DE602005004153T2

DE602005004153T2 - Verfahren für peptidsynthese

Info

Publication number: DE602005004153T2
Application number: DE602005004153T
Authority: DE
Inventors: Matthieu Giraud; Michaela Williner; Oleg Werbitzky
Original assignee: Lonza AG
Current assignee: Lonza AG
Priority date: 2004-07-16
Filing date: 2005-07-13
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2025-07-14
Also published as: EP1771463B1; ES2299064T3; ATE382629T1; JP2008511543A; PL1771463T3; PT1771463E; SI1771463T1; DK1771463T3; BRPI0511831A; EP1771463A1; JP4908408B2; US20080200648A1; KR101222837B1; DE602005004153D1; KR20070042170A; WO2006008050A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet pharmazeutisch wertvoller Polypeptide, insbesondere ein diesbezügliches Verfahren der chemischen Derivatisierung zur Verstärkung der biologischen Wirksamkeit solcher Peptide. Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren der chemischen Amidierung des C-Terminus eines Polypeptids.
Kleine Peptide enthaltende Arzneimittel haben als eine eigenständige, wertvolle Klasse pharmazeutisch wirksamer Inhaltsstoffe an Bedeutung gewonnen. Bei antiinfektiven Peptiden zum Beispiel, insbesondere bei kationischen Peptiden, deren industrielle biotechnologische Herstellung in US 2003/0219854 A1 beschrieben ist, handelt es sich um eine neue Klasse von antimikrobiellen Substanzen mit Breitbandwirkung, die dazu beitragen können, die schnelle Ausbreitung einer Resistenz gegen eine Mehrzahl von Arzneimitteln aus der Klasse der Standardantibiotika unter pathogenen Mikroben zu bekämpfen.
Natürlich vorkommende antiinfektive Peptide enthalten posttranslationale Modifikationen wie eine C-terminale Amidierung, die für eine anhaltende biologische Wirksamkeit von entscheidender Bedeutung sind (Boman, Immunol. Rev. 173:5, 2000). Eine C-terminale Amidierung eliminiert zum Beispiel eine potentielle Ladung und schützt weiterhin gegen den schnellen Abbau durch allgegenwärtige Exopeptidasen. Während bei einer vollständig chemischen Synthese C-terminale Amidfunktionen in geeigneter Weise während der Synthese eingeführt werden können (z. B. Han et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6326-6339; Albericio, F. und Barany, G., Int. J. Peptide Protein Res. 30, 1987, 206-216), besteht bei der kostengünstigeren biotechnologischen Route der Verarbeitung von Einzelpeptiden aus großen Kopf-Schwanz-Peptidkonkatemeren diese Möglichkeit nicht. Ein biotechnologisch hergestelltes Peptid gemäß US 2003/0219854 A1 muss daher in einem Downstream-Verarbeitungsschritt C-terminal amidiert werden. Bei den bisher beschriebenen Ansätzen zur chemischen Amidierung kommt es jedoch in beträchtlichem Grade zu einer Racemisierung des Peptidgerüsts.
In der US 2003/0219854 wird die terminale Amidierung eines tryptophanreichen Boc-geschützten 12-Mers durch die Umsetzung mit einem Überschuss an Ammoniak und einem basischen Reagenz (20 Äq.) in dem aprotischen Lösungsmittel DMF in Gegenwart von nahezu stöchiometrischen Mengen (6 Äq.) eines Uronium-Kupplungsreagenz (HATU: O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat) und des Koaktivators N-Hydroxy-9-azabenzotriazol beschrieben. Die Ausbeute an amidiertem, entschütztem Peptidderivat wurde als 47% angegeben.
Eine vorsichtige Nachstellung dieser Reaktionssequenz und der Analyse des Reaktionsprodukts (siehe Exp. Teil) zeigt, dass die niedrige Ausbeute hauptsächlich auf die unerwünschte Epimerisierung der C-terminalen Aminosäure zurückzuführen ist, die zu zwei amidierten Diastereomeren in einem Verhältnis von nahezu 1:1 führt, was durch sowohl mit einem Tween-20- und einem Cyclodextrin-CE-Verfahren erhaltene Elektropherogramme bestätigt wurde. Dieses erhaltene Verhältnis wurde außerdem durch eine Umkehrphasen-LC/ESI-MS-Tandemchromatographie unter Verwendung von Marfeys Reagenz als chirales Derivatisierungsmittel für das hydrolisierte Peptid, wie ausführlich im experimentellen Teil der vorliegenden Anmeldung beschrieben, bestätigt. Dies bedeutet, dass die Hälfte des Produkts bei der Amidierung aufgrund einer effizienten Racemisierung der C-terminalen Aminosäure verlorengeht.
Ein anderes Verfahren, das nur im Rahmen einer Festphasensynthese anwendbar ist, ist in Albericio, F. und Barany, G., Int. J. Peptide Protein Res. 30, 1987, 206-216 beschrieben. Das Verfahren ist jedoch umständlich, da es die Bildung spezieller FMOC-Trisalkoxy-Benzylamid-„Griffe” für die Funktionalisierung des Trägerharzes erfordert. Nach der Kupplung und der Synthese des Peptids am Träger liefert die Abspaltung vom auf diese Weise modifizierten Trägerharz in einfacher Weise amidiertes Peptid mit einer optischen Reinheit von etwa 80% des gewünschten Diastereoisomers, was zu einer niedrigeren Spaltungseffizienz beiträgt, so dass man eine Gesamtausbeute von nur etwa 60 bis 70% des gewünschten amidierten Diastereoisomers des Peptids erhält. Ein ähnlicher Ansatz mit chemisch leicht verschiedenen Amidgriffen ist vom gleichen Autor in US 5306562 beschrieben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Vermeidung der Nachteile des Stands der Technik und die Entwicklung eines anderen bzw. eines verbesserten Verfahrens zur chemischen, nicht-enzymatischen Amidierung einer ungeschützten α-Carboxylgruppe eines Peptids oder einer Aminosäure. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Amidierung der freien α-Carboxylgruppe einer Aminosäure oder eines Peptids gelöst, bei dem man als ersten Schritt die besagte Aminosäure oder bevorzugt das besagte Peptid mit einem Peptidkupplungsreagenz in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer Base und weiterhin in Gegenwart eines Ammoniumsalzes mindestens eines Peptidkupplungszusatzes, wobei das Ammoniumkation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus protoniertem Ammoniak, protoniertem primären Amin und protoniertem sekundären Amin, und wobei die Seitenkette und die α-Aminofunktion oder die besagte Aminosäure bzw. das besagte Peptid mit nicht-baselabilen Schutzgruppen geschützt sind, umsetzt.
Es versteht sich, dass das Basenreagenz und das Ammoniumkation des Salzes vorzugsweise nicht identisch sind und somit kein konjugiertes Säure-Base-Paar bilden. Vielmehr liegen eine erste Base und eine zweite Base vor, wobei es sich bei der zweiten Base um das Ammoniumkation gemäß der vorliegenden Erfindung handelt. Im folgenden ist der Ausdruck „Base" stets so zu verstehen, dass er sich ausschließlich auf die erste Base bezieht. Die zweite Base wird stets als das Ammoniumkation bezeichnet.
Das Vefahren der vorliegenden Erfindung bietet den Vorteil, dass es die nachteilige Epimerisierung des α-Kohlenstoffatoms des Aminosäurerestes, der an seiner α-Carboxylgruppe amidiert wird, auf ein Minimum reduziert. Bei Di- oder höheren N-Mer-Peptiden handelt es sich bei diesem Aminosäurerest um den C-Terminalrest eines Peptids, bei dem es sich um eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt.
Bei dem Peptid bzw. Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann es sich um ein beliebiges Peptid handeln. Durch Schützen der Seitenketten und der α-Aminofunktion lässt sich eine ausreichende Löslichkeit eines in geeigneter Weise geschützten Peptids bzw. einer in geeigneter Weise geschützten Aminosäure in dem organischen Lösungsmittel erzielen. Es versteht sich von selbst, dass die Lösungsmittelbedingungen gemäß der vorliegenden Erfindung sich als günstig für eine effiziente Amidierung unter Retention der Konfiguration erweisen, sich jedoch als denaturierend in der Hinsicht erweisen können, als dass die Sekundär- oder sogar die Tertiärstruktur längerer Peptide nicht verändert wird, insbesondere wenn eine solche Sekundär- bzw. Tertiärstruktur nicht durch kovalente Bindungen zwischen den Ketten oder ähnliche, möglicherweise nicht-natürliche Strukturelemente stabilisiert wird.
Vorzugsweise umfasst ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung 100 Aminosäurereste oder weniger, besonders bevorzugt 50 Aminosäurereste oder weniger, ganz besonders bevorzugt 20 Aminosäurereste oder weniger. Diese Definition schließt Peptide ein, die nicht-natürliche Komponenten enthalten, wie z. B. D-Aminosäuren, L- oder D-Aminosäuren mit modifizierten oder ungewöhnlichen Seitenketten oder Nicht-Aminosäure-Bausteinen, die verschiedene Teile der Peptidkette in dem obenerwähnten Peptid miteinander verbinden. Die Festphasensynthese ermöglicht eine effiziente Synthese von Peptiden mit nahezu 50 Resten, obwohl eine weitere Segmentkondensationsreaktion in flüssiger Phase eine Produktion noch längerer vollsynthetischer Peptide ermöglicht. Für aus der biotechnologischen Produktion erhaltene Peptide gibt es nun Längeneinschränkungen. Bei der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, den Wassergehalt der Reaktionsmischung zu reduzieren sowie geeigneterweise andere protische Lösungsmittel auszuschließen und neben Wasser insbesondere niedere C1-C5-Alkylalkohole wie Methanol, Isopropanol oder Ethanol auszuschließen. Bei dem Peptid handelt es sich vorzugsweise um ein antimikrobielles oder antiinfektiöses bakterielles Peptid, vorzugsweise ein kationisches antimikrobielles Peptid wie z. B. ILRWPWWPWRRK, Indolicidin, die in ihrer C-terminal amidierten Form wirksamer sind. Antiinfektive Peptide, insbesondere kationische Peptide wie Indolicidinderivate und besonders ILRWPWWPWRRK, dessen industrielle biotechnologische Herstellung in US 2003/0219854 A1 beschrieben ist, handelt es sich um eine neue Klasse antimikrobieller Substanzen mit Breitbandwirkung, die dazu beitragen können, die schnelle Ausbreitung einer Resistenz gegen eine Mehrzahl von Arzneimitteln aus der Klasse der Standardantibiotika unter pathogenen Mikroben zu bekämpfen.
Die Amidierungsreaktion wird vorzugsweise mit einem Wassergehalt von weniger als 25 Vol.-%, besonders bevorzugt weniger als 15 Vol.-%, ganz besonders bevorzugt weniger als 5 Vol.-%, durchgeführt. Bei einer weiter bevorzugten Ausführungsform wird die Umsetzung unter im Wesentlichen wasserfreien Bedingungen durchgeführt. Dies kann zum Beispiel die Verwendung von frisch destilliertem Lösungsmittel oder die Verwendung einer schützenden Stickstoffatmosphäre einschließen.
Bei dem organischen Lösungsmittel handelt es sich vorzugsweise um ein aprotisches organisches Lösungsmittel, besonders bevorzugt um ein polares aprotisches organisches Lösungsmittel. Geeignete Beispiele sind Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dichlormethan und N,N-Dimethylformamid. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem organischen aprotischen Lösungsmittel um N,N-Dimethylformamid.
Die Amidierungsreaktion wird vorzugsweise bei –15°C bis 50°C und einem pH-Wert, der während der Umsetzung im Bereich von etwa pH 8 bis 9, vorzugsweise bei etwa pH 8,5, gehalten wird, durchgeführt.
Die Reagenztypen, auf die oben Bezug genommen wurde, wie z. B. Kupplungsmittel, Kupplungszusätze und Schutzgruppen, sind aus der Standardpeptidsynthese, bei der es sich im Wesentlichen um eine Amidierungsreaktion handelt, gut bekannt und ausführlich z. B. in Bodanszky, M., Principles of Peptide Synthesis, 2. Auflage, Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993) beschrieben.
Nicht-baselabile Schutzgruppen sind im Stand der Technik gut bekannt, wobei der Ausdruck „baselabil" so ausgelegt wird, dass er sich auf eine Abspaltung bei basischem pH-Wert und/oder eine Aminolyse durch primäre oder sekundäre Amine bezieht, wie dies im Stand der Technik üblich ist. Geeignete Beispiele sind z. B. die 2-Nitromethoxyphenylsulfenyl-, die Alloc-(Allyloxycarbonyl-), die Z-(Benzyloxycarbonyl-), die Boc-(tert.-Butoxycarbonyl-) und die Bpoc-(Biphenylylisopropoxycarbonyl-)gruppe. Orthogonale Schutzschemata, die einen baselabilen Schutz einschließen, sind von der vorliegenden Erfindung natürlich ausgeschlossen. Ob ein globaler Schutz mit einem einzigen Typ von Schutzgruppe oder ein Schutz durch verschiedene Typen von Schutzgruppen im gleichen Peptid bzw. in der gleichen Aminosäure erforderlich ist, hängt von der Quelle des Peptids aus chemischer oder biotechnologischer Synthese und der in dem Peptid bzw. der Aminosäure enthaltenen Typ von Seitenkette ab. Es sei angemerkt, dass die Abspaltung solcher nicht-baselabiler Gruppen auf verschiedene Weisen oder unter verschiedenen Reaktionsbedingungen erfolgen kann. So wird zum Beispiel die Nps-(o-Nitrophenylsulfenyl-)gruppe günstig durch Sulfhydrylnukleophile entfernt, Z-Gruppen werden durch Hydrogenolyse entfernt oder Alloc-Gruppen können durch Pd(I)-katalysierte Hydrierung entfernt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden geeigneterweise nicht-baselabile Schutzgruppen vorzugsweise nach der Amidierung durch Azidolyse entfernt, wie dies zum Beispiel bei Boc-, Z-, Trityl-, Nps- oder Bpoc-Gruppen möglich ist.
Aus dem Hauptgedanken der vorliegenden Erfindung folgt, dass der Schutz von Aspartyl- und Glutamylseitenketten, die in dem Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung vohanden sein können, einer besonderen Beachtung bedarf und geeignete Carboxylschutzgruppen für das selektive Schützen bzw. Maskieren von ω-Carboxylgruppen bedarf, so dass die C-terminale α-Carboxylgruppe verbleibt. Dies lässt sich zum Beispiel durch eine globale Veresterung von Carboxylgruppen mit einem Benzylhalogenid unter Erhalt eines Benzylesters und anschließende regioselektive Spaltung des α-Esters mit LiOH in Aceton (Bryant, P. et al., 1959, J. Chem. Soc., S. 3868 ff.) oder durch die selektive Veresterung von ω-Carboxylgruppen mit Alkylhalogeniden in Gegenwart von Cu(II)-Salzen unter Maskierung der α-Funktion während der Veresterung durch Komplexbildung (Ledger, R., 1965, Austral. J. Chem. 18:1477ff) erzielen; das Entschützen der ω-Carboxylgruppe kann auch durch eine Cu(II)-Katalyse unterstützt werden (Prestidge, R., 1975, J. Org. Chem. 40:3287ff).
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das zu amidierende Peptid bzw. die zu amidierende Aminosäure mit Ausnahme der zu amidierenden C-terminalen α-Carboxylgruppe frei von Carboxylgruppen und vorzugsweise frei von Glutamyl- oder Aspartylresten.
Da gegebenenfalls die Erzeugung von Glutaminyl- oder Asparaginylresten durch begleitende ω-Carboxylgruppen wünschenswert ist und bei der synthetischen Gesamtstrategie eines Peptids oder einer Aminosäure gemäß der vorliegenden Erfindung berücksichtigt werden muss, ist es eine weitere unabhängige Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Amidierung der freien α-Carboxylgruppe einer Aminosäure oder eines Peptids, umfassend als Schritt die Reaktion der besagten Aminosäure oder des besagten Peptids mit einem Peptidkupplungsreagenz in Gegenwart einer ersten Base und weiter in Gegenwart eines Ammoniumsalzes mindestens eines Peptidkupplungszusatzes, wobei das Ammoniumkation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus protoniertem Ammoniak, protoniertem primären Amin und protoniertem sekundären Amin, und wobei die Seitenkette und die α-Aminofunktion der besagten Aminosäure oder des besagten Peptids mit nicht-baselabilen Schutzgruppen geschützt sind, außer der Carboxylgruppen von einzelnen Aspartyl- oder Glutamylresten, und wobei besagte ω-Carboxylgruppen gleichzeitig mit der freien α-Carboxylgruppe in der Reaktion amidiert werden, bereitzustellen. Diese zweite Aufgabe ist besonders bevorzugt, wenn Ammoniak als Salzverbindung verwendet wird, aus dem offensichtlichen Grund, dass natürliche Aminosäureamide, nämlich Asparaginyl und/oder Glutaminyl, erhalten werden.
Alle oben oder in den folgenden Abschnitten angeführten technischen Erläuterungen und Beschreibungen der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die sich auf die erste Aufgabe der Erfindung beziehen, erstrecken sich gleichermaßen auf diese zweite Aufgabe, es sei denn, sie sind offensichtlich unvereinbar mit dieser zweiten Aufgabe der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel wenn die vollständige Abwesenheit jeglicher Aspartyl- oder Glutamylreste im Peptid beansprucht wird.
Kupplungsreagenzien für die Peptidsynthese sind im Stand der Technik gut bekannt (fliehe z. B. Bodanszky, oben). Bei den Kupplungsreagenzien kann es sich um gemischte Anhydride (z. B. T3P: Propanphosphonsäureanhydrid) oder andere Acylierungsmittel wie aktivierte Ester oder Säurehalogenide (z. B. ICBF, Chlorameisensäureisobutylester) handeln, oder es kann sich bei ihnen um Carbodiimide, aktivierte Benzotriazinderivate (DEPBT: 3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-on) oder Uronium- oder Phosphoniumsalzderivate von Benzotriazol handeln. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Kupplungsreagenz um ein Kupplungsreagenz mit Ausnahme eines Carbodiimids.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Kupplungsreagenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Uroniumsalzen und Phosphoniumsalzen, von denen gefunden wurde, dass sie die besten Gesamtausbeuten und den besten Schutz gegen Racemisierung beim Verfahren der vorliegenden Erfindung geben.
Weiterhin ist das Kupplungsreagenz besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Uroniumsalzen und Phosphoniumsalzen von Benzotriazol, die dazu in der Lage sind, die α-Carboxylgruppe zu aktivieren, und die Umsetzung wird besonders bevorzugt in Gegenwart einer Base durchgeführt. Geeignete und gleichermaßen bevorzugte Beispiele für solche Uronium- bzw. Phosphoniumkupplungssalze sind z. B. HBTU (O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat), BOP (Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat), PyBOP (Benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat), PyAOP, HCTU (O-(1H-6-Chlorbenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat), TCTU (O-(1H-6-Chlorbenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat), HATU (O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat), TATU (O-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat), TOTU (O-[Cyano(ethoxycarbonyl)methylenamino]-N,N',N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat), HAPyU (O-(Benzotriazol-1-yl)oxydipyrrolidinouroniumhexafluorphosphat.
Vorzugsweise handelt es sich bei der Base bzw. der ersten Base um eine schwache Base, deren konjugierte Säure einen pKa-Wert von pKa 7,5 bis 15, besonders bevorzugt von pKa 7,5 bis 10, aufweist, mit Ausnahme einer α-Aminofunktion eines Peptids oder einer Aminosäure oder eines Aminosäurederivats, wobei es sich bei der Base vorzugsweise um ein tertiäres, sterisch gehindertes Amin handelt. Beispiele dar und weiter bevorzugt sind Hünig-Base (N,N-Diisopropylethylamin), N,N-Dialkylanilin, 2,4,6-Trialkylpyridin oder N-Alkylmorpholin, wobei es sich bei dem Alkyl um geradkettiges oder verzweigtes C₁-C₄-Alkyl handelt; besonders bevorzugt ist N-Methylmorpholin oder Collidin (2,4,6-Trimethylpyridin), ganz besonders bevorzugt ist Collidin. Alle oben und im Folgenden beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen werden besonders bevorzugt in Kombination mit einem ersten schwachen Hasenreagenz durchgeführt, wie in diesem Abschnitt beschrieben.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform führt man das Amidierungsverfahren mit einem Carbodiimid als Kupplungsreagenz und vorzugsweise und insbesondere in Gegenwart eines tertiären Amins durch. Besonders bevorzugt ist das Carbodiimid-Kupplungsreagenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Diisopropylcarbodiimid, Dicylohexylcarbodiimid und 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid; ganz besonders bevorzugt ist 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid. Carbodiimide sind jedoch aus technischen Gründen weniger für die industrielle Maßstabsvergrößerung synthetischer Verfahren geeignet. Die Umsetzung unter Verwendung eines Carbodiimids als Kupplungsreagenz wird vorzugsweise in Gegenwart eines zweiten Kupplungszusatzes, bei dem es sich nicht um das besagte Ammoniumsalz handelt, durchgeführt, wobei es sich bei dem zweiten Zusatz um ein protoniertes, d. h. nichtionisches, N-Hydroxybenzotriazol oder N-Hydroxybenzotriazolderivat handelt, das den unmittelbar unten angeführten Definitionen entspricht.
Die Verwendung von Kupplungszusätzen, insbesondere von Kupplungszusätzen des Benzotriazoltyps, ist ebenfalls bekannt. Daher ist es weiter bevorzugt, dass es sich bei dem Kupplungsreagenzzusatz um eine nukleophile Hydroxyverbindung handelt, die dazu in der Lage ist, aktivierte Ester zu bilden, und besonders bevorzugt eine azide, nukleophile N-Hydroxyfunktion aufweist, wobei es sich bei N um Imid oder um N-Acyl- oder N-Aryl-substituiertes Triazeno handelt; ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Kupplungszusatz um ein N-Hydroxybenzotriazolderivat (bzw. ein 1-Hydroxybenzotriazolderivat) oder um ein N-Hydroxybenzotriazinderivat. Solche Kupplungszusatz-N-Hydroxyverbindungen sind in WO 94/07910 und EP-410 182 beschrieben. Beispiele sind z. B. N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin, 1- Hydroxy-7-azabenzotriazol und N-Hydroxybenzotriazol. N-Hydroxybenzotriazinderivate sind besonders bevorzugt; bei einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Kupplungsreagenzzusatz um Hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin. Ammoniumsalzverbindungen von Kupplungszusätzen sind bekannt und wurden zum Beispiel in US 4806641 beschrieben.
Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Uronium- oder Phosphoniumsalzkupplungsreagenz um ein Uroniumsalzreagenz und bevorzugt um HCTU, TCTU oder HBTU, das in der Umsetzung noch mehr bevorzugt in Kombination mit einem Ammoniumsalz von N-Hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin eingesetzt wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist anzumerken, dass HCTU und TCTU so definiert sind, dass sie unter den Begriff „Uroniumsalzreagenz" fallen, obwohl diese Verbindungen und ihre Analoga der Formel I gemäß Kristallstrukturanalyse eine Isonitrosogruppe und keine Uroniumgruppe enthalten (O. Marder, Y. Shvo and F. Albericio HCTU and TCTU: New Coupling Reagents: Development and Industrial Applications, Poster, Presentation Gordon Conference February 2002), wobei ein N-Amidinosubstituent am heterocyclischen Kern statt dessen zu einer Guanidiniumstruktur führt. Diese Klasse von Verbindungen gemäß der Formel I wird daher gemäß der vorliegenden Erfindung als die Unterklasse vom Guanidiniumtyp der Uroniumsalzreagenzien bezeichnet:
wobei R1, R2, R3, R4 jeweils für Alkyl stehen und vorzugsweise unabhängig voneinander für Ethyl oder Methyl stehen und wobei Atom A für N oder C steht und wobei R5 für H oder vorzugsweise für einen elektronenziehenden Substituenten und besonders bevorzugt für Chlor steht und wobei X für ein komplexes Anion, vorzugsweise für Hexafluorphosphat oder Tetrafluorborat, steht.
Was das in den Salzen der vorliegenden Erfindung zu verwendende Ammoniumkation betrifft, so handelt es sich bei dem Ammoniumkation um H₂N⁺R1R2, wobei R1, R2 jeweils unabhängig voneinander für H oder C1-C10-, vorzugsweise C1-C5-, aliphatisches oder alicyclisches Hydrocarbyl stehen, das gegebenenfalls weiter durch Aryl, Alkoxy, Aralkoxy, Alkylaryl, Aryloxy, Hydroxy oder Halogen substituiert sein kann, vorzugsweise mit Ausnahme von N-heteroaromatischen Gruppen. R1 und R2 sind vorzugsweise nicht weiter substituiert und, wie oben definiert, Alkyl. Besonders bevorzugt steht R1 für H und R2 für Methyl, Ethyl, Propyl oder Isopropyl, oder R1, R2 stehen beide für H, d. h. bei dem Kation handelt es sich um NH₄ ⁺. NH₄ ⁺ ist ganz besonders bevorzugt.
Vorzugsweise wird in einem zweiten Schritt nach dem ersten Reaktionsschritt die amidierte Aminosäure bzw. das amidierte Peptid isoliert und in einem dritten Schritt entschützt, so dass man die freien Seitenketten und die freie α-Aminofunktion erhält; die amidierte Aminosäure bzw. das amidierte Peptid wird vorzugsweise durch Azidolyse teilentschützt oder vollständig entschützt. Bei einer möglichen, jedoch weniger bevorzugten, Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Aminosäure auf diese Weise amidiert und das reine L-Aminosäurecarbonsäureamid erhalten, indem geeigneterweise seitenkettenmaskierende oder -schützende Gruppen erhalten bleiben, zur Verwendung eines Überschusses an einem solchen Aminosäureamid bei einem normalen Segmentkondensationspeptidsyntheseschema mit einem zweiten Peptidfragment. Auf diese Weise werden unnötige Verluste bei dem teureren, zum Beispiel aus der Festphasensynthese stammenden Peptid aufgrund der durch die Amidierung verursachten Racemisierung vermieden, während das billigere Aminosäureamid in großem Überschuss für eine effiziente Kupplung verwendet werden kann. Diese Ausführungsform ist besonders geeignet für die Verwendung von Ammoniak oder niederen Alkylaminen wie oben bei der Amidierungsreaktion gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das geschützte Peptid der vorliegenden Erfindung an ein herkömmliches Trägerharz gekuppelt, indem man eine Seitenkette an der funktionellen Verbindungsgruppe des Harzes verankert. Der C-Terminus verbleibt somit frei zum Zweck der Amidierung. Bei diesem Träger kann es sich um ein beliebiges Harz handeln, das herkömmlicherweise im Stand der Technik verwendet wird, wie z. B. CTC-, Wang- oder Merrifield-Harz. Auf diese Weise ermöglicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine effiziente Rückgewinnung und Entschützung des Amidierungsprodukts. Weiter bevorzugt wird in einem zweiten Schritt nach dem ersten Reaktionsschritt die amidierte, geschützte Aminosäure oder vorzugsweise das amidierte, geschützte Peptid isoliert und in einem darauffolgenden dritten Schritt entschützt, so dass man die freien Seitenketten und die freie α-Aminofunktion erhält; vorzugsweise wird teilweise oder vollständig durch Azidolyse entschützt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amidierung eines beispielsweise biotechnologisch hergestellten, ungeschützten Peptids mit einer freien α-Carboxylgruppe, welches die folgenden Schritte umfasst

a) Rückgewinnung und Isolierung des Peptids aus einem konkatemeren Fusionsprotein dieses Peptids, wobei das Fusionsprotein weiterhin dazwischenliegende Verbindungssequenzen enthalten kann,
b) die Derivatisierung mindestens der α-Aminofunktion des ungeschützten Peptids mit nicht-baselabilen Schutzgruppen, wobei vorzugsweise auch nukleophile Gruppen individueller Aminosäureseitenketten durch nicht-baselabile Schutzgruppen geschützt werden,
c) vorzugsweise die Rückgewinnung des geschützten Peptids durch Ausfällen mit Wasser,
d) die Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppe durch das in den vorhergehenden Abschnitten beschriebene Verfahren,
e) vorzugsweise die Isolierung des amidierten Peptids,
f) und die Entschützung der Seitenketten und der α-Aminofunktion.

Alle der oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen, die die Peptide der vorliegenden Erfindung betreffen, gelten gleichermaßen spezifisch und vorzugsweise für (C-terminal) amidierende antimikrobielle Peptide, vorzugsweise für antimikrobielle Peptide, besonders bevorzugt für ILRWPWWPWRRK und/oder andere Indolicidinderivate.
Beispiele
Boc-Schützen des 12mers ILRWPWWPWRRK-OH
Das Peptid wurde im Wesentlichen wie in der US 2003/0219854 A1 beschrieben geschützt, wobei allerdings das Produkt durch Ausfällen anstatt durch Lyophilisieren zurückgewonnen wurde. Das di-Bocgeschützte ILRWPWWPWRRK-OH (diBoc-MBI 1187) (ESI-MS:m/z 1980) wurde ohne weitere Aufreinigung für die anschließende Amidierung verwendet.
Die Boc-Schutzgruppen wurden mit Dikohlensäure-di-tert.-butylester (Boc₂O) in Acetonitril/1 N NaOH/H₂O eingeführt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur gerührt, der pH-Wert wurde dann auf pH 4,6 eingestellt und die organischen Lösungsmittel wurden im Vakuum abgezogen. Der pH-Wert wurde dann wieder auf 2 eingestellt. Wasser wurde zugesetzt, und die Suspension wurde auf 4°C abgekühlt, bevor der auf diese Weise gebildete Niederschlag isoliert wurde. Der Feststoff wurde mit Wasser gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.
C-terminale Amidierung von Boc-ILRWPWWPWRRK(Boc)-OH
HCTU (209 mg, 0,5 mmol) wird zu einer Lösung von diBoc-MBI 11B7 (900 mg, 0,455 mmol), N-Methylmorpholin (150 μl, 1,365 mmol) und NH₃/HOOBt (250 mg, 1,365 mmol) in DMF (36 ml) gegeben und unter einer Stickstoffatmosphäre bei 25°C gerührt. Falls erforderlich, wird der pH-Wert mit N-Methylmorpholin auf pH 8,5 (±0,5) eingestellt. Die Reaktionsmischung wird 2 h bei 25°C gerührt und überprüft, um einen pH-Wert von 8,5 (±0,2) aufrechtzuerhalten.
Das DMF wird dann im Vakuum abgedampft (Wasserbadtemperatur < 50°C). Wasser wird zugesetzt (90 ml) und die Suspension wird vor der Isolierung wenigstens 2 h bei 4°C gehalten. Der Feststoff wird abfiltriert und der Kuchen wird mit Wasser gewaschen (zweimal 25 ml). Das Rohpeptid wird 15 h im Vakuum getrocknet (Temperatur < 50°C). Man erhält ein weißes Pulver (910 mg), das einer weiteren Analyse unterzogen wird. Analyseverfahren: Derivatisierung einzelner Aminosäuren nach vollständiger Hydrolyse des Peptids
Unter Anwendung einer Behandlung mit 6N HCl wird das Peptid zu den einzelnen Aminosäuren hydrolysiert. Während dieser Behandlung wird das C-terminale Lysinamid in die entsprechende Carbonsäure (Lys-OH) umgewandelt, wie von Marfey et al. (Marfey, P., Carlsberg Res. Commun., 49, (1984), 591) beschrieben. Mit Ausnahme von möglicherweise Cys wird durch eine solche vollständige Hydrolyse die Racemisierung von Aminosäuren nicht gefördert. Kurz gesagt werden bei dem Verfahren optische Isomere von Aminosäuren im Hydrolysat mit FDAA (1-Fluor-2,4-dinitrophenyl-5-L-alaninamid) derivatisiert. Die einfache Derivatisierungsvorschrift ist innerhalb von 90 Minuten abgeschlossen.
Im vorliegenden Zusammenhang lassen sich die Lysinderivate leicht durch Umkehrphasen-HPLC auftrennen und quantifizieren. Die Derivate haben einen Absorptionskoeffizienten von ~3 × 10⁴ und lassen sich mit Picomol-Empfindlichkeit durch UV bei 340 nm nachweisen. Zunächst werden das L-Lys-NH₂ und das D-Lys-NH₂ hydrolysiert und derivatisiert. – Die Umwandlungsrate und somit die Gesamtausbeute (Umw.-%) wurde durch HPLC-Auftrennung der amidierten Diastereomere des Ausgangsmaterials bestimmt. Das die L-Konfiguration am terminalen Lysinamid beibehaltende Produkt wurde durch das Verfahren von Marfey et al. identifiziert, und der relative Überschuss an nicht-epimerisiertem L-Lys-Produkt gegenüber dem D-Lys-Produkt (%P) wurde durch HPLC bestimmt. Für die Diastereoisomeranalyse wurde ein HPLC-Verfahren im Wesentlichen wie in Marfey et al. beschrieben entwickelt, und man erhielt eine gute Auftrennung.

Für die Amidierung des gleichen Peptids wurden verschiedene Kombinationen an Kupplungsreagenzien und Zusätzen getestet (Tabelle 1). Zu Vergleichszwecken wurde, wo angegeben, in Ausnahmefällen wässiges Ammoniak zusammen mit einem separaten Kupplungszusatz anstelle des gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Ammoniumsalzes des Kupplungszusatzes verwendet (Tabelle I). „SM" gibt die Menge an umgesetztem Boc-ILRWPWWPWRRK(Boc)-OH an. Tabelle I

SM [mg]	K.-Rg.	koactiv.	Base	Lösungsmittel	„NH₃"	Umw.-%	%P
26,0	T3P	-	NMM	DMf	NH₃/HOOBt	80	92,0
51,0	HCTU	-	NMM	DMF	NH₃/HOOBt	100	92,5
51,2	HBTU	-	NMM	DMF	NH₃/HOOBt	93	93,7
51,0	EDC	Cl-HOBt	TMP	DMF	NH₃/HOOBt/CuCl₂	79	90,3
51,0	EDC	Cl-HOBt	TMP	DMF	NH₃/HOOBt	98	95,2
50,0	IBCF	-	NMM	DMF	NH₃/HOOBt	82	80,1
50,4	IBCF	-	TMP	DMF	NH₃/HOSu	88	82,2
50,9	TCTU	-	NMM	DMF	NH₃/HOOBt	89	94,2
50,1	IBCF	-	NMM	DMF	wässriges NH₃	85	52,6
304,0	HCTU	-	NMM	DMF	NH₃/HOOBt	94	94,3
49,8	HCTU	-	NMM	DMF	NH₃/HOOBt	100	94,8

Durch die Verwendung eines Ammoniumsalzes als koaktivierendes Reagenz wird die Retention der Konfiguration der C-terminalen Aminosäure verbessert.
Entschützen von Boc-ILRWPWWPWRRK(Boc)-NH₂
100 mg diBoc-Peptidamid werden in 0,8 ml DMF, zu denen 0,2 ml Trifluoressigsäure gegeben werden, entschützt. Die Mischung wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das ungeschützte Peptidamid wird dann weiter durch Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt und schließlich lyophilisiert (ESI-MS: m/z 1779).

Claims

Verfahren zur Amidierung der freien Carboxygruppe einer Aminosäure oder eines Peptids, enthaltend als ersten Schritt die Reaktion der besagten Aminosäure oder des besagten Peptids mit einem Peptidkupplungsreagenz in einem aprotischen organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer ersten Base, die nicht eine α-Aminofunktion eines Peptids oder einer Aminosäure ist, und in Anwesenheit eines Ammoniumsalzes mindestens eines Peptidkupplungszusatzes, wobei das Ammoniumkation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus protoniertem Ammoniak, protoniertem primären Amin und protoniertem sekundären Amin, wobei während der Reaktion der pH auf einen Wert im Bereich von 8 bis 9 kontrolliert wird, und wobei die Seitenkette und die α-Aminofunktion der besagten Aminosäure oder des besagten Peptids mit nicht-baselabilen Schutzgruppen geschützt sind.
Verfahren zur Amidierung der freien Carboxygruppe einer Aminosäure oder eines Peptids enthaltend als Schritt die Reaktion der besagten Aminosäure oder des besagten Peptids mit einem Peptidkupplungsreagenz in einem aprotischen organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer ersten Base, die nicht eine α-Aminofunktion eines Peptids oder einer Aminosäure ist, und in Anwesenheit eines Ammoniumsalzes mindestens eines Peptidkupplungszusatzes, wobei das Ammoniumkation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus protoniertem Ammoniak, protoniertem primären Amin und protoniertem sekundären Amin, wobei während der Reaktion der pH auf einen Wert im Bereich von 8 bis 9 kontrolliert wird, und wobei die Seitenkette und die α-Aminofunktion der besagten Aminosäure oder des besagten Peptids mit nicht-baselabilen Schutzgruppen geschützt sind ausser der ω-Carboxygruppen von einzelnen Aspartyl- oder Glutamylresten, und wobei besagte ω-Carboxygruppen gleichzeitig mit der freien α-Carboxygruppe in der Reaktion amidiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Base eine schwache Base ist, deren konjugierte Säure einen pKa-Wert von 7,5 bis 15, bevorzugt von 7,5 bis 10, hat.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die schwache Base N,N-Diisopropylethylamin, 2,4,6-Trialkylpyridin oder N-Alkylmorpholin ist, wobei das Alkyl vorzugsweise gerades oder verzweigtes C₁-C₄ Alkyl ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Kupplungsreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Uroniumsalzen und Phosphoniumsalzen des Benzotriazols und imstande ist, besagte α-Carboxygruppe zu aktivieren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ein polares aprotisches organisches Lösungsmittel ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid, Dichlormethan und N,N-Dimethylformamid; bevorzugt ist es N,N-Dimethylformamid.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Kupplungszusatz eine nukleophile N-Hydroxyverbindung ist, welche imstande ist, aktivierte Ester zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Kupplungsreagenzzusatz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin, 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol und N-Hydroxybenzotriazol.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Kupplungsreagenzzusatz Hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass während der Reaktion der pH auf einen Wert im Bereich von 8 bis 9, bevorzugt auf einen Wert von ungefähr 8,5, kontrolliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren mit einem Carbodiimid als Kupplungsreagenz, und bevorzugt in Anwesenheit eines protonierten N-Hydroxybenzotriazols als zweiter Kupplungszusatz, ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Kupplungsuroniumsalz oder- phosphoniumsalz ein Uroniumsalzreagenz, bevorzugt HCTU, TCTU oder HBTU ist, und besonders bevorzugt in Kombination mit einem Ammoniumsalz des N-Hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazins in der Reaktion verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Ammoniumkation H₂N⁺R¹R² ist, wobei R¹ und R² jeweils unabhängig H oder ein aliphatischer oder alizyklischer C₁-C₁₀, bevorzugt ein C₁-C₅, Kohlenwasserstoff sind.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ H ist und R² Methyl, Ethyl, Propyl oder Isopropyl ist, oder dass R¹ und R² beide H sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einem zweiten Schritt nach dem ersten Reaktionsschritt die amidierte, geschützte Aminosäure oder das amidierte, geschützte Peptid isoliert und in einem dritten Schritt entschützt wird, um die freien Seitenketten und α-Aminofunktion zu liefern, wobei es bevorzugt teilweise oder komplett durch Azidolyse entschützt wird.
Verfahren zur Amidierung der freien Carboxygruppe eines Peptids ILRWPWWPWRRK, enthaltend als ersten Schritt die Reaktion des besagten ILRWPWWPWRRK mit einem Peptidkupplungsreagenz in einem aprotischen organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer ersten Base, die nicht eine α-Aminofunktion eines Peptids oder einer Aminosäure ist, und ferner in Anwesenheit eines Ammoniumsalzes mindestens eines Peptidkupplungszusatzes, wobei das Ammoniumkation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus protoniertem Ammoniak, protoniertem primären Amin und protoniertem sekundären Amin, wobei während der Reaktion der pH auf einen Wert im Bereich von 8 bis 9 kontrolliert wird, und wobei die Seitenkette und α-Aminofunktion des besagten ILRWPWWPWRRK mit nicht-baselabilen Schutzgruppen geschützt sind.
Verfahren zur Amidierung der freien Carboxygruppe eines antimikrobiellen Peptids, bevorzugt eines kationischen, antimikrobiellen Peptids, enthaltend als ersten Schritt die Reaktion des besagten Peptids mit einem Peptidkupplungsreagenz in einem aprotischen organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer ersten Base, die nicht eine α-Aminofunktion eines Peptids oder einer Aminosäure ist, und ferner in Anwesenheit eines Ammoniumsalzes mindestens eines Peptidkupplungszusatzes, wobei das Ammoniumkation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ammoniak, primäres Amin oder sekundäres Amin, wobei während der Reaktion der pH auf einen Wert im Bereich von 8 bis 9 kontrolliert wird, und wobei die Seitenkette und α-Aminofunktion des besagten Peptids mit nicht-baselabilen Schutzgruppen geschützt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass in einem zweiten Schritt nach dem ersten Reaktionschritt das amidierte, geschützte ILRWPWWPWRRK oder das antimikrobielle, vorzugsweise antimikrobielle kationische, Peptid isoliert und in einem dritten – Schritt entschützt wird, um die freien Seitenketten und α-Aminofunktion zu liefern, wobei es vorzugsweise teilweise oder komplett durch Azidolyse entschützt wird.