CN112521459B

CN112521459B - 一种stat3抑制多肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112521459B
Application number: CN202011457840.2A
Authority: CN
Inventors: 邹健; 张博; 邵珺; 汪京京; 纪丽; 殷莹
Original assignee: Wuxi Peoples Hospital
Current assignee: Wuxi Peoples Hospital
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2040-12-11
Also published as: AU2021101509A4; CN112521459A

Abstract

本发明提供了一种STAT3抑制多肽及其制备方法和应用，涉及抗肿瘤药物技术领域。本发明所述抑制多肽具有包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，能够与肿瘤细胞中高表达的STAT3相结合，通过阻止STAT3二聚体化，促进肿瘤细胞凋亡，抑制增殖和迁移；同时对正常细胞毒性较小，具有优秀的选择性。本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成上述抑制多肽，极大的提高了多肽合成的效率，缩短了合成周期；而且微波促进固相合成新型STAT3抑制多肽的粗品纯度大于80％，方便工业化生产，因此所述STAT3抑制多肽及其可药用盐可以潜在的用于抗肿瘤的临床治疗中，具有广阔的开发前景。

Description

一种STAT3抑制多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种STAT3抑制多肽及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤作为严重威胁人类健康的常见病和多发病，已经成为全球范围内死亡率仅次于心血管疾病的第二大疾病。化学药物治疗作为一种全身性的肿瘤治疗手段，已经成为肿瘤治疗的主要策略。近年来，随着肿瘤生物学及其相关学科的发展，酪氨酸激酶受体单抗Trastuzumab、多靶点新药Sunitinib以及表皮生长因子受体抑制剂Gifitinib等针对肿瘤信号转导通路中关键因子研发的分子靶向药物成功应用于临床，肿瘤化疗从此进入了崭新的时代。虽然这些早期肿瘤分子靶向药物具有特异性强，毒副作用小等优点，但是其靶点专一性，耐药性等缺点限制了其进一步的临床应用。因此，发现和确证更多的靶点分子，开发安全有效的新型分子靶向药物已成为目前抗肿瘤药物研发的热点。

信号转导与转录激活因子3(Signal transducer and activator oftranscription3，STAT3)是一种参与调控细胞生长、增殖及凋亡等生命活动的关键信号转导蛋白，能够被多种细胞因子激活，广泛存在于不同类型的细胞和组织中，与肿瘤的发生发展密切相关。正常细胞中STAT3的激活迅速而短暂，但是在大多数肿瘤细胞中，过表达的STAT3可以持续激活，活化后的STAT3可以通过其结构中的SH2结构域实现STAT3-STAT3二聚体化，从而上调包括抗凋亡蛋白Bcl-xL、增殖相关蛋白c-Myc、促血管生成因子VEGF以及侵袭转移相关蛋白MMP-2在内的多种靶基因的转录和表达，通过抑制凋亡，诱导细胞增殖、侵袭和转移，诱发炎症和免疫抑制来促进肿瘤组织的发生发展。因此，研究以STAT3信号通路为靶点的肿瘤分子靶向药物具有重要的临床意义和广阔的应用前景。

以STAT3信号通路为靶点的抑制剂研究分为间接抑制和直接抑制两种研发策略，其中间接策略主要以阻断STAT3的上游分子为主，如JAK、Abl、Src、Lyn等，然而由于STAT3间接抑制剂主要作用于酶催化中心，与其他激酶结构类似，容易脱靶，毒副作用较大。因此，研发直接靶向STAT3的抑制剂则更为理想。但是由于STAT3二聚体化是一种蛋白-蛋白相互作用，作用面积较大，用小分子化合物或者短肽阻断其相互作用，具有较大困难，同时相关作用域，正电荷残基聚集，对化合物所携带的负电荷要求较高，不易成药，种种限制使得STAT3抑制剂的研发困难重重，大多数化合物均处于临床前研究阶段。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种STAT3抑制多肽及其制备方法和应用，所述抑制多肽具有优异的STAT3亲和性，能够与肿瘤细胞中高表达的STAT3相结合，阻止STAT3二聚体化，从而达到促进肿瘤细胞凋亡以及抑制增殖和迁移的效果。因此可将所述抑制多肽用于抗肿瘤的临床治疗中，具有广阔的开发前景。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种STAT3抑制多肽，所述抑制多肽具有包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

优选的，在所述抑制多肽的N末端的Pro包括利用酰胺键连接的脂肪酸链，所述脂肪酸链修饰的Pro的分子结构如式I所示：

其中n为1～20的正整数。

优选的，在所述抑制多肽的C末端的Arg结构中羧基中的羟基还可被氨基取代。

本发明还提供了上述抑制多肽的制备方法，包括以下步骤：(1)依次利用DCM和NMP溶胀树脂后，清洗干净得溶胀的树脂；

(2)将所述溶胀的树脂与含0.1M HOBT的哌啶/NMP溶液混合，第一微波反应1min，冷却后滤去溶液，再与含0.1M HOBT的哌啶/NMP溶液混合，第二微波反应4min，冷却后得脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂；所述第一微波的功率为15W；所述第二微波的功率为25W；

(3)将促进液与所述脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂混合，第三微波反应7min，冷却后滤去反应液，洗涤树脂，得Fmoc-Leu-Rink amide-MBHA Resin；所述促进液为包含Fmoc-Arg(Pbf)-OH、HBTU、HOBT和DIPEA的NMP混合溶液；所述NMP混合溶液中，所述Fmoc-Arg(Pbf)-OH的浓度为0.04mmol/L，HBTU的浓度为0.04mmol/L，HOBT的浓度为0.04mmol/L和DIPEA的浓度为0.08mmol/L；

(4)按照所述抑制多肽的肽链顺序，依此从C-端到N-端重复步骤(2)和步骤(3)以连接上相应的氨基酸，得到多肽-树脂复合物；

(5)将所述多肽-树脂复合物与裂解剂Reagent K混合后，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h，抽滤后将滤液与冰乙醚混合，收集沉淀得所述抑制多肽的粗品；所述裂解剂Reagent K为包含TFA、苯甲硫醚、水、苯酚和EDT的混合溶液，且所述TFA、苯甲硫醚、水、苯酚和EDT的体积比为82.5:5:5:5:2.5。

优选的，步骤(1)所述树脂包括Fmoc-Wang amide-MBHAResin；利用DCM溶胀所述树脂时，所述树脂与所述DCM的质量体积比为50mg：7mL；抽滤出DCM后，再利用NMP进行溶胀，所述树脂与所述NMP的质量体积比为50mg：10mL。

优选的，步骤(2)所述第一微波和第二微波以及步骤(3)所述第三微波时的温度均低于50℃。

优选的，在步骤(3)合成Fmoc-Leu-Rink amide-MBHA Resin后，还包括检测偶合效率，选择显色反应为阴性的Fmoc-Leu-Rink amide-MBHAResin进入下一个偶合循环。

优选的，在步骤(5)得到所述抑制多肽的粗品后，还包括液相色谱纯化，色谱条件包括：C18反相柱；流动相A：体积百分浓度为0.1％的TFA/水，流动相B：体积百分浓度为0.1％的TFA/乙腈；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为6mL/min检测波长为214nm。

本发明还提供了上述抑制多肽或利用上述制备方法制备得到的抑制多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤的药物，所述药物的有效成分包括上述抑制多肽或利用上述制备方法制备得到的抑制多肽或所述抑制多肽的盐。

本发明提供了一种STAT3抑制多肽，具有包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，能够与肿瘤细胞中高表达的STAT3相结合，通过阻止STAT3二聚体化，促进肿瘤细胞凋亡，抑制增殖和迁移；同时对正常细胞毒性较小，具有优秀的选择性。因此所述STAT3抑制多肽及其可药用盐可以潜在的用于抗肿瘤的临床治疗中，具有广阔的开发前景。STAT3的二聚体化是一种蛋白-蛋白相互作用，作用面积较大，本发明所述抑制多肽为长肽类STAT3抑制剂，能够在一定程度上弥补小分子化合物或者短肽较难阻断蛋白-蛋白相互作用这一缺点。

本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成上述抑制多肽；微波促进固相合成的新型STAT3抑制多肽大大的提高了偶合反应速率，常规固相合成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2h到20h不等，甚至更长。而微波促进则平均只需要10min左右，常规固相合成方法脱Fmoc保护基，往往需要30min到1h不等，而微波促进则平均只需要5min左右，这极大的提高了多肽合成的效率，缩短了合成周期；而且微波促进固相合成新型STAT3抑制多肽的粗品纯度大于80％，较常规固相合成方法大大提高，方便了后续的纯化工作。在本发明中，微波促进固相方法合成新型STAT3抑制多肽，其成本低，由于偶合效率较高，所需要保护氨基酸平均只需要2倍过量，较常规固相合成方法需要4到5倍过量大为降低。微波促进固相合成新型STAT3抑制多肽的方法易于实现自动化、大规模化，这使其更适合工业化生产。

具体实施方式

在本发明中，各缩略词分别表征以下内容，且所述内容如非特殊说明，均为常规购买获得：

Et3N：三乙胺；NMM：N-甲基吗啉；DIEA：N,N'-二异丙基乙胺；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亚砜；DCM：二氯甲烷；Fmoc：N-9-芴甲氧羰基；Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；DIC：N,N’-二异丙基碳二亚胺；CDI：N,N’-羰基二咪唑；DMAP：4-二甲氨基吡啶；HOSU：N-羟基琥珀酰亚胺；EDC.HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU：6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT：1-羟基-苯并三氮唑；PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC：高效液相色谱；ESI-MS：电喷雾质谱；Pal：棕榈酸；Gly：甘氨酸；Ser：丝氨酸；Ala：丙氨酸；Val：缬氨酸；Ile：异亮氨酸；Leu：亮氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；His：组氨酸；Pro：脯氨酸；Met：蛋氨酸；Glu：谷氨酸；Lys：赖氨酸；Arg：精氨酸。

本发明提供了一种STAT3抑制多肽，所述抑制多肽具有包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列：Pro-Phe-Ser-Ser-Val-Pro-Glu-Ile-Val-His-His-Tyr-Ala-Ser-Arg-Lys-Leu-Pro-Ile-Lys-Gly-Ala-Glu-His-Met-Ser-Leu-Leu-Tyr-Pro-Val-Ala-Ile-Arg，且在所述抑制多肽的N末端的Pro上优选还包括利用酰胺键连接的脂肪酸链，利用所述脂肪酸链修饰的Pro的分子结构优选如式I所示：

其中n为1～20的正整数；在所述抑制多肽的C末端的Arg结构中羧基中的羟基还可被氨基取代，因此本发明除提供了上述序列，还提供了Pro-Phe-Ser-Ser-Val-Pro-Glu-Ile-Val-His-His-Tyr-Ala-Ser-Arg-Lys-Leu-Pro-Ile-Lys-Gly-Ala-Glu-His-Met-Ser-Leu-Leu-Tyr-Pro-Val-Ala-Ile-Arg-OH，以及Pal-Pro-Phe-Ser-Ser-Val-Pro-Glu-Ile-Val-His-His-Tyr-Ala-Ser-Arg-Lys-Leu-Pro-Ile-Lys-Gly-Ala-Glu-His-Met-Ser-Leu-Leu-Tyr-Pro-Val-Ala-Ile-Arg-NH₂，其中Pal优选包括棕榈酸链。

本发明利用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成所述抑制多肽，在合成时，首先依次利用DCM和NMP溶胀树脂后，清洗干净得溶胀的树脂。本发明所述树脂优选包括Fmoc-Wang amide-MBHAResin；利用DCM溶胀所述树脂时，所述树脂与所述DCM的质量体积比优选为50mg：7mL；抽滤出DCM后，再利用NMP进行溶胀，所述树脂与所述NMP的质量体积比优选为50mg：10mL。本发明所述清洗优选包括依次利用与上述相同量的NMP、DCM和NMP进行冲洗。

得溶胀的树脂后，本发明将所述溶胀的树脂与含0.1M HOBT的哌啶/NMP溶液混合，第一微波反应1min，冷却后滤去溶液，再与含0.1M HOBT的哌啶/NMP溶液混合，第二微波反应4min，冷却后得脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂；所述第一微波的功率为15W；所述第二微波的功率为25W。本发明所述含0.1M HOBT的哌啶/NMP溶液的用量优选与上述DCM的用量相同，即所述树脂与含0.1M HOBT的哌啶/NMP溶液的质量体积比为50mg：7mL。本发明所述含0.1M HOBT的哌啶/NMP溶液中，哌啶的体积百分含量优选为25％。本发明所述第一微波和第二微波的温度优选均低于50℃，且本发明在所述第一微波和第二微波后，优选均使用空气压缩机压缩空气冷却，反应结束后滤去溶液。本发明在所述第二微波反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。

得脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂后，本发明将促进液与所述脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂混合，第三微波反应7min，冷却后滤去反应液，洗涤树脂，得Fmoc-Leu-Rink amide-MBHAResin；所述促进液为包含Fmoc-Arg(Pbf)-OH、HBTU、HOBT和DIPEA的NMP混合溶液；所述NMP混合溶液中，所述Fmoc-Arg(Pbf)-OH的浓度为0.04mmol/L，HBTU的浓度为0.04mmol/L，HOBT的浓度为0.04mmol/L和DIPEA的浓度为0.08mmol/L。本发明所述第三微波的功率优选为25W，反应温度控制在50℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却；反应结束后滤除反应液，依次用等量的DCM和NMP各洗涤树脂3次，每次所述DCM和NMP的用量优选与步骤(1)中的用量相同。

本发明在合成Fmoc-Leu-Rink amide-MBHAResin后，优选还包括检测偶合效率，选择显色反应为阴性的Fmoc-Leu-Rink amide-MBHAResin进入下一个偶合循环。本发明优选利用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环。本发明对所述茚三酮法或者溴酚兰法的具体步骤并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可，且利用上述两个方法进行检测时，如果树脂显蓝色即为阳性。

本发明按照所述抑制多肽的肽链顺序，依此从C-端到N-端重复步骤(2)和步骤(3)以连接上相应的氨基酸，得到多肽-树脂复合物。

得多肽-树脂复合物后，本发明将所述多肽-树脂复合物与裂解剂Reagent K混合后，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h，抽滤后将滤液与冰乙醚混合，收集沉淀得所述抑制多肽的粗品；所述裂解剂Reagent K为包含TFA、苯甲硫醚、水、苯酚和EDT的混合溶液，且所述TFA、苯甲硫醚、水、苯酚和EDT的体积比为82.5:5:5:5:2.5。本发明在所述抽滤后优选还包括利用等体积TFA和DCM再分别洗涤三次，而合并滤液。本发明将滤液加入10倍体积的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。

本发明在得到所述抑制多肽的粗品后，优选还包括液相色谱纯化，色谱条件包括：C18反相柱；流动相A：体积百分浓度为0.1％的TFA/水，流动相B：体积百分浓度为0.1％的TFA/乙腈；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为6mL/min检测波长为214nm。

本发明还提供了上述抑制多肽或利用上述制备方法制备得到的抑制多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。在本发明中，所述抑制多肽的化学性质稳定，对STAT3具有显著的蛋白亲和性，能够有效地结合STAT3蛋白，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，诱导细胞凋亡，具有良好的广谱抗肿瘤活性；对正常细胞毒性较小，具有良好的选择性，因此可将其应用于制备抗肿瘤药物。

本发明还提供了一种抗肿瘤的药物，所述药物的有效成分包括上述抑制多肽或利用上述制备方法制备得到的抑制多肽或所述抑制多肽的盐。本发明所述药物中优选还包括药学上可接受的载体或稀释剂。

下面结合实施例对本发明提供的一种STAT3抑制多肽及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

Pro-Phe-Ser-Ser-Val-Pro-Glu-Ile-Val-His-His-Tyr-Ala-Ser-Arg-Lys-Leu-Pro-Ile-Lys-Gly-Ala-Glu-His-Met-Ser-Leu-Leu-Tyr-Pro-Val-Ala-Ile-Arg-OH(SEQ IDNO.1-OH)的微波促进固相合成

(1)树脂的溶胀

称取Fmoc-Wang amide-MBHAResin 50mg(取代量0.4mmol/g)，经7mL DCM溶胀30min，抽滤去DCM，再用10mLNMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。

(2)微波促进Fmoc保护基的脱除

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反应器中反应1min，微波功率为15W，反应温度控制在50℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却，反应结束后滤去溶液；再加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。

(3)微波促进Fmoc-Leu-Rink amide-MBHAResin的合成

将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.04mmol)，HBTU(0.04mmol)，HOBT(0.04mmol)和DIPEA(0.08mmol)溶于10mLNMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。

(4)偶合效率的检测

用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环。

其中，茚三酮法：取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5％茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀释于98ml吡啶中)、80％苯酚乙醇溶液各2滴，于100℃加热5min，如果树脂显蓝色即为阳性。

溴酚兰法：取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3min，如果树脂显蓝色即为阳性。

(5)肽链的延长

按照化合物肽链的顺序，依此从C-端到N-端重复以上脱保护和偶合的步骤连接上相应的氨基酸，偶合微波促进反应时间5～20min不等，具体反应时间根据步骤(4)确定。得到多肽-树脂复合物。

(6)树脂上多肽的裂解

将上述得到的多肽-树脂复合物放入反应瓶中，各加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到目标化合物粗品65.1mg，收率为94.5％。

(7)多肽的纯化

将粗品多肽溶于50％的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为6mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品30mg。理论相对分子质量为3844.6。ESI-MS m/z:found[M+4H]⁴⁺962.1，[M+5H]⁵⁺769.9；calu[M+4H]⁴⁺961.5，[M+5H]⁵⁺769.4。

实施例2

Pal-Pro-Phe-Ser-Ser-Val-Pro-Glu-Ile-Val-His-His-Tyr-Ala-Ser-Arg-Lys-Leu-Pro-Ile-Lys-Gly-Ala-Glu-His-Met-Ser-Leu-Leu-Tyr-Pro-Val-Ala-Ile-Arg-NH₂(Pal-SEQ ID NO.1-OH，其中Pal为棕榈酸)的微波促进固相合成

根据实施例1中提供的方法，根据相应的序列合成得到上述序列的抑制多肽，通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。理论相对分子质量为4081.9。ESI-MS m/z:found[M+4H]⁴⁺1021.4，[M+5H]⁵⁺817.3；calu[M+4H]⁴⁺1020.8，[M+5H]⁵⁺816.8。

对实施例1和实施例2制备合成的抑制多肽进行实验：

(1)抑制多肽对STAT3靶向亲和性

利用凯氏定氮法测定STAT3蛋白含量为7.55mg/g wet gel，即85nmol/gwet gel。使用0.1g wet gel，含有8.5nmol STAT3，分别与1mL含有不同浓度梯度(初始浓度为：2、4、6、8、10、12、14、16、18和20μM)的实施例化合物及对照Scr小肽在20mM PBS溶液中，4℃缓慢震荡12h，直至静态吸附平衡，3000rpm离心取上清，利用NanoDrop 2000超微量分光光度计在280nm波长处分别测定上清中小肽的浓度，并以没有偶联STAT3蛋白的空白琼脂糖凝胶作为空白对照。利用Origin内用非线性拟合工具，依据Langmuir等温吸附方程进行拟合，分别得出实施例化合物及对照Scr的静态吸附最大值Qmax(nmol/g)与平衡解离常数Kd(μmol/L)。

表1实施例化合物及对照Scr的静态吸附最大值与平衡解离常数

注：^*P≤0.05及^**P≤0.01为相对于Scr对照组的Student’s t检验结果。

如表1所示，固定化STAT3(85nmol/g wet gel)对实施例1制备得到的抑制多肽的静态吸附最大值Qmax达到86.21±0.17nmol/g wet gel，平衡解离常数Kd达到0.07±0.04μmol/L；实施例2得到的抑制多肽的静态吸附最大值Qmax达到86.13±0.18nmol/g wet gel；平衡解离常数Kd达到0.08±0.02μmol/L；对照Scr小肽的静态吸附最大值Qmax达到12.89±0.52nmol/g wet gel；平衡解离常数Kd达到4.08±0.63μmol/L。实施例1和实施例2制备得到的抑制多肽均比Scr小肽的平衡解离常数Kd低两个数量级，显示了显著的靶向亲和性；其静态吸附最大值Qmax分别达到86.21±0.17nmol/g wet gel和86.13±0.18nmol/g wetgel，与STAT3固定在CNBr-activated Sepharose 4B材料上的实际蛋白量(85nmol/g wetgel)基本一致，符合1:1相互作用的模型。

(2)体外抗肿瘤活性

人胶质瘤细胞U87和U118，人宫颈癌HeLa，人结肠癌HCT-116，人肺腺癌A549、人乳腺癌MCF-7，白血病细胞K562、人前列腺癌PC-3，人胃粘膜上皮细胞GES-1和人脐静脉内皮细胞HUVEC均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，取处于对数生长期状态良好的上述细胞，分别以1×10⁵/ml密度接种于96孔培养板中培养24h后，加入不同浓度梯度的抑制多肽物孵育48h。孵育结束后，每孔加入20μl CCK-8溶液，继续孵育2h后通过酶标仪检测其在450nm波长下的OD值，最后通过GraphPad Prism 7.0计算待测化合物的IC₅₀值。

表2抑制多肽的体外细胞毒性

如表2所示，相对于正常细胞GES-1，HUVEC和不表达STAT3的肿瘤细胞PC-3，抑制多肽对STAT3高表达的肿瘤细胞U87，U119，Hela,HCT-116，A549，MCF-7和K562均有明显的细胞毒性。表明本发明提供的抑制多肽具有良好的广谱抗肿瘤活性，对正常细胞毒性较小，具有良好的选择性。

(3)体内抗肿瘤活性：

将U87细胞分别接种于balb/c裸鼠的右侧腋窝皮下，待肿瘤生长至100mm³后将动物随机分组，分为空白对照组和给药组，每2天静脉给药1次，给药组静脉注射所述抑制多肽，给药剂量为10mg/kg，给药体积为0.2ml，空白对照组静脉注射等体积的生理盐水，给药后每日测量小鼠体重和肿瘤体积，动态观察化合物的抗肿瘤效应。给药14天后，处死小鼠，手术剥取瘤块称重并计算相对肿瘤体积V(mm³)。

表3 U87体内肿瘤体积(mm³)

注：*P≤0.05及**P≤0.01为相对于空白对照的Student’s t检验结果。

表4 U87体内肿瘤肿瘤(g)

如表3和表4所示，本发明提供的所述抑制多肽均能够有效的抑制裸鼠体内U87的生长，具有良好的体内抗肿瘤活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 无锡市人民医院

<120> 一种STAT3抑制多肽及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Pro Phe Ser Ser Val Pro Glu Ile Val His His Tyr Ala Ser Arg Lys

1 5 10 15

Leu Pro Ile Lys Gly Ala Glu His Met Ser Leu Leu Tyr Pro Val Ala

20 25 30

Ile Arg

Claims

1.一种STAT3抑制多肽，其特征在于，所述抑制多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述抑制多肽，其特征在于，在所述抑制多肽的N末端的Pro进行棕榈酸修饰，且C末端的Arg结构中的羧基中的羟基被氨基取代。

3.权利要求1或2所述抑制多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)依次利用DCM和NMP溶胀树脂后，清洗干净得溶胀的树脂；

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤(1)所述树脂为Fmoc-Wang amide-MBHA Resin；利用DCM溶胀所述树脂时，所述树脂与所述DCM的质量体积比为50mg：7mL；抽滤出DCM后，再利用NMP进行溶胀，所述树脂与所述NMP的质量体积比为50mg：10mL。

5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤(2)所述第一微波和第二微波以及步骤(3)所述第三微波时的温度均低于50℃。

6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，在步骤(3)合成Fmoc-Leu-Rink amide-MBHA Resin后，还包括检测偶合效率，选择显色反应为阴性的Fmoc-Leu-Rink amide-MBHAResin进入下一个偶合循环。

7.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，在步骤(5)得到所述抑制多肽的粗品后，还包括液相色谱纯化，色谱条件包括：C18反相柱；流动相A：体积百分浓度为0.1％的TFA/水，流动相B：体积百分浓度为0.1％的TFA/乙腈；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为6mL/min检测波长为214nm。

8.权利要求1或2所述抑制多肽或利用权利要求3～7任一项所述制备方法制备得到的抑制多肽在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤选自胶质瘤、宫颈癌、结肠癌、肺腺癌、乳腺癌或白血病。

9.一种抗肿瘤的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括权利要求1或2所述抑制多肽或利用权利要求3～7任一项所述制备方法制备得到的抑制多肽或所述抑制多肽的盐；所述肿瘤选自胶质瘤、宫颈癌、结肠癌、肺腺癌、乳腺癌或白血病。