CN101437836A

CN101437836A - 肽的硫酯化合物的制造方法

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Publication number: CN101437836A
Application number: CNA2007800158333A
Authority: CN
Inventors: 梶原康宏; 山本直毅; 南部由利; 深江一博; 朝井洋明
Original assignee: Otsuka Chemical Co Ltd
Current assignee: Sugar Lock Engineering Institute Co., Ltd.
Priority date: 2006-03-29
Filing date: 2007-03-28
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2027-03-28
Also published as: EP2000474B1; JP5328345B2; EP2000474A1; KR101462454B1; US20090137780A1; SG170022A1; KR20090007709A; EP2000474A4; JPWO2007114454A1; TW201109347A; CN101437836B; TWI450905B; WO2007114454A1; AU2007232742B2; TW200806686A; CA2647867C; DK2000474T3; AU2007232742A1; US8058394B2; TWI353989B

Abstract

本发明提供一种肽的硫酯化合物的制造方法，其特征在于，(A)将用式(1)表示的连接体修饰的树脂用作固相，通过固相合成法形成肽，(B)用选自稀盐酸、稀硫酸、甲酸及乙酸中的至少一种酸切断固相与肽之间的键，制造在C末端具有羧基的肽，(C)在溶剂中，在缩合剂的存在下，使硫醇化合物在－100～0℃下反应。式(1)中，R¹表示C_1－4烷基，R²表示氢原子、C_1－4烷氧基。n表示1～4的整数。

Description

肽的硫酯化合物的制造方法

技术领域

本发明涉及一种肽的硫酯化合物的制造方法。

背景技术

生物体内存在的蛋白质多为具有糖链的糖蛋白。糖蛋白中的糖链承担着维持蛋白质的三维结构、调节溶解性及赋予蛋白酶耐受性等功能。最近，逐步探明糖蛋白中的糖链参与受精及分化、信号传递、癌变、蛋白质的细胞内输送及生理活性的调节等生命现象。因此，与蛋白质结合的糖链对各种生理机能起着重要的作用。但是，由于所述糖链的结构多样、种类繁多，所以确定哪种结构的糖链参与生命现象极其困难。为了阐明所述机能，也必须合成具有单一结构的糖链的糖蛋白、糖肽。目前，可以通过生物学方法利用蛋白质表达来表达糖蛋白，但难以得到具有均一结构的糖链的糖蛋白。因此，近年来正在研究采用化学方法精密合成具有单一结构的糖链的糖肽、糖蛋白。

本发明人等确立了通过组合酶法和化学法从鸡蛋中大量制备可作为原料的二支链复合型糖链的方法(专利文献1)，以及通过应用肽的固相合成法，使用复合型糖链合成唾液酸糖链肽的方法(专利文献2)。只要能将糖肽进行高分子化，就可以合成具有单一结构的糖链的大型糖蛋白。

作为将肽进行高分子化的方法，目前认为使N末端的氨基酸为半胱氨酸(Cys)的肽片段与在C末端具有硫酯的肽进行偶联的自然化学连接(Native Chemical Ligation)法(非专利文献1)最有效。

作为肽的合成方法，通常使用固相合成法，即，将N末端被保护的氨基酸固定于不溶性树脂载体上，氨基酸的保护基脱保护以后使肽链按顺序延长。作为制造在C末端具有硫酯的肽的方法，可以举出在从固相上切下肽时进行硫酯化的方法、从固相上切下肽以后将肽的C末端羧基进行硫酯化的方法等。

作为在从固相上切下肽时进行硫酯化的方法，例如已知使用安全连接体(Safety Catch Linker)在固相树脂上制造肽、并使其与硫醇化合物作用的方法(非专利文献1、2)。但是，存在将第一个氨基酸固定于树脂上时的缩合效率差、缩合时氨基酸轻微外消旋化、通过硫醇化合物酯化的反应性差等诸多问题。另外，在糖肽的糖链羟基未被保护的情况下，为了活化安全连接体而进行的烷基化容易将糖羟基也烷基化，必须进行脱烷基化处理，糖链键等受条件影响，不能确保所得的糖肽具有均一的糖链结构。为了解决上述问题，提出了预先保护糖链羟基的方案，但增加了保护、脱保护的工序，不是一种有效率的方法。

从固相树脂上切下肽时，通常使用95％三氟乙酸或氟化氢等强酸。但是，使用所述强酸伴有肽侧链的脱保护或糖肽的糖链键的切断。因此，作为使用弱酸不发生脱保护地从固相树脂上切下肽的方法，报道了以三苯甲基树脂作为固相，使用乙酸进行切下的方法(非专利文献3、4、5)，和以用4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸修饰的树脂(HMPB树脂)作为固相，使用1％三氟乙酸(TFA)进行切下的方法(非专利文献6)。但是，使用三苯甲基树脂的方法不能制造羟基没有被保护的糖肽。另一方面，使用HMPB树脂作为固相制备糖肽时，用1％TFA无法切下，使用10％TFA时，一部分肽侧链的保护基也被脱保护。进行肽的硫酯化时，特别是为了防止N末端半胱氨酸的巯基的自缩合，必须对其进行保护，但切下时的脱保护给下一步反应带来致命的结果。因此，所述方法不适合成为C末端具有硫酯的肽的制造原料的具有羧基的肽的制造方法。

可以通过使侧链被保护的肽与烷基硫醇反应制造肽的硫酯体，但存在C末端的氨基酸发生外消旋化的问题。为了避免外消旋化，报道了将C末端的氨基酸替换为甘氨酸的方法(非专利文献7)、在二氯甲烷(DCM)中使用六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基磷(PyBOP，benzotriazole-l-yloxy-trispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)/二异丙基乙胺(DIPEA)作为缩合剂的方法(非专利文献8)、在四氢呋喃(THF)中作为缩合剂使用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)/DIPEA的方法(非专利文献9)。但是，使C末端氨基酸为甘氨酸的方法所制造的肽自然是有限的。另外，具有未被保护基保护的羟基的糖肽不能溶解在DCM或THF之类溶剂中，只能更换溶剂，导致再次发生C末端氨基酸的外消旋化问题。

【专利文献1】WO 03/008431号公报

【专利文献2】WO 2004/005330号公报

【非专利文献1】J.Am.Chem.Soc.，121，11369-11374(1999)

【非专利文献2】Angew.Chem.Int.Ed.，44，1650-1654(2005)

【非专利文献3】Tetrahedron Lett.，38，6237-6240(1997)

【非专利文献4】Tetrahedron Lett.，44，3551-3554(2003)

【非专利文献5】J.Am.Chem.Soc.，123，3885-3891(2001)

【非专利文献6】Tetrahedoron，49，9307-9320(1993)

【非专利文献7】Tetrahedron Lett.，38，6237-6240(1997)

【非专利文献8】Tetrahedron Lett.，44，3551-3554(2003)

【非专利文献9】J.Am.Chem.Soc.，123，3885-3891(2001)

本发明的目的是提供一种维持肽侧链的保护基的C末端具有羧基的肽的制造方法，该方法显然适用于不具有糖链的肽，还可适用于具有糖链、特别是具有羟基未被保护的糖链的糖肽。

本发明的目的是提供一种抑制外消旋体生成的肽的硫酯化合物的高效制造方法，该方法当然适用于不具有糖链的肽，还可适用于具有糖链、特别是具有羟基未被保护的糖链的糖肽。

发明内容

本发明涉及以下发明。

一种肽的硫酯化合物的制造方法，其特征在于，

(A)将用式(1)表示的连接体(linker)修饰的树脂用作固相，采用固相合成法形成肽，

(B)用选自稀盐酸、稀硫酸、甲酸及乙酸中的至少一种酸切断固相与肽之间的键，制造在C末端具有羧基的肽，

(C)在溶剂中在缩合剂的存在下，使硫醇化合物在-100～0℃下反应。

[式中，R¹表示C_1-4烷基，R²表示氢原子、C_1-4烷氧基。n表示1～4的整数。]

本发明人等发现通过使用特定的固相树脂，将在特定条件下生成的肽从该固相树脂上切下，可以不影响糖链结构地制造维持侧链保护基的在C末端具有羧基的肽。

进而发现了通过在特定缩合剂的存在下，于低温下使硫醇化合物与得到的肽的C末端羧基作用，可以制造肽的C末端外消旋化被抑制的肽的硫酯化合物。

本发明的肽的硫酯化合物的制造方法由下述工序组成：(A)将用式(1)表示的连接体修饰的树脂用作固相，采用固相合成法形成肽，(B)用选自稀盐酸、稀硫酸、甲酸及乙酸中的至少一种酸切断固相与肽之间的键，制造在C末端具有羧基的肽，(C)在溶剂中，在缩合剂的存在下，使硫醇化合物在-100～0℃下反应。

工序(A)：肽的形成

本工序中使用式(1)表示的连接体修饰的树脂(resin)。

作为C_1-4烷基，表示甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等碳原子数为1至4的直链或支链烷基。

作为C_1-4烷氧基，表示甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等碳原子数为1至4的直链或支链烷氧基。

用式(1)表示的连接体修饰的树脂，可以为市售的树脂或现有公知的树脂，例如可以举出HMPB-BHA树脂(4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸-二苯甲基胺)、HMPB-MBHA树脂(4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸-甲基二苯甲基胺)等，但制造糖肽时可以使用如下得到的溶胀性优异的树脂，即根据现有公知的酰胺化反应，在脱水缩合剂的存在下，通过使氨基-PEGA树脂(novabiochem公司制)的氨基与式(2)表示的羧酸化合物的羧基反应得到的树脂。此处所谓PEGA树脂表示二丙烯酰胺基丙烷-1-基聚乙二醇(bisacrylamidoprop-1-ylpolyethyleneglycol)。

[式中，R¹、R²及n与上述相同。]

得到的具有式(1)表示的连接体的树脂中，优选R¹为甲基，R²为氢原子、C_1-4烷基的树脂；更优选R¹为甲基，R²为氢原子、C_1-4烷基，n为2～4的树脂；特别优选R¹为甲基，R²为氢原子、C_1-4烷基，n为3的树脂。

具体而言，例如特别优选式(3)表示的树脂。

[式中，R²与上述相同。]

将上述用式(1)表示的连接体修饰的树脂用作固相制造肽。

例如可以举出以下(a)～(e)的工序。

(a)将用式(1)表示的连接体修饰的树脂中式(1)表示的连接体部分的羟基与氨基被保护基保护的氨基酸的羧基进行酯化反应，

(b)将氨基的保护基脱保护，形成未被保护的氨基，

(c)将该未被保护的氨基与氨基被保护的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，

(d)将上述保护基脱保护，形成未被保护的氨基，

(e)将上述(c)及(d)工序重复进行1次以上，形成肽。

作为氨基酸，可以使用全部氨基酸，例如可以举出丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)。

作为保护基，例如可以举出9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)及烯丙氧基碳酸酯(allyloxycarbonate)(Alloc)基等含有碳酸酯的基团、乙酰(Ac)基等酰基、烯丙基、苄基等保护基等。导入保护基时，例如导入Fmoc基时，可以通过加入9-芴基甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(9-fluorenylmethyl-N-succinimidyl carbonate)和碳酸氢钠进行反应而导入保护基。反应可以在0～50℃下，优选在室温下，约进行1～5小时左右。

作为氨基被脂溶性保护基保护的氨基酸，可以通过采用上述方法或公知的方法在上述氨基酸的氨基上导入脂溶性保护基进行制造，也可以使用市售的产品。例如作为氨基被Fmoc基保护的氨基酸，可以举出Fmoc-Ser、Fmoc-Asn、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Ile、Fmoc-Ala、Fmoc-Tyr、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys、Fmoc-Arg、Fmoc-His、Fmoc-Asp、Fmoc-Glu、Fmoc-Gln、Fmoc-Thr、Fmoc-Cys、Fmoc-Met、Fmoc-Phe、Fmoc-Trp、Fmoc-Pro。

若选择半胱氨酸(Cys)作为最后导入的氨基酸，则可以制造在N末端具有半胱氨酸的肽，在自然化学连接中可以用作与肽的硫羟酸酯化合物偶联的片段。

通过使用在氨基酸上键合有糖链的糖链氨基酸，可以制造在肽链的任意位置导入了糖链氨基酸的糖肽。

作为使用的糖链氨基酸，只要为具有任意数量的糖残基的糖链氨基酸即可，没有特别限定，可以举出含有较多甘露糖的高甘露糖、在糖链的非还原末端具有唾液酸或半乳糖残基的复合型糖链(Figurel)、混杂有高甘露糖结构与复合型糖链的混合型糖链、与天冬酰胺侧链的酰氨基进行N糖基化形成的N结合型糖链、使丝氨酸、苏氨酸侧链的醇糖基化形成的O结合型糖链等。具体而言，可以举出WO03/008431号公报中记载的糖链天冬酰胺。其中，优选二唾液酸糖链天冬酰胺或单唾液酸糖链天冬酰胺，例如特别优选式(4)表示的该唾液酸的羧基被苄基等保护基保护的糖链。所述键合了二唾液酸糖链天冬酰胺或单唾液酸糖链天冬酰胺的糖肽为优选糖肽。

树脂的连接体部分的羟基与上述具有被保护的氨基的氨基酸的羧基的酯化反应，例如可以使用1-均三甲苯基磺酰基-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)、DCC、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)等脱水缩合剂进行反应，例如优选通过向固相柱中加入树脂，用溶剂清洗之后加入氨基酸的溶剂溶液进行反应。

作为清洗用溶剂，例如可以举出DMF、异丙醇、DCM等。作为溶解氨基酸的溶剂，例如可以举出DMSO、DMF、DCM等。反应可以在0～50℃下、优选在室温下，进行约10分钟～30小时左右、优选15分钟～24小时左右。

此时还可以使用乙酸酐等将固相上未反应的羟基乙酰化，进行封端。

可以通过用酸或碱处理进行氨基的保护基的脱保护，例如保护基为Fmoc基的情况下，可以使用哌啶、吗啉等碱。此时优选在溶剂的存在下进行脱保护，例如可以举出DMSO、DMF、甲醇等。

优选在活化剂及溶剂的存在下，使未被保护的氨基和氨基被保护的任意氨基酸的羧基进行酰胺化反应，。

作为活化剂，例如可以举出二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·盐酸盐(WSC/HCl)、叠氮磷酸二苯酯(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、氰基磷酸二乙酯(DEPC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCI)、六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基磷(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、羟基邻苯二甲酰亚胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、3，4-二氢-3-羟基-4-氧-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt)等。

作为溶剂，例如可以举出二甲亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)等。

活化剂的使用量相对于式(2)表示的羧酸化合物为0.1～20当量，优选为0.5～10当量，更优选为0.8～5当量，较为理想。可以在溶剂中进行反应，在0～50℃下、优选在室温下，反应约10分钟～30小时左右，优选反应15分钟～24小时左右。另外，通过在固相合成用柱中进行反应，可以直接用于之后的固相合成，故优选。

可以与上述同样地进行保护基的脱离。

工序(B)：切下肽

优选用酸处理将肽链从树脂(resin)上切断。作为使用的酸，可以举出稀盐酸、稀硫酸等无机酸类、甲酸、乙酸等羧酸类。作为稀盐酸或稀硫酸，可以举出0.01～2当量左右、优选0.05～1当量左右的盐酸或硫酸的水溶液。所述酸中优选乙酸。作为酸的使用量，只要相对于1当量肽为1当量以上即可，没有特别限定，例如可以为1～10000当量左右，优选为10～1000当量左右。

优选在醇的存在下进行本反应，例如可以举出甲醇、乙醇、丙醇等低级醇、三氟乙醇(TFE)、2，2，2-三氯乙醇等卤代醇。所述醇中优选甲醇、三氟乙醇，特别优选三氟乙醇。醇的使用比例相对于1体积的酸可以使用0.1～2体积的醇，优选0.5～1.5体积，更优选0.8～1.2体积。

另外，根据需要，本反应可以使用DCM、DMF、DMSO等有机溶剂。

溶剂的使用量没有特别限定，相对于1体积的酸可以使用0.1～100体积左右的溶剂。

反应可以在0～50℃、优选在室温下，约进行1～30小时左右。

如上所述，可以得到在C末端具有羧基的肽。

工序(C)：制造肽的硫酯化合物

可以通过在溶剂中，在缩合剂的存在下，使得到的肽(原料肽)与硫醇化合物作用制造C末端为硫酯的肽。作为硫醇化合物，可以举出可在苯环上的任意位置具有任意数量的氟、氯、溴、碘等卤素原子、甲基、乙基等碳原子数为1～4的低级烷基、甲氧基、乙氧基等碳原子数为1～4的烷氧基、硝基等取代基的苄硫醇类、甲硫醇、乙硫醇等低级烷硫醇类等。所述硫醇化合物中特别优选苄硫醇。

作为硫醇化合物的使用量，相对于1当量原料肽，可以使用1～100当量、优选10～80当量、更优选20～50当量的硫醇化合物。特别是为了抑制肽的C末端的外消旋化，优选使用大大过量的硫醇化合物，优选使用30当量左右以上。

作为使用的溶剂，例如可以举出THF、DCM、DMSO、DMF等，其中优选DMF。

作为缩合剂，可以举出HOBt/DIPCI或PyBOP/DIPEA等，优选PyBOP/DIPEA。

HOBt/DIPCI的使用比例为相对于1当量HOBt，可以使用0.1～10当量，优选0.5～5当量，更优选0.8～1.2当量的DIPCI。

PyBOP/DIPEA的使用比例为相对于1当量PyBOP，可以使用0.1～10当量，优选0.5～5当量，更优选0.8～1.2当量的DIPEA。

HOBt的使用比例相对于1当量原料肽为1～20当量，优选3～15当量，更优选8～12当量。

PyBOP的使用比例相对于1当量原料肽为1～10当量，优选2～8当量，更优选3～6当量。

在本反应中，优选使用分子筛等脱水剂。原料肽的C末端羧酸被活化时发生肽的外消旋化。因此，优选将原料肽与硫醇化合物混合以后，加入缩合剂进行反应。反应温度可以为-100～0℃，优选为-80～-10℃，可以反应30分钟～2小时左右。

在本发明中抑制所得肽的外消旋体的比例，通常外消旋体的比例为6％以下，优选为4％以下，更优选为2％以下，特别优选为0～1％。

具体实施方式

以下举出实施例进行说明，但本发明不限于任何所述实施例。

使用的Fmoc化氨基酸为公知的氨基酸，可以为市售品，或通过在氨基酸中导入Fmoc基而容易地制备。

另外，Fmoc-Ala、Fmoc-Asn、Fmoc-Gly、Fmoc-Leu、Fmoc-Met、Fmoc-Phe、Fmoc-Pro、Fmoc-Val表示各氨基酸的氨基被Fmoc基保护。Boc-Cys(Acm)表示半胱氨酸的氨基被Boc基保护，并且巯基被乙酰胺基甲基保护。Fmoc-Arg(Pbf)表示精氨酸的α位氨基被Fmoc基保护的N^G-(2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)精氨酸。Fmoc-Asp(OtBu)及Fmoc-Glu(OtBu)表示各氨基酸的氨基被Fmoc基保护，天冬氨酸β位及谷氨酸γ位的羧基被叔丁基保护。Fmoc-Cys(trt)表示半胱氨酸的氨基被Fmoc基保护，并且巯基被三苯甲基保护。Fmoc-Lys(Boc)表示赖氨酸的α位氨基被Fmoc基保护，并且ε位氨基被Boc基保护。Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Tyr(tBu)及Fmoc-Thr(tBu)表示各氨基酸的氨基被Fmoc基保护，并且羟基被三苯甲基保护。Boc-Leu及(Boc)Leu表示亮氨酸的氨基被Boc基保护。(Boc)Lys(Boc)表示赖氨酸的α位及ε位氨基被Boc基保护，Lys(Boc)表示赖氨酸的ε位氨基被Boc基保护。Boc-Cys(Thz)表示N-t-Boc-1，3-噻唑烷-4-羧酸。Thr(tBu)、Tyr(tBu)以及Ser(tBu)表示各氨基酸的羟基被叔丁基保护。His(trt)表示咪唑的氮被三苯甲基保护，Cys(trt)表示半胱氨酸的巯基被三苯甲基保护以及Gln(trt)表示谷氨酰胺的酰胺氮被三苯甲基保护。Asp(OtBu)及Glu(OtBu)表示天冬氨酸β位及谷氨酸γ位的羧基被叔丁基保护。Cys(Thz)表示1，3-噻唑烷-4-羰基。Arg(Pbf)表示N^G-(2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)精氨酸。

所述保护基的导入可以使用现有公知的方法，或使用导入了保护基的市售品。另外，Ph表示苯基，Bn表示苄基。

用布鲁克的AVANCE400(记作400MHz)测定¹H-NMR。

电喷雾质谱(ESI mass)测定装置使用布鲁克·道尔顿公司(BrukerDaltonics)制Esquire3000 plus，基质辅助激光解析质谱(MALDI mass)测定装置使用布鲁克·道尔顿公司制Autoflex，基质使用二羟基苯甲酸。

实施例1

在固相合成用柱中加入氨基-PEGA树脂(1g，50μmol)，用DCM、DMF充分清洗以后，用DMF充分溶胀。将4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(30.1mg，0.13mmol)、TBTU(40.1mg，0.13mmol)、N-乙基吗啉(15.8μl，0.13mmol)溶解于DMF(1ml)，并装入柱中，在室温下搅拌2小时。树脂用DMF及DCM充分清洗，得到HMPB-PEGA树脂，用作固相合成的固相。

将Fmoc-Phe(96.8mg，0.25mmol)与MSNT(74mg，0.25mmol)、N-甲基咪唑(15μl，0.19mmol)溶解于DCM(1ml)，装入固相合成用柱中，在室温下搅拌2小时。搅拌后用DCM、DMF清洗树脂。用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基进行20分钟脱保护。用DMF清洗后，之后的肽链延长采用以下所示方法按顺序缩合氨基酸。

将氨基被Fmoc基保护的氨基酸与HOBt(33.8mg，0.25mmol)、DIPCI(38μl，0.25mmol)溶解于DMF(1ml)中，活化15分钟以后，装入固相合成用柱中。在室温下搅拌1.5小时以后，用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基进行20分钟脱保护。重复该操作，按顺序缩合氨基酸。

作为氨基被Fmoc基保护的氨基酸，使用Fmoc-Tyr(tBu)(114.9mg，0.25mmol)、Fmoc-Asn(88.6mg，0.25mmol)、Fmoc-Ala(77.8mg，0.25mmol)、Fmoc-His(trt)(154.9mg，0.25mmol)、Fmoc-Ser(tBu)(95.9mg，0.25mmol)、Fmoc-Asp(OtBu)(102.9mg，0.25mmol)、Fmoc-Leu(88.4mg，0.25mmol)、Fmoc-Val(84.9mg，0.25mmol)，在固相树脂上形成19个残基的肽，即Phe-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Asn-Ala-His(trt)-Ser(tBu)-His(trt)-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Tyr(tBu)-Leu-Phe-Phe-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Asn。

用DCM及DMF清洗后，将相当于2μmol19个残基的肽的树脂移至Eppendorf试管中。

将下式(5)表示的糖链天冬酰胺的联苄基体(10mg，3.6μmol)与DEPBT(2mg，6μmol)溶解于DMF(0.12ml)中，装入Eppendorf试管中。

加入DIPEA(0.68μl，4μmol)，在室温下搅拌18小时。用DMF清洗后，使用20％哌啶将Fmoc基脱保护，在固相树脂上形成20个残基的肽，即Phe-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Asn-Ala-His(trt)-Ser(tBu)-His(trt)-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Tyr(tBu)-Leu-Phe-Phe-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Asn-Asn(寡糖链)(6)。

实施例2

将一部分在实施例1中得到的形成了20个残基的肽的树脂装入固相合成用柱中，加入乙酸:DCM:甲醇(＝5:4:1)，使树脂充分浸渍，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下浓缩反应溶液。将得到的残渣用HPLC(Cadenza column C1875×4.6mm展开溶剂A：0.1％ TFA水溶液 B：0.1％ TFA 乙腈:水＝90:10梯度A:B＝60:40→0:10015分钟流速0.1ml/min)精制，得到20个残基的肽(7)。

所得肽的C末端具有羧基，并维持了侧链保护基。

ESI-MS：C₂₇₉H₃₈₂N₃₄O₉₄：[M+3H]³⁺ 理论值1906.3，实测值1905.8

实施例3

实施例2中使用的乙酸:DCM:甲醇及反应时间变为乙酸:TFE:DMC(＝2:2:6)、反应2小时，或乙酸:TFE(＝1:1)、反应27小时。

均可得到20个残基的肽(7)。

但是，乙酸:TFE:DMC条件下的收率约为乙酸:DCM:甲醇条件下的5倍，并且乙酸:TFE条件下的收率约为乙酸:DCM:甲醇条件下的8倍。

实施例4

与实施例1同样地操作得到HMPB-PEGA树脂(25μmol)，用作固相合成的固相，使氨基酸缩合形成肽。氨基酸的缩合与实施例1同样地进行。使用Fmoc-Ala(38.9mg，0.13mmol)作为第1个氨基酸，利用MSNT(37mg，0.13mmol)、N-甲基咪唑(7.5μl，94μmol)、DCM(0.5ml)进行缩合。

将其后的氨基被保护的氨基酸利用HOBt(16.9mg，0.13mmol)、DIPCI(19.2μl，0.13mmol)、DMF(0.5ml)按顺序进行缩合。作为保护了氨基的氨基酸，使用Fmoc-Gln(46.1mg，0.13mmol)、Fmoc-Thr(tBu)(49.7mg，0.13mmol)、Fmoc-Ile(44.2mg，0.13mmol)、Fmoc-Val(42.4mg，0.13mmol)、Fmoc-Ser(tBu)(47.9mg，0.13mmol)，按顺序进行缩合。

肽延长后，相对于2μmol树脂，使用式(5)表示的糖链天冬酰胺的联苄基体(10mg，3.6μmol)与DEPBT(2mg，6μmol)、DIPEA(0.68μl，4μmol)、DMF(0.12ml)。之后，利用HOBt(1.36mg，10μmol)、DIPCI(1.54μl，10μmol)、DMF(0.25ml)缩合Boc-Cys(Acm)(2.9mg，10μmol)。

向树脂中加入AcOH:TFE＝1:1(1ml)，在室温下反应14小时。过滤除去树脂，浓缩反应溶液。通过用HPLC(Cadenza column C1875×4.6mm展开溶剂A：0.1％ TFA水溶液 B：0.1％ TFA/乙腈:水＝90:10 梯度A:B＝60:40→0:100 15分钟流速 0.1ml/min)精制，得到侧链被保护的9个残基的肽(8)。

ESI-MS：C₁₅₅H₂₄₉N₁₈O₇₉S：[M+2H]⁺² 理论值1830.3，实测值1831.0.

实施例5

在DMF溶剂(85μl)中，于氩气流中、-20℃的条件下，将在实施例4中制造的9个残基的肽(8)(2mg，0.55μmol)与分子筛(MS)4A(10mg)、苄硫醇(2μl，16.4μmol)搅拌1小时后，加入PyBOP(1.4mg，2.7μmol)、DIPEA(0.46μl，2.7μmol)，搅拌4小时。之后，在反应溶液中加入乙醚(5ml)使化合物沉淀，过滤后用50％乙腈水溶液回收沉淀物。将其冷冻干燥，向得到的冷冻干燥品中加入95％TFA水溶液，在室温下搅拌2小时。过滤除去树脂，浓缩反应溶液以后，溶解于50％乙腈水溶液中进行冷冻干燥。冷冻干燥品用HPLC(Cadenza column C18 75×4.6mm展开溶剂A：0.1％ TFA水溶液B：0.1％ TFA 乙腈:水＝90:10 梯度A:B＝95:5→25:75 15分钟流速0.1ml/min)精制，制造式(9)表示的C末端为苄硫酯的肽(NH₂-Cys(Acm)-Asn(disialooligo)-Thr-Ser-Val-Ile-Thr-Gln-Ala-COSBn)。

¹H—NMR(400MHz，295K，D₂O，HOD＝δ 4.81)7.53—7.33(m，15H，Ph×3)，5.37(d，2H，J＝11.7Hz，PhCH₂)，5.29(d，2H，J＝11.6Hz，PhCH₂)，5.11(s，1H，Man4—H—1)，5.02(d，1H，GlcNAc1—H—1)，4.92(s，1H，Man4′—H—1)，4.65—4.52(m，3H，Gl cNAc 2，5，5′—H—1)，2.91—2.78(m，4H，Asn—β CH₂，Cys—·β CH₂)，2.67(dd，2H，NeuAc7，7′—H_3eq)，2.39—2.31(m，2H，Gln—γCH₃)，1.83(dd，2H，J＝13.1，13.1Hz，NeuAc7，7′—H—3_ax)，1.38(d，3H，Ala—βCH₃)，1.20(d，3H，J＝6.51Hz，Thr—γCH₃)，1.17(d，3H，J＝6.40Hz，Thr—γCH₃)，0.95—0.80(m，12H，Val—γCH₃，Ile—·γCH₃，·CH₃)

ESI-MS：C₁₄₅H₂₂₃N₁₈O₇₆S：[M+2H]²⁺ 理论值1749.8，实测值1749.2

实施例6

用现有公知的方法制造在C末端具有羧基的肽AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COOH，作为原料使用。在DMF溶剂(0.14ml)中，于氩气流中、-20℃的条件下，将该肽(0.5mg，1μmol)与MS4A(10mg)、苄硫醇(3.7mg，30μmol)搅拌1小时后，加入PyBOP(2.6mg，5μmol)和DIPEA(0.85μl，5μmol)搅拌17小时。之后，在反应溶液中加入乙醚(5ml)，沉淀化合物，过滤后，用50％乙腈水溶液回收沉淀物。通过将其用HPLC(Cadenza columnC1875×4.6mm展开溶剂A：0.1％ TFA水溶液 B：0.1％ TFA 乙腈:水＝90:10梯度A:B＝70:30→40:60 15分钟流速0.1ml/min)精制，得到C末端为苄硫酯的AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COSBn。

外消旋体的生成率为2％以下。

ESI-MS：C₃₀H₃₆N₆O₅S：[M+H]⁺ 理论值592.3，实测值592.2

实施例7

除反应温度为0℃以外，与实施例6同样操作，得到苄硫酯体AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COSBn。所得化合物的质谱与实施例6的质谱相同。外消旋体的生成率为6％。

实施例8

在DMF溶剂(0.14ml)中，于氩气流中、0℃的条件下，将肽AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COOH(0.5mg，1μmol)与MS4A(10mg)、HOBt(0.7mg，5μmol或1.4mg，10μmol)搅拌1小时后，加入DIPCI(0.8μl，5μmol或1.6μl，10μmol)和苄硫醇(3.7mg，30μmol)。以下与实施例6同样地处理，得到苄硫酯体AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COSBn。使用5当量HOBt时的收率为75％，10当量时的收率为98％。得到的化合物的质谱与实施例6的质谱相同。外消旋体的生成率分别为5％。

实施例9

通过现有公知的方法制造在C末端具有羧基的肽AcNH-Cys-Cys-Glu-His-COOH，作为原料使用。在DMF溶剂(0.14ml)中，于氩气流中、-20℃的条件下，将该肽(0.5mg，1μmol)和MS4A(10mg)、HOBt(1.4mg，10μmol)搅拌1小时后，加入DIPCI(1.6μl，10μmol)和苄硫醇(3.7mg，30μmol)进行反应。以下与实施例6同样地处理，得到苄硫酯体AcNH-Cys-Cys-Glu-His-COSBn。

外消旋体的生成率为2％以下。

实施例10

将三苯甲基氯树脂(150μmol)用作固相合成的固相，按顺序缩合氨基酸形成肽。与实施例1同样地进行氨基酸的缩合。

使用Fmoc-Leu(159.0mg，0.45mmol)作为第1个氨基酸，利用DCM(0.9ml)及DIEA(204.1μl，1.2mmol)进行缩合。

将其后的氨基被保护的氨基酸用HOBt(101.3mg，0.75mmol)、DIPCI(115.4μl，0.75mmol)、DMF(3ml)进行缩合。

作为氨基被保护的氨基酸，使用Fmoc-Pro(253.1mg，0.75mmol)、Fmoc-Arg(Pbf)(486.6mg，0.75mmol)、Fmoc-Tyr(tBu)(334.7mg，0.75mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)(319.2mg，0.75mmol)、Fmoc-Met(278.6mg，0.75mmol)、Fmoc-Thr(tBu)(298.1mg，0.75mmol)、Fmoc-Cys(trt)(439.3mg，0.75mmol)、Fmoc-Ala(233.5mg，0.75mmol)、Fmoc-Pro(253.1mg，0.75mmol)、Fmoc-Lys(Boc)(351.4mg，0.75mmol)、Fmoc-Pro(253.1mg，0.75mmol)、Fmoc-Tyr(tBu)(334.7mg，0.75mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)(319.2mg，0.75mmol)、Fmoc-Ser(tBu)(287.6mg，0.75mmol)、Fmoc-Cys(trt)(439.3mg，0.75mmol)、Fmoc-Asp(OtBu)(308.6mg，0.75mmol)、Fmoc-Val(254.6mg，0.75mmol)、Fmoc-Ser(tBu)(287.6mg，0.75mmol)、Fmoc-Val(254.6mg，0.75mmol)、Fmoc-Ala(233.5mg，0.75mmol)、Fmoc-Ala(233.5mg，0.75mmol)、Boc-Leu(187mg，0.75mmol)，按顺序进行缩合。

向树脂中加入AcOH:DCM:MeOH＝5:4:1(1ml)，在室温下反应3小时。向反应溶液中加入己烷。之后过滤除去树脂。将树脂用MeOH清洗，将其溶液浓缩。在浓缩残渣中加入苯，进一步浓缩，得到侧链被保护的23个残基的肽((Boc)Leu-Ala-Ala-Val-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Cys(trt)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Ala-Cys(trt)-Thr(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Leu-COOH)(10)。

在DMF溶剂(1350μl)中，于氩气流中、-20℃的条件下，将得到的23个残基的肽(10)(39mg，10μmol)与MS4A、苄硫醇(35.5μl，300μmol)搅拌1小时后，加入PyBOP(26mg，50μmol)、DIPEA(8.5μl，50μmol)搅拌2小时。之后，在反应溶液中加入乙醚，沉淀化合物，过滤后，用DMF回收沉淀物。将其浓缩，向残渣中加入95％TFA水溶液，在室温下搅拌2小时后冷冻干燥。

将冷冻干燥品用HPLC(Cadenza column C1875×4.6mm展开溶剂A：0.1％ TFA水溶液 B：0.1％ TFA 乙腈:水＝90:10梯度A:B＝80:20→40:60 15分钟流速1.0ml/min)精制，制造式(11)表示的C末端为苄硫酯的肽(Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-COSBn)。

收量：20mg

外消旋体的生成率：2％以下

ESI-MS：C₁₁₈H₁₈₁N₂₇O₃₄S₄：[M+2H]⁺² 理论值1325.1，实测值1325.3

实施例11

在固相为三苯甲基树脂(40μmol)的26个残基的肽(Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Ala-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Val-Arg(Pbf)-Val-Thr(tBu)-Val-Leu-Arg(Pbf)-Gln(trt)-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Val-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-CO-(三苯甲基树脂))(300mg，novabiochem公司制造品)上，利用HOBt(27.0mg，0.2mmol)、DIPCI(30.8μl，0.2mmol)、DMF(1ml)缩合Cys(Thz)(46.7mg，0.2mmol)。

向树脂中加入1％TFA/DCM溶液(1.0ml)，在室温下反应2分钟，过滤除去树脂，用吡啶中和反应溶液。重复5次该反应，将反应溶液浓缩后，加入水使侧链被保护的肽沉淀。沉淀物用DMF溶液回收，浓缩，得到侧链被保护的27个残基的肽(Cys(Thz)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Ala-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Val-Arg(Pbf)-Val-Thr(tBu)-Val-Leu-Arg(Pbf)-Gln(trt)-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Val-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-COOH)(12)。

在DMF溶剂(1.36μl)中，于氩气流中、-20℃的条件下，将得到的27个残基的肽(12)(10μmol)与MS4A(20mg)、苯硫酚(30.6μl，300μmol)搅拌1小时后，加入PyBOP(8.6mg，50μmol)、DIPEA(26.0μl，50μmol)搅拌4小时。之后，在反应溶液中加入乙醚，使化合物沉淀，过滤后，用DMF回收沉淀物。将其浓缩，向得到的浓缩品中加入95％TFA水溶液，在室温下搅拌2小时。过滤除去树脂，将反应溶液浓缩后溶解于50％乙腈水溶液中，进行冷冻干燥。将冷冻干燥品用HPLC(Cadenza column C1875×4.6mm展开溶剂A：0.1％ TFA水溶液B：0.1％ TFA乙腈:水＝90:10 梯度A:B＝95:5→25:75 15分钟流速0.1ml/min)精制，制造式(13)表示的C末端为苯硫酯的肽(Cys(Thz)-Glu-Tyr-Ala-Ser-Pro-Gly-Lys-Ala-Thr-Glu-Val-Arg-Val-Thr-Val-Leu-Arg-Gln-Ala-Asp-Ser-Gln-Val-Thr-Glu-Gly-COSPh)。

收量：5mg

外消旋体的生成率：1％以下

ESI-MS：C₁₂₈H₂₀₄N₃₆O₄₃S₂：[M+2H]⁺² 理论值1499.7，实测值1499.8

实施例12

在固相为三苯甲基树脂(40μmol)的17个残基的肽(Ala-Ala-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Met-Met-Gly-Asn-Glu(OtBu)-Leu-Thr(tBu)-Phe-Leu-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gly-CO-(三苯甲基树脂))(500mg，novabiochem公司制造品)上，利用HOBt(27.0mg，0.2mmol)、DIPCI(30.8μl，0.2mmol)、DMF(1ml)缩合Cys(Thz)(46.7mg，0.2mmol)。

向树脂中加入1％ TFA/DCM溶液，在室温下反应2分钟，过滤除去树脂，用吡啶中和反应溶液。重复5次该反应，将反应溶液浓缩后，加入水使侧链被保护的肽沉淀。用DMF溶液回收沉淀物，浓缩，得到侧链被保护的18个残基的肽(Cys(Thz)-Ala-Ala-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Met-Met-Gly-Asn-Glu(OtBu)-Leu-Thr(tBu)-Phe-Leu-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gly-COOH)(14)。

在DMF溶剂(1.36μl)中，于氩气流中、-20℃的条件下，将得到的18个残基的肽(14)(10μmol)与MS4A(20mg)、苄硫醇(36.0μl，300μmol)搅拌1小时后，加入PyBOP(8.6mg，50μmol)、DIPEA(26.0μl，50μmol)搅拌4小时。之后，向反应溶液中加入乙醚，使化合物沉淀，过滤后，用DMF回收沉淀物。将其浓缩，向得到的浓缩品中加入95％TFA(含有乙二硫醇(EDT))水溶液，在室温下搅拌2小时。过滤除去树脂，将反应溶液浓缩后溶解于50％乙腈水溶液中进行冷冻干燥。冷冻干燥品用HPLC(Cadenza column C18 75×4.6mm展开溶剂A：0.1％TFA水溶液 B：0.1％ TFA/乙腈:水＝90:10 梯度A:B＝95:5→25:75 15分钟流速0.1ml/min)精制，制造式(15)表示的C末端为苄硫酯的肽(Cys(Thz)-Ala-Ala-Thr-Tyr-Met-Met-Gly-Asn-Glu-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-Ser-Gly-COSBn)。

收量：4mg

外消旋体的生成率：1％以下

ESI-MS：C₈₉H₁₂₉N₁₉O₂₉S₄：[M+2H]⁺² 理论值2056.8，实测值2057.2

实施例13

在固相为三苯甲基树脂(20μmol)的22个残基的肽((Boc)Lys(Boc)-Ala-Met-His(trt)-Val-Ala-Gln(trt)-Pro-Ala-Val-Val-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Ile-Ala-Ser(tBu)-Phe-Gly-CO-(三苯甲基树脂))(250mg，novabiochem公司制造品)中加入1％TFA/DCM溶液，在室温下反应2分钟，过滤除去树脂，用吡啶中和反应溶液。重复5次该反应，将反应溶液浓缩后，加入水使侧链被保护的肽沉淀。用DMF溶液回收沉淀物，浓缩，得到侧链被保护的22个残基的肽((Boc)Lys(Boc)-Ala-Met-His(trt)-Val-Ala-Gln(trt)-Pro-Ala-Val-Val-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Ile-Ala-Ser(tBu)-Phe-Gly-COOH)(16)。

ESI-MS：C₁₇₀H₂₄₅N₂₉O₃₄S₂：[M+2H]⁺² 理论值1652.0，实测值1651.6

在DMF溶剂(300μl)中，于氩气流中、-20℃的条件下，将得到的22个残基的肽(16)(7.5mg，2.2μmol)与MS4A(20.0mg)、苯硫酚(6.7μl，11.0μmol)搅拌1小时后，加入PyBOP(5.7mg，66.0μmol)、DIPEA(1.7μl，11.0μmol)搅拌4小时。之后，向反应溶液中加入乙醚使化合物沉淀，过滤后用DMF回收沉淀物。将其浓缩，向得到的浓缩品中加入95％TFA水溶液，在室温下搅拌2小时。过滤除去树脂，将反应溶液浓缩后溶解于50％乙腈水溶液中进行冷冻干燥。冷冻干燥品用HPLC(Cadenza column C1875×4.6mm展开溶剂A：0.1％ TFA水溶液B：0.1％ TFA/乙腈:水＝90:10 梯度A:B＝95:5→25:7515分钟流速0.1ml/min)精制，制造式(17)表示的C末端为苯硫酯的肽(Lys-Ala-Met-His-Val-Ala-Gln-Pro-Ala-Val-Val-Leu-Ala-Ser-Ser-Arg-Gly-Ile-Ala-Ser-Phe-Gly-COSPh)。

收量：2mg

外消旋体的生成率：1％以下

ESI-MS：C₁₀₃H₁₆₅N₂₉O₂₆S₂：[M+2H]⁺² 理论值1145.9，实测值1145.7.

实施例14

与实施例1同样地得到HMPB-PEGA树脂(50μmol)，用作固相合成的固相，使氨基酸缩合形成肽。与实施例1同样地进行氨基酸的缩合。

使用Fmoc-Phe(96.9mg，0.25mmol)作为第1个氨基酸，利用MSNT(74.0mg，0.25mmol)、N-甲基咪唑(14.9μl，187.5μmol)、DCM(1ml)进行缩合。

将其后的氨基被保护的氨基酸利用HOBt(33.7mg，0.25mmol)、DIPCI(38.5μl，0.25mmol)、DMF(1ml)进行缩合。

作为氨基被保护的氨基酸，使用Fmoc-Asn(88.6mg，0.25mmol)、Fmoc-Cys(trt)(146.4mg，0.25mmol)、Fmoc-Lys(Boc)(117.1mg，0.25mmol)、Fmoc-Asn(88.6mg，0.25mmol)、Fmoc-Gly(74.3mg，0.25mmol)、Fmoc-Tyr(tBu)(114.9mg，0.25mmol)、Fmoc-Thr(tBu)(99.4mg，0.25mmol)、Fmoc-Lys(Boc)(117.1mg，0.25mmol)，在固相树脂上形成9个残基的肽，即Phe-Asn-Cys(trt)-Lys(Boc)-Asn-Gly-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)。

用DCM及DMF清洗后，将相当于3μmol9个残基的肽的树脂移至Eppendorf试管内。

将下述式(18)表示的糖链天冬酰胺(12mg，6μmol)与DEPBT(3mg，9μmol)溶解于DMF:DMSO＝4:1(201μl)，装入Eppendorf试管内。

加入DIPEA(1.02μl，6μmol)，在室温下搅拌20小时。用DMF清洗后，用20％哌啶将Fmoc基脱保护，在固相树脂上形成10个残基的肽，即Phe-Asn-Cys(trt)-Lys(Boc)-Asn-Gly-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asn(寡糖链)。在该10个残基的肽上，与上述同样地利用HOBt、DIPCI、DMF进一步缩合氨基酸。

使用Fmoc-Asp(1.7mg，0.015mmol)、Fmoc-Ser(tBu)(1.9mg，0.015mmol)、Fmoc-Gly(1.5mg，0.015mmol)、Boc-Cys(Thz)(1.7mg，0.015mmol)作为氨基酸按顺序进行缩合。

向树脂中加入AcOH:TFE＝1:1(1ml)，在室温下反应20小时。过滤除去树脂，将反应溶液浓缩，得到侧链被保护的14个残基的肽(Cys(Thz)-Gly-Ser(tBu)-Asp-Asn(寡糖链)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Asn-Lys(Boc)-Cys(trt)-Asn-Phe-COOH)(19)。

在DMF溶剂(405μl)中，于氩气流中、-20℃的条件下，将得到的14个残基的肽(19)(11.7mg，3μmol)与MS4A、苄硫醇(10.6μl，90μmol)搅拌1小时后，加入PyBOP(7.8mg，15μmol)、DIPEA(2.6μl，15μmol)搅拌2小时。之后，在反应溶液中加入乙醚，使目的物质以沉淀物析出。通过过滤，将该沉淀物与溶液分离，将滤纸上残留的沉淀物溶解于50％乙腈水溶液中进行回收。将回收的溶液浓缩，加入95％TFA水溶液，在室温下搅拌2小时。之后进行冷冻干燥。冷冻干燥品用HPLC(Cadenza column C18 75×4.6mm展开溶剂A：0.01％ TFA水溶液B：0.01％ TFA/乙腈:水＝90:10梯度A:B＝80:20→40:60 15分钟流速1ml/min)精制，制造式(20)表示的C末端为苄硫酯的肽(Cys(Thz)-Gly-Ser-Asp-Asn(寡糖链)-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-COSBn)。

收量3mg

外消旋体的生成率为2％以下。

ESI-MS：C₁₃₃H₂₀₃N₂₃O₆₇S₃：[M+2H]⁺² 理论值1646.1，实测值1646.4.

比较例1

除将PyBOP替换为DEPBT(1.5mg，5μmol)或HBTU(1.9mg，5μmol)以外，与实施例7同样地操作，得到苄硫酯体AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COSBn。使用DEPBT时的收率为10％，使用HBTU时的收率小于10％。

比较例2

除使反应温度为30℃以外，与实施例9同样地操作，得到苄硫酯体AcNH-Cys-Cys-Glu-His-COSBn。

外消旋体的生成率为40％。

产业上的可利用性

根据本发明的方法，可以不影响糖链结构地制造维持了肽侧链保护基、在C末端具有羧基的肽，显然该方法可以制造不具有糖链的肽，还可以制造具有糖链、特别是具有羟基未被保护的糖链的糖肽，进而可以制造肽的C末端基本不发生外消旋化的硫酯化合物。

通过使所得肽的硫酯化合物与N末端的氨基酸为Cys的肽片段作用，可以进行高分子化，还能够制造具有单一结构的糖链的大型糖蛋白。

Claims

1、一种肽的硫酯化合物的制造方法，其特征在于，

(A)将用式(1)表示的连接体修饰的树脂用作固相，通过固相合成法形成肽，

(B)用选自稀盐酸、稀硫酸、甲酸及乙酸中的至少一种酸切断固相与肽之间的键，制造C末端具有羧基的肽，

(C)在溶剂中，在缩合剂的存在下，使硫醇化合物在-100～0℃下反应，

式中，R¹表示C_1-4烷基，R²表示氢原子、C_1-4烷氧基，n表示1～4的整数。

2、一种C末端具有羧基的肽的制造方法，其特征在于，

(B)用选自稀盐酸、稀硫酸、甲酸及乙酸中的至少一种酸切断固相与肽之间的键。

3、一种肽的硫酯化合物的制造方法，其特征在于，在溶剂中，在缩合剂的存在下，使硫醇化合物与C末端具有羧基的肽反应。

4、如权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，肽的N末端的氨基酸为半胱氨酸。

5、如权利要求4所述的制造方法，其中，所述肽是半胱氨酸的巯基被脂溶性保护基保护的肽。

6、如权利要求1或2所述的制造方法，其中，用式(1)表示的连接体修饰的树脂为在氨基PEGA树脂的氨基上结合有式(1)表示的连接体的树脂。

7、如权利要求1或2所述的制造方法，其特征在于，在醇的存在下进行(B)工序。

8、如权利要求7所述的制造方法，其中，醇为卤代醇。

9、如权利要求1或3所述的制造方法，其中，溶剂为选自N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的至少一种。

10、如权利要求1或3所述的制造方法，其中，缩合剂为1-羟基苯并三唑/二异丙基碳二亚胺或六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基磷/二异丙基乙胺。

11、如权利要求1～10中任一项所述的制造方法，其中，肽为糖肽。