JP7362148B2 - Wntヘキサペプチドの逐次液相経路 - Google Patents
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Description
PG-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OR
で表されるヘキサペプチド誘導体は、好ましくは、Rがメチル又はt-ブチルなどのC1~C6アルキルから選択され、PGが窒素原子に対する塩基感受性保護基、すなわち、酸性条件では安定であるが、アルカリ性/塩基性条件ではペプチドから切断することができる保護基である場合、Foxy-5の前駆体として優れている可能性があることを見いだした。本発明では、Fmoc、Tfa、Tsoc、Mesoc、Peoc、Cyoc又はNscなどの保護基が好適で、Fmocが好ましい。
PG-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OR
(式中、Rは、メチル又はt-ブチルなどのC1~C6アルキルから選択され、PGは、Fmoc、Tfa、Tsoc、Mesoc、Peoc、Cyoc又はNscなどの塩基感受性保護基である)
で表されるヘキサペプチド誘導体に関する。
a 第1の側面のヘキサペプチド誘導体を準備する、
b 前記ヘキサペプチド誘導体からPG保護基を除去する、
c 工程bで得た生成物をギ酸又はその活性エステルとカップリングし、保護されたFoxy-5誘導体For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
d 工程cで得た保護されたFoxy-5誘導体を包括的に脱保護し、粗Foxy-5を得る、
e 必要に応じて、さらに精製する、及び、
f 必要に応じて、得られたFoxy-5ヘキサペプチドを固体のアルカリ性又は酸性塩として沈殿させる
(上記式中、Rは、メチル又はt-ブチルなどのC1~C6アルキルから選択され、PGは、Fmoc、Tfa、Tsoc、Mesoc、Peoc、Cyoc又はNscなどの塩基感受性保護基である)
工程を含む方法に関する。
a 保護されたL-ロイシン誘導体PG-Leu-ORを準備する、
b 前記保護されたL-ロイシン誘導体から保護基PGを除去し、次いで、PG-Glu-OtBuとカップリングして保護されたジペプチドPG-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
c 前記保護されたジペプチドから保護基PGを除去し、次いで、PG-Cys(Trt)-OHとカップリングして保護されたトリペプチドPG-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
d 前記保護されたトリペプチドから保護基PGを除去し、次いで、PG-Gly-OHとカップリングして保護されたテトラペプチドPG-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
e 前記保護されたテトラペプチドから保護基PGを塩基性条件で除去し、次いで、過剰の塩基を除去し、保護基PGが除去されたテトラペプチドH-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
f 前記保護基が除去されたテトラペプチドをPG-Asp(OtBu)と塩基性条件でカップリングし、次いで、過剰の塩基を除去し、保護されたペンタペプチドPG-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
g 前記保護基が除去されたペンタペプチドから保護基PGを除去し、次いで、ギ酸又はその活性エステルとカップリングして保護されたヘキサペプチドPG-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
(上記式中、Rは、メチル又はt-ブチルなどのC1~C6アルキルから選択され、PGは、Fmoc、Tfa、Tsoc、Mesoc、Peoc、Cyoc又はNscなどの塩基感受性保護基である)
を含む方法に関する。
Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu
Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号2)
Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号3)
Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号4)
For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号5)
Cys-Glu-Leu
Gly-Cys-Glu-Leu(配列番号6)
Asp-Gly-Cys-Glu-Leu(配列番号7)
Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu(配列番号8)
に関する。
Fmoc=フレオニルメトキシカルボニル
Tfa=トリフルオロアセチル
Tsoc=4-トルエンスルホニルエチルオキシカルボニル
Mesoc=メチルスルホニルエチルオキシカルボニル
Peoc=2-(トリフェニルホスホノ)エチルオキシカルボニル
Cyoc=2-シアノ-t-ブチルオキシカルボニル
Pht=フタリル
Nsc=2-(4-ニトロフェニルスルホニル)エトキシカルボニル
Boc=tert-ブチルオキシカルボニル
For=ホルミル
Trt=トリフェニルメチル(トリチル)
tBu=tert-ブチル
THF=テトラヒドロフラン
DIPE=ジ-イソプロピルエーテル
DMF=N, N-ジメチルホルムアミド
TFA=トリフルオロ酢酸
TIS=トリイソプロピルシラン
HOBt=1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DCM=ジクロロメタン
EDAC、HCl=1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
DIPEA=ジイソプロピルアミン
DBU=1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン
アミノ酸略号
Met=メチオニン
Asp=アスパラギン
Gly=グリシン
Cys=システイン
Glu=グルタミン酸
Leu=ロイシン
Foxy-5=For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu
PG-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OR
(式中、Rは、メチル又はt-ブチルなどのC1~C6アルキルから選択され、PGは、Fmoc、Tfa、Tsoc、Mesoc、Peoc、Cyoc又はNscなどの塩基感受性保護基である)
で表されるヘキサペプチド誘導体に関する。
Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OR
(式中、Rはメチル又はt-ブチルなどのC1~C6アルキルから選択される)
で表されるヘキサペプチド誘導体に関する。
Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号4)
である。
a 第1の側面のヘキサペプチド誘導体を準備する、
b 前記ヘキサペプチド誘導体からPG保護基を除去する、
c 工程bで得た生成物をギ酸又はその活性エステルとカップリングし、保護されたFoxy-5誘導体For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
d 工程cで得た保護されたFoxy-5誘導体を包括的に脱保護し、粗Foxy-5を得る、
e 必要に応じて、さらに精製する、及び、
f 必要に応じて、得られたFoxy-5ヘキサペプチドを固体のアルカリ性又は酸性塩として沈殿させる
(上記式中、Rは、メチル又はt-ブチルなどのC1~C6アルキルから選択され、PGは、Fmoc、Tfa、Tsoc、Mesoc、Peoc、Cyoc又はNscなどの塩基感受性保護基である)
工程を含む。
a 保護されたL-ロイシン誘導体PG-Leu-ORを準備する、
b 前記保護されたL-ロイシン誘導体から保護基PGを除去し、次いで、PG-Glu-OtBuとカップリングして保護されたジペプチドPG-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
c 前記保護されたジペプチドから保護基PGを除去し、次いで、PG-Cys(Trt)-OHとカップリングして保護されたトリペプチドPG-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
d 前記保護されたトリペプチドから保護基PGを除去し、次いで、PG-Gly-OHとカップリングして保護されたテトラペプチドPG-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
e 前記保護されたテトラペプチドから保護基PGを塩基性条件で除去し、次いで、過剰の塩基を除去し、保護基PGが除去されたテトラペプチドH-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
f 前記保護基が除去されたテトラペプチドをPG-Asp(OtBu)と塩基性条件でカップリングし、次いで、過剰の塩基を除去し、保護されたペンタペプチドPG-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
g 前記保護基が除去されたペンタペプチドから保護基PGを除去し、次いで、ギ酸又はその活性エステルとカップリングして保護されたヘキサペプチドPG-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
(上記式中、Rは、メチル又はt-ブチルなどのC1~C6アルキルから選択され、PGは、Fmoc、Tfa、Tsoc、Mesoc、Peoc、Cyoc又はNscなどの塩基感受性保護基である)
を含む、第1の側面のヘキサペプチド誘導体を製造する方法に関する。
1 Leu-OtBuとFmoc-Glu-OtBuをカップリングしてジペプチドINTM-1、Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-OtBuを得る、
2 次いで、これとFmoc-Cys(Trt)-OHをカップリングしてトリペプチドINTM-2、Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBuを得る、
3 次いで、これとFmoc-Gly-OHをカップリングして保護されたテトラペプチドINTM-3、Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号2)を得る、
4 次いで、これとFmoc-Asp-OtBuをカップリングして保護されたペンタペプチドINTM-4、Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号3)を得る、
5 次いで、Fmoc-Metとカップリングして保護されたヘキサペプチドINTM-5、Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号4)を得る、
6 次いで、これとギ酸を反応させて保護されたFoxy-5であるINTM-6、For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号5)を得る、
7 次いで、t-Bu及びTrt基を包括的に脱保護して、Foxy-5であるFor-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(配列番号1)を未精製の形態で得る
に関する。
Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu
Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号2)
Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号3)
Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号4)
For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号5)
Cys-Glu-Leu
Gly-Cys-Glu-Leu(配列番号6)
Asp-Gly-Cys-Glu-Leu(配列番号7)
Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu(配列番号8)
に関する。
50gのロイシンt-ブチルエステル塩酸塩と175g(2.0当量)のFmoc-Glu-(OtBu)を、窒素ガス雰囲気下、2025mlのジクロロメタン(27容量)と225mlのTHF(3容量)の溶媒混合物中、EDAC塩酸塩(2.0当量)、HOBt(2.0当量)及びDIPEA(5.0当量)の存在下で、最初に0~5℃で1時間、続いて15~20℃で1時間かけてカップリングさせ、ジペプチドINTM-1、Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBuを得た。1H NMR及び質量分析により、同定を行った。次の工程でFmoc-Cys(Trt)-OHと反応させるため、生成物の単離を省略し、水による処理後にジクロロメタン溶液に溶解した。得られたジペプチドINTM-1、Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBuのその後の反応は、このジクロロメタン溶液を使用した。DBUを使用してFmocを脱保護し、EDAC塩酸塩(2.0当量)、HOBt(2.0当量)及びDIPEA(4当量)の存在下で、204g(1.1当量)のFmoc-Cys(Trt)-OHとカップリングして粗トリペプチドINTM-2を得、溶離液としてEtOAc-ヘキサンを使用するシリカゲル(100-200)クロマトグラフィーで精製し、トリペプチドINTM-2、Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBuをオフホワイト色の固体として得た(148g、2回のカップリング反応全体の収率68%、HPLC純度93.8%)。
実施例1で得たINTM-2、(Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu)を、DCM(50容量)中のDBUと反応させてFmocを脱保護し、次いで、DIPEA(3当量)、EDC塩酸塩(2.0当量)及びHOBt(2.0当量)の存在下で、1.3当量のFmoc-Gly-OHと反応させて保護されたテトラペプチドINTM-3、Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号2)を得た。良好な変換がTLCで観察され、DCM相を水とブラインで洗浄した。最終的な有機相を10~15容量に濃縮し、次の段階では、単離せずにそのまま使用した。
実施例2においてDCM濃縮溶液として得た主要な中間体INTM-3、Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBuを、まず、DBUと反応させてFmocを脱保護した。次のカップリング工程に進む前に反応物をシリカプラグに通過させ、以前の実験において望ましくないアスパルチミド副生成物の形成を誘発することが判明しているDBUを除去した。Fmoc-Asp-OtBuとカップリングする前にDBUを除去すると、アスパルチミドの形成が効果的に抑制される。シリカプラグ処理後、DIPEA、EDAC塩酸塩(1.2当量)及びHOBt(1.2当量)の存在下でDCM溶液とFmoc-Asp(OtBu)とを反応させ、保護されたペンタペプチドINTM-4、Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号3)を得た。1H NMR及び質量分析により、生成物の同定を行った。
実施例3で得られたペンタペプチドINTM-4のFmoc脱保護をDBUで行い、DIPEA(3.0当量)、EDC塩酸塩(2.0当量)及びHOBt一水和物(2.0当量)の存在下、溶媒としてDCM-THF(50容量+10容量)中で、Fmoc-Metとカップリングすることにより、保護された疎Foxy-5誘導体INTM-5、Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号4)を得た。溶離液としてDCM/THFを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製した生成物をDIPE中でスラリー化し、白色の固体を得た。
実施例4で得たヘキサペプチドINTM-5のFmoc脱保護をDCM(50容量)中のDBUで行い、次いで、EDC塩酸塩(4.0当量)、HOBt一水和物(4.0当量)及びDIPEA(4.0当量)の存在下でギ酸(3.0当量)とカップリングし、INTM-6、For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号5)を得た。
実施例5で得た17gのヘキサペプチドを、窒素ガス雰囲気下で、TFA(10容量)/(i-Pr)3SiH(TIS、1.7容量)/DTT(1.7当量)のカクテル中に溶解し、10~15℃で15~30分間撹拌し、包括的に脱保護(Trt及びtBu基)した。次いで、反応混合物を25~30℃に温め、この温度で1~2時間撹拌した。その後、反応物を減圧下で2~3容量に濃縮した。反応終了後、THF(5容量)を添加し、25~30℃でさらに10~15分間撹拌を続けた。次いで、MTBE(30容量)をゆっくりと加えて粗生成物を沈殿させ、固体として定量的収率(12.3g)で得た。
カラム内径:50mm ID×250mm(Novasep)
流速:50.0mL/分
試料調製:100gの試料を4mLの希釈液に溶解し、0.45μmのフィルターでろ過
緩衝液A:10mLのトリフルオロ酢酸と10Lの精製水を混合し、水中の0.10±0.01%のトリフルオロ酢酸緩衝液を調製
緩衝液B:10mLのトリフルオロ酢酸と10Lのアセトニトリルを混合し、アセトニトリル中の0.10±0.01%のトリフルオロ酢酸緩衝液を調製
1. 緩衝液A:緩衝液B=95:5の緩衝液のカラム容量3~5を流速5.0mL/分で用いてカラムを平衡化する。
2. 試料溶液をカラムに注入する。
3. カラムに接続されたクロマトグラフィーシステムをプログラムし、以下の溶出プログラムを実行して、生成物の溶出を開始する。
注:溶出時間はスケールに依存し、実験ごとに異なる可能性がある。
5. ピークの溶出後、直ちにカラムを、2カラム容量の20:80(%v/v)の水及びアセトニトリルで洗浄する。
6. 画分の純度を分析する。
7. 画分を-20℃±2℃で保管する。
Claims (12)
- 式:
Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OR
(式中、Rは、メチル又はt-ブチルなどのC1~C6アルキルから選択される)
で表されるヘキサペプチド誘導体。 - 式:
Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(配列番号4)
である、請求項1に記載のヘキサペプチド誘導体。 - 請求項1又は2に記載のヘキサペプチド誘導体の製造方法であって、前記方法は、以下の工程:
a 保護されたL-ロイシン誘導体Fmoc-Leu-ORを準備する、
b 前記保護されたL-ロイシン誘導体から保護基Fmocを除去し、次いで、Fmoc-Glu-OtBuとカップリングして保護されたジペプチドFmoc-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
c 前記保護されたジペプチドから保護基Fmocを除去し、次いで、Fmoc-Cys(Trt)-OHとカップリングして保護されたトリペプチドFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
d 前記保護されたトリペプチドから保護基Fmocを除去し、次いで、Fmoc-Gly-OHとカップリングして保護されたテトラペプチドFmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
e 前記保護されたテトラペプチドから保護基Fmocを塩基性条件で除去し、次いで、過剰の塩基を除去し、保護基が除去されたテトラペプチドH-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
f 前記保護基が除去されたテトラペプチドをFmoc-Asp(OtBu)と塩基性条件でカップリングし、次いで、過剰の塩基を除去し、保護されたペンタペプチドFmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
g 前記保護基されたペンタペプチドから保護基Fmocを除去し、次いで、Fmoc-メチオニンとカップリングして保護されたヘキサペプチドFmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
(上記式中、Rは、メチル又はt-ブチルなどのC1~C6アルキルから選択される)
を含む方法。 - 少なくとも2つ、例えば2つ,3つ又は4つの連続するカップリング工程は、生成物を単離することなく行う、請求項3に記載の方法。
- フラッシュクロマトグラフィーなどによる中間体の精製は、生成物を単離することなく、2つの連続するカップリング工程の間に少なくとも1回、例えば、1回、2回、3回又は4回、行う、請求項3又は4に記載の方法。
- b~gの全ての工程は溶液中で行う、請求項3~5のいずれか一項に記載の方法。
- Foxy-5(配列番号1)の製造方法であって、前記方法は、
a 請求項1又は2に記載のヘキサペプチド誘導体を準備する、
b 前記ヘキサペプチド誘導体の末端Metにおける窒素保護基であるFmocを除去する、
c 工程bで得たヘキサペプチドをギ酸又はその活性エステルとカップリングし、保護されたFoxy-5誘導体For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-ORを得る、
d 工程cで得た保護されたFoxy-5誘導体を包括的に脱保護し、粗Foxy-5を得る、
e 必要に応じて、さらに精製する、及び、
f 必要に応じて、固体のFoxy-5を得る
工程を含む方法。 - 少なくとも2つ、例えば2つ,3つ又は4つの連続する反応工程は、生成物を単離することなく行う、請求項7に記載の方法。
- フラッシュクロマトグラフィーなどによる中間体の精製は、生成物を単離することなく、2つの連続する反応工程の間に少なくとも1回、例えば、1回、2回又は3回、行う、請求項7又は8に記載の方法。
- 粗Foxy-5を逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーで精製する、請求項7~9のいずれか一項に記載の方法。
- Foxy-5を、ヘキサペプチド自体として、又はその酸性若しくはアルカリ性付加塩として、固体の形態で単離する、請求項7~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Foxy-5の固体の形態は、凍結乾燥物、無定形粉末又は結晶性化合物である、請求項7~11のいずれか一項に記載の方法。
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