参照实施例14和实施例15的方法制备粗肽。
干燥得到亮丙瑞林粗肽181g，标定内含亮丙瑞林64.12g，合成收率63.12％，纯度82.41％。HPLC图谱与特征峰结果与实施例15相似。
实施例19：参照图1，亮丙瑞林精制
将实施例15制备的亮丙瑞林粗品溶于纯水中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：A相，0.1％-0.3％的三乙胺水溶液磷酸调PH值2-3；B相：乙腈；B相梯度：5％-40％流速400mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合格样品峰合并浓缩后转盐，浓缩冻干，得到56.24g白色絮状产品，纯度：99.88％，纯化收率70.59％，总收率46.20％(以Fmoc-Pro-HMBA AM Resin 100mmol计)。HPLC图谱如图3所示，特征峰结果如表3所示，所得产品质谱图见图4。
表3实施例19亮丙瑞林精肽的特征峰峰表
峰# 保留时间 面积 面积％
1 4.554 2360 0.01
2 7.110 4561 0.02
3 11.881 1648 0.01
4 16.630 4175 0.02
5 17.730 10677 0.04
6 19.482 27037790 99.88
7 21.386 9741 0.04
总计 27070951 100.00
实施例20：参照图1，亮丙瑞林精制
实施例16制得的亮丙瑞林粗品参照实施例19的方法进行纯化。
得到51.31g白色絮状产品，纯度：99.85％，纯化收率70.37％，总收率45.97％(以Fmoc-Pro-HMBA AM Resin 100mmol计)。HPLC图谱、特征峰结果及产品质谱图与实施例19相似。
实施例21：参照图1，亮丙瑞林精制
实施例17制得的亮丙瑞林粗品参照实施例19的方法进行纯化。
得到56.34g白色絮状产品，纯度：99.89％，纯化收率70.61％，总收率46.37％(以Fmoc-Pro-HMBA AM Resin 100mmol计)。HPLC图谱、特征峰结果及产品质谱图与实施例19相似。
实施例22：参照图1，亮丙瑞林精制
实施例18制得的亮丙瑞林粗品参照实施例19的方法进行纯化。
得到56.19g白色絮状产品，纯度：99.84％，纯化收率70.35％，总收率45.83％(以Fmoc-Pro-HMBA AM Resin 100mmol计)。HPLC图谱、特征峰结果及产品质谱图与实施例19相似。
对比例1：亮丙瑞林的制备
制备Fmoc-Pro-Wang树脂
1)取125gWang树脂(0.8mmol/g树脂，100mmol)，用800mlDMF浸泡，使树脂充分溶胀，吹干。
2)取125.25g(FW：337.4，371mmol)Fmoc-Pro-OH、119.1g(FW：321，371mmol)TBTU/HBTU、56.8g(FW：153，371mmol)HOBT，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。
3)吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干，约得141.3g。
制备Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang树脂：
1)加1000ml脱帽试剂，25℃反应15分钟，吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干。
2)加入240.7g(FW：648.8，371mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH、119.1g(FW：321，371mmol)TBTU/HBTU、56.8g(FW：153，371mmol)HOBT，用1000ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。
3)吹干，分别用DMF、无水乙醇和DMF各洗涤三次，吹干。
按照上述操作依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、pGlu-OH得到保护九肽树脂。
切肽：
将保护九肽转移至1000ml反应器中，加入事先配制好并预冷至约5℃的试剂(TFA/EDT/H2O/TIS＝680ml/18ml/18ml/3.6ml)，25℃搅拌1小时。减压除溶剂至小体积，加入800ml冷乙醚沉淀，离心收集，用无水乙醚洗后，P2O5真空干燥。
乙胺化：
HOBt—乙胺的制备：77.5gHOBT加4000ml水，加入77ml乙胺搅拌至HOBt溶解。冷冻干燥。将HOBt—乙胺转移到切肽后的粗品中，再加入DIC51g，25℃搅拌过夜。乙醚沉淀。过滤，用乙醚洗涤三次，得亮丙瑞林粗品58g(48.0mmol)，纯度53.08％。HPLC图谱如图5所示，特征峰结果如表4所示。
表4对比例1亮丙瑞林粗肽的特征峰峰表
峰# 保留时间 面积 面积％
1 8.1208 8771 0.05
2 8.5334 24204 0.13
3 9.6957 9926 0.05
4 10.0050 11057 0.06
5 12.0358 56066 0.29
6 13.4162 60497 0.32
7 15.2317 40124 0.20
8 16.4161 26381 0.14
9 17.3007 43619 0.23
10 20.1400 32389 0.17
11 22.3425 125618 0.66
12 24.6707 10127848 53.08
13 34.1545 629960 3.30
14 36.4072 7727962 40.50
15 42.7377 41327 0.21
16 42.9542 116354 0.61
总计 19082103 100.00
分离纯化：
将亮丙瑞林粗品溶于纯水中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：A相，0.1％-0.3％的三乙胺水溶液磷酸调PH值2-3；B相：乙腈；B相梯度：5％-40％流速400mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合格样品峰合并浓缩后转盐，浓缩冻干，约得22.5g白色块状物成品，纯度99.68％，总收率31％(以Wang树脂的100mmol计)。HPLC图谱如图6所示，特征峰结果如表5所示。
表5对比例1亮丙瑞林精肽的特征峰峰表
峰# 保留时间 面积 面积％
1 19.948 6866 0.02
2 21.095 54569 0.18
3 21.872 22380 0.07
4 23.255 30280212 99.68
5 25.462 13887 0.05
总计 30377913 100.00
从实施例1～7与对比例1中HPLC图谱和数据可知，与对比例1相比，实施例6中亮丙瑞林粗品的纯度为82.82％，与对比例1相比提高了56.15％，由此可知，本发明提供的亮丙瑞林的合成方法可提高粗肽的纯度。经过简单的纯化步骤，本发明实施例7中亮丙瑞林精品的纯度为99.88，与对比例1相比提高了0.2％。本发明亮丙瑞林总收率为46.20％，与对比例1相比提高49.03％。实施例5中通过乙胺溶液胺解直接得到末端乙胺化保护肽，无需进行切肽再乙胺化，不仅简化了反应操作，同时提高了收率，并且避免了现有工艺报道液相缩合乙胺盐酸盐的消旋副反应。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种亮丙瑞林的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)Fmoc-Leu-OH与HOPFP在缩合剂作用下得到Fmoc-Leu-OPFP；Fmoc-Leu-OPFP与H-Arg(Pbf)-OH在碱作用下反应生成Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH；
(2)以AM Resin为起始树脂，与HMBA Linker偶联后得到HMBA AM Resin，再与N端Fmoc保护的氨基酸Fmoc-Pro-OH缩合得到Fmoc-Pro-HMBA AM Resin；
(3)脱除Fmoc-Pro-HMBA AM Resin中的Fmoc保护，得到H-Pro-HMBA AM Resin，再与步骤1中得到的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-OH缩合得到Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-HMBA AM Resin；
(4)通过固相合成法，按照亮丙瑞林主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，得到全保护肽树脂；
(5)用乙胺溶液胺解全保护肽树脂，得到碳端乙胺化的全保护肽；
(6)全保护肽用酸性试剂脱保护后得到粗肽；
(7)纯化、转盐、浓缩、冷冻干燥，得到产品亮丙瑞林醋酸盐。
2.根据权利要求1所述的一种亮丙瑞林的制备工艺，其特征在于：步骤2中所述HMBALinker为4-羟甲基苯甲酸同系物，可选自下述结构中任何一种：
3.根据权利要求1所述的亮丙瑞林的制备方法，其特征在于：步骤1中所述的缩合剂选自HOBt/HOAT、DIC/DCC/EDC.HCl、HATU、HBTU、HCTU、PyBOP、PyAOP中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种亮丙瑞林的制备工艺，其特征在于：步骤1中所述的碱选自DIEA、吡啶、碳酸氢钠、碳酸钠、吗啡林、氢氧化钠中的任何一种。
5.根据权利要求1所述的一种亮丙瑞林的制备工艺，其特征在于：步骤2中所述AMResin的替代度1.5mmol/g～3.0mmol/g。
6.根据权利要求1所述的一种亮丙瑞林的制备工艺，其特征在于：相对于合成规模，保护氨基酸与树脂的投料量比值为1.5～3.0eq，氨基酸和缩合剂的比为1：1.1。
7.根据权利要求1所述的一种亮丙瑞林的制备工艺，其特征在于：步骤5中所述乙胺溶液溶剂可选自甲醇溶液、乙醇溶液、四氢呋喃溶液、水溶液中的任何一种。
8.根据权利要求1或7中任一所述的乙胺溶液，其特征在于：乙胺溶液的浓度为20％-75％。
9.根据权利要求1所述的一种亮丙瑞林的制备工艺，其特征在于：步骤6中所述酸性试剂可选自三氟乙酸/捕获剂/抗氧化剂的组合溶液、氯化氢的四氢呋喃溶液、氯化氢的乙酸乙酯溶液中的任何一种。
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