JP7362148B2 - Ｗｎｔヘキサペプチドの逐次液相経路 - Google Patents

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Description

本発明は、概して、ポリペプチド合成の分野、より具体的には、ＷｎｔヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を得るための逐次液相アプローチに関する。本発明は、さらに、新規なＦｏｘｙ-５トリ、テトラ及びペンタペプチド断片の液相合成に関する。
Ｆｏｘｙ-５は、ホルミル化されたＷｎｔ５Ａ由来のヘキサペプチド及びＷｎｔ５Ａミメティックで、潜在的な抗転移活性を有し、いくつかの一般的ながんにおける腫瘍拡散を予防するための薬物として現在開発中である。
Ｆｏｘｙ-５のアミノ酸配列は、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列番号１、図１）である。
静脈内に投与した場合、Ｆｏｘｙ-５は主にFrizzledファミリーのＷＮＴ５Ａ受容体に結合して活性化し、ＷＮＴ５Ａ媒介性シグナル伝達を活性化する。
Ｆｏｘｙ-５は、転移のリスクを低下させるために、大腸癌患者で認められる腫瘍組織におけるタンパク質ＷＮＴ５Ａの欠損を補うためのものである。ステージＩＩＩの大腸癌（ＣＲＣ）患者の近年の後ろ向き研究のサブ解析により、ＷＮＴ５Ａの発現が低い患者の割合は、ステージＩＩの大腸癌患者における以前の研究で観察されたものより著しく高いことが示されている。ＣＲＣステージＩＩＩの患者は、主に原発性腫瘍に隣接するリンパ節に腫瘍細胞が存在する点でステージＩＩの患者と異なり、このため、より侵襲性で、より速く進行する。ＷＮＴ５Ａの量が少ないことがステージＩＩＩの患者の７０％近くで観察されているのに対して、ステージが低い患者では約４５％である。これは、ＷＮＴ５Ａ発現量が疾患の経過に大いに影響するという仮説を支持する。
薬物候補Ｆｏｘｙ-５の安全性プロファイル、薬物動態及び第２相の用量の決定を目的としたＦｏｘｙ-５を用いた第１ｂ相試験に基づいて、現在、Ｆｏｘｙ-５の第２相臨床試験が行われており、この相では、大腸癌患者の治療は、手術が行われる前の診断時に開始される。治療は、最大１２週間、又は化学療法の開始まで継続することが予定されている。
Ｆｏｘｙ-５及びその製造方法は、国際公開第２００６／１３００８２号に記載されている。これまでに実施された前臨床及び臨床研究のための原薬（ＡＰＩ）は、古典的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）で製造されており、Ｆｏｘｙ-５は逐次１＋１＋１＋１＋１＋１経路で製造されている（図２参照）。
アミノ酸配列Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨは、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）戦略により、Ｃ末端アミノ酸Ｌｅｕが結合した2-クロロトリチル樹脂上に構築される。合成はＳＰＰＳ反応器で行い、カップリング、アセチル化及びN-α-脱保護を交互に行う。カップリングは、N,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はＤＭＦ／ジクロロメタン（ＤＣＭ）溶媒中で行う。活性化剤及び場合によっては塩基の存在下で、N-α-保護アミノ酸誘導体を樹脂に結合したアミノ酸にカップリングする。最後に、活性化剤を用いることなく、ギ酸活性エステルをカップリングする。
カップリングが完了していない場合、カップリングを継続することができ、又は手順を繰り返すことができる。副生成物としてのアミノ酸の欠失を回避するために、カップリング工程後に系統的なアセチル化工程（キャッピング）を行うか、又は再カップリング工程後に再カップリングを行う場合は、ＤＭＦ、無水酢酸及びピリジンを使用する。
アセチル化に続いて、ＤＭＦによる樹脂の洗浄、ＤＭＦ中のピペリジンによるＦｍｏｃ基の開裂、ＤＭＦによる洗浄からなるN-α-脱保護工程を行う。不完全な開裂の場合、上記のN-α-脱保護工程を繰り返すことができる。溶媒及び／又は試薬を工程ごとに添加し、反応混合物を撹拌し、次いでろ過を行い、樹脂から溶媒及び／又は試薬を除去する。
樹脂が完全なペプチド配列Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨを形成するまで、カップリング、アセチル化及びN-α-脱保護工程を繰り返す。ギ酸活性エステルのカップリングの後は、アセチル化は行わない。ペプチド樹脂をＤＭＦ及びＩＰＡで洗浄し、減圧下で乾燥することによってＳＰＰＳは完了する。
樹脂からのペプチドの開裂及び側鎖保護基の開裂は、適切なスカベンジャー（例．水及びＥＤＴ）の存在下でペプチド樹脂をＴＦＡで処理することによって行う。次いで、得られた粗ペプチドを、ＡＣＮ勾配溶離（ギ酸系及び酢酸系）による逆相カラムでの二次元分取ＨＰＬＣで精製する。
十分な純度の画分を凍結乾燥する。凍結乾燥物をＨＰＬＣで分析し、設定された純度基準に適合しない場合には、必要に応じて、二次元分取ＨＰＬＣで再精製する。
上述のＳＰＰＳアプローチでは、前臨床及び初期の臨床研究のためには十分な物質を得ることができたが、次の段階の臨床試験及び最終的な商業目的のために、商品のコストを低減することができ、より大きなバッチのＦｏｘｙ-５を利用可能とすることができる大規模合成により適した合成が必要とされている。
したがって、次の段階の臨床試験及び最終的な商業目的の両者のために、Ｆｏｘｙ-５を数ｋｇスケールで得ることができる信頼性の高い合成経路が必要とされている。
本発明は、「Ｆｏｘｙ-５」（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列番号１））として公知のホルミル化ヘキサペプチド、並びにその保護された誘導体を含むさまざまなトリ、テトラ、ペンタ及びヘキサペプチド断片を製造するための逐次液相法に関する。本明細書に記載の方法は、原材料費の安さ、中間体精製の容易さ、ペプチド断片組立ての容易さ、高いキラル純度及び商業的スケールアップへの順応性を含むがこれらには限定されない、従来の固相合成と比較して多くの利点を有し、以下で詳細に説明する。
したがって、本発明の主な目的は、Ｆｏｘｙ-５の拡張可能な合成経路を提供することである。さらなる目的は、医薬品の製造管理及び品質管理の基準（ＧＭＰ）に沿った製造のために、この拡張可能な合成経路に適した中間体を特定することである。
固相化学に伴う費用及び非拡張性を考慮して、液相化学経路を開発することに焦点が当てられてきた。本発明は、Ｆｏｘｙ-５又はその中間体及び前駆体の製造に対する逐次（１＋１＋１＋１＋１＋１）液相アプローチに関する。
ジペプチド又はトリペプチドを個別に製造し、次いでカップリングを行うヘキサペプチドの従来の収束的液相アプローチとは対照的に、本発明者らは、驚くべきことに、アミノ酸Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ及びＬｅｕの保護された誘導体の連続的液相カップリングによりＦｏｘｙ-５のペプチド配列を構築する逐次経路を非常に効率的に機能させることができることを見いだした。
本発明の中心的な部分は、Ｎ末端のメチオニンにホルミル（Ｆｏｒ）基を導入することにある。本明細書の後半で説明するように、この特定の化学的工程は、良好な収率並びに高い化学的及び光学的純度を達成することが最も困難であった。
本発明者らは、式：
ＰＧ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲ
で表されるヘキサペプチド誘導体は、好ましくは、Ｒがメチル又はt-ブチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、ＰＧが窒素原子に対する塩基感受性保護基、すなわち、酸性条件では安定であるが、アルカリ性／塩基性条件ではペプチドから切断することができる保護基である場合、Ｆｏｘｙ-５の前駆体として優れている可能性があることを見いだした。本発明では、Ｆｍｏｃ、Ｔｆａ、Ｔｓｏｃ、Ｍｅｓｏｃ、Ｐｅｏｃ、Ｃｙｏｃ又はＮｓｃなどの保護基が好適で、Ｆｍｏｃが好ましい。
第１の側面では、本発明は、式：
ＰＧ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲ
（式中、Ｒは、メチル又はt-ブチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、ＰＧは、Ｆｍｏｃ、Ｔｆａ、Ｔｓｏｃ、Ｍｅｓｏｃ、Ｐｅｏｃ、Ｃｙｏｃ又はＮｓｃなどの塩基感受性保護基である）
で表されるヘキサペプチド誘導体に関する。
第１の側面のヘキサペプチド誘導体は、N-脱保護、ギ酸とのカップリング、そして、残りの保護基の包括的な脱保護により、所望のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５に変換することができる。
第２の側面では、本発明は、ヘキサペプチドＦｏｘｙ-５（配列番号１）の製造方法であって、前記方法は、
ａ 第１の側面のヘキサペプチド誘導体を準備する、
ｂ 前記ヘキサペプチド誘導体からＰＧ保護基を除去する、
ｃ 工程ｂで得た生成物をギ酸又はその活性エステルとカップリングし、保護されたＦｏｘｙ-５誘導体Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
ｄ 工程ｃで得た保護されたＦｏｘｙ-５誘導体を包括的に脱保護し、粗Ｆｏｘｙ-５を得る、
ｅ 必要に応じて、さらに精製する、及び、
ｆ 必要に応じて、得られたＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを固体のアルカリ性又は酸性塩として沈殿させる
（上記式中、Ｒは、メチル又はt-ブチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、ＰＧは、Ｆｍｏｃ、Ｔｆａ、Ｔｓｏｃ、Ｍｅｓｏｃ、Ｐｅｏｃ、Ｃｙｏｃ又はＮｓｃなどの塩基感受性保護基である）
工程を含む方法に関する。
第１の側面のヘキサペプチド誘導体は、固相合成法又は液相法などの適切な方法によって、そして最も都合のよい方法としては、以下に示す本発明者らが開発した方法で製造することができる。
第３の側面では、本発明は、第１の側面のヘキサペプチド誘導体を製造する方法であって、前記方法は、以下の工程：
ａ 保護されたL-ロイシン誘導体ＰＧ－Ｌｅｕ－ＯＲを準備する、
ｂ 前記保護されたL-ロイシン誘導体から保護基ＰＧを除去し、次いで、ＰＧ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕとカップリングして保護されたジペプチドＰＧ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
ｃ 前記保護されたジペプチドから保護基ＰＧを除去し、次いで、ＰＧ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとカップリングして保護されたトリペプチドＰＧ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
ｄ 前記保護されたトリペプチドから保護基ＰＧを除去し、次いで、ＰＧ－Ｇｌｙ－ＯＨとカップリングして保護されたテトラペプチドＰＧ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
ｅ 前記保護されたテトラペプチドから保護基ＰＧを塩基性条件で除去し、次いで、過剰の塩基を除去し、保護基ＰＧが除去されたテトラペプチドＨ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
ｆ 前記保護基が除去されたテトラペプチドをＰＧ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）と塩基性条件でカップリングし、次いで、過剰の塩基を除去し、保護されたペンタペプチドＰＧ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
ｇ 前記保護基が除去されたペンタペプチドから保護基ＰＧを除去し、次いで、ギ酸又はその活性エステルとカップリングして保護されたヘキサペプチドＰＧ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
（上記式中、Ｒは、メチル又はt-ブチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、ＰＧは、Ｆｍｏｃ、Ｔｆａ、Ｔｓｏｃ、Ｍｅｓｏｃ、Ｐｅｏｃ、Ｃｙｏｃ又はＮｓｃなどの塩基感受性保護基である）
を含む方法に関する。
好ましい態様を含む本発明の上述した態様を、以下でさらに検討する。
本発明の第４の側面は、トリペプチド中間体ＩＮＴＭ-２、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕと、アミノ酸Ｇｌｙ、Ａｓｐ及びＭｅｔの保護された誘導体との連続したカップリングとN-脱保護、そしてギ酸とのカップリングに基づく、保護されたヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を製造する方法に関する。
本発明の第５の側面は、テトラペプチド中間体ＩＮＴＭ-３、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕと、アミノ酸Ａｓｐ及びＭｅｔの保護された誘導体との連続したカップリングとN-脱保護、そしてギ酸とのカップリングに基づく、保護されたヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を製造する方法に関する。
本発明の別の側面は、以下のペプチド：
Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ
Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号２）
Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号３）
Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）
Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号５）
Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ
Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ（配列番号６）
Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ（配列番号７）
Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ（配列番号８）
に関する。
図１は、Ｆｏｘｙ-５の化学構造を示す。Ｆｏｘｙ-５は、ホルミル化されたＮ末端を有する６個のアミノ酸からなる直鎖状のペプチドである。光学活性アミノ酸残基は全てL-立体配置である。Ｆｏｘｙ-５の分子式はＣ２６Ｈ４２Ｎ６Ｏ１２Ｓ２で、分子量は６９４．８ｇ／ｍｏｌ（平均質量）である。 図２は、ＳＰＰＳ経路によるＦｏｘｙ-５の合成スキームを示す。 図３は、Ｆｏｘｙ-５を製造するための逐次１＋１＋１＋１＋１＋１戦略を示す。 図４は、「アスパルチミド不純物」の形成を示す。 図５は、認められたエピマー化反応におけるホルミル基の役割を示す。
略号
Ｆｍｏｃ＝フレオニルメトキシカルボニル
Ｔｆａ＝トリフルオロアセチル
Ｔｓｏｃ＝4-トルエンスルホニルエチルオキシカルボニル
Ｍｅｓｏｃ＝メチルスルホニルエチルオキシカルボニル
Ｐｅｏｃ＝2-(トリフェニルホスホノ)エチルオキシカルボニル
Ｃｙｏｃ＝2-シアノ-t-ブチルオキシカルボニル
Ｐｈｔ＝フタリル
Ｎｓｃ＝2-(4-ニトロフェニルスルホニル)エトキシカルボニル
Ｂｏｃ＝tert-ブチルオキシカルボニル
Ｆｏｒ＝ホルミル
Ｔｒｔ＝トリフェニルメチル（トリチル）
ｔＢｕ＝tert-ブチル
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＤＩＰＥ＝ジ-イソプロピルエーテル
ＤＭＦ＝N, N-ジメチルホルムアミド
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ＝トリイソプロピルシラン
ＨＯＢｔ＝1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＥＤＡＣ、ＨＣｌ＝1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルアミン
ＤＢＵ＝1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン
アミノ酸略号
Ｍｅｔ＝メチオニン
Ａｓｐ＝アスパラギン
Ｇｌｙ＝グリシン
Ｃｙｓ＝システイン
Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ｌｅｕ＝ロイシン
Ｆｏｘｙ-５＝Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ
発明の概要の項において述べたように、Ｆｏｘｙ-５ヘキサペプチドを製造するための逐次液相アプローチが考案されており、以下の詳細に説明する。
一般的なアプローチは、全てのアミノ酸をO-ｔＢｕ、N-Ｆｍｏｃ誘導体として保護することであった。さらに、ターゲットは可能な限り「telescoped」合成で、それにより、時間と費用がかかる中間体の分離を回避する。好ましくは、一連の各工程は、例えば、過剰な塩基を除去するための有機溶媒の水による後処理やシリカプラグ処理（「フラッシュクロマトグラフィー」）といった簡単な精製工程により、生成物を単離することなく行うことが可能でなければならない。
逐次合成は、２つのtelescoped工程（工程１＋２）によるトリペプチドＩＮＴＭ-２、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕの製造で開始し、まず、反応溶媒としてのジクロロメタン（ＤＣＭ）中で、ロイシンt-ブチルエステル塩酸塩とＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）をカップリングする。反応混合物を水とブラインで処理し、工程２において中間体ジペプチドＩＮＴＭ-１、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを単離することなくこのＤＣＭ溶液を直接使用する。
工程２では、ＩＮＴＭ-１のＤＣＭ溶液をＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨと反応させて、目的のトリペプチドＩＮＴＭ-２、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを製造する。反応は順調に進行し、２工程合わせて約６８％の収率が繰り返し得られる。ＩＮＴＭ-２は、シリカゲル（１００～２００）のクロマトグラフィーで白色の固体として精製することができる。得られたＤＣＭ溶液はそのまま持ち越し、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨとカップリングする工程３で直接使用することもできる。
工程３では、ＩＮＴＭ-２のＦｍｏｃをＤＢＵで脱保護し、ＤＣＭ中のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨとカップリングしてテトラペプチドＩＮＴＭ-３、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを製造する。反応終了後、ＤＣＭ層を水及びブラインで洗浄する。次いで、有機相を５０容量から１０～１５容量に濃縮し、次の段階（工程４）に単離することなくそのまま持ち越す。
工程４では、最初にＩＮＴＭ-３のＤＣＭ溶液をＤＢＵで処理し、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行う。脱保護の後、ＥＤＣ塩酸塩、ＨＯＢｔ一水和物及びＤＩＰＥＡの存在下でテトラペプチドとＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕをカップリングする前に、反応物をシリカプラグカラムに通過させてＤＢＵを除去する。反応終了後、反応物を再びシリカプラグカラムに通過させて、残存するＤＩＰＥＡを除去する。望ましくないアスパルチミド不純物の形成を抑制するためには、上述したＤＢＵ及びＤＩＰＥＡの除去が不可欠である。図４参照。このように行うと、２つの工程（工程３＋４）でのＩＮＴＭ-４、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕの１００～１６０ｇスケールでの収率は、約６０％であった。ＤＢＵの存在下では、収率はわずか約２５％であった。
工程５では、ＩＮＴＭ-４のＦｍｏｃを溶媒ＤＣＭ中のＤＢＵで脱保護し、Ｆｍｏｃ－メチオニンとカップリングして、中間体である粗ＩＮＴＭ-５、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を製造する。ＤＣＭ／ＴＨＦを溶離液とするカラムクロマトグラフィーで精製する。精製した生成物をＤＩＰＥ中でスラリー化して、白色固体を得る。
当初、ＩＮＴＭ-４とN-ホルミルメチオニン（Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－ＯＨ）を直接カップリングして、ヘキサペプチドＩＮＴＭ-６を製造することを試みたが、この反応条件ではＦｏｒ－Ｍｅｔ－ＯＨは可逆的に環化してオキサゾリドンを生成し、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－ＯＨがラセミ化することから、この合成戦略では最終生成物の部分的なエピマー化が生じることが判明した。図５参照。代わりに、Ｆｍｏｃ－メチオニンを使用し、次いで、Ｆｍｏｃ基をＤＢＵで脱保護し、ギ酸又はその活性エステルとカップリングすることで、目的の中間体ヘキサペプチドＩＮＴＭ-６を得ることができる。（Ｔｒｔ及びO-ｔＢｕの）包括的な脱保護により、粗Ｆｏｘｙ-５を得ることができ、例えばクロマトグラフィーによってさらに精製してもよく、及び／又は、酸性若しくはアルカリ性付加塩といった固体として沈殿させてもよい。
第１の側面では、本発明は、式：
ＰＧ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲ
（式中、Ｒは、メチル又はt-ブチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、ＰＧは、Ｆｍｏｃ、Ｔｆａ、Ｔｓｏｃ、Ｍｅｓｏｃ、Ｐｅｏｃ、Ｃｙｏｃ又はＮｓｃなどの塩基感受性保護基である）
で表されるヘキサペプチド誘導体に関する。
第１の側面の態様では、ＰＧはＦｍｏｃである。第１の側面の別の態様は、式：
Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲ
（式中、Ｒはメチル又はt-ブチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルから選択される）
で表されるヘキサペプチド誘導体に関する。
第１の側面の好ましい態様では、ヘキサペプチド誘導体は、式：
Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）
である。
第２の側面では、本発明は、ヘキサペプチドＦｏｘｙ-５（配列番号１）を製造する方法に関し、前記方法は、
ａ 第１の側面のヘキサペプチド誘導体を準備する、
ｂ 前記ヘキサペプチド誘導体からＰＧ保護基を除去する、
ｃ 工程ｂで得た生成物をギ酸又はその活性エステルとカップリングし、保護されたＦｏｘｙ-５誘導体Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
ｄ 工程ｃで得た保護されたＦｏｘｙ-５誘導体を包括的に脱保護し、粗Ｆｏｘｙ-５を得る、
ｅ 必要に応じて、さらに精製する、及び、
ｆ 必要に応じて、得られたＦｏｘｙ-５ヘキサペプチドを固体のアルカリ性又は酸性塩として沈殿させる
（上記式中、Ｒは、メチル又はt-ブチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、ＰＧは、Ｆｍｏｃ、Ｔｆａ、Ｔｓｏｃ、Ｍｅｓｏｃ、Ｐｅｏｃ、Ｃｙｏｃ又はＮｓｃなどの塩基感受性保護基である）
工程を含む。
第２の側面の態様では、ＰＧはＦｍｏｃである。第２の側面の別の態様では、アルキル基Ｒはt-ブチル基である。第２の側面の別の態様では、ギ酸又はその活性エステルとのカップリングは溶液中で行われる。第２の側面の別の態様では、得られた粗Ｆｏｘｙ-５を逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーで精製する。第２の側面の別の態様では、得られたＦｏｘｙ-５を固体のアルカリ性又は酸性塩として沈殿させる。第２の側面の別の態様では、得られたＦｏｘｙ-５をアルカリ性又は酸性塩の結晶として単離する。
第３の側面では、本発明は、以下の工程：
ａ 保護されたL-ロイシン誘導体ＰＧ－Ｌｅｕ－ＯＲを準備する、
ｂ 前記保護されたL-ロイシン誘導体から保護基ＰＧを除去し、次いで、ＰＧ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕとカップリングして保護されたジペプチドＰＧ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
ｃ 前記保護されたジペプチドから保護基ＰＧを除去し、次いで、ＰＧ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとカップリングして保護されたトリペプチドＰＧ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
ｄ 前記保護されたトリペプチドから保護基ＰＧを除去し、次いで、ＰＧ－Ｇｌｙ－ＯＨとカップリングして保護されたテトラペプチドＰＧ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
ｅ 前記保護されたテトラペプチドから保護基ＰＧを塩基性条件で除去し、次いで、過剰の塩基を除去し、保護基ＰＧが除去されたテトラペプチドＨ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
ｆ 前記保護基が除去されたテトラペプチドをＰＧ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）と塩基性条件でカップリングし、次いで、過剰の塩基を除去し、保護されたペンタペプチドＰＧ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
ｇ 前記保護基が除去されたペンタペプチドから保護基ＰＧを除去し、次いで、ギ酸又はその活性エステルとカップリングして保護されたヘキサペプチドＰＧ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
（上記式中、Ｒは、メチル又はt-ブチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルから選択され、ＰＧは、Ｆｍｏｃ、Ｔｆａ、Ｔｓｏｃ、Ｍｅｓｏｃ、Ｐｅｏｃ、Ｃｙｏｃ又はＮｓｃなどの塩基感受性保護基である）
を含む、第１の側面のヘキサペプチド誘導体を製造する方法に関する。
第３の側面の態様では、ＰＧはＦｍｏｃである。
第３の側面の態様では、ｂ～ｇの全ての工程は溶液中で行う。
別の態様では、第１の側面のヘキサペプチド誘導体は、第３の側面の方法によって得ることができる。
第３の側面の好ましい態様では、塩基感受性保護基ＰＧはＦｍｏｃであり、アルキル基Ｒはt-ブチル基である。
第３の側面の別の態様では、少なくとも２つ、例えば２つ，３つ又は４つの連続するカップリング工程は、生成物を単離することなく行う。
したがって、好ましい態様では、本発明は、粗ヘキサペプチドＦｏｘｙ-５を製造するための以下の一連の工程：
１ Ｌｅｕ－ＯｔＢｕとＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕをカップリングしてジペプチドＩＮＴＭ-１、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを得る、
２ 次いで、これとＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨをカップリングしてトリペプチドＩＮＴＭ-２、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを得る、
３ 次いで、これとＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨをカップリングして保護されたテトラペプチドＩＮＴＭ-３、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号２）を得る、
４ 次いで、これとＦｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕをカップリングして保護されたペンタペプチドＩＮＴＭ-４、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号３）を得る、
５ 次いで、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔとカップリングして保護されたヘキサペプチドＩＮＴＭ-５、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を得る、
６ 次いで、これとギ酸を反応させて保護されたＦｏｘｙ-５であるＩＮＴＭ-６、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号５）を得る、
７ 次いで、t-Ｂｕ及びＴｒｔ基を包括的に脱保護して、Ｆｏｘｙ-５であるＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（配列番号１）を未精製の形態で得る
に関する。
第４の側面では、新規なトリペプチド中間体ＩＮＴＭ-２、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕと、アミノ酸Ｇｌｙ、Ａｓｐ及びＭｅｔの保護された誘導体との連続したカップリングとN-脱保護、そしてギ酸とのカップリングに基づく、保護された形態のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５であるＩＮＴＭ-６、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号５）を製造する方法に関する。
ある態様では、中間体ＩＮＴＭ-２、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕは、固相合成によって製造される。好ましい態様では、前記中間体ＩＮＴＭ-２は液相合成によって製造される。
第５の側面では、新規なテトラペプチド中間体ＩＮＴＭ-３、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕと、アミノ酸Ａｓｐ及びＭｅｔの保護された誘導体との連続したカップリングとN-脱保護、そしてギ酸とのカップリングに基づく、保護された形態のヘキサペプチドＦｏｘｙ-５であるＩＮＴＭ-６、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号５）を製造する方法に関する。
ある態様では、中間体ＩＮＴＭ-３、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕは、固相合成によって製造される。好ましい態様では、前記中間体ＩＮＴＭ-３は液相合成によって製造される。
本発明の別の態様は、以下のペプチド：
Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ
Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号２）
Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号３）
Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）
Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号５）
Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ
Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ（配列番号６）
Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ（配列番号７）
Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ（配列番号８）
に関する。
実施例１ Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ、工程１＋２
５０ｇのロイシンｔ－ブチルエステル塩酸塩と１７５ｇ（２．０当量）のＦｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）を、窒素ガス雰囲気下、２０２５ｍｌのジクロロメタン（２７容量）と２２５ｍｌのＴＨＦ（３容量）の溶媒混合物中、ＥＤＡＣ塩酸塩（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）及びＤＩＰＥＡ（５．０当量）の存在下で、最初に０～５℃で１時間、続いて１５～２０℃で１時間かけてカップリングさせ、ジペプチドＩＮＴＭ-１、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により、同定を行った。次の工程でＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨと反応させるため、生成物の単離を省略し、水による処理後にジクロロメタン溶液に溶解した。得られたジペプチドＩＮＴＭ-１、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕのその後の反応は、このジクロロメタン溶液を使用した。ＤＢＵを使用してＦｍｏｃを脱保護し、ＥＤＡＣ塩酸塩（２．０当量）、ＨＯＢｔ（２．０当量）及びＤＩＰＥＡ（４当量）の存在下で、２０４ｇ（１．１当量）のＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとカップリングして粗トリペプチドＩＮＴＭ-２を得、溶離液としてＥｔＯＡｃ－ヘキサンを使用するシリカゲル（１００－２００）クロマトグラフィーで精製し、トリペプチドＩＮＴＭ-２、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕをオフホワイト色の固体として得た（１４８ｇ、２回のカップリング反応全体の収率６８％、ＨＰＬＣ純度９３．８％）。
７５ｇのロイシンｔ－ブチルエステル塩酸塩を出発物質として、上記telescoped反応の工程１と２を繰り返し、２０８ｇのＩＮＴＭ-２を得た。
実施例２ テトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ、工程３
実施例１で得たＩＮＴＭ-２、（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ）を、ＤＣＭ（５０容量）中のＤＢＵと反応させてＦｍｏｃを脱保護し、次いで、ＤＩＰＥＡ（３当量）、ＥＤＣ塩酸塩（２．０当量）及びＨＯＢｔ（２．０当量）の存在下で、１．３当量のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨと反応させて保護されたテトラペプチドＩＮＴＭ-３、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号２）を得た。良好な変換がＴＬＣで観察され、ＤＣＭ相を水とブラインで洗浄した。最終的な有機相を１０～１５容量に濃縮し、次の段階では、単離せずにそのまま使用した。
実施例３ ペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ、工程４
実施例２においてＤＣＭ濃縮溶液として得た主要な中間体ＩＮＴＭ-３、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕを、まず、ＤＢＵと反応させてＦｍｏｃを脱保護した。次のカップリング工程に進む前に反応物をシリカプラグに通過させ、以前の実験において望ましくないアスパルチミド副生成物の形成を誘発することが判明しているＤＢＵを除去した。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯｔＢｕとカップリングする前にＤＢＵを除去すると、アスパルチミドの形成が効果的に抑制される。シリカプラグ処理後、ＤＩＰＥＡ、ＥＤＡＣ塩酸塩（１．２当量）及びＨＯＢｔ（１．２当量）の存在下でＤＣＭ溶液とＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）とを反応させ、保護されたペンタペプチドＩＮＴＭ-４、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号３）を得た。１Ｈ ＮＭＲ及び質量分析により、生成物の同定を行った。
１４８ｇ及び１９０ｇのＩＮＴＭ-２を出発物質として、telescoped反応（工程３＋工程４）を２回繰り返し、それぞれ、１０７ｇ及び１７８ｇのＩＮＴＭ-４を得た（理論値の５８．１％及び７５．４％）。
実施例４ ヘキサペプチドＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ、工程５
実施例３で得られたペンタペプチドＩＮＴＭ-４のＦｍｏｃ脱保護をＤＢＵで行い、ＤＩＰＥＡ（３．０当量）、ＥＤＣ塩酸塩（２．０当量）及びＨＯＢｔ一水和物（２．０当量）の存在下、溶媒としてＤＣＭ－ＴＨＦ（５０容量＋１０容量）中で、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔとカップリングすることにより、保護された疎Ｆｏｘｙ-５誘導体ＩＮＴＭ-５、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）を得た。溶離液としてＤＣＭ／ＴＨＦを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製した生成物をＤＩＰＥ中でスラリー化し、白色の固体を得た。
貧溶媒による沈殿やクロマトグラフィーといったさまざまな条件で、数回精製した。最良の方法はカラムクロマトグラフィーとその後のＤＩＰＥ中でのスラリー化で、２５ｇスケールで、収率が７８％で化学純度が９５．４％のものを得た。反応を８０ｇスケールで繰り返し、化学純度が９４．１％の生成物を７４ｇ（収率８３％）得た。
実施例５ ヘキサペプチドＩＮＴＭ-６、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ、工程６
実施例４で得たヘキサペプチドＩＮＴＭ-５のＦｍｏｃ脱保護をＤＣＭ（５０容量）中のＤＢＵで行い、次いで、ＥＤＣ塩酸塩（４．０当量）、ＨＯＢｔ一水和物（４．０当量）及びＤＩＰＥＡ（４．０当量）の存在下でギ酸（３．０当量）とカップリングし、ＩＮＴＭ-６、Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号５）を得た。
４、１８及び１８ｇのＩＮＴＭ-５を出発物質として、反応（工程６）を３回行い、化学純度が６７．５～７７．２％のものを収率７５～８３％で得た。１０当量のギ酸を使用して３０ｇスケールで反応を繰り返し、化学純度が８８．８％の生成物を１７ｇ（収率６７％）得た。
実施例６ ヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）、工程７
実施例５で得た１７ｇのヘキサペプチドを、窒素ガス雰囲気下で、ＴＦＡ（１０容量）／（i-Ｐｒ）３ＳｉＨ（ＴＩＳ、１．７容量）／ＤＴＴ（１．７当量）のカクテル中に溶解し、１０～１５℃で１５～３０分間撹拌し、包括的に脱保護（Ｔｒｔ及びｔＢｕ基）した。次いで、反応混合物を２５～３０℃に温め、この温度で１～２時間撹拌した。その後、反応物を減圧下で２～３容量に濃縮した。反応終了後、ＴＨＦ（５容量）を添加し、２５～３０℃でさらに１０～１５分間撹拌を続けた。次いで、ＭＴＢＥ（３０容量）をゆっくりと加えて粗生成物を沈殿させ、固体として定量的収率（１２．３ｇ）で得た。
最後に、粗生成物を以下の条件の逆相クロマトグラフィーで精製し、９８．３％の純度で所望のヘキサペプチドＦｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－ＯＨ（Ｆｏｘｙ-５）を得た。
カラム：Luna C18 (3)（Phenomenex製）、ポアサイズ：１０μｍ
カラム内径：５０ｍｍ ＩＤ×２５０ｍｍ（Novasep）
流速：５０．０ｍＬ／分
試料調製：１００ｇの試料を４ｍＬの希釈液に溶解し、０．４５μｍのフィルターでろ過
緩衝液調製：
緩衝液Ａ：１０ｍＬのトリフルオロ酢酸と１０Ｌの精製水を混合し、水中の０．１０±０．０１％のトリフルオロ酢酸緩衝液を調製
緩衝液Ｂ：１０ｍＬのトリフルオロ酢酸と１０Ｌのアセトニトリルを混合し、アセトニトリル中の０．１０±０．０１％のトリフルオロ酢酸緩衝液を調製
操作手順：
１. 緩衝液Ａ：緩衝液Ｂ＝９５：５の緩衝液のカラム容量３～５を流速５．０ｍＬ／分で用いてカラムを平衡化する。
２. 試料溶液をカラムに注入する。
３. カラムに接続されたクロマトグラフィーシステムをプログラムし、以下の溶出プログラムを実行して、生成物の溶出を開始する。
４. ピーク前部、ピーク、ピーク後部の画分を回収する。
注：溶出時間はスケールに依存し、実験ごとに異なる可能性がある。
５. ピークの溶出後、直ちにカラムを、２カラム容量の２０：８０（％v/v）の水及びアセトニトリルで洗浄する。
６. 画分の純度を分析する。
７. 画分を－２０℃±２℃で保管する。

Claims (12)

  1. 式：
    Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲ
    （式中、Ｒは、メチル又はt-ブチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルから選択される）
    で表されるヘキサペプチド誘導体。
  2. 式：
    Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕ（配列番号４）
    である、請求項１に記載のヘキサペプチド誘導体。
  3. 請求項１又は２に記載のヘキサペプチド誘導体の製造方法であって、前記方法は、以下の工程：
    ａ 保護されたL-ロイシン誘導体Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＲを準備する、
    ｂ 前記保護されたL-ロイシン誘導体から保護基Ｆｍｏｃを除去し、次いで、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕとカップリングして保護されたジペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
    ｃ 前記保護されたジペプチドから保護基Ｆｍｏｃを除去し、次いで、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨとカップリングして保護されたトリペプチドＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
    ｄ 前記保護されたトリペプチドから保護基Ｆｍｏｃを除去し、次いで、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨとカップリングして保護されたテトラペプチドＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
    ｅ 前記保護されたテトラペプチドから保護基Ｆｍｏｃを塩基性条件で除去し、次いで、過剰の塩基を除去し、保護基が除去されたテトラペプチドＨ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
    ｆ 前記保護基が除去されたテトラペプチドをＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）と塩基性条件でカップリングし、次いで、過剰の塩基を除去し、保護されたペンタペプチドＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
    ｇ 前記保護基されたペンタペプチドから保護基Ｆｍｏｃを除去し、次いで、Ｆｍｏｃ-メチオニンとカップリングして保護されたヘキサペプチドＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
    （上記式中、Ｒは、メチル又はt-ブチルなどのＣ１～Ｃ６アルキルから選択される）
    を含む方法。
  4. 少なくとも２つ、例えば２つ，３つ又は４つの連続するカップリング工程は、生成物を単離することなく行う、請求項３に記載の方法。
  5. フラッシュクロマトグラフィーなどによる中間体の精製は、生成物を単離することなく、２つの連続するカップリング工程の間に少なくとも１回、例えば、１回、２回、３回又は４回、行う、請求項３又は４に記載の方法。
  6. ｂ～ｇの全ての工程は溶液中で行う、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. Ｆｏｘｙ-５（配列番号１）の製造方法であって、前記方法は、
    ａ 請求項１又は２に記載のヘキサペプチド誘導体を準備する、
    ｂ 前記ヘキサペプチド誘導体の末端Ｍｅｔにおける窒素保護基であるＦｍｏｃを除去する、
    ｃ 工程ｂで得たヘキサペプチドをギ酸又はその活性エステルとカップリングし、保護されたＦｏｘｙ-５誘導体Ｆｏｒ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－ＯＲを得る、
    ｄ 工程ｃで得た保護されたＦｏｘｙ-５誘導体を包括的に脱保護し、粗Ｆｏｘｙ-５を得る、
    ｅ 必要に応じて、さらに精製する、及び、
    ｆ 必要に応じて、固体のＦｏｘｙ-５を得る
    工程を含む方法。
  8. 少なくとも２つ、例えば２つ，３つ又は４つの連続する反応工程は、生成物を単離することなく行う、請求項７に記載の方法。
  9. フラッシュクロマトグラフィーなどによる中間体の精製は、生成物を単離することなく、２つの連続する反応工程の間に少なくとも１回、例えば、１回、２回又は３回、行う、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 粗Ｆｏｘｙ-５を逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーで精製する、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. Ｆｏｘｙ-５を、ヘキサペプチド自体として、又はその酸性若しくはアルカリ性付加塩として、固体の形態で単離する、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記Ｆｏｘｙ-５の固体の形態は、凍結乾燥物、無定形粉末又は結晶性化合物である、請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法。
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