JP2021534199A - Wntヘキサペプチドの液相合成 - Google Patents
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Abstract
Description
Fmoc=フルオレニルメトキシカルボニル
Boc=tert-ブチルオキシカルボニル
For=ホルミル
Trt=トリフェニルメチル(トリチル)
Cbz=カルボキシベンジル
DCHA=ジシクロヘキシルアミン
tBu=tert-ブチル
THF=テトラヒドロフラン
DMF=N,N-ジメチルホルムアミド
TEA=トリエチルアミン
Bn=ベンジル
TFA=トリフルオロ酢酸
TIS=トリイソプロピルシラン
HOBt=1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HOSu=N-ヒドロキシスクシンイミド
DCM=ジクロロメタン
HOAt=1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
EDAC,HCl=1-エチル-3-(3’-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
DIPEA=ジイソプロピルアミン
DIPE=ジイソプロピルエーテル
DBU=1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン
アミノ酸略号:
Met=メチオニン
Asp=アスパラギン
Gly=グリシン
Cys=システイン
Glu=グルタミン酸
Leu=ロイシン
Foxy-5=For−Met−Asp−Gly−Cys−Glu−Leu
したがって、本発明の主な目的は、Foxy-5の拡張可能な合成経路を提供することである。さらなる目的は、医薬品の製造管理及び品質管理の基準(GMP)に沿った製造のために、この拡張可能な合成経路に適した中間体を特定することである。
3つのジペプチドをカップリングしてヘキサペプチドを形成する2+2+2カップリング戦略、
2つのトリペプチドをカップリングする3+3カップリング戦略、
テトラペプチドを順次伸長する4+1+1カップリング戦略、及び
トリペプチドを順次伸長する3+1+1+1カップリング戦略。
2+2+2経路A(図5)
第1のキージペプチドKD-1a(Boc−Met−Asp(OtBu)−OH)の合成は、市販のBoc−Met−OH及びHAsp(OtBu)−OMeのカップリングから開始する。次いで、得られたジペプチドBoc−Met−Asp(OtBu)−OMeのC末端を選択的に脱保護する。
第1のキージペプチドKD-1b(Cbz−Met−Asp(OBn)−OSu)の合成は、対応するメチオニン誘導体からのスクシンイミドエステルCbz−Met−OSuの形成を伴う。活性化されたエステルと市販のH−Asp(OBn)−OHを塩基性条件下でカップリングすることにより、ジペプチドCbz−Met−Asp(OBn)−OHを得、次いでこれもHOSuで活性化し、第1のジペプチドKD-1、Cbz−Met−Asp(OBn)−OSuを得る。
第1のキージペプチドKD-1c、Fmoc−Met−Asp(OtBu)−OHの合成を、市販のFmoc−Met−OHとH−Asp(OtBu)−OHをジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)でカップリングすることにより行った。
断片KT-1(For−Met−Asp(OtBu)−Gly−OH)の合成は、グリシンのグリシンメチルエステルへの変換によって開始される。これを、市販のFmoc−Asp−(O-tBu)とカップリングすると、Fmoc−Asp(OtBu)−Gly−OMeを得ることができる。Fmocを脱保護し、その後、市販のFor−Met−OHとカップリングして、For−Met−Asp(OtBu)−Gly−OMeを得る。メチルエステルを加水分解し、所望の断片KT-1を得る。
4+1+1カップリング戦略によるFoxy-5の合成は、テトラペプチドFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)とFmoc−Asp−OtBu及びFmoc−Metとの連続的カップリングで開始し、その後Fmoc除去、ホルミル化及び脱保護を行う。テトラペプチド自体は、上述したジペプチド断片KD-3c、Fmoc−Glu−(OtBu)−Leu−OtBuと、KD-2c、Fmoc−Gly−Cys(Trt)−OHのカップリングによって得る。
3+1+1+1カップリング戦略によるFoxy-5の合成は、断片KT-2(Fmoc−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OMe)をFmoc−Gly−OHと連続的にカップリングして保護されたテトラペプチドFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OMe(配列番号7)を得ることによって開始し、その後Fmoc−Asp−OtBuとカップリングして保護されたペンタペプチドFmoc−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OMe(配列番号9)を得、次いでホルミル−メチオニンとカップリングして保護された形態のFoxy-5、すなわちFor−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OMe(配列番号3)を得る。
a)PG1−Cys(PG2)−Glu(OPG3)−Leu−OR1
b)PG5−Met−Asp(OPG4)−Gly−OR2
c)PG1−Gly−Cys(PG2)−Glu(OPG3)−Leu−OR1
(式中、PG1は水素又はフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)若しくはBocのような保護基であり、PG2は水素又はアセトニド(シュードプロリン、ΨMe、MePro)、トリチル(Trt)から選択される保護基であり、PG3は水素又はtert-ブチル(tBu)保護基であり、PG5はホルミル又はフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)のような塩基感受性保護基であり、PG4は水素又はtert-ブチル(tBu)保護基であり、R1及びR2は独立して水素又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル(tBu)のようなC1〜C6アルキルである)
から選択されるFoxy-5(For−Met−Asp−Gly−Cys−Glu−Leu−OH)の保護されたペプチド断片が提供される。
a.ジペプチドFmoc−Glu−(OtBu)−Leu−OtBu(KD-3c)をFmoc−Gly−Cys(Trt)−OH(KD-2c)とカップリングしてテトラペプチドFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)を得、続いてPG5−Met−Asp(OtBu)−OHとカップリングすること、又は
b.トリペプチドPG5−Met−Asp(OtBu)−Gly−OHをFmoc−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(KT-2*)とカップリングすること、又は
c.トリペプチドFmoc−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(KT-2*)をFmoc−Gly−OH、Fmoc−Asp−OtBu及びPG5−Metと順次カップリングすること、又は
d.テトラペプチドFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)をFmoc−Asp−OtBu及びPG5−Metと順次カップリングすることを含み、
必要に応じて、その後カラムクロマトグラフィーにより粗ヘキサペプチドを精製し、続いて有機溶媒から固体として沈殿させ、ここで、PG5はホルミル又はFmocのような塩基感受性保護基である、方法が提供される。
PG5がホルミルの場合、
i.For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号15)を脱保護して、粗Foxy-5を得、又は、
PG5がFmocのような塩基感受性保護基の場合、
ii.ヘキサペプチドPG6−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBuからPG5を除去し、続いてギ酸とカップリングして、For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号15)を得、
iii.For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号15)を脱保護して、粗Foxy-5を得ること、を含み、
続いて、
a.必要に応じて、カラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、その後、必要に応じて有機溶媒から固体として沈殿させ、
b.必要に応じて、得られたFoxy-5ヘキサペプチドを結晶形態のような固体のアルカリ性塩又は酸性塩として沈殿させる、方法を提供する。
2+2+2経路
実施例1 キージペプチドKD-1a、Boc−Met−Asp(OtBu)−OHの製造
標的ジペプチドのメチルエステルBoc−Met−Asp(OtBu)−OMeの合成を以下のように行った。Boc−Met−OH(2.6g、10.4mmol、1.0当量)をDMF(乾燥)(25ml)に溶解し、DCC(2.2g、10.4mmol、1.0当量)及びHOAt(1.4g、10.4mmol、1.0当量)を添加した。乾燥した100ml丸底フラスコ中で、H−Asp(OtBu)−OMe・HCl(2.5g、10.4mmol、1.0当量)を、DMF(乾燥)(50ml)中でDIPEA(1.8ml、10.4mmol、1.0当量)と混合した。双方の溶液を0℃に冷却した。10分後、アスパラギン酸誘導体を含有する溶液をメチオニン溶液に滴下した。室温で72時間反応させた。酸性水溶液(0.5Mクエン酸)及び塩基(飽和NaHCO3)による後処理後、得られた物質をLCMSで分析した。若干の溶媒シグナル(EtOAc)及び不純物が観察されたが、シグナルは化合物Boc−Met−Asp(OtBu)−OMeの構造に一致した。
250ml丸底フラスコに、L-システイン塩酸塩一水和物(5.0g、28.5mmol)及びアセトン(80ml、1088mmol)(実用品質)を添加した。次いで、反応物(0.36M)を1.5時間加熱還流した。30分後、白色懸濁液は粘性のあるスラリーに変化した。ろ過し、過剰のアセトンを除去して4.7gの白色非晶質固体を得た。1H NMR分析により、約50%の未反応システインが残留していることが示された。プロリンアセトニドの収率及び品質を改善するために、白色非晶質固体(4.72g)とアセトン(200ml)を混合し、より薄い反応混合物(0.14M)として再度処理した。懸濁液を2時間還流し、ゆっくりと室温に冷却し、次いで0℃で30分間冷却した。氷冷懸濁液をp3ガラスフィルターでろ過し、アセトン(2×10ml)ですすいだ。残留アセトンを真空中で除去した。所望のアセトニドH−Cys(ψMe,MePro)−OH(4.4g、27mmol、収率95%)を優れた収率及び純度で白色粉末として得た。生成物の1H NMR(DMSO)スペクトルは標的分子構造と一致し、出発物質H−Cys−OHのシグナルは観察されなかった。
Fmoc−Met−OSuは、国際公開第90/08773号に従って、Fmoc−Met−OH(14.87g)、N-ヒドロキシスクシンイミド(HOSu、5.52g)及びジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、8.26g)をテトラヒドロフラン(THF、200ml)中、0℃で3.5時間反応させることによりin situで調製した。沈殿したジシクロヘキシル尿素(DCU)をろ過により除去し、THFろ液を、40mlの水酸化ナトリウムが添加された220mlの10:1水/THF中のH−Asp(OtBu)−OH冷溶液に添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した後、固体のクエン酸(20g)をEtOAc(600ml)と共に添加した。EtOAc層を分離し、10%クエン酸及びブラインで洗浄し、乾燥(硫酸マグネシウム)した。EtOAc溶液を蒸発させて残渣を得、これをEtOAc200mlに溶解し、ジシクロヘキシルアミン(DCHA、7.84ml)で処理して、所望の生成物のDCHA塩17.93g、mp159〜162℃を沈殿させた。
250ml丸底フラスコを使用し、市販のCbz−Glu(OtBu)−OH(5.0g、14.8mmol、1.0当量)の冷却溶液にHOAt(2.4g、17.8mmol、1.2当量)を添加し、無水MeCN(25ml)に溶解させたDCC(3.7g、17.8mmol、1.2当量)と混合した。この溶液に、無水MeCN(50ml)中においてH−Leu−OtBu・HCl(3.3g、14.8mmol、1.0当量)及びDIPEA(2.58ml、14.82mmol)の混合物を添加した。得られた反応混合物(0.2mol)を0℃で撹拌し、18時間かけて室温まで徐々に上昇させた。次いで、反応混合物を真空中で濃縮して、9.1g(70面積%のHPLC純度に基づいて最大83%の収率)の濃い黄色油状物を得、これは数時間放置するとゆっくりと凝固した。その一部(5.2g)を50mlのEtOAcに懸濁し、30mlの水を添加した。有機相を洗浄し、蒸発させ、2.9gの白色固体を得た。HPLCでは、4.105分(76面積%)に生成物のピークが示された。1H NMRの結果は標的分子と一致し、Cbz−Glu(OtBu)−Leu−OtBuが、計算収率52%、クロマトグラフィーを行わずに平均純度76%(HPLC分析に基づく)、収率63%(1H NMR分析に基づく純度95%)で得られた。この物質をさらに精製することなく次の反応に用いた。
高度希釈(50体積)ジクロロメタン中、EDAC,HCl(2.0当量)、HOBt(2.0当量)及びDIPEA(5.0当量)の存在下で、50gのロイシンt-ブチルエステル塩酸塩と1.3当量のFmoc−Glu−(OtBu)を、最初は0〜5℃で1時間、次いで15〜20℃で1時間カップリングし、ジペプチドFmoc−Glu−(OtBu)−Leu−OtBu(KD-3c)を得た。1H NMR及び質量分析により同定した。Fmoc−Gly−Cys(Trt)−OHとの反応については、生成物の単離を省略し、水性後処理の後にジクロロメタン溶液を実施例4aで直接使用した。
その後の反応は、DCC及びHOAtの存在下で、ジペプチドH−Glu(OtBu)−Leu−OtBu及びCbz−Gly−Cys(ΨMe,MePro)−OHのカップリングを伴った。
ジペプチドKD-3c、Fmoc−Glu−(OtBu)−Leu−OtBuのその後の反応を、上記(実施例3a)のジクロロメタン溶液を用いて行う。DBUを用いてFmocを脱保護し、1.3当量のFmoc−Gly−Cys(Trt)−OH(市販)とのカップリングを、DIPEA(3当量)、EDC・HCl(2.0当量)及びHOBt(2.0当量)の存在下で行って、保護されたテトラペプチドFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)を得る。DCM層を水及びブラインで洗浄し、10〜15体積に濃縮し、次の段階(実施例5a)でそのまま使用する。
ヘキサペプチドBoc−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(ΨMe,MePro)−Glu(OtBu)−Leu−OtBuを得るための、Boc−Met−Asp(OtBu)−OHとH−Gly−Cys(ΨMe,MePro)−Glu(OtBu)−Leu−OtBuとのペプチドカップリングを、18時間、室温で、DMF中カップリング試薬DCC及び添加剤HOAtの存在下で行った。
実施例4aで濃縮されたDCM溶液として得たFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)を、DBUと反応させてFmocを脱保護する。次のカップリング工程に進む前に、反応物をシリカカラムに通してDBUを除去する。カラム処理後、DIPEA(3.0当量)、EDC・HCl(2.0当量)及びHOBt・H2O(2.0当量)の存在下で、実施例2aでDCHA塩として得たFmoc−Met−Asp(OtBu)−OH(KD-1c)とDCM溶液を反応させて(遊離後)、保護されたFoxy-5誘導体 Fmoc−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号4)を粗製形態で得る。次いで、DCM中のDBUによりFmocを脱保護し、EDC・HCl、HOBt・H2O及びDIPEAの存在下でギ酸とカップリングして、For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号15)を得た。この保護されたヘキサペプチドを、TFA/(i-Pr)3SiH/DTTに溶解し、撹拌することによって(Trt基及びtBu基を)脱保護した。反応完了後、THF/MTBEで沈殿させ、粗生成物を固体として得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドFor−Met−Asp−Gly−Cys−Glu−Leu−OH(Foxy-5)を90%を超える収率及び純度約97%で得た。
実施例6 断片KT-1(For−Met−Asp(OtBu)−Gly−OH)及びKT-1*(Fmoc−Met−Asp(OtBu)−Gly−OH)の製造
実施例6a トリペプチドKT-1*(Fmoc−Met−Asp(OtBu)−Gly−OH)の製造で、ホルミル−メチオニンの代わりにFmoc−メチオニンを使用した例
グリシンメチルエステル(25g)を、DIPEA(1.0当量)、EDAC,HCl(2.0当量)及びHOBt(2.0当量)の存在下、DMF中でFmoc−Asp(OtBu)−OHと反応させた。標準的な後処理の後、粗生成物を15%EtOAc/n-ヘキサンを用いてシリカゲルで精製した。この1gをFmoc−Metとカップリングし、保護トリペプチドFmoc−Met−Asp(OtBu)−Gly−OMe(2.0g、72.7%)を得た。1H NMR及び質量分析により同定した。
グリシンメチルエステルを、実施例6aに概説した手順に従ってFmoc−Asp(OtBu)−OHとカップリングし、保護ジペプチドFmoc−Asp(OtBu)−Gly−OMeを得た。DBUを用いてFmocを脱保護し、DIPEA(1.0当量)、EDAC,HCl(2.0当量)及びHOBt(2.0当量)の存在下で、DCM中で市販のFor−Met−OHとカップリングし、所望の断片KT-1を得た。
Fmocロイシン(250g)をメタノールに溶解し、塩化チオニルで処理することにより定量的な収率でFmocメチルロイシンに変換した。ジクロロメタン中のDBUによるFmocの脱保護により、所望のロイシンメチルエステル(76g、全収率74%)を得た。1H NMR及び質量分析により同定した。次に、高度希釈ジクロロメタン中、EDAC,HCl(2.0当量)及びHOBt(2.0当量)の存在下で、10gのロイシンメチルエステルとFmoc−Glu−(OtBu)を、最初は0〜5℃で1時間、次いで15〜20℃で1時間カップリングし、ジペプチドFmoc−Glu−(OtBu)−Leu−OMe(7.2g、全収率55%)を得た。1H NMR及び質量分析により同定した。次の工程におけるFmocシステインとの反応では、生成物の単離を省略し、水性処理の直後にジクロロメタン溶液を使用した。ジペプチドFmoc−Glu−(OtBu)−Leu−OMeのその後の反応は、上述のジクロロメタン溶液を用いた。DBUを用いてFmocを脱保護し、EDAC,HCl(1.2当量)及びHOBt(1.2当量)の存在下でFmoc−Cys(Trt)−OHとカップリングして、断片KT-2、Fmoc−Cys(Trt)−Glu−(OtBu)−Leu−OMeを得た(6.6g、2回のカップリング反応の全収率88%)。1H NMR及び質量分析により同定した。
高度希釈(50体積)ジクロロメタン中、EDAC,HCl(2.0当量)、HOBt(2.0当量)及びDIPEA(5.0当量)の存在下で、50gのロイシンt-ブチルエステル塩酸塩と1.3当量のFmoc−Glu−(OtBu)を、最初は0〜5℃で1時間、次いで15〜20℃で1時間カップリングし、ジペプチドFmoc−Glu−(OtBu)−Leu−OtBu(KD-3c)を得た。1H NMR及び質量分析により同定した。次の工程におけるFmoc−Cys(Trt)−OHとの反応については、生成物の単離を省略し、水性後処理の後にジクロロメタン溶液を直接使用した。ジペプチドKD-3cのその後の反応は、上述のジクロロメタン溶液を用いて行った。DBUを用いてFmocの脱保護を行い、EDAC,HCl(1.2当量)、HOBt(1.2当量)及びDIPEA(5当量)の存在下、1.3当量のFmoc−Cys(Trt)−OHとカップリングして粗トリペプチドKT-2*を得、これを、溶離剤としてEtOAc−ヘキサンを使用するシリカゲル(100〜200)クロマトグラフィーによって精製し、トリペプチドKT-2*、Fmoc−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBuを白色固体(148g、2回のカップリング反応の全収率68%)として得た。1H NMR及び質量分析により同定した。
2つのトリペプチド断片、KT-1及びKT-2からのFoxy-5の合成は、KT-2のFmocの脱保護から始める。その後、KT-1とカップリングし、For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OMeを得る。次いで、塩基性条件下でけん化し、For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OHを得、tBu保護基及びトリチル保護基を脱保護し、所望のヘキサペプチドFoxy-5を粗製形態で得る。
2つのトリペプチド断片、KT-1*及びKT-2*からのFoxy-5の合成は、KT-2*のFmocの脱保護から始める。その後、KT-1*とカップリングし、Fmoc−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号4)を得、DCM中のDBUでFmocを脱保護し、EDC・HCl、HOBt・H2O及びDIPEAの存在下でギ酸とカップリングし、For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号15)を得た。この保護されたヘキサペプチドを、TFA/(i-Pr)3SiH/DTT中に溶解し、撹拌することによって(Trt基及びtBu基を)脱保護した。反応完了後、THF/MTBEで沈殿させ、粗生成物を固体として得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドFor−Met−Asp−Gly−Cys−Glu−Leu−OH(Foxy-5)を90%を超える収率及び純度約97%で得た。
実施例10 テトラペプチドFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)とFmoc−Asp−OtBu及びFmoc−Metとの連続的カップリング、Fmoc除去、ホルミル化及び脱保護によるFoxy-5の製造
実施例4aで得たFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)を、まずDBUと反応させてFmocを脱保護する。次のカップリング工程に進む前に、反応物をシリカカラムに通してDBUを除去したが、これは望ましくないアスパルトイミド副生成物の形成を誘導することが以前の実験で分かっているためである。Fmoc−Asp−OtBuとのカップリング前にDBUを除去すると、アスパルトイミド形成が効果的に抑制される。シリカカラム処理後、DCM溶液を、DIPEA、EDAC,HCl(1.2当量)及びHOBt(1.2当量)の存在下でFmoc−Asp(OtBu)と反応させて、保護されたペンタペプチドFmoc−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号3)を得た。生成物を1H NMR及び質量分析により同定した。
実施例11 Foxy-5に対する逐次液相アプローチの実行可能性
KT-2(Fmoc−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OMe)をDCM中でDBUと反応させてFmocを脱保護し、その後DIPEA、EDAC,HCl(1.2当量)及びHOBt(1.2当量)の存在下でFmoc−Gly−OHと反応させて保護されたテトラペプチドFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OMe(配列番号7)を得た。生成物を1H NMR及び質量分析により同定した。粗生成物を、DCM中のDBUと類似の様式でさらに反応させて、Fmocを脱保護し、その後DIPEA、EDAC,HCl(1.2当量)及びHOBt(1.2当量)の存在下でFmoc−Asp(OtBu)と反応させて、保護されたペンタペプチドFmoc−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OMe(配列番号9)を得、これをシリカゲル精製及びメタノール中でのスラリー化後に白色固体として得た。生成物を1H NMR及び質量分析により同定した。ペンタペプチドのFmocの脱保護はDBUを用いて行い、DIPEA(1.0当量)、EDAC,HCl(2.0当量)及びHOBt(2.0当量)の存在下、DCM中で市販のFor−Met−OHとカップリングすると、保護されたFoxy-5誘導体For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OMe(配列番号3)が得られ、これを塩基性条件下でけん化すると、For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OH(配列番号4)が得られ、tBu保護基及びトリチル保護基を脱保護し、所望のヘキサペプチドFoxy-5を粗製形態で得る。
実施例8で得たKT-2*(Fmoc−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu)を、DCM(50体積)中でDBUと反応させてFmocを脱保護し、その後1.3当量のFmoc−Gly−OHを、DIPEA(3当量)、EDC・HCl(2.0当量)及びHOBt(2.0当量)の存在下で反応させて、保護されたテトラペプチドFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)を得た。TLCにより良好な変換が観察され、DCM層を水及びブラインで洗浄した。最終有機層を10〜15体積に濃縮し、単離することなく次の段階でそのまま使用した。
濃縮DCM溶液として得たFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)を、まずDBUと反応させてFmocを脱保護した。次のカップリング工程に進む前に、反応物をシリカカラムに通してDBUを除去したが、これは望ましくないアスパルトイミド副生成物の形成を誘導することが以前の実験で分かっているためである。Fmoc−Asp−OtBuとのカップリング前にDBUを除去すると、アスパルトイミド形成が効果的に抑制される。シリカカラム処理後、DCM溶液を、DIPEA、EDAC,HCl(1.2当量)及びHOBt(1.2当量)の存在下でFmoc−Asp(OtBu)と反応させて、保護されたペンタペプチドFmoc−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号3)を得た。生成物を1H NMR及び質量分析により同定した。
実施例13で得たペンタペプチドFmoc−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号10)のFmocの脱保護を、DBUで行い、DIPEA(3.0当量)、EDC・HCl(2.0当量)及びHOBt・H2O(2.0当量)の存在下、溶媒としてのDCM−THF(50体積+10体積)中でFmoc−Metとカップリングし、保護Foxy-5誘導体Fmoc−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号4)を粗製形態で得た。溶離剤としてDCM/THFを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製を行った。精製した生成物をDIPE中でスラリー化して白色固体を得た。
実施例14で得たヘキサペプチドFmoc−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号4)のFmocの脱保護を、DCM(50体積)中のDBUで行い、その後EDC・HCl(4.0当量)、HOBt・H2O(4.0当量)及びDIPEA(4.0当量)の存在下で、ギ酸(3.0当量)とカップリングし、For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号15)を得た。
実施例15で得たヘキサペプチド14gをTFA(10体積)/(i-Pr)3SiH(TIS)(TIS、1.7体積)/DTT(1.7当量)中に溶解し、1.5時間撹拌することによって(Trt基及びtBu基を)脱保護した。反応完了後、THF/MTBEで沈殿させ、粗生成物を固体として収率97%(9.5g)で得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドFor−Met−Asp−Gly−Cys−Glu−Leu−OH(Foxy-5)を純度97%で得た。
実施例15で得たヘキサペプチド14gをTFA(10体積)/(i-Pr)3SiH(TIS)(TIS、1.7体積)/DTT(1.7当量)中に溶解し、1.5時間撹拌することによって(Trt基及びtBu基を)脱保護した。反応完了後、THF/MTBEで沈殿させ、粗生成物を固体として収率97%(9.5g)で得た。クロマトグラフィーで精製し、所望のヘキサペプチドFor−Met−Asp−Gly−Cys−Glu−Leu−OH(Foxy-5)を純度97%で得た。
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
[1] a)PG 1 −Cys(PG 2 )−Glu(OPG 3 )−Leu−OR 1
b)PG 5 −Met−Asp(OPG 4 )−Gly−OR 2
c)PG 1 −Gly−Cys(PG 2 )−Glu(OPG 3 )−Leu−OR 1
(式中、PG 1 は水素、又はフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)若しくはBocのような保護基であり、PG 2 は水素、又はアセトニド(シュードプロリン、Ψ Me、Me Pro)、トリチル(Trt)から選択される保護基であり、PG 3 は水素又はtert-ブチル(tBu)保護基であり、PG 5 はホルミル又はフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)のような塩基感受性保護基であり、PG 4 は水素又はtert-ブチル(tBu)保護基であり、R 1 及びR 2 は、独立して、水素、又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル(tBu)のようなC 1 〜C 6 アルキルである)
から選択されるFoxy-5(For−Met−Asp−Gly−Cys−Glu−Leu−OH)の保護されたペプチド断片。
[2] PG 1 −Cys(PG 2 )−Glu(OPG 3 )−Leu−OR 1 である、[1]に記載のFoxy-5の保護されたトリペプチド断片。
[3] PG 5 −Met−Asp(OPG 4 )−Gly−OR 2 である、[1]に記載のFoxy-5の保護されたトリペプチド断片。
[4] PG 1 −Gly−Cys(PG 2 )−Glu(OPG 3 )−Leu−OR 1 である、[1]に記載のFoxy-5の保護されたテトラペプチド断片。
[5] Fmoc−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(キートリペプチド-2 * 、KT-2 * )である、[1]又は[2]に記載のFoxy-5の保護されたトリペプチド断片。
[6] Fmoc−Met−Asp(OtBu)−Gly(キートリペプチド-1 * 、KT-1 * )である、[1]又は[3]に記載のFoxy-5の保護されたトリペプチド断片。
[7] Fmoc−Gly−Cys(PG 2 )−Glu(OPG 3 )−Leu−OtBuである、[1]又は[4]に記載のFoxy-5の保護されたテトラペプチド断片。
[8] 固体である、[1]〜[7]のいずれかに記載のFoxy-5の保護されたペプチド断片。
[9] 結晶形態である、[8]に記載のFoxy-5の保護されたペプチド断片。
[10] Foxy-5の保護誘導体であるPG 5 −Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBuを製造する液相法であって、前記方法は、
a.ジペプチドFmoc−Glu−(OtBu)−Leu−OtBu(KD-3c)をFmoc−Gly−Cys(Trt)−OH(KD-2c)とカップリングしてテトラペプチドFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)を得、続いてPG 5 −Met−Asp(OtBu)−OHとカップリングすること、
b.トリペプチドPG 5 −Met−Asp(OtBu)−Gly−OHをFmoc−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(KT-2 * )とカップリングすること、
c.トリペプチドFmoc−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(KT-2 * )をFmoc−Gly−OH、Fmoc−Asp−OtBu及びPG 5 −Metと順次カップリングすること、又は
d.テトラペプチドFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)をFmoc−Asp−OtBu及びPG 5 −Metと順次カップリングすることを含み、
必要に応じて、その後カラムクロマトグラフィーにより粗ヘキサペプチドを精製し、続いて有機溶媒から固体として沈殿させ、ここで、PG 5 はホルミル又はFmocのような塩基感受性保護基である、方法。
[11] PG 5 −Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBuをFoxy-5(For−Met−Asp−Gly−Cys−Glu−Leu−OH)に変換する液相法であって、前記方法は、
PG 5 がホルミルの場合、
i.For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号15)を脱保護して、粗Foxy-5を得ること、
又は、
PG 5 がFmocのような塩基感受性保護基の場合、
ii.ヘキサペプチドPG 6 −Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBuからPG 5 を除去し、続いてギ酸とカップリングして、For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号15)を得、
iii.For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号15)を脱保護して、粗Foxy-5を得ること、
を含み、続いて、
a.必要に応じて、カラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、その後、必要に応じて有機溶媒から固体として沈殿させ、
b.必要に応じて、得られたFoxy-5ヘキサペプチドを結晶形態のような固体のアルカリ性塩又は酸性塩として沈殿させる、方法。
Claims (11)
- a)PG1−Cys(PG2)−Glu(OPG3)−Leu−OR1
b)PG5−Met−Asp(OPG4)−Gly−OR2
c)PG1−Gly−Cys(PG2)−Glu(OPG3)−Leu−OR1
(式中、PG1は水素、又はフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)若しくはBocのような保護基であり、PG2は水素、又はアセトニド(シュードプロリン、ΨMe、MePro)、トリチル(Trt)から選択される保護基であり、PG3は水素又はtert-ブチル(tBu)保護基であり、PG5はホルミル又はフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)のような塩基感受性保護基であり、PG4は水素又はtert-ブチル(tBu)保護基であり、R1及びR2は、独立して、水素、又はメチル、エチル若しくはtert-ブチル(tBu)のようなC1〜C6アルキルである)
から選択されるFoxy-5(For−Met−Asp−Gly−Cys−Glu−Leu−OH)の保護されたペプチド断片。 - PG1−Cys(PG2)−Glu(OPG3)−Leu−OR1である、請求項1に記載のFoxy-5の保護されたトリペプチド断片。
- PG5−Met−Asp(OPG4)−Gly−OR2である、請求項1に記載のFoxy-5の保護されたトリペプチド断片。
- PG1−Gly−Cys(PG2)−Glu(OPG3)−Leu−OR1である、請求項1に記載のFoxy-5の保護されたテトラペプチド断片。
- Fmoc−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(キートリペプチド-2*、KT-2*)である、請求項1又は2に記載のFoxy-5の保護されたトリペプチド断片。
- Fmoc−Met−Asp(OtBu)−Gly(キートリペプチド-1*、KT-1*)である、請求項1又は3に記載のFoxy-5の保護されたトリペプチド断片。
- Fmoc−Gly−Cys(PG2)−Glu(OPG3)−Leu−OtBuである、請求項1又は4に記載のFoxy-5の保護されたテトラペプチド断片。
- 固体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のFoxy-5の保護されたペプチド断片。
- 結晶形態である、請求項8に記載のFoxy-5の保護されたペプチド断片。
- Foxy-5の保護誘導体であるPG5−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBuを製造する液相法であって、前記方法は、
a.ジペプチドFmoc−Glu−(OtBu)−Leu−OtBu(KD-3c)をFmoc−Gly−Cys(Trt)−OH(KD-2c)とカップリングしてテトラペプチドFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)を得、続いてPG5−Met−Asp(OtBu)−OHとカップリングすること、
b.トリペプチドPG5−Met−Asp(OtBu)−Gly−OHをFmoc−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(KT-2*)とカップリングすること、
c.トリペプチドFmoc−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(KT-2*)をFmoc−Gly−OH、Fmoc−Asp−OtBu及びPG5−Metと順次カップリングすること、又は
d.テトラペプチドFmoc−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号6)をFmoc−Asp−OtBu及びPG5−Metと順次カップリングすることを含み、
必要に応じて、その後カラムクロマトグラフィーにより粗ヘキサペプチドを精製し、続いて有機溶媒から固体として沈殿させ、ここで、PG5はホルミル又はFmocのような塩基感受性保護基である、方法。 - PG5−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBuをFoxy-5(For−Met−Asp−Gly−Cys−Glu−Leu−OH)に変換する液相法であって、前記方法は、
PG5がホルミルの場合、
i.For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号15)を脱保護して、粗Foxy-5を得ること、
又は、
PG5がFmocのような塩基感受性保護基の場合、
ii.ヘキサペプチドPG6−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBuからPG5を除去し、続いてギ酸とカップリングして、For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号15)を得、
iii.For−Met−Asp(OtBu)−Gly−Cys(Trt)−Glu(OtBu)−Leu−OtBu(配列番号15)を脱保護して、粗Foxy-5を得ること、
を含み、続いて、
a.必要に応じて、カラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、その後、必要に応じて有機溶媒から固体として沈殿させ、
b.必要に応じて、得られたFoxy-5ヘキサペプチドを結晶形態のような固体のアルカリ性塩又は酸性塩として沈殿させる、方法。
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