WO2015152565A1

WO2015152565A1 - 데스모프레신의 제조방법

Info

Publication number: WO2015152565A1
Application number: PCT/KR2015/002925
Authority: WO
Inventors: 김재일; 김종민; 전용국; 김대영; 박진석
Original assignee: 애니젠 주식회사
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2015-03-25
Publication date: 2015-10-08
Also published as: KR101658942B1; KR20150114111A

Abstract

본 발명은 고체상(solid-phase) 합성 방법 및 액상(solution-phase) 합성 방법으로 펩타이드를 합성한 후 유기용매 내에서 이황화 결합 형성 반응을 실시하는 신규한 데스모프레신 제조방법을 제공한다. 본 발명은 고체상 합성 반응과 액상 반응을 실시한 후 펩타이드의 이황화 결합 형성 반응을 유기용매 내에서 수행하므로, 반응이 종료된 후 목적물의 분리 및 정제가 용이하여 상업적 대량 생산이 가능하다. 또한, 본 발명은 당업 기술분야에서 이용되는 방법으로 합성된 데스모프레신 보다 수율 및 순도가 개선되어 생산비용 측면에서 경제적 효과가 있다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

데스모프레신의 제조방법 【기술분야】

본 발명은 대한민국 산업통상자원부의 지원 하에서 과제번호 10037719에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국산업기술평가원, 연구사업명은 "지식경제 기술혁신사업 [WPM사업] " ， 연구과제명은 "비천연 아미노산 융합 소재" , 주관기관은 아미노로직스 (주) , 연구기간은 2010.09.01 ~ 2017.03.31이다.

본 특허출원은 2014 년 3 월 31 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0037939 호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 신규한 데스모프레신의 제조방법에 관한 것이다/

【발명의 배경이 되는 기술】

바소프레신의 합성 유사체인 초산 데스모프레신은 항 이뇨 호르몬이다. 그러나 바소프레신과는 달리 약물작용 시간이 길고 항 이뇨 효과가 강하며 심혈관계 수축 작용은 없다. 이 약물은 소아의 일차성 야뇨증뿐만 아니라 성인의 야간뇨의 상당 부분 원인을 차지하는 야간다뇨에 효과적으로 작용한다.

데스모프레신의 합성방법에는 고체상 합성 방법과 액상 합성 방법이 있다. 고체상 합성 방법에는 아미노산 서열을 고체 지지체 (Res in)에 부착시켜 조립을 완료한 후에 상기 지지체로부터 서열을 유리한다. 이 방법은 반움속도가 빠르고 부산물이 적고 또한 자동화가 용이하다는 장점이 있으나 과량의 원료를 사용해야 하는 단점이 있다. 반면 액상 합성 방법은 통상의 유기 합성 방법으로서 시약과 재료의 비용이 적게 드는 장점이 있지만 반웅 단계수가 많고 각 단계별로 중간체를 유리해야 하고 또한 이성체가 생길 가능성이 있어 정제가 어려운 단점이 있다.

데스모프레신을 제조하기 위한 종래의 제조방법은 다음과 같다. 미국특허 제 3， 497 ,491 은 액체상 합성방법으로 데스모프레신 펩타이드를 제조하는 기술을 기재하고 있다. 그러나 상기 제조방법은 제조 단계수가 많고 최종공정에서는 산업적으로 이용 불가능한 시약을 사용하는 등 제조공정이 까다로울 뿐만 아니라 제조 수율이 낮아 상업적 대량 생산 시 가격적 경쟁력이 떨어진다는 단점이 있다.

미국특허 제 5 , 200 , 507 은 터트 -부틸카보닐 보호화 합성기술로 각 아미노산을 순차적으로 결합시키는 방법으로 데스모프레신 펩타이드를 제조하는 기술을 기재하고 있다. 그러나 이 방법의 경우, 터트- 부틸카보닐 보호기를 제거 시 상업적 대량 생산에 적용이 어려운 불산 (Hydrogen Fluor ide)을 각 단계마다사용해야 하는 단점이 있다.

미국특허 20060148699 A1 에는 데스모프레신 펩타이드 제조 시 고가의 링크 아미드 레진을 사용하고， 이황화 결합의 형성반웅은 물에서 수행하므로 반웅이 종료된 후 물과 무기염을 제거하는 공정이 쉽지 않아 목적물의 분리 및 정제가 어렵게 되에 상업적 대량 생산의 적용에는 많은 제한이 있다.

이상에서 언급한 바와 같이 데스모프레신 펩타이드의 제조를 위한 종래의 기술들의 경우， 상업적 대량 생산에의 적용에 있어 개선되어야 하는 많은 문제점들을 내포하고 있다. 따라서 데스모프레신 펩타이드를 효과적으로 제조하는 방법에 대한 연구는 의약 산업에 있어서 매우 중요한 개발 과제라 할 수 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

【발명의 내용】

【해결하고자 하는 과제】

본 발명자들은 데스모프레신을 안정적으로 대량 생산하기 어려운 문제점을 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고체상 (sol id- phase) 합성 방법과 액상 (solut ion-phase) 합성 방법을 병행 실시하여 선형 펩타이드를 제조한 다음 펩타이드의 이황화 결합 형성 반웅을 유기용매 내에서 실시하면 데스모프레신을 효율적으로 생산할 수 있다는 사실을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 신규한 데스모프레신의 제조방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다. 【과제의 해결 수단】

본 발명은 다음 단계를 포함하는 데스모프레신의 제조방법을 제공한다:

(a) 고체상 (sol i d-phase) 합성 방법으로 레진이 부착된 하기 화학식 I로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계 ;

(b) 상기 단계 (a)에서 수득한 펩타이드에서 레진을 제거하여 하기 화학식 Π로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계;

(c) 상기 단계 (b)에서 수득한 펩타이드를 액상 (solut i on-phase) 합성 방법으로 H-Gly-NH₂ · HC1 과 결합반응을 수행하여 하기 화학식 m으로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계 ;

(d) 상기 단계 (c)에서 수득한 펩타이드를 이용하여 유기용매 내에서 이황화 결합 형성 반응을 실시하여 하기 화학식 IV 으로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계; 및

(e) _, 상기 단계 (d)에서 수득한 펩타이드에서 탈보호화 반웅을 실시하여 화학식 V로 표시되는 데스모프레신을 수득하는 단계 . 화학식 I

Mp^R^-Ty R^-Phe-Gl^R^-Asn ^-Cy^R^-Pro-D-Arg ^H)-레진

화학식 Π

Mpr CR^-Tyr CR^-Phe-GlnCR^-AsnCR^-CysCR^-Pro-D-ArgCR^-OH

화학식 m

Mpr CR^-Tyr R^-Phe-Gln R^-AsnCR^-CysCR^-Pro-D-Arg R^-Gly-NHa 화학식 IV

상기 화학식에서， R^l은 티을 보호기， R²는 수소 또는 수산기 보호기，

R³는 수소 또는 아미드 보호기 , R⁴는 구아니딘 보호기이다. 본 발명자들은 데스모프레신을 안정적으로 대량 생산하기 어려운 문제점을 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고체상 (solid- phase) 합성 방법과 액상 (solution-phase) 합성 방법을 병행 실시하여 선형 펩타이드를 제조한 다음 펩타이드의 이황화 결합 형성 반웅을 유기용매 내에서 실시하면 데스모프레신을 효율적으로 생산할 수 있다는 사실을 규명하였다. 약어의 정리

본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한， 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB 의 생화학 용어 위원회 (Commission of Biochemical Nomenclature)에서 권장하는 용어에 기초한다 (Biochemistry, 11： 1726-1732(1972)； Pure & Appl. Chem. , Vol .56, No.5, pp.595- 624,1984).

본 명세서에서 사용한 보호기 및 아미노산의 약어는 다음과 같다: t-Bu: 터트 -부틸 (tert -Butyl)

Fmoc： 9-플루오레닐옥시카보닐 ( 9— F 1 uor eny 1 oxycarbony 1 ) Trt: 트리페닐메틸 (또는 트리틸 KTriphenylmethyl or Trityl)

Pbf： 2,2,4，6，7-펜타메틸 -디히드로벤조퓨란 -5-설포닐 (2，2，4，6,7-

Pent ame t hy 1 -d i hydr obenzo f ur an-5-su 1 f ony 1 )

Pmc: 2,2，5,7，8-펜타메틸크로만 -6-설포닐 (2，2，5，7，8- pent ame t hy 1 chr oman-6- su 1 phony 1 )

Mtr: 4-메톡시 -2，3，6-트리메틸페닐-설포닐 (4-methoxy-2,3,6- trimethylphenyl-sul fonyl )

Tos: 파라-를루엔설포닐 (p-Toluenesul fonyl)

D-Arg: D-아르기닌 (D-Arginine)

Gly: 글리신 (Glycine)

Pro: 프롤린 (Proline)

Cys: 시스테인 (Cysteine)

Asn: 아스파라긴 (Asparagine)

Gin: 글루타민 (Glutamine)

Phe: 페닐알라.닌 (Phenyl alanine)

Tyr: 타이로신 (Tyrosine)

Mpr： 머캡토프로피은산 (Mercaptopropionic acid) 상기 화학식 I 내지 m에서 R¹ 은 당업계에서 통상적으로 이용하는 티올 보호기이다. 바람직하게는， 상기 티올 보호기는 터트-부틸， 벤조일， 트리틸， 벤질， 파라-메톡시벤질， 벤질옥시카보닐， 파라-니트로벤질, 디페닐메틸， 트리페닐메틸기 또는 아세트아미노메틸기이며， 가장 바람직하게는 트리페닐메틸기이다.

상기 화학식 I 내지 IV 에서 R²는 당업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 수산기 보호기가 될 수 있다. 바람직하게는， 상기 수소 또는 수산기 보호기는 파라-메록시벤질기, 메록시메틸기, 벤질옥시메틸기， 테트라히드로피란기， 테트라히드로퓨란기， 터트-부틸기, 트리페닐메틸기，

2-클로로트리틸기， 벤질기, 알릴기, 터트-부틸디메틸실릴기， 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기， 터트 -부틸카르보닐기， 아세틸기 또는 벤조일기이고， 보다 바람직하게는 터트-부틸기 또는 트리페닐메틸기 이며， 가장 바람직하게는 수산기 보호기가 터트-부틸기인 것이다.

상기 화학식 I 내지 IV 에서 R³는 당업계에서 통상적으로 이용하는 ε-아미노 보호기이다. 바람직하게는， 상기 ε-아미노 보호기는 터트- 부틸옥시카보닐기， 벤질옥시카보닐기， 메톡시메틸기， 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기， 벤질기, 알릴기, 터트-부틸디메틸실릴기， 트리페닐실릴기 또는 트리이소프로필실릴기이고， 보다 바람직하게는 터트 -부틸옥시카보닐기 또는 벤질옥시카보닐기이며, 가장 바람직하게는 터트 -부틸옥시카보닐기이다. 상기 화학식 I 내지 IV 에서 R⁴는 당업계에서 통상적으로 이용하는 구아니딘 보호기이다. 바람직하게는， 상기 구아니딘 보호기는 터트- 부틸옥시카보닐기， 벤질옥시카보닐기， 메톡시메틸기， 벤질옥시메틸기， 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기， 터트-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 니트로기， Pmc(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6- sul hony 1 ) , Mt r ( ( 4^~me t hoxy-2 ,3,6-trimethyl heny 1 ) s u 1 f ony 1 ) , Pbf， Tos(p-toluenesulfonyl) 이고, 보다 바람직하게는 Pbf 또는 Mtr 기 이며, 가장 바람직하게는 pbf 기 이다.

상기 작용기에 대한 보호기는 Protecting Groups in Organic

Synthesis (Greene and Wuts, John Wiley & Sons, 1991)에 상세히 기재되어 있다.

본 명세서에서 용어 "펩타이드" 는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 제조방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 화학식 I로 표시되는 펩타이드의 수득

화학식 I로 표시되는 펩타이드는 당 업계에서 통상적으로 사용하는 고체상 (solid-phase) 합성 방법에 의해 제조된다 (Merrif ield, R. B., J. Am. Chem. Soc. , 85:2149-2154(1963) Kaiser, E. , Colescot, R. L. , Bos singer, CD. , Cook, P. I., Anal. Biochem. , 34：595-598(1970)). 즉， 알파-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후， 알파-아미노 보호기를 제거하고 남은 알파-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 결합하여 중간체를 얻는다. 적절한 보호기의 선택은 보호되는 작용기 보호기가 노출되는 조건 및 그 분자 내에 존재할 수 있는 다른 작용기에 따라 달라진다. 보호기는 합성 각 단계에서 ( i ) 알파-아미노 보호기를 제거하기 위해 선택한 반응조건 및 시약에 대해 안정해야 하고， (ii) 결합반웅에서 탈 보호화 반응이 일어나지 않아야 하며， (iii) 원하는 아미노산 사슬을 포함하는 합성이 완결되었을 때 레진과의 분해 조건에서 안정하여야 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면， 화학식 I의 펩타이드를 합성하는 과정에 서 레진을 사용한다. 사용될 수 있는 레진은 제조된 펩타이드의 측쇄 보호기를 완전히 보존시킬 수 있는 온화한 산성조건하에서 쉽게 분해될 수 있는 통상적인 레진을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 레진은 트리틸클로라이드 레진， 2-클로로트리틸 레진 4ᅳ메틸트리틸 레진 또는 ₄ᅳ메톡시트리틸 레진이고， 보다 바람직하게는 트리틸클로라이드 레진 또는 2-클로로트리틸 레진이며， 가장 바람직하게는 2ᅳ클로로트리틸 레진이다. 단계 (b): 화학식 Π로 표시되는 펩타이드의 수득

(⁹ρμομρ φΑι! gpiiui ipoq BOjAii -_NM-([AcIojdouiuJBiAi^9iuTp_g)-N) K)H · 3G3 ' (siozs iuii i iAuoq^jBO) ιαο ¾

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SZ6Z00/ST0ZaM/X3d S9SZSl/ST0Z OAV 사용될 수 있고, 바람직하게는 HBTU 또는 EDO HCl 이고， 가장 바람직하게는 EDC · HC1 이다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면， 결합 액상반응에서 사용되는 유기용매는 디클로로메탄, 1 , 2-디클로로에탄, 클로로포름, Ν ,Ν- 디쩨틸포름아미드이며, 바람직하게는 디클로로메탄과 Ν ,Ν- 디메틸포름아미드이며， 가장 바람직하게는 디클로로메탄괴- Ν ,Ν- 디메틸포름아미드의 흔합 용매이다.

상기 결합 반응의 반응 온도는 -20~50 ^°C이고， 바람직하게는 0~25^°C 이다. 단계 (d) : 화학식 IV로 표시되는 펩타이드의 수득

화학식 IV 로 표시되는 화합물은 상기 단계 (c)에서 얻은 펩타이드로부터 유기용매 하에서 적합한 산화제를 사용하여 이황화 결합 형성반웅을 수행하여 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면， 단계 (d)에서 이용 가능한 산화제는 요오드 ( 1₂) , 산소， 페리사이어나이드, 다이메틸설폭사이드, 글루타티온, 퍼옥시니트라이드 또는 과산화수소이고， 보다 바람직하게는, 요오드 ( 1₂) 또는 다이메틸설폭사이드 이며, 가장 바람직하게는 요오드 ( 1₂)이다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면， 이황화 결합의 형성 반응에서 유기용매를 사용한다. 바람직하게는, 상기 유기용매는 할로겐화 탄화수소 용매 또는 알코올류 용매이며， 더욱 바람직하게는 디클로로메탄， 1，2- 다클로로에탄, 클로로포름， 메탄을， 에탄올 또는 이소프로판을이며, 가장 바람직하게는 디클로로메탄， 메탄올의 흔합 용매이다.

상기 흔합 용매의 이황화 결합 형성 반응 농도는 화학식 IV 로 표시되는 화합물을 기준으로 하여 바람직하게는 0.01-0.0001 M이 적합하며， 가장 바람직하게는 0.005-0.0005 M이다. 단계 (e) : 데스모프레신의 수득

데스모프레신은 상기 단계 (d)에서 얻은 펩타이드로부터 당업계에서 통상적으로 이용하는 반응 조건하에서 탈 보호화 반웅을 수행하여 얻을 수 있다.

탈 보호화 반응의 반웅 조건으로는 바람직하게는 트리플루오로아세트산, 물, 페놀， 티오아니솔 및 에탄디티올의 흔합물， 트리폴루오로아세트산, 트리이소프로필실란 및 물의 흔합물 또는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란， 물 및 에탄디티올의 흔합물 하에서 가능하며, 가장 바람직하게는 트리플루오로아세트산， 트리이소프로필실란， 물의 흔합물 하에서 수행된다. 상기 내용을 바탕으로 데스모프레신을 제조하는 전체 공정을 정리하면 다음과 같다 . 화학반웅식 1

례건

(a)고체상 ¾타이드 합성

Mpr (R¹) -Tyr (R²) -Phe-G 1 n (R³) -Asn (R³) -Cys (R^l) -Pro-D-Arg (R⁴) -0-레건

(b)레진 제거

Mpr (R¹) -Tyr (R²) -Phe-G In (R³) -Asn (R³) -Cys (R¹) -Pro-D-Arg (R⁴) -OH

(c) H-G!y-NH₂HCl액상

Mpr (R¹) -Tyr (R²) -Phe-G 1 n (R³) -Asn (R³) -Cys (R¹) -Pro-D-Arg (R⁴) -Gl -NH₂

)이¾화 걸합 ¾성

Mpr-Tyr (R²) -Phe-G In (R³) -Asn (R³) -Cys-Pro-D-Arg (R⁴) -G 1 y-NH₂

I (e)탈보호화반응

Mpr-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gl -NH2

【효과】

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

( i ) 본 발명은 고체상 (sol id-phase) 합성 방법 및 액상 (solution- phase) 합성 방법으로 펩타이드를 합성한 후 유기용매 내에서 이황화 결합 형성 반웅을 실시하는 신규한 데스모프레신 제조방법을 제공한다.

(ii) 본 발명은 고체상 합성 반응과 액상 반웅을 실시한 후 펩타이드의 이황화 결합 형성 반웅을 유기용매 내에서 수행하므로, 반웅이 종료된 후 목적물의 분리 및 정제가 용이하여 상업적 대량 생산이 가능하다.

(iii) 또한， 본 발명은 당업계 기술분야에서 이용되는 방법으로 합성된 데스모프레신 보다 수율 및 순도가 개선되어 생산비용 측면에서 경제적 효과가 있다. 【도면의 간단한 설명】 도 1은 데스모프레신을 제조하는 전체 공정을 나타낸 모식도이다.

【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명올 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예

본 명세서 전체에 거쳐， 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 " "는 별도의 언급이 없는 한 고체 /고체는 (중량 /중량) , 고체 /액체는 (중량 /부피) ， 그리고 액처 j/액체는 (부피 /부피) %이다. 실시예 1 ： 화학식 VI로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 VI

Mpr(Trt) -Tyr (t-Bu) -Phe-G ln(Trt )-Asn(Trt )-Cys(Trt ) -Pro^~D- Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진

Fmoc-D-Arg(Pbf )-2-클로로트리틸 레진의 제조

여과막이 장착된 고체상 (sol id-phase) 합성 반응기에 2-클로로트리틸 클로라이드 레진 (치환율 = 1.08 mmol/g 의 레진, 16 mmol)(Bead Tech) 및 디클로로메탄 (50 ml) (Dae Jung)를 넣고， 15 분간 레진을 팽창시킨 후， 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. Fmoc-D-Arg(Pbf)-0H(20.8 g, 32 隱 ol, 2.0 당량)이 포함된 디클로로메탄 (100 ml)을 넣고， 이어서 디이소프로필에틸아민 (5.2 g, 40 關 ol, 2.5 당량) (Dae Jung)을 첨가한 후， 실온에서 4 시간 동안 반응시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 1 회 세척한 후， 레진에 디클로로메탄 ： 메탄올 ： 디이소프로필에틸아민 = 17 ： 2 ： 1 (100 ml)을 넣고 20 분간 교반시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 3회 세척한 후, 진공 하에서 건조하여 Fmoc-D-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다. 치환율은 0.55 醒 ol/g 이었다. Fmoc-AA-OH결합 반웅

(a) H-D-Arg(Pbf)-2—클로로트리틸 레진의 수득

여과막이 장착된 고상합성 반응기에 Fmoc-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진 (0.55 圈 ol/g, 10 mmol) 및 Ν,Ν-디메틸포름아미드 (100 ml) (Dae Jung)를 넣고, 15 분간 레진을 부풀림 (Swelling) 시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 20%(v/v) 피페리딘이 포함된 Ν,Ν- 디메틸포름아미드 (100 ml)를 넣어 15 분간 Fmoc 의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 Fmoc 의 제거 반응을 1 회 반복하고， 이어서 레진을 차례로 Ν,Ν-디메틸포름아미드로 1 회， 디클로로메탄으로 2 회 및 Ν,Ν-디메틸포름아미드로 2 회 세척하여 H-D- Arg(Pbf)-2_클로로트리틸 레진올 수득하였다.

(b) Fmoc-Pro-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진의 수득

상기 반웅 (a)에서 얻은 H-D-Arg(pbf)-2-클로로트리틸 레진 (10 麵 ol)에 i½oc-Pro-0H(6.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 1- 히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량)의 Ν,Ν-디메틸포름아미드 (80 ml)를 넣고， 이어서 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 Ν,Ν- 디메틸포름아미드 용액 (10 ml, 2 M 용액, 2 당량)을 첨가한 후， 실온에서 ⁴시간 동안 반응시켰다.

감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 Ν,Ν-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 Fmoc-Pro-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다.

(c) H-Pro-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진의 수득

상기 반웅 (b)에서 얻은 f½oc-Pro-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진에

20% (v/v) 피페리딘이 포함된 Nᅳ N-디메틸포름아미드 (100 ml)를 넣어 15분간 Fmoc 의 제거 반웅을 수행한 후， 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 Fmoc 의 제거 반웅을 1 회 반복하고， 이어서 레진을 차례로 Ν,Ν- 디메틸포름아미드로 1 회， 디클로로메탄으로 2 회 및 Ν,Ν- 디메틸포름아미드로 2회 세척하여 H-Pro-D-Arg(Pbf)-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다. (d) Fmoc-AA-OH의 결합 및 최종 물질의 수득

상기 반응 (b) 및 (c) 과정을 반복하면서

순차적으로 결합하였다.

Fmoc-Cys(Trt)-0H (11.7 g 20 mmol, 2 당량), 히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 Ν,Ν-디메틸포름아미드 용액 (10 2 M 용액， 2 당량)

Fmoc-Asn(Trt)-0H (11.9 g 20 mmol, 2 당량), 히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 Ν,Ν-디메틸포름아미드 용액 (10 2 M용액， 2 당량)

Fmoc-Gln(Trt)-0H (12.2 g 20 麵 ol, 2 당량)， 히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 Ν,Ν-디메틸포름아미드 용액 (10 2 M 용액 , 2 당량)

Fmoc-Phe-0H (7.7 g, 20 mmol, 2 당량)， 1-히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 Ν,Ν- 디메틸포름아미드 용액 (10 ml , 2 M 용액 , 2 당량)

Fmoc-Tyr(t-Bu)-0H (9.2 g, 20 mmol, 2 당량)， 1- 히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol, 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 Ν,Ν-디메틸포름아미드 용액 (10 ml, 2 M 용액， 2 당량) Mpr(Trt)-0H (7.0 g, 20 mmol, 2 당량), 1-히드록시벤조트리아졸 (2.7 g, 20 mmol , 2 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 Ν,Ν- 디메틸포름아미드 용액 (10 ml, 2 M용액， 2 당량) Mpr(Trt)-0H 의 결합 반응을 수행한 후， 레진을 차례로 Ν,Ν- 디메틸포름아미드로 3 회 및 디클로로메탄으로 3 회 세척하여 상기 화학식 VI로 표시되는 펩타이드를 수득하였다. 실시예 2 ： 화학식 VE로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 VH

Mpr ( Tr t ) -Tyr ( t -Bu ) -Phe-G 1 n ( Tr t )-Asn(Trt )-Cys(Trt )-Pro-D- Arg(pbf)-0H 상기 실시예 1 에서 얻은 상기 화학식 VI 로 표시되는 펩타이드가 결합된 레진에 디클로로메탄 ： 아세트산 ： 트리플루오로에탄올 (Alfa Aesar) = 8 ： 1 ： 1 의 흔합액 (300 ml)을 넣고 2 시간 동안 교반하였다. 감압 여과하여 레진을 제거하고， 여과액을 감압 농축하여 상기 화학식 VC로 표시되는 크루드 펩타이드를 22.1 g 올 수득하였다. 크루드 펩타이드의 수율은 98% 였고， HPLC순도는 96.5%였다. 실시예 3 ： 화학식 VI으로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식

Mpr (Trt) -Tyr ( t -Bu ) -Phe-G ln(Trt )-Asn(Trt ) -Cys (Trt) -Pro-D- Arg(pbf)-Gly- H₂ 상기 실시예 2 에서 얻은 상기 화학식 VE로 표시되는 크루드 펩타이드 (22.9 g, 10 麵 ol)을 디클로로메탄 50 ml 에 녹이고ᅳ 프롤린에틸아미드 염산염 (2.7 g, 15 瞧 ol), 1-히드록시벤조트리아졸 (2 g, 15隱 olKGLS)을 넣고 녹인 후， 디이소프로필에틸아민 (1.9 g, 15 mmol) (Dae Jung)을 넣고， Ν,Ν-디메틸포름아미드을 넣어 부피가 100 ml 이 되게 한다. 여기에 HBTUC5.7 g, 15 画 ol ) (Novabiochem)을 서서히 넣어주고, 0°C에서 4시간 반웅시킨다.

반웅이 완료된 후, 유기층을 0.2 N 염산 100 ml 로 씻은 후 분층한 디클로로 메탄을 분리해낸다. 100 ᅵ ill 물로 한 번 더 씻은 후 디클로로메탄올 분리하고, 10 % 탄산염 100 ml 로 씻은 다음 디클로로메탄 층을 분리해 낸다. 유기층을 무수 Na₂S0₄ 로 건조하고， 여과 및 감압 증류하여 상기 화학식 I로 표시되는 펩타이드 22.0 g을 수득하였다. 실시예 4 ： 화학식 K으로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 K

Mpr-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys-Pro-D-Arg(pbf)-Gly-NH₂

I I ^"

이황학결합

상기 실시예 3 에서 얻은 화학식 VDI로 표시되는 크루드 펩타이드 (4.7 g)에 디클로로메탄 2 L를 넣고， I₂(0.5 g, 20 隱 ol)을 녹인 메탄을 25 ml 을 천천히 적가한 후， 15 분간 더 교반시켰다. 1 N 의 Na₂S₂0₃ 수용액 (1 L)을 넣어 과량의 1₂ 을 제거하고， 층을 분리한 후， 유기층을 1 N 의 시트르산 수용액으로 세척하였다. 유기층을 Na₂S0₄로 건조하고, 여과 및 감압증류를 수행하여 화학식 K으로 표시되는 펩타이드 3.5 g을 수득하였다. 실시예 5 ： 화학식 V으로 표시되는 데스모프레신의 제조

화학식 V

Mpr-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-PiO-D-Ai'g-Gly-NH₂

I I

이황화결합

상기 실시예 4 에서 얻은 화학식 K으로 표시되는 펩타이드 3.5 g 을 ,삼불화초산 (Dae Jung) ： 트리이소프로필실란 (Al fa Aesar) ： 물 = 95 ： 2.5 ： 2.5 (40 ml) 흔합용액에 넣고, 2 시간 동안 탈 보호화 반웅을 수행하였다. 용매를 감압증류하고 터트-부틸메틸에테르 (60 ml) (Dae Jung)를 넣어 얻은 고체를 여과하여 크루드 데스모프레신 2.0 g 을 수득하였다. 역상 HPLCC220 nm , 10 ml /분, 10 미크론 C18 컬럼에서 20 분 내에 0. 1% 아세트산 내 아세토니트릴 초기농도 15%에서 30%로 증가)로 정제하여 화학식 V 로 표시되는 데스모프레신 0.86 g 을 수득하였다. 총 수율은 40% 였으며， HPLC의 순도는 99.7% 였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】

【청구항 11

다음의 단계를 포함하는 데스모프레신의 제조방법:

(a) 고체상 (sol id-phase) 합성 방법으로 레진이 부착된 하기 화학식 I로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)에서 수득한 펩타이드에서 레진을 제거하여 하기 화학식 Π로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계 ;

(c) 상기 단계 (b)에서 수득한 펩타이드를 액상 (solution— phase) 합성 방법으로 H-Gly— NH₂ · HC1 와 결합 반웅올 수행하여 하기 화학식 ΠΙ으로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계;

(e) 상기 단계 (d)에서 수득한 펩타이드에서 탈보호화 반웅올 통하여 하기 화학식 V으로 표시되는 데스모프레신을 수득하는 단계. 화학식 I

Mp R^-TyKR^-Phe-Gln ³)— Asn(R³)— Cys -Pro-D-Ar^R⁴)-^레진

화학식 Π

Mpr R^-TyrCR^-Phe-GlnCR^-AsnCR^-CysCR^-Pro-D-ArgCR^-OH

화학식 m

MprCR^-TyrCR^-Phe-Gln R^-AsnCR^-CysCR^-Pro-D-ArgiR^-Gly^

화학식 IV

Mpr-Tyr(R²)-Phe-Gln( ³)-Asn(R³)-Cys-Pro-D-Ai-g(R⁴)-Gly-NH₂

이황화결합

화학식 V

Mpr-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-PiO-D-Arg-Gly-NH₂

이황화결합 상기 화학식에서 , R 은 알파-아미노 보호기， R¹은 티오 보호기 , R²는 수소 또는 수산기 보호기 , R³는 수소 또는 아미드 보호기， R⁴는 구아니딘 보호기 이다.

【청구항 2】

제 1 항에 있어서， 상기 R¹ 은 수소, 트리페닐메틸기 또는 아세트아미노메틸기인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조방법

【청구항 3】

제 1 항에 있어서， 상기 R² 은 수소， 파라-메록시벤질기, 메톡시메틸기， 벤질옥시메틸기， 테트라히드로피란기， 테트라히드로퓨란기, 터트-부틸기， 트리페닐메틸기， 벤질기, 알릴기， 트리메틸실릴기, 터트- 부틸디메틸실릴기， 트리페닐실릴기， 트리이소프로필실릴기, 터트- 부틸카르보닐기, 아세틸기 또는 벤조일기인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조방법.

【청구항 4】

제 1 항에 있어서, 상기 R³은 수소， 메록시메틸기， 벤질옥시메틸기 트리페닐 메틸기, 터트-부틸디메틸실릴기， 트리페닐실릴기 또는 트리이소프로필실릴기인 것을 특징으로 하는 데스 모프레신의 제조방법.

【청구항 5】

제 1 항에 있어서， 상기 R⁴ 은 터트-부틸옥시카보닐기， 벤질옥시카보닐기, 메특시메틸기， 벤질옥시메틸기， 트리페닐메틸기， 벤질기, 알릴기， 터트-부틸디메틸실릴기， 트리페닐실릴기 또는 트리이소프로필실릴기이고 니트로기, Pmc , Mt r , Pbf 또는 Tos 기인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조방법.

【청구항 6】 제 1 항에 있어서， 상기 단계 (a)에서 레진은 2-클로로트리틸 레진, 트리틸 레진， 4-메틸트리틸 레진 또는 4-메록시트리틸 레진인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법 .

【청구항 7】

제 1 항에 있어서， 상기 단계 (b)에서의 레진을 제거하는 과정은 산성 용액의 존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법 .

【청구항 8】

제 7 항에 있어서， 상기 산성 용액은 디클로로메탄, 아세트산 및 트리플루오로에탄올의 흔합용액인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법ᅳ

【청구항 9】

제 8 항에 있어서， 상기 산성 용액은 디클로로메탄 ： 아세트산 ： 트리플루오로에탄을의 부피비가 8 ： 1 ： 1 인 흔합용액인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법 .

【청구항 10】

제 8 항에 있어서， 상기 산성 용액은 0.5 내지 5% 트리플루오로아세트산이 포함된 디클로로메탄 용액인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법 .

【청구항 11】

제 1 항에 있어서， 상기 단계 (c)에서 사용되는 결합 시약은 DCC , DIC , BOP, PyBOP, HBTU, TBTU, HATU, TATU, CDI 및 EDC · HC1 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조방법.

【청구항 12】 제 1 항에 있어서， 상기 단계 (c)에서 결합 액상반웅에 사용되는 유기용매는 디클로로메탄 1， 2-디클로로에탄， 클로로포름 및 Ν,Ν- 디메틸포름아미드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조방법.

【청구항 13】

제 1 항에 있어서， 상기 단계 (c)에서의 반웅 온도는 -20 ~ 5(rc인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법 . 【청구항 14】

제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 사용되는 유기용매는 디클로로메탄, 1， 2-디클로로에탄， 클로로포름, 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 데스모프레신의 제조 방법 .