KR101971417B1 - 부세렐린의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 부세렐린(Buserelin)의 제조 방법에 관한 것으로 고체상(solid-phase) 합성 방법과 액상(solution-phase) 합성 방법을 병행 실시하여 선형 펩타이드를 제조한 후 수소반응을 수행하여 부세렐린을 수득한다. 본 발명의 제조 방법은 고상반응, 수렴반응, 수소반응을 순차적으로 적용함으로써 반응이 종료된 후 목적물의 분리 및 정제가 용이하며, 이는 부세렐린의 상업적 대량 생산에 적합하다.

Description

부세렐린의 제조 방법{Process for the Preparation of Buserelin}
본 발명은 부세렐린의 제조 방법에 관한 것이다.
부세렐린(Buserelin)은 테스토스테론의 억제가 필요한 전립선암의 치료제로 호르몬성 항암제이다.
부셀렐린의 합성방법에는 수렴형 합성 방법과 액상 합성 방법이 있다. 수렴형 합성법은 아미노산 서열을 고체 지지체(Resin)에 부착시켜 조립을 완료한 후에 상기 지지체로부터 서열을 유리한 다음 액상반응을 통해 부셀렐린을 제조하는 방법이다. 이 방법은 반응속도가 빠르고 부산물이 적고 또한 자동화가 용이하다는 장점이 있으나 과량의 원료를 사용해야 하는 단점이 있다.
반면, 액상 합성 방법은 통상의 유기 합성 방법으로서 시약과 재료의 비용이 적게 드는 장점이 있지만 반응 단계수가 많고 각 단계별로 중간체를 유리해야 하고 또한 이성체가 생길 가능성이 있어 정제가 어려운 단점이 있다.
부세렐린을 제조하기 위한 종래의 제조 방법은 다음과 같다.
미국특허 제 6,448,031은 액체상 합성방법으로 부세렐린을 제조하는 기술을 기재하고 있다. 그러나 상기 제조 방법은 제조 단계수가 많고 최종공정에서는 산업적으로 이용치 못한 시약을 사용하는 등 제조공정이 까다로울 뿐만 아니라 제조 수율이 낮아 상업적 대량 생산 시 가격적 경쟁력이 떨어진다는 단점이 있다.
미국특허 제 6,897,289은 고상반응으로 각 아미노산을 순차적으로 결합시킨 후 레진을 제거하고 수렴 반응을 통해 부세렐린을 제조하는 기술을 기재하고 있다. 그러나 이 제조 방법의 경우, 보호기가 제거된 상태로 반응을 진행함으로써 불순물이 다수 생성되어 정제가 어렵다는 단점이 있다.
국제특허 2006/119388 에는 부세렐린 제조 시 수렴형 합성법을 적용하고 최종적으로 수소 반응을 진행하였다. 그러나 일부 보호화된 고가의 아미노산 사용의 문제점과 고상 반응 시 프롤린을 첫 번째 아미노산으로 사용함으로써 불순물의 생성이 용이하다는 단점이 있다.
이상에서 언급한 바와 같이 부세렐린의 제조를 위한 종래의 기술들의 경우, 상업적 대량 생산에의 적용에 있어 개선되어야 하는 많은 문제점들을 내포하고 있다. 따라서 부세렐린을 효과적으로 제조하는 방법에 대한 연구는 펩타이드 API 생산에 매우 중요한 개발 과제라 할 수 있다.
본 발명자들은 부세렐린을 안정적으로 대량 생산하기 어려운 문제점을 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고체상(solid-phase) 합성 방법과 액상(solution-phase) 합성 방법을 결합한 후 펩타이드의 탈 보호화 반응 및 수소 반응을 수행함으로써 부세렐린을 안정적으로 대량 생산할 수 있다는 사실을 규명하고 새로운 부세렐린의 제조 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 신규한 부세렐린의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 양태는 다음의 단계를 포함하는 부세렐린(buserelin)의 제조 방법에 관한 것이다:
(a) 고체상(solid-phase) 합성 방법으로 레진이 부착된 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
(b) 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드에서 레진을 제거하여 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
(c) 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 액상(solution-phase) 합성 방법으로 H-Pro-NHEt·HCl와 결합 반응을 수행하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
(d) 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드에 대하여 탈보호화 반응을 수행하여 하기 화학식 Ⅳ으로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; 및
(e) 화학식 Ⅳ로 표시되는 펩타이드를 수소 반응시켜 하기 화학식 ⅴ로 표시되는 부세렐린을 얻는 단계.
[화학식 I]
Pyr-His(R1)-Trp-Ser(R2)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R3)-O-레진
[화학식 Ⅱ]
Pyr-His(R1)-Trp-Ser(R2)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R3)-OH
[화학식 Ⅲ]
Pyr-His(R1)-Trp-Ser(R2)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R3)-Pro-NHEt
[화학식 IV]
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R3)-Pro-NHEt
[화학식 ⅴ]
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt
상기 화학식 I 내지 화학식 Ⅲ에서,
R1은 수소 또는 이미다졸 보호기이고,
R2는 수소 또는 수산기 보호기이며,
R3은 구아니딘 보호기이다.
약어의 정리
본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어 위원회 (Commission of Biochemical Nomenclature) 에서 권장하는 용어에 기초한다 (Biochemistry, 11:1726-1732(1972); Pure & Appl. Chem., Vol. 56, No. 5, pp. 595-624, 1984).
본 명세서에서 사용한 보호기 및 아미노산의 약어는 다음과 같다:
tBu: 터트-부틸(tert-Butyl)
Fmoc: 9-플루오레닐옥시카보닐 (9-Fluorenyloxycarbonyl)
Trt: 트리페닐메틸(또는 트리틸) (Triphenylmethyl or Trityl)
Mtt: 4-메틸트리틸(4-Methyl trityl)
Bzl: 벤질(Benzyl)
Arg: 아르기닌(Arginine)
Pro: 프롤린(Proline)
Leu: 루신(Leucine)
Ser: 세린(Serine)
D-Ser: 디-세린(D-Serine)
Tyr: 타이로신(Tyrosine)
Trp: 트립토판(Tryptophan)
His: 히스티딘(Histidine)
Pyr: 피로클루탐산(Pyroglutamic acid)
상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R1은 당업계에서 통상적으로 이용하는 이미다졸 보호기일 수 있으며, 예를 들어, 수소(H) 또는 4-메틸트리틸(4-Methyl trityl)기일 수 있다.
상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R2는 당업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 수산기 보호기일 수 있다.
상기 수산기 보호기는 트리페닐메틸(triphenylmethyl) 또는 벤질(benzyl)기일 수 있다.
상기 화학식 Ⅰ 내지 IV에서 R3은 당업계에서 통상적으로 이용하는 구아니딘 보호기일 수 있으며, 예를 들어, 구아니딘 보호기는 수소(H), 염산(hydrochloric acid) 또는 니트로(NO2)기일 수 있다.
상기 작용기에 대한 보호기는 Protecting Groups in Organic Synthesis (Greene and Wuts, John Wiley & Sons, 1991)에 상세히 기재되어 있다.
본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명의 제조 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
(a) 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드의 수득
화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드는 당업계에서 통상적으로 사용하는 고체상 (solid- phase) 합성 방법에 의해 제조된다 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem . Soc., 85:2149-2154(1963), Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P.I., Anal. Biochem., 34:595-598(1970)).
즉, 알파-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후, 알파-아미노 보호기를 제거하고 남은 알파-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 결합하여 중간체를 얻는다.
적절한 보호기의 선택은 보호되는 작용기, 보호기가 노출되는 조건 및 그 분자 내에 존재할 수 있는 다른 작용기에 따라 달라진다. 보호기는 합성 각 단계에서 알파-아미노 보호기를 제거하기 위해 선택한 반응조건 및 시약에 대해 안정해야 하고, 결합반응에서 탈 보호화 반응이 일어나지 않아야 하며, 원하는 아미노산 사슬을 포함하는 합성이 완결되었을 때 레진과의 분해 조건에서 안정하여야 한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 화학식 Ⅰ의 펩타이드를 합성하는 과정에서 레진을 사용한다.
상기 레진은 제조된 펩타이드의 측쇄 보호기를 완전히 보존시킬 수 있는 온화한 산성조건하에서 쉽게 분해될 수 있는 통상적인 레진을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 2-클로로트리틸(2-chlorotrityl) 레진, 트리틸(trityl) 레진, 4-메틸트리틸(4-methyl trityl) 레진 및 4-메톡시트리틸(4-methoxy trityl) 레진로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 레진일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(b) 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드의 수득
상기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드는 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드로부터 온화한 산성조건하에서 레진을 제거하여 얻을 수 있다.
상기 산성조건은 아미노산 사슬의 측쇄 보호기가 유지될 수 있는 온화한 조건이어야 한다.
상기 레진의 제거는 디클로로메탄, 아세트산 및 트리플루오로에탄올의 혼합 용액을 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어, 디클로로메탄 : 아세트산 : 트리플루오로에탄올 = 8 : 1 : 1(부피비)로 혼합한 용액을 이용하여 수행할 수 있다.
(c) 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드의 수득
화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드는 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 H-Pro-NHEt·HCl와 결합 시약의 존재 하에서 액상반응을 수행하여 얻는다.
상기 결합 시약은 N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide: DCC), N,N'-디이소프로필 카르보디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide: DIC), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate: BOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(피롤이디노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(pyrrolidino)-phosphonium hexafluorophosphate: PyBOP), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-Benzotriazole-1,1,3,3-tetramethyluronium- hexafluorophosphate: HBTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트 (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-uronium tetrafluoroborate: TBTU), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate: HATU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(0-(7- Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate: TATU), N,N'-카보닐디이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole: CDI) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 히드로크롤라이드(N-(3-dimethylaminopropyl)-N`-ethylcarbodiimide hydrochloride: EDC.HCl)로 이루어진 군에서 선택적으로 사용할 수 있으며, 예를 들어, EDC.HCl일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 결합 액상반응은 유기용매에서 수행하는 것일 수 있다.
상기 유기용매는 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 클로로포름 및 N,N-디메틸포름아미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용매이며, 바람직하게는 디클로로메탄과 N,N-디메틸포름아미드의 혼합 용매일 수 있다.
상기 결합 반응은 -20℃ 내지 50℃, -20℃ 내지 40℃, -20℃ 내지 30℃, -20℃ 내지 20℃, -20℃ 내지 10℃, -20℃ 내지 4℃, -10℃ 내지 50℃, -10℃ 내지 40℃, -10℃ 내지 30℃, -10℃ 내지 20℃, -10℃ 내지 10℃, -10℃ 내지 4℃, 0℃ 내지 50℃, 0℃ 내지 40℃, 0℃ 내지 30℃, 0℃ 내지 20℃ 또는 0℃ 내지 10℃일 수 있으며, 예를 들어, 0℃ 내지 4℃일 수 있다.
상기 결합 반응을 0℃ 내지 4℃의 저온에서 실시하는 경우, 불순물 생성을 줄일 수 있다.
(d) 화학식 Ⅳ로 표시되는 펩타이드의 수득
화학식 Ⅳ로 표시되는 펩타이드는 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드에 대하여 산성 조건하에서 탈 보호화 반응을 수행하여 얻을 수 있다.
상기 탈 보호화 반응은 디클로로메탄, 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산의 혼합 용액 하에서 수행할 수 있다.
(e) 부세렐린의 수득
부세렐린은 화학식 Ⅳ로 표시되는 펩타이드로부터 당업계에서 통상적으로 이용하는 반응 조건하에서 수소 반응을 수행하여 얻을 수 있다.
상기 수소 반응은 촉매로서 H2/Pd(5% Palladium carbon in H2 Gas)를 사용하여 수행할 수 있다.
상기 내용을 바탕으로 부세렐린을 제조하는 전체 공정을 정리하면 다음과 같다.
[반응식 1]
Figure 112017063233818-pat00001
본 발명은 부세렐린의 제조 방법에 관한 것으로, 고체상(solid-phase) 합성과 액상(solution-phase) 반응을 결합한 후, 펩타이드의 탈 보호화 반응 및 수소 반응을 수행하여 부세렐린을 수득함으로써, 반응이 종료된 후 목적물의 분리 및 정제가 용이하며, 상업적 대량 생산이 가능하다는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 부세렐린을 제조하는 전체 공정을 나타낸 모식도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 거쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 한 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1: 화학식 Ⅵ로 표시되는 펩타이드의 제조
[화학식 Ⅵ]
Pyr-His(Mtt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-O-레진
1-1. H- Arg (NO 2 )-2- Chlorotrityl 레진의 제조
반응조에 2-클로로트리틸클로라이드 레진 47.2 g(치환율 1.27 mmole/g 기준)을 투입하였다. 399.0 g의 디클로로메탄(이하 DCM)을 투입한 다음 30분 동안 교반하여 스웰링(swelling)하고 DCM을 완전히 드레인(drain)하였다.
523.0 g Fmoc-Arg(NO2)에 399.0 g DCM을 투입하여 용해하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(이하 DIEA) 23.3 g을 위의 용액에 넣어 완전히 용해한 후 레진이 들어있는 반응조에 서서히 투입하여 4시간 동안 25±5℃에서 교반하였다. 반응액을 완전히 배출한 다음 399.0 g DCM을 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다.
레진을 399.0 g DCM을 투입하여 추가적으로 1회 더 세척하고 DCM /메탄올(이하 MeOH)/DIEA(17:2:1(V/V/V%))(255.0 mL(339.2 g)/30.0 mL(23.8 g)/15.0 mL(11.1 g))을 투입하여 10분 동안 25±5℃에서 교반 후 용액을 드레인하였다. 레진을 추가적으로 1회 더 DCM/MeOH /DIEA(17:2:1(V/V/V%))(255.0 mL(339.2 g)/30.0 mL(23.8 g)/15.0 mL(11.1 g))을 투입하여 동일하게 처리하였다. 399.0 g DCM을 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 399.0 g DCM을 사용하여 레진을 1회 더 반복하여 세척하고 완전히 드레인하였다. 이어서 283.2 g N,N-디메틸포름아미드(이하 DMF)을 투입하고 2분 동안 교반 후 드레인한 다음 283.2 g DMF로 동일하게 레진을 2회 추가 세척하였다. 20%(V/ V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g)/DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 투입하고 15분 동안 교반하여 드레인한 다음, 20%(V/ V% ) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g)/DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 1회 더 반복 처리하였다. 반응액을 완전히 배출하고 283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 5회 더 세척하여 준 다음, 다음 과정을 수행하였다(수율 >98%).
1-2. H-Leu-Arg(NO 2 )-2-Chlorotrityl 레진의 제조
31.8 g Fmoc-Leu/13.4 g 1-히드록시벤조트리아졸(이하 HOBt)을 DMF, 240.7 g에 용해하여 반응조에 투입하였다. 11.4 g N,N'-디이소프로필카르보디이미드(이하 DIC)액을 DMF 29.2 g에 희석하여 투입한 다음 25±5℃에서 4시간 동안 교반하였다. 닌히드린(이하 Ninhydrin) 시험을 실시하여 반응의 진행 여부를 확인한 다음 반응이 완결되었으면 반응액을 완전히 드레인하였다.
283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 1회 더 세척하였다. 20%(V/ V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g)/DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 투입한 다음 15분 동안 교반하고 드레인한 다음, 20%(V/V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g)/DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 1회 더 반복 처리하였다. 반응액을 완전히 배출하고 283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 5회 더 세척한 다음, 다음 과정을 수행하였다(수율 >98%).
1-3. H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO 2 )-2-Chlorotrityl 레진의 제조
34.5 g Fmoc-D-Ser(tBu)/13.4 g HOBt를 DMF 240.7 g에 용해하여 반응조에 투입하였다. 11.4 g DIC액을 DMF 29.2 g에 희석하여 투입한 다음 25±5℃에서 4시간 동안 교반하였다. Ninhydrin 시험을 실시하여 반응의 진행 여부를 확인한 다음 반응이 완료되었으면 반응액을 완전히 드레인하였다.
283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 1회 더 세척하였다. 20%(V/ V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g)/DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 투입한 다음 15분 동안 교반하고 드레인한 다음, 20%(V/V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g)/DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 1회 더 반복 처리하였다. 반응액을 완전히 배출하고 283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 5회 더 세척하여 준 다음, 다음 과정을 수행하였다(수율 >98%).
1-4. H-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO 2 )-2-Chlorotrityl 레진의 제조
36.3 g Fmoc-Tyr/13.4 g HOBt를 DMF 240.7 g에 용해하여 반응조에 투입하였다. 11.4 g DIC액을 DMF 29.2 g에 희석하여 투입한 다음 25±5℃에서 4시간 동안 교반하였다. Ninhydrin 시험을 실시하여 반응의 진행 여부를 확인한 다음 반응이 완료되었으면 반응액을 완전히 드레인하였다.
283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 1회 더 세척하였다. 20%(V/ V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g)/DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 투입한 다음 15분 동안 교반하고 드레인한 다음, 20%(V/V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g)/DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 1회 더 반복 처리하였다. 반응액을 완전히 배출하고 283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 5회 더 세척한 다음, 다음 과정을 수행하였다(수율 >98%).
1-5. H- Ser ( Trt )- Tyr -D- Ser ( tBu )-Leu- Arg (NO 2 )-2- Chlorotrityl 레진의 제조
51.32 g Fmoc-Ser(Trt)/13.4 g HOBt를 DMF 240.7 g에 용해하여 반응조에 투입하였다. 11.4 g DIC액을 DMF 29.2 g에 희석하여 투입한 다음 25±5℃에서 4시간 동안 교반하였다. Ninhydrin 시험을 실시하여 반응의 진행 여부를 확인한 다음 반응이 완결되었으면 반응액을 완전히 드레인하였다.
283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 1회 더 세척하였다. 20%(V/ V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g)/DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 투입한 다음 15분 동안 교반하고 드레인한 다음, 20%(V/V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g)/DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 1회 더 반복 처리하였다. 반응액을 완전히 배출하고 283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 5회 더 세척한 다음, 다음 과정을 수행하였다(수율 >98%).
1-6. H-Trp- Ser ( Trt )- Tyr -D- Ser ( tBu )-Leu- Arg (NO 2 )-2- Chlorotrityl 레진의 제조
38.4 g Fmoc-Trp/13.4 g HOBt를 DMF 240.7 g에 용해하여 반응조에 투입하였다. 11.4 g DIC액을 DMF 29.2 g에 희석하여 투입한 다음 25±5℃에서 4시간 동안 교반하였다. Ninhydrin 시험을 실시하여 반응의 진행 여부를 확인한 다음 반응이 완결되었으면 반응액을 완전히 드레인하였다.
283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 1회 더 세척하였다. 20%(V/ V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g)/DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 투입한 다음 15분 동안 교반하고 드레인한 다음, 20%(V/V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g) /DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 1회 더 반복 처리하였다. 반응액을 완전히 배출하고 283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 5회 더 세척한 다음, 다음 과정을 수행하였다(수율 >98%).
1-7. H-His( Mtt )-Trp- Ser ( Trt )- Tyr -D- Ser ( tBu )-Leu- Arg (NO 2 )-2- Chlorotrityl 레진의 제조
57.0 g Fmoc-His(Mtt)/13.4 g HOBt를 DMF 240.7 g에 용해하여 반응조에 투입하였다. 11.4 g DIC액을 DMF 29.2 g에 희석하여 투입한 다음 25±5℃에서 4시간 동안 교반하였다. Ninhydrin 시험을 실시하여 반응의 진행 여부를 확인한 다음 반응이 완결되었으면 반응액을 완전히 드레인하였다.
283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 1회 더 세척하였다. 20%(V/ V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g)/DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 투입한 다음 15분 동안 교반하고 드레인한 다음, 20%(V/V%) 피페리딘 60.0 mL(51.7 g) /DMF 240.0 mL(226.6 g) 용액을 1회 더 반복 처리하였다. 반응액을 완전히 배출하고 283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 5회 더 세척한 다음, 다음 과정을 수행하였다(수율 >98%).
1-8. Pyr -His( Mtt )-Trp- Ser ( Trt )- Tyr -D- Ser ( tBu )-Leu- Arg (NO 2 )-2-Chlorotrityl 레진의 제조
11.6 g Pyr/13.4 g HOBt를 DMF 240.7 g에 용해하여 반응조에 투입하였다. 11.4 g DIC액을 DMF 29.2 g에 희석하여 투입한 다음 25±5℃에서 4시간 동안 교반하였다. Ninhydrin 시험을 실시하여 반응의 진행 여부를 확인한 다음 반응이 완료된 후 반응액을 완전히 드레인하였다.
283.2 g DMF를 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 283.2 g DMF를 사용하여 레진을 추가적으로 1회 더 세척하였다. 399.0 g DCM을 투입하고 2분 동안 교반한 후 드레인하였다. 399.0 g DCM를 사용하여 레진을 추가적으로 2회 더 세척하였다.
실시예 2: 화학식Ⅶ로 표시되는 펩타이드의 제조
[화학식 Ⅶ]
Pyr-His(Mtt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-OH
DCM/2,2,2-트리플루오로에탄올(이하 TFE)/초산(이하 AcOH) (8:1:1(V/V/V%))(600.0 mL(798.0 g))/75.0 mL(104.3 g)/750.0 mL(78.7 g)(Int J Pept Protein Res. 1991 Jun;37(6):513-20)을 투입하여 25±5℃에서 2시간 동안 교반 후 배출액을 다른 반응기로 이송하였다. DCM/TFE/AcOH(8:1:1(V/V/ V%))(120.0 mL(159.6 g))/15.0 mL(20.9 g)/15.0 mL(15.7 g)을 투입하여 25±5℃에서 5분 동안 교반 후 드레인 액을 다른 반응기로 이송하여 합하였다. 남아있는 레진을 199.5 g DCM으로 세척하고 드레인하여 레진 cleavage액과 합하였다. 모두 합한 반응액을 3552.0 g tert-Butyl methylether(이하 MTBE)에 투입 교반한 다음 고체를 결정화하여 여과하였다. 고체를 444.0 g MTBE를 넣어 교반 후 여과하였다. 이를 1회 더 진행한 후 건조하였다. 건조된 고체를 DCM/DMF (270.0 mL (359.1 g)/ 30.0 mL (28.3 g) 혼합용매에 녹였다.
MTBE 2700.0 mL(1998.0 g)에 녹인 혼합용매를 넣고 교반 후 석출된 고체를 여과하였다. 여과한 고체를 MTBE 300.0 mL(222.0 g)에 풀어서 교반 후 여과한 후 건조하였다.
건조된 고체를 DCM/DMF(270.0 mL (359.1 g)/30.0 mL (28.3 g) 혼합용매에 녹였다. MTBE 2700.0 mL(1998.0 g)에 녹인 혼합용매를 넣고 교반 후 석출된 고체를 여과하였다. 여과한 고체를 MTBE 300.0 mL (222.0 g)에 풀어서 교반 후 여과한 후 건조하였다. 그 결과로 화학식 Ⅶ로 표시되는 펩타이드 54.7 g(수율 >100%)을 수득하였다.
실시예 3: 화학식 Ⅷ으로 표시되는 펩타이드의 제조
[화학식 Ⅷ]
Pyr-His(Mtt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt
Pyr-His(Mtt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-OH 54.7 g을 반응조에 넣었다. 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(이하 HOAt) 8.2 g을 DCM 195.0 mL(259.4 g)/ DMF60.0 mL(56.6 g)에 용해하여 반응조에 투입하고 프롤린-에틸아마이드하이드로클로라이드(H-Pro-NHEtHCl) 10.7 g을 반응기에 투입하였다. 서서히 교반하면서 반응조를 0±5℃로 냉각하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이마이드 염산염(EDCHCl) 11.5 g을 DMF 45.0 mL (42.5 g)에 용해하여 반응조에 140분 동안 적가하였다.
적가가 완료되면 온도를 25±5℃로 올리고, 이 온도에서 Pyr-His(Mtt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-OH 이 최대 2.0% 이하로 존재할 때까지 반응시켰다. HPLC로 반응의 완결 여부를 확인하고 반응이 완결되었으면 반응액을 물 300.0 mL로 세척 후 DCM층을 분층하고, 10% NaCl 용액(NaCl 30.0 g, 정제수 300.0 g) 로 각 1회씩 세척 후 DCM층을 분리고 MTBE 1200.0 mL(888.0 g)에 투입하여 Pyr-His(Mtt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt를 석출시키고 분층하여 상층액을 제거하였다. 석출된 결정에 MTBE 155.0 mL(111.0 g) 를 적가하여 세척 후 분층하여 상층액을 제거하였다. 다시 석출된 결정에 MTBE 155.0 mL(111.0 g)을 적가하여 세척 후 여과하였다. 여과 완료 후 40±5oC에서 12시간 이상 감압 건조하여 Pyr-His(Mtt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt 56.2 g(수율 >100%)을 수득하였다.
실시예 4: 화학식 Ⅸ으로 표시되는 펩타이드의 제조
[화학식 Ⅸ]
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt
건조된 Pyr-His(Mtt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt 56.2 g을 반응기에 투입한 다음 DCM 750.0 mL(997.5 g)/ACN 750.0 mL(589.5 g)/TFA 30.0 mL (44.7 g)의 혼합액 1530.0 mL을 가하여 25±5℃에서 24시간 동안 교반하였다. 소량의 액을 취하여 터트-부틸메틸에테르로 결정화하고 HPLC로 분석하여 최종 Cleavage 여부를 확인하였다. 반응이 완결되면 MTBE 7500.0 mL (5550.0 g)에 적가하여 고체를 석출시켰다.
교반 후 분층하여 상층액을 제거하였다. MTBE 600.0 mL(444.0 g) 넣고 교반 후 분층하여 상층액을 제거하였다. 고체를 여과하여 40±5℃에서 12시간 이상 건조하였다.
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt 38.5 g을 수득하였다(수율 >90%).
실시예 5: 화학식 ⅴ으로 표시되는 부세렐린의 제조
[화학식 ⅴ]
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt
건조된 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt 38.5 g을 에탄올 900.0 mL(710.1 g)/H2O 600.0 mL(600.0 g)에 용해시켜 반응기에 투입한 다음 포름산(Formic acid) 60.0 mL(73.2 g)을 넣고 5% Pd(in carbon) 19.3 g을 넣은 후 수소를 통과시켜 2시간 교반하였다. 소량의 액을 취하여 터트-부틸메틸에테르로 결정화하고 HPLC로 분석하여 최종 Cleavage 여부를 확인하였다. 반응이 완결되면 반응액을 여과하여 5% Pd 을 제거하였다. Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt를 35.3 g을 수득하였다(수율 >90%, 순도 >70%).
정제 용매 A로 정제수(67500.0 mL(67500.0 g))/ACN)(7500.0 mL(5910.0 g))/AcOH 78.7 g를 넣어 조제하고, 정제 용매 B로 ACN(27000.0 mL(21210.0 g))/H2O 3000.0 mL(3000.0 g)/AcOH 31.5 g를 넣어 조제하였다. Crude 부세렐린을 농축한 후 35.3 g/600.0 mL H2O 0.45㎛ 필터로 여과하였다.
컬럼 온도는 실온, UV 파장 230 nm, 유속 100.0 mL/분의 조건으로 정제용매 A, B Gradient 조건으로 분리 정제하고 ACN을 농축 제거하였다.
농축액을 트레이에 이송하고 냉매를 순환하여 트랩의 온도를 -50℃로 세팅하고 5시간에 걸쳐 온도를 낮췄다. 트레이에서 제품액을 완전히 얼린 다음 진공펌프를 켜서 서서히 압력을 낮춘 다음 순차적으로 조정하여 약 3일 동안 건조하였다.
건조 완료 후 제품을 정제수 500.0 mL(500.0 g)에 용해하였다. 용해액을 0.2 μm 여과하고 트레이에 적재한다. 냉매를 순환하여 트랩의 온도를 -50℃로 세팅하고 5시간에 걸쳐 온도를 낮췄다. 트레이에서 제품액을 완전히 얼린 다음 진공펌프를 켜서 서서히 압력을 낮춘 다음 순차적으로 조정하여 약 3일 동안 건조하였다. 진공을 파기하고 샘플을 취하여 잔류용매, 수분 및 AcOH 함량을 측정(잔류용매, ACN < 410 ppm; 수분, < 4.0%; AcOH 함량, 3.0 - 7.0%)하였다. 규격이 맞지 않으면 진공을 걸어 계속 건조시켰다. IPC 결과 잔류용매, 수분, AcOH 함량이 규격 이내이면 꺼내어 최종 포장 및 시험 분석하였다. 최종 동결건조 진행하여 10.4 g의 초산 부세렐린을 수득하였다(동결건조 수율 >90%) (총 수율 >28%).
<110> ANYGEN CO., LTD. <120> Process for the Preparation of Buserelin <130> PN170175 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Buserelin <220> <221> SITE <222> (1) <223> Pyroglutamic acid <220> <221> SITE <222> (6) <223> D-Serine <220> <221> SITE <222> (6) <223> (tert-Butyl) <220> <221> SITE <222> (9) <223> -NHEt <400> 1 Glu His Trp Ser Tyr Ser Leu Arg Pro 1 5

Claims (12)

  1. 다음의 단계를 포함하는 부세렐린(buserelin)의 제조 방법:
    (a) 고체상(solid-phase) 합성 방법으로 레진이 부착된 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
    (b) 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드에서 레진을 제거하여 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
    (c) 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 액상(solution-phase) 합성 방법으로 H-Pro-NHEt·HCl와 결합 반응을 수행하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
    (d) 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드에 대하여 탈보호화 반응을 수행하여 하기 화학식 Ⅳ으로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; 및
    (e) 화학식 Ⅳ로 표시되는 펩타이드를 수소 반응시켜 하기 화학식 ⅴ로 표시되는 부세렐린을 얻는 단계.
    [화학식 I]
    Pyr-His(R1)-Trp-Ser(R2)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R3)-O-레진
    [화학식 Ⅱ]
    Pyr-His(R1)-Trp-Ser(R2)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R3)-OH
    [화학식 Ⅲ]
    Pyr-His(R1)-Trp-Ser(R2)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R3)-Pro-NHEt
    [화학식 IV]
    Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R3)-Pro-NHEt
    [화학식 ⅴ]
    Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt
    상기 화학식 I 내지 화학식 Ⅲ에서, R1은 수소(H) 또는 4-메틸트리틸(4-Methyl trityl)기이고,
    상기 화학식 I 내지 화학식 Ⅲ의 R2는 수소(H), 트리페닐메틸(triphenylmethyl) 및 벤질(benzyl)기로 이루어진 군에서 선택되며,
    상기 화학식 I 내지 화학식 IV의 R3은 수소(H) 및 니트로(NO2)기로 이루어진 군에서 선택된다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 레진은 2-클로로트리틸(2-chlorotrityl) 레진, 트리틸(trityl) 레진, 4-메틸트리틸(4-methyl trityl) 레진 및 4-메톡시트리틸(4-methoxy trityl) 레진으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 부세렐린의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 레진의 제거는 산성 용액의 존재 하에서 실시하는 것인, 부세렐린의 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 산성 용액은 디클로로메탄(dichloromethane), 아세트산(acetic acid) 및 트리플루오로에탄올(trifluoroethyl alcohol)로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 혼합용액인 것인, 부세렐린의 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 산성 용액은 디클로로메탄(dichloromethane) : 아세트산(acetic acid) : 트리플루오로에탄올(trifluoroethyl alcohol)의 부피비가 8:1:1인 혼합용액인 것인, 부세렐린의 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 결합 반응은 N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide: DCC), N,N'-디이소프로필 카르보디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide: DIC), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate: BOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(피롤이디노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(pyrrolidino)-phosphonium hexafluorophosphate: PyBOP), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-Benzotriazole-1,1,3,3-tetramethyluronium- hexafluorophosphate: HBTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트 (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-uronium tetrafluoroborate: TBTU), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate: HATU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(0-(7- Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate: TATU), N,N'-카보닐디이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole: CDI) 및 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 히드로크롤라이드(N-(3-dimethylaminopropyl)-N`-ethylcarbodiimide hydrochloride: EDC.HCl)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 결합 시약을 이용하는 것인, 부세렐린의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 디클로로메탄(dichloromethane), 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane), 클로로포름(chloroform) 및 N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에서 수행하는 것인, 부세렐린의 제조 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 결합 반응은 -20℃ 내지 50℃에서 수행하는 것인, 부세렐린의 제조 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 수소 반응은 물 및 에탄올의 혼합 용매에서 수행하는 것인, 부세렐린의 제조 방법.
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