CN112638934A - 用于wnt六肽的溶液相路径 - Google Patents
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Abstract
本公开总体上涉及多肽合成领域，并且更具体地，涉及Wnt六肽Foxy‑5及其受保护的衍生物和肽片段的溶液相合成。
Description
技术领域
本公开总体上涉及多肽合成领域，更具体地，涉及Wnt六肽Foxy-5的溶液相合成。本公开进一步涉及新颖三肽、四肽和五肽的溶液相合成。
背景技术
Foxy-5是一种甲酰化的、Wnt5a衍生的六肽和Wnt-5a模拟物，具有潜在的抗转移活性，目前正在作为候选药物研发以预防几种常见形式的癌症中的肿瘤扩散。
Foxy-5具有氨基酸序列For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_ID NO 1，图1)。静脉内施用后，Foxy-5结合并激活wnt-5a受体Frizzled-2和-5，Frizzled-2和-5激活wnt-5a介导的信号传导。增加的wnt-5a信号传导可能抑制内皮肿瘤细胞迁移和侵袭。
Foxy-5旨在补偿结肠癌患者中注意到的肿瘤组织中蛋白质Wnt-5a的缺乏，以降低转移的风险。最近一项对III期结直肠癌患者的回顾性研究的子分析显示，Wnt 5a低表达患者的比例明显高于对II期结直肠癌(CRC)患者的先前研究中所观察到的。CRC III期肿瘤患者与II期患者的不同之处主要在于，在与原发肿瘤相邻的淋巴结中存在肿瘤细胞，因此更具侵袭性且进展更快。在III期患者的近70％中观察到低水平的Wnt-5a，相比之下，肿瘤次晚期患者情况下的比例为约45％。这支持了Wnt-5a水平显著影响疾病进程的假设。
基于旨在记录候选药物的安全性概况的已完成的针对Foxy-5的1b期研究，针对2期的药代动力学和剂量确定，Foxy-5现在用于2期临床试验研究，其中结肠癌患者的治疗将在诊断时在进行手术之前开始。该治疗旨在持续最多12周，或直到开始化疗。
Foxy-5及其制备方法描述于国际专利号WO 06130082 A1。迄今为止，用于临床前和临床研究的活性药物成分(API)是通过经典固相肽合成(SPPS)生产的，其中Foxy-5是通过线性1+1+1+1+1+1路径生产的，见图2。
因此，使用Fmoc策略(Fmoc＝芴基甲基氧基羰基)将序列For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH组装在带有C末端氨基酸Leu的2-氯三苯甲基树脂上。合成在SPPS反应器中进行并且由以下组成：交替偶联、乙酰化和N-α-脱保护程序。偶联在作为溶剂的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)或DMF/DCM(二氯甲烷)中进行。如果需要的话，它由以下组成：在激活剂和碱的存在下，将N-α-保护的氨基酸衍生物与前面的氨基酸偶联。甲酸在没有激活剂的情况下作为活性酯偶联。
如果偶联不完全，则可以继续进行或重复该程序。为了避免形成作为副产物的缺失序列的形成，在偶联步骤之后进行系统性乙酰化步骤(加帽)，或者，如果在再偶联步骤之后进行再偶联，则使用DMF、乙酸酐和吡啶。
乙酰化之后是N-α-脱保护程序，该程序由以下组成：用DMF洗涤树脂，用在DMF中的哌啶裂解Fmoc-基团，并且随后用DMF洗涤。在不完全裂解的情况下，可以重复如上所述的N-α-脱保护程序。对于每个单个步骤，添加溶剂和/或试剂，并且搅拌反应混合物，然后过滤以将溶剂和/或试剂从树脂除去。
重复偶联、乙酰化和N-α-脱保护步骤，直到树脂带有完整的肽序列For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH。在甲酸活性酯的最终偶联之后，不进行乙酰化。通过用DMF和IPA洗涤肽树脂并随后在减压下干燥来完成SPPS。
通过在合适的清除剂(例如水和EDT)存在下用TFA处理肽树脂来完成从树脂上裂解肽和伴随的侧链保护基团裂解。随后，通过二维制备型HPLC在反相柱上使用ACN梯度洗脱(甲酸和乙酸系统)纯化获得的粗制肽。
将具有足够纯度的合并的级分冻干。在不符合设定的纯度标准的情况下，则将冻干物通过HPLC分析，并任选地通过如上概述的二维制备型HPLC再纯化。
上面概述的SPPS方法已经为临床前和早期临床研究提供了足够的材料，但是对于进一步的临床研究和最终的商业目的，需要一种更适合大规模合成的合成方法，这样可以降低商品成本并可以提供更大批量的Foxy-5。
因此，需要一种可靠的合成路径，其可以提供数千克规模的Foxy-5，用于进一步的临床试验供应和最终的商业目的。
附图说明
图1显示了Foxy-5的化学结构。Foxy-5是一种线性肽，其由具有甲酰化N末端的六个氨基酸组成。所有光学活性氨基酸残基均为L-构型。Foxy-5的分子式为C26H42N6O12S2，并且分子量为694.8g/mol(平均质量)。
图2显示了通往Foxy-5的SPPS路径的合成方案。
图3显示了关键三肽1(KT-1)的化学结构，即For-Met-Asp(OtBu)-Gly(上图)和关键三肽1*(KT-1*)，即Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly，所有光学活性氨基酸残基均处于L-构型。KT-1的分子式为C16H27N3O7S，并且分子量为405g/mol(平均质量)。
图4显示了关键三肽2(KT-2)，Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe(上图)和关键三肽2*(KT-2*)，Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-O-tert-Bu(下图)的结构。
图5说明了基于酸不稳定的保护基团策略形成Foxy-5的2+2+2策略。
图6说明了基于氢解保护基团策略形成Foxy-5的2+2+2策略。
图6a说明了基于碱不稳定的保护基团策略形成Foxy-5的2+2+2策略。
图7说明了基于以下形成Foxy-5的3+3策略：将关键三肽1(KT-1)与关键三肽2(KT-2)偶联，然后进行1)皂化亮氨酸甲酯和2)对叔丁基和三苯甲基保护基团脱保护。
图7a说明了基于以下形成Foxy-5的3+3策略：将关键三肽1*(KT-1*)与键三肽2*(KT-2*)偶联，然后用DBU进行Fmoc脱保护，与甲酸偶联，并且对叔丁基和三苯甲基保护基团进行脱保护，得到所期望的Foxy-5。
图8说明了基于关键三肽2(KT-2)与氨基酸Gly、Asp和甲酰-Met的顺序延伸而形成Foxy-5的3+1+1+1策略。
图8a说明了基于关键三肽2*(KT-2*)与氨基酸Fmoc-Gly、Fmoc-Asp-OtBu和Fmoc-Met的顺序延伸，形成Foxy-5的3+1+1+1策略。将所得六肽用DBU进行Fmoc脱保护，与甲酸偶联，并且对叔-丁基和三苯甲基保护基团进行脱保护，得到所期望的Foxy-5。
缩写词
Fmoc＝芴基甲氧基羰基
Boc＝叔丁基氧基羰基
For＝甲酰基
Trt＝三苯甲基(Trityl)
Cbz＝羧基苄基
DCHA＝二环己胺
tBu＝叔-丁基
THF＝四氢呋喃
DMF＝N,N-二甲基甲酰胺
TEA＝三乙胺
Bn＝苄基
TFA＝三氟乙酸
TIS＝三异丙基硅烷
HOBt＝1-羟基苯并三唑
HOSu＝N-羟基琥珀酰亚胺
DCM＝二氯甲烷
HOAt＝1-羟基-7-氮杂苯并三唑
EDAC,HCl＝1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，HCl
DIPEA＝二异丙胺
DIPE＝二异丙醚
DBU＝1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯
氨基酸缩写：
Met＝甲硫氨酸
Asp＝天冬酰胺
Gly＝甘氨酸
Cys＝半胱氨酸
Glu＝谷氨酸
Leu＝亮氨酸
Foxy-5＝For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu
发明内容
本公开提供了几种溶液相方法，用于制备被称为“Foxy-5”的甲酰化六肽(即For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH)，以及其各种三、四、五-及六肽片段，包括其受保护的衍生物。本文提供的方法具有优于传统固相合成的多个优点，包括但不限于低的原料成本，易于纯化工艺中间体，易于片段组装，高的手性纯度以及对商业规模化的适应性，等等，这将在下面更详细地描述。
因此，本发明的主要目的是为Foxy-5提供可扩展的合成路径。另一个目的是为所述可扩展的合成路径鉴定和表征合适的关键中间体，以用于药物物质的随后GMP(良好生产规范)生产。
考虑到通常与固相化学相关的商品成本和繁琐的可扩展性，重点一直放在开发溶液相化学路径上。因此，本公开提供了使用片段偶联策略制备Foxy-5或其中间体和前体的溶液相方法。
测试了三种不同的方法：
·A2+2+2偶联策略，其中三个二肽偶联形成最终的六肽，
·A3+3偶联策略，其中两个三肽偶联，
·A4+1+1偶联策略，其中四肽被顺序延伸，以及
·A3+1+1+1偶联策略，其中三肽被顺序延伸。
在2+2+2方法中，Foxy-5的主链通过偶联三个独立的关键二肽片段KD-1、KD-2和KD-3组装而成。设计了三种不同的方法，a、b和c，参见图5、图6和图6a。这三个二肽的溶液相片段合成之后，以会聚的方式形成六肽。2+2+2方法中的保护基团策略基于N末端保护基团(Cbz)的氢解或片段N末端保护基团(Fmoc)的碱催化脱保护，并涉及使用侧链上的酸不稳定的保护基团。另外，所有中间体都可以通过溶液相化学法获得。对于所有三个2+2+2方法，在所有三个二肽片段均已偶联后，在合成的最后阶段引入Met N-甲酰基基团。
在3+3方法中，Foxy-5的主链通过两个三肽片段的溶液相片段偶联而组装。在3+3方法的一个版本中，使用关键三肽KT-1和KT-2(图7)，在早期(即，在三肽片段KT-1的合成中)就引入了甲酰基。在3+3方法的第二个版本中，在通过两个不同的三肽片段KT-1*和KT-2*偶联建立六肽主链后，首先引入甲酰基基团(图7a)。
本发明的第一方面提供了新颖的三肽Met-Asp-Gly及其受保护的衍生物For-Met-Asp(OtBu)-Gly(关键三肽-1，KT-1)和Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly(关键三肽-1*，KT-1*)。
本发明的第二方面提供了新颖的三肽Cys-Glu-Leu及其受保护的衍生物Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-O-Me(关键三肽-2，KT-2)和Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(关键三肽2*，KT-2*)。
在本发明的第三方面，提供了一种基于新颖三肽衍生物KT-1和KT-2的偶联，可替代地基于新颖三肽衍生物KT-1*和KT-2*的偶联来产生受保护形式的六肽Foxy-5的方法，该偶联之后(取决于实际路径)可以是整体脱保护或N-脱保护，然后进行N-甲酰化和最终的侧链脱保护，得到所期望的六肽Foxy-5。
在3+1+1+1方法中，Foxy-5的主链通过以下形成：三肽片段KT-2或KT-2*与受保护的氨基酸Gly、Asp和Met的顺序溶液相偶联，形成受保护形式的Foxy-5或六肽Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH。根据实际路径，整体脱保护或N-脱保护，然后进行N-甲酰化和最终的侧链脱保护，得到所期望的六肽Foxy-5。
在本发明的第四方面，提供了一种基于新颖三肽衍生物KT-2或KT-2*与氨基酸Gly、Asp和Met的受保护的衍生物的顺序偶联来产生受保护形式的六肽Foxy-5的方法，该顺序偶联之后(取决于特定的起始三肽)可以是整体脱保护或N-脱保护，然后进行N-甲酰化和最终的侧链脱保护，得到所期望的六肽Foxy-5。
具体实施方式
如上文概述中所述，设计了用于组装Foxy-5六肽序列的四种不同的溶液相方法，即2+2+2路径(三个版本)、3+3路径(两个版本)、4+1+1路径和3+1+1+1路径(2个版本)。以下将详细讨论这些策略。
2+2+2偶联策略
2+2+2路径A(图5)
第一关键二肽KD-1a(Boc-Met-Asp(OtBu)-OH)的合成从可商购的Boc-Met-OH和HAsp(OtBu)-OMe的偶联开始。然后将所得的二肽Boc-Met-Asp(OtBu)-OMe在C末端选择性脱保护。
第二关键二肽KD-2a(Cbz-Gly-Cys(ψMe,MePro)-OH)通过以下来制备：由H-Cys-OH和丙酮形成半胱氨酸丙酮化合物H-Cys(ψMe,MePro)-OH，然后与琥珀酰亚胺酯Cbz-Gly-OSu偶联。
第三二肽KD-3a(H-Glu(OtBu)-Leu-OtBu)的合成涉及可商购的起始材料Cbz-Glu(OtBu)-OH和H-Leu-OtBu的偶联。随后通过在Pd/C上氢化的Cbz-脱保护产生中间体二肽H-Glu(OtBu)-Leu-OtBu。
最后通过路线A从三个关键的二肽KD-1a、KD-2a和KD-3a由以下起始合成Foxy-5：偶联二肽KD-2a Cbz-Gly-Cys(ψMe,MePro)-OH和KD-3a H-Glu(OtBu)-Leu-OtBu，脱保护后给出四肽Gly-Cys(ψMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 5)。然后在存在标准偶联试剂的情况下，将二肽KD-1a，Boc-Met-Asp(OtBu)-OH与四肽Gly-Cys(ψMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu偶联。通过用强酸处理所得的受保护的六肽来进行整体脱保护。随后的甲酰化反应得到以粗品形式的目标化合物Foxy-5。
2+2+2路径B(图6)
第一关键二肽KD-1b(Cbz-Met-Asp(OBn)-OSu)的合成涉及由相应的甲硫氨酸衍生物形成琥珀酰亚胺酯Cbz-Met-OSu。在碱性条件下，将活化的酯与可商购的H-Asp(OBn)-OH偶联，得到Cbz-Met-Asp(OBn)-OH二肽，然后再将其用HOSu活化，得到第一二肽KD-1，Cbz-Met-Asp(OBn)-OSu。
对于第二关键二肽，KD-2b(H-Gly-Cys(Bn)-OH)半胱氨酸最初在侧链上受苄基保护，得到H-Cys(Bn)-OH。然后将可商购的琥珀酰亚胺活化的甘氨酸结构单元Boc-Gly-OSu与受苄基保护的半胱氨酸结构单元偶联，以在Boc脱保护之后得到所期望的二肽KD-2b，H-Gly-Cys(Bn)-OH。
第三关键二肽KD-3b(H-Glu(OBn)-Leu-OBn)是通过将活化的酯Boc-Glu(OBn)-OSu与可商购的H-Leu-OBn偶联而形成。
最后通过路线B从三个二肽片段KD-1b、KD-2b和KD-3b由以下起始合成Foxy-5：受保护的关键二肽KD-1b(Cbz-Met-Asp(OBn)-Osu)和KD-2b(H-Gly-Cys(Bn)-OH)偶联生成受保护的四肽Cbz-Met-Asp(OBn)-Gly-Cys(Bn)-OH(SEQ_ID NO 12)，其顺序地与KD-3b(H-Glu(OBn)-Leu-OBn)偶联以生成Cbz-Met-Asp(OBn)-Gly-Cys(Bn)-Glu(OBn)-Leu-OBn(SEQ_IDNO 13)。然后，该受保护的六肽通过在Pd/C上氢化而整体脱保护，得到六肽Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_ID NO 14)，其在最后的化学步骤中被甲酰化以得到所期望的粗品形式的六肽Foxy-5。
注意，四肽Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_ID NO 8)和Met-Asp-Gly-Cys-OH(SEQ_IDNO 11)及其两个受保护的衍生物Gly-Cys(ψMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 5)和Cbz-Met-Asp(OBn)-Gly-Cys(Bn)-OH(SEQ_ID NO12)是新颖的化合物。同样，受保护的六肽Cbz-Met-Asp(OBn)-Gly-Cys(Bn)-Glu(OBn)-Leu-OBn(SEQ_ID NO 13)是新颖的化合物。
2+2+2路径C(图6a)
通过将可商购的Fmoc-Met-OH和H-Asp(OtBu)-OH与二环己基碳二亚胺(DCC)偶联来进行第一关键二肽KD-1c，Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH的合成。
由于受保护的二肽是可商购的，因此避免了第二关键二肽KD-2c，Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH的合成。
第三关键二肽KD-3c，Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu的合成通过以下进行：在存在EDAC,HCl、HOBt和DIPEA的情况下，在高稀释度的DCM中的将可商购的叔丁基亮氨酸酯HCl与Fmoc-Glu-(OtBu)偶联。
最后通过路线C从三个二肽片段KD-1c、KD-2c和KD-3c由以下起始合成Foxy-5：受保护的关键二肽KD-3c，Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu与KD-2c，Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH偶联得到四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)，其随后与KD-1c，Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH偶联，得到受保护的六肽Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 4)，随后将其在DCM中用DBU进行Fmoc脱保护，然后在EDC.HCl、HOBt.H2O和DIPEA存在下与甲酸偶联，得到For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 15)。
通过在TFA/(i-Pr)3SiH/DTT的混合物中溶解和搅拌，将该受保护的六肽(SEQ_IDNO 15)整体脱保护(Trt和tBu基团)。反应完成后，通过用THF/MTBE沉淀，以97％的产率(9.5克)得到作为固体的粗产物。色谱纯化得到纯度为97.6％的所期望的六肽For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(Foxy-5)。
3+3偶联策略(图7和7a)
通过甘氨酸向甘氨酸甲酯的转化来引发片段KT-1(For-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH)的合成。于此与可商购的Fmoc-Asp-(O-tBu)偶联得到Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OMe。Fmoc脱保护，然后与可商购的For-Met-OH偶联，得到For-Met-Asp(OtBu)-Gly-OMe。后者在甲酯水解后提供所期望的片段KT-1。
为了允许在以后引入任选的甲酰基基团(或另一个酰基基团)，还产生了片段KT-1的经修饰版本KT-1*(Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH)，其中首先将二肽Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OMe脱保护Fmoc，然后与可商购的Fmoc-Met-OH偶联。
片段KT-2的合成(Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe)是通过将L-亮氨酸转化为其甲酯而引发的。于此用可商购的Fmoc-Glu-(OtBu)形成酰胺键，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-OMe。脱保护并与可商购的Fmoc-Cys(Trt)-OH进一步偶联提供所期望的片段KT-2。
替代片段KT-2*(Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu)的合成是通过将叔丁基亮氨酸酯HCl与Fmoc-Glu-(OtBu)偶联以产生Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu(即KD-3c)来实现。不分离二肽，而是直接将其(在用DBU进行Fmoc脱保护后)与Fmoc-Cys(Trt)-OH偶联以产生所期望的片段KT-2*。
由三肽片段KT-1和KT-2合成Foxy-5的实现从KT-2的Fmoc脱保护开始。随后与KT-1偶联可得到For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe。于此在碱性条件下的皂化得到For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OH，后者在叔-丁基和三苯甲基保护基团脱保护后得到所期望的粗品形式的六肽Foxy-5。
可替代地(图7a)，由三肽片段KT-1*和KT-2*合成Foxy-5的实现从KT-2*的Fmoc-脱保护开始。随后与KT-1*偶联可得到Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 4)，随后将其用DBU进行Fmoc脱保护，然后与甲酸偶联以产生For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH。将该受保护的六肽整体脱保护(Trt和tBu基团)，以提供粗品形式的Foxy-5。色谱纯化得到纯度为97.6％的所期望的六肽For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(Foxy-5)。
4+1+1偶联策略
通过四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)与Fmoc-Asp-OtBu和Fmoc-Met的顺序偶联来启动通过4+1+1偶联策略进行的Foxy-5合成，然后是去除Fmoc、甲酰化和脱保护。通过偶联上文所述的二肽片段KD-3c Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu和KD-2c Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH来提供四肽本身。
随后将四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)与Fmoc-Asp-OtBu偶联以提供受保护的五肽Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 10)，随后是与Fmoc-甲硫氨酸偶联以提供受保护的六肽Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 4)。随后将其用DBU进行Fmoc脱保护，然后与甲酸偶联以产生For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO15)。将该受保护的六肽整体脱保护(Trt和tBu基团)，以提供粗品形式的Foxy-5。色谱纯化得到纯度为97.6％的所期望的六肽For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(Foxy-5)。
3+1+1+1偶联策略(图8和8a)
通过以下起始由3+1+1+1偶联策略合成Foxy-5：将片段KT-2(Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe)与Fmoc-Gly-OH顺序偶联，得到受保护的四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe(SEQ_ID NO 7)，随后与Fmoc-Asp-OtBu偶联，得到受保护的五肽Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe(SEQ_ID NO 9)，随后与甲酰基甲硫氨酸偶联，得到受保护形式的Foxy-5，即For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe(SEQ_IDNO 3)。
Foxy-5本身的合成最终通过与上述3+3偶联策略相同的策略实现，即通过将亮氨酸甲酯皂化以提供For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OH(SEQ_ID NO 4)，并最终从中除去三苯甲基和叔-丁基保护基团，得到粗品形式的Foxy-5。
可替代地，通过以下起始由3+1+1+1偶联策略合成Foxy-5：将片段KT-2*(Fmoc-Cys (Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu)与Fmoc-Gly-OH顺序偶联，得到受保护的四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)，随后与Fmoc-Asp-OtBu偶联，得到受保护的五肽Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 10)，随后与Fmoc-甲硫氨酸偶联，得到受保护的六肽Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 4)。随后将其用DBU进行Fmoc脱保护，然后与甲酸偶联以产生For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 15)。将该受保护的六肽整体脱保护(Trt和tBu基团)，以提供粗品形式的Foxy-5。色谱纯化得到纯度为97.6％的所期望的六肽For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(Foxy-5)。
注意，三肽For-Met-Asp-Gly-OH和本文所述的受保护的衍生物，For-Met-Asp(OtBu)-Gly-OMe和For-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH是新颖的化合物。同样，三肽Met-Asp-Gly和本文所述的受保护的衍生物Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OMe、Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OtBu和Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH(KT-1*)是新颖的化合物。同样，三肽Cys-Glu-Leu-OH和本文所述的受保护的衍生物，Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe、(Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu)和Cys-Glu-Leu-OMe是新颖的化合物。
还应注意，四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe(SEQ_ID NO 7)和Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)，受保护的五肽Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe(SEQ_ID NO 9)和Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 10)，和受保护的Foxy-5衍生物For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe(SEQ_ID NO 3)和For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO15)都是新颖化合物。
在本发明的另一方面，因此提供了选自以下的Foxy-5的受保护三肽片段(For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH)：
a)PG1-Cys(PG2)Glu(OPG3)-Leu-OR1
b)PG5-Met-Asp(OPG4)-Gly-OR2
c)PG1-Gly-Cys(PG2)Glu(OPG3)-Leu-OR1
其中PG1选自H和保护基团，例如芴基甲基氧基羰基(Fmoc)或Boc，PG2选自H和保护基团，这些保护基团选自丙酮化合物(假脯氨酸，ψMe,MePro)、三苯甲基(Trt)；PG3选自H和保护基团，这些保护基团选自叔丁基(tBu)；PG5是甲酰基或碱敏感性保护基团，例如芴基甲基氧基羰基(Fmoc)；PG4选自H和保护基团，这些保护基团选自叔丁基(tBu)；并且R1和R2独立地选自H和C1-C6烷基，例如甲基、乙基或叔丁基(tBu)。
在优选的实施方案中，提供了Foxy-5的受保护的三肽片段，其是PG1-Cys(PG2)Glu(OPG3)-Leu-OR1，其中PG1、PG2、PG3和R1如上文所定义。在特别优选的实施方案中，所述三肽片段是Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe。
在另一个优选的实施方案中，提供了Foxy-5的受保护的三肽片段，其是PG5-Met-Asp(OPG4)-Gly-OR2，其中PG5、PG4和R2如上文所定义。在特别优选的实施方案中，所述三肽片段是Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OtBu。
在本发明的另一方面，提供了一种溶液相方法，用于制备Foxy-5的受保护的衍生物，PG5-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu，该方法包括：
a.将二肽Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu(KD-3c)与Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH(KD-2c)偶联，得到四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)，随后与PG5-Met-Asp(OtBu)-OH偶联，或
b.将三肽PG5-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH与Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(KT-2*)偶联，或
c.将三肽Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(KT-2*)与Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp-OtBu和PG5-Met顺序偶联，或
d.将四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)与Fmoc-Asp-OtBu和PG5-Met顺序偶联，
任选地，随后通过柱色谱法纯化粗六肽，然后从有机溶剂中以固体形式沉淀，并且其中PG5为甲酰基或碱敏感性保护基团，例如Fmoc。
在另一方面，本发明提供了一种溶液相方法，用于将PG5-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu转化为Foxy-5(For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH)，该方法包括：
对于PG5＝甲酰基：
i.脱保护For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_NO 15)，得到粗品形式的Foxy-5，
或对于PG5＝碱敏感性保护基团，例如Fmoc：
ii.从六肽PG6-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu中除去PG5，然后与甲酸偶联生成For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_NO 15)，
iii.脱保护For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_NO15)，得到粗品形式的Foxy-5，
然后是：
a.任选地，通过柱色谱法纯化粗产物，任选地，然后从有机溶剂中以固体沉淀，
b.任选地，沉淀形成的呈固体形式，例如呈晶体形式的呈碱性或酸性盐的Foxy-5六肽。
在优选的实施方案中，PG5是Fmoc。
实验
2+2+2路径
实施例1-关键二肽KD-1aBoc-Met-Asp(OtBu)-OH的制备
目标二肽的甲酯Boc-Met-Asp(OtBu)-OMe的合成如下：将Boc-Met-OH(2.6g，10.4mmol，1.0当量)溶于DMF(干)(25ml)中，并且添加DCC(2.2g，10.4mmol，1.0当量)和HOAt(1.4g，10.4mmol，1.0当量)。在干燥的100ml圆底烧瓶中，将H-Asp(OtBu)-OMe·HCl(2.5g，10.4mmol，1.0当量)与DIPEA(1.8ml，10.4mmol，1.0当量)在DMF(干)(50ml)中组合。两种溶液均冷却至0℃。10min后，将含有天冬氨酸衍生物的溶液逐滴转移至甲硫氨酸溶液中。使反应经72h升温至室温。酸水溶液(0.5M柠檬酸)和碱溶液(饱和NaHCO3)处理后，通过LCMS分析获得的物质。尽管观察到一些溶剂信号(EtOAc)和杂质，但这些信号与化合物Boc-Met-Asp(OtBu)-OMe的结构一致。
在随后的步骤中，将中间体甲酯Boc-Met-Asp(OtBu)-OMe(3.5g，8.1mmol，1.0当量)溶于1,4-二噁烷/MeOH(14:1)(75ml)中，并且然后添加新鲜制备的3.6M NaOH(水性)溶液(2.3ml，8.5mmol，1.0当量)。将反应在室温下搅拌18h，并取样反应混合物。LCMS分析表明起始材料被完全消耗。在2.031分钟(70面积％)处的主要信号显示目标分子Boc-Met-Asp(OtBu)-OH的质量(M＝420g/mol，发现：m/z+＝421[M+H]+，443[M+Na]+)。观察到副产物，其可以鉴定为Boc-Met-Asp-OH；并且因此，建议皂化反应的反应时间较短(<18h)。获得目标化合物，关键二肽KD-1a(Boc-Met-Asp(OtBu)-OH)，产率为63％，纯度为70面积％(LCMS)。
实施例2-关键二肽KD-2aCbz-Gly-Cys(ψMe,MePro)-OH的制备
向250ml圆底烧瓶中添加L-半胱氨酸盐酸盐一水合物(5.0g，28.5mmol)和丙酮(80ml，1088mmol)(p.a.质量)。然后将反应(0.36摩尔)加热至回流1.5h。30分钟后，白色悬浮液变成稠浆。过滤并随后除去过量的丙酮，得到4.7g白色无定形固体。1H NMR分析表明，大约有50％的未反应半胱氨酸保留。为了提高脯氨酸丙酮化合物的产率和质量，将白色无定形固体(4.72g)在更稀的反应混合物(0.14M)中用丙酮(200ml)第二次处理。将悬浮液回流2h。然后将悬浮液缓慢冷却至室温，然后在0℃下冷却30分钟。将冰冷的悬浮液通过p3玻璃过滤器过滤，并用丙酮(2x10ml)冲洗。真空除去残留的丙酮。以优异产率和纯度获得了呈白色粉末状的所期望的丙酮化合物H-Cys(ψMe,MePro)-OH(4.4g，27mmol，95％产率)。产物的1H NMR(DMSO)光谱与目标分子结构一致，并且未显示起始原料H-Cys-OH的信号。
在随后的步骤中，将丙酮化合物中间体H-Cys(ψMe,MePro)-OH(1.0g，6.2mmol，1.0当量)溶于DMF(50ml)中并且添加三乙胺(2.6ml，19mmol，3.0当量)。在室温下搅拌10分钟后，添加可商购的Cbz-Gly-OSu(2.4g，6.2mmol，1.0当量)，并将反应混合物搅拌18h，在此期间混合物保持悬浮液。
添加在1,4-二噁烷中的4M盐酸(10.11ml，10.11mmol)酸化反应混合物至pH＝4。此时，固体沉淀；通过过滤收集固体。残余物主要由Et3N·HCl盐组成。将250ml水添加至滤液中，并用EtOAc(3x50ml)萃取。然后将合并的有机相用盐水(2x50ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到灰白色固体(1.58g)。合并的有机相的LCMS分析显示在2.003分钟(77面积％)处的主要信号代表二肽Cbz-Gly-Cys(ψMe,MePro)-OH(M＝352g/mol，发现：m/z-＝351[M-H]-，703[2M-H]-)。在1.779分钟(9面积％)处，观察到Cbz-Gly-OH(在1.887分钟处未观察到琥珀酰亚胺酯Cbz-Gly-OSu，表明起始材料水解)。
然后将水相进一步酸化至pH＝1，并再次用EtOAc(3x50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(3x50ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到淡黄色油状物(2.60g)。LCMS分析显示目标分子在2.006min(66面积％)处。在1.778分钟(20面积％)处观察到主要副产物信号，并归因于Cbz-Gly-OH。未经进一步纯化，二肽Cbz-Gly-Cys(ψMe,MePro)-OH的合并产率为4.2g(83％，基于70％LCMS纯度)。主要杂质被鉴定为Cbz-Gly-OH。
实施例2a-替代性二肽KD-1cFmoc-Met-Asp(OtBu)-OH的制备
Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH Fmoc-Met-OSu根据WO 1990008773 A1，原位通过Fmoc-Met-OH(14.87g)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu，5.52g)和二环己基碳二亚胺(DCC，8.26g)在四氢呋喃(THF，200ml)中在0℃下反应3.5小时制备。通过过滤除去沉淀的二环己基脲(DCU)，并将THF滤液添加到H-Asp(OtBu)-OH在220ml 10:1水/THF中的冷溶液中，向其中添加40mlN氢氧化钠。在室温下将反应混合物搅拌过夜后，将固体柠檬酸(20g)与EtOAc(600ml)一起添加。分离EtOAc层，用10％柠檬酸和盐水洗涤，并干燥(硫酸镁)。蒸发EtOAc溶液，得到残余物，将其溶于200ml EtOAc中，并用二环己胺(DCHA，7.84ml)处理，以沉淀出17.93g所期望产物的DCHA盐，mp 159℃-162℃。
实施例3-关键二肽KD-3aH-Glu(OBn)-Leu-OBn的制备
在250ml圆底烧瓶中，将可商购的Cbz-Glu(OtBu)-OH(5.0g，14.8mmol，1.0当量)的冷却溶液与HOAt(2.4g，17.8mmol，1.2当量)、和DCC(3.7g，17.8mmol，1.2当量)在无水MeCN(25ml)中合并。向该溶液中添加H-Leu-OtBu·HCl(3.3g，14.8mmol，1.0当量)和DIPEA(2.58ml，14.82mmol)在无水MeCN(50ml)中的混合物。将得到的反应混合物(0.2摩尔)在0℃下搅拌，并在18h内逐渐升至室温。然后将反应混合物真空浓缩，得到9.1g(基于70面积％的HPLC纯度，最大83％产率)的粘稠的黄色油状物，其静置数小时后缓慢固化。于此将一部分(5.2g)悬浮在50ml EtOAc中，并添加30ml H2O。将有机相洗涤并蒸发；这得到2.9g白色固体。HPLC分析显示产物在4.105分钟(76面积％)处。1H NMR分析与目标分子一致，获得Cbz-Glu(OtBu)-Leu-OtBu，在没有色谱的情况下其计算产率是52％并且平均纯度是76％(基于HPLC分析)，根据1H NMR分析，其产率是63％，纯度是95％。所述处理无需进一步纯化即可用于随后的反应。
最后，彻底的催化剂筛选后，然后使用Noblyst Pd/C催化剂类型P1141进行Cbz脱保护，以提供目标二肽KD-3a H-Glu(OBn)-Leu-OBn。对于该反应，将Cbz-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(1.5g，3.0mmol，1.0当量)溶于MeOH(20ml)中并且添加Pd(在活性炭上10％，NoblystP1141型)(500mg，470μmol，0.2当量)。将H2鼓泡通入溶液1h。然后将反应在氢气气氛(1个大气压)下搅拌18h。HPLC分析(在18h后获得)显示了起始材料的完全转化，并且主要显示了在3.391分钟处的甲苯信号和在2.843分钟处的目标分子信号。将反应混合物在P3玻璃过滤器中通过硅藻土过滤。将残余物用MeOH(3x1ml)冲洗，并将滤液真空浓缩。根据HPLC分析，获得呈淡黄色油状物的目标化合物HGlu(OtBu)-Leu-OtBu，1.02g(92％产率)和95面积％纯度。将该材料如其获得用于后续反应中。
实施例3a-替代性关键二肽KD-3c Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu的制备
在EDAC,HCl(2.0当量)和HOBt(2.0当量)和DIPEA(5.0当量)的存在下，在二氯甲烷中以高稀释度(50体积)将50克叔丁基亮氨酸酯HCl与1.3当量Fmoc-Glu-(OtBu)偶联，初始在0-5℃下持续1小时，然后在15℃-20℃下持续1小时，得到二肽Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu(KD-3c)。通过1H NMR和质谱确认身份。为了与Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH反应，省略了产物分离，并且在水后处理之后将二氯甲烷溶液直接用于实施例4a中。
实施例4-四肽Gly-Cys(ψMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 5)的制备
随后的反应涉及二肽H-Glu(OtBu)-Leu-OtBu和Cbz-Gly-Cys(ψMe,MePro)-OH在DCC和HOAt存在下的偶联。
偶联反应如下进行：将H-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(898mg，2.4mmol，1.0当量)溶于干DMF(20ml)中，并将溶液冷却至0℃。然后，添加DCC(498mg，2.4mmol，1.0当量)和HOAt(328mg，2.4mmol，1.0当量)。向混合物中添加Cbz-Gly-Cys(ψMe,MePro)-OH(850mg，2.4mmol，1.0当量)，并且搅拌反应混合物，使其逐渐升温至室温持续18h。
将反应混合物在P3玻璃过滤器中通过硅藻土过滤。将残余物用DMF(2x5ml)冲洗。向滤液中添加100ml H2O，在其上形成乳状胶状溶液。添加EtOAc(50ml)。相分离非常缓慢，决定向混合物中添加约20克NaCl，之后混合物略微澄清，并出现清晰的相分离。然后将水相用EtOAc(50ml)萃取两次。采样得到的水相用于LCMS分析并且不包含产物质量。根据标准程序对合并的有机相进行后处理，这得到1.41g的淡黄色油状物，将其与Et2O共同蒸发时会固化成灰白色的大体积固体(1.41g，58％产率，基于70％的纯度)。LCMS分析表明存在约6面积％的DCC，对应于2.034分钟处的信号(M＝224g/mol，发现：m/z+＝225[M+H]+、449[M+Na]+)。在2.297分钟处，观察到未知化合物，m/z+＝452、579(16面积％)。在2.404分钟(76面积％)处观察到目标分子Cbz-Gly-Cys(ΨMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(M＝706g/mol，发现：m/z+＝707[M+H]+，729[M+Na]+)。
然后使用Noblyst P1141催化剂对Cbz-Gly-Cys(ψMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu进行随后的Cbz脱保护，该催化剂先前在二肽Cbz-Glu(OtBu)-Leu-OtBu的脱保护反应中提到。在该特定情况下，选择该催化剂是因为它在筛选实验中显示出良好的反应性，并且起始材料在18小时的反应时间内被完全转化。因此，这些条件也用于四肽Cbz-Gly-Cys(ψMe, MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu的选择性Cbz脱保护。初步测试反应表明，四肽(Cbz-Gly-Cys(ψMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu)的氢化所需的Pd/C比二肽Cbz-Glu(OtBu)-Leu-OtBu所需的更多，以获得令人满意的反应速率。
对于该反应，将Cbz-Gly-Cys(ψMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(700mg，1.0mmol，1.0当量)溶于MeOH(10ml)中并且添加Pd/C(Noblyst P1141，10％(w/w)Pd，60％H2O)(700mg，40μmol，4mol％)。将反应混合物在氢气气氛(1个大气压)下搅拌。反应之后是HPLC分析。
反应5h后，仍观察到起始材料的23面积％。24h后，HPLC分析表明仍剩余12面积％的起始材料。然后，添加另外数量的Pd/C催化剂(200mg)。在72小时的总反应时间后，HPLC分析表明起始材料几乎被完全消耗(剩余0.84面积％)。将反应混合物在P3玻璃过滤器中通过hyflo过滤，并用MeOH(3x5ml)冲洗。将滤液真空浓缩，得到550mg淡黄色油状物。HPLC分析显示在1.929min(81面积％)处的主要信号，该信号显示了目标分子质量(M＝572g/mol，发现：m/z+573[M+H]+)。
以80％的纯度(基于LCMS)获得四肽H-Gly-Cys(ψMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(550mg，0.78mmol，79％产率)。
实施例4a-替代性四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO6)的
制备
使用上述二氯甲烷溶液(实施例3a)，进行得到的二肽KD-3c Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu的后续反应。用DBU进行Fmoc脱保护并与1.3当量Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH(可商购)在DIPEA(3当量)、EDC.HCl(2.0当量)和HOBt(2.0当量)存在下偶联，得到受保护的四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)。DCM层用水和盐水洗涤，浓缩至10-15体积，并在不分离的情况下在下一阶段(实施例5a)中照原样使用。
实施例5-六肽Boc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(ΨMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu
(SEQ_ID NO 2)的制备
在偶联剂DCC和添加剂HOAt存在下在DMF中在室温将Boc-Met-Asp(OtBu)-OH和H-Gly-Cys(ψMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu进行肽偶联18h以给出六肽Boc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(ΨMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu。
对于该反应，将Boc-Met-Asp(OtBu)-OH(200mg，0.48mmol，1.0当量)溶解在DMF(2.0ml)中，并在冰浴中冷却。向澄清溶液中添加HOAt(65mg，0.48mmol，1.0当量)和DCC(98mg，0.48mmol，1.0当量)。15分钟后，添加HCys(ΨMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(272mg，0.48mmol，1.0当量)，并且将反应混合物搅拌18h，同时缓慢升温至室温。然后根据标准程序对反应混合物进行后处理。后处理批次的LCMS分析显示目标分子Boc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(ΨMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu在保留时间为2.760分钟(M＝974g/mol，发现：m/z+＝975[M+H]+，997[M+Na]+)。获得目标分子Boc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(ΨMe,MePro)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu，76％产率(420mg，0.36mmol)，基于84％纯度(LCMS)，呈多白色固体。
实施例5a替代性六肽Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu (SEQ_ID NO 4)的制备并且于此转化为Foxy-5
如上文实施例4a中获得的作为浓缩DCM溶液的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)首先与DBU反应以实现Fmoc脱保护。在进行下一个偶联步骤之前，使反应物质通过二氧化硅塞以除去DBU。二氧化硅塞处理后，在DIPEA(3.0当量)、EDC.HCl(2.0当量)和HOBt.H2O(2.0当量)存在下，使DCM溶液(释放后)与上文实施例2a中作为DCHA盐获得的Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH(KD-1c)反应，得到粗品形式的受保护的Foxy-5衍生物Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 4)。随后将其在DCM中用DBU进行Fmoc脱保护，然后在EDC.HCl、HOBt.H2O和DIPEA存在下与甲酸偶联，得到For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 15)。通过在TFA/(i-Pr)3SiH/DTT的混合物中溶解和搅拌，将该受保护的六肽整体脱保护(Trt和tBu基团)。反应完成后，通过用THF/MTBE沉淀得到作为固体的粗产物。色谱纯化得到所期望的六肽For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(Foxy-5)，产率>90％并且纯度为约97％。
3+3路径
实施例6-片段KT-1和KT-1*(分别为For-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH和Fmoc-Met-Asp
(OtBu)-Gly-OH)的制备
实施例6a-在三肽KT-11*(Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH)的制备中使用Fmoc-甲硫氨酸代替甲酰基-甲硫氨酸的实施例。
使甘氨酸甲酯(25克)在DMF中与Fmoc-Asp(OtBu)-OH在DIPEA(1.0当量)、EDAC,HCl(2.0当量)和HOBt(2.0当量)的存在下反应。在标准后处理之后，使用15％EtOAc/正己烷在硅胶上纯化粗产物。于此将1克本文与Fmoc-Met偶联以得到受保护的三肽Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-OMe(2.0克，72.7％)。通过1H NMR和质谱确认身份。
实施例6b-片段KT-1的制备(For-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH)
根据实施例6a中概述的程序，将甘氨酸甲酯与Fmoc-Asp(OtBu)-OH偶联，得到受保护的二肽Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OMe。于此用DBU实现Fmoc脱保护，并在DIPEA(1.0当量)、EDAC,HCl(2.0当量)和HOBt(2.0当量)的存在下，在DCM中与可商购的For-Met-OH偶联，得到所期望的片段KT-1。
实施例7-片段KT-2(Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe)的制备
将Fmoc亮氨酸(250克)溶解在甲醇中，并通过用亚硫酰氯的处理以定量产率转化为Fmoc亮氨酸甲酯。用DBU在二氯甲烷中的Fmoc脱保护得到所期望的亮氨酸甲酯(76克，总产率74％)。通过1H NMR和质谱确认身份。接下来，将10克亮氨酸甲酯与Fmoc-Glu-(OtBu)在二氯甲烷中以高稀释度在EDAC,HCl(2.0当量)和HOBt(2.0当量)存在下偶联，初始在0-5℃下持续1小时，然后在15℃-20℃下持续1小时，得到二肽Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OMe(7.2小时，总产率55％)。通过1H NMR和质谱确认身份。为了在下一步中与Fmoc半胱氨酸反应，省略了产物分离，并且在水性后处理后直接使用二氯甲烷溶液。因此，使用上述二氯甲烷溶液进行所得二肽Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OMe的后续反应。用DBU进行Fmoc脱保护，并在EDAC,HCl(1.2当量)和HOBt(1.2当量)存在下与Fmoc-Cys(Trt)-OH偶联，得到片段KT-2Fmoc-Cys(Trt)-Glu-(OtBu)-Leu-OMe(6.6克，经两个偶联反应总产率为88％)。通过1H NMR和质谱确认身份。
实施例8-替代性三肽片段Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(KT-2*)的制备。
在EDAC,HCl(2.0当量)和HOBt(2.0当量)和DIPEA(5.0当量)的存在下，在二氯甲烷中以高稀释度(50体积)将50克叔丁基亮氨酸酯HCl与1.3当量Fmoc-Glu-(OtBu)偶联，初始在0-5℃下持续1小时，然后在15℃-20℃下持续1小时，得到二肽Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu(KD-3c)。通过1H NMR和质谱确认身份。为了在下一步中与Fmoc-Cys(Trt)-OH反应，省略了产物分离，并且在水性后处理后直接使用二氯甲烷溶液。因此，使用上述二氯甲烷溶液进行所得二肽KD-3c的后续反应。使用DBU实现Fmoc脱保护，并在EDAC,HCl(1.2当量)、HOBt(1.2当量)和DIPEA(5当量)存在下与1.3当量Fmoc-Cys(Trt)-OH偶联，得到粗品三肽KT-2*，将其通过硅胶(100-200)色谱纯化，使用EtOAc-己烷作为洗脱剂，得到三肽KT-2*Fmoc-Cys (Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu，呈白色固体(148克，经两次偶联反应的总产率为68％)。通过1HNMR和质谱确认身份。
从75克叔丁基亮氨酸酯HCl重复上述伸缩反应，得到208克KT-2*
实施例9a-通过偶联三肽片段KT-1和KT-2，然后脱保护来制备Foxy-5。
由两个三肽片段、KT-1和KT-2合成Foxy-5的实现从KT-2的Fmoc脱保护开始。随后与KT-1偶联可得到For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe。然后在碱性条件下的皂化得到For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OH，后者在O-tBu和三苯甲基保护基团脱保护后得到所期望的粗品形式的六肽Foxy-5。
实施例9b-通过偶联三肽片段KT-1*和KT-2*，然后Fmoc去除、甲酰化和脱保护来制
备Foxy-5。
由两个三肽片段、KT-1*和KT-2*合成Foxy-5的实现从KT-2*的Fmoc脱保护开始。随后与KT-1*偶联，得到Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_IDNO 4)，随后将其在DCM中用DBU进行Fmoc脱保护，然后在EDC.HCl、HOBt.H2O和DIPEA存在下与甲酸偶联，得到For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO15)。通过在TFA/(i-Pr)3SiH/DTT的混合物中溶解和搅拌，将该受保护的六肽整体脱保护(Trt和tBu基团)。反应完成后，通过用THF/MTBE沉淀得到作为固体的粗产物。色谱纯化得到所期望的六肽For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(Foxy-5)，产率>90％并且纯度为约97％。
4+1+1路径
实施例10-通过四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)与Fmoc-Asp-OtBu和Fmoc-Met的顺序偶联然后去除Fmoc、甲酰化和脱保护，来制备Foxy-5。
首先，将上文实施例4a中获得的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)与DBU反应以实现Fmoc脱保护。在进行下一偶联步骤之前，使反应物质通过二氧化硅塞以除去DBU，DBU在先前的实验中已发现可诱导形成不期望的天冬酰胺副产物。在与Fmoc-Asp-OtBu偶联之前去除DBU可有效抑制天冬酰胺形成。硅胶塞处理后，使DCM溶液在DIPEA、EDAC,HCl(1.2当量)和HOBt(1.2当量)存在下与Fmoc-Asp(OtBu)反应，得到受保护的五肽Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 3)。通过1H NMR和质谱法确认产物身份。
用DBU实现获得的五肽Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 3)的Fmoc脱保护，并在DIPEA(3.0当量)、EDC.HCl(2.0当量)和HOBt.H2O(2.0当量)存在下，与Fmoc-Met在作为溶剂的DCM-THF(50体积+10体积)中偶联，得到粗品形式的受保护的六肽Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 4)。
用在DCM(50体积)中的DBU实现了实施例4中获得的六肽Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 4)的Fmoc脱保护，然后在EDC.HCl(4.0当量)、HOBt.H2O(4.0当量)和DIPEA(4.0当量)的存在下与甲酸(3.0当量)偶联，得到For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 15)，其通过在TFA(10体积)/(i-Pr)3SiH(TIS，1.7体积)/DTT(1.7当量)的混合物中溶解和搅拌1.5小时而整体脱保护(Trt和tBu基团)。反应完成后，通过用THF/MTBE沉淀，以97％的产率(9.5克)得到作为固体的粗产物。色谱纯化得到纯度为97.6％的所期望的六肽For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(Foxy-5)。
3+1+1+1路径
实施例11-线性溶液相方法得到Foxy-5的可行性
将上面获得的KT-2(Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OMe)与DBU在DCM中反应，以实现Fmoc脱保护，随后在DIPEA、EDAC,HCl(1.2当量)和HOBt(1.2当量)存在下与Fmoc-Gly-OH反应，得到受保护的四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe(SEQ_ID NO 7)。通过1HNMR和质谱法确认产物身份。粗产物进一步以类似的方式与DBU在DCM中反应，以实现Fmoc脱保护，然后在DIPEA、EDAC,HCl(1.2当量)和HOBt(1.2当量)存在下与Fmoc-Asp(OtBu)反应，得到受保护的五肽Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe(SEQ_ID NO 9)，其在硅胶纯化并在甲醇中浆化后得到，呈白色固体。通过1H NMR和质谱法确认产物身份。用DBU实现对获得的五肽进行Fmoc脱保护并在DIPEA(1.0当量)、EDAC,HCl(2.0当量)和HOBt(2.0当量)存在下与可商购的For-Met-OH在DCM中偶联，得到受保护的Foxy-5衍生物For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe(SEQ_ID NO 3)，其在碱性条件下的皂化后得到For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OH(SEQ_ID NO 4)，后者在O-tBu和三苯甲基保护基团脱保护后得到所期望的粗品形式的六肽Foxy-5。
实施例12-Fmoc-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)
将上述实施例8中获得的KT-2*(Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu)与DBU在DCM(50体积)中反应以实现Fmoc脱保护，然后在DIPEA(3当量)、EDC.HCl(2.0当量)和HOBt(2.0当量)存在下与1.3当量Fmoc-Gly-OH反应，得到受保护的四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO6)。通过TLC观察到良好的转化，并且用水和盐水洗涤DCM层。将最终的有机层浓缩至10-15体积，并照原样用于下一步而不分离。
实施例13-Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 10)
如上文中获得的作为浓缩DCM溶液的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)首先与DBU反应以实现Fmoc脱保护。在进行下一偶联步骤之前，使反应物质通过二氧化硅塞以除去DBU，DBU在先前的实验中已发现可诱导形成不期望的天冬酰胺副产物。在与Fmoc-Asp-OtBu偶联之前去除DBU可有效抑制天冬酰胺形成。硅胶塞处理后，使DCM溶液在DIPEA、EDAC,HCl(1.2当量)和HOBt(1.2当量)存在下与Fmoc-Asp(OtBu)反应，得到受保护的五肽Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 3)。通过1HNMR和质谱法确认产物身份。
从148克和220克起始材料开始，重复两次伸缩反应，分别得到107克和163克产物(理论值的58.1％和59.2％)。
实施例14-Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO
4)
用DBU实现从实施例13获得的五肽Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)Glu(OtBu)- Leu-OtBu(SEQ_ID NO 10)的Fmoc脱保护，并在DIPEA(3.0当量)、EDC.HCl(2.0当量)和HOBt.H2O(2.0当量)存在下，与Fmoc-Met在作为溶剂的DCM-THF(50体积+10体积)中偶联，得到粗品形式的受保护的Foxy-5衍生物Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 4)。通过柱色谱法使用DCM/THF作为洗脱剂进行纯化。将纯化的产物在DIPE中制浆，得到白色固体。
纯化在各种条件下进行几次，例如用抗溶剂沉淀和色谱法。发现最好的解决方案是柱色谱法，然后在DIPE中制浆，以25克的规模给出78％的产率和95.4％的化学纯度。
实施例15-For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu，(SEQ_ID NO15)
用在DCM(50体积)中的DBU实现了实施例14中获得的六肽Fmoc-Met-Asp(OtBu)- Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 4)的Fmoc脱保护，然后在EDC.HCl(4.0当量)、HOBt.H2O(4.0当量)和DIPEA(4.0当量)的存在下与甲酸(3.0当量)偶联，得到For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_NO 15)。
反应分别从4克、18克和18克起始材料进行三次，以提供75％-83％的产率和67.5％-77.2％的化学纯度。
实施例16-For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(Foxy-5)，(SEQ_ID NO 1)
将实施例15获得的14克六肽通过在TFA(10体积)/(i-Pr)3SiH(TIS，1.7体积)/DTT(1.7当量)的混合物中溶解和搅拌1.5小时而整体脱保护(Trt和tBu基团)。反应完成后，通过用THF/MTBE沉淀，以97％的产率(9.5克)得到作为固体的粗产物。色谱纯化得到纯度为97.6％的所期望的六肽For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(Foxy-5)。
Claims (11)
1.一种Foxy-5(For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH)的受保护的肽片段，其选自：
a)PG1-Cys(PG2)Glu(OPG3)-Leu-OR1
b)PG5-Met-Asp(OPG4)-Gly-OR2
c)PG1-Gly-Cys(PG2)Glu(OPG3)-Leu-OR1
其中PG1选自H和保护基团，例如芴基甲基氧基羰基(Fmoc)或Boc；PG2选自H和保护基团，这些保护基团选自丙酮化合物(假脯氨酸，ψMe,MePro)、三苯甲基(Trt)；PG3选自H和保护基团，这些保护基团选自叔丁基(tBu)；PG5是甲酰基或碱敏感性保护基团，例如芴基甲基氧基羰基(Fmoc)；PG4选自H和保护基团，这些保护基团选自叔丁基(tBu)；并且R1和R2独立地选自H和C1-C6烷基，例如甲基、乙基或叔丁基(tBu)。
2.如权利要求1所述的Foxy-5的受保护的三肽片段，其是
PG1-Cys(PG2)Glu(OPG3)-Leu-OR1。
3.如权利要求1所述的Foxy-5的受保护的三肽片段，其是
PG5-Met-Asp(OPG4)-Gly-OR2。
4.如权利要求1所述的Foxy-5的受保护的四肽片段，其是
PG1-Gly-Cys(PG2)Glu(OPG3)-Leu-OR1。
5.如权利要求1或2所述的Foxy-5的受保护的三肽片段，其是
Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(关键三肽-2*，KT-2*)。
6.如权利要求1或3所述的Foxy-5的受保护的三肽片段，其是
Fmoc-Met-Asp(OtBu)-Gly(关键三肽-1*，KT-1*)。
7.如权利要求1或4所述的Foxy-5的受保护的四肽片段，其是
Fmoc-Gly-Cys(PG2)Glu(OPG3)-Leu-OtBu。
8.如权利要求1-7中任一项所述的Foxy-5的受保护的肽片段，其呈固体形式。
9.如权利要求8中任一项所述的Foxy-5的受保护的肽片段，其呈晶体形式。
10.一种溶液相方法，用于制备Foxy-5的受保护的衍生物，PG5-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu，该方法包括：
a.将二肽Fmoc-Glu-(OtBu)-Leu-OtBu(KD-3c)与Fmoc-Gly-Cys(Trt)-OH(KD-2c)偶联，得到四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)，随后与PG5-Met-Asp(OtBu)-OH偶联，或
b.将三肽PG5-Met-Asp(OtBu)-Gly-OH与Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(KT-2*)偶联，或
c.将三肽Fmoc-Cys(Trt)Glu(OtBu)-Leu-OtBu(KT-2*)与Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp-OtBu和PG5-Met顺序偶联，或
d.将四肽Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_ID NO 6)与Fmoc-Asp-OtBu和PG5-Met顺序偶联，
任选地，随后通过柱色谱法纯化粗六肽，然后从有机溶剂中以固体形式沉淀，并且其中PG5为甲酰基或碱敏感性保护基团，例如Fmoc。
11.一种溶液相方法，用于将PG5-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu转化为Foxy-5(For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH)，该方法包括：
对于PG5＝甲酰基：
i.脱保护For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_NO 15)，得到粗品形式的Foxy-5，或对于PG5＝碱敏感性保护基团，例如Fmoc：
ii.从六肽PG6-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu中除去PG5，然后与甲酸偶联生成For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_NO 15)，
iii.脱保护For-Met-Asp(OtBu)-Gly-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OtBu(SEQ_NO 15)，得到粗品形式的Foxy-5，然后是：
a.任选地，通过柱色谱法纯化粗产物，任选地，然后从有机溶剂中以固体沉淀，
b.任选地，沉淀形成的呈固体形式，例如呈晶体形式的呈碱性或酸性盐的Foxy-5六肽。
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