DD299189A5

DD299189A5 - Verfahren zur solubilisation von peptiden und verfahren zu ihrer synthese

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Publication number: DD299189A5
Application number: DD90344321A
Authority: DD
Inventors: Jean-Marie Bernard; Kamel Bouzid; Christian Gervais
Original assignee: ��`��@��k��
Priority date: 1989-10-02
Filing date: 1990-10-01
Publication date: 1992-04-02
Also published as: IE903511A1; DE69016732D1; FR2652581B1; ATE118219T1; PT95478A; DE69016732T2; CA2026655C; JP2579699B2; FR2652581A1; DK0421848T3; IE67453B1; ES2071058T3; GR3015802T3; CA2026655A1; JPH03204894A; US5712367A; JPH08311095A; EP0421848B1; PT95478B; EP0421848A1

Abstract

Verfahren zur Solubilisation von Peptiden in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Loesungsmittel, in dem an die terminale Carboxylgruppe dieses Peptids eine lipophile Gruppe ueber eine Amid- oder Esterbindung gebunden wird und diese lipophile Gruppe dadurch gekennzeichnet ist, dasz, sofern sie an L-Serin gebunden ist, ein Molekuel erhalten wird, dessen Loeslichkeit in Wasser bei 25C kleiner als 30 g/l ist. Diese lipophile Gruppe ist chemisch definiert und nicht polymer. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Synthese von gegebenenfalls geschuetzten Peptiden in fluessigem Milieu, dadurch gekennzeichnet, dasz man von einer im organischen Milieu durch eine lipophile A-L-Gruppe solubilisierten Aminosaeure oder einem Peptid ausgeht, welche(s) an die Carboxylgruppe der Starteraminosaeure oder des -peptids gebunden ist und dasz man die zu verknuepfenden Aminosaeuren oder Peptide zugibt, die an ihrer Saeurefunktion aktiviert und an ihrer Aminogruppe und gegebenenfalls ihrer Seitenkette geschuetzt sind. Die nach dieser Synthese enthaltenen Peptide koennen zur Synthese von Medikamenten, Impfstoffen, Duenge- oder Pflanzenschutzmitteln verwendet werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Solubilisation von Peptiden und ein Verfahren zu ihrer Synthese in der Flüssigphase. In der Literatur ist eine große Anzahl von Verfahren zur Synthese von Peptiden beschrieben. Gemeinsamkeiten bestehen in

- dem Schutz der funktioneilen Gruppe der Seitenkette einer Aminosäure durch eine am Ende der Peptidsynthese abspaltbare Schutzgruppe,

- dem Schutz der Amidgruppe (Na) dieser Aminosäure durch eine nach der Kondensation der Aminosäure abspaltbare Schutzgruppe,

- der Aktivierung der Carboxylgruppe dieser geschützten Aminosäure und anschließender Kondensation mit einer Aminosäure oder einem Peptid, deren C-terminale Gruppe geschützt und deren Aminogruppe frei ist,

- der Herstellung des Peptids durch vollständige Entfernung der Schutzgruppen nach Kondensation sämtlicher Aminosäuren. Die verschiedenen Syntheseverfahren unterscheiden sich durch den physikalischen Zustand der Phase, in der die Synthese stattfindet, nämlich der flüssigen odar festen Phase.

Die Synthesevertahrei" der Flüssigphase bestehen aus der Durchführung sämtlicher Umsetzungen in homogener Phase. In dem durch Bodansky und Vigneaud in „Journal of American Chemical Society" 81 (1959) 5688-5691 beschriebenen Verfahren wird die Ausgangsaminosäure durch eine Methylgruppe geschützt, und die folgenden Aminosäuren werden „Schritt für Schritt" nach Schutz ihrer Aminogruppe durch eine Benzyloxycarbonylgruppe und Aktivierung ihrer Carboxylgruppe durch einen Nitrophenylester kondensiert. Die aufeinanderfolgenden Zwischenprodukte werden durch Ausfällen oder Waschen gereinigt. Dieses Verfahren erfordert eine hohe Anzahl komplizierter oder langer Synthesestufen, die unvermeidlich bedeutende Produktveriuste mit sich br! in, so erhielten Schwyzer und Sieber (Helvetica Chemica Acta, 49, (1966), 134-158) mit diesem Verfahren eine ACTH-Ausbeute von nur 6,85%.

Die von Bsyermann et al. (Rec. Trav. Chim., Niederlande, 92, [1973], 481) beschriebene Synthese besteht aus der Anwendung des obigen Verfahrens ausgehend von einer Aminosäure oder einem Peptid, dessen Carboxylgruppe durch eine Benzylgrup^e geschützt ist, und der Herstellung der Bindungen in Gegenwart eines Überschusses geschützten Aminosäureanhydrids zur Erhöhung der Ausbeute. Die Anzahl der Verfahrensstufen ist auch wie im vorigen Verfahren hoch, und das gebildete Peptid verliert häufig seine Löslichkeit im organischen Milieu, sobald die Zahl der Aminosäuren vier oder fünf überschreitet. Verschiedene Syntheseverfahren in der Flüssigphase verwenden bessere solubilisierende Schutzmittel für die Ausgangsaminosäure oder das -peptid, so nennt die EP-PS 17536 als Schutzgruppe die Phenylazobenzylsulfonylethyloxygruppe (OPSE). Die Gruppe erlaubt die Solubilisation der gebildeten Peptide in Dimethylformamid und ihr Unlöslichmachen sowohl in Wasser als auch in anderen organischen Lösungsmitteln. Die Synthese erfolgt immer noch „Schritt für Schritt" mit Ausfällen jedes gebildet! η Peptidzwischenproduktes vor einer erneuten Aminosäurezugabe, was Schwierigkeiten bei der Filtration der Feststoffe verursacht. Dieses wie auch sämtliche anderen zuvor erwähnten Verfahren erlaubt nicht, Peptide mit einer großen Arninosäurezahl in Lösung zu halten.

Von den Verfahren in der Flüssigphase sind noch solche zu nennen, in denen die Aminosäure durch Verwendung eines geradkettigen, nicht vernetzten Polymeren wie Polyethylenglykol (Mutter und Beyer, Nature 237 [1972], 512) in Lösung gehalten wird, wobei die Nebenprodukte durch Ultrazentrifugieren oder Ausfällen entfernt werden.

Von den Syntheseverfahren in eier feston Phase ist das von Merrifield 1963 im „Journal of American Chemical Society" 85, 2149-2154 beschriebene Verfahren zu nennen, das aus der Bindung der C-terminalen Carboxylgruppe der ersten Aminosäure

oder der ersten Peptidgruppe an einen unlöslichen Träger besteht. Die Verknüpfungs- und die Waschvorgänge können zum Erhalten eiens automatisierbaren Verfahrens standardisiert werden. Dieses Verfahren ist bis zum heutigen Tag sehr kostenaufwendig, da es die Verwendung von Ausgangsstoffen in großem Überschuß zur Umwandlung sämtlicher Peptidketten während der Synthese in einer vernünftigen Zeit erfordert. Die Reinheit und Homogenität der gebildeten Peptide ist noch weit vom Idealzustand entfernt, wobei die aus unvollständigen Peptidketten gebildeten Nebenprodukte am Ende der Reaktion entfernt werden müssen. Die Reinigung in der Zwischonproduktstufe ist unmöglich, während sie in der Endstufe schwierig ist, da sie eine komplizierte Apparatur und ein hochentwickeltes Verfahren erfordert, deren Kosten hoch wie die der präparativen Hochdruckflüssigkeitschromatographie sind.

Die Übertragung dieser Technologie in den industriellen Maßstab bleibt bis auf den heutigen Tag ein ungelöstes Problem aufgrund der Schwierigkeiten des Einsatzes großer Harzmengen, entweder im Rührreaktor oder im Festbett.

Die vorliegende Erfindung erlaubt die Lösung einer großen Anzahl der nach dem Stand der Technik offen gelassenen Probleme.

Es ist ein Verfahren zur Solubilisation von Peptiden gefunden worden, das ihre Synthese in der nichtwäßrigen Flüssigphase und

ihre Reinigung gestattet '

Das Verfahren zur Solubilisation von gegebenenfalls geschürten oder als Salz vorliegenden Peptiden in einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel ist dadurch gekennzeichnet, daß die C-terminale Gruppe dieses Peptids über eine Amid- oder Esterbindung an eine lipophile Gruppe gebunden ist, wobei letztere, wenn sie an L-Serin gebunden ist, ein Molekül ergibt, dessen Löslichkeit in Wasser bei 25°C geringer als 30g/l und dier.e lipophile Gruppe chemisch definiert und nicht polymer

Die lipophile Gruppe, welche d'i Peptidsynthese in der mit Wasser nicht mischbaren, organischen Flüssigphase erlaubt, ist vorzugsweise aus zwei Einheit an A und L zusammengesetzt, die miteinander durch eine kovalente Bindung und mit dem Peptid kovalent über die Einheit A verbunden sind:

Peptid-Co-A-L

Die Einheit A ist während der Synthese ein bifunktionelles Bindeglied zwischen dem Peptid und der Gruppe L.

Die Gruppe L bedeutet den lipophilen Teil der Einheit A-L. Diese Gruppe L ist niemals polymerer Art. Sie ist vorzugsweise eine gegebenenfalls Halogene umfassende kohlenwasserstoffhaltige Gruppe der allgemeinen Formel

worin a bis g ganze Zahlen sind und -a zwischen 1 und 50

- b zwischen 3 und 101

- c zwischen 0 und 6

- d zwischen 0 und 2

- e zwischen 0 und 2

- f zwischen 0 und 2 und

- g zwischen 0 und 20 ist und

- X ein aus Fluor, Chlor und Brom ausgewähltes Halogen bedeuten.

Man bevorzugt aus der Gesamtheit der Verbindungen, die die Gruppe L bedeuten kann, jene, für die (a) eine ganze Zahl größer als 6 und besonders bevorzugt größer als 12 und diejenigen, in denen (g) eine ganze Zahl größer als 2 bedeutet.

Die Gruppe A, die wie zuvor erläutert, das bifunktionelle Bindeglied bedeutet, weist an einem ihrer Enden wenigstens eine Alkohol- oder Aminogruppe (B) und am anderen eine Carbonyl- oder Ethergruppe auf. Sie kann mit der folgenden allgemeinen Formel

bezeichnet werden, worin

- B eine Hydroxyl-oder Aminogruppe,

- Ar einen mono- oder polycyclischen aromatischen Rest,

- R] eine kovalente Bindung, einen 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthaltenden Alkylenrest, der gegebenenfalls durch einen Phenylrest oder eine Alkylencarbonylgruppe substituiert ist, bedeutet,

- R₂ eine kovalente Bindung, einen 1 bis4 Kohlenstoffatome enthaltenden, gegebenenfalls subsmuierten Alkylenrest, eine 1 bis 4 Kohlenstoffatome in der Alkylenkette enthaltende Oxyalkylengruppe und ein Sauerstoffatom bedeutet,

- k, m und η 0 oder 1 sind und

- ρ 1 oder 2 ist.

Die beiden Einheiten A und L können eine ein 'ige Gruppe der Formeln

B-R₁-Ar' oder B-CH_l3-_qrAr"(_q)

bilden, worin

- B und R) dieselben Bedeutungen wie oben haben

- Ar' einen polycyclischen aromatischen Rest und

- Ar" einen Benzolrest bedeuten und q 2 oder 3 ist.

Aus den Gruppen A sind die Gruppen der folgenden Formeln zu nennen:

H0-

QV0-CH2-C0-

H0-CH2

0-CÜ2-C0-

HO-CH2

CH2-CH2-CO-

HO-CH2

HO-CH₂-/q\-CH₂-

CO-

HO-

CO-

H0-

HO-CH?-

0-

HO-CH₂-CO-O-

H₂

- Dt und D₂ jeweils identische oder verschiedene, aus den Resten oder Atomen O, CO, CH₂O, CH₂CO und OCO ausgewählte Gruppen und

- D₁ oder D₂ H bedeuten,

H2N-CH

D₂

worin D< und D₂ dieselben Bedeutungen wie oben haben,

HO-CH₂-CO

D₂

worin D₁ und D₂ ebenfalls dieselben Bedeutungen wie oben haben. Aus den lipophilen Gruppen L sind die Gruppen der folgenden Formeln zu nennen:

-Q-CH₂-.

CH₂-

OVO

D₃

-CH₂-

-CH2

0-Ü3

-CH₂-VQ

0-D₃

0-C0-D3

-CH2-/Q

0-C0-D3

[Ol ΙΟΙ (Ol (O

D3 γ V ¹COO-D₃

Ö3 C00-D3

CO-

-0-CH₂

O-D₃

COO-D₃

CH₃ CH3-C-CH3

Cll3

CH3-C-CH3 CH₃

(CH₂)I₂-CO-

O-CH3

CO-

CH₃-CH-CH-CHe-CH

CO-

>-C0-C-Ü4

CO-O-Ü4

worin D₄ eine Aryl- oder Aralkylgruppe bedeutet

CH₂-CO- OCH₂-CO-

C9H19

-0-CH₂

Die Lösungsmittel, in denen die Peptide dank ihrer Bindung an die lipophile Gruppe löslich sind, sind mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel wie halogenierte aliphatisch^ Verbindungen, insbesondere Methyienchlorid, aromatische Verbindungen wie Anisol oder Chlorbenzol und Ester wie Ethylacetat.

Das Verfahren zur Solubilisation erlaubt, insbesondere die Löslichkeit der Peptide in der organischen Phase zu erhöhen.

Beispielsweise gestattet es homogene Lösungen mit einer Konzentration von größer oder gleich 50g/l zu erhalten.

Ein anderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die an die zuvor definierten Gruppen A-L gebundenen Peptide einen höheren Verteilungskoeffizienten dank der organischen Phase während des Dokantierens in Gegenwart von

Wasser haben.

Diese Eigenschaft kann vorteilhaft zum Reinigen der Peptide durch Waschen mit Wasser genutzt werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Synthese von gegebenenfalls geschützten Peptiden in flüssigem Milieu, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man von einer Aminosäure oder einem Peptid ausgeht, die (das) im organischen Milieu durch eine wie zuvor definierte Gruppe A-L gelöst ist, die an die Carboxylgruppe der Asugangsaminosäure oder des -peptids gebunden ist, und daß man die zu verknüpfenden Aminosäuren oder Peptide zugibt, die über ihre Säuregruppe aktiviert und in ihrer Aminogruppe und gegebenenfalls ihrer Seitenkette geschützt sind.

Der Schutz der Aminogruppe der Aminosäuren kann durch Ersetzen eines Wasserstoffatoms dieser Gruppe durch eine solche wie tert.-Butyloxycarbonyl oder durch die Bildung von Salzen der DANE oeispielsweiso durch Umsetzung der Aminogruppe mit

einer ß-Dicarbonylverbindung erfolgen.

Die Aktivierung des Peptids oder der N-geschützten Aminosäure wird durch Bildung eines gemischten Anhydrids durch ein Säurechlorid, eines gemischten Anhydrids durch ein Alkylchloroformiat, eines symmetrischen Anhydrids durch ein Carbodiimid, eines nach einem bekannten Syntheseverfahren aktivierten Esters oder durch jedes andere Aktivierungsverfahren einer N-geschUtzten Aminosäure durchgeführt.

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es eine wirtschaftliche und wiederholbare Synthese im organischen Milieu erlaubt, in der das an das zuvor definierte lipophile Molekül A-L gebundene Peptid ständig in Lösung gehalten wird. Auch wird jedes A-L-Peptidzwischenprodukt, das gegebenenfalls N-geschützt ist, im organischen Milieu in

Lösung gehalten.

Ein anderer bedeutender Vorteil des Verfahrens liegt in der Entfernung der überschüssigen Ausgangsprodukte.und der Synthesenebenenprodukte aus der organischen Phase durch einfaches Wuschen mit Wasser,

- nach der Kondensationsstufe Produkte wie die überschüssigen aktivierten Aminosäuren oder aktivierten Peptide, Salze, Säuren oder Alkohole oder sämtliche anderen Reaktionsnebenprodukte, die nicht an die synthetisierte Peptidkette gebunden sind, und

- nach der Abspaltung der Schutzgruppe die Mittel zur Entfernung der Schutzgruppen von den gewünschten Funktionen und die Reaktionsnebenprodukte der Abspaltung der N-Schutzgruppe.

Dieses Verfahren vermeidet so sämtliche Reinigungsstufen durch Ausfällung, die nach dem Stand der Technik erforderlich

waren.

Das Überwachen der Reinheit des Peptids während der Synthese ist jederzeit durch einfaches Entnehmen und Analysieren mit Verfahren wie Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), Protonen- oder Kohlenstoff-NMR-Spektroskopie, Potentiometrie

und Massenspektrometrie möglich.

Wegen der Ähnlichkeit der Verfahrensschritte Verknüpfung und Abspaltung der Schutzgruppen während der jeweiligen Zugabe

der Aminosäuren erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Synthese von Peptiden in einer sich wiederholenden

Arbeitsweise.

Aufgrund dieser sich wiederholenden Syntheseschritte kann das Verfahren vorteilhaft automatisiert durchgeführt werden. Wenn die Synthese der Anfangspeptidsequenz beendet ist, wird das Peptid von seinen Schutzgruppen und von der solubilisierenden A-L-Gruppe durch Hydrolyse, Hydrogenolyse oder jedes andere in der Peptidsynthese verwendete Verfahren

befreit.

Dieses Verfahren ist für die Synthese von hydrophilen Peptiden oder Trägern hydrophiler Gruppen besonders interessant

beispielsweisefürjene.diein ihrer Kette die Aminosäuren Arginin, Glutamin, Asparagin, Serin.Threonin und Glycin aufweisen.

Die aus der Synthese erhaltenen Peptide werden gegebenenfalls zur Gewinnung von Medikamenten, Impfstoffen, Dunge- oder

Pflanzenschutzmitteln verwendet.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert.

I Synthese der Ausgangsstoffe, die das Erhalten der solubllk !erenden A-L-Gruppen erlauben

Beispiel 1

Herstellung von 4-Phenylbenzyl-3-chlormethylben2oat In einen 500-cm³-Dreihalskolben gibt man nacheinander

- 40g (0,217 mol) Biphenylmethanol

- 150cm³ Toluol und

- 42,9g (0,22Vmol) 3-Chlormethylbenzoylchlorid.

Das Gemisch wird gerührt und auf 4O⁰C erwärmt. Danach gibt man 10 Minuten lang 25cm³ (0,227 mol) N-Methylmorpholin zu.

Die Temperatur des Reaktionsmilieus erhöht sich sofort auf 60⁰C, danach erwärmt man 2,5 Stunden lang auf 8O⁰C.

Das erhaltene Reaktionsgemisch wird in einen Scheidetrichter gegossen, auf einen Liter durch Zugabe von Ethylacetat verdünnt, anschließend nacheinander mit 450cm³ normaler Salzsäure, 400cm³ wäßriger normaler Natriumhydrogencarbonatlösung und zum Schluß bis zur Neutralisation mit Wasser gewaschen.

Das Abdestillieren des Lösungsmittels führt zu einem festen Rückstand, der durch Kühlung in 1,6 Liter Methanol umkristallisiert

4-Phenylbenzyl-3-chlormethylbenzoat wird mit einer Ausbeute von 81 % (59,5g) in Form eines weißen Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 102⁰C erhalten.

Seine Struktur wird durch Massenspektrometrie und Protonen-NMR-Sp ektroskopie (360 MHz) nachgewiesen.

Die Analyse durch Dünnschichtchromatographie (DC) auf einer Siliciumdioxidschicht Merck 60F254 weist nur einen Fleck in jedem der zwei verwendeten Elutionssysteme nach:

Ethylacetat/Cyclohexan (2/5) Ri = 0,7

Hexan/Aceton(4/1) R, = 0,6.

Beispiele 2 bis 14

Man arbeitet unter denselben Verfahrensbedingungen wie im Beispiel 1 und stellt die folgenden Verbindungen her:

Belpslol 2

2-Phenoxybenzyl-3-chlormethylbenzoat Aussehen: ölig Ausbeute: 94%

Beispiel 3

g-Methylenanthracyl-S-chlormethylbenzoat Aussehen: Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 148°C (Umkristallisieren in Methanol) Ausbeute: 82%

Beispiel 4

4-Phenylbenzyl-3-brommethylbenzoat Aussehen: Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 63 bis 65⁰C Ausbeute: 26%

Beispiel 5

4-tert.-Butylbenzyl-3-chlormethylbenzoat Aussehen: ölig Ausbeute: 47%

Beispiel 6

2,4-Dichlorbenzyl-3-chlormethylbenzoat Aussehen: Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 75⁰C (Umkristallisieren in Aceton und Wasser)

Ausbeute: 75% ^

Beispiel 7

Ciiolesteryl-3-chlormethylbenzoat Aussehen: Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 122°C (Umkristallisieren in Dichlormethan und Methanol) Ausbeute: 78%

Beispiele

Phytyl-3-Chlormethylbenzoat Aussehen: ölig Ausbeute: 53%

Beispiel 9

2,2,3,3,4,4,4-Heptafluorbutyl-3-chlormethylbenzoat Aussehen: ölig Ausbeute: 79%

Beispiel 10

2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,e.e.e-Pentadecafluoroctyl-S-chlormethylbenzoat Aussehen: ölig Ausbeute: 81%

Beispiel 11

Cholesterylchloracetat Aussehen: kristallin Ausbeute: 72%

Beispiel 12

2,2,3,3,4,4,4-Hoptafliiorbutylchloracetat Aussehen: flüssig mit einem Siedepunkt von 80°C (bei 2660 Pa) Ausbeute: 20%

Beispiel 13

2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,fJ-Pentadecafluoroctylchloracetat Aussehen: ölig Ausbeute: 72%

Beispiel 14

4-(3',5'-dichlorphenoxy)-benzylchloracetat Aussehen: ölig Ausbeute: 97%

Il Synthese der verschiedenen geschützten A-L-Aminoacyl- oder A-L-Peptlde

Beispiel 15

Synthese von N-tert.-Butyloxyjarbonyl-L-leucin^-hydroxymethylbiphenyl-S-methylbenzoat Man gibt nacheinander in einen 500-cm³-Dreihalskolben

- 15g Kaliumsalz des N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucinsfO.OSemol),

- 180cm³ trockenes DMF,

- 14,905 (0,044mol) 4-Hydroxymethylbiphθnyl-3-chlormethylbenzoat, gelöst in 100cm³ trockenem DMF und

- 1,5g Natriumiodid.

Das Gemisch wird unter Rühren auf 75⁰C gebracht.

Nach 2 Stunden Umsetzung werden 490cm³ Ethylacetat zugegeben.

Dio organische Lösung wird nacheinander zweimal mit 100cm³ Wasser, 200cm³ verdünnter KHCO:i-Lösung (pH8,5), 200cm³ Wasser, 200cm³ einer KHSO₄-Lösung (pH 2) und 200cm³ Wasser gewaschen.

Die organische Phase wird über Na₂SO₄ getrocknet, anschließend filtriert und zum Erhalt eines Öls mit einer Ausbeute von 100% verdampft.

Die Struktur des Produkts wird durch Massenspektroskopie und Protonen-NMR-Spektroskopie (360MHz) nachgewiesen.

Dia Dünnschichtchromatographie auf einer Siliciumdioxidschic'nt zeigt nur einen Fleck im folgenden Elutionssystem:

Ethylacetat/Hexan (2/5) R, = 0,66.

Beispiele 16 bis 22 Ur.ter denselben Verfahrensbedingungen wie im Beispiel 15 stellt man die folgenden Verbindungen her.

Beispiel 10

(CH3)3-C-Ü-CO-NH-CH-CO-O-CH2-/Q CH2

CH / \

CII3 CH3

CO-O-CH₂-.

Aussehen: ölig Ausbeute: 98%

Beispiel 17

Aussehen: ölig Ausbeute: 05%

CO-O-CH2

(CH3)3-C-0-C0-N— CH-CO-O-CH₂-

CO-O-

Aussehen: ölig Ausbeute: 100%

Beispiel 19

(CHs)₃-C-O -CO- [NH-CH₂-CO]₂-O-CH₂-VQ'

Aussehen: weißes Pulver Ausbeute: 100%

Beispiel 20

:-0-C0-[NH-CH₂-C0]5-0-CH2-/O/ ^

Aussehen: weißes Pulver Ausbeute: 77,5%

Beispiel 21

(CH₃)S-C-O-Co-[NH-CH₂-CO]₂-O-CH₂VQ'

CO-O-CH₂

Aussehen: ölig Ausbeute: 100%

Beispiel 22

)-[NH-CH₂-CO]5-O-CH₂VQ^x

"CO-O-CH₂-(CF₂J₂-CF₃

Aussehen: Pulver Ausbeute: 70%

Beispiel 23

(CH3)3-C-0-C0-[NH-CH2-C0]5-0-CH2-/Q

CO-O-CH₂

Aussehen: weißes Pulver Schmelzpunkt: 215⁰C

Beispiel 24

(CH3)3-C-0-C0-[NH-CH2-C0]5-0-CH2-/q

CO-O-CH₂-(CF2)7-CF3

Aussehen: weißes Pulver Schmelzpunkt: 240°C

Beispiel 25

(CH3)3-C-O-CO-[NH-CH2-CO]4-O-CH2-/q\

CO-O-CH2-(CF2)7-F

Aussehen; weißes Pulver

III Syhtese der verschiedenen A-L-Aminoacylgruppen

Beispiel 26

£ ynthese des Chlorhydrats des L-Leucin-(4-hy^rlroxymethylbiphenyl-3-methylbenzoats In einen 250-cm³-Dreihalskolben gibt man nacheinander:

- 24,6g (0,044mol) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucin^-hydroxymethylbiphenyl-S-methylbenzoat und

- lOOgDichlormethan.

Danach leitet man 1,5 Stunden lang bei Umgebungstemperatur einen trockenen Salzsäurestrom in das geriihi te Gemisch.

Anschließend wird die Lösung 20 Minuten lang durch einen Stickstoffstrom entgast.

Das Reaktionsgemisch wird bis auf ein Volumen von 50cm³ eingedampft und anschließend durch Zugabe von 200 cm³ Ethylether ausgefällt.

Das nach Filtration erhaltene Produkt wient 19,3g (0,0413 mol) (Ausbeute 94%). Es ist ein weißes Pulver mit einem Schmelzpunkt von 121 bis 122⁰C.

Die Struktur des Produkts wird durch Massenspektrometrie und Protonen-NMR-Spektroskopie (360MHz) nachgewiesen.

Die Dünnschichtchromatographie auf einer Siliciumdioxidschicht weist nur einen Fleck im folgenden Elutionssystem nach:

Dichlormethan/Methanol/Essigsäure (90/10/5) Ri = 0,55.

Beispiele 27 bis Man arbeitet unter denselben Verfahrensbedingungen wie im Beispiel 26 und stellt die folgenden Verbindungen her.

Beispiel 27

HCl, NH2-CH-CO-O-CH2 CH.2

CH₃ ^NCH₃

Aussehen: ölig Ausbeute: 98%

Beispiel 28

HCl, NH₂-CII-CO-O-CH₂Vr^ CH₂ ^X '

OH

Aussehen: weißes Pulver Ausbeute: 98%

CO-O-CH₂-

Beispiel 29

HCl, HN-CH-C0-0-CH2-

Aussehen: weißes Pulver Ausbeute: 80%

IV Messungen der Löslichkeiten von Molekülen der Formel (L)-Seryl-A-L in Wasser Beispiel 30

Wenn die lipophilen Gruppen A-L an L-Serin gebunden sind, ergeben sie ein Molekül, dessen Löslichkeit in Wasser kleiner als 30g/l bei Umgebungstemperatur ist.

Synthese von Molekülen der Formel (L)-Seryl-A-L

Die nach dem in den Beispielen 26 bis 29 beschriebenen Verfahren erhaltenen Chlorhydrtte der Formel HCI, (L)-Seryl-A-L werden in Dichlcrmethar gelöst. Man leitet gasförmiges Ammoniak bei Umgebungstemperatur in diese Lösung ein. Der erhaltene Ammoniumchloridniederschlag wird schnell filtriert. Anschließend wird das Fütrat unter sehr vermindertem Druck konzentriert.

Das nach der Konzentration erhaltene Produkt wird sofort in Wasser 16 Min jten lang bei L ingebungstemperatur zerrieben und anschließend filtriert.

Die Löslichkeit des Produkts der Formel (L)-Seryl-A-L wird im Filtrat gemessen.

Löslichkeit von Molekülen de- Formel (L)-Seryl-A-L

• 4-Hydroxymethylbiphenyl-L-sfcrin-3-hydroymethylbenzoat: Löslichkeit in Wasser bei 25'C:0g/i (unlöslich)

ο Benzyl-L-SBrin-3-hydroxyrrethyibenzoat;

Löslichkeit in Wasser bei 25"C:0,2 g/l β S-Phenoxybenzyl-L-serin-S-hydroxymethylbenzoat:

Löslichkeit in Wasser bei 25°C:0,75g/l Vergleich:

• L-Serinmethylester:

Löslichkeit in Wasser bei 25°C:> 100g/l

• L-Serinbeni'.ylester:

Löslichkeit in Wasser bei 2ö°C:>100g/l

V SolubiilsierenJe Effekte der lipophilen Schutzgruppe der Carboxylgruppe von Peptiden In organischen Lösungsmitteln Der solubilisierende Effekt der lipophilen Gruppe wird durch nachfolgend beschriebene Messungen der Löslichkeit verdeutlicht, worin das aufgebaute Peptid ein teilweise hydrophiles Peptid N-tert.-Butyloxycarbonylpentaglycin ist

(CHa)₃C-O-CO-(NH-CHr-CO)₆-OR

R	Löslichkeit in g/1 OO cm³ Anisol CH₂CI₂	> 10 > 10 0,33 0,070	H₂O	Verteilungskoef fizient zwischen CH₂CI₂ und H₂O
Ri R₂ -CH₃* Benzyl·	5 5 unlöslich unlöslich		0,0016 0,0008 0,50 0,017	>1000 >2000 0,66 4,1
* als Vergleich

Rl = -CH?-

CO-O-CH2

R2 = -CH2-

C0-0-CH2

Vl Peptidsynthese durch llpophile Gruppen A-L im konzentrierten organischen Milieu Man synthetisiert das Pentapeptid Leucin-Encephalin-L-tyrosylglycylglycyl-L-phenylalanyl-L-leucin

- mit dem 4-Hydroxymethylbiphenyl-3-methylbenzoat als lipophiler Gruppe A-L und

- mit der tert.-Butyloxycarbonylgruppe als Schutzgruppe der Aminogruppe der konstitutionellen Aminosäuren.

Beispiel 31

Beispiel 31 a: Synthese das 4-Hydroxymethylbiphenyl-3-hydroxymethylbenzoats des N-tert.-Butyl-oxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-leucins

Man gibt in einen 500-cm³-Dreihalskolben nacheinander

- 10,33g (0,039mol) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin und

- 75cm³Dichlormethan.

Nach dem Lösen wird die Temperatur des Reaktionsgemische auf -5⁰C abgekühlt und nacheinander unter Rühren 4,29cm³ (0,039mol) N-Methylmorpholin und 4,46cm³ (0,036mol) Pivaloylchlorid zugegeben. Nach 4stündiger Umsetzung werden 14,018g (0,030mol) Chlorhydrat des 4-Hydroxymethylbiphenyl-L-leucin-3-hydroxymethylbenzoats und anschließend 3,3cm³ (0,030mol) N-Methylmorpholin hinzugegeben

Nach 2 Stunden Umsetzung wird das Reaktionsgemisch nacheinander mit

2x 25cm³ Wasser (pH-Wert 5,8 bis 6,44),

3x 30cm³ verdünntem KHCO₃ (pH-Wert 8,2 bis 8,3),

2x 30cm³ Wasser (pH-Wert 7,3 bis 7,2),

2x 30cm³ H₂SO* (pH-Wert 3,89 bis 3,35) und

2x 30cm³ verdünntem NaCI (pH-Wert 6,7 bis 6,5) gewaschen.

Die Ausbeute des bezogen auf einen Standard analysierten Produkts beträgt 100%.

Die Analyse durch Dünnschichtchromatographie mit einer Siliciumdioxidschicht weist nur einen Fleck im folgenden Elutionssystem nach: Ethylacetat/Hexan (2/5) R₁ = 0,38.

Die Struktur des Produkts wurde durch Massenspektrometrie und Protonen-NMR-Spektroskopie (360MHz) und seine Reinheit durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) nachgewiesen.

Beispiel 31 b: Synthese des Chlorhydrats des 4-Hydroxymethylbiphonyl-L-phenylalanyl-L-l8ucin-3-hydroxymethylbezoats Die nach Extraktion im Beispiel 31 a erhaltene Lösung wird durch Abdestillieren des Dichlormethans unter Vakuum getrocknet.

Das Endvolumen wird auf 150cm³ gebracht.

Man spült die Lösung 1 Stunde 45 Minuten lang mit einem trockenen Chlorwasserstoffstrom bei Umgebungstemperatur.

Anschließend wird das Reaktionsgemisch durch ständiges Einleiten eines trockenen Stickstoffstroms in die Lösung entgast.

Das Reaktionsgemisch wird unter Vakuum auf ein Volumen von 75cm³ konzentriert.

Durch Dünnschichtchromatographie mit einer Siliciumdioxidschicht wird die Reinheit des Produkts nachgewiesen: Ri = 0,8 im

Elutionssystem Dichlormethan/Methan (90/10).

Die Analyse durch HPLC bestätigt, daß die Entfernung der N-tert.-Butyloxycarbonylgruppe quantitativ (100%) ist.

Eine Probe des im System Ethylacetat/Ethylether ausgefällten Produkts hat einen Schmelzpunkt von 167 bis 169°C.

Beispiel 31 c: Synthese des 4-Hydroxymethylblphenyl-3-hydroxymethylbenzoats des N-tert.-Butyloxycarbonylglycylglycyl-L-phenylalanyl-L-leuclns

In einen 500-cm³-Dreihalskolben gibt man nacheinander

- 5,1 g (0,022mol) N-tert.-Butyloxycarbonyl-glycylglycin und

- 75cm³Dichlormethan.

Nach der Auflösung wird die Temperatur des Reaktionsmilieus auf -5⁰C abgekühlt und nacheinander unter Rühren 2,4cm³ (0,022mol) N-Methylmorpholin und 2,7cm³ (0,0176mol) Pivaloylchlorid zugegeben.

Nach 2stündiger Umsetzung unfsr Rühren bei -5⁰C gibt man die Hälfte der im Beispiel 31 b erhaltenen Lösung des Chlorhydrats

von 4-Hydroxymethyibiphenyl-3-hydroxymethylbenzoesäureester des L-phenylalanyl-L-leucins (0,0147 mol in 40cm³ Dichlormethan) und anschließend 1,62cm³ (0,0147mol) N-Methylmorpholin hinzu.

Nach 2,5stündiger Umsetzung unter Rühren wird das Reaktionsgemisch nacheinander mit 30cm³ verdünnter H₂SO₄ (pH-Wert 3,5),

2x 30cm³ Wasser (pH-Wert 4,5 bis 3,6),

2x 30cm³ verdünnter NaOH (pH-Wert 8,6 bis 7,3) und

2x 30cm³ Wasser (pH-Wert 6,8 bis 6,1) gewaschen.

Die Analyse durch Dünnschichtchromatographie auf einer Siliciumdioxidschicht weist ein einziges Produkt im folgenden Elutionssystem nach: Dichlormethan/Methanol (90/10) R, = 0,6.

Die Struktur des Produkts wurde durch Massenspektrometrie und Protonen-NMR-Spektroskopie (360MHz) und seine Reinheit durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPCL) nachgewiesen.

Beispiel 31 d: Synthese des Chlorhydrats des 4-Hydroxymethylblphenylglycylglycyl-L-phenylalanyl-L-leucin-3-methylbenzoats

Die im Beispiel 31 c nach Extration erhaltene Lösung wird durch Abdestillieren des Dichlormethans unter Vakuum getrocknet.

Das Endvolumen wird auf 75cm³ gebracht.

Man leitet einen trockenen Chlorwasserstoffstrom 1,5 Stunden lang bei Umgebungstemperatur in die Lösung. Anschließend wird das Reaktionsmilieu durch einstündiges Spülen der Lösung mit trockenem Stickstoff entgast.

Die Ausbeute des so aus der Lösung erhaltenen, analysierten Produktes beträgt 100%.

Die Reinheit des Produkts wird durch Dünnschichtchromatographie mit Siliciumdioxidschicht und durch HPLC nachgewiesen.

Beispiel 31 e: Synthese des 4-Hydroxymethylb!phenyl-3-methylbenzoats des N-tert.-butyloxycarbonyl-L-tyrosylglycylglycyl- L-phenylalanyl-L-leucins

In einen 250-cm³-Dreihalskolben gibt man nacheinander

- 5,26g N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosin und

- 40cm³Dichlormethan.

Nach dem Lösen wird die Temperatur des Reaktionsgemische auf -15⁰C abgekühlt und nacheinander unter Rühren 2,23cm³ (0,02mol) N-Methylmorpholin und 2,5cm³ (0,019mol)lsobutylchlorformiatzugegeben. Nach 10minütiger Umsetzung wird diese Lösung zu der in Beispiel 31 d erhaltenen Lösung des Chlorhydrats des 4-Hydroxymethylbiphenylglycylglycyl-L-phenylalanyl-L-leucin-3-met'iylbenzc2*¹= (0 0135mol in 40cm³ Dichlormethan) unter Rühren bei -15°C zugegeben und anschließend 1,5cm³ (0,0135mol) N-Methylmorpnolin ergänzt. Nach 4stündiger Umsetzung unter Rühren wird das Reaktionsgemisch nacheinander mit

50cm³ verdünnter H₂SO₄ (pH-Wert 6,6),

25cm³ verdünnter H₂SO₄ (pH-Wert 2,2),

2x 40cm³ Wasser (pH-Wert 4,3 bis 3,8)

40cm³ verdünntem KHCO₃ (pH-Wert 8,1) und

2x 40cm³ Wasser (pH-Wert 7,9 bi? 6,9) gewaschen.

Die organische Phase wird verdampft und 14,4g oines weißen Feststoffs mit baiserartigem Aussehen erhalten. Die Analyse durch Dünnschichtchromatographie auf einer Sliciumdioxidschicht ergab ein einziges Produkt. Die Struktur des Produkts wurde durch Massenspektrometrie und Protonen-NMR-Spektroskopie (360MHz) und seine Reinheit durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) nachgewiesen.

Beispiel 31 f: Synthese des N-tert-Butyloxycarbonyl-L-tyrosylglycytglycyl-L-phenylalanyl-L-leucins

In einem 100-cm³-Dreihalskolben werden 5g des4-Hydroxymethylbiphenyl-3-methylb3nzoats des N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyroxylglycylglycyl-L-phenylalanyl-L-leucins in 15cm³ Methanol suspendiert.

Man gibt 15,7cm³1 N Natronlauge und 15cm³ Acetonitril hinzu.

Nach 4stündiger Umsetzung ergänzt man mit 20cm³ Ethylether.

Die wäßrige Phase wird dekantiert und mit 2x 20cm³ Ethylether gewaschen, anschließend durch eine 5%ige KHSO₄-Lösung auf einen pH-Wert von 3 angesäuert.

Man extrahiert das N-tert.-Butyloxycarbonylpentapeptid mit einem 75/5-Gemisch aus Ethylacetat und Ethylether.

Die (rganische Phase (75cm³) wird mit 2x 30cm³ Wasser (pH-Wert 4,0 bis 5,0) gewaschen.

Die am Schluß erhaltene organische Phase wird in einem Maßkolben auf 100cm³ für die HPLC-Analyse, die auf einen Reinstandard bezogen ist, verdünnt.

Die nach Extraktion und Verseifung nachgewiesene Ausbeute beträgt 94,5%, bezogen auf das Chlorhydrat des 4-Hydroxymethylbiphenyl-L-leucin-3-methylbenzoats, was bedeutet, daß man in jeder Stufe eine Ausbeute höher als 99% erhalten hat.

Nach der Analyse wird die organische Lösung unter sehr geringem Druck konzentriert und getrocknet. Der erhaltene Rückstand (3,5 g bei einer Ausbeute von 100%) wird in Isopropylalkohol gelöst und anschließend durch Zugabe von Diisopropylether ausgefällt.

Diese Verfahrensstufe wird ein zweites Mal zum abschließenden Erhalten von 2,42g eines Pulvers wiederholt und ergibt eine Ausbeute des isolierten reinen Produktes von 71 %.

Die Reinheit des Produktes wird durch HPLC-Analyse, durch Protonen-NMR-Spektroskopie (360MHz) und durch Massenspektrometrie nachgewiesen.

Beispiel 31 g: Herstellung von L-Tyrosylglycylglycyl-L-phenylalanyl-L-leucin-trlfluoracetat

In einen 50-cm³-Dreihalskolben löst man bei Umgebungstemperatur 2,12g (2,78mmol) des im Beispiel 31 f hergestellten

N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosylglycylglycyl-L-phenylalanyl-L-leucins in 10cm³ eines Gemisches aus 1:1 Volumenteilen Dichlormethan/Anisol und 5cm³TrifluoresFigsäure auf.

Nach einstündiger Umsetzung unter Rühren wird die Lösung unter vermindertem Druck konzentriert.

Das Produkt wird bezogen auf einen 100%igen Reinheitsstandard analysiert.

Die Ausbeute nach der Entfernung beträgt 100% (2,78mmol des analysierten Produkts).

Die analysierte Lösung wird anschließend zum Erhalten von 1,72g eines weißen Pulvers lipopholisiert, was einer Endausbeute

des gewonnenen Produkts von 92,5%, bezogen auf das N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosylglycylglycyl-L-phenylanalyl-L-leucin entspricht.

Die Reinheit des Produkts wird durch HPLC-Analyse, durch Protonen-NMR-Spektroskopie (360MHz) und durch Massenspektrometrie nachgewiesen.

Die Elementaranalyse des Endprodukts ergibt

C =53,1%

H = 5,7%

N = 9,9%

F = 8,1%

und eine Bruttoformel C₂SH₃₇O₇N₆, CF₃ COOH, 2H₂O.

Claims

^Λ . Verfahren zur Solubilisation von gegebenenfalls geschützten oder als Salz vorliegenden Peptiden in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß die C-terminale Gruppe dieses Peptids über eine Amid- oder Esterbindung an eine lipophile Gruppe gebunden ist, letztere, falls sie an L-Serin gebunden ist, ein Molekül ergibt, dessen Löslichkeit in Wasser bei 25°C kleiner als 30g/l beträgt und diese lipophile Gruppe chemisch definiert und nicht polymer ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lipophile Gruppe aus zwei chemischen Einheiten A und L zusammengesetzt ist, die miteinander durch eine kovalente Bindung verbunden sind, in der

- A ein Bindeglied zwischen dem Peptid und der Gruppe L und

- L eine lipophile Kohlenwasserstoffgruppe bedeutet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe A ein bifunktionelles Bindeglied ist, das wenigstens eine Alkohol- oder Amingruppe (B) und am anderen Ende eine Carbonyl- oder Ethergruppe aufweist und die allgemeine Formel

B-R i-f

hat, worin

- B eine Hydroxyl- oder Aminogruppe

- Ar einen mono- oder polycyclischen aromatischen Rest

- Ri eine kovalente Bindung, einen 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthaltenden, gegebenenfalls durch einen Phenylrest substituierten Alkylenrest oder eine Alkylencarbonylgruppe

- R2 eine kovalente Bindung, einen 1 bis 4 Kohlenstoffatcme enthaltenden und gegebenenfalls substituierten Alkylenrest, eine 1 bis 4 Kohlenstoffatome in der Alkylenkette enthaltende Oxyalkylengruppe oder ein Sauerstoffatom bedeutet und

- k, m und η gleich 0 oder 1 sind und

- p1 oder 2 ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die lipophile Gruppe L die Formel

hat, worin

- X ein aus Fluor, Chlor und Brom ausgewähltes Halogen bedeutet und

- a bis g ganzzahlig sind und

- a zwischen 1 und 50

- b zwischen 3 und 101

- c zwischen 0 und 6

- d zwischen 0 und 2

- e zwischen 0 und 2
-f zwischen 0 und 2 und

- g zwischen 0 und 20 liegen.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei Einheiten A und L eine einzige Gruppe nach einer der Formeln

B-R₁-Ar' oder B-CH₍₃__qrAr",_q)

bilden können, worin

- B eine Hydroxyl-oder Aminogruppe

- Ri eine kovalente Bindung, einen 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthaltenden, gegebenenfalls durch einen Phenylrest substituierten Alkylenrest und eine Alkylencarbonylgruppe

- Ar' einen polycyclischen aromatischen Rest und

- Ar" einen Benzolrest bedeuten und

- q 2 oder 3 ist.
6. Verfahren zur Synthese von gegebenenfalls gestützten Peptiden im flüssigen Milieu, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem nach den Ansprüchen 1 bis 5 solubilisierten Starterpeptid oder einer -aminosäure ausgeht und daß man nacheinander einzeln die an der Säuregruppe aktivierten und an der Aminogruppe geschützten Aminosäuren zugibt.
7. Verfahren zur Synthese von gegebenenfalls geschützten Peptiden im flüssigen Milieu, dadurch gekennzeichnet, daß man von einer nach einem der Ansprüche 1 bis 5 solubilisierten Aminosäure oder einem Peptiri ausgeht und daß man ein anderes Peptid mit seiner aktivierten C-terminalen Säuregruppe un d seiner geschützten N-terminalen Aminogruppe anknüpft.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Milieu aus einem aus den halogenierten aliphatischen und aromatischen Verbindungen und den Estern ausgewählten Lösungsmittel besteht.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, iß die N-terminale Aminogruppe durch eine tert.-Butyloxycarbonyl(Boc)-Gruppe oder durch Umsetzung mit einer ß-Dicarbonylverbindung geschützt ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Säuregruppe durch ein Säurechlorid, ein Alkylchlorformiat, ein Carbodiimid oder durch einen aktivierten Ester aktiviert ist.
11. Verfahren nach oinem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das C-terminale Starterpeptid in das Reaktionsmilieu eingebracht, anschließend die an ihrer Säuregruppe aktivierte und ihrer Aminogruppe geschützte Aminosäure oder das Peptid zugegeben, nach Umsetzung die Nebenprodukte und der Überschuß an Ausgangsprodukten aus der organischen Phase durch Waschen mit neutralen, sauren oder basischen wäßrigen Lösungen entfernt, im Anschluß daran die Aminogruppe deblockiert und schließlich eine neue Aminosäure oder ein neues in seiner Säuregruppe aktiviertes und seiner Aminogruppe geschütztes Peptid eingebracht wird.