TWI450905B

TWI450905B - 肽之製造方法

Info

Publication number: TWI450905B
Application number: TW099136653A
Authority: TW
Inventors: Yasuhiro Kajihara; Naoki Yamamoto; Yuri Nambu; Kazuhiro Fukae; Hiroaki Asai
Original assignee: Glytech Inc
Priority date: 2006-03-29
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2014-09-01
Also published as: DK2000474T3; KR20090007709A; CN101437836B; EP2000474A4; JPWO2007114454A1; WO2007114454A1; US8058394B2; EP2000474A1; KR101462454B1; TWI353989B; CN101437836A; SG170022A1; TW201109347A; CA2647867A1; US20090137780A1; JP5328345B2; AU2007232742A1; AU2007232742B2; EP2000474B1; TW200806686A

Description

肽之製造方法

本發明係有關肽之硫酯化合物的製造方法。

多數存在於活體內的蛋白質係具有糖鏈的糖蛋白。糖蛋白中的糖鏈係負責蛋白質的三維結構之維持及溶解性的調節、蛋白酶耐性的附加等之運作。最近，亦逐漸闡明糖蛋白中的糖鏈牽扯到受精或分化、訊號傳遞、癌變、蛋白質的細胞內輸送或生理活性的調節等之生命現象。如此，與蛋白質結合的糖鏈擔負著生理機能的重要角色。然而，由於該等糖鏈有各色各樣的結構，且其種類龐大，而難以確定何種結構的糖鏈是與生命現象有關者。即便要闡明這種機能時，也務必要有具單一結構的糖鏈之糖蛋白、糖肽的合成。如今，雖然已可在生物學的方式中使用蛋白質呈現來顯現糖蛋白，但不易獲得具有均勻結構的糖鏈之糖蛋白。因此，近年來即探討著是否可以化學性將具有單一結構的糖鏈之糖肽、糖蛋白精密合成。

本發明人等係應用酵素法與化學法的組合以從雞蛋中大量調製作為原料之二分枝複合型糖鏈之方法(專利文獻1)、或複合型糖鏈的肽之固相合成法，而建立可合成唾液醯基糖鏈肽的方法(專利文獻2)。只要可使糖肽形成高分子，即有可能合成具有單一結構的大型糖蛋白。

至於使肽高分子化的方法，現今被認為最有效的方法，乃係使胺基末端的胺基酸為半胱胺酸(Cys)(cysteine) 的肽片段(fragment)與羧基末端上具有硫酯的肽耦合之化學接合法(Native chemical ligation)(非專利文獻1)。

至於肽的合成方法，一般所使用的是使經保護之胺基末端的胺基酸固定在不溶性樹脂載體上，於胺基酸的保護基脫保護後而依序使肽鏈延伸之固相合成法。在羧基末端上具有硫酯的肽之製法方面，例如有：從固相切出肽時進行硫酯化的方法、從固相切出肽之後使肽的羧基末端羧基予以硫酯化的方法。

至於從固相切出肽時進行硫酯化的方法，已知的方法是例如在固相樹脂上利用安全捕捉連結劑(safety catch linker)製造肽後，使硫酯化合物作用(非專利文獻1、2)。不過，會有第一個胺基酸固定在樹脂時的縮合效率不佳、或該縮合時的胺基酸僅是消旋化作用(racemization)，經硫醇化合物之酯化的反應性不良等多種問題。並且，當糖肽的糖鏈氫氧基未受到保護時，因安全捕捉連結劑(safety catch linker)的活化而進行之烷化作用，亦容易使糖氫氧基行烷化作用，不僅必須進行脫烷化作用的處理，也將因條件而影響到糖鏈鍵等，以致未能確保所得糖肽的均勻糖鏈結構。為能消除這些影響，雖然已有預先保護糖鏈氫氧基的提案，但因會增加保護、脫保護的步驟，故並非有效率的方法。

在從固相樹脂切出肽時，通常是使用95%的三氟醋酸或氟化氫等的強酸。然而，在使用這樣的強酸時，也將伴隨著肽側鏈的脫保護或切斷糖肽的糖鏈鍵。因此而使用弱酸而可無須脫保護的從固相樹脂切出肽之方法，已有報告係使用三苯甲基樹脂作為固相並以醋酸切除的方法(非專利文獻3、4、5)，或使用以4-羥甲基-3-甲氧苯氧丁酸改質的樹脂(HMPB樹脂)作為固相，並以1%的三氟醋酸(TFA)切除的方法(非專利文獻6)。不過，在使用三苯甲基樹脂的方法中，並不能製造未保護氫氧基的糖肽。另一方面，在使用HMPB樹脂作為固相而製作糖肽時，無法以1%的TFA切除，而在使用10%的TFA時，也有部份肽側鏈的保護基脫保護。在進行肽的硫酯化作用時，雖然尤其必須保護胺基末端半胱胺酸的硫基以防止自行縮合，但會使切除時的脫保護在下個反應上招到毀滅性的結果。因此，這些方法在製造具有可作為羧基末端上具有硫酯的肽之製造原料的羧基之肽的方法上，並不算是良好的方法。

肽的硫酯物雖然可由經保護側鏈的肽與烷硫醇反應而製得，但會有羧基末端的胺基酸消旋化之問題。為避免消旋化，據報告指出有下列之方法：使羧基末端的胺基酸取代成甘胺酸的方法(非專利文獻7)、在二氯甲烷(DCM)中使用苯并三唑-1-基氧基-三吡咯鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)/二異丙基乙胺(DIPEA)作為縮合劑的方法(非專利文獻8)、在四氫呋喃(THF)中使用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)/DIPEA作為縮合劑的方法(非專利文獻9)之報告。然而，在使羧基末端的胺基酸成為甘胺酸的方法中，所製造的肽會受到自然的限制。並且，由於具有未受保護基保護的氫氧基之糖肽無法溶解於如DCM 或THF等之溶劑中而不得不變更溶劑，但又會產生羧基末端胺基酸的消旋化作用之問題。

[專利文獻1] WO 03-008431號公報

[專利文獻2] WO 2004-005330號公報

[非專利文獻1] J. Am. Chem. Soc., 121, 11369-11374 (1999)

[非專利文獻2] Angew. Chem. Int. Ed., 44, 1650-1654 (2005)

[非專利文獻3] Tetrahedron Lett., 38, 6237-6240 (1997)

[非專利文獻4] Tetrahedron Lett., 44, 3551-3554 (2003)

[非專利文獻5] J. Am. Chem. Soc., 123, 3885-3891(2001)

[非專利文獻6] Tetrahedron Lett., 49, 9307-9320 (1993)

[非專利文獻7] Tetrahedron Lett., 38, 6237-6240 (1997)

[非專利文獻8] Tetrahedron Lett., 44, 3551-3554 (2003)

[非專利文獻9] J. Am. Chem. Soc., 123, 3885-3891 (2001)

本發明的目的是為提供一種肽之製造方法，其中，不具有糖鏈的肽所適用者當然為糖鏈，尤其具有不為氫氧基保護的糖鏈肽亦為適用，且在維持有肽側鏈的保護基之羧基末端上具有羧基。

本發明的目的是為提供一種有效地製造肽之硫酯化合物的方法，其中，不具有糖鏈的肽所適用者當然為糖鏈，尤其具有不為氫氧基保護的糖鏈肽亦為適用，並可抑制消旋物的生成。

本發明是與以下的發明有關。

一種具有下述特徵的肽之硫酯化合物的製造方法：(A)將經式(1)所表示的連結劑(linker)所改質之樹脂為固相予以使用，並以固相合成法形成肽、(B)以選自稀鹽酸、稀硫酸、甲酸及醋酸中的至少一種酸切斷固相與肽的結合，以製造羧基末端具有羧基的肽、(C)在溶劑中於縮合劑的存在下，使硫醇化合物於-100至0℃中反應。

[式中，R¹表示C_1-4烷基、R²表示氫原子、C_1-4烷氧基。n為1至4的整數。]

本發明人等發現一種肽之製造方法，係在使用特定的固相樹脂，並於特定的條件下使生成的肽從該固相樹脂切出後，可不受糖鏈結構的影響，且在維持有側鏈保護基的羧基末端上具有羧基者。

本發明人等亦發現在所得之肽的羧基末端羧基上，以低溫使硫醇化合物在特定之縮合劑的存在下作用，即可製造肽的羧基末端經抑制消旋化的肽的硫酯化合物之製造方法。

本發明的肽的硫酯化合物之製造方法，包括以下的步驟：(A)將經式(1)所示的連結劑(linker)所改質之樹脂為固相予以使用，並以固相合成法形成肽、(B)以選自稀鹽酸、稀硫酸、甲酸及醋酸中的至少一種酸切斷固相與肽的結合，以製造羧基末端具有羧基的肽、(C)在溶劑中於縮合劑的存在下，使硫醇化合物於-100至0℃中反應。

[步驟(A)：肽的形成]

本步驟中係使用經式(1)所示的連結劑(linker)所改質之樹脂。

至於C_1-4烷基，係表示甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基等的直鏈狀或分枝狀的碳數1至4的烷基。

至於C_1-4烷氧基，係表示甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基等的直鏈狀或分枝狀的碳數1至4的烷氧基。

經式(1)所示的連結劑(linker)改質之樹脂，雖然可為市售品或歷來習知的樹脂，例如HMPB-BHA樹脂(4-羥甲基-3-甲氧苯氧基丁酸-二苯甲基胺)、HMPB-MBHA樹脂(4-羥甲基-3-甲氧苯氧基丁酸-甲基二苯甲基胺)等，但在製造糖肽中，則可利用使胺基-PEGA樹脂(Nova Bi ochem公司製)的胺基與式(2)表示的羧酸化合物之羧基，依照習知之醯胺化反應，於脫水縮合劑的存在下反應而得膨脹性優異的樹脂。此時所稱的PEGA樹脂係指雙丙烯醯胺丙-1-基聚乙二醇之意。

[式中，R¹、R²及n係與前述者同。]

在所得具有以式(1)表示連結劑(linker)的樹脂中，是以R¹為甲基、R²為氫原子、C_1-4烷基的樹脂為佳，並以R¹為甲基、R²為氫原子、C_1-4烷基、n為2至4的樹脂更佳，而最好的是R¹為甲基、R²為氫原子、C_1-4烷基、n為3的樹脂。

具體而言，是以例如以式(3)表示的樹脂尤佳。

[式中，R²係與前述者同。]

將經上述式(1)所示的連結劑(linker)所改質之樹脂作為固相予以使用以製造肽。

可舉例如以下的步驟(a)至(e)。

(a)使經上述式(1)所示的連結劑(linker)改質之樹脂的式(1)所示之連結劑(linker)之部份氫氧基，與胺基經保護基保護的胺基酸之羧基進行酯化反應；(b)將胺基的保護基脫保護後，形成未受保護的胺基；(c)將此未受保護的胺基與胺基經保護基保護的胺基酸之羧基進行醯胺化反應；(d)將上述的保護基脫保護後，形成未受保護的胺基；(e)將上述(c)及(d)的步驟反復進行一次以上後，即可形成肽。

可使用所有的胺基酸作為胺基酸，例如有絲胺酸(serine)(Ser)、天冬醯胺(Asn)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile)、丙胺酸(Ala)、酪胺酸(Tyr)、甘胺酸(Gly)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、天冬胺酸(Asp)、谷胺酸(Glu)、谷胺醯胺(Gln)、蘇胺酸(Thr)、半胱胺酸(Cys)、蛋胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、脯胺酸(Pro)。

至於保護基，可舉例如9-芴甲氧基羰(Fmoc)基或第三丁基羰(Boc)基、烯丙基氧碳酸根(Alloc)等含有碳酸根、乙醯(Ac)基等的醯基、烯丙基、苯甲基等的保護基。在導入保護基時，例如在導入Fmoc基時，可加入9-芴甲基-氮-琥珀醯亞胺基(succinimidyl)碳酸酯與碳酸氫鈉，以進行反應而導入。並以0至50℃，最好是在室溫下，進行約1至5小時的反應為佳。

至於經脂溶性保護基保護胺基的胺基酸，可以使上述的胺基酸之胺基以上述的方法或周知的方法導入脂溶性保護基而製得，也可使用市售商品。例如經Fmoc基保護胺基的胺基酸，可舉例如Fmoc-Ser、Fmoc-Asn、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Ile、Fmoc-Ala、Fmoc-Tyr、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys、Fmoc-Arg、Fmoc-His、Fmoc-Asp、Fmoc-Glu、Fmoc-Gln、Fmoc-Thr、Fmoc-Cys、Fmoc-Met、Fmoc-Phe、Fmoc-Trp、Fmoc-Pro。

最後所導入的胺基酸只要選擇半胱胺酸(Cys)，即可製造胺基末端具有半胱胺酸的肽。可使用作為與Native Chemical Ligation中的肽之硫酯化合物耦合的片段。

藉由使用胺基酸上鍵結糖鏈的糖鏈胺基酸，而可製造將糖鏈胺基酸導入肽鏈的任意位置上之糖肽。

至於所使用的糖鏈胺基酸，只要是具有任意數的糖殘基者即無特別的規定，可舉例如含多量甘露糖(mannose)的高甘露糖、糖鏈的非還原末端上具有唾液酸(sialic acid)或半乳糖殘基的複合型糖鏈(Figurel)、高甘露糖結構與複合型糖鏈混合的混成型糖鏈、天冬醯胺的側鏈之醯胺基與氮糖化的氮結合型糖鏈、絲胺酸、蘇胺酸的側鏈之醇經糖化的氧結合型糖鏈等。具體上，可舉例如WO03/008431號公報上的糖鏈天冬醯胺。其中並以二涎糖鏈天冬醯胺或單涎糖鏈天冬醯胺為佳，例如，尤其以經式(4)所示的該唾液酸的羧基經苯甲基等的保護基保護的糖鏈為最佳。這樣的結合有二涎糖鏈天冬醯胺或單涎糖鏈天冬醯胺之糖肽，是較佳的糖肽。

樹脂的連結劑(linker)之部份氫氧基、與具有上述經保護的胺基之胺基酸的羧基之酯化反應，可使用例如1-三甲苯撐磺酸基-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、DCC、二異丙羧基醯亞胺(DIPCDI)等的脫水縮合劑而進行，例如以在固相柱中加入樹脂，以溶劑洗淨後，再加入胺基酸的溶劑溶液進行者為佳。

至於洗淨用溶劑，可例如為DMF、2-丙醇、DCM等。而可溶解胺基酸的溶劑，可例如為DMSO、DMF、DCM等。反應是在0至50℃下，並以室溫較佳，進行約10分鐘至30小時，並以15分鐘至24小時為佳。

此時固相上未反應的氫氧基也可使用醋酸酐進行乙醯基化並覆蓋(capping)。

胺基的保護基之脫保護，可藉由酸或鹼之處理而進行。例如保護基為Fmoc基時，可使用哌啶、嗎福啉等之鹼。此時，以在溶劑的存在下進行為佳，可舉例如DMSO、DMF、甲醇等。

未受保護的胺基與胺基經保護的任何胺基酸進行醯胺化反應，是以在活化劑及溶劑的存在下進行為佳。

至於活化劑，可舉例如二環己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亞胺‧鹽酸鹽(WSC/HCl)、二苯基磷酸疊氮(dibenzylphosphorylazide)(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、二乙基氰基膦酸鹽(DEPC)、二異丙基碳二亞胺(DIPCI)、苯并三唑-1-基氧基-三吡咯鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、羥基琥珀醯亞胺(HOSu)、二甲基胺吡啶(DMAP)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)、羥基酞醯亞胺(HOPht)、五氟酚(Pft-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)、氧-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)、氧-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)、3,4-二氫-3-氫二-4-噁-1,2,3-苯并三唑(Dhbt)等。

至於溶劑，可舉例如二甲基亞碸(DMSO)、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)等。

相對於式(2)表示的羧酸化合物，活化劑的使用量是0.1至20當量，並以0.5至10當量時為宜，而較佳的是0.8至5當量。反應可在溶劑中進行，於0至50℃中(以室溫時為佳)，進行約10分鐘至30小時(以15分鐘至24小時為佳)。又，經由在固相合成用柱中進行反應，以可直接使用於之後的固相合成為佳。

保護基之脫離，可進行與上述同樣的操作。

[步驟(B)：肽的切出]

在從樹脂上將肽鏈切斷時，是以酸處理者為佳。至於使用的酸，可舉例如稀鹽酸、稀硫酸等的無機酸類、甲酸、醋酸等的羧酸類。稀鹽酸或稀硫酸是約0.01至2N的稀鹽酸或稀硫酸之水溶液，並以0.05至1N為佳。在這些酸中又以醋酸較佳。相對於肽為1當量時，酸的使用量只要在1當量以上即無特別的限制，例如只要約在1至10,000當量即可，並以約10至1,000當量為佳。

本反應宜在醇的存在下進行，可舉例如甲醇、乙醇、丙醇等的低級醇、三氟乙醇(TFE)、三氯乙醇等的鹵化醇。在這些醇中，又以甲醇、三氟乙醇為佳，而三氟乙醇尤佳。在相對於1容量的酸，醇的使用比率只要醇為0.1至2容量即可，並以0.5至1.5容量較佳，而0.8至1.2容量更佳。

同時，本反應也可配合必要性而使用DCM、DMF、DMSO等的有機溶劑。

溶劑的使用量並無特別的限制，在相對於1容量的酸，只要約在0.1至100容量即可。

反應是在0至50℃中，並以於室溫時為佳，進行約1至30小時為佳。

由以上之步驟，即可得羧基末端具有羧基的肽。

[步驟(C)：肽的硫酯化合物之製造]

使所得的肽(原料肽)在溶劑中於縮合劑的存在下與硫醇化合物作用，即可製造羧基末端為硫酯的肽。至於硫醇化合物，也可舉例如在苯環任意位置上具有任意數的氟、氯、溴、碘等鹵原子、甲基、乙基等碳數1至4的低級烷基、甲氧基、乙氧基等碳數1至4的烷氧基、硝基等取代基的苯甲硫醇類、甲硫醇、乙硫醇等的低級烷硫醇類等。在這些硫醇化合物之中，尤其以苯甲硫醇為最佳。

至於硫醇化合物的使用量，在相對於原料肽為1當量時，只要在1至100當量即可，並以10至80當量較佳，而更好的是20至50當量。尤其為能抑制肽的羧基末端之消旋作用時，則以使用甚過量者為宜，並以約在30當量以上時較佳。

至於所使用的溶劑，可舉例如THF、DCM、DMSO、DMF等，其中並以DMF為較佳。

至於縮合劑，可使用HOBt/DIPCI或PyBOP/DIPEA等，並以PyBOP/DIPEA為佳。

相對於1當量的HOBt，HOBt/DIPCI的使用比率只要以DIPCI為0.1至10當量時即可，並以0.5至5當量較佳，而0.8至1.2當量時更佳。

相對於1當量的PyBOP，PyBOP/DIPEA的使用比率只要以DIPEA為0.1至10當量時即可，並以0.5至5當量較佳，而0.8至1.2當量時更佳。

相對於1當量的原料肽，HOBt的使用比率只要在1至20當量時即可，並以3至15當量為佳，而8至12當量時更佳。

相對於1當量的原料肽，PyBOP的使用比率只要在1 至10當量時即可，並以2至8當量為佳，而3至6當量時更佳。

在本發明中，是以使用分子篩等的脫水劑為佳。肽的消旋作用發生在原料肽的羧基末端羧酸活化後的時刻。因此，將原料肽與硫醇化合物混合後，加入縮合劑之後再進行反應為佳。反應溫度只要為-100至0℃即可，並以-80至-10℃時為佳，進行約30分鐘至2小時即可。

為抑制本發明中所得肽之消旋物之比率，通常消旋物之比率是在6%以下，並以4%以下為佳，在2%以下時更好，尤其是在0至1%時為最佳。

以下舉出實施例說明本發明，但本發明的範圍並不只限於這些實施例。

所使用經Fmoc化的胺基酸為習知者，係市售商品或在胺基酸上導入Fmoc基即可輕易的調製。

另外，Fmoc-Ala、Fmoc-Asn、Fmoc-Gly、Fmoc-Leu、Fmoc-Met、Fmoc-Phe、Fmoc-Pro、Fmoc-Val係表示各胺基酸的胺基經Fmoc基保護之意。Boc-Cys(Acm)係表示半胱胺酸的胺基經Boc基保護，及硫醇經乙醯胺甲基保護之意。Fmoc-Arg(Pbf)係表示精胺酸的α位胺基經Fmoc基保護的N^G-(2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯基)精胺酸之意。Fmoc-Asp(OtBu)及Fmoc-Glu(OtBu)係表示各胺基酸的胺基經Fmoc基保護，且天冬胺酸的β位及谷胺酸的γ位之羧基經第三丁基保護之意。Fmoc-Cys(trt)係表示半胱胺酸的胺基經Fmoc基保護，及硫醇經三苯甲基保護之意。Fmoc-Lys(Boc)係表示離胺酸的α位胺基經Fmoc基保護，及ε位胺基經Boc基保護之意。Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Tyr(tBu)及Fmoc-Thr(tBu)，係表示各胺基酸的胺基經Fmoc基保護，及氫氧基經三苯甲基保護之意。Boc-Leu及(Boc)Leu係表示白胺酸的胺基經Boc基保護之意。(Boc)Lys(Boc)係表示離胺酸的α位及ε位之胺基經Boc基保護之意，Lys(Boc)係表示離胺酸的ε位胺基經Boc基保護之意。Boc-Cys(Thz)係表示N-第三-Boc-1,3-噻唑啶-4-羧酸之意。Thr(tBu)、Tyr(tBu)及Ser(tBu)係表示各胺基酸的氫氧基經第三丁基保護之意。His(trt)係表示咪唑氮、Cys(trt)係表示半胱胺酸的硫醇基、Gln(trt)係表示谷胺醯胺之醯胺氮分別經三苯甲基保護之意。Asp(OtBu)及Glu(OtBu)係表示天冬胺酸的β位及谷胺酸的γ位之羧基經第三丁基保護之意。Cys(Thz)係表示1,3-噻唑啶-4-羧酸之意。Arg(Pbf)係表示N^G-(2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯基)精胺酸之意。

這些保護基是以歷來習知的方法導入，亦可使用經導入保護基的市售商品。另外，Ph係表示苯基，Bn係表示苯甲基。¹H-NMR是以Bruker的AVANCE 400(以400MHz表示)測定。

在Bruker Daltonics公司製的Esquire 3000 plus之ESI mass測定器，Bruker Daltonics公司製的Autoflex之MALDI mass測定器中，其母體(matrix)係使用二羥苯甲酸。

[實施例1]

將Amino-PEGA樹脂(1g,50μmol)加入固相合成用柱中，以DCM、DMF充分洗淨後，再以DMF使其充分膨脹。使4-羥甲基-3-甲氧苯氧酪酸(HMPB)(30.1mg,0.13mmol)、TBTU(40.1mg,0.13mmol)、N-乙基嗎福啉(15.8μl,0.13mmol)溶解於DMF(1ml)中後加入柱內，於室溫下攪拌2小時。以DMF及DCM充分洗淨樹脂後，可得HMPB-PEGA樹脂，使用為固相合成時的固相。

將Fmoc-Phe(96.8mg,0.25mmol)與MSNT(74mg,0.25mmol)、N-甲基咪唑(15μl,0.19mmol)溶解於DCM(1ml)中後加入固相合成用柱內，於室溫下攪拌2小時。攪拌後，使用DCM、DMF洗淨樹脂。使用20%哌啶/DMF溶液(1ml)以20分鐘脫保護Fmoc基。以DMF洗淨後，之後的肽鏈之伸長可利用以下所示的方法，依序將胺基酸縮合。

使胺基經Fmoc基保護的胺基酸與HOBt(33.8mg,0.25mmol)、DIPCI(38μl,0.25mmol)，溶解於DMF(1ml)中使其活化15分鐘後，加入固相合成用柱內。於室溫下攪拌1.5小時後，使用20%哌啶/DMF溶液(1ml)以20分鐘脫保護Fmoc基。反復這樣的操作後，可使胺基酸依序縮合。在胺基經Fmoc基保護的胺基酸中，係使用Fmoc-Tyr(tBu)(114.9mg,0.25mmol)、Fmoc-Asn(88.6mg,0.25mmol)、Fmoc-Ala(77.8mg,0.25mmol)、Fmoc-His(trt)(154.9mg,0.25mmol)、Fmoc-Ser(tBu)(95.9mg,0.25mmol)、Fmoc- Asp(OtBu)(102.9mg,0.25mmol)、Fmoc-Leu(88.4mg,0.25mmol)、Fmoc-Val(84.9mg,0.25mmol)，並在固相樹脂上形成Phe-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Asn-Ala-His(trt)-Ser(tBu)-His(trt)-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Tyr(tBu)-Leu-Phe-Phe-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Asn的19殘基之肽。

使用DCM及DMF洗淨之後，將19殘基的肽相當2μmol的樹脂移到微量管中。

使以上述式(5)表示的糖鏈天冬醯胺的二苯甲酯物(10mg,3.6μmol)與DEPBT(2mg,6μmol)溶解於DMF(0.12ml)中後，放入微量管內。

加入DIPEA(0.68μl,4μmol)後於室溫下攪拌18小時。以DMF洗淨後，使用20%哌啶將Fmoc基脫保護，並在固相樹脂上形成Phe-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Asn-Ala-His(trt)-Ser(tBu)-His(trt)-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Tyr(tBu)-Leu-Phe-Phe-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Asn-Asn(寡糖鏈)的20殘基(6)之肽。

[實施例2]

將實施例1中所得形成20殘基的肽之部份樹脂放入固相合成用柱內，加入可使樹脂充分浸漬程度的醋酸：DCM：甲醇(=5：4：1)，於室溫中攪拌3小時。過濾樹脂並去除，於減壓下濃縮反應溶液。將所得殘渣經HPLC(Cadenza column C18 75×4.6mm展開溶劑(developing solvent)A：0.1%TFA水溶液B：0.1%TFA乙腈：水=90：10梯度A：B=60：40→0：100 15分鐘流速0.1ml/min)的精製後，可得20殘基的肽(7)。

所得的肽係在羧基末端具有羧基，且維持有側鏈保護基者。

ESI-MS：Calcd for C₂₇₉H₃₈₂N₃₄O₉₄：[M+3H]³⁺ 1906.3,found.1905.8

[實施例3]

將實施例2中使用的醋酸：DCM：甲醇及反應時間，改變成以醋酸：TFE：DMC(=2：2：6)時為2小時，或醋酸：TFE(=1：1)時為27小時的反應。

任何一種均可得20殘基的肽(7)。

不過，在醋酸：TFE：DMC的條件比醋酸：DCM：甲醇之條件可得到約為5倍的收率，更且，醋酸：TFE的條件比醋酸：DCM：甲醇之條件可得到約為8倍的收率。

[實施例4]

與實施例1同樣的得到HMPB-PEGA樹脂(25μmol)，作為固相合成時用的固相，使胺基酸縮合形成肽。胺基酸的縮合是進行與實施例1同樣的操作。使用Fmoc-Ala(38.9mg,0.13mmol)作為第1胺基酸，藉由MSNT(37mg,0.13mmol)、N-甲基咪唑(7.5μl,94μmol)、DCM(0.5ml)使之縮合。

之後經保護胺基之胺基酸，則藉由HOBt(16.9mg,0.13mmol)、DIPCI(19.2μl,0.13mmol)、DMF(0.5ml)而依序使之縮合。使用Fmoc-Gln(46.1mg,0.13mmol)、Fmoc-Thr(tBu)(49.7mg,0.13mmol)、Fmoc-Ile(44.2mg,0.13mmol)、Fmoc-Val(42.4mg,0.13mmol)、Fmoc-Ser(tBu)(47.9mg,0.13mmol)作為經保護胺基的胺基酸，而依序使之縮合。

肽伸長後，相對於2μmol的樹脂而使用糖鏈天冬醯胺的二苯甲酯物(10mg,3.6μmol)與DEPBT(2mg,6μmol)、DIPEA(0.68μl,4μmol)、DMF(0.12ml)。之後，使Boc-Cys(Acm)(2.9mg,10μmol)藉由HOBt(1.36mg,10μmol)、DIPCI(1.54μl,10μmol)、DMF(0.25ml)而縮合。

在樹脂中加入AcOH：TFE=1：1(1ml)後，於室溫下反應14小時。將樹脂過濾並去除，濃縮反應溶液。經HPLC(Cadenza column C18 75×4.6mm展開溶劑A：0.1%TFA水溶液B：0.1%TFA/乙腈：水=90：10梯度A：B=60：40→0：100 15分鐘流速0.1ml/min)的精製後，可得經保護側鏈之9殘基的肽(8)。

ESI-MS：Calcd for C₁₅₅H₂₄₉N₁₈O₇₉S：[M+2H]⁺² 1830.3,found.1831.0.

[實施例5]

將實施例4中製得的9殘基肽(8)(2mg,0.55μmol)與分子篩(MS)4A(10mg)、苯甲硫醇(2μl,16.4μmol)於DMF溶劑中(85μl)在-20℃氬氣流下攪拌1小時後，加入PyBOP(1.4mg,2.7μmol)、DIPEA(0.46μl,2.7μmol)攪拌4小時。之後，在反應溶液中加入二乙基醚(5ml)使化合物沉澱，過濾之後以50%的乙腈水溶液回收沉澱物。使此以冷凍乾燥後，在所得的冷凍乾燥品中加入95%TFA水溶液並於室溫中攪拌2小時。將樹脂過濾並去除，濃縮反應溶液後，以50%的乙腈水溶液溶解並使其冷凍乾燥。使冷凍乾燥品經HPLC(Cadenza column C18 75×4.6mm展開溶劑A：0.1%TFA水溶液B：0.1%TFA乙腈：水=90：10梯度A：B=95：5→25：75 15分鐘流速0.1ml/min)的精製後，製得以式(9)表示羧基末端為苯甲硫酯的肽(NH₂-Cys(Acm)-Asn(二涎寡)-Thr-Ser-Val-Ile-Thr-Gln-Als-COSBn)。

¹H-NMR(400MHz,295K in D₂O,HOD=δ4.81)7.53-7.33(m,15H,Ph×3),5.37(d,2H,J=11.7Hz,PhCH₂),5.29(d,2H,J=11.6Hz,PhCH₂),5.11(s,1H,Man4-H-1),5.02(d,1H,GlcNAc1-H-1),4.92(s,1H,Man4’-H-1),4.65-4.52(m,3H,GlcNAc2,5,5’-H-1),2.91-2.78(m,4H,Asn-βCH₂,Cys-βCH₂),2.67(dd,2H,NeuAc7,7’-H_3eq),2.39-2.31(m,2H,Gln-γCH₃),1.83(dd,2H,J=13.1,13.1Hz,NeuAc7,7’-H-3_ax),1.38(d,3H,Ala-βCH₃),1.20(d,3H,J=6.51Hz,Thr-γCH₃),1.17(d,3H,J=6.40Hz,Thr-γCH₃),0.95-0.80(m,12H,Val-γCH₃,Ile-γCH₃,CH₃)

ESI-MS：Calcd for C₁₄₅H₂₂₃N₁₈O₇₆S：[M+2H]²⁺ 1749.8,found.1749.2

[實施例6]

以歷來習知的方法製造羧基末端具有羧基的肽AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COOH以作為原料。將該肽(0.5mg,1μmol)與MS 4A(10mg)、苯甲硫醇(3.7mg,30μmol)於DMF溶劑中(0.14ml)在-20℃氬氣流下攪拌1小時後，加入PyBOP(2.6mg,5μmol)、DIPEA(0.85μl,5μmol)攪拌17小時。之後，在反應溶液中加入二乙基醚(5ml)使化合物沉澱，過濾後以50%的乙腈水溶液回收沉澱物。使此經HPLC(Cadenza column C18 75×4.6mm展開溶劑A：0.1%TFA水溶液B：0.1%TFA乙腈：水=90：10梯度A：B=70：30→40：60 15分鐘流速0.1ml/min)的精製後，製得羧基末端為苯甲硫酯的AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COSBn。

消旋物的生成率在2%以下。

ESI-MS：Calcd for C₃₀H₃₆N₆O₅S：[M+H]⁺ 592.3,found.592.2。

[實施例7]

除了使反應溫度設在0℃之外，其餘進行與實施6同樣的操作，而得苯甲硫酯物AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COSBn。所得化合物的質譜分析與實施例6者相同。消旋物的生成率為6%。

[實施例8]

將肽AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COOH(0.5mg,1μmol)與MS 4A(10mg)、HOBt(0.7mg,5μmol或1.4mg、10μmol)於DMF溶劑中(0.14ml)在0℃氬氣流下攪拌1小時後，加入DIPCI(0.8μl,5μmol或1.6μl,10μmol)與苯甲硫醇(3.7mg,30μmol)。以下，即與實施6進行同樣的操作而得苯甲硫酯物的AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COSBn。在使用5當量的HOBt時，其收率為75%，在10當量時收率為98%。所得化合物的質譜分析與實施例6者相同。消旋物的生成分別為5%。

[實施例9]

以歷來習知的方法製造羧基末端具有羧基的肽AcNH-Cys-Cys-Glu-His-COOH以作為原料。將該肽(0.5mg,1μmol)與MS 4A(10mg)、HOBt(1.4mg,10μmol)於DMF溶劑中(0.14ml)在-20℃氬氣流下攪拌1小時後，加入DIPCI(1.6μl,10μmol)與苯甲硫醇(3.7mg,30μmol)使之反應。以下，與實施6進行同樣的操作而得苯甲硫酯物的AcNH-Cys-Cys-Glu-His-COSBn。

消旋物的生成率在2%以下。

[實施例10]

將三苯甲基氯化物樹脂(150μmol)使用為固相合成時的固相，依序使胺基酸縮合形成肽。胺基酸的縮合是進行與實施例1同樣的操作。

使用Fmoc-Leu(159.0mg,0.45mmol)作為第1胺基酸，藉由DCM(0.9ml)及DIEA(204.1μl,1.2mmol)使之縮合。

將之後經保護胺基之胺基酸藉由HOBt(101.3mg,0.75mmol)、DIPCI(115.4μl,0.75mmol)、DMF(3ml)使之縮合。

使用Fmoc-Pro(253.1mg,0.75mmol)、Fmoc-Arg(Pbf)(486.6mg,0.75mmol)、Fmoc-Tyr(tBu)(334.7mg,0.75mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)(319.2mg,0.75mmol)、Fmoc-Met(278.6mg,0.75mmol)、Fmoc-Thr(tBu)(298.1mg,0.75mmol)、Fmoc-Cys(trt)(439.3mg,0.75mmol)、Fmoc-Ala(233.5mg,0.75mmol)、Fmoc-Pro(253.1mg,0.75mmol)、Fmoc-Lys(Boc)(351.4mg,0.75mmol)、Fmoc-Pro(253.1mg,0.75mmol)、Fmoc-Tyr(tBu)(334.7mg,0.75mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)(319.2mg,0.75mmol)、Fmoc-Ser(tBu)(287.6mg,0.75mmol)、Fmoc-Cys(trt)(439.3mg,0.75mmol)、Fmoc-Asp(OtBu)(308.6mg,0.75mmol)、Fmoc-Val(254.6mg,0.75mmol)、Fmoc-Ser(tBu)(287.6mg,0.75mmol)、Fmoc-Val(254.6mg,0.75mmol)、Fmoc-Ala(233.5mg,0.75mmol)、 Fmoc-Ala(233.5mg,0.75mmol)、Boc-Leu(187mg,0.75mmol)作為經保護胺基的胺基酸，而使其依序縮合。

在樹脂中加入AcOH：DCM：MeOH=5：4：1(1ml)，於室溫中反應3小時。在反應溶液中加入己烷。之後過濾並去除樹脂。以MeOH洗淨樹脂後，濃縮該溶液。在濃縮殘渣中加入苯再予以濃縮，可得經保護側鏈的23殘基肽((Boc)Leu-Ala-Ala-Val-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Cys(trt)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Ala-Cys(trt)-Thr(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Leu-COOH)(10)。

將所得的23殘基肽(10)(39mg,10μmol)與MS 4A、苯甲硫醇(35.5μl,300μmol)於DMF溶劑中(1,350μl)在-20℃氬氣流下攪拌1小時後，加入PyBOP(26mg,50μmol)、DIPEA(8.5μl,50μmol)並攪拌2小時。之後，在反應溶液中加入二乙基醚使化合物沉澱，過濾後以DMF回收沉澱物。將此濃縮後，在殘渣中加入95%TFA水溶液並於室溫中攪拌2小時，之後加以冷凍乾燥。

使冷凍乾燥品經HPLC(Cadenza column C18 75×4.6mm展開溶劑A：0.1%TFA水溶液B：0.1%TFA乙腈：水=90：10梯度A：B=80：20→40：60 15分鐘流速1.0ml/min)的精製後，製得以式(11)表示的羧基末端為苯甲硫酯之肽(Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-COSBn)。

產量：20mg

消旋物的生成率：2%以下

ESI-MS：Calcd for C₁₁₈H₁₈₁N₂₇O₃₄S₄：[M+2H]²⁺ 1325.1,found.1325.3。

[實施例11]

在固相為三苯甲基樹脂(40μmol)的26殘基肽(Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Ala-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Val-Arg(Pbf)-Val-Thr(tBu)-Val-Leu-Arg(Pbf)-Gln(trt)-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Val-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-CO-三苯甲基樹脂))(300mg,Nova Biochem公司製品)中，使Cys(Thz)(46.7mg,0.2mmol)藉由HOBt(27.0mg,0.2mmol)、DIPCI(30.8μl,0.2mmol)、DMF(1ml)而縮合。

在樹脂中加入1%TFA/DCM溶液(1.0ml)，於室溫下反應2分鐘後，過濾並去除樹脂，以吡啶中和反應溶液。反復操作此反應5次，濃縮此反應溶液後，加水使經保護側鏈的肽沉澱。以DMF溶液回收沉澱物後，濃縮即得經保護側鏈的27殘基肽(Cys(Thz)-(Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Ala-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Val-Arg(Pbf)-Val-Thr(tBu)-Val-Leu-Arg(Pbf)-Gln(trt)-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Val-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-COOH)。

將所得的27殘基肽(12)(10μmol)與MS 4A(20mg)、硫酚(30.6μl,300μmol)於DMF溶劑中(1.36μl)在-20℃氬氣流下攪拌1小時後，加入PyBOP(8.6mg,50μmol)、DIPEA(26.0μl,50μmol)並攪拌4小時。之後，在反應溶液中加入二乙基醚使化合物沉澱，過濾後以DMF回收沉澱物。將此濃縮後，在所得濃縮物中加入95%TFA水溶液並於室溫中攪拌2小時。過濾並去除樹脂，在濃縮反應溶液之後，溶解於50%乙腈水溶液中並予以冷凍乾燥。使冷凍乾燥品經HPLC(Cadenza column C18 75×4.6mm展開溶劑A：0.1%TFA水溶液B：0.1%TFA乙腈：水=90：10梯度A：B=95：5→25：75 15分鐘流速0.1ml/min)的精製後，製得以式(13)表示的羧基末端為苯基硫酯的肽(Cys(Thz)-Glu-Tyr-Ala-Ser-Pro-Gly-Lys-Ala-Thr-Glu-Val-Arg-Val-Thr-Val-Leu-Arg-Gln-Ala-Asp-Ser-Gln-Val-Thr-Glu-Gly-COSPh)。

產量：5mg

消旋物的生成率：1%以下

ESI-MS：Calcd for C₁₂₈H₂₀₄N₃₆O₄₃S₂：[M+2H]²⁺ 1499.7,found.1499.8。

[實施例12]

在固相為三苯甲基樹脂(40μmol)的17殘基肽(Ala-Ala-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Met-Met-Gly-Asn-Glu(OtBu)-Leu-Thr(tBu)-Phe-Leu-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gly-CO-三苯甲基樹脂)(500mg,Nova Biochem公司製品) 中，使Cys(Thz)(46.7mg,0.2mmol)藉由HOBt(27.0mg,0.2mmol)、DIPCI(30.8μl,0.2mmol)、DMF(1ml)而縮合。

在樹脂中加入1%TFA/DCM溶液，於室溫下反應2分鐘後，過濾並去除樹脂，以吡啶中和反應溶液。反復操作此反應5次，濃縮此反應溶液後，加水使經保護側鏈的肽沉澱。以DMF溶液回收沉澱物後，濃縮即得經保護側鏈的18殘基肽(Cys(Thz)-Ala-Ala-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Met-Met-Gly-Asn-Glu(OtBu)-Leu-Thr(tBu)-Phe-Leu-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gly-COOH)(14)。

將所得的18殘基肽(14)(10μmol)與MS 4A(20mg)、苯甲硫醇(36.0μl,300μmol)於DMF溶劑中(1.36μl)在-20℃氬氣流下攪拌1小時後，加入PyBOP(8.6mg,50μmol)、DIPEA(26.0μl,50μmol)並攪拌4小時。之後，在反應溶液中加入二乙基醚使化合物沉澱，過濾後以DMF回收沉澱物。將此濃縮後，在所得濃縮物中加入95%TFA(含有乙烷二硫醇(EDT))水溶液並於室溫下攪拌2小時。過濾並去除樹脂，在濃縮反應溶液之後，溶解於50%乙腈水溶液中並將其冷凍乾燥。使冷凍乾燥品經HPLC(Cadenza column C18 75×4.6mm展開溶劑A：0.1%TFA水溶液B：0.1%TFA/乙腈：水=90：10梯度A：B=95：5→25：75 15分鐘流速0.1ml/min)的精製後，製得可以式(15)表示的羧基末端為苯甲硫酯的肽(Cys(Thz)-Ala-Ala-Thr-Tyr-Met-Met-Gly-Asn-Glu-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-Ser-Gly-COSBn)。

產量：4mg

消旋物的生成率：1%以下

ESI-MS：Calcd for C₈₉H₁₂₉N₁₉O₂₉S₄：[M+2H]²⁺ 2056.8,found.2057.2。

[實施例13]

在固相為三苯甲基樹脂(20μmol)的22殘基肽((Boc)Lys(Boc)-Ala-Met-His(trt)-Val-Ala-Gln(trt)-Pro-Ala-Val-Val-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Ile-Ala-Ser(tBu)-Phe-Gly-CO-三苯甲基樹脂)(250mg,Nova Biochem公司製品)中，加入1%TFA/DCM溶液，於室溫下反應2分鐘後，過濾並去除樹脂，以吡啶中和反應溶液。反復操作此反應5次，濃縮此反應溶液後，加水使經保護側鏈的肽沉澱。以DMF溶液回收沉澱物後，濃縮即得經保護側鏈的22殘基肽((Boc)Lys(Boc)-Ala-Met-His (trt)-Val-Ala-Gln(trt)-Pro-Ala-Val-Val-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Ile-Ala-Ser(tBu)-Phe-Gly-COOH)(16)。

ESI-MS：Calcd for C₁₇₀H₂₄₅N₂₉O₃₄S₂：[M+2H]²⁺ 1652.0,found.1651.6。

將所得的22殘基肽(16)(7.5mg,2.2μmol)與MS 4A(20.0mg)、硫酚(6.7μl,11.0μmol)於DMF溶劑中(300μl)在-20℃氬氣流下攪拌1小時後，加入PyBOP(5.7mg,66.0μmol)、DIPEA(1.7μl,11.0μmol)並攪拌4小時。之後，在反應溶液中加入二乙基醚使化合物沉澱，過濾後以DMF回收沉澱物。將此濃縮後，在所得濃縮物中加入95%TFA水溶液並於室溫下攪拌2小時。過濾並去除樹脂，在濃縮反應溶液之後，溶解於50%乙腈水溶液中並加以冷凍乾燥。使冷凍乾燥品經HPLC(Cadenza column C18 75×4.6mm展開溶劑A：0.1%TFA水溶液B：0.1%TFA/乙腈：水=90：10梯度A：B=95：5→25：75 15分鐘流速0.1ml/min)的精製後，製得以式(17)表示的羧基末端為苯甲硫酯的肽(Lys-Ala-Met-His-Val-Ala-Gln-Pro-Ala-Val-Val-Leu-Ala-Ser-Ser-Arg-Gly-Ile-Ala-Ser-Phe-Gly-COSPh)。

產量：2mg

消旋物的生成率：1%以下

ESI-MS：Calcd for C₁₀₃H₁₆₅N₂₉O₂₆S₂：[M+2H]²⁺ 1145.9,found.1145.7。

[實施例14]

與實施例1同樣的操作而得HMPB-PEGA樹脂(50μmol)，作為固相合成時用的固相，使胺基酸縮合形成肽。胺基酸的縮合是與實施例1同樣的操作。

使用Fmoc-Phe(96.9mg,0.25mmol)作為第1胺基酸，藉由MSNT(74.0mg,0.25mmol)、N-甲基咪唑(14.9μl,187.5μmol)、DCM(1ml)而使之縮合。

之後經保護胺基的胺基酸，則是藉由HOBt(33.7mg,0.25mmol)、DIPCI(38.5μl,0.25mmol)、DFM(1ml)而使之縮合。

至於經保護胺基的胺基酸，則使用Fmoc-Asn(88.6mg,0.25mmol)、Fmoc-Cys(trt)(146.4mg,0.25mmol)、Fmoc-Lys(Boc)(117.1mg,0.25mmol)、Fmoc-Asn(88.6mg,0.25mmol)、Fmoc-Gly(74.3mg,0.25mmol)、Fmoc-Tyr(tBu) (114.9mg,0.25mmol)、Fmoc-Thr(tBu)(99.4mg,0.25mmol)、Fmoc-Lys(Boc)(117.1mg,0.25mmol)，而在固相樹脂中形成Phe-Asn-Cys(trt)-Lys(Boc)-Asn-Gly-Tyr(tBu)-Thr(tBu)Lys(Boc)的9殘基肽。

使用DCM及DMF洗淨9殘基肽後，將9殘基的肽3μmol當量的樹脂移到微量管。

將以下述式(18)表示的糖鏈天冬醯胺(12mg,6μmol)與DEPBT(3mg,9μmol)溶解於DMF：DMSO=4：1(201μl)中後，放入微量管。

加入DIPEA(1.02μl,6μmol)後於室溫下攪拌20小時。以DMF洗淨後，使用20%哌啶將Fmoc基脫保護，並在固相樹脂上形成Phe-Asn-Cys(trt)-Lys(Boc)-Asn-Gly-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asn(寡聚糖鏈)的10殘基肽。在10殘基肽中，與前述同樣的以HOBt、DIPCI、DMF使胺基酸更加縮合。

至於胺基酸，則是用Fmoc-Asp(1.7mg,0.015mmol)、Fmoc-Ser(tBu)(1.9mg,0.015mmol)、Fmoc-Gly(1.5mg,0.015mmol)、Boc-Cys(Thz)(1.7mg,0.015mmol)使其依序縮合。

在樹脂中加入AcOH：TFE=1：1(1ml)，於室溫下反應20小時。過濾並去除樹脂，濃縮此反應溶液後，即得經保護側鏈的14殘基肽(Cys(Thz)-Gly-Ser(tBu)-Asp-Asn(寡聚糖鏈)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Asn-Lys(Boc)-Cys(trt)-Asn-Phe-COOH)(19)。

將所得的14殘基肽(19)(11.7mg,3μmol)與MS 4A、苯甲硫醇(10.6μl,90μmol)於DMF溶劑中(405μl)在-20℃氬氣流下攪拌1小時後，加入PyBOP(7.8mg,15μmol)、DIPEA(2.6μl,15μmol)並攪拌2小時。之後，在反應溶液中加入二乙基醚使目的物以沉澱物析出。藉由過濾使沉澱物與溶液分離，以50%的乙腈水溶液溶解回收殘留在濾紙上之沉澱物。濃縮此回收之溶液後，加入95%TFA水溶液並於室溫下攪拌2小時。之後加以冷凍乾燥。使冷凍乾燥品經HPLC(Cadenza column C18 75×4.6mm展開溶劑A：0.01%TFA水溶液B：0.01%TFA/乙腈：水=90：10梯度A：B=80：20→40：60 15分鐘流速1ml/min)的精製後，製得以式(20)表示的羧基末端為苯甲硫酯的肽(Cys(Thz)-Gly-Ser-Asp-Asn(寡聚糖鏈)-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-COSBn)。

產量：3mg

消旋物的生成率在2%以下

ESI-MS：Calcd for C₁₃₃H₂₀₃N₂₃O₆₇S₃：[M+2H]²⁺ 1646.1,found.1646.4。

[比較例1]

除了以DEPBT(1.5mg,5μmol)或HBTU(1.9mg,5μmol)取代PyBOP之外，其餘與實施例7同樣的操作，可得苯甲硫酯物AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COSBn。使用DEPBT時的收率為10%，而使用HBTU時則不到10%。

[比較例2]

除了將反應溫度設在30℃之外，其餘與實施例9同樣的操作，可得苯甲硫酯物AcNH-Cys-Cys-Glu-His-COSBn。

消旋物的生成率為40%。

[產業上之可應用性]

如依本發明的方法，即可製造不僅為不具有糖鏈的肽，即使具有尤其是氫氧基不經保護的糖鏈之糖肽，也不受該糖鏈結構的影響，且在維持有肽側鏈的保護基之羧基末端上具有羧基的肽，更可製造在肽之羧基末端上幾乎不生成消旋物的硫酯化合物。

使所得肽之硫酯化合物，與胺基末端的胺基酸為Cys的肽片段作用下即可進行高分子化，而亦可製得具有單一結構的糖鏈之大型糖蛋白。

Claims

一種羧基末端具有羧基的肽之製造方法，其特徵為：(A)將經式(1)所示的連結劑(linker)所改質之樹脂作為固相予以使用，並以固相合成法形成肽；(B)以選自稀鹽酸、稀硫酸、甲酸及醋酸中的至少一種酸切斷固相與肽的結合； [式中，R¹表示C_1-4烷基、R²表示氫原子、C_1-4烷氧基，n為1至4的整數]。
如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中，肽的胺基末端胺基酸為半胱胺酸。
如申請專利範圍第2項所述之製造方法，其中，前述半胱胺酸的硫醇基是經脂溶性保護基所保護。
如申請專利範圍第1項或第2項所述之製造方法，其中，經式(1)所示的連結劑所改質之樹脂，係在胺基PEGA樹脂的胺基上結合以式(1)所示的連結劑之樹脂。
如申請專利範圍第1項或第2項所述之製造方法，其中，步驟(B)在選自低級醇及鹵醇之至少一種醇的存在下進行。
如申請專利範圍第5項所述之製造方法，其中，醇為鹵醇。
如申請專利範圍第1項或第2項所述之製造方法，其中，肽為糖肽。