CN112912390A - Glp-1类似物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过固相上的片段缩合以高得率和纯度制备GLP‑1类似物的方法。具体地，描述了一种汇集合成，通过将C‑末端假脯氨酸片段A与结合到固相支持物的片段B缩合，然后去保护并从所述支持物上切下，最后纯化，以得到所需肽。本发明还提供了在所述制备方法中有用的中间体。

Description

GLP-1类似物的制备方法
技术领域
本发明涉及肽合成。具体地，本发明涉及GLP-1类似物的制备方法。更具体地，本发明涉及通过肽片段缩合制备利拉鲁肽和索马鲁肽的方法。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种天然存在的肽激素，具有最强的促胰岛素活性之一。GLP-1是在胰腺和肠中产生并加工成GLP-1的较长肽的一部分。胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂或GLP-1类似物是用于治疗2型糖尿病的一类相对新的可注射药物。它们相对于较早的胰岛素促分泌素例如磺酰脲类或美格列奈类的优点之一在于它们引起低血糖的风险较低。
利拉鲁肽和索马鲁肽两者都是长度为30个氨基酸的高度相似的肽，它们的差异仅在于第2位中的氨基酸(aa2，其在利拉鲁肽中是Ala，在索马鲁肽中是α-氨基异丁酸Aib)和附连到第20位中的赖氨酸(Lys20)的侧链，即亲脂性的结合白蛋白的组成部分。附连到这个赖氨酸的ε-氨基，利拉鲁肽具有Glu隔开的棕榈酸(被标为Pal-Glu)，而索马鲁肽带有十八烷二酰化的谷氨酸加上另外的间隔物。
使用氨基酸/肽的“三字母密码”，将利拉鲁肽和索马鲁肽表示如下：
Figure BDA0003011436750000011
其中氨基酸残基的编号从表示N-末端组氨酸的1开始，并以表示C-末端甘氨酸的31结束，
并且其中
在利拉鲁肽(SEQ ID No 1)中，
X1是Ala，
X2是如下所示的N-(1-氧代十六烷基)-L-γ-谷氨酰基(也表示为Pal-Glu)，
Figure BDA0003011436750000012
并且
在索马鲁肽(SEQ ID No 2)中，
X1是Aib(α-氨基异丁酸)，
X2是如下所示的N-(17-羧基-1-氧代十七烷基)-L-γ-谷氨酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基，
Figure BDA0003011436750000021
并且其中X2通过用
Figure BDA0003011436750000022
表示的酰胺键附连到Lys20的ε-氨基。
可选地，贯穿本申请，使用氨基酸/肽的“单字母密码”将上述两个肽或其任何片段表示为式I：
HX1EGTFTSDVSSYLEGQAAK(X2)EFIAWLVRGRG (I)
其中X1和X2分别如上所定义。
在进一步的选择中，贯穿本申请，上述两个肽或其任何片段使用它们的化学结构表示。
在下文中，片段也用它们在上述序列中的相应位置进行指称。例如，“片段(1-16)”是指由上述序列中第1位至第16位处存在的氨基酸构成的肽序列。
在一些专利申请中已描述了GLP-1类似物的制备。顺序SPPS(固相肽合成)和基于片段的方法两者均得以推行。值得指出的是，利拉鲁肽和索马鲁肽的支链结构及其低水溶性大大阻碍了它们的合成和纯化。
在基于片段的肽合成中，C-末端羧基是在偶联之前必须被活化的两个反应性片段之一。然而，肽片段的C-末端羧基的活化可能导致活化酯和噁唑酮两者的形成，它们在偶联期间的碱性条件下可容易地被消旋(N.L.Benoiton，《肽合成化学》(Chemistry of PeptideSynthesis)，Tailor and Francis Group.2006)。因此，通过这种方式获得的粗品肽含有对应于所述异构化产物的杂质。由于所述异构体杂质具有与所需目标肽非常相近的保留时间，因此非常难以将这些杂质与所述肽分离开。解决这个问题的一种方式是将GLP-1类似物肽序列在Gly4和/或Gly16位置处劈开，并在最后的步骤中偶联所述片段(正如在例如CN104004083和WO2016046753中所公开的)。
然而，受保护的片段(1–16)在肽合成中常用的溶剂中的极低溶解度使得与方案片段(1-16)+片段(17-31)的最终偶联非常困难，尤其是当C-末端片段(即片段(17-31))被固定化在固相支持物上时。
另外，诸如利拉鲁肽和索马鲁肽之类的长肽易于发生肽链的分子间聚集。这个问题与分子内肽折叠一起在肽合成期间特别严重，降低了氨基酸偶联和去保护的效率，导致许多副产物的形成或甚至导致无法获得目标肽。
因此，对于开发一种高效、简单且在工业上可行的制备利拉鲁肽和索马鲁肽的方法，仍存在着需求。因此，非常需要一种改进的方法克服现有技术未解决的合成问题，并以高得率和有利的杂质分布提供两种肽。
本文描述了利拉鲁肽和索马鲁肽的新的、改进的固相合成，其利用包括按照通用方案1进行的最终片段偶联步骤的汇集(convergent)方法，其中N-末端片段A在C-末端反应活性部位处具有假脯氨酸：
Figure BDA0003011436750000031
具体地，设计了一种策略，其中通过SPPS制备受保护的N-末端假脯氨酸片段(或片段A)，然后将其从固相支持物上切下，同时保持α-氨基和侧链的保护，并通过SPPS或CSPPS(汇集SPPS)制备固相承载的C-末端片段(或片段B)，并且在最终片段偶联之前只将其α-氨基去保护。最后，将完整的序列确定的肽从固相支持物上切下并去保护，并且任选地纯化以分别获得纯的利拉鲁肽或索马鲁肽。已令人吃惊地发现，在本发明的基于片段的方法中，在C-末端终端处使用假脯氨酸有效地减少杂质的形成，使得所获得的粗品肽可更容易被纯化，以高的总得率得到所述最终肽。
发明目的
本发明的目的是提供在固相中制备GLP-1类似物或其可药用盐的改进方法，所述方法以高得率和良好的杂质分布产生粗品肽，便于最终的纯化。
本发明的另一个目的是提供制备利拉鲁肽和索马鲁肽的高效、简单且在工业上可行的方法。
本发明的另一个目的是提供以比现有技术所实现的更高的得率和纯度制备利拉鲁肽和索马鲁肽的方法。
本发明的另一个目的是提供用于合成利拉鲁肽或索马鲁肽或者其可药用盐的有用的肽中间体。
发明内容
本发明提供了用于在固相合成中制备某些GLP-1类似物的汇集方法(convergentmethod)，所述方法包括将以在C-末端反应活性部位处具有假脯氨酸为特征的第一N-末端受保护的肽片段(受保护的N-末端假脯氨酸片段A)与附连到固相支持物的第二受保护的C-末端肽片段(片段B)偶联的最终步骤。
片段A具有C-末端假脯氨酸反应活性部位，并且在其N-末端α-氨基处受保护。片段A优选地在其氨基酸侧链处受保护。
片段A选自：
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(ψz,zpro)，其被称为片段A(1-8)或SEQ ID No3，
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(ψz,zpro)，其被称为片段A(1-11)或SEQ ID No 4，
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(ψz,zpro)，其被称为片段A(1-12)或SEQ ID No 5，
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(ψz,zpro)，其被称为片段A(1-7)或SEQ ID No6，
和
His-X1-Glu-Gly-Thr(ψz,zpro)，其被称为片段A(1-5)或SEQ ID No 7，
其中，对于利拉鲁肽，X1是Ala，对于索马鲁肽，X1是Aib，并且
其中aa(ψz,zpro)表示C-末端氨基酸(aa)、优选为Ser或Thr，按照下式被假脯氨酸保护：
Figure BDA0003011436750000041
其中
对于Ser，Y是氢，对于Thr，Y是甲基(Me)，
Z是氢或甲基(Me)，并且
R1是除了所述假脯氨酸保护的氨基酸之外的氨基酸的侧链。
括号中的片段计数法例如(1-8)仅表示所述片段相对于完整肽序列的位置。
因此，例如，aa-Ser(ψMe,Mepro)表示：
Figure BDA0003011436750000051
其中R1是aa的侧链，
并且如上所定义的片段A(1-8)中的Thr-Ser(ψz,zpro)表示：
Figure BDA0003011436750000052
其中Z如上所定义。
为简单起见，在上述结构中未定义立体化学。除非另有说明，否则始终使用L-氨基酸。
片段B在其C-末端氨基酸即甘氨酸31(Gly31)处结合到树脂或固相支持物。所述固相支持物优选地选自Wang树脂、2-氯三苯甲基氯(CTC)树脂、三苯甲基氯树脂、MBH和4-MeO-MBH树脂。所述固相支持物更优选地选自Wang树脂、2-氯三苯甲基氯(CTC)树脂和三苯甲基氯树脂。片段B优选地在其氨基酸侧链、包括X2组成部分的Lys20处受保护。
片段B选自：
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，其被称为片段B(9-31)或SEQ ID No 8，
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，其被称为片段B(12-31)或SEQ ID No 9，
Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，其被称为片段B(13-31)或SEQ ID No 10，
Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，其被称为片段B(8-31)或SEQ ID No 11，
和
Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，其被称为片段B(6-31)或SEQ ID No12，
其中
对于利拉鲁肽，X2是N-(1-氧代十六烷基)-L-γ-谷氨酰基(Pal-Glu)，并且
对于索马鲁肽，X2是任选地受保护的N-(17-羧基-1-氧代十七烷基)-L-γ-谷氨酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基。
将片段A和片段B偶联，以便获得利拉鲁肽或索马鲁肽全序列。然后将所述得到的、优选地侧链受保护的30-aa的肽去保护和/或从所述固相支持物上切下，以得到粗品肽。任选地将这些粗品肽纯化，以获得纯的利拉鲁肽或索马鲁肽。本发明的方法以高得率和高纯度提供利拉鲁肽和索马鲁肽。
此外，本发明提供了中间体片段A和B以及它们的制备方法。
具体实施方式
本发明公开了以高得率和纯度制备GLP-1类似物的新方法。具体地，它由固相上的汇集方法组成。更具体地，最终偶联涉及以在C-末端反应活性部位处具有假脯氨酸为特征的肽片段(片段A)。
假脯氨酸由Mutter在1992年开发(T.Haack,M.Mutter，丝氨酸衍生的噁唑烷作为肽合成中的二级结构破坏性、增溶性构件(Serine derived oxazolidines as secondarystructure disrupting,solubilizing building blocks in peptide synthesis)，Tetrahedron Lett.1992,33,1589-1592)。令人吃惊的是，已发现在本发明的基于片段的方法中，在C-末端终端处使用假脯氨酸有效地降低了形成的杂质的量，由此产生了作为本发明目的的改进的方法。这种方法显著减少了杂质的形成，以便使得到的粗品肽可以容易被纯化，以高的总得率提供最终肽。
另一方面，本发明提供了所需的肽片段A和B以及制备它们的方法。此类合成通过标准的SPPS或通过CSPPS进行，两者均使用偶联剂系统。
术语“肽片段”或“片段”描述了具有关于利拉鲁肽或索马鲁肽序列的部分氨基酸序列的肽。它可以任选地在其C-末端氨基酸处附连到树脂。肽片段可以受保护或不受保护。肽片段可以在其C-末端终端处或在氨基酸序列中的内部位置处具有假脯氨酸。
术语“受保护的肽片段”或“受保护的片段”描述了可以在其氨基酸侧链或侧基处和/或其α-氨基处独立地带有保护基团的肽片段。
片段或肽片段也可以用特定氨基酸序列表示，如
aa1-aa2-…-aan
其中aax是第x位置中的氨基酸的三字母密码，并且其中在侧链或α-氨基上保护基团的存在或不存在未被定义。在肽合成期间，在某些条件下保护氨基酸的侧链的必要性在本领域中是已知的，并且用于鉴定适合的保护策略的各种策略已有描述。
如果在本说明书中对于特定氨基酸序列(片段)而言在伴随氨基酸的三字母密码的括号中特别提及侧链的保护基团，则应该理解，用简单的三字母密码表示的其余氨基酸是未保护的。
当所述片段用aa1-aa2-…-aan-OH表示时，意指C-末端氨基酸aan具有游离羧酸。
当所述片段用H-aa1-aa2-…-aan表示时，意指N-末端氨基酸aa1具有游离α-氨基。
当所述片段用aa1-aa2-…-aan(ψz,zpro)-OH表示时，意指C-末端氨基酸aan按照下述结构被假脯氨酸保护并具有游离羧酸：
Figure BDA0003011436750000071
其中R1是aa(n-1)的侧链，并且aan(ψz,zpro)-OH可以是
Ser(ψz,zpro)-OH，其中Y是氢并且Z是氢或Me，或
Thr(ψz,zpro)-OH，其中Y是Me并且Z是氢或Me。
作为α-氨基受保护的二肽的假脯氨酸是可商购的。例如，下述假脯氨酸二肽用于实施本发明：
P-Thr(tBu)-Ser(ψz,zpro)8-OH
P-Val-Ser(ψz,zpro)11-OH
P-Ser-Ser(ψz,zpro)12-OH
P-Phe-Thr(ψz,zpro)7-OH
P-Gly-Thr(ψz,zpro)5-OH
其中P是α-氨基保护基团，并且Z如上所定义。
优选地，用于实施本发明的假脯氨酸二肽选自：
Fmoc-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH
Fmoc-Thr(tBu)-Ser(ψH,Hpro)8-OH
Fmoc-Val-Ser(ψMe,Mepro)11-OH
Fmoc-Val-Ser(ψH,Hpro)11-OH
Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)12-OH
Fmoc-Ser(tBu)-Ser(ψH,Hpro)12-OH
Fmoc-Phe-Thr(ψMe,Mepro)7-OH
Fmoc-Phe-Thr(ψH,Hpro)7-OH
Fmoc-Gly-Thr(ψMe,Mepro)5-OH
和
Fmoc-Gly-Thr(ψH,Hpro)5-OH。
假脯氨酸在肽序列中的引入可以在标准的偶联条件下在固相中进行。在通过酸解将肽从树脂切下后，提供了两个相应的本源氨基酸。
术语“树脂”或“固相支持物”描述了一种功能化的不溶性聚合物，氨基酸或肽片段可以与其附连，并且其适合于氨基酸延伸直至获得完整的所需序列。
SPPS可以被定义为一种过程，在所述过程中通过顺序添加构成肽序列的任选受保护的氨基酸组装通过C-末端氨基酸锚定到树脂的所述肽。它包括将第一α-氨基受保护的氨基酸或肽或如上所定义的假脯氨酸二肽加载到树脂上，然后重复由α-氨基保护基团的切开和后续受保护的氨基酸的偶联组成的被称为循环或延伸步骤的一系列步骤。
两个氨基酸之间或氨基酸与肽片段之间或两个肽片段之间肽键的形成可能涉及两个步骤。首先是为时5分钟至2小时的游离羧基的活化，然后是氨基在活化羧基处的亲核攻击。
所述循环可以被顺序重复，直至获得所述肽的所需序列。
最后，将所述肽去保护和/或从树脂上切下。
作为SPPS的参考文献，请参见例如Knud J.Jensen等主编，《肽合成和应用》(Peptide Synthesis and Applications)，Methods in Molecular Biology,vol.1047,Springer Science,2013。
在本发明的优选方面，使用酸敏感性树脂。更优选地，其选自Wang树脂、2-氯三苯甲基氯(CTC)树脂、三苯甲基氯树脂、MBH和4-MeO-BH树脂。更优选地，所述树脂选自Wang树脂、2-氯三苯甲基氯(CTC)树脂和三苯甲基氯树脂。
甚至更优选地，Wang和MBH树脂被用于片段B的制备，并因此参与片段A与片段B的偶联。甚至更优选地，Wang树脂被用于片段B的制备，并因此参与片段A与片段B的偶联。
优选地，将CTC树脂用于片段A的制备，并在与片段B偶联之前将片段A从所述树脂切下。
在本发明的优选方面，在将Wang树脂在适合的溶剂、优选为DMF中溶胀，过滤所述树脂，并在碱例如二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下向所述树脂添加受保护的氨基酸与活化剂例如碳二亚胺的溶液之后，进行第一C-末端氨基酸在Wang树脂上的加载。在使用三苯甲基氯树脂、特别是CTC树脂的情况下，在将所述树脂在适合的溶剂、优选为DCM中溶胀并过滤所述树脂之后，添加受保护的氨基酸与有机碱、优选为二异丙基乙胺(DIEA)的溶液。
在本发明的其他优选方面，为了制备片段A，第一步是在将CTC树脂在适合的溶剂、优选为DCM中溶胀后，将适合的假脯氨酸二肽加载在所述树脂上。
在本发明的优选方面，在第一C-末端氨基酸或假脯氨酸二肽已被加载在树脂上之后，进行阻断未反应部位的附加步骤，以避免截短的序列并阻止任何副反应。这种步骤通常被称为“封端”。
通过用大大过量的高反应性未受阻试剂短暂处理加载的树脂实现封端，所述试剂根据待封端的未反应部位进行选择。在使用Wang树脂时，所述未反应部位是羟基，其优选地通过用碱性介质中的酸衍生物例如酸酐，例如用优选地具有17/2/1v/v/v或5/2/1v/v/v组成的DMF/DIEA/Ac2O混合物或用Ac2O 10％DMF溶液处理进行封端。
在使用CTC树脂时，所述未反应部位是氯，其优选地通过用碱性介质中的醇例如用优选地具有17/2/1v/v/v组成的DCM/DIEA/MeOH混合物处理进行封端。然后，在用DCM清洗后，将所述树脂进一步用优选地具有17/2/1v/v/v组成的DCM/DIEA/Ac2O混合物处理，以封端可能由氯水解产生的羟基。
作为加载第一C-末端氨基酸的替选方案，在肽片段的制备中使用预装树脂。它们是可商购的附连有Fmoc保护的L-或D-氨基酸的Wang/CTC树脂。因此，例如，Fmoc-Gly-Wang树脂优选被用于片段B的合成，Fmoc-假脯氨酸-树脂可用于片段A的合成。
在本发明的优选方面，第一C-末端氨基酸在树脂上的加载采用分光光度法确定，正如例如在Knud J.Jensen等主编，《肽合成和应用》(Peptide Synthesis andApplications)，Methods in Molecular Biology,vol.1047,Springer Science,2013中所述。
在本发明的优选方面，每个氨基酸可以在其α-氨基处和/或其侧链官能团处被保护。
优选地，用于SPPS的氨基酸α-氨基的保护基团是氨基甲酸酯类型的。最优选的保护基团是可以在碱性条件下除去的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团和可以在酸性条件下除去的叔丁氧基羰基(Boc)基团。
氨基酸侧链官能团任选地用在偶联步骤期间和α-氨基保护基团移除期间通常稳定并且本身在适合的条件下可移除的基团进行保护。此类适合的条件通常与所述α-氨基去保护的条件正交。在本申请中使用的氨基酸侧链官能团的保护基团通常可以在酸性条件下移除，这与通常用于Fmoc保护基团去保护的碱性条件正交。
在本发明的优选方面，此类侧链保护基团根据相关GLP-1类似物序列中出现的每个单独的氨基酸指定，如下所述：
精氨酸(Arg)胍基优选地用选自均可在酸性条件下移除的甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基(Mtr)、2,2,5,7,8-五甲基色烷基-6-磺酰基(Pmc)和2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)的保护基团保护；更优选地，使用Pbf基团；
丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)或酪氨酸(Tyr)的羟基优选地用选自三苯甲基(Trt)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)和叔丁基(tBu)的基团保护；更优选地，使用tBu基团；
谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)的羧基优选地用选自2-苯基异丙基(2-Phi-Pr)、tBu酯、苯甲基酯(OBzl)、烯丙基酯(OAll)的基团保护；更优选地，使用tBu酯；
色氨酸(Trp)的吲哚氮优选地用选自叔丁氧基羰基(Boc)、甲酰基(For)的基团保护；更优选地，使用叔丁氧基羰基(Boc)基团；
组氨酸(His)的咪唑氮优选地用选自叔丁氧基羰基(Boc)、单甲氧基三苯甲基(Mmt)、3-甲氧基苯甲氧基甲基(MBom)、2-氯三苯甲基(Clt)、三苯甲基(Trt)的基团保护；更优选地，使用三苯甲基(Trt)基团。
通常使用可商购的受保护的L-氨基酸。对于在Lys20上引入亲脂性结合白蛋白的组成部分X2而言，在利拉鲁肽的制备中使用如下所示的可商购的Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH：
Figure BDA0003011436750000111
在索马鲁肽的制备中，使用如下所示的受保护的赖氨酸衍生物：
Figure BDA0003011436750000112
这种衍生物是可商购的，并且它的制备也描述在例如CN104356224中。这种衍生物也被表示为Fmoc-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-OH，其中AEEA代表2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基。
所述X2组成部分构件的tBu酯保护基团均可在酸性条件下移除，并因此在制备过程结束时切下。
在本发明的优选方面，所述偶联步骤在偶联剂存在下进行。
优选地，所述偶联剂选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基六氟磷酸鏻(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲(HATU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲(HBTU)和乙基-二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)。更优选地，所述反应在N,N′-二异丙基碳二亚胺存在下进行。
在本发明的优选方面，所述偶联步骤也在添加剂存在下进行。当用于所述偶联反应时，添加剂的存在减少羧酸残基处构型的丧失，提高偶联速率并降低消旋的风险。
优选地，所述添加剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-羟基吡啶N-氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、内-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰胺、5-(羟基亚氨基)-1,3-二甲基嘧啶-2,4,6-(1H,3H,5H)-三酮(Oxyma-B)和2-氰基-2-羟基亚氨基-乙酸乙酯(OxymaPure)。更优选地，所述添加剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-羟基吡啶N-氧化物、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、内-N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰胺和2-氰基-2-羟基亚氨基-乙酸乙酯(OxymaPure)。甚至更优选地，所述反应在2-氰基-2-羟基亚氨基-乙酸酯存在下进行。
在一个优选方面，所述偶联步骤在清洁剂存在下进行。根据所描述的合成，用于片段偶联的优选清洁剂是非离子型清洁剂例如Triton X-100(也被称为TX-100或聚乙二醇叔辛基苯基醚)或Tween 20，最优选为Triton X-100。例如，使用1％的TX-100在DMF:DCM 50:50v/v中的溶液。
在本发明的优选方面，所述偶联步骤在选自DMF、DCM、THF、NMP、DMA或其混合物的溶剂中进行。更优选地，在使用Wang树脂时所述偶联在DMF中进行，在使用CTC树脂时其在DCM中进行。
在本发明的优选方面，所述偶联步骤在可以在10-70℃范围内变化的温度下进行。优选地，温度在室温(即20℃)至50℃的范围内变化，更优选地温度在35-45℃的范围内变化，甚至更优选地所述偶联步骤在40℃下进行。
在本发明的优选方面，所述α-氨基保护基团在碱性条件下切除。具体地，Fmoc保护基团通过用适合的仲胺处理进行切除，所述仲胺选自哌啶、吡咯烷、哌嗪和DBU，优选为哌啶。更优选地，Fmoc去保护使用20％的哌啶在DMF中的溶液进行。
在本发明的另一个优选方面，所述α-氨基保护基团在酸性条件下切除。具体地，Boc保护基团通过用强酸性溶液例如用三氟乙酸(TFA)、盐酸(HCl)或磷酸(H3PO4)处理进行切除。更优选地，Boc去保护在从树脂切下所述肽或肽片段期间，通过用根据树脂类型而选择的基于TFA的混合物处理来进行。例如，对于Wang树脂而言使用混合物TFA/水/苯酚/TIS(v/v/v/v 88/5/5/2)，其中TIS是也如下文所述的清除剂。
在本发明的优选方面，在所需肽片段或最终肽已按照如上所述的SPPS或CSPPS获得并附连到其固相支持物之后，进行最终的去保护和/或从此类固相支持物上的切下。优选地，这个步骤在酸性或微酸性条件下使用为所使用的树脂个性化定制的特定混合物来进行。
在使用CTC树脂时，所述切割步骤优选地通过使用HFIP:DCM(30:70v/v)的混合物或1-2v/v％的TFA在DCM中的溶液处理来进行。具体地，当在片段A或另一个片段的制备中使用CTC树脂时，这种切割不移除α-氨基保护基团也不移除侧链保护基团，因此得到完全受保护的片段，已准备好在其游离C-末端羧酸处进行反应。
在使用Wang树脂时，使用包含TFA和清除剂的切割混合物的处理既提供了包括X2组成部分去保护在内的侧链去保护，也提供了从树脂的切下。具体地，当在片段B的制备中使用Wang树脂时，最终的切割产生粗品GLP-1类似物。清除剂是能够在切割环境中将敏感的去保护的侧链、例如精氨酸残基的敏感的去保护的侧链的修饰或破坏降至最低的物质，例如苯甲醚、苯甲硫醚、三异丙基甲硅烷(TIS)、1,2-乙二硫醇和苯酚。这种切割/去保护步骤优选地使用具有例如v/v/v/v 90/5/2/3组成的TFA/苯甲硫醚/苯甲醚/十二硫醇的混合物或具有例如v/v/v/v 88/5/5/2组成的TFA/水/苯酚/TIS的混合物来进行。
在本发明的优选方面，通过从树脂切割而获得的粗品肽，不论是片段还是最终的GLP-1类似物，经纯化以提高其纯度。
为此目的，将所述肽的溶液加载到具有适合的固定相、优选为C18或C8修饰的二氧化硅的HPLC柱上，并将包含有机溶剂、优选为乙腈或甲醇的水性流动相通过所述柱。如有必要，使用所述流动相的梯度。收集具有所需纯度的肽并任选地将其冷冻干燥。
因此，本发明提供了在固相合成中制备利拉鲁肽或索马鲁肽的汇集方法，其中所述方法包括至少一个受保护的N-末端假脯氨酸片段A与受保护的C-末端片段B的最终偶联，然后进行同时或顺序的去保护和从固相支持物的切割，并任选地通过层析进行最终纯化。
本发明还提供了中间体片段A和B以及它们的制备方法。
在一个方面，片段A是所需GLP-1类似物肽的N-末端片段，在其C-末端反应活性部位处具有假脯氨酸。在优选情况下，片段A在其α-氨基处被保护，甚至更优选地用Boc基团保护。在另一个优选方面，片段A在其侧链官能团处用适合的保护基团保护。
片段A选自：
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(ψz,zpro)，其被称为片段A(1-8)，
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(ψz,zpro)，其被称为片段A(1-11)，
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(ψz,zpro)，其被称为片段A(1-12)，
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(ψz,zpro)，其被称为片段A(1-7)，
和
His-X1-Glu-Gly-Thr(ψz,zpro)，其被称为片段A(1-5)，
其中对于利拉鲁肽而言X1是Ala，对于索马鲁肽而言X1是Aib，并且
其中(ψz,zpro)表示所使用的假脯氨酸，并具有上文所定义的含义。
优选地，片段A选自：
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(ψMe,Mepro)，
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(ψMe,Mepro)，
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(ψMe,Mepro)，
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(ψMe,Mepro)，
和
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr(ψMe,Mepro)，
其中X1和(ψMe,Mepro)如上文所定义。
更优选地，为了制备利拉鲁肽，片段A选自：
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH，
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(ψMe,Mepro)11-OH，
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)12-OH，
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(ψMe,Mepro)7-OH，
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(ψMe,Mepro)5-OH，
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH，
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(ψMe,Mepro)11-OH，
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)12-OH，
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(ψMe,Mepro)7-OH，和
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(ψMe,Mepro)5-OH。
甚至更优选地，片段A是
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH，也被称为片段4，其是特定形式的片段A(1-8)。
在另一个实施方案中，提供索马鲁肽的制备，片段A优选为
Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(ψMe,Mepro)，
并且更优选为
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH，也被称为片段7，其是特定形式的片段A(1-8)。
片段A通过逐步SPPS或通过LPPS来制备。例如，通过始于在树脂上加载适合的C-末端假脯氨酸二肽例如Fmoc-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH，随后通过一个接一个地偶联序列氨基酸，通过交替的偶联和α-氨基去保护步骤延伸所述肽链，在固相中制备片段A。
优选地，在片段A的制备中使用在CTC树脂上的逐步Fmoc SPPS，并且所述合成通过使用Boc保护的最后一个氨基酸即Boc-His(Trt)-OH来完成。在其序列已被完成后，将片段A从所述固相支持物上切下，同时保留α-氨基和侧链保护基团两者。
作为片段A的制备实例，片段4和片段7的制备描述在本申请的实施例中。
类似地，上文定义的所有片段A以相似的方式制备。
在另一个实施方案中，片段B是所需GLP-1类似物肽的C-末端片段，其被结合到固相支持物，优选为Wang树脂。在另一个优选实施方案中，所述固相支持物是MBH树脂。
片段B选自：
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Wang树脂，
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Wang树脂，
Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Wang树脂，
Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Wang树脂，
和
Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Wang树脂，
其中
对于利拉鲁肽的合成而言，X2是N-(1-氧代十六烷基)-L-γ-谷氨酰基(Pal-Glu)，并且
对于索马鲁肽的合成而言，X2是N-(17-羧基-1-氧代十七烷基)-L-γ-谷氨酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基。
优选地，为了制备利拉鲁肽，片段B选自：
H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂，其也被称为片段3，
H-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂，
H-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂，
H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂，
和
H-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂。
甚至更优选地，为了制备利拉鲁肽，片段B是
H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂，也被称为片段3，其是特定形式的片段B(9-31)。
在另一个实施方案中，提供索马鲁肽的制备，片段B优选为
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)16-CO-γGlu-OR’)-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，
其中R和R’相同或不同，并且是羧酸保护基团，优选为酯；
更优选地，片段B是
H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-MBH树脂，也被称为片段6，其是特定形式的片段B(9-31)。
片段B通过逐步SPPS或通过CSPPS或通过LPPS制备。例如，通过始于在树脂上加载受保护的C-末端氨基酸即Gly31，随后通过一个接一个地偶联序列氨基酸，通过交替的偶联和α-氨基去保护步骤延伸所述肽链，在固相中制备片段B。或者，片段B通过偶联两个或更多个肽片段，通过CSPPS制备。
在本发明的优选实施方案中，片段B的制备包括按照方案2将适合的N-末端片段C偶联到C-末端片段D：
Figure BDA0003011436750000181
片段D通过Gly31附连到固相支持物，并且优选地在其氨基酸侧链处受保护。在本发明的优选实施方案中，片段D是
Gln17-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31-树脂，也被称为片段D(17-31)或SEQ ID No 13。
片段C是选自下述的适合的片段：
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly，其被称为片段C(9-16)或SEQ ID No14，
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly，其被称为片段C(12-16)或SEQ ID No 15，
Tyr-Leu-Glu-Gly，其被称为片段C(13-16)或SEQ ID No 16，
Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly，其被称为片段C(8-16)或SEQ ID No17，
和
Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly，其被称为片段C(6-16)或SEQID No 18。
片段C具有C-末端甘氨酸，其在上文讨论的条件下方便地反应以形成所需的酰胺键。片段C也优选地在其氨基酸侧链处及其α-氨基处受保护。
片段C优选地选自：
Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，
Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，
和
Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH。
最优选地，片段C是
Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，也被称为片段2。
正如将在本申请的实施例中描述的，该片段C方便地用于利拉鲁肽和索马鲁肽两者的制备。
在本发明的更优选实施方案中，
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-Wang树脂通过片段C(9-16)+片段D(17-31)偶联策略获得，优选地通过将
Asp9-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly16-OH
与
H-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31树脂偶联获得，
其中
对于利拉鲁肽的合成而言，X2是N-(1-氧代十六烷基)-L-γ-谷氨酰基，并且
对于索马鲁肽的合成而言，X2是N-(17-羧基-1-氧代十七烷基)-L-γ-谷氨酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基；
并且其中所述树脂优选为Wang树脂。
在甚至更优选实施方案中，在制备利拉鲁肽时，优选的片段3(即H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂)通过片段C(9-16)+片段D(17-31)偶联策略获得，优选地通过将
Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH(片段2)
与
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu-(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂(片段1，特定的片段D(17-31))偶联获得。
然后将由此获得的α-氨基受保护的片段B(9-31)如上所述在碱性条件下处理以切除Fmoc基团，提供如上所定义的片段3。
在另一个优选实施方案中，在制备索马鲁肽时，优选的片段6(即H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-MBH树脂)通过片段C(9-16)+片段D(17-31)偶联策略获得，优选地通过将
Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH(片段2)
与
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-MBH树脂(片段5，特定的片段D(17-31))偶联获得。
然后将由此获得的α-氨基受保护的片段B(9-31)如上所述在碱性条件下处理以切除Fmoc基团，提供如上所定义的片段6。
作为片段B的制备实例，片段3和片段6的制备描述在本申请的实施例中，包括片段1、片段5和片段2的制备。
类似地，上文定义的所有片段B通过如上所定义的适合的片段C和适合的片段D的偶联制备。
制备利拉鲁肽的方法的最优选实施方案是根据权利要求1所述的方法，其中：
片段A是His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(ψz,zpro)，其被称为片段A(1-8)，
更优选为Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH，也被称为片段4；并且
片段B是Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，其被称为片段B(9-31)，
更优选为H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂，也被称为片段3。
在这种背景下，最优选地片段C是Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly，其被称为片段C(9-16)，更优选为Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，也被称为片段2；并且
片段D是Gln17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31-树脂，其也被称为片段D(17-31)，
更优选为H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu-(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂，也被称为片段1。
制备索马鲁肽的方法的最优选实施方案是根据权利要求1所述的方法，其中，
片段A是His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(ψz,zpro)，其被称为片段A(1-8)，
更优选为Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH，也被称为片段7；并且
片段B是Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)16-CO-γGlu-OR’)-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，其被称为片段B(9-31)，
更优选为H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-MBH树脂，也被称为片段6。
在这种背景中，最优选地片段C是Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly，其被称为片段C(9-16)，更优选为Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，也被称为片段2；并且
片段D是Gln17-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)16-CO-γGlu-OR’)-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31-树脂，其也被称为片段D(17-31)，其中R和R’相同或不同，是羧酸保护基团，优选为酯，
更优选为H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-MBH树脂，片段5。
上述用于制备GLP-1类似物的汇集的基于片段的方法提供了所需的树脂结合的最终肽，将其用同时或顺序的去保护和/或切割步骤进行处理以获得粗品肽，所述粗品肽任选地被进一步纯化。
缩略语
SPPS 固相肽合成
LPPS 液相肽合成
CSPPS 汇集固相肽合成
CTC 2-氯-三苯甲基氯
MBH 4-甲基二苯甲基
4-MeO-BH 4-甲氧基二苯甲基
AEEA 2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基
Fmoc 9-芴基甲氧基羰基
Boc 叔丁氧基羰基
Trt 三苯甲基(三苯基甲基)
tBu 叔丁基
Pbf 2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基
eq. 当量
h 小时
min 分钟
HPLC 高效液相色谱
DIEA/DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DBU 1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
TFA 三氟乙酸
TIS 三异丙基甲硅烷
Ac2O 乙酸酐
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMA N,N-二甲基乙酰胺
DCM 二氯甲烷
THF 四氢呋喃
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
MTBE 甲基-叔丁基醚
DIPE 二异丙基醚
MeOH 甲醇
HFIP 六氟-2-丙醇
TBDMS 叔丁基-二甲基-甲硅烷基
DIC N,N’-二异丙基碳二亚胺
DCC N,N‘-二环己基碳二亚胺
EDC N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
NHS N-羟基琥珀酰亚胺
TBTU O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基四氟硼酸脲
HBTU O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基六氟磷酸脲
HATU 2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲
PyBOP (苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基六氟磷酸鏻
OxymaPure 2-氰基-2-羟基亚氨基-乙酸乙酯
Oxyma-B 5-(羟基亚氨基)1,3-二甲基嘧啶-2,4,6-(1H,3H,5H)-三酮
TX-100 Triton X-100，也被称为聚乙二醇叔辛基苯基醚
实施例
根据本发明，适用于制备利拉鲁肽和索马鲁肽的详细实验参数由下述实施例提供，所述实施例旨在说明而不是限制本发明的所有可能实施方案。
实施例1
利拉鲁肽的制备
步骤1.片段1即片段D(17-31)的制备
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂
Figure BDA0003011436750000231
在室温下使用0.25g Wang树脂(0.75mmol/g)，通过逐步Fmoc SPPS进行所述肽片段1的合成。在将所述树脂在2ml DMF中溶胀后，添加DMF中的Fmoc-Gly-OH、DIC和DMAP(相对于树脂的载量分别为4eq、2eq和0.1eq)。1h后，通过用DMF/DIPEA/Ac2O混合物(v/v/v 5/2/1)处理30分钟将树脂的未反应的羟基封端。使用DMF中的20％哌啶溶液(2×2ml，5min和15min)进行Fmoc去保护，并将树脂用DMF(4×2ml)清洗。通过Fmoc去保护后收集的溶液的UV吸收测量检测取代度，结果为0.53mmol/g。将Fmoc保护的氨基酸(相对于树脂的载量四倍过量)用DIC(4eq)和2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(OxymaPure，4eq)的混合物预活化，并在60min内相继偶联到所述树脂。通过茚三酮试验监测偶联的完成。在反应不完全的情况下，重复所述偶联。为了将Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH引入到肽序列中，使用3eq和1.5eq棕榈酰化二肽进行两次偶联(分别为9h和5h)。在每次偶联结束时，将未反应的肽链在DIPEA(10eq)存在下用乙酸酐(10eq)酰化。使用DMF中的20％哌啶溶液(2×2ml，5min和15min)进行中间体Fmoc的去保护，然后用DMF(4×2ml)清洗所述树脂。在合成完成后，将树脂用DCM清洗并干燥。
步骤2.片段2即片段C(9-16)的制备
Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH
Figure BDA0003011436750000241
使用2-氯三苯甲基氯树脂(CTC树脂)(0.25g，1.6mmol/g)，通过逐步SPPS进行所述肽片段的合成。在将所述树脂用3ml DCM溶胀后，添加DCM中的Fmoc-Gly-OH和DIEA(相对于树脂的载量分别0.8eq和3eq)。将所述反应混合物搅拌1小时并过滤掉溶剂。将所述树脂的未反应部位用DCM/DIPEA/MeOH混合物(v/v/v 17/2/1)封端30分钟。在用DCM(3×5ml)清洗后，将树脂用DCM/DIPEA/Ac2O混合物(v/v 5/2/1)处理30分钟。通过Fmoc去保护后溶液的UV吸收测量检查树脂的载量，结果为1.08mmol/g。然后将Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH(相对于树脂的载量三倍过量)用DIC(三倍过量)和OxymaPure(三倍过量)预活化，并在60min内相继偶联到树脂。使用DMF中的20％哌啶溶液(2×2ml，5min和15min)进行中间体Fmoc的去保护，然后用DMF(4×2ml)清洗所述树脂。在合成完成后，将树脂用DCM清洗。通过用1ml DCM中的1％TFA处理2min将受保护的肽从树脂上切下，并将所述溶液过滤到2ml甲醇中的10％吡啶溶液中。将所述程序重复4次。然后将树脂用DCM(3×2ml)、甲醇(3×2ml)清洗，并将合并的溶液浓缩至5％的体积。通过在冰冷却浴下添加水将所述受保护的八肽沉淀，过滤，用水清洗几次并干燥。产量：330mg(90％)，HPLC纯度为91％。
步骤3-a.片段1和片段2的缩合：片段3即片段B(9-31)的制备
H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂
Figure BDA0003011436750000251
将在步骤1中获得的肽片段1在2ml DMF中溶胀。将受保护的片段2(180mg，0.13mmol，1eq)溶解在7ml DMF中，用DIC(16mg，0.13mmol)、OxymaPure(40mg，0.27mmol)预活化并偶联到片段1。将所述反应在40℃下搅拌并使用HPLC监测。在40℃下添加另外1eq预活化的肽片段2(180mg，0.13mmol)并搅拌，以完成缩合。然后将树脂用DMF(2×2ml)清洗，并将残留的未反应的氨基官能团用DMF中的10％Ac2O溶液(2ml，30min)封端。
最后，使用DMF中的20％哌啶溶液(2×2ml，5min和15min)除去Fmoc保护基团，然后将所述树脂用DMF(3×2ml)清洗。
步骤3-b.在清洁剂存在下片段1和片段2的缩合：片段3即片段B(9-31)的制备
H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂
将在步骤1中获得的肽片段1在2ml混合物DMF:DCM 50:50v/v+1％Triton X-100(TX-100)中溶胀。将受保护的片段2(267mg，0.195mmol，1.5eq)溶解在5.3ml DMF:DCM 50:50v/v+1％TX-100中，用DIC(24.6mg，0.195mmol)、OxymaPure(27.7mg，0.195mmol)预活化并偶联到片段1。将所述反应在40℃下搅拌并通过HPLC监测。然后将树脂用2ml DMF:DCM50:50v/v+1％TX-100并用DMF(2x 2ml)清洗。将残留的未反应的氨基官能团用DMF中的10％Ac2O溶液(2ml，30min)封端。
最后，使用DMF中的20％哌啶溶液(2×2ml，5min和15min)除去Fmoc保护基团，然后将所述树脂用DMF(3×2ml)清洗。
步骤4.片段4即片段A(1-8)的制备
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH
Figure BDA0003011436750000261
肽片段4以与步骤2中所述相似的方式制备。首先，在DCM中的DIEA(3eq)存在下进行Fmoc-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH(0.8eq)与CTC树脂(0.25g，1.6mmol/g)的附连，以提供0.96mmol/g的载量。然后将Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH(相对于树脂的载量三倍过量)在用DIC(3eq)和OximaPure(3eq)预活化后，在60min内相继偶联到树脂。使用DMF中的20％哌啶溶液(3×2ml，3min)进行第一次Fmoc去保护，然后用DMF(4×2ml)清洗所述树脂。为了将其他氨基酸Fmoc去保护，使用DMF中的20％哌啶溶液进行两次处理(5min和15min)。使用与前述相同的程序(参见步骤2)将所述受保护的八肽从所述树脂上切下。产量：270mg(80％)，HPLC纯度为87％。
步骤5-a.片段3和片段4的缩合：利拉鲁肽(1-31)的制备
将在步骤3(3-a或3-b)中获得的Fmoc去保护的肽基树脂承载的片段3在2ml DMF中溶胀。将受保护的片段4(272mg，0.20mmol，1.5eq)溶解在7ml DMF中，用DIC(16mg，0.13mmol)、OxymaPure(40mg，0.27mmol)预活化并偶联到片段3。将所述反应在40℃搅拌并使用HPLC监测。添加另外1.5eq预活化的片段3(270mg，0.20mmol)并在40℃搅拌，以完成所述缩合。然后将树脂用DMF(2×2ml)清洗，并将残留的未反应的氨基官能团用DMF中的10％Ac2O溶液(2ml，30min)封端。然后将树脂最后用DCM(2ml)清洗两次并干燥。
步骤5-b.在清洁剂存在下片段3和片段4的缩合：利拉鲁肽(1-31)的制备
将在步骤3(3-a或3-b)中获得的Fmoc去保护的树脂承载的片段3在2ml混合物DMF:DCM 50:50v/v+1％TX-100中溶胀。将受保护的片段4(270mg，0.195mmol，1.5eq)溶解在2.7ml DMF:DCM 50:50v/v+1％TX-100中，用DIC(25mg，0.195mmol)、OxymaPure(28mg，0.195mmol)预活化并偶联到片段3。将所述反应在40℃搅拌并使用HPLC监测。然后将树脂用2ml DMF:DCM 50:50v/v+1％TX-100并用DMF(2×2ml)清洗。将残留的未反应的氨基官能团用DMF中的10％Ac2O溶液(2ml，30min)封端。然后将树脂最后用DCM(2ml)清洗两次并干燥。
步骤6.利拉鲁肽的切割和纯化
将在步骤5-a中获得的干的肽基树脂悬浮在2ml混合物TFA/水/苯酚/TIS(v/v/v/v88/5/5/2)中并搅拌4h。然后将树脂过滤并用1ml TFA清洗。收集溶液并在5ml MTBE中沉淀出粗品肽。将沉淀物用MTBE清洗几次并干燥，得到粗品利拉鲁肽，总产量为375mg(75％)并且HPLC纯度为81％。将所述粗品利拉鲁肽使用流动相A 0.1％TFA/水和流动相B 0.1％TFA/乙腈进行纯化。收集纯度高于99.0％的级分并冷冻干燥，得到纯化的利拉鲁肽。HPLC纯度：99.4％，产量112mg(30％)。
实施例2
索马鲁肽的制备
步骤1.片段5即片段D(17-31)的制备
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-MBH树脂
Figure BDA0003011436750000281
在室温下使用0.5g H-Gly-O-MBH树脂(载量0.60mmol/g)进行肽片段5的合成。将所述树脂在3ml DMF中溶胀并用于逐步Fmoc SPPS。将Fmoc保护的氨基酸(相对于树脂的载量两倍过量)用DIC(2eq)和OxymaPure(2eq)的混合物预活化3min，并在90min内相继偶联到树脂。Arg、Val、Trp、Ala24、Phe和Gln的偶联使用1eq偶联混合物重复60min。使用1.5eqFmoc-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-OH进行脂化侧链在所述肽序列中的引入，其用1.5eq DIC和1.5eq OxymaPure预活化，并在40℃下在6h内偶联。通过茚三酮试验监测所述偶联的完成。在每次偶联结束时，将未反应的肽链用DMF中的乙酸酐(3eq)乙酰化，并用DMF(3×5ml)清洗。使用DMF中的20％哌啶溶液(2×5ml，10min)进行中间体Fmoc的去保护，然后用DMF(4×5ml)清洗所述树脂。在合成完成后，将树脂用DCM清洗并干燥。
步骤2.片段2即片段C(9-16)的制备
Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH
参见实施例1的步骤2。
步骤3.在清洁剂存在下片段5和片段2的缩合：片段6即片段B(9-31)的制备
H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-MBH树脂
Figure BDA0003011436750000291
将在步骤1中获得的带有肽片段5的Fmoc去保护的树脂在4ml混合物DMF:DCM 50:50v/v+1％TX-100中在40℃溶胀。将受保护的肽片段2(765mg，0.56mmol，2eq)在7ml混合物DMF:DCM 50:50v/v+1％TX-100中的溶液用DIC(16mg，0.56mmol)和OxymaPure(88mg，0.56mmol)在40℃下预活化15min，然后将它添加到所述树脂，并将反应混合物在40℃搅拌3.5h。通过茚三酮试验监测所述偶联的完成。将未反应的肽链用DMF中的3eq乙酸酐乙酰化，然后将所述肽树脂用DMF(3×5ml)清洗。在结束时，使用DMF中的20％哌啶溶液(2×5ml，10min)除去Fmoc保护基团，然后用DMF(4×5ml)清洗所述树脂。
步骤4.片段7即片段A(1-8)的制备
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH
Figure BDA0003011436750000292
使用1g CTC树脂(载量为1.6mmol/g)进行肽片段7的合成。在将所述树脂在10mlDCM中溶胀后，添加Fmoc-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH和DIEA(相对于树脂的载量0.8eq和3eq)在5ml DCM中的溶液。将反应混合物搅拌16小时并过滤掉溶剂。所述树脂的未反应的部位使用MeOH(3eq)和DIEA(3eq)在5ml DCM中的溶液封端15分钟。在用DCM(2×10ml)清洗后，将树脂用乙酸酐(3eq)和DIEA(3eq)在10ml DCM中的溶液处理15分钟，用DMF(3×10ml)、DCM(3×10ml)清洗并干燥。通过Fmoc去保护后的溶液的UV吸收测量检查树脂的载量，结果为1.3mmol/g。然后将Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH(2eq)用2eq DIC和2eq OxymaPure预活化3min，并在90min内相继偶联到所述树脂。在His的情况下，用Oxyma-B代替OxymaPure并将预活化时间减少到0℃下1min。使用DMF中的20％哌啶溶液(2×10ml，10min)进行中间体Fmoc的去保护，然后用DMF(4×10ml)清洗所述树脂。在合成完成后，将树脂用DCM(2×10ml)清洗并干燥。通过用3ml DCM中的1.5％TFA处理2min将所述受保护的肽从所述树脂上切下，并将溶液过滤到3ml甲醇中的10％吡啶溶液中。将所述程序重复4次，并将合并的溶液浓缩到30％的体积。通过在冰冷却浴下添加水将所述受保护的肽沉淀，过滤，用水清洗几次并干燥。产量：960mg(77％)。
步骤5.片段6和片段7的缩合：索马鲁肽(1-31)的制备
将在步骤3中获得的Fmoc去保护的肽基树脂承载的片段6在2ml混合物DMF:DCM50:50v/v+1％TX-100中在40℃下溶胀。将受保护的肽片段7(780mg，0.56mmol，2eq)在7ml混合物DMF:DCM 50:50v/v+1％TX-100中的溶液用DIC(16mg，0.56mmol)和OxymaPure(88mg，0.56mmol)在40℃下预活化15min。然后将所述偶联混合物添加到所述树脂，并将反应混合物在40℃下搅拌3.5h。通过茚三酮试验监测所述偶联的完成。将未反应的肽链用DMF中的3eq乙酸酐乙酰化，并将肽树脂用DMF(3×5ml)、DCM(2×5ml)清洗并干燥。
步骤6.索马鲁肽的切割和纯化
将在步骤5中获得的干的肽基树脂悬浮在5ml混合物TFA/水/苯酚/TIS(v/v/v/v88/5/5/2)中，在0℃搅拌1h并在RT搅拌3h。然后将树脂过滤并用1ml TFA清洗。收集溶液并在25ml DIPE中沉淀出粗品肽。将沉淀物用DIPE清洗几次并干燥，得到粗品索马鲁肽，总产量为0.7g(61％)并且HPLC纯度为74％。将所述粗品索马鲁肽使用流动相A 0.1％TFA/水和流动相B0.1％TFA/乙腈进行纯化。收集纯度高于99.0％的级分并冷冻干燥，得到纯化的索马鲁肽。HPLC纯度：99.1％，产量196mg(28％)。
SEQUENCE LISTING
<110> Fresenius Kabi iPSUM S.r.l.
<120> PROCESS FOR THE MANUFACTURE OF GLP-1 ANALOGUES
<130> FK18168-05-PAT-WO
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
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<211> 31
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<213> Artificial Sequence
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)ethoxy]acetyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl)
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20 25 30
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)ethoxy]acetyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl)
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Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala
1 5 10 15
Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment B (12-31)
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Lys(Pal-Glu) or
Lys(N-(17-carboxy-1-oxoheptadecyl)-L-glutamyl-2-[2-(2-aminoethoxy
)ethoxy]acetyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl)
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Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
1 5 10 15
Arg Gly Arg Gly
20
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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)ethoxy]acetyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl)
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Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg
1 5 10 15
Gly Arg Gly
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)ethoxy]acetyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl)
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Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Xaa Glu
1 5 10 15
Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment D (17-31)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Lys(Pal-Glu) or
Lys(N-(17-carboxy-1-oxoheptadecyl)-L-glutamyl-2-[2-(2-aminoethoxy
)ethoxy]acetyl-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetyl)
<400> 13
Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
1 5 10 15
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment C (9-16)
<400> 14
Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment C (12-16)
<400> 15
Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment C (13-16)
<400> 16
Tyr Leu Glu Gly
1
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment C (8-16)
<400> 17
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fragment C (6-16)
<400> 18
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10

Claims (16)

1.制备式I的GLP-1类似物的基于片段的固相方法，
HX1EGTFTSDVSSYLEGQAAK(X2)EFIAWLVRGRG (I)
其中
X1是Ala，X2是N-(1-氧代十六烷基)-L-γ-谷氨酰基，
或者
X1是α-氨基异丁酸(Aib)，X2是N-(17-羧基-1-氧代十七烷基)-L-γ-谷氨酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基，
其中所述方法包括N-末端片段A与C-末端片段B之间的最终偶联步骤，并且其中所述N-末端片段A在C-末端反应活性部位处具有假脯氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，
其中片段A选自：
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(ψz,zpro)
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(ψz,zpro)
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(ψz,zpro)
His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(ψz,zpro)
和
His-X1-Glu-Gly-Thr(ψz,zpro)
其中X1是Ala或Aib，并且
其中(ψz,zpro)表示Ser或Thr按照下式被假脯氨酸保护：
Figure FDA0003011436740000011
其中
对于Ser，Y是氢，对于Thr，Y是Me，
Z是氢或Me，并且
R1是除了所述假脯氨酸保护的氨基酸之外的氨基酸的侧链。
3.根据权利要求2所述的方法，
其中片段A选自：
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(ψMe,Mepro)，
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(ψMe,Mepro)，
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser(ψMe,Mepro)，
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr(ψMe,Mepro)，
和
Boc-His-X1-Glu-Gly-Thr(ψMe,Mepro)，
其中X1和(ψMe,Mepro)如权利要求2中所定义，
并且其中片段A被偶联到选自下述的附连到树脂的受保护的肽片段B：
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，
Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，
Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，
和
Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，
其中
X2如权利要求1中所定义。
4.根据权利要求3所述的方法，其中片段B的制备包括将片段C与片段D偶联，其中
片段C选自：
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly，
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly，
Tyr-Leu-Glu-Gly，
Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly，
和
Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly，
并且其中片段D是
Gln17-Ala-Ala-Lys(X2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly31-树脂
其中
X2如权利要求1中所定义。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中X1是Ala，X2是N-(1-氧代十六烷基)-L-γ-谷氨酰基。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中X1是Aib，X2是N-(17-羧基-1-氧代十七烷基)-L-γ-谷氨酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基-2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基。
7.根据权利要求4所述的方法，其中片段C选自：
Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，
Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，
和
Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，
并且其中片段D是
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂，或
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-MBH树脂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中
片段C是
Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH，
并且片段D是
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂，或
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-O-MBH树脂。
9.根据权利要求3所述的方法，其中，分别地，
片段A是
Boc-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(ψMe,Mepro)，或
Boc-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser(ψMe,Mepro)，
片段B是
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala--Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，或
Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys[(ROOC-(CH2)16-CO-γGlu-OR’)-AEEA-AEEA]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-树脂，
其中R和R’相同或不同，是羧酸保护基团。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，分别地，
片段A是
Boc-His(Trt)1-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH，或
Boc-His(Trt)1-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(ψMe,Mepro)8-OH，
片段B是
H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂，或
H-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-MBH树脂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中片段B的制备包括将
Fmoc-Asp(OtBu)9-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly16-OH
与
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys(Pal-Glu-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-Wang树脂，或
H-Gln(Trt)17-Ala-Ala-Lys[(tBuOOC-(CH2)16-CO-γGlu-OtBu)-AEEA-AEEA]-Glu-(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(NinBoc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly31-MBH树脂
分别进行偶联。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述片段的偶联在N,N’-二异丙基碳二亚胺和2-氰基-2-羟基亚氨基-乙酸乙酯的存在下进行。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述片段的偶联在10-70℃的范围内、更优选地20-50℃的范围内，甚至更优选地在35-45℃的范围内的温度下进行。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述片段的偶联在清洁剂、优选为Triton X-100的存在下进行。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括所述肽的去保护和从所述树脂上切下。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过层析纯化所述肽。
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