一种布舍瑞林的固液合成方法
技术领域
本发明涉及一种布舍瑞林的固液合成方法。
背景技术
布舍瑞林(Buserelin),商品名为CinnaFact,CinnaGen公司生产的醋酸Buserelin水针剂已投入市场。适应症:用于治疗子宫内膜异位、中枢性早熟、乳腺癌和前列腺癌。布舍瑞林是促性腺素释放激素类(LH-RH)药物,LH-RH是由下丘脑分泌的激素,能促进垂体合成并释放黄体生成素、卵细胞雌激素。该类激素的同系物包括戈舍瑞林(Goserelin)、亮丙瑞林(Leuprorelin)、曲普瑞林(Triptorelin)、戈那瑞林(Gonadoerlin)。
布舍瑞林为线性九肽,分子量为1239.42,CAS登记号为57982-77-1,分子式为:C60H86N16O13,其氨基酸序列为H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt。结构式如下:
专利CN101935339报道了一种固相制备布舍瑞林的方法。该方法采用部分保护的氨基酸合成线性九肽后,进行乙胺化,然后脱除保护基得到布舍瑞林。其中3号位色氨酸和5号位酪氨酸没有进行侧链保护,且处在整条链的中间位置,后续合成过程经历反复的缩合和脱保护,因为它们的侧链吲哚基和羟基都相对活泼,导致合成后的粗肽杂质较多并且极性相差较小,粗肽的纯化和制备工作就会更加复杂。该方法采用的裂解剂在脱除侧链保护基的同时也会脱除D-Ser(tBu)的部分tBu基团,导致布舍瑞林失去药物活性。
专利CN103554229A报道了一种固相合成布舍瑞林的方法。利用乙胺基树脂合成全保护的线性粗肽,裂解树脂,催化氢化脱除保护基得到布舍瑞林。该方法采用氨基钠合成乙胺基树脂,提高了树脂的成本,并且氨基钠性质不稳定,易于氧化发生爆炸,反应液需要及时后处理,实际操作繁琐,不利于工业化的生产。而专利CN201410269996采用了片段合成的全保护的粗肽,最后催化氢化得到布舍瑞林。该方法的氨基酸保护策略与专利CN103554229A相同,虽然采用片段缩合的方法避开专利,但最终都是运用催化氢化脱除保护基方法。催化氢化是采用Pd/C,通入氢气的方法脱除保护基,Pd/C价格昂贵,产品容易引入重金属,需要必要的重金属检测,不适合药物的生产,并且催化氢化需要特种设备,操作要求高,安全系数低,不利于工业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作步骤简单、收率高、纯度高,易于工业化生产的布舍瑞林固液合成方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种布舍瑞林的固液合成方法,所述方法包括如下步骤:
(1)采用Fmoc固相合成策略,利用偶联剂依次将Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、H-Pyr-OH按照布舍瑞林前5个氨基酸的序列连接至树脂上,得到全保护的五肽树脂,即Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-树脂;切割树脂,同时脱除侧链保护基,经乙醚沉淀,得到线性五肽片段,即H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH;
(2)采用Fmoc固相合成策略,利用偶联剂依次将Fmoc-Arg(HCl)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH按照布舍瑞林第6至第8个氨基酸的序列连接至树脂上,得到全保护的三肽树脂,即Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-树脂;切割树脂,乙醚沉淀,得到全保护的三肽片段,即Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-OH;
(3)将步骤(2)得到的三肽片段与特殊氨基酸Pro-NHEt·HCl液相中偶联,脱除Fmoc基团,得到四肽片段,即:H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-NHEt;
(4)将步骤(1)得到的五肽片段与步骤(3)得到的四肽片段液相中在偶联剂的作用下进行缩合,乙醚沉淀,得到布舍瑞林粗肽,再经脱盐,转盐,得到布舍瑞林纯肽。
步骤(1)和(2)中,所用的树脂为二氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl ChlorideResin),取代值优选为0.6~0.9mmol/g。
步骤(1)、(2)、(3)和(4)中,所使用的偶联剂为以下三种混合物中的任选一种:HBTU、Y试剂和DIEA的混合物;HATU、Y试剂和DIEA的混合物;DIC与Y试剂的混合物;其中,所述的Y试剂为HoBt或HoAt。
步骤(1)和(2)中,优选按1:(1~6):(2~12)的摩尔比分别称取溶胀后的二氯三苯甲基氯树脂、Fmoc保护氨基酸和DIEA,将Fmoc保护氨基酸、DIEA溶于DMF,预活化,然后再加入到溶胀后的二氯三苯甲基氯树脂中,室温震荡反应0.5~3小时连接第一个Fmoc保护氨基酸,连接下一个氨基酸之前用哌啶的DMF溶液脱Fmoc保护基2次,时间分别为3~5分钟和15~25分钟,每次连接上一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都需要用DMF、DCM洗涤3~10次;
自连接第二个氨基酸起,按1:(1~6):(1~6):(1~6):(2~12)的摩尔比分别计算树脂、Fmoc保护氨基酸、HoBt、HBTU和DIEA的量,将Fmoc保护氨基酸、HoBt溶于二甲基甲酰胺,冰上预活化,加入HBTU和DIEA,然后再加入到树脂中,室温震荡反应0.5~3小时连接Fmoc保护氨基酸,重复上述过程,直至连接完毕。
步骤(1)、(2)和(3)中,脱除Fmoc保护基的方法是用体积百分含量25%的哌啶的DMF溶液。
步骤(1)中,切割肽树脂的方法是将三氟乙酸、三异丙基硅烷、水按体积比95:2.5:2.5混合,加入全保护的五肽树脂中,室温震荡反应0.5~4小时后,将反应液过滤逐滴滴入冷乙醚中,沉淀,离心,洗涤,干燥,得到布舍瑞林五肽片段;步骤(2)中,切割肽树脂的方法是将三氟乙酸与二氯甲烷按体积比1:99混合,加入全保护的三肽树脂中,室温震荡反应0.5~4小时后,将反应液过滤逐滴滴入冷乙醚中,沉淀,离心,洗涤,干燥,得到布舍瑞林三肽片段。
步骤(3)中,按1:(1~6):(1~6):(1~6):(2~12)的摩尔比分别取羧基端三肽片段组分、特殊氨基酸Pro-NHEt·HCl、缩合剂X、试剂Y和DIEA(缩合剂X为HATU、HBTU、PyBop、DCC、DIC、EDC·HCl其中一种或多种组合,试剂Y为HoBt或HoAt),将两种片段组分、试剂Y溶于DMF,冰浴预活化,加入缩合剂X和DIEA,室温搅拌反应0.5~4小时,水沉淀,离心,洗涤,得到Fmoc保护的布舍瑞林四肽;将Fmoc保护的布舍瑞林四肽片段溶解于预先冰浴的25%v/v的哌啶的DMF溶液,室温搅拌反应0.5~2小时,乙醚沉淀,离心,洗涤,得到布舍瑞林四肽片段。
步骤(4)中,按1:(1~6):(1~6):(1~6):(2~12)的摩尔比分别取氨基端四肽片段组分、羧基端五肽片段组分、缩合剂X、试剂Y和DIEA(缩合剂X为HATU、HBTU、PyBop、DCC、DIC、EDC·HCl其中一种或多种组合,试剂Y为HoBt或HoAt),将两种片段组分、试剂Y溶于DMF,冰浴预活化,加入缩合剂X和DIEA,室温震荡反应0.5~4小时,乙醚沉淀,离心,洗涤,得到布舍瑞林粗肽。
有益效果:本发明所述的布舍瑞林的合成方法,运用片段缩合的方法,降低了反应中杂质,提高了合成效率,降低了产品的生产成本,脱保护采用常规裂解方法,不采用催化氢化,有效避免了药物生产中重金属的污染,规避了催化氢化安全风险,降低了特种设备要求,操作安全简便,易于工业化生产。因此,本发明提供了一种生产效率高,成本低,反应条件温和易于控制,对人体和环境影响小,有利于工业化生产的合成方法。
附图说明
图1布舍瑞林的质谱鉴定图。
图2布舍瑞林的液相色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
说明书或权利要就书中所使用的缩写含义见表1。
表1
Fmoc |
9-芴甲氧羰基 |
tBu |
叔丁基 |
Trt |
三苯甲基 |
Boc |
叔丁氧羰基 |
DCM |
二氯甲烷 |
DMF |
N,N-二甲基甲酰胺 |
HoBt |
1-羟基苯并三唑 |
HBTU |
苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 |
DIEA |
N,N-二异丙基乙胺 |
TFA |
三氟乙酸 |
DIC |
N,N'-二异丙基碳二亚胺 |
HoAt |
N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑 |
HATU |
2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 |
PyBop |
(苯并三唑-1-氧)三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐 |
Pro-NHEt·HCl |
脯氨酸乙氨基盐酸盐 |
EDC·HCl |
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 |
实施例1:Fmoc-Tyr(tBu)-二氯三苯甲基氯树脂的制备。
称取0.5g(0.30mmol)二氯三苯甲基氯树脂(取代值0.60mmol/g)置于加筛板的20ml BD注射器(或普通玻璃肽反应器),用3倍树脂体积的DCM溶胀两次,每次1小时,使树脂溶胀完全。用10ml DMF溶解551.40mg(1.2mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH,加入0.4ml(2.4mmol)DIEA,活化3min,将混合溶液加入到固相反应器中,搅拌反应2h,DMF洗涤三次,DCM洗三次。加入10ml DCM和800μl的甲醇封闭树脂,搅拌反应30min,DCM洗涤3次,抽干得到Fmoc-Tyr(tBu)-二氯三苯甲基氯树脂。
实施例2:Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-二氯三苯甲基氯树脂的合成。
将Fmoc-Tyr(tBu)-二氯三苯甲基氯树脂装入固相反应器中,DMF洗两次,用20%(v/v)哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护基2次,时间分别为5min和20min,DMF洗涤3次,茚三酮法检验。用10ml DMF溶解460.08mg(1.2mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH和162.12mg(1.2mmol)HOBt,冰浴10min,加入0.4ml(2.4mmol)DIEA,活化3min,再加入455.04mg(1.2mmol)HBTU,将混合溶液加入到固相反应器中,搅拌反应1.5h,茚三酮检验呈阴性,DMF洗三次,DCM洗三次。
重复上述操作,依次连接Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、H-Pyr-OH,原料用量:氨基酸(1.2mmol),HBTU 455.04mg(1.2mmol),HOBt 162.12mg(1.2mmol)。实施例3:Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-二氯三苯甲基氯树脂的合成。
称取0.5g(0.30mmol)二氯三苯甲基氯树脂(取代值0.60mmol/g)置于加筛板的20ml BD注射器(或普通玻璃肽反应器),用3倍树脂体积的DCM溶胀两次,每次1小时,使树脂溶胀完全。用10ml DMF溶解519.48mg(1.2mmol)Fmoc-Arg(HCl)-OH,加入0.4ml(2.4mmol)DIEA,活化3min,将混合溶液加入到固相反应器中,搅拌反应2h,DMF洗三次,DCM洗三次。加入10ml DCM和800μl的甲醇封闭树脂,搅拌反应30min,DCM洗涤3次,抽干得到Fmoc-Arg(HCl)-二氯三苯甲基氯树脂。
将Fmoc-Arg(HCl)-二氯三苯甲基氯树脂装入固相反应器中,DMF洗两次,用20%(v/v)哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护基2次,时间分别为5min和20min,DMF洗涤3次,茚三酮法检验。用10ml DMF溶解424.08mg(1.2mmol)Fmoc-Leu-OH和162.12mg(1.2mmol)HOBt,冰浴10min,加入0.4ml(2.4mmol)DIEA,活化3min,再加入455.04mg(1.2mmol)HBTU,将混合溶液加入到固相反应器中,搅拌反应1.5h,茚三酮检验呈阴性,DMF洗三次,DCM洗三次。
重复上述操作,连接氨基酸Fmoc-D-Ser(tBu)-OH。原料用量:Fmoc-D-Ser(tBu)-OH460.08mg(1.2mmol),HBTU 455.04mg(1.2mmol),HOBt 162.12mg(1.2mmol)。
实施例4:H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH的制备
配制10ml裂解试剂,将三氟乙酸、三异丙基硅烷、水按体积比95:2.5:2.5混合,置于冰箱中。将Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-二氯三苯甲基氯树脂装入到固相反应器中,加入预冷的裂解试剂,反应4h。过滤树脂,收集滤液。将滤液逐滴滴入50ml冰乙醚中,出现沉淀。5℃,4000rpm离心十分钟,重复用冰乙醚洗涤三次,得到五肽H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH 202.2mg(0.288mmol),累积产率为96%。
实施例5:H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-NHEt的制备
配制10ml裂解试剂,按照三氟乙酸和DCM体积比1:99混合,置于冰箱中。将Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-二氯三苯甲基氯树脂装入到固相反应器中,加入预冷的裂解试剂,反应2h。过滤树脂,收集滤液。将滤液逐滴滴入50ml冰乙醚中,出现沉淀。5℃,4000rpm离心10min,重复用冰乙醚洗涤三次,得到三肽180.5mg,产率为92%。
将180.5mg(0.28mmol)三肽加入100ml的圆底烧瓶中,用10ml DMF溶解,加入214.8mg(1.2mmol)Pro-NHEt·HCl和162.12mg(1.2mmol)HOBt,冰浴10min,加入0.4ml(2.4mmol)DIEA,再加入455.04mg(1.2mmol)HBTU,通入氮气,反应4h。将反应液缓慢加入50ml冰水中,出现白色沉淀。5℃,4000rpm离心10min,重复用纯水洗涤三次,干燥后得到四肽Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-NHEt。
将四肽Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-OH加入100ml的圆底烧瓶,用7.5ml DMF溶解,冰浴10min后,加入2.5ml哌啶,反应30min。将反应液逐滴滴入50ml冰乙醚中,出现沉淀。静置半小时后,5℃,4000rpm离心10min,重复用冰乙醚洗涤三次,得到四肽H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-NHEt 141.0mg(0.243mmol),累积产率为81%。
实施例6:H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-NHEt粗肽的制备
称取五肽189.1mg(0.27mmol)H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH放入100ml的圆底烧瓶中,加入10ml DMF溶解,再加入90μl(0.54mmol)DIEA,162.12mg(0.27mmol)HOBt和0.042ml(0.27mmol)DIC,冰浴活化30min后,加入四肽(141.0mg,0.243mmol)H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-NHEt的DMF溶液,搅拌反应4h。将反应液逐滴滴入50ml冰乙醚中,出现白色沉淀。静置半小时后,5℃,4000rpm离心10min,重复用冰乙醚洗涤三次,得到布舍瑞林粗肽353mg,纯度>77.8%,累积总收率>73.8%(即从实施例1至本实施例的制备过程的总收率)。
实施例7:H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt纯肽的制备
将布舍瑞林粗品溶于醋酸水溶液中,过滤后经过HPLC纯化,色谱柱:纳微Unips10-300:洗脱液A:0.5%(v/v)醋酸/H2O,洗脱液B:100%乙腈,梯度洗脱,B:5%~40%,时间为40min;检测波长为220nm,收集组分,浓缩,冻干,获得纯品布舍瑞林156mg,累积总收率为42%(即从实施例1至本实施例的累积总收率),纯度>99.0%。