KR101694190B1

KR101694190B1 - 지코노티드의 제조방법

Info

Publication number: KR101694190B1
Application number: KR1020130090321A
Authority: KR
Inventors: 김종민; 김대영; 박진석; 이은숙; 김진권; 이서희
Original assignee: 애니젠 주식회사
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2013-07-30
Publication date: 2017-01-10
Also published as: KR20150015581A

Abstract

본 발명은 고상(solid phase) 합성방법을 통하여 펩타이드를 합성하는 통상적인 방법 대신에 초음파(sonication) 처리와 가열, 질소기류 하 조건으로 고상 합성을 진행(SPPS 방법)하거나 고상합성과 액상(solution-phase)합성을 혼합(수렴 방법)한 신규한 지코노티드(Ziconotide)의 제조방법이다. 본 발명에 따르면, 합성된 지코노티드의 분리 정제가 개선되어 상업적 대량 생산이 가능하다. 또한, 본 발명은 당업 기술분야에서 이용되는 방법으로 합성된 지코노티드 보다 수율 및 순도가 개선되어 생산비용 측면에서 경제적 효과가 있다.

Description

지코노티드의 제조방법{Process for the Preparation of Ziconotide}

본 발명은 신규한 지코노티드의 제조방법에 관한 것이다.

지코노티드(Ziconotide)는 특정 이온채널을 선택적으로 제어하는 신경질환 특이적인 치료제로 신경병증성 통증 치료제로 사용되고 있다. 일반적으로 전통적인 소분자 약물보다는 관리가 편리하지 않지만 지코노티드는 질병 원인을 표적으로 하는데 보다 큰 특수성을 제공하는 장점이 있다.

상기 지코노티드 펩타이드의 합성 방법에는 통상 고상(solid-phase)합성 방법과 액상(solution-phase)합성방법이 있다. 고상 합성방법에는 아미노산 서열을 고체 지지체에 부착시켜 조립을 완료한 후에 상기 지지체로부터 서열을 유리한다. 이 방법은 반응속도가 빠르고 부산물이 적고 또한 자동화가 용이하다는 장점이 있으나 과량의 원료를 사용해야 하는 단점이 있다. 반면 액상 합성 방법은 통상의 유기합성방법으로서 시약과 재료의 비용이 적게 드는 장점이 있지만 반응 단계수가 많고 각 단계별로 중간체를 유리해야 하고 또한 이성체가 생길 가능성이 있어 정제가 어려운 단점이 있다.

선행기술로써 특허(US2011/0171163 A1)에는 당 특허와 같은 고상 반응을 이용한 지코노티드의 제조법을 보고하였으나, 비교적 고가인 폴리머 레진을 사용하였고 수율이 낮은 결과를 보였다. 또한, 다른 특허(CN101709082 B)에서는 고상반응법의 지코노티드 합성방법을 묘사하였으나, 여기에서도 역시 펩타이드를 일반적인 고상반응법으로 제조함으로써 지코노티드의 합성효율이 낮아 불순물의 증가 및 최종 전체 수율이 낮은 단점이 있다.

상기에서 언급한 바와 같이 지코노티드의 제조를 위한 종래의 기술들은 합성시 개선 되어야 하는 수많은 문제점을 가지고 있다. 따라서 지코노티드를 효과적으로 제조하는 방법에 대한 연구는 의약산업 분야에서 매우 중요한 기술이라 할 수 있겠다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 고상 합성법을 이용한 지코노티드의 기존 합성 방법의 문제점을 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 지코노티드 합성 중 초음파 처리, 가열 및 질소 기류 하 조건을 확립함으로써 높은 수율 및 순도로 지코노티드를 제조할 수 있을 뿐 아니라, 고상(solid-phase)합성과 액상(solution-phase)반응을 결합한 수렴(Convergnet) 합성 제조방법을 규명함으로서 본 발명의 신규한 지코노티드 합성법을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 신규한 지코노티드의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 지코노티드의 제조방법(SPPS 방법:고상 펩타이드 합성방법)을 제공한다:

(a) 질소 기류 하에서 초음파를 인가하는 고상(solid-phase) 합성 방법으로 레진이 부착된 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;

(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 펩타이드에서 레진 및 보호기를 제거하는 탈보호화 반응을 통하여 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드에서 이황화결합 형성 반응을 수행하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 지코노티드를 얻는 단계;

화학식 Ⅰ

H-Cys(R¹)-Lys(R²)-Gly-Lys(R²)-Gly-Ala-Lys(R²)-Cys(R¹)-Ser(R³)-Arg(R⁴)-Leu-Met-Tyr(R³)-Asp(R⁵)-Cys(R¹)-Cys(R¹)-Thr(R³)-Gly-Ser(R³)-Cys(R¹)-Arg(R⁴)-Ser(R³)-Gly-Lys(R²)-Cys(R¹)-레진

화학식 Ⅱ

H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH₂

화학식 Ⅲ

상기 화학식 Ⅰ에서, R¹은 수소 또는 티올 보호기이고, R²는 수소 또는 아민의 보호기이며, R³는 수소 또는 1차 알콜의 보호기이고, R⁴는 수소 또는 구아니딘의 보호기이며, R⁵는 카르복실산 보호기이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 지코노티드의 제조방법(수렴(Convergent) 합성방법)을 제공한다:

(a) 질소 기류 하에서 초음파를 인가하는 고상(solid-phase) 합성 방법으로 레진이 부착된 하기 화학식 Ⅳ 및 화학식 Ⅴ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;

(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 펩타이드로부터 레진을 제거하여 하기 화학식 Ⅵ 및 화학식 Ⅶ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;

(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 화학식 Ⅶ로 표시되는 펩타이드를 액상(solution-phase) 합성 방법으로 H-Cys(R¹)-NH₂와 커플링반응을 통하여 하기 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;

(d) 상기 단계 (b) 및 (c) 에서 얻은 화학식 Ⅵ 및 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드들을 수렴(convergent) 반응시켜 하기 화학식 Ⅸ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;

(e) 상기 단계 (d)에서 얻은 펩타이드에서 보호기를 제거하는 탈보호화 반응을 통하여 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; 및

(f) 상기 단계 (e)에서 얻은 펩타이드에서 이황화결합 형성 반응을 수행하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 지코노티드를 얻는 단계;

화학식 Ⅱ

화학식 Ⅲ

화학식Ⅳ

R²-Cys(R¹)-Lys(R²)-Gly-Lys(R²)-Gly-Ala-Lys(R²)-Cys(R¹)-Ser(R³)-Arg(R⁴)-Leu-레진

화학식 Ⅴ

R²-Met-Tyr(R³)-Asp(R⁵)-Cys(R¹)-Cys(R¹)-Thr(R³)-Gly-Ser(R³)-Cys(R¹)-Arg(R⁴)-Ser(R³)-Gly-Lys(R²)-레진

화학식 Ⅵ

R²-Cys(R¹)-Lys(R²)-Gly-Lys(R²)-Gly-Ala-Lys(R²)-Cys(R¹)-Ser(R³)-Arg(R⁴)-Leu-OH

화학식 Ⅶ

R²-Met-Tyr(R³)-Asp(R⁵)-Cys(R¹)-Cys(R¹)-Thr(R³)-Gly-Ser(R³)-Cys(R¹)-Arg(R⁴)-Ser(R³)-Gly-Lys(R²)-OH

화학식 Ⅷ

R²-Met-Tyr(R³)-Asp(R⁵)-Cys(R¹)-Cys(R¹)-Thr(R³)-Gly-Ser(R³)-Cys(R¹)-Arg(R⁴)-Ser(R³)-Gly-Lys(R²)-Cys(R¹)-NH₂

화학식 Ⅸ

R²-Cys(R¹)-Lys(R²)-Gly-Lys(R²)-Gly-Ala-Lys(R²)-Cys(R¹)-Ser(R³)-Arg(R⁴)-Leu-Met-Tyr(R³)-Asp(R⁵)-Cys(R¹)-Cys(R¹)-Thr(R³)-Gly-Ser(R³)-Cys(R¹)-Arg(R⁴)-Ser(R³)-Gly-Lys(R²)-Cys(R¹)-NH₂

상기 화학식 Ⅳ 내지 화학식 Ⅸ에서, R¹은 수소 또는 티올 보호기이고, R²는 수소 또는 아민의 보호기이며, R³는 수소 또는 1차 알콜의 보호기이고, R⁴는 수소 또는 구아니딘의 보호기이며, R⁵는 카르복실산 보호기이다.

본 발명자들은 고상 합성법을 이용한 지코노티드의 기존 합성 방법의 문제점을 개선하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 지코노티드 합성 중 초음파 처리, 가열 및 질소 기류 하 조건을 확립함으로써 높은 수율 및 순도로 지코노티드를 제조할 수 있을 뿐 아니라, 고상(solid-phase)합성과 액상(solution-phase)반응을 결합한 수렴(Convergnet) 합성 제조방법을 규명하였다.

약어의 정리

본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어 위원회(Commission of Biochemical Nomenclature)에서 권장하는 용어에 기초한다(Biochemistry, 11:1726-1732(1972)).

본 명세서에서 사용한 보호기의 약어는 다음과 같다:

Thr: 트레오닌(Threonine)

Glu: 글루타믹 애시드(Glutamic acid)

Ser: 세린(Serine)

Arg: 아르기닌(Arginine)

Leu: 루신(Leucine)

Ala: 알라닌(Alanine)

Gly: 글리신(Glycine)

Asp: 아스파틱 애시드(Aspartic acid)

Lys: 리이신(Lysine)

Met: 메티오닌(Methionine)

Tyr: 타이로신(Tyrosine)

Cys: 시스테인(Cysteine)

Boc: 터트-부틸옥시카보닐(tert-butyloxycarbonyl)

tBu: 터트-부틸(tert-butyl)

Fmoc: 9-플루오레닐메톡시옥시카보닐(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)

Trt: 트리틸(trityl 또는 triphenylmetyl)

Mtt: 4-메틸트리페닐메틸(4-Methyltriphenylmetyl)

Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐(2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl)

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 SPPS 방법 및 수렴 합성방법에 의한 지코노티드의 제조방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

SPPS 방법에 의한 지코노티드의 제조

단계 (a): 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드 수득 단계

우선, 질소 기류 하에서 초음파를 인가하는 고상 합성 방법으로 레진이 부착된 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 얻는다. 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드는 당업계에서 통상적으로 사용하는 고상 합성 방법에 의해 제조된다(Merrifield, R. B., J. Am . Chem . Soc . , 85:2149-2154(1963), Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal . Biochem ., 34:595-598(1970)). 즉, α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후, α-아미노 보호기를 제거하고 남은 α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 커플링하여 중간체를 얻는다.

적절한 보호기의 선택은 보호되는 작용기, 보호기가 노출되는 조건 및 그 분자내에 존재할 수 있는 다른 작용기에 따라 달라진다. 보호기는 합성 각 단계에서 ㈀ α-아미노보호기를 제거하기 위해 선택한 반응조건 및 시약에 대해 안정해야 하고, ㈁ 커플링반응에서 탈보호화반응이 일어나지 않아야 하며, ㈂ 원하는 아미노산 사슬을 포함하는 합성이 완결되었을 때 레진과의 분해 조건에서 안정하여야 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a)의 합성 방법은 25-45℃의 온도에서 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a)의 합성 방법은 25-40℃ 또는 30-40℃의 온도에서 실시한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a)의 합성 방법은 초음파를 2.5-6시간 인가하여 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a)의 합성 방법은 초음파를 2.5-5시간, 2.5-4시간 또는 2.5-3.5시간 인가하여 실시한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 Ⅰ의 펩타이드를 합성하는 과정에서 레진을 사용한다. 사용될 수 있는 레진은 제조된 펩타이드의 측쇄 보호기를 완전히 보존시킬 수 있는 온화한 산성조건하에서 쉽게 분해될 수 있는 통상적인 레진을 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 레진은 링크 아미드 레진 또는 링크 아미드 MBHA 레진이고, 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 레진은 링크 아미드 MBHA 레진이다.

단계 (b): 레진 및 보호기 제거를 통한 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드 수득 단계

단계 (a) 실시 이후, 상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물로부터 탈보호화 반응을 통해 레진 및 보호기가 제거된 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 수득한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b)에서의 레진 및 보호기를 제거하는 과정은 산성 용액의 존재 하에서 실시된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 산성 용액은 삼불화초산, 물, 티오아니솔 및 에탄디티올의 혼합용액; 삼불화초산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합용액; 또는 삼불화초산, 트리이소프로필실렌, 물 및 에탄디티올의 혼합용액이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 산성 용액은 삼불화초산, 물, 티오에니솔 및 에탄디티올의 혼합용액이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 산성 용액은 삼불화초산:티오에니솔:2,2-에탄디티올:물의 부피비가 87.5:12.5:5:5인 혼합용액이다.

단계 (c): 이황화결합 형성 반응을 통한 화학식 Ⅲ 으로 표시되는 지코노티드 수득 단계

단계 (b) 실시 이후, 상기 화학식 Ⅱ로 표시되는 화합물에서 이황화결합 형성 반응을 통해 화학식 Ⅲ으로 표시되는 지코노티드를 수득한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (c)에서의 이황화결합을 형성하는 과정은 pH 6.5-8.5에서 실시된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (c)에서의 이황화결합을 형성하는 과정은 pH 7.0-8.5에서 실시된다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (c)에서의 이황화결합을 형성하는 과정은 pH 7.0-8.0에서 실시된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 R¹은 수소 또는 터트-부틸기, 벤조일기, 벤질기, p-메톡시벤질기, 벤질옥시카보닐기, p-니트로벤질기, 아세트아미도메틸기, 디페닐메틸기, 트리페닐메틸(트리틸: Trt)기 및 아세트아미노메틸기로 구성된 군으로부터 선택되는 티올 보호기이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 티올 보호기는 디페닐메틸기, 트리페닐메틸기이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, Trt기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 R²는 수소 또는 터트-부틸옥시카보닐기(Boc), 트리페닐메틸기, 9-플루오레닐메틸카보닐기(Fmoc), 벤질옥시카보닐기, p-니트로벤질옥시카보닐기, 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 파라-톨루엔설포닐기, 메탄설포닐기, 메톡시메틸기로 구성된 군으로부터 선택되는 아민의 보호기이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 아민의 보호기는 Boc기 또는 Fmoc기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 R³은 수소 또는 파라-메톡시벤질기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 테트라히드로피란기, 테트라히드로퓨란기, 터트-부틸기, 트리페닐메틸기(트리틸), 벤질기, 알릴기, 트리메틸실릴기, 터트-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 터트-부틸카르보닐기, 아세틸기 및 벤조일기로 구성된 군으로부터 선택되는 1차 알콜의 보호기이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 1차 알콜의 보호기는 터트-부틸기, 트리페닐메틸기(트리틸)기 또는 벤질기이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 터트-부틸기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 R⁴은 수소 또는 터트-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기(트리틸), 벤질기, 알릴기, 터트-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 니트로기, 2,2,5,7,8-펜타메틸-크로멘-6-설포닐기(Pmc), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐기(Mtr), 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐기(Pbf) 및 토루엔설포닐기(Tos)로 구성된 군으로부터 선택되는 구아니딘의 보호기이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 구아니딘의 보호기는 Pbf 또는 Pmc기이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면 Pbf기이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 R⁵은 수소 또는 터트-부틸기, 메틸기, 벤질기로 구성된 군으로부터 선택되는 카르복실산 보호기이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 카르복실산 보호기는 t-부틸기 또는 벤질기이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면 t-부틸기이다.

수렴 합성방법에 의한 지코노티드의 제조

단계 (a): 화학식 Ⅳ 및 화학식 Ⅴ로 표시되는 펩타이드의 수득 단계

우선, 질소 기류 하에서 초음파를 인가하는 고상 합성 방법으로 레진이 부착된 화학식 Ⅳ 및 화학식 Ⅴ로 표시되는 펩타이드를 얻는다. 화학식 Ⅳ 및 화학식 Ⅴ로 표시되는 펩타이드는 당업계에서 통상적으로 사용하는 고상 합성 방법에 의해 제조된다. 즉, α-아미노기 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후, α-아미노 보호기를 제거하고 이어 α-아미노기 및 보호화 측쇄 작용기를 가지는 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 커플링하여 중간체를 얻는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 Ⅳ 및 화학식 Ⅴ로 표시되는 펩타이드를 합성하는 과정에서 레진을 사용한다. 사용될 수 있는 레진은 제조된 펩타이드의 측쇄 보호기를 완전히 보존시킬 수 있는 온화한 산성조건하에서 쉽게 분해될 수 있는 통상적인 레진을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 레진은 트리틸클로라이드 레진, 2-클로로트리틸 레진, 4-메틸트리틸 레진 또는 4-메톡시트리틸 레진이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 레진은 트리틸클로라이드 레진 또는 2-클로로트리틸 레진이며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 2-클로로트리틸 레진이다.

단계 (b): 화학식 Ⅵ 및 화학식 Ⅶ로 표시되는 펩타이드의 수득 단계

이어, 상기 화학식 Ⅳ 및 화학식 Ⅴ로 표시되는 화합물을 온화한 산성조건하에서 레진을 제거하여 화학식 Ⅵ 및 화학식 Ⅶ의 펩타이드를 얻는다. 이 때, 사용할 수 있는 산성조건은 아미노산 사슬의 측쇄 보호기가 유지될 수 있는 온화한 조건이어야 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 레진을 제거하는 과정은 산성 용액의 존재 하에서 실시된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 산성 용액은 디클로로메탄, 아세트산 및 트리플루오로에탄올의 부피비가 각각 8:1:1로 포함된 용액 또는 0.5-5 (부피/부피)% 삼불화초산이 포함된 디클로로메탄 용액 하에서 수행한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 삼불화초산의 (부피/부피)%는 0.5-3 (부피/부피)%, 0.5-2 (부피/부피)%, 0.5-1.5 (부피/부피)% 또는 0.8-1.2 (부피/부피)%이다.

단계 (c): 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드의 수득 단계

단계 (b)에서 얻은 화학식 Ⅶ로 표시되는 펩타이드를 액상 합성 방법으로 H-Cys(R¹)-NH₂와 커플링반응을 통하여 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드를 얻는다.

이 과정은 본 발명의 제조방법에서 특이한 과정 중 하나로써 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드에서 Cys 서열을 제외한 모든 서열은 고상합성법에서 제조되지만, 마지막 C-말단의 Cys 잔기는 액상반응을 통하여 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드를 완성한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (c)에서 사용되는 커플링 시약은 N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide: DCC), N,N'-디이소프로필 카르보디이미드(N,N'-diisopropyl carbodiimide: DIC), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate: BOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(피롤이디노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(pyrrolidino)-phosphonium hexafluorophosphate: PyBOP), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-Benzotriazole-1,1,3,3-tetramethyluronium- hexafluorophosphate: HBTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl- uronium tetrafluoroborate: TBTU), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate: HATU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(0-(7- Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate: TATU), N,N'-카보닐디이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole: CDI), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-원 (3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one: DEPBT), 브로모-트리스-피롤이디노-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate: PyBrOP), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (1-hydroxy-7-azabenzotriazole: HOAt), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트라아진-3-일)유라니움 테트라플루오로보레이트 (N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-yl)uranium tetrafluoroborate: TDBTU), O-(N-숙신이미딜)-1,1,3,3-테트라메틸 우라니움 테트라플루오로보레이트 (O-(N-Succinimidyl)-1,1,3,3-tetramethyl uranium tetrafluoroborate: TSTU), 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미니움 헥사플루오로포스페이트(2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate: HCTU) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로크롤라이드(1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride: EDC.HCl)로 구성된 군으로부터 선택적으로 사용될 수 있고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, HBTU 또는 EDC.HCl이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면 EDC.HCl이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (c)의 커플링 액상 반응에서 사용되는 용매는 유기용매이고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름 및 디메틸포름아미드로 구성된 군으로부터 선택된 1이상의 용매이며, 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드 또는 디클로로메탄과 디메틸포름아미드의 혼합용매이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 디클로로메탄과 디메틸포름아미드의 혼합용매이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (c)의 커플링 반응의 반응 온도는 -20-50℃이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (c)의 단계 (c)의 커플링 반응의 반응 온도는 -10-50℃, -5-50℃, -5-25℃, -5-15℃, -5-5℃, -2-5℃ 또는 -2-2℃이다.

단계 (d): 수렴( convergent ) 반응을 통한 화학식 Ⅸ로 표시되는 펩타이드의 수득 단계

이어, 단계 (b) 및 (c)에서 얻은 화학식 Ⅵ 및 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드들을 수렴(convergent) 반응시켜 하기 화학식 Ⅸ로 표시되는 펩타이드를 얻는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (d)의 수렴 반응은 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt) 및 에틸렌디클로라이드(EDC) 용매 하에서 실시한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (d)의 수렴 반응은 5℃ 이하에서 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (d)의 수렴 반응은 -20-5℃, -10-5℃, -5-5℃ 또는 0-5℃에서 실시한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (d)의 수렴 반응은 5-15시간 동안 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (d)의 수렴 반응은 8-12시간 또는 9-11 시간 동안 실시한다.

단계 (e): 보호기 제거를 통하여 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드의 수득

화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드는 상기 단계 (d)에서 얻은 펩타이드로부터 당업계에서 통상적으로 이용하는 반응 조건하에서 탈보호화반응을 수행하여 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b)에서의 보호기를 제거하는 과정은 산성 용액의 존재 하에서 실시된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 산성 용액은 삼불화초산, 물, 티오아니솔 및 에탄디티올의 혼합용액; 삼불화초산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합용액; 또는 삼불화초산, 트리이소프로필실렌, 물 및 에탄디티올의 혼합용액이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 산성 용액은 삼불화초산, 물, 티오에니솔 및 에탄디티올의 혼합용액이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 산성 용액은 삼불화초산:티오에니솔:2,2-에탄디티올:물의 부피비가 87.5:12.5:5:5인 혼합용액이다.

단계 (f): 이황화결합 형성 반응을 통한 화학식 Ⅲ 으로 표시되는 지코노티드 수득 단계

단계 (e) 실시 이후, 상기 화학식 Ⅱ로 표시되는 화합물에서 이황화결합 형성 반응을 통해 화학식 Ⅲ으로 표시되는 지코노티드를 수득한다.

본 발명의 R¹-R⁵는 SPPS 방법에서 개시된 펩타이드의 R¹-R⁵와 동일하기 때문에, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 상술한 SPPS 방법(고상 펩타이드 합성방법)에 의한 지코노티드의 제조방법은 당업계에서 지코노티드를 생산하기 위하여 이용하는 고상 합성방법 보다 높은 수득율로 제조가 가능하며, 특히 고순도(예컨대 98%이상의 순도)로 정제된 지코노티드를 제조할 수 있는 효과를 발휘한다(본원발명의 실시예 참조). 본 발명의 상술한 수렴 합성방법에 의한 지코노티드의 제조방법 역시 당업계에서 지코노티드를 생산하기 위하여 이용하는 액상 합성 방법 또는 고상 합성방법보다 불순물이 적은 매우 향상된 수득율로 지코노티드 제조가 가능하며, 특히 고순도(예컨대 99% 이상의 순도)로 정제된 지코노티드를 제조할 수 있는 효과를 발휘한다(본원발명의 실시예 참조).

또한, 본 발명의 방법에 의하여 지코노티드 펩타이드를 대량생산하는 경우 제조 수득율 면에서 종래의 제조 방법보다 매우 큰바(예컨대, SPPS 방법: 15% 이상의 수율 및 수렴 합성방법: 20% 이상의 수율) 경제적인 효과를 가져올 수 있다.

상술한 내용을 바탕으로 SPPS 방법(반응식 1) 및 수렴 합성방법(반응식 2)에 의한 지코노티드를 제조하는 전체 공정을 정리하면 다음과 같다:

반응식 1

반응식 2

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 고상(solid-phase)합성을 초음파(sonication) 처리와 가열, 질소기류 하 조건에서 진행하는 신규한 지코노티드 제조방법(SPPS 방법)을 제공한다.

(b) 또한, 본 발명은 고상(solid-phase)합성과 액상(solution-phase)반응을 혼합한 신규한 지코노티드 제조 방법(수렴 합성방법)을 제공한다.

(c) 본 발명은 합성된 지코노티드의 분리 정제가 개선되어 상업적 대량 생산이 가능하다.

(d) 또한, 본 발명은 당업 기술분야에서 이용되는 방법으로 합성된 지코노티드 보다 수율 및 순도가 개선되어 생산비용 측면에서 경제적 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 방법에 의해 제조된 지코노티드의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 지코노티드 제조 공정 중 SPPS 방법을 나타낸 것이다. 도 2에서의 영문 표기 및 표현은 본원발명의 상세한 설명에서 개시된 표현을 참조로 하여 해석된다.
도 3은 지코노티드 제조 공정 중 수렴(Convergent) 방법을 나타낸 것이다. 도 3에서의 영문 표기 및 표현은 본원발명의 상세한 설명에서 개시된 표현을 참조로 하여 해석된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.

실시예 1 : 화학식 1로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 1

H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-링크(Rink) 아미드(amide) MBHA 레진

9-플루오레닐옥시카보닐-아미노산-OH 커플링 반응

(a) 9- 플루오레닐옥시카보닐 - Cys ( Trt )-링크 아미드 MBHA 레진의 수득

여과막이 장착되고 질소 버블링(bubbling) 및 초음파 처리가 가능한 특수제작 반응기에 링크 아미드 MBHA 레진(0.30 mmol/g, 30 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (500 ml, 대정화금)를 넣고 15분 간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 20% 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 500 ml를 상기 레진에 넣은 다음, 15분 간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후 감압하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 6회 세척하였다.

상기 반응에서 얻어진 레진에 9-플루오레닐옥시카보닐-Cys(Trt)-OH(87.9 g, 150 mmol, 5.0 당량) 및 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.)의 N,N-디메틸포름아미드 500 ml를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름이미드 용액(75 ml, 2M 용액, 5.0 당량)을 첨가한 후, 4 시간 동안 반응시켰다. 반응은 질소기류 하에서 진행하였으며 초음파 처리를 반응시작 시 3시간 처리하였고, 반응기 내부 온도를 30-40℃로 유지하였다.

(b) H- Cys ( Trt )-링크 아미드 MBHA 레진의 수득

상기 반응(a)에서 얻은 9-플루오레닐옥시카보닐-Cys(Trt)-링크 아미드 MBHA 레진에 20% 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 500 ml를 상기 레진에 넣은 다음, 15분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후 감압하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 6회 세척하여 H-Cys(Trt)-링크 아미드 MBHA 레진을 얻었다.

(c) 9-플루오레닐옥시카보닐-아미노산-OH의 커플링 및 최종 물질 수득

상기 반응 (a) 및 (b) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 유도체를 순차적으로 커플링 하였다. 위 과정을 반복 수행한 후 화학식 1로 표시되는 펩타이드를 얻었다. 다음은 각 단계별 아미노산 및 반응 시약의 조성이다:

9-플루오레닐옥시카보닐-Lys(Boc)-OH(70.3 g, 150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Gly-OH(44.6 g, 150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(tBu)-OH(57.5 g,150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-OH(97.3 g, 150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Cys(Trt)-OH(87.9 g, 150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(tBu)-OH(57.5 g, 150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Gly-OH(44.6 g, 150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸 (22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Thr(tBu)-OH(59.6 g, 150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Cys(Trt)-OH(87.9 g,150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Asp(tBu)-OH(61.7 g, 150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Tyr(tBu)-OH(68.9 g, 150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Met-OH(55.7 g, 150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-OH(53.0 g, 150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-OH(46.7 g, 150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Gly-OH(44.6 g,150 mmol, 5 당량, GL Biochem Ltd.), 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.), 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5 당량)

상기 과정에서 얻은 9-플루오레닐옥시카보닐-AA(25mer)-링크 아미드 MBHA 레진에 20% 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 700 ml를 상기 레진에 넣은 다음, 20분 간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후 감압하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 3회 및 디클로로메탄 3회 세척하여 화학식 1으로 표기되는 펩타이드를 얻었다.

실시예 2 : 화학식 3으로 표시되는 지코노이드의 제조

화학식 2

화학식 3

상기 실시예 1에서 얻은 상기 화학식 1으로 표시되는 펩타이드에 삼불화초산:티오에니솔:2,2-에탄디티올:물=87.5:12.5:5:5 혼합용액 1500 ml를 넣고, 3시간 동안 탈 보호화 반응을 수행하였다. 이어서 반응액을 여과하여 탈기된 레진을 제거하고 여액에 냉각된 디에틸에테르 6000 ml를 넣어 고체를 형성시켰다. 얻어진 고체를 여과하고, 디에틸에테르 2000 ml로 세척하고 이 과정을 3회 반복한 후 건조하여 화학식 2로 표시되는 불순물이 포함된 펩타이드 83.3 g(수율 105%, HPLC 순도 30-40%)을 얻었다.

이어서, NH₄OAc 완충액 pH 7.0-8.0에서 이황화결합(Disulfide bonding)을 형성(화학식 2 아미노산 서열의 1번과 16번 아미노산, 8번과 20번 아미노산, 15번과 25번 아미노산 사이에 형성)시키고 역상 HPLC(230 nm, 10 ml/분, 10 미크론 C18 컬럼에서 30분 내 0.1% 삼불화초산 내 아세토니트릴 초기농도 10%에서 30%로 증가)로 정제하여 화학식 3으로 표시되는 지코노티드 12.5 g(수율 15%, HPLC순도 98%)을 얻었다.

실시예 3 : 화학식 6 및 화학식 7로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 6

Boc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-OH

화학식7

Fmoc-Met-Tyr(tBu)-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-OH

(a-1) 9- 플루오레닐옥시카보닐 - Leu -2- 클로로트리틸 레진의 제조

여과막이 장착된 고상(solid-phase)합성 반응기(제이오텍)에 2-클로로트리틸 클로라이드 레진(f=1.40 mmol/g의 레진, 30 mmol, 비드텍) 및 디클로로메탄(600 ml, 대정화금)를 넣고, 15분 간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-OH(15.9 g, 45 mmol, 1.5 당량, GL Biochem Ltd.)이 포함된 디클로로메탄(400 ml)을 상기 처리된 레진에 첨가하고, 이어서 디이소프로필에틸아민(45 ml, 90 mmol, 2 M 용액 3.0 당량, 대정화금)을 첨가한 후, 실온에서 8시간 동안 반응시켰다. 상기 반응결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 3회 세척한 후, 레진에 디클로로메탄:메탄올:디이소프로필에틸아민=17:2:1(부피 비, 600 ml)을 넣고 20분 간 교반시켰다. 반응결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 3회 세척한 후, 진공 하에서 건조하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다. 치환율은 0.75 mmol/g이었다.

(a-2) 9- 플루오레닐옥시카보닐 - Lys ( Boc )-2- 클로로트리틸 레진의 제조

여과막이 장착된 고상(solid-phase)합성 반응기(제이오텍)에 2-클로로트리틸 클로라이드 레진(f=1.40 mmol/g의 레진, 30 mmol, 비드텍) 및 디클로로메탄(600 ml, 대정화금)를 넣고, 15분 간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 9-플루오레닐옥시카보닐-Lys(Boc)-OH(28.1 g, 60 mmol, 2.0 당량, GL Biochem Ltd.)이 포함된 디클로로메탄(500 ml)을 상기 처리된 레진에 첨가하고, 이어서 디이소프로필에틸아민(60 ml, 120 mmol, 2 M 용액 4.0 당량, 대정화금)을 첨가한 후, 실온에서 8시간 동안 반응시켰다. 상기 반응결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 3회 세척한 후, 레진에 디클로로메탄:메탄올:디이소프로필에틸아민=17:2:1(부피 비, 600 ml)을 넣고 20분 간 교반시켰다. 반응결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 3회 세척한 후, 진공 하에서 건조하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Lys(Boc)-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다. 치환율은 0.65 mmol/g이었다.

(b) 9- 플루오레닐옥시카보닐 -아미노산- OH 커플링 반응

H- Leu (혹은 Lys ( Boc ))-2- 클로로트리틸 레진의 수득

여과막이 장착된 고상합성 반응기에 9-플루오레닐옥시카보닐-Leu(혹은 Lys(Boc))-2-클로로트리틸 및 N,N-디메틸포름아미드(500 ml, 대정화금)를 넣고, 15분 간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 20% v/v) 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(500 ml)를 상기 레진에 넣은 다음, 15분 간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 1회, 디클로로메탄으로 3회 및 N,N-디메틸포름아미드로 3회 세척하여 H-Leu(혹은 Lys(Boc))-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.

9- 플루오레닐옥시카보닐 (혹은 Boc )-아미노산- OH 의 커플링 및 최종 물질의 수득

상기 반응에서 얻어진 레진에 9-플루오레닐옥시카보닐-AA-OH(150 mmol, 5.0 당량) 및 1-하이드록시벤조트리아졸(22.3 g, 165 mmol, 5.5 당량, GL Biochem Ltd.)의 N,N-디메틸포름아미드 500 ml를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름이미드 용액(75 ml, 2 M 용액, 5.0 당량)을 첨가한 후, 6 시간 동안 반응시켰다. 반응은 질소기류 하에서 진행하였으며 초음파 처리를 반응시작 시 3시간 처리하였고, 반응기 내부 온도를 30-40℃로 유지하였다.

상기 과정을 아미노산 서열 순서(실시예 1 참조)대로 반복하여, 다음 화학식 4 및 화학식 5로 표시되는 생산물을 얻었다.

화학식 4

Boc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-OH-2-클로로트리틸 레진

화학식 5

Fmoc-Met-Tyr(tBu)-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-2-클로로트리틸 레진

화학식 4와 화학식 5는 디클로로메탄:아세트산:트리플루오로에탄올=8:1:1의 혼합액(600 ml)를 넣고 2시간 동안 교반하였다. 감압 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 감압 농축하여 트리틸 레진이 화학식 4에서 제거된 화학식 6과 화학식 5에서 레진이 제거된 화학식 7로 표시되는 펩타이드를 얻었다.

실시예 4 : 화학식 8로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 8

Fmoc-Met-Tyr(tBu)-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-NH₂

화학식 5에서 트리틸 레진이 제거된 펩타이드(30 mmol)를 디메틸포름아미드 300 ml에 용해한 후 H-Cys(Trt)-NH₂(45 mmol, 1.5 당량), 1-히드록시벤조트리아졸(60 mmol, 2.0 당량)을 넣고 녹인 후, EDC.HCl(60 mmol, 1.5 당량, GL Biochem Ltd.)을 서서히 넣어 주고, 0℃에서 10시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 정제수 첨가하여 고체를 석출시킨 후 원심분리하여 고체를 분리하였다. 이후 정제수 세척을 2회 더 실시 후 씻은 다음 동결건조하여 상기 화학식 8로 표시되는 펩타이드를 얻었다.

위 생성물을 건조 후, 20 (v/v)% 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(500 ml)을 첨가한 다음, 15분 간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 정제수를 첨가하여 고체를 석출시킨 후 원심분리하여 고체를 분리하였다. 이후 정제수 세척을 추가 진행 후 동결건조하여 상기 화학식 8에서 9-플루오레닐옥시카보닐이 제거된 펩타이드를 수득하였다.

실시예 5 : 지코노티드의 제조

실시예 3의 최종 생성 펩타이드(화학식 6으로 표시되는 펩타이드) 30 mmol을 디메틸포름아미드 400 ml에 녹인 용액에 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)(60 mmol, 2 당량), EDC.HCl(60 mmol, 2 당량)을 첨가한 후 교반 진행하였다. 이 후 실시예 4에서 얻은 최종 생성 펩타이드(화학식 8에서 9-플루오레닐옥시카보닐이 제거된 펩타이드)(30 mmol)를 디메틸포름아미드 250 ml에 녹인 용액을 반응기에 서서히 첨가하였다. 반응은 5℃ 이하에서 10시간 동안 유지하였다. 반응 완료 후 정제수 첨가하여 고체를 석출시킨 후 원심 분리하여 고체를 분리하였다. 이후 정제수 세척을 2회 더 실시 후 씻은 후 동결건조하여 펩타이드를 얻어냈다.

상기에서 얻은 상기 펩타이드에 삼불화초산:티오에니솔:2,2-에탄디티올:물=87.5:12.5:5:5 혼합용액 1500 ml를 넣고, 3시간 동안 탈 보호화 반응을 수행하였다. 이어서 반응액을 여과하여 탈기된 레진을 제거하고 여액에 냉각된 디에틸에테르 6000 ml를 넣어 고체를 형성시켰다. 얻어진 고체를 여과하고, 디에틸에테르 2000 ml로 세척하고 이 과정을 3회 반복한 후 건조하여 화학식 2로 표시되는 불순물이 포함된 지코노티드 71.4 g(수율 90%, HPLC 순도 60%)을 얻었다.

이어서, NH₄OAc 완충액 pH 7.0-8.0에서 이황화결합을 형성(화학식 2 아미노산 서열의 1번과 16번 아미노산, 8번과 20번 아미노산, 15번과 25번 아미노산 사이에 형성)시키고 역상 HPLC(230 nm, 10 ml/분, 10 미크론 C18 컬럼에서 30분 내 0.1% 삼불화초산 내 아세토니트릴 초기농도 10%에서 30%로 증가)로 정제하고, 정제액을 초산염으로 치환하여 화학식 3로 표시되는 지코노티드 14.3 g(수율 20%, HPLC 순도 99%)을 얻었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

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다음의 단계를 포함하는 지코노티드의 제조방법:
(a) 질소 기류 하에서 초음파를 인가하는 고상(solid-phase) 합성 방법으로 레진이 부착된 하기 화학식 Ⅳ 및 화학식 Ⅴ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 펩타이드로부터 레진을 제거하여 하기 화학식 Ⅵ 및 화학식 Ⅶ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 화학식 Ⅶ로 표시되는 펩타이드를 액상(solution-phase) 합성 방법으로 H-Cys(R¹)-NH₂와 커플링반응을 통하여 하기 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
(d) 상기 단계 (b) 및 (c) 에서 얻은 화학식 Ⅵ 및 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드들을 수렴(convergent) 반응시켜 하기 화학식 Ⅸ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;
(e) 상기 단계 (d)에서 얻은 펩타이드에서 보호기를 제거하는 탈보호화 반응을 통하여 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; 및
(f) 상기 단계 (e)에서 얻은 펩타이드에서 Cys 아미노산 간의 이황화결합 형성 반응을 pH 6.5-8.5 조건 하에서 동시에 수행하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 지코노티드를 얻는 단계;
화학식 Ⅱ
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH₂
화학식 Ⅲ

화학식Ⅳ
R²-Cys(R¹)-Lys(R²)-Gly-Lys(R²)-Gly-Ala-Lys(R²)-Cys(R¹)-Ser(R³)-Arg(R⁴)-Leu-레진
화학식 Ⅴ
R²-Met-Tyr(R³)-Asp(R⁵)-Cys(R¹)-Cys(R¹)-Thr(R³)-Gly-Ser(R³)-Cys(R¹)-Arg(R⁴)-Ser(R³)-Gly-Lys(R²)-레진
화학식 Ⅵ
R²-Cys(R¹)-Lys(R²)-Gly-Lys(R²)-Gly-Ala-Lys(R²)-Cys(R¹)-Ser(R³)-Arg(R⁴)-Leu-OH
화학식 Ⅶ
R²-Met-Tyr(R³)-Asp(R⁵)-Cys(R¹)-Cys(R¹)-Thr(R³)-Gly-Ser(R³)-Cys(R¹)-Arg(R⁴)-Ser(R³)-Gly-Lys(R²)-OH
화학식 Ⅷ
R²-Met-Tyr(R³)-Asp(R⁵)-Cys(R¹)-Cys(R¹)-Thr(R³)-Gly-Ser(R³)-Cys(R¹)-Arg(R⁴)-Ser(R³)-Gly-Lys(R²)-Cys(R¹)-NH₂
화학식 Ⅸ
R²-Cys(R¹)-Lys(R²)-Gly-Lys(R²)-Gly-Ala-Lys(R²)-Cys(R¹)-Ser(R³)-Arg(R⁴)-Leu-Met-Tyr(R³)-Asp(R⁵)-Cys(R¹)-Cys(R¹)-Thr(R³)-Gly-Ser(R³)-Cys(R¹)-Arg(R⁴)-Ser(R³)-Gly-Lys(R²)-Cys(R¹)-NH₂
상기 화학식 Ⅳ 내지 화학식 Ⅸ에서, R¹은 수소 또는 티올 보호기이고, R²는 수소 또는 아민의 보호기이며, R³는 수소 또는 1차 알콜의 보호기이고, R⁴는 수소 또는 구아니딘의 보호기이며, R⁵는 카르복실산 보호기이다.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 합성 방법은 25-45℃의 온도에서 실시하는 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조방법.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 합성 방법은 초음파를 2.5-6시간 인가하여 실시하는 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조방법.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 레진은 트리틸클로라이드 레진, 2-클로로트리틸 레진, 4-메틸트리틸 레진 또는 4-메톡시트리틸 레진인 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조방법.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 레진을 제거하는 과정은 산성 용액의 존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조방법.
제 13 항에 있어서, 상기 산성 용액은 디클로로메탄, 아세트산 및 트리플루오로에탄올의 부피비가 8:1:1인 용액 또는 0.5-5 (부피/부피)% 삼불화초산이 포함된 디클로로메탄 용액인 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조방법.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 사용되는 커플링 시약은 N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide), N,N'-디이소프로필카르보디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(피롤이디노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트 (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트 (2-(7-Aza-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로니움 테트라플루오로보레이트 tetrafluoroborate(O-(7-Azabenzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate), N,N'-카보닐디이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-원 (3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one), (브로모-트리스-피롤이디노-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(Bromo-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (1-hydroxy-7-azabenzotriazole), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트라아진-3-일)유라니움 테트라플루오로보레이트 (N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-yl)uranium tetrafluoroborate), O-(N-숙신이미딜)-1,1,3,3-테트라메틸 우라니움 테트라플루오로보레이트 (O-(N-Succinimidyl)-1,1,3,3-tetramethyl uranium tetrafluoroborate), 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미니움 헥사플루오로포스페이트(2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로크롤라이드(1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)로 구성된 군으로부터 선택되는 커플링 시약인 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 사용되는 용매는 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름 및 디메틸포름아미드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 반응 온도는 -20℃-50℃인 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 수렴(convergent) 반응은 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 및 에틸렌디클로라이드 용매하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조방법.
삭제
제 9 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R¹은 수소 또는 터트-부틸기, 벤조일기, 벤질기, p-메톡시벤질기, 벤질옥시카보닐기, p-니트로벤질기, 아세트아미도메틸기, 디페닐메틸기, 트리페닐메틸(트리틸)기 및 아세트아미노메틸기로 구성된 군으로부터 선택되는 티올 보호기인 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조방법.
제 9 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R²는 수소 또는 터트-부틸옥시카보닐기, 트리페닐메틸기, 9-플루오레닐메틸카보닐기, 벤질옥시카보닐기, p-니트로벤질옥시카보닐기, 아세틸기, 트리플루오로아세틸기, 파라-톨루엔설포닐기, 메탄설포닐기, 메톡시메틸기로 구성된 군으로부터 선택되는 아민의 보호기인 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조방법.
제 9 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R³은 수소 또는 파라-메톡시벤질기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 테트라히드로피란기, 테트라히드로퓨란기, 터트-부틸기, 트리페닐메틸기(트리틸), 벤질기, 알릴기, 트리메틸실릴기, 터트-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 터트-부틸카르보닐기, 아세틸기 및 벤조일기로 구성된 군으로부터 선택되는 1차 알콜의 보호기인 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조방법.
제 9 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R⁴은 수소 또는 터트-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기(트리틸), 벤질기, 알릴기, 터트-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, 니트로기, 2,2,5,7,8-펜타메틸-크로멘-6-설포닐기, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐기, 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐기 및 토루엔설포닐기로 구성된 군으로부터 선택되는 구아니딘의 보호기인 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조방법.
제 9 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R⁵은 수소 또는 터트-부틸기, 메틸기, 벤질기로 구성된 군으로부터 선택되는 카르복실산 보호기인 것을 특징으로 하는 지코노티드의 제조방법.