KR20150114111A

KR20150114111A - 데스모프레신의 제조방법

Info

Publication number: KR20150114111A
Application number: KR1020140037939A
Authority: KR
Inventors: 김재일; 김종민; 전용국; 김대영; 박진석
Original assignee: 애니젠 주식회사
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2015-10-12
Also published as: KR101658942B1; WO2015152565A1

Abstract

본 발명은 고체상(solid-phase) 합성 방법 및 액상(solution-phase) 합성 방법으로 펩타이드를 합성한 후 유기용매 내에서 이황화 결합 형성 반응을 실시하는 신규한 데스모프레신 제조방법을 제공한다. 본 발명은 고체상 합성 반응과 액상 반응을 실시한 후 펩타이드의 이황화 결합 형성 반응을 유기용매 내에서 수행하므로, 반응이 종료된 후 목적물의 분리 및 정제가 용이하여 상업적 대량 생산이 가능하다. 또한, 본 발명은 당업 기술분야에서 이용되는 방법으로 합성된 지코노티드 보다 수율 및 순도가 개선되어 생산비용 측면에서 경제적 효과가 있다.

Description

데스모프레신의 제조방법{Process for the Preparation of Desmopressin}

본 발명은 신규한 데스모프레신의 제조방법에 관한 것이다.

바소프레신의 합성 유사체인 초산 데스모프레신은 항 이뇨 호르몬이다. 그러나 바소프레신과는 달리 약물작용 시간이 길고 항 이뇨 효과가 강하며 심혈관계 수축 작용은 없다. 이 약물은 소아의 일차성 야뇨증뿐만 아니라 성인의 야간뇨의 상당 부분 원인을 차지하는 야간다뇨에 효과적으로 작용한다.

데스모프레신의 합성방법에는 고체상 합성 방법과 액상 합성 방법이 있다. 고체상 합성 방법에는 아미노산 서열을 고체 지지체(Resin)에 부착시켜 조립을 완료한 후에 상기 지지체로부터 서열을 유리한다. 이 방법은 반응속도가 빠르고 부산물이 적고 또한 자동화가 용이하다는 장점이 있으나 과량의 원료를 사용해야 하는 단점이 있다. 반면 액상 합성 방법은 통상의 유기 합성 방법으로서 시약과 재료의 비용이 적게 드는 장점이 있지만 반응 단계수가 많고 각 단계별로 중간체를 유리해야 하고 또한 이성체가 생길 가능성이 있어 정제가 어려운 단점이 있다.

데스모프레신을 제조하기 위한 종래의 제조방법은 다음과 같다.

미국특허 제 3,497,491은 액체상 합성방법으로 데스모프레신 펩타이드를 제조하는 기술을 기재하고 있다. 그러나 상기 제조방법은 제조 단계수가 많고 최종공정에서는 산업적으로 이용 불가능한 시약을 사용하는 등 제조공정이 까다로울 뿐만 아니라 제조 수율이 낮아 상업적 대량 생산 시 가격적 경쟁력이 떨어진다는 단점이 있다.

미국특허 제 5,200,507은 터트-부틸카보닐 보호화 합성기술로 각 아미노산을 순차적으로 결합시키는 방법으로 데스모프레신 펩타이드를 제조하는 기술을 기재하고 있다. 그러나 이 방법의 경우, 터트-부틸카보닐 보호기를 제거 시 상업적 대량 생산에 적용이 어려운 불산(Hydrogen Fluoride)을 각 단계마다 사용해야 하는 단점이 있다.

미국특허 20060148699 A1에는 데스모프레신 펩타이드 제조 시 고가의 링크 아미드 레진을 사용하고, 이황화 결합의 형성반응은 물에서 수행하므로 반응이 종료된 후 물과 무기염을 제거하는 공정이 쉽지 않아 목적물의 분리 및 정제가 어렵게 되어, 상업적 대량 생산의 적용에는 많은 제한이 있다.

이상에서 언급한 바와 같이 데스모프레신 펩타이드의 제조를 위한 종래의 기술들의 경우, 상업적 대량 생산에의 적용에 있어 개선되어야 하는 많은 문제점들을 내포하고 있다. 따라서 데스모프레신 펩타이드를 효과적으로 제조하는 방법에 대한 연구는 의약 산업에 있어서 매우 중요한 개발 과제라 할 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 데스모프레신을 안정적으로 대량 생산하기 어려운 문제점을 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고체상(solid-phase) 합성 방법과 액상(solution-phase) 합성 방법을 병행 실시하여 선형 펩타이드를 제조한 다음 펩타이드의 이황화 결합 형성 반응을 유기용매 내에서 실시하면 데스모프레신을 효율적으로 생산할 수 있다는 사실을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 신규한 데스모프레신의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 다음 단계를 포함하는 데스모프레신의 제조방법을 제공한다:

(a) 고체상(solid-phase) 합성 방법으로 레진이 부착된 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)에서 수득한 펩타이드에서 레진을 제거하여 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계;

(c) 상기 단계 (b)에서 수득한 펩타이드를 액상(solution-phase) 합성 방법으로 H-Gly-NH₂·HCl과 결합반응을 수행하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계;

(d) 상기 단계 (c)에서 수득한 펩타이드를 이용하여 유기용매 내에서 이황화 결합 형성 반응을 실시하여 하기 화학식 IV으로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계; 및

(e) 상기 단계 (d)에서 수득한 펩타이드에서 탈보호화 반응을 실시하여 화학식 V로 표시되는 데스모프레신을 수득하는 단계.

화학식 Ⅰ

Mpr(R¹)-Tyr(R²)-Phe-Gln(R³)-Asn(R³)-Cys(R¹)-Pro-D-Arg(R⁴)-O-레진

화학식 Ⅱ

Mpr(R¹)-Tyr(R²)-Phe-Gln(R³)-Asn(R³)-Cys(R¹)-Pro-D-Arg(R⁴)-OH

화학식 Ⅲ

Mpr(R¹)-Tyr(R²)-Phe-Gln(R³)-Asn(R³)-Cys(R¹)-Pro-D-Arg(R⁴)-Gly-NH₂

화학식 Ⅳ

화학식 Ⅴ

상기 화학식에서, R¹은 티올 보호기, R²는 수소 또는 수산기 보호기, R³는 수소 또는 아미드 보호기, R⁴는 구아니딘 보호기이다.

본 발명자들은 데스모프레신을 안정적으로 대량 생산하기 어려운 문제점을 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고체상(solid-phase) 합성 방법과 액상(solution-phase) 합성 방법을 병행 실시하여 선형 펩타이드를 제조한 다음 펩타이드의 이황화 결합 형성 반응을 유기용매 내에서 실시하면 데스모프레신을 효율적으로 생산할 수 있다는 사실을 규명하였다.

약어의 정리

본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어 위원회(Commission of Biochemical Nomenclature)에서 권장하는 용어에 기초한다(Biochemistry, 11: 1726-1732(1972); Pure & Appl. Chem., Vol.56, No.5, pp.595-624,1984).

본 명세서에서 사용한 보호기 및 아미노산의 약어는 다음과 같다:

t-Bu: 터트-부틸(tert-Butyl)

Fmoc: 9-플루오레닐옥시카보닐(9-Fluorenyloxycarbonyl)

Trt: 트리페닐메틸(또는 트리틸)(Triphenylmethyl or Trityl)

Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐(2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl)

Pmc: 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulphonyl)

Mtr: 4-메톡시-2,3,6-트리메틸페닐-설포닐 (4-methoxy-2,3,6-trimethylphenyl-sulfonyl)

Tos: 파라-톨루엔설포닐(p-Toluenesulfonyl)

D-Arg: D-아르기닌(D-Arginine)

Gly: 글리신(Glycine)

Pro: 프롤린(Proline)

Cys: 시스테인(Cysteine)

Asn: 아스파라긴(Asparagine)

Gln: 글루타민(Glutamine)

Phe: 페닐알라닌(Phenylalanine)

Tyr: 타이로신(Tyrosine)

Mpr: 머캡토프로피온산(Mercaptopropionic acid)

상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R¹은 당 업계에서 통상적으로 이용하는 티올 보호기이다. 바람직하게는, 상기 티올 보호기는 터트-부틸, 벤조일, 트리틸, 벤질, 파라-메톡시벤질, 벤질옥시카보닐, 파라-니트로벤질, 디페닐메틸, 트리페닐메틸기 또는 아세트아미노메틸기이며, 가장 바람직하게는 트리페닐메틸기이다.

상기 화학식 Ⅰ 내지 IV에서 R²은 당 업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 수산기 보호기가 될 수 있다. 바람직하게는, 상기 수소 또는 수산기 보호기는 파라-메톡시벤질기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 테트라히드로피란기, 테트라히드로퓨란기, 터트-부틸기, 트리페닐메틸기, 2-클로로트리틸기, 벤질기, 알릴기, 터트-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 터트-부틸카르보닐기, 아세틸기 또는 벤조일기이고, 보다 바람직하게는 터트-부틸기 또는 트리페닐메틸기 이며, 가장 바람직하게는 수산기 보호기가 터트-부틸기인 것이다.

상기 화학식 Ⅰ 내지 IV에서 R³은 당 업계에서 통상적으로 이용하는 ε-아미노 보호기이다. 바람직하게는, 상기 ε-아미노 보호기는 터트-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, 터트-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기 또는 트리이소프로필실릴기이고, 보다 바람직하게는 터트-부틸옥시카보닐기 또는 벤질옥시카보닐기이며, 가장 바람직하게는 터트-부틸옥시카보닐기이다.

상기 화학식 Ⅰ 내지 IV에서 R⁴은 당 업계에서 통상적으로 이용하는 구아니딘 보호기이다. 바람직하게는, 상기 구아니딘 보호기는 터트-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, 터트-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 니트로기, Pmc(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulphonyl), Mtr((4-methoxy-2,3,6-trimethylphenyl)sulfonyl), Pbf, Tos(p-toluenesulfonyl) 이고, 보다 바람직하게는 Pbf 또는 Mtr기 이며, 가장 바람직하게는 Pbf기 이다.

상기 작용기에 대한 보호기는 Protecting Groups in Organic Synthesis (Greene and Wuts, John Wiley & Sons, 1991)에 상세히 기재되어 있다.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 제조방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드의 수득

화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드는 당 업계에서 통상적으로 사용하는 고체상 (solid-phase) 합성 방법에 의해 제조된다(Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154(1963), Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C.D., Cook, P. I., Anal. Biochem., 34:595-598(1970)). 즉, 알파-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후, 알파-아미노 보호기를 제거하고 남은 알파-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 결합하여 중간체를 얻는다.

적절한 보호기의 선택은 보호되는 작용기, 보호기가 노출되는 조건 및 그 분자 내에 존재할 수 있는 다른 작용기에 따라 달라진다. 보호기는 합성 각 단계에서 (ⅰ) 알파-아미노 보호기를 제거하기 위해 선택한 반응조건 및 시약에 대해 안정해야 하고, (ⅱ) 결합반응에서 탈 보호화 반응이 일어나지 않아야 하며, (ⅲ) 원하는 아미노산 사슬을 포함하는 합성이 완결되었을 때 레진과의 분해 조건에서 안정하여야 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 화학식 Ⅰ의 펩타이드를 합성하는 과정에 서 레진을 사용한다. 사용될 수 있는 레진은 제조된 펩타이드의 측쇄 보호기를 완전히 보존시킬 수 있는 온화한 산성조건하에서 쉽게 분해될 수 있는 통상적인 레진을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 레진은 트리틸클로라이드 레진, 2-클로로트리틸 레진, 4-메틸트리틸 레진 또는 4-메톡시트리틸 레진이고, 보다 바람직하게는 트리틸클로라이드 레진 또는 2-클로로트리틸 레진이며, 가장 바람직하게는 2-클로로트리틸 레진이다.

단계 (b): 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드의 수득

상기 화학식 Ⅱ로 표시되는 화합물은 상기 단계 (a)에서 얻은 펩타이드로부터 온화한 산성조건하에서 레진을 제거하여 얻을 수 있다. 이 때, 사용할 수 있는 산성조건은 아미노산 사슬의 측쇄 보호기가 유지될 수 있는 온화한 조건이어야 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 레진을 제거하는 과정은 산성 조건하에서 수행한다. 바람직하게는, 산성 조건은 디클로로메탄 : 아세트산 : 트리플루오로에탄올 = 8 : 1 : 1인 용액 하에서 수행하거나, 0.5 내지 5% 트리플루오로아세트산이 포함된 디클로로메탄 용액 하에서 수행한다.

단계 (c): 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드의 수득

화학식 Ⅲ로 표시되는 화합물은 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드를 H-Gly-NH₂·HCl와 결합 시약의 존재 하에서 액상반응을 수행하여 얻는다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 단계 (c)에서 이용 가능한 결합 시약은 DCC(N,N-dicyclohexylcarbodiimide), DIC(N,N-diisopropylcarbodiimide), BOP(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate), PyBOP(Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate), HBTU(O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate), TBTU(O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluoroborate), HATU(2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphatemethanaminium), TATU(2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroboratemethanaminium), CDI(carbonyldiimidazole), EDC·HCl (N-(3-dimethylaminopropyl)-N`-ethylcarbodiimide hydrochloride)으로 구성된 군으로부터 선택적으로 사용될 수 있고, 바람직하게는 HBTU 또는 EDC·HCl 이고, 가장 바람직하게는 EDC·HCl 이다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 결합 액상반응에서 사용되는 유기용매는 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 클로로포름, N,N-디메틸포름아미드이며, 바람직하게는 디클로로메탄과 N,N-디메틸포름아미드이며, 가장 바람직하게는 디클로로메탄과 N,N-디메틸포름아미드의 혼합 용매이다.

상기 결합 반응의 반응 온도는 -20~50℃이고, 바람직하게는 0~25℃ 이다.

단계 (d): 화학식 IV로 표시되는 펩타이드의 수득

화학식 IV로 표시되는 화합물은 상기 단계 (c)에서 얻은 펩타이드로부터 유기용매 하에서 적합한 산화제를 사용하여 이황화 결합 형성반응을 수행하여 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 단계 (d)에서 이용 가능한 산화제는 요오드 (I₂),산소, 페리사이어나이드, 다이메틸설폭사이드, 글루타티온, 퍼옥시니트라이드 또는 과산화수소이고, 보다 바람직하게는, 요오드 (I₂)또는 다이메틸설폭사이드 이며, 가장 바람직하게는 요오드 (I₂)이다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 이황화 결합의 형성 반응에서 유기용매를 사용한다. 바람직하게는, 상기 유기용매는 할로겐화 탄화수소 용매 또는 알코올류 용매이며, 더욱 바람직하게는 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 클로로포름, 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올이며, 가장 바람직하게는 디클로로메탄, 메탄올의 혼합 용매이다.

상기 혼합 용매의 이황화 결합 형성 반응 농도는 화학식 IV로 표시되는 화합물을 기준으로 하여 바람직하게는 0.01-0.0001 M이 적합하며, 가장 바람직하게는 0.005-0.0005 M이다.

단계 (e): 데스모프레신의 수득

데스모프레신은 상기 단계 (d)에서 얻은 펩타이드로부터 당업계에서 통상적으로 이용하는 반응 조건하에서 탈 보호화 반응을 수행하여 얻을 수 있다.

탈 보호화 반응의 반응 조건으로는 바람직하게는 트리플루오로아세트산, 물, 페놀, 티오아니솔 및 에탄디티올의 혼합물, 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란 및 물의 혼합물 또는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란, 물 및 에탄디티올의 혼합물 하에서 가능하며, 가장 바람직하게는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란, 물의 혼합물 하에서 수행된다.

상기 내용을 바탕으로 데스모프레신을 제조하는 전체 공정을 정리하면 다음과 같다.

화학반응식 1

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 고체상(solid-phase) 합성 방법 및 액상(solution-phase) 합성 방법으로 펩타이드를 합성한 후 유기용매 내에서 이황화 결합 형성 반응을 실시하는 신규한 데스모프레신 제조방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 고체상 합성 반응과 액상 반응을 실시한 후 펩타이드의 이황화 결합 형성 반응을 유기용매 내에서 수행하므로, 반응이 종료된 후 목적물의 분리 및 정제가 용이하여 상업적 대량 생산이 가능하다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 당업 기술분야에서 이용되는 방법으로 합성된 데스모프레신 보다 수율 및 순도가 개선되어 생산비용 측면에서 경제적 효과가 있다.

도 1은 데스모프레신을 제조하는 전체 공정을 나타낸 모식도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 거쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 한 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1 : 화학식 Ⅵ로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅵ

Mpr(Trt)-Tyr(t-Bu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-D-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진

Fmoc-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진의 제조

여과막이 장착된 고체상(solid-phase) 합성 반응기에 2-클로로트리틸 클로라이드 레진(치환율 = 1.08 mmol/g의 레진, 16 mmol)(Bead Tech) 및 디클로로메탄(50 ml)(Dae Jung)를 넣고, 15분간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(20.8 g, 32 mmol, 2.0 당량)이 포함된 디클로로메탄(100 ml)을 넣고, 이어서 디이소프로필에틸아민(5.2 g, 40 mmol, 2.5 당량)(Dae Jung)을 첨가한 후, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 1회 세척한 후, 레진에 디클로로메탄 : 메탄올 : 디이소프로필에틸아민 = 17 : 2 : 1 (100 ml)을 넣고 20분간 교반시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 3회 세척한 후, 진공 하에서 건조하여 Fmoc-D-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다. 치환율은 0.55 mmol/g 이었다.

Fmoc-AA-OH 결합 반응

(a) H-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진의 수득

여과막이 장착된 고상합성 반응기에 Fmoc-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진 (0.55 mmol/g, 10 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드(100 ml)(Dae Jung)를 넣고, 15분간 레진을 부풀림(Swelling) 시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 20%(v/v) 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(100 ml)를 넣어 15분간 Fmoc의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 Fmoc의 제거 반응을 1회 반복하고, 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 1회, 디클로로메탄으로 2회 및 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 H-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다.

(b) Fmoc-Pro-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진의 수득

상기 반응 (a)에서 얻은 H-D-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진(10 mmol)에 Fmoc-Pro-OH(6.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸(2.7 g, 20 mmol, 2 당량)의 N,N-디메틸포름아미드(80 ml)를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(10 ml, 2 M 용액, 2 당량)을 첨가한 후, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다.

감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 Fmoc-Pro-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다.

(c) H-Pro-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진의 수득

상기 반응 (b)에서 얻은 Fmoc-Pro-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진에 20% (v/v) 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(100 ml)를 넣어 15분간 Fmoc의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 Fmoc의 제거 반응을 1회 반복하고, 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 1회, 디클로로메탄으로 2회 및 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 H-Pro-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다.

(d) Fmoc-AA-OH의 결합 및 최종 물질의 수득

상기 반응 (b) 및 (c) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 유도체를 순차적으로 결합하였다.

Fmoc-Cys(Trt)-OH (11.7 g, 20 mmol, 2 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ml, 2 M 용액, 2 당량)

Fmoc-Asn(Trt)-OH (11.9 g, 20 mmol, 2 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ml, 2 M 용액, 2 당량)

Fmoc-Gln(Trt)-OH (12.2 g, 20 mmol, 2 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ml, 2 M 용액, 2 당량)

Fmoc-Phe-OH (7.7 g, 20 mmol, 2 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ml, 2 M 용액, 2 당량)

Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH (9.2 g, 20 mmol, 2 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ml, 2 M 용액, 2 당량)

Mpr(Trt)-OH (7.0 g, 20 mmol, 2 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ml, 2 M 용액, 2 당량)

Mpr(Trt)-OH의 결합 반응을 수행한 후, 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 3회 및 디클로로메탄으로 3회 세척하여 상기 화학식 Ⅵ로 표시되는 펩타이드를 수득하였다.

실시예 2 : 화학식 Ⅶ로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅶ

Mpr(Trt)-Tyr(t-Bu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-D-Arg(pbf)-OH

상기 실시예 1에서 얻은 상기 화학식 VI로 표시되는 펩타이드가 결합된 레진에 디클로로메탄 : 아세트산 : 트리플루오로에탄올(Alfa Aesar) = 8 : 1 : 1의 혼합액(300 ml)을 넣고 2시간 동안 교반하였다. 감압 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 감압 농축하여 상기 화학식 Ⅶ로 표시되는 크루드 펩타이드를 22.1 g을 수득하였다. 크루드 펩타이드의 수율은 98% 였고, HPLC 순도는 96.5%였다.

실시예 3 : 화학식 Ⅷ으로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅷ

Mpr(Trt)-Tyr(t-Bu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-D-Arg(pbf)-Gly-NH₂

상기 실시예 2에서 얻은 상기 화학식 Ⅶ로 표시되는 크루드 펩타이드(22.9 g, 10 mmol)을 디클로로메탄 50 ml에 녹이고, 프롤린에틸아미드 염산염(2.7 g, 15 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸(2 g, 15 mmol)(GLS)을 넣고 녹인 후, 디이소프로필에틸아민(1.9 g, 15 mmol)(Dae Jung)을 넣고, N,N-디메틸포름아미드을 넣어 부피가 100 ml 이 되게 한다. 여기에 HBTU(5.7 g, 15 mmol)(Novabiochem)을 서서히 넣어주고, 0℃에서 4시간 반응시킨다.

반응이 완료된 후, 유기층을 0.2 N 염산 100 ml로 씻은 후 분층한 디클로로 메탄을 분리해낸다. 100 ml 물로 한 번 더 씻은 후 디클로로메탄을 분리하고, 10 % 탄산염 100 ml로 씻은 다음 디클로로메탄 층을 분리해 낸다. 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과 및 감압 증류하여 상기 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드 22.0 g을 수득하였다.

실시예 4 : 화학식 Ⅸ으로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅸ

상기 실시예 3에서 얻은 화학식 Ⅷ로 표시되는 크루드 펩타이드(4.7 g)에 디클로로메탄 2 L를 넣고, I₂(0.5 g,20 mmol)을 녹인 메탄올 25 ml을 천천히 적가한 후, 15분간 더 교반시켰다. 1 N의 Na₂S₂O₃수용액(1 L)을 넣어 과량의 I₂을 제거하고, 층을 분리한 후, 유기층을 1 N의 시트르산 수용액으로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조하고, 여과 및 감압증류를 수행하여 화학식 Ⅸ으로 표시되는 펩타이드 3.5 g을 수득하였다.

실시예 5 : 화학식 V으로 표시되는 데스모프레신의 제조

화학식 V

상기 실시예 4에서 얻은 화학식 Ⅸ으로 표시되는 펩타이드 3.5 g을 삼불화초산(Dae Jung) : 트리이소프로필실란(Alfa Aesar) : 물 = 95 : 2.5 : 2.5 (40 ml) 혼합용액에 넣고, 2시간 동안 탈 보호화 반응을 수행하였다. 용매를 감압증류하고 터트-부틸메틸에테르(60 ml)(Dae Jung)를 넣어 얻은 고체를 여과하여 크루드 데스모프레신 2.0 g을 수득하였다. 역상 HPLC(220 nm, 10 ml/분, 10 미크론 C18 컬럼에서 20분 내에 0.1% 아세트산 내 아세토니트릴 초기농도 15%에서 30%로 증가)로 정제하여 화학식 V로 표시되는 데스모프레신 0.86 g을 수득하였다. 총 수율은 40% 였으며, HPLC의 순도는 99.7% 였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> ANYGEN CO., LTD. <120> Process for the Preparation of Desmopressin <130> PN140157 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemical Formula I Back Bone <400> 1 Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemical Formula II Back Bone <400> 2 Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemical Formula III Back Bone <400> 3 Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemical Formula IV Back Bone <400> 4 Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemical Formula V Back Bone <400> 5 Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemical Formula VI Back Bone <400> 6 Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemical Formula VII Back Bone <400> 7 Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemical Formula VIII Back Bone <400> 8 Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemical Formula IX Back Bone <400> 9 Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly 1 5

Claims

다음의 단계를 포함하는 데스모프레신의 제조방법:
(a) 고체상(solid-phase) 합성 방법으로 레진이 부착된 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 수득한 펩타이드에서 레진을 제거하여 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 수득한 펩타이드를 액상(solution-phase) 합성 방법으로 H-Gly-NH₂·HCl와 결합 반응을 수행하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계;
(d) 상기 단계 (c)에서 수득한 펩타이드를 이용하여 유기용매 내에서 이황화 결합 형성 반응을 실시하여 하기 화학식 IV으로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계; 및
(e) 상기 단계 (d)에서 수득한 펩타이드에서 탈보호화 반응을 통하여 하기 화학식 Ⅴ으로 표시되는 데스모프레신을 수득하는 단계.

화학식 I
Mpr(R¹)-Tyr(R²)-Phe-Gln(R³)-Asn(R³)-Cys(R¹)-Pro-D-Arg(R⁴)-O-레진
화학식 Ⅱ
Mpr(R¹)-Tyr(R²)-Phe-Gln(R³)-Asn(R³)-Cys(R¹)-Pro-D-Arg(R⁴)-OH
화학식 Ⅲ
Mpr(R¹)-Tyr(R²)-Phe-Gln(R³)-Asn(R³)-Cys(R¹)-Pro-D-Arg(R⁴)-Gly-NH₂
화학식 Ⅳ

화학식 Ⅴ

상기 화학식에서, R은 알파-아미노 보호기, R¹은 티오 보호기, R²는 수소 또는 수산기 보호기, R³는 수소 또는 아미드 보호기, R⁴는 구아니딘 보호기 이다.
제 1 항에 있어서, 상기 R¹은 수소, 트리페닐메틸기 또는 아세트아미노메틸기인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조방법
제 1 항에 있어서, 상기 R²은 수소, 파라-메톡시벤질기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 테트라히드로피란기, 테트라히드로퓨란기, 터트-부틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, 트리메틸실릴기, 터트-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 터트-부틸카르보닐기, 아세틸기 또는 벤조일기인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 R³은 수소, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐 메틸기, 터트-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기 또는 트리이소프로필실릴기인 것을 특징으로 하는 데스 모프레신의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 R⁴은 터트-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, 터트-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기 또는 트리이소프로필실릴기이고, 니트로기, Pmc, Mtr, Pbf 또는 Tos기인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 레진은 2-클로로트리틸 레진, 트리틸 레진, 4-메틸트리틸 레진 또는 4-메톡시트리틸 레진인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 레진을 제거하는 과정은 산성 용액의 존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 산성 용액은 디클로로메탄, 아세트산 및 트리플루오로에탄올의 혼합용액인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 산성 용액은 디클로로메탄 : 아세트산 : 트리플루오로에탄올의 부피비가 8 : 1 : 1인 혼합용액인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 산성 용액은 0.5 내지 5% 트리플루오로아세트산이 포함된 디클로로메탄 용액인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 사용되는 결합 시약은 DCC, DIC, BOP, PyBOP, HBTU, TBTU, HATU, TATU, CDI 및 EDC·HCl로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 결합 액상반응에 사용되는 유기용매는 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 클로로포름 및 N,N-디메틸포름아미드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 반응 온도는 -20 ~ 50℃인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 사용되는 유기용매는 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 클로로포름, 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법.