DE1643345C3 - Glucagonderivat und Verfahren zur Herstellung von Glucagon - Google Patents

Description

Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(tBuHOtBu)
22 23 24 25 26 27 28 29

2. Verfahren zur Herstellung von Glucagon, dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid der Glucagonsequenz 7 bis 29 der Formel

H-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tliu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Arg-Arg-Ala-GIn-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Tlir(tBu)-OtBu (I)

17 IS 19 20 21 22 Ii 24 25 26 27 2K 29

mit einem Überschuß an dem Peptid der Glucigonsequenz 1 6 der Formel

AdOC-HislAdOO-SerdBul-Gln-Gly-ThrdBut-Phe-OH (H)

I 2 3 4 5 6

mittels Carbodiimiden in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid oder von N-Hydroxyphlalimid kondensiert und aus dem so erhaltenen geschützten Glucagon der Formel III die Schulzgruppen anschließend mittels Trifluoressigsäure abspaltet.

Das Protcohormon Glucagon konnte bisher syn- gar nicht zur Verfügung stehen. Somit ist eine

thetisch nicht hergestellt werden, sondern wurde aus chemische Glucagonsynthese trotz der zahlreichen

Pankreas gewonnen. Eine chemische Vollsynthese 35 Synthesestufen gegenüber der Gewinnung aus Pan-

des Glucagons, des Gegenspielers des Insulins, ist von kreas vorteilhafter, sie bedeutet für die Technik einen

großem Interesse. Sie ist auch von großer praktischer wesentlichen Fortschritt.

Bedeutung, da die aus Pankreas gewinnbaren Mengen Es wurde nun gefunden, daß man Glucagon synthe-

an Glucagon sehr gering sind. Pur eine therapeutische tisch herstellen kann, indem man das Peptid der GIu-

Verwendung des Glucagons müßten solche Mengen 4° cagonsequenz 7 bis 29 der Formel
an Pankreas bearbeitet werden, wie sie praktisch

H-ThrdBul-SerltBuJ-AspfOtBul-TyrdBul-SerltBiD-LysiBOO-TyrdBiO-Lcu-AsptOlBul-SerdBu)-

7 8 9 10 11 12 13 14 15 lh

Arg-Arg-Ala-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(lBu;-ÜtBu (1)

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 .:, 29

mit einem Uherschuß an dem Peptid der Glucagonsequenz I 6 der Formel
AdOC-HislAdOD-SerltBul-Gln-Gly-ThrdBul-Phe-OH (H)

I 2 3 4 5 6

mittels Carbodiimiden in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid oder von N-IIydroxyphtalimid kondensiert und aus dem so erhaltenen geschützten Glucagon der Formel

AdOC-HislAdOCl-SerltBiD-Gln-Gly-ThrllBiO-Phe-ThrdBul-SerttBul-AsplOtBul-TyrltBul-SerdBu)-

I 2 1 4 S fi 7 X 9 10 Il

LyslBOO-TyrdBiO-Leu-AsplOtBiD-SerltBul-Arg-Aig-Ala-Gln-AspiOtBiO-Phe-Val-Cjln-Trp-Leu-

12 13 14 15 16 17 IS 19 20 21 :? 23 24 25 2b

Mct-Asn-Thr (t BuH Ot Bu) (III)

27 2S 29

die Schutzgruppe.^ anschließend mittels Trifluorcssig- Bei der Kondensation der beiden geschilderten säure abspaltet. Bruchstücke nach dem eriindungsgenidten Verfahren Die Herstellung der als Ausgangsstoffe benötigten 65 werden Carbodiimide verwendet, vorzugsweise bc-Glucagonpeptide der Sequenzen I bis 6 sowie 7 bis 29 nutzt man das Dicyc'.ohexylcarbodiimid. Das Konwird im Anschluß an die Ausrührungsbeispiele be- densationsvcrfahren wird in üblicher Weise -lurchschrieben. geführt. Als Lösungsmittel werden vorzugsweise Di-

nethylacetamid, Phosphorsäure - tris - dimethylamid ider N-Methylpyrrolidon oder auch ein Gemisch lieser Lösungsmittel verwendet. Man beginnt bei tiefen Temperaturen, etwa -20 bis - 10 C, und läßt im Verlauf der Reaktion unter Rühren langsam auf S Zimmertemperatur kommen. Aus dem erhaltenen Reaktionsgemisch wird das Reaktionsprodukt durch teilweises Abdestillieren des oder der Lösungsmittel und Fällen mit Äther/Petroläther erhalten. Die im Überschuß eingesetzte Peptidkomponente der Se-

_enz ι bis 6 läßt sich überraschenderweise selektiv init Tetrahydrofuran aus dem amorphen Reaktionsnrodukt extrahieren. Diese vorteilhafte Reinigungsmethode, die wesentlich zum Gelingen einer technisch verwertbaren Glucagonsynthese b-iträgt, war nicht zu erwarten, da alle anderen in der Peptidchemie verwendeten Lösungsmittel für diese spezielle Reimiiung versagten.

Die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens, die Abspaltung der Schutzgruppen, erfolgt mittels Trifluoressigsäure unter den üblichen Reaktions-

bedinnungen. . . .

Die" Kondensation zur Synthese eines biologisch aktiven Glucagons kann nicht mit beliebig gewählten Peotidbruchstücken durchgeführt werden; z. B. ist es nicht möglich, die Glucagonsequenz durch Konden-Sn defpeptidbruchstücke 1 8 +^9-29 nach der Azidmethode aufzubauen, obwohl sich dieses Kondensationsschema nach den in der Peptidchemie vorl.enenden Erfahrungen wegen des carboxylendstandigen Serins als besonders geeignet anbot. Auch bei der erfindungseemäß gewählten Kondensation aus den Bruchslücken 1 6 + 7-29 lassen sich die sonst .n der Peptidchemie üblichen Kondensationsverfahren nicht anwenden, lediglich die geschilderte Kondensationsmethode Führte zum Ziel.

Auf Grund der Bedeutung des Glucap.ors bei der Regulierung des Blutzuckerspiegels kann dieses Peptid in der Therapie Verwendung finden. ....

In den nachstehenden Beispielen werden die Aminosäuren in der üblichen Weise abgekürzt. Die Schutzgruppen bedeuten:

-OSU = —Ο—Ν

AdOC = < *

O—CO-

BOC CIl, C

CW,

IBu

CH, , C

CH.,

NPS

\ CW₂ -O CO

NO₁

ONP = --Ο-

NO, Hinter den Verbindungen ist in Klammern die Position der Peptide in der Glucagonsecjuenz angegeben.

Beispiel

a) Geschütztes Glucagon (Sequent I -29)

Ni.,N(im)-Di-adamantyloxycarbonyl-L-histidyl-

O-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-

O-tert.-butyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-

O-tert.-butyl-i -threonyl-O-tert.-buiyl-i-seryl-

L-asp„rat.yl!,.'-tert.-butylester)-O-tert.-butyl-i.-tyrosyl-

O-tert.-butyl-i.-seryl-Nf-tert.-butyl-oxycarbonyl-

l -lysyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-asparagyl-l^'-tert.-butylestcrl-O-iert.-butyl-

L-seryl-i.-arginyl(hydrobroniid)-

i.-arginyl(hydrobromid)-i.-alanyl-L-glutaminyl-

i.-asparagyl(, i-tert.-but ylestcr)-1 -ph enylalanyl-

i.-valyl-i -glutaminyl-i -tryptophyl-: -leucyl-

i-mcthionyl-i-asparaginyl-O-tert.-butyl-

i.-threonin-tert.-butylester (1 29)

1,9 g H-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu) - Lvs(BOC) - T\r(tBu) - Leu - Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(HBr)-Arg(HBr)-Ala-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Vai-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(tBu)-OtBu · HBr (7 - 29-Hydrobromid) und 2,36 g AdOC-His(AdOC)-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (1 ■«) und 0,345 g N-Hydroxysuccinimid werden in 40 cm' frisch destillierten Dimethylacetamid Phosphorsäure-tris-dimcthylamid (1:1) unter Rühren gelöst. Die erhaltene Lösung wird anschließend mit 0.07 cm³ Triathylamin versetzt, auf -15 C abgekühlt, nach Zugabe von 0,618 g Dicyclohexylcarbodiimid 24 Stunden bei 0 bis 5" C und weitere 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird /ur Reaktionsmischung nochmals 0,6 g AdOC-His(AdOC)-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (1 6). 0 06 g N-Hydroxysuccinimid und 0,103 g Dicyclohexylcarbodiimid zugefügt, der Ansatz weitere 2 Tage unter Rühren belassen. Man erwärmt 30 Minuten lan^ auf 60 C. nitriert und dampft anschließend Dimelhylacetamid bei 50 C und 10 ¹ Torr ab: die verbleibende Lösung läßt man in 1.5 1 absolutem Diathyläther einfließen.

Nach 3stündigcm Stehenlassen wird der Niederschlag abfiltrierl und mit absolutem Diathyläther sorgfältig nachgewaschen. Das erhaltene Produkt wird 3mal mit heißem Essigester und anschließend 2mal mit bideslillierteni Wasser digeriert, im Vakuum kurz getrocknet und letztlich 17 Stunden lang im Soxhlet-Apparat mit absolutem Tetrahydrofuran erschöpfend extrahiert. Nach 15stündigem Trocknen bei 80 C und 10"² Torr über P₂O₅: weißes amorphes Pulver.

Ausbeute: 2,06 g (84% der Theorie). C₂₃₂H₃₆₇N₄₃O₅₅Br₂S + 6H₂O (4938,826):

Berechnet ... C 56,42, H 7,74, N 12,20, O 19,76; gefunden .... C 55,91, H 7,39, N 12,31, O 19,61.

Aminosäureanalyse:

	Hi5	Ser	GIu	GIy	Thr
Berechnet	1 0,87	4 3,51	3 3.06	1 0,98	3 2,77
gefunden

	Arg	Phe	Asp	Tyr	Lys	Leu
Berechnet . gefunden ..	2 1,99	2 1,96	4 3,90	2 1J5	1 0,91	2 1,92
	AIa	VaI	Trp	Mm	NH3
Berechnet gefunden	1 1,02	1 1,01	1	1 0,90	4 5,02

	Phe	Asp	Tyr	Lys	Leu
Berechnet	2 1,97	4 3.97	2 1.75	1 0,94	2 1.95
gefunden

Berechnet
gefunden

Arg 2 2,0

AIa 1 1,02

VaI 1 1,04

Trp 1

Md 1 0,94

b) Glucagon (Sequenz 1 29)

L-Histidyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-asparagyl- L-tyrosyl-L-seryl-L-lysyl-L-tyrosyl-L-leucyl-

L-asparagyl-L-seryl-L-arginyl-L-arginyl-L-alanyl-L-glutaminyl-L-asparagyl-L-phenylalanyl-L-valyl- L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-methionyl-L-asparaginyl-L-threonin (1 -29)

0,5 g AdOC - His(AdOC) - Ser(tBu) - GIn - GIy-Thr(tBu) - Phe - Thr(tBu) - Ser(tBu) - Asp( OtBu)-Tyr(tBu) - Ser(tBu) - Lys(BOC) - Tyr(tBu) - Leu-Asp(OtBu) - Ser(tBu) - Arg(HBr) - Arg(HBr) - AIa - GIn-Asp(OtBu) - Phe - VaI - GIn - Trp - Leu - Met - Asn-Thr(tBu)-OtBu (1—29) werden mit 10 cm³ wasserfreier Trifluoressigsäure Übergossen und unter Argon-Atmosphäre 2 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen; hierbei erfolgt Lösung. Anschließend wird die Trifluoressigsäure bei möglichst tiefer Temperatur (Badtemperatur max. 15° C) im Vakuum (10~² Torr) abgezogen, der verbleibende Rückstand mit einer wäßrigen Aufschlämmung von v>Dowex^(S4« (OH-Form) 1 Stunde lang und nach Ansäuern mit Essigsäure auf etwa pH = 4 weitere 10 Minuten gerührt. Das Filtrat vom Ionenaustauscher wird lyophilisiert; das erhaltene Material in eiskaltem Wasser aufgenommen, von wenig Unlöslichem abfiltriert und erneut lyophilisiert: weißes amorphes Pulver.

Ausbeute: 380 mg (Roh-Glucagon).

Q53H225N43O49S + X H₂O.

Aminosäureanalyse:

	His	Scr	GIu	GIy
Berechnet ...	1 0,85	4 3,48	3 2,94	1 0,99
gefunden

Herstellung der Ausgangspeptide
A. Sequenz 1—6

1. Benzyloxycarbonyl-0-tert.-butyl-L-threonyl-L-phenylalanin-methylester (5—6)

Zu einer Lösung von 70 g (226 mMol)
Z-Thr(tBu)-OH (5)

NH, in 500 cm³ Dichlormethan werden bei - 5 C nachem-

ander 31,4 cm³ Triäthylamin, 29 g (227 mMol) H-Phe-OME · HCl (6-Hydrochlorid) und 51 g

50 ²⁵ (²^ mMol) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Man rührt die Reaktionsmischung 4 Stunden bei - 5° C und weitere 10 Stunden bei Raumtemperatur. Das Filtrat vom Dicyclohexylharnstoff wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand zwischen Essigester und Wasser verteilt, die abgetrennte organische Phase wie üblich mit verdünnter Citronensäure-, Kaliumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Eindampfen im Vakuum erhält man ein öl. das mehrere Stunden im Hochvakuum getrocknet wird. Ausbeute 80,0 g (75% der Theorie).

2. O-tert.-Butyl-L-threonyl-L-phenylalanylmethylester-hydrochlorid (5 6)

80,0g(170mMol)öligenZ-Thr(tBu)-Phe-OMe(5 --6) in 400 cm³ Methanol werden wie üblich unter Zutropfen von n-methanolischer Salzsäure bei pH = 4 hydriert. Das Filtrat vom Katalysator wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand aus Methanol/Diäthyläther umkristallisiert: Schmp. 162 bis 163C; («K : +26,6 ± Γ bzw. («)? : +33,1' (c = 1,3; in Äthanol). Chromatog. rein in tert.-Butanol/Eisessig/ Wasser/Pyridin (30:6:24:20) bzw. tert.-Butanol/Eisessig/Wasser (6:2:2). Ausbeute 59,1g (93% der Theorie).

C₁₈H₂₈N₂O₄ ■ HCl (372,9):

Berechnet ... C 57.98, H 7,84, N 7,51;
gefunden .... C 57,79. H 7,85, N 7,31.

3. Benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycinmethylester (3—-4)

Zu 84,0 g (0,3MoI) Z-GIn-OH (3) und 41,7 cm³ Triäthylamin in 400 cm³ Tetrahydrofuran Acetonitril 6o(l:l) werden bei -15°C unter Rühren 28,6cm³ Chlorameisensäureäthylester langsam zugetropft. Zur Reaktionsmischung fügt man 37,8 g (etwa 0,3 Mol)

H-GIy-OMe · HCl (4-Hydrochlorid) und 41,7 cm³ Tri-

, _hr äthylamin in 200 cm³ Dimethylformamid, rührt 1 Stunde bei -10⁰C und weitere 4 Stunden bei Raumtemperatur. Danach destilliert man die Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Rückstand wird mit 1000 cm^{3 2}·⁶⁸ 0,5n-HCl behandelt, das gebildete feste Material

10

abfiltriert, anschließend mit 0,5 n-Kaliurnhydrogencarbonat-Lösung digeriert, erneut auf das Filter gebracht und mit Wasser gut gewaschen. Das im Vakuum über P₂O₅ getrocknete Produkt wird letztlich aus Methanol umkristallisiert: Schmp. 174,5 bis 175,5° C; («)·?: -16,2 ± 1 ° bzw. («)&: -18,8° (c = 0,8; in Äthanol); («)?f: -6,6 ± Γ bzw. (u)l°.₆: -7,7° (c = 1; in Eisessig). Ausbeute 80,3 g (76% der Theorie).

C₁₆H₂₁N₃O₆ (351,4):

Berechnet ... C 54,70, H 6,02, N 11,96;
gefunden .... C 54,48, H 6.11, N 11,71.

4. L-Glutaminyl-glycin-methyles'ierhydrochlorid (3—4 Hydrochlorid)

Eine Aufschlämmung von 88,0 g (235 mMol) Z-Gln-Gly-OMe (3—4) in 400 cm³ Methanol wird in Gegenwart von Palladiumschwarz und unter Zutropfen von n-methanolischer Salzsäure bei pH 4 12 Stunden wie üblich hydriert. Das Filtrat vom Katalysator wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand aus absolutem Äthanol umkristallisiert: Schmp. 110 bis 113°C; («)i: +16,6il° bzw. (a)&: +19,3° (c = 2,3; in Methanol). Ausbeute 56,3 g (94,5% der Theorie).

C₈H₁₅N₃O₄ HCl (253,7):

Berechnet ... C 37,87, H 6,36, N 16,56, Cl 13,98; gefunden .... C 37,66, H 6,32, N 16,38, Cl 13,97.

5. Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminylglycin-methylester (2—4)

Zu 62,5 g (212 mMol) Z-Ser(tBu)-OH (2). hergestellt nachthem. Ber. 99. 105 (1966), und 29.4 cm³ Triäthylamin in 400 cm³ Tetrahydrofuran werden bei -10 C unter Rühren 20,2 cm³ Chloramcisensäureäthylester zugetropft, zur erhaltenen Lösung des asymmetrischen Anhydrids 53.6 g (212 mMol) H-Gln-Gly-OMe ■ HCl (3 4-Hydrochlorid) und 29,4 cm³ Triäthylamin in 300 cm' Dimethylformamid zugegeben. Man rührt die Reaktionslösung 1 Stunde bei -10- C. dann 2 Stunden bei Raumtemperatur und dampft anschließend im Vakuum ein. Der erhaltene Rückstand wird mit verdünnter Citronensäure-Lösung behandelt, das gebildete feste Produkt auf das Filter gebracht, mit Wasser säurefrei gewaschen, im Vakuum über P₂O₅ getrocknet und letztlich aus Äthanol umkristallisiert: Schmp. 185 bis 186 C: («) : -9.2 ±0.5 bzw. («),«: -10.7 (c = 1.6: in Äthanol); («)": — 15.6 ± 1 bzw.(«)₅«: -18.9 U = I: in 80%iger Essigsäure), nach Trocknen bei 90 C und 10 ~³ Torr. Chromatog. rein in η-Amylalkohol Pyndin "Wasser (35:35:30). Ausbeute 83.6 g (80% der Theorie).

C₂₃H₃₄N₄O₈ (494.6):

Berechnet ... C 55,86. H 6.93. N 11.33:
gefunden .... C 55.68. H 7.01. N 11.35.

6. Benzyloxycarbonyl-O-tcrt.-butyl-i -seryl- _fc

L-glutaminyl-gKt. in (2 —4)

32.7 g (66 mMol) Z-Ser(tBu)-Gln-Gly-OMe (2 4) in 150 cm³ Dioxan werden mit 66 cm³ n-Natronlauge wie üblich verseift. Nach Ansäuern mit 66 cm³ n-Schwefelsäurc wird die Lösung im Vakuum bis zur 6j Trockene eingedampft, der Rückstand mit Aceton behandelt, wobei Natriumsulfat ungelöst bleibt. Das im Vakuum eingedampfte Filtrat hinterlaßt einen festen Rückstand, der aus wenig Wasser umkristallisiert wird:Schmp. 158 bis 159°C(145°);(«)2>: -9,0 ± 1° bzw. (n)li₆ : -10,3° (c = 1,2; in Äthanol). Chromatog. rein in tert.-Bulanol / Eisessig/ Wasser/ Pyridin (30:6:24:20). Ausbeute 29,2 g (90% der Theorie).

C₂₂H₃₂N₄O₈

Berechnet .
gefunden ..

H₂O (489,5):

C 53,98, H 6,80, N 11,43; C 54,06. H 6,89. N 11,39.

7. Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-O-tert.-butyl-L-threonyl- i-phenylalanin-methylester (2—6)

Zu 42,2 g(88 mMol)Z-Ser(lBu)-Gln-Gly-OH(2 4) und 12,25 cm³ Triäthylamin in 300 cm³ Dimethylformamid werden bei -5 C 32,9 g (88 mMol) H-Thr(tBu)-Phe-OMe ■ HCl (5 -6-Hydrochlorid), 15,2 g (132 mMol) N-Hydroxysuccinimid und 20,0 g (97 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Die Reaktionsmischung wird 4 Stunden bei - 5° C und 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfillriert und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird nacheinander mit 5%iger Citronensäure-bzw. 10%igcr Kaliumhydrogencarbonat-Lösung digeriert, auf das Filter gebracht und sorgfältig mit Wasser gewaschen. Nach Umkristallisieren aus 70%igem Methanol: Schmp. 178.5 bis 181.5⁰C; («)·''· +5,4 ±1 bzw. (u)U_e: +6.5 (f = 1,1: in Methanol). Chromatogr. rein in n-Heptan n-Butanol Eisessig (3:1:1) bzw. n-Propanol Essigester Wasser (7:1:2). Ausbeute 65 g (93% der Theorie).

C₄₀H_3xN₆O₁₁ (798,9):

Berechnet ... C 60.13, H 7.32. N 10.52. O 22.03: gefunden .... C 60.07, H 7.28. N 10.60. O 21,99.

8. Ben/yloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L-gluiaminyl-glycyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-

L-phenylalanin (2 h5)

Die Lösung von 20,0 g (25 mMol) Z-Scr(tBu)-Gln-Gly-ThrUBu)-Phe-OMe (2- 6) in 40 cm³ Dioxan wird mit 25.5 cm³ η-Natronlauge innerhalb 30 Minuten wie üblich verseift. Nach Ansäuern mit 25.5 cm³ η-Salzsäure entfernt man das Dioxan weitgehend im Vakuum: beim Stehenlassen der Restlösung bei + 2 C tritt Kristallisation ein. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert. über P₂O₅ im Vakuum getrocknet und schließlich aus Äthanol/Essigester oder Acetonitril umkristallisiert: Schmp. 155.5 bis 157 C: («I : + 16,7 : 1 bzw. («k«: +19,1 <c = 1: in Methanol). Ausbeute 16.3 g (83% der Theorie).

C₃₉H₅₆N₆O₁₁ (784.9):

Berechnet ... C 59.68. H 7.19. N 10.71. O 22.42; gefunden .... C 59.67, H 7.33. N 10.62. O 22.47.

9. O-tert.-Butyl-i -seryl-i.-glutaminyl-glycyl-O-tert.-butyl-i -threonyl-phenylalanin (2 -6)

15.7 g (2OmMoI) Z-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (2 6) in 300 cm³ wäßrigem Methanol und 1 cm' Essigsäure werden wie üblich hydrogenolytisch entacyliert Das Filtrat vom Katalysator hinterläßt nach Eindampfen im Vakuum einen Rückstand, der aus Methanol Propanol-2 Diäthylather kristallisiert: (.1) : +7.33 : 1 b/w (.,».„: +9.13 (< =0.9: in Wasser! ("hromatou. rein in tcrt.-Butanol Fiscssig

509639/50

Wasser (4:1:5) bzw. Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35:35:30). Ausbeute 10,85 g (80% der Theorie).

C₃₁H₅₀N₆O₉ + 1,5H₂O (677,8):

Berechnet ... C 54,96, H 7,86, N 12,41, O 24;
gefunden .... C 54,94, H 8,07. N 12,48, O 25.

10. Nu,N(im)-Di-adamantyloxycarbonyl-i..-histidin-(N-hydroxy-succinimidester) (I)

25,6 g AdOC-HiS(AdOC)-OH (1 3). hergestellt nach J. Amer. Chem. Soc. 88 (1966), S. 1988. und 7 g N-Hydroxy-succinimid in 250 cm³ Dioxan werden bei 0"C mit 11 g Dicyelohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden bei 0 C und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, nach erneutem Abkühlen auf O'C vom abgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff filtriert. Der nach Eindampfen des Filtrats im Vakuum erhaltene Rückstand wird mit 100 cm³ Dichlormethan behandelt, wobei geringe Mengen Dicyclohexylharnstoff ungelöst bleiben. Die erwärmte Dichlormethan-Lösung versetzt man vorsichtig mit wenig Pelroläther; nach Einsetzen der Kristallisation wird mit Petroläthcr überschichtet und zuerst bei Raumtemperatur und anschließend bei — 5 C zur Vervollständigung der Kristallisation stchengelassen. Das abfütriertc Produkt wird im Vakuum bei 60"C getrocknet: Schmp. 164.5 bis 167.5 C (1511. Ausbeute 22,6 g. (Der erhaltene AdOC-His(AdOC)-OSU enthält noch etwas N-Hydroxy-succinimid. ist jedoch für die weitere Umsetzung genügend rein.)

11. Nf/.N(im)-Di-adamantyloxycarbonyl-

1 -histidyl-O-lert.-butyl-i.-seryl-i -!iluiamiryl-

glycyl-O-tert.-butyl-i-thrconyl-

i.-phenylalanin (1 6)

6.78 g(l mMol) H-Ser(tBu)-Gln-Gly-ThrttBu)-Phe-OH (2 6) und 1.4cm³ Triäthylamin in 150cm' Pyridin werden bei -5 C mit 9.2 g (etwa 1.5 mMol) AdOC-HiS(AdOC)-OSU(I) (Rohprodukt) versetzt; die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei 0 C und weitere 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, im Vakuum eingedampft, der Rückstand mit absolutem Diäthyläther behandelt und auf das Filter gebracht. Die Lösung des erhaltenen Produktes in 100 cm³ ^₅ Methanol läßt man in 500 cm³ Wasser, das 4.3 kg Citronensäure enthält, einfließen. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, nach sorgfältigem Waschen mit Wasser im Vakuum getrocknet und schließlich in 300 cm³ Essigester/Methanol (5: Π aufgenommen. In diese Lösung läßt man unter Rühren 100 cm³ absoluten Diäthyläther langsam einfließen. Nach mehrstündigem Stehenlassen hn Kühlschrank bei - 5 C wird der Niederschlag abfiltriert und im Vakuum bei 40 C getrocknet. Beim Umkristallisieren aus Aceto nitril und Trocknen der Fällung bei 60 C und 10 ^Λ Torr erhält man das Acyl-hexapeptid mit 1 Mol Wasser und ' , Mol Acetonitril.

^H₈SNgO₁₄ f H₂O + ',CH₁CN (1182.91:
Berechnet ... C 60.92. H 7.54. N 11.25. O 20,29: gefunden .... C (1O.88. H 7.61. N 11.24. O 2009 C₅₉H₈₅N₉O₁₄ + CH₃OH (1176,4):

Berechnet ... C 61,26, H 7,63, N 10.72, 0 20,40; gefunden .... C 60,90, H 7,87, N 10,87. O 20,33.

Aminosäureanalyse:

60

(./) : ± lf>.63 1 1 bzw. {,i).„ + 19.94 (< = 0.9: in Methanol). Chromatog. rein in Amylalkohol Pyridin Wasser (35 : 35 : 301. n-Butanol Eisessig Wasser (6:2:2( bzw n-Heptan n-Bulanol Eisessig (1:2: Ii Ausbeute 9.45 g (80% der Theorie).

	11 is	Scr	GIu	CiIy	Ihr	Phc
Berechnet gefunden	1 0,96	1 0.96	1 1,0	1 1,0	1 1.0	1 0,96

B. Sequenz (7 -29)

1. Nu-2-Nitrophenylsulfenyl-O-tert.-butyl-L-serin-4-nitrophenylester [NPS-Ser(tBu)-ONP] (8)

Zu 5OmMoI H-Ser(tBu)-OH in 25 cm³ Dioxan und 17 cm³ 2 η-Natronlauge tropft man unter Rühren innerhalb von 30 Minuten 55 mMol 2-Nitro-phenylsulfenylchlorid in 25 cm³ Dioxan sowie 2 n-Natronlauge unter Einhalten eines pH-Wertes von 8 zu (Verbrauch etwa 38 cm³ 2 η-Natronlauge). Die Reaktionsmischung wird 1 Stunde lang weitergerührt, nach Verdünnen mit 600 cm³ Wasser filtriert und nach Zugabe von 200 cm³ Essigesler vorsichtig bei 0 C mit η-Schwefelsäure auf pH = 3 angesäuert. Die abgetrennte organische Phase wird zweimal mit wenig Wasser gewaschen. Zu der erhaltenen über Natriumsulfat getrockneten Essigesterlösung des NPS-O-tert.-butyl-serins wird bei 0^l C unter Rühren 5OmMoI 4-Nitrophcnol und 50 mMol Dicyelohexylcarbodiimid zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 1 Stunde bei 0^cC und 3 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt, nach kurzzeitigem Abkühlen auf 0 C vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Der verbleibende Rückstand wird aus Äthanol umkristallisicrt und im Vakuum über P₂O, getrocknet. Ausbeute 67.5% der Theorie. Schmp. 82.5 bis 83.5 C; (.<) : - 116,0 bzw. ('4«: -130.8' {c= 1; in Dimethylformamid).

C₁₉H₂₁N₃O₇S (435,3):

Berechnet ... C 52.43. H 4.86. N 9.65. S 7.35; gefunden C 52.16. H 4.86. N 9.25. S 7.17.

2. i--Asparagyl(_/)-tert.-butylester)-O-tcrl.-butyl-

L-tyrosyl-O-tert.-butyl-i-seryl-

Ν,-tert.-butyloxycarbonyI-i -lysyl-O-tert.-butyl-

i-tyrosyl-i-leucyl-asparat:insäurc(_/.--tert.-biiiyl-

esler)(9 15)

200 g (141 mMoll Z-Asp( Ot Bu)-Ty r(t Bu )-Ser(t Bu)-Lys(BOC>Tyr(tBu(-Leu-Asp(OtBu»-OH (9 151. hergestellt nach Chem. Bcr. 99 (1966). S. 105. in 2(KK) cm' Dimethylformamid 95%igem Methanol (1:1) und 3 cm Eisessig werden bei 40 C wie üblich 72 Stunden hydriert. l>te Reaktionsmischung wird auf dem Wasserbad erwärmt, vom Katalysator abnltnert und in d-.τ Kälte der Kristallisation überlassen. Das erhaltene Produkt wird mit Äthanol digeriert und im Vakuum gctrcKknc! Chromatog. rein in η-Amylalkohol Pyndin Wasser (35:35:30) bzw in n-Butanol Eisessig Wasser (6:2:2). Schmp. über 250 C; (-,) : t 3.5 1 I bzw. („).,„: ,4.6 (<· =■ 1.4: in 80"· ο ige r 1 ssiiisäurel Ausbeute I 76,4 g (99"η)

< M₁Hi₁M₁N₁₁O₁, IH,O (1301.71:

Berechnet C f O.90. H 8.36. N 8.61:

j-vfunden ("NI.SI H 8.42. N 8.61

10

Nach Trocknen bei 9O⁰C und 10~³ Torr wird die wasserfreie Substanz erhalten.

C₆₆H₁₀₆N₈O₁₇ (1283,6):

Berechnet ... C 61,76, H 8,32, N 8,73; gefunden .... C 61,78, H 8,40, N 8,73.

3. Nu-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-

L-asparagyl(/)'-tert.-butylester)-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-O-tert.-butyl-L-seryl-Nt-tert.-butyloxy-

carbonyl-L-lysyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-asparaginsäure(/f-tert.-butylester) (8- 15)

8,21 g(6,32 mMol)H-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH (9 -15) werden in 100 cm¹ Dimethylformamid mit 0,89 cm³ Triäthylamin gelöst und bei Raumtemperatur unter Rühren mit 3,42 g (8.2 mMol) Z-Ser(tBu)-ONP (8 g), hergestellt nach Chem. Ber., 99 (1966), S. 105. versetzt. Nach 48stündigem Rührenlassen wird die Reaktionsmischung mit 3,8 cm¹ Eisessig versetzt, anschließend im Vakuum eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird mit verdünnter Citronensäure-Lösung behandelt, auf das Filter gebracht und zunächst mit Wasser und dann mit Diäthyläther sorgfältig gewaschen. Nach Umkristallisieren aus 90%igem Mcthanol und Trocknen bei 80"C und 10~³ Torr; Schmp. 208 bis 209 C; («)": - 12,8 J- 1 ' bzw. («);„: -17,5° (c — 1; in Methanol). Chromatog. rein in Amylalkohol Pyridin Wasser (35:35:30) bzw. in n-Butanol Wasser Lisessie (6:2:2). Ausbeute 8,75 g (88%).

C₈₁H₁₂₅N₉O₂₁ '4H₂O (1565,5):

Berechnet ... C 62,15, H 8.08. N 8.05; gerunden .... C 62,06. H 8.11. N 8.01.

4. O-tert.-Butyl-L-seryl-i.-asparagyl(/;-tert.-butylester)-O-tert.-butyl-i-tyrosyl-O-tert.-bulyl-L-seryl-

Nj-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-O-tert.-butyl-

i.-tyrosyl-i.-leucyl-L-asparatiinsäure(/i'-tert.-butylester)

(8-15)

50 g (32 mMol) Z-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-1 yr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH (8 15) in 800 cm³ Dimethylformamid<95%igem Methanol (1:1) und 3 cm³ Essigsäure werden bei 45 C wie üblich hydriert. Durch kurzes Erhitzen auf dem Wasserbad wird das ausgefallene Produkt in Lösung gebracht, noch heiß vom Katalysator filtriert, das Filtrai anschließend mehrere Stunden im Kühlschrank bei - 5 C stehengelassen. Das abgeschiedene Material wird abgesaugt, mit Methanol gewaschen und über P₂O, im Vakuum getrocknet: Schmp. 250 C; (.1) : -3.9 + 1 bzw. (.<),.: -4,5 (r = 1: in 80%iger Essigsäure). Chromatog. rein in n-Butanol I isessig Wasser (2:2:11 bzw. in Amylalkohol Pyridin Wasser (35: 35:30). Ausbeute 40.9 g (80%).

C-,Η,,,,Ν,,Ο,«, I H₂O 0444.8):

Berechnet . . C 60.69. H 8.44. N 8.73. O 22.10: gefunden ... C^- 60.79. H 8.58. N 8.73. O 21.91. sation ein. Das Produkt wird nach Behandeln mit Petroläther abfiltriert, mit dem gleichen Lösungsmittel gut gewaschen und im Vakuum getrocknet. Nach Umkristallisieren aus Diäthyläther/Petroläther: F. = 112 bis 114"C; («)?': -93,2 ± 1° bzw. («)&: -95,9° (c= 1; in Dimethylformamid). Ausbeute 12,85 g (fast quantitativ).

C₁₄H₂₀N₂O₅S (328,4):

Berechnet ... C 51,21, H 6,13, N 8,53, S 9,74;
gefunden .... C 51,26, H 6,07, N 8,46, S 9,74.

5. N'/O-Nitro-phenylsulfcnyl-O-tert-butyl-1 -threonin (NPS-Thr(tBuH)H) (7)

7 g (40 mMol) H-ThDtBu)-OH werden mit 2-Nitrophenylsulfcnylchlorid wie unter B(I) beschrieben umgesetzt und aufgearbeitet. Die erhaltene Fssigesterlösung wird im Vakuum, zum Schluß inter a/eotroper Destillation mit Benzol, dabei tritt Kristalli-

6. Να-2-Nitrophenylsulfenyl-O-tert.-butyl-L-threonin-N-hydroxysuccinimid-ester

(NPS-Thr(tBu)-OSU)(7)

25 mMol NSP-Thr(tBu)-OH in 150 cm³ Essigester werden bei 0"C unter Rühren mit 25 mMol N-Hydroxysuccinimid und 25 mMol Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionsmischung wird 1 Stunde lang bei 0° C und 3 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Dicyclohexylharnstoffs wird die Lösung im Vakuum eingedampft, der erhaltene Rückstand mit Äthanol behandelt. Hierbei erfolgt zunächst Lösung und anschließend rasche Kristallisation, die durch mehrstündiges Stehenlassen im Kühlschrank vervollständigt wird. Ausbeute 91% der Theorie. Schmp. 138 bis 139,5° C; (-<)·: -52,9 bzw. (,^₆: -56,9" (c = 1: in Dimethylformamid).

C₁₈H₂₃N₁O₇S (425.4):

Berechnet ... C 50.82. H 5.45. N 9.87, S 7,52;
gefunden .... C 50.81, H 5,46, N 9,70, S 7.58.

7. Nu-2-Nitro-phenylsulfenyl-O-tert.-butyl-

L-threonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-

i-asparagyl(^-tert.-butylester)-O-tert.-butyl-

i-tyrosyl-O-tert.-bulyl-L-seryl-Nj-tert.-butyloxy-

carbonyl-L-lysyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyli -leucyl-i -usparaginsäurel/Mert.-butylesler) (7 15)

11,6g (8 mMol) H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH (8 -15) in 150 cm³ Dimethylformamid werden mit 1.12 cm' Triäthylamin und 4,2 g (8.8 mMol) NPS-Thr(tBu)-OSU (7). hergestellt nach Beispiel B (6), versetzt, die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 15 Stunden lang bis zum gallertartigen Erstarren gerührt. Beim Behandeln der Masse mit 1000 cm³ verdünnter Citronensäure-Lösung (pH = 4) flockt das Produkt aus: es wird nach sorgfältigem Verreiben abfiltriert und mit Wasser gut nachgewaschen. Das noch feuchte Produkt wird in wenig heißem Methanol aufgelöst; beim Stehenlassen der Lösung über Nacht bei 0 C scheidet sich reines, kristallines Nonapeptid-Derivat ab. Fs wird abfiltriert und hn Vakuum bc 10 ³ Torr getrocknet: (..) : -20.8 t 1 bzw. <«■),-

23.0 (c = 0.9: in Dimethylformamid). Chromatog rein in Amylalkohol Pyridin Wasser (35: 35: 30) Chloroform Methanol (7:3) bzw. n-Butanol Eisessig Wasser (6:2.2) bzw n-Butanol Äthanol Wasse (2:2:1». Ausbeute 12.4 g (89%).

Ch-H₁₁-N₁₁O₂₃S «1737,21:

Berechnet . . . C 60.15. H 7.95. N 8.87:
gefunden ... C 59.94. H 8.05. N 8.58

Berechnet S 1.81. O 21,19;
gefunden .... S 1.94. O 21,43.

Aminosäureanalyse:

Berechnet
gefunden

Thr

1
0,95

Scr

2
1,81

Asp

2,06

Tyr

2
1,85

Lys

1,02

8. Να-2-Nitro-phenylsulfenyl-O-lert.-butyl-L-seryl-L-arginyl-(hydrobromid)-L-arginyl-

(hydrobromid)-L-alanyl-L-glutaminyl-L-asparaginsäure(/i-tert.-butylester) (16 21)

15,8 g H - Arg(HBr) - Arg(AcOH) - Ala - GIn-Asp(OtBu)-OH (17—21), hergestellt nach Chem. Ber.. 100 (1967), S. 820, in 200 cm³ Dimethylformamid werden bei - 10⁰C mit 10 g NPS-Ser(tBu)-ONP versetzt. Die Reaktionslösung wird 24 Stunden bei 0 C und 40 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend in viel Diäthyläther eingerührt. Das ausgefallene Material wird abfiltriert, in wenig Dimethylformamid gelöst und erneut in Diäthyläther eingerührt; die Prozedur wird nochmals wiederholt, das abgeschiedene Material auf das Filter gebracht und mit Essigester und Diäthyläther sorgfältig gewaschen. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Methanol/ Äthanol:Zersetzungspunktabl70°C;04v -31,1 ± Γ (c = 1; in Dimethylformamid). Chromatogr. rein in n-Butanol/Essigsäure/Wasser (6:2:2). Ausbeute 18,4 g (93% der Theorie).

C₄₁H₆₉N₁₄O₁₃ + H₂O (1096.1):

Berechnet ... C 44.93. H 6,53. N 17.90;
gefunden .... C 44.97. H 6.78. N 17.54.

Berechnet ... O 20.44. Br 7.29. S 2.93;
gefunden .... O 20.39. Br 7.05. S 2.88.

9. Nfi-2-Nitro-phenylsulfenyl-O-tert.-butyl-

L-seryl-L-arginyl (hydrobromid)-

i.-arginyl(hydrobromid)-i-alanyl-L-glutaminy!-

L-asparagyl(/i-tert.-butylester)-L-phenyIalanyl-

L-valyl-L-glutaminyl-i -tryptophyl-L-leucyl-

L-methionyl-L-asparaginyl-O-tert.-butyl-

L-threonin-tert.-butylester (16 29)

16.5 g NPS-Ser(tBu)-Am(HBr)-Arg-Ala-GIn-Asp(OtBu)-OH (16 21). 18.5 e H-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(tBu)-OtBuHBr (22 29-Hydrobromid) — hergestellt aus dem freien Octapeptid (22—29). Chem. Ben. 100 (1967). S. 816. in Dimethylformamid durch Umsetzung mit der berechneten Menge 0,1 n-Bromwasserstoffsäure — und 1.73 g N-Hydroxy-succinimid m 300 cm³ Dimethylformamid Iverden bei —15° C mit 3,42 g Dicyclohexylcarbodi-■nid versetzt. Die Reaktionslösung wird 60 Stunden fcei 0^c C und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Filtrat vom abgeschiedenen Dicydohexylharnttoff rührt man in 2000 cm³ Essigester ein: der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und anschließend 2mal aus wenig Methanol Wasser umgefällt (die gebildete Fällung wird zweckmäßig durch Zentrifugieren abgetrennt). Das so erhaltene Produkt wird letztlich durch dreimaliges Umföllen aus Dimethylformamid Essigester AVasser (200:25OO:2Ocm'l weiter gereinigt: Schmp. 230 bis 232 C (Zers): M : -18.83 ±1 bzw. (.«>;*„: -20.80 (c = 1: in Dimethylformamid). Chromatogr. rein in Amylalkohol Pyridin Wasser (35:35:30) bzw. tert.-Butanol lissiy-

säure/Wasser/Pyridin (60:6:24:20). Ausbeute 24.4 (70% der Theorie).

C₉₈H₁₅₅N₂₅O₂₄Br₂S₂ + H₂O (2309,49):

Berechnet ... C 50,57, H 6.85, N 15,16;
gefunden .... C 50,94, H 6,94. N 14,96.

Berechnet ... O 17,32, Br 6,92, S 2,78;
gefunden .... O 17,69, Br 6,36, S 2,79.

Aminosäureanalyse :

Berechnet
gefunden .

Berechnet
gefunden .

Scr

1
0,84

Phc

1
1,02

Arg
2

1,98

AIa

1
0,97

VaI

1,03

Leu

1,04

Met

1.01

CIu

2
2,0

Ihr

1
0.96

10. O-tert.-Butyl-L-seryl-L-arginyl(hydrobromid)-L-arginyl(hydrobromid)-L-alanyl-L-glutaminyl-L-asparagyl(/Mert.-butylester)-L-phenylalanyl-

L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-methionyl-L-asparaginyl-O-tert.-butyl-

L-threonin-tert.-butylester-hydrobromid (16 29)

11,5 g NPS-Ser(tBu)-Arg(HBr)-Arg(HBr)-AIa-Gln-AsptOtBuJ-Phe-Val-Gln-Tro-Leu-Mct-Asn- Thr(tBu)-OtBu (16—29) und 13,1g 2-Methylindol in 850cm³ Dimethylformamid/Methanol (16:1) werden unter Eiskühlung tropfenweise mit 110 cm³ 0.1 n-methanolischer Bromwasserstoffsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wird unter weiterer Eis-

kühlung 2 Stunden und anschließend 5 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt, anschließend in viel absolutem Diäthyläther eingegossen. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und 2mal aus Dimethylformamid Methanol/Diäthyläther unter Zusatz von

2-Methylindol umgefällt. Das nunmehr farblose Produkt wird auf das Filter gebracht, mit absolutem Diäthyläther gewaschen und letztlich im Vakuum bei 10 ³Torr getrocknet: Schmp. 216 bis 218 C (Zers.): («) : -34,1 ± Γ bzw. («)£_F: -41.1 (c=\: in 80%iger Essigsäure). Chromatogr. rein in tert.-Butanol Essigsäure Wasser Pyridin (60:6:24:20); Whatman Nr. 1. aufsteigend. Aasbeute 10 g (90° _n der Theorie).

C₉₂H₁₅₃N₂₄O₂₂Br₃S + 3H₂O (2273J):

Berechnet ... C 48,61. H 7.05. N 14.79;
gefunden .... C 48.93. H 7.04. N 14.76.

Berechnet ... O 17,60, Br 10,55. S 1.47;
to gefunden .... O 17,57, Br 1041. S 1.46.

Aminosäureanalyse:

	Scr	1	Arg	AIa	GIu
Berechnet . ..	0.89	2	1	2
gefunden	1.95	1.0	2.02

IS

Fortsetzung

	Phe	VaI	Leu	Met	Thr	NH1
Berechnet	1 1,0	1 1,01	1 1,02	1 0,94	1 0,96	3 3,15
gefunden

2O

11. Na-2-Nitrophenylsulfenyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-0-tert.-butyl-L-seryl-

L-asparagyl(/?-tert-butylester)-O-tert>butyl-

L-tyrosyl-O-tert.-butyl-L-seryl-Nj-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-O-tert-butyl-L-tyrosyl- L-leucyl-L-asparagyl(/Rert.-butylester)-

O-tert-butyl-L-seryl-L-arginyl(hydrobromid)-

L-arginyl(hydrobromid)-L-alanyl-L-glutarainyl-L-asparagyI(/}-tert.-butylester)-L-phenyla1any}- L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-1-leucyl-L-methionyl-L-asparaginyl-O-tert.-butyl- L-threonin-tert.-butylester (7 29)

7.32 g H-Ser(tBu)-Arg(HBr)-Arg(HBr)-AIa-GIn-Asp( OtBu) - Phe - VaI - GIn - Trp - Leu - Met - Asn-Thr(tBu)-OtBu-HBr (16 29) und 5,25 g NPS-Thr(tBu) - Ser(tBu) - Asp(OtBu) - Tyr(tBu) - Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-AsplOtBu)-OH (7- 15) werden in 150 cm³ Dimethylacetamid unter Erwärmen und Rühren gelöst. Die auf Raumtemperatur abgekühlte Mischung wird nunmehr tropfenweise mit 0,42 cm³ Triäthylamin und anschließend mit 0,52 g N-Hydroxysuccinimid, nach Abkühlen auf -10 C schließlich mit 0,93 g Dicyclohexylcarbodiimid unter Rühren versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 60 Stunden bei 0° C und weitere 40 Stunden bei Raumtemperatur unter Magnetrührung gehalten, anschließend im Vakuum bei 10² Torr zu einem zähen Brei eingedampft. Das nach Verrührm mit bidestilliertem Wasser erhaltene feste Material wird abfiltriert, in wenig Dimethylacetamid suspendiert und erneut mit bidestüliertem Wasser ausgefällt. Das nach sorgfältigem Waschen mit Wasser trockengesaugte Produkt wird anschließend mehrfach mit heißem Essigester digeriert, auf das Filter gebracht und mit Essigester und Diäthyläther nachgewaschen. Das so erhaltene Rohprodukt wird zur Entfernung von nichtumgesetzter Kopfkomponente (7--15) 18 Stunden mit absolutem Tetrahydrofuran und anschließend ■ etwa 9 Stunden mit absolutem Methanol im Soxhlet extrahiert. Das so gereinigte Material wird mit Diäthyläther auf das Filter gebracht und anschließend bei 80'C und 10"³ Torr 24 Stunden über P₂O₅So getrocknet: F. = ab 250' C allmähliche Zersetzung, chromatogr rein in tert.-Butanol Eisessig Wasser/Pyridin (60:6:24:20) bzw. in Amylalkohol/Pyridin/ Wasser (35:35:30). Ausbeute 7,85 g (68% der Theorie).

Berechnet

gefunden

Lys

1
0,94

Leu

2
2,03

Arg

2
1,97

Berechnet
gefunden .

GIu

2
2,01

Phe

1
1,04

VaI

1
1,03

Met

1,02

AIa

1,0

3
3,09

12. O-tert.-Butyl-L-threonyl-0-tert.-buiyl-

L-seryl-L-asparagyl(/Mert.-butylester>-

O-tert.-bu: vl-L-tyrosyl-O-tert.-buryl-i-seryl-

N_£-tert.-bulyi oxycarbonyl-i -lysyl-O-tert.-butyl-

L-tyrosyl-L-leucyl-i.-asparagyH/MerL-butylester)-

O-tert.-bmyl-i-seryl-L-arginyl(hydrobromid)-

i-arginyl(hydrobromid)-L-alanyl-L-glulaminyl-

1 -asparagyl(/Mcrt.-bulylester)-i -phcnylaianyl-

1 -valyl-L-giutaminyl-i-tryptophyl-i-leucyl-

1-methionyl-i-asparaginyl-O-lert.-butyl-

L-threonin-tert.-butylester-hydrobromid

(7 29-Hydrobromid)

3,85 g NPS - Thr(tBu) - Ser(tBu) - Asp(OtBu)-Tyr(tBu) - Ser(tBu) - Lys(BOC) - Tyr(tBu) - Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(HBr)-Arg(HBr)-Ala-Gln-Asp(OtBu) - Phe - VaI - GIn - Trp - Leu - Met - Asn-Thr(tBu)-OtBu (7 - 29) und 13 g 2-Methylindol werden in etwa 500 cm³ Dimethylacetamid unter Rühren gelöst, die Mischung nach Abkühlen auf 0 C mit 100 cm³ eiskaltem Methanol und unter Rühren und Eiskühlung anschließend mit 2,2 cm³ 1 n-methanolischer Bromwasserstoffsäure, verdünnt mit 100 cm³ Methanol, tropfenweise versetzt. Nach 3stündigem Rühren bei 0 C und 22 Stunden bei Raumtemperatur destilliert man das Methanol im Vakuum bei 15C Badtemperatur ab. Anschließend rührt man die verbleibende Lösung in 2800 cm³ absolutem Diäthyläther Petroläther (25:10) ein; die gebildete Fällung wird nach mehrstündigem Stehen ;m Kühlschrank abfiltriert und anschließend zweimal aus Dimethylacetamid Diäthyläther umgefällt. Nach Trocknen bei 8O⁰C und 10 -^J Torr über P₂O₅: F. = ab 220"C allmähliche Zersetzung; («) : +15,27 i 2 bzw. (<i)£_e: + 17.36 (c = 0,6; in Dimethylacetamid Phosphorsäure-tris-dimethylamid (9:1)). Chromatogr. rein in tert.-Butanol Eisessig/Wasser/Pyridin (60:6: 24:20) bzw. Amylalkohol/Pyridin Wasser (35:35:30). Ausbeute 3,4 g = 88% der Theorie.

C179H287N^O44 Berechnet .. gefunden ... Berechnet .. gefunden ...	Br2S (3857.51): C 55,73, H 7,50, C 55,64, H 7,44, O 18,25, Br 4,14, O 18,67, Br 3,78,	Scr	N 12.70; N 12,69. S 1,66; S 1,67.	Berechnet ... gefunden .... Berechnet ... 60 gefunden ....	kjS + 2H2O (3821,22): C 54.37. H 7,62, N 12,58; C 54,52, H 7,69, N 12,39. O 18,43, Br 6,33, S 0,85: O 18,65, Br 6,28, S 0,99	Tyr 65	Thr	Scr	•	Asp	Tyr
Aminosäureanal	yse:	3 2,73		Aminosäureanalyse:	2 Berechnet .... 1,95 gefunden	2 1,86	3 2,72		4 3,94	2 1.87
	Thr	Asp
Berechnet .... gefunden	2 1,92	4 4,15

17

Berechnet

gefunden

Lys

1
0,98

Leu

2 2,03

Arg

2
1,95

Fortsetzung AIa .

1 5 Berechnet

1,0 gefunden .

18

GIu

Phe

1,94

1,03

VaI

1,03

Met

1
0,97

NH₃ 3

3,63

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Glucagon-deriv^t der Formel III

AdOC-His(AdOC)-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-

1 2 3 4 5 6 7 8

Asp(OtBu)-Tyr(tBuKSer(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(^

9 10 11 12 13 I⁴ '5 ¹⁶ '' ^li! ' ~